1 INTRODUCCIN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA

MICROBIOLOGA
2 DESARROLLO HISTRICO DE LA MICROBIOLOGA
2.1 PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL
MICROSCOPIO
2.2 EL PERIODO DE LOS PRIMEROS
MICROSCOPISTAS
2.3 EL DEBATE SOBRE LA GENERACIN
ESPONTNEA
2.4 EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS
2.5 LOS AVANCES TCNICOS
2.6 EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS
ENFERMEDADES
2.7 DESARROLLO DE LA ASEPSIA, QUIMIOTERAPIA Y
ANTIBIOTERAPIA
2.8 AUGE DE LA MICROBIOLOGA GENERAL
2.9 DESARROLLO DE LA INMUNOLOGA
2.10 ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGA
2.11 RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGA Y
OTRAS CIENCIAS BIOLGICAS
3 OBJETO DE ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGA
3.1 OBJETO MATERIAL: LOS MICROORGANISMOS
3.1.1 MICROORGANISMOS CELULARES
3.1.2 VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS
3.2 OBJETO FORMAL
4 IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGA
5. UBICACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL
MUNDO VIVO
BIBLIOGRAFA
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1 INTRODUCCIN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA
MICROBIOLOGA
La Microbiologa se puede definir, sobre la base de su
etimologa, como la ciencia que trata de los seres vivos muy
pequeos, concretamente de aquellos cuyo tamao se encuentra por
debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto
de esta disciplina venga determinado por la metodologa apropiada
para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos.
Precisamente, el origen tardo de la Microbiologa con relacin a
otras ciencias biolgicas, y el reconocimiento de las mltiples
actividades desplegadas por los microorganismos, hay que
atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos
y tcnicas pertinentes. Con la invencin del microscopio en el siglo
XVII comienza el lento despegue de una nueva rama del
conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150
aos su progreso se limit casi a una mera descripcin de tipos
morfolgicos microbianos, y a los primeros intentos taxonmicos,
que buscaron su encuadramiento en el marco de los sistemas
naturales de los Reinos Animal y Vegetal.
El asentamiento de la Microbiologa como ciencia est
estrechamente ligado a una serie de controversias seculares (con sus
numerosas filtraciones de la filosofa e incluso de la religin de la
poca), que se prolongaron hasta finales del siglo XIX. La
resolucin de estas polmicas dependi del desarrollo de una serie
de estrategias experimentales fiables (esterilizacin, cultivos puros,
perfeccionamiento de las tcnicas microscpicas, etc.), que a su vez
dieron nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que
constitituy el ncleo aglutinador de la ciencia microbiolgica. El
reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el
definitivo abandono de la idea de la generacin espontnea, y el
triunfo de la teora germinal de la enfermedad, representan las
conquistas definitivas que dan carta de naturaleza a la joven
Microbiologa en el cambio de siglo.
Tras la Edad de Oro de la Bacteriologa, inaugurada por las
grandes figuras de Pasteur y Koch, la Microbiologa qued durante
cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,
estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo
paralelo al de la Qumica, que le aportara varios avances
metodolgicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en
principio minoritaria, dedicada a los estudios bsicos centrados con
ciertas bacterias del suelo poseedoras de capacidades metablicas
especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la
nutricin de las plantas, logr hacer ver la ubicuidad ecolgica y la
extrema diversidad fisiolgica de los microorganismos. De esta
forma, se estableca una cabeza de puente entre la Microbiologa y
otras ciencias biolgicas, que lleg a su momento decisivo cuando
se comprob la unidad qumica de todo el mundo vivo, y se
demostr, con material y tcnicas microbiolgicas que la molcula
de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un ntimo y frtil
intercambio entre la Microbiologa, la Gentica y la Bioqumica, que
se plasma en el nacimiento de la Biologa Molecular, base del
espectacular auge de la Biologa desde mediados del siglo XX.
Por otro lado, el programa inicial de la Microbiologa
(bsqueda de agentes infectivos, desentraamiento y
aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador)
condujeron a la creacin de ciencias subsidiarias (Virologa,
Inmunologa) que finalmente adquirieron su mayora de edad y una
acentuada autonoma.
Por ltimo, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la
creacin de la Microbiologa, mantuvo su vigencia, enriquecida por
continuos aportes de la investigacin bsica, y hoy muestra una
impresionante hoja de servicios y una no menos prometedora
perspectiva de expansin a mltiples campos de la actividad
humana, desde el control de enfermedades infecciosas (higiene,
vacunacin, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento
econmico racional de los mltiples procesos en los que se hallan
implicados los microorganismos (biotecnologas).
As pues, la sencilla definicin con la que se abri este
apartado, esconda todo un cmulo de contenidos y objetos de
indagacin, todos emanados de una peculiar manera de aproximarse
a la porcin de realidad que la Microbiologa tiene encomendada. En
las prximas pginas ampliaremos y concretaremos el concepto al
que hemos hecho rpida referencia. Realizaremos un recorrido por el
desarrollo de la Microbiologa a lo largo de su historia, que nos
permitir una visin concreta de algunos de sus caractersticos
modos de abordar su objeto de estudio; finalmente, estaremos en
disposicin de definir este ltimo, desglosado como objeto material
y formal.
2 DESARROLLO HISTRICO DE LA MICROBIOLOGA.
La Microbiologa, considerada como una ciencia especializada,
no aparece hasta finales del siglo XIX, como consecuencia de la
confluencia de una serie de progresos metodolgicos que se haban
empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que
obligaron a una revisin de ideas y prejuicios seculares sobre la
dinmica del mundo vivo.
Siguiendo el ya clsico esquema de Collard (l976), podemos
distinguir cuatro etapas o periodos en el desarrollo de la
Microbiologa:

Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende
desde la antigedad hasta llegar a los primeros microscopistas.

Segundo periodo, de lenta acumulacin de observaciones (desde
l675 aproximadamente hasta la mitad del siglo XIX), que arranca
con el descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek
(l675).

Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega
hasta finales del siglo XIX, donde las figuras de Pasteur y Koch
encabezan el logro de cristalizar a la Microbiologa como ciencia
experimental bien asentada.

Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros das),
en el que los microorganismos se estudian en toda su complejidad
fisiolgica, bioqumica, gentica, ecolgica, etc., y que supone un
extraordinario crecimiento de la Microbiologa, el surgimiento de
disciplinas microbiolgicas especializadas (Virologa,
Inmunologa, etc), y la estrecha imbricacin de las ciencias
microbiolgicas en el marco general de las Ciencias Biolgicas. A
continuacin se realiza un breve recorrido histrico de la disciplina
microbiolgica, desglosando los perodos 3 y 4 en varios
apartados temticos.
2.1 PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL
MICROSCOPIO
Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a
simple vista debi aguardar hasta el ltimo tercio del siglo XVII, sus
actividades son conocidas por la humanidad desde muy antiguo,
tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones
implicadas en la produccin de bebidas alcohlicas, pan y derivados
lcteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades
infecciosas.
Diversas fuentes escritas de la antigedad griega y romana
hablan de grmenes invisibles que transmiten enfermedades
contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su De rerum natura hace
varias alusiones a semillas de enfermedad. En el Renacimiento
europeo, Girolamo Frascatorius, en su libro De contagione et
contagionis (1546) dice que las enfermedades contagiosas se deben
a grmenes vivos que pasan de diversas maneras de un individuo a
otro. Estos inicios de explicacin que renunciaban a invocar causas
sobrenaturales fueron probablemente catalizados por la introduccin
en Europa de la sfilis, una enfermedad en la que estaba clara la
necesidad de contacto para su contagio. Pero la cosa que se
transmite en la enfermedad sigui siendo objeto de conjeturas
durante mucho tiempo.
2.2 EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS.
Ya en el siglo XIV, con la invencin de las primeras lentes
para corregir la visin, surgi una cierta curiosidad sobre su
capacidad de aumentar el tamao aparente de los objetos. En el siglo
XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la fsica ptica de las
lentes de aumento, pero no encontraron una aplicacin inmediata. Se
dice que Galileo hizo algunas observaciones microscpicas
invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero
en cualquier caso est claro que no tuvieron ninguna repercusin.
La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se
debe a Constantijn Huygens, quien relata que el ingls Cornelis
Drebbel tena en su taller un instrumento magnificador, que recibi
el nombre de microscopium en l625, en la Accademia dei Lincei, de
Roma.

Antonie van
Leeuwenhoek
El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un
comerciante holands de tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-
1723), quien en su pasin por pulir y montar lentes casi esfricas
sobre placas de oro, plata o cobre, casi lleg a descuidar sus
negocios. Fabric unos cuatrocientos microscopios simples, con los
que lleg a obtener aumentos de casi 300 dimetros. En 1675
descubri que en una gota de agua de estanque pululaba una
asombrosa variedad de pequeas criaturas a las que denomin
animlculos. En 1683 descubre las bacterias, por lo que se
considera el padre de la Microbiologa. Durante varias dcadas
Leeuwenhoek fue comunicando sus descubrimientos a la Royal
Society de Londres a travs de una serie de cartas que se
difundieron, en traduccin inglesa, en las Philosophical
Transactions. Sus magnficas dotes de observador le llevaron
asimismo a describir protozoos (como Giardia, que encontr en sus
propias heces), la estructura estriada del msculo, la circulacin
capilar, a descubrir los espermatozoides y los glbulos rojos (por lo
que tambin se le considera el fundador de la Histologa animal), as
como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y
embriones de plantas. Leeuwenhoek se percat de la abundancia y
ubicuidad de sus animlculos, observndolos en vinagre, placa
dental, etc.

Microscopio simple de
Leeuwenhoek

Microscopio compuesto de
Hooke
Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron
inters al ser comunicados, pocos intentaron o pudieron
reproducirlos seriamente. Adems, la fabricacin de lentes sencillas
de gran aumento era difcil y el manejo de los microscopios simples,
bastante engorroso.
Simultneamente el ingls Robert Hooke (1635-1703) usando
microscopios compuestos, describi los hongos filamentosos (1667),
y descubri la estructura celular de las plantas (Micrographia,
1665), acuando el trmino clula. Pero el trabajo con microscopios
compuestos aplicados al estudio de los animlculos" languideci
durante casi 200 aos, debido a sus imperfecciones pticas, hasta
que hacia 1830 se desarrollaron las lentes acromticas.
2.3 EL DEBATE SOBRE LA GENERACIN ESPONTNEA.
La autoridad intelectual de Aristteles por un lado, y la
autoridad moral representada por la Biblia, por otro, junto con las
opiniones de escritores clsicos como Galeno, Plinio y Lucrecio, a
los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura
mdica en la Edad Media y Renacimiento, dieron carta de naturaleza
a la idea de que algunos seres vivos podan originarse a partir de
materia inanimada, o bien a partir del aire o de materiales en
putrefaccin. Esta doctrina de la generatio spontanea o
abiognesis, fue puesta en entredicho por los experimentos de
Francesco Redi (1621-1697), quien haba acuado la expresin
Omne vivum ex ovo (1668), tras comprobar que los insectos y
nematodos procedan de huevos puestos por animales adultos de su
misma especie. Demostr que si un trozo de carne era cubierto con
gasa de forma que las moscas no podan depositar all sus huevos,
no aparecan gusanos, que l correctamente identific como fases
larvarias del insecto. Los descubrimientos de Redi tuvieron el efecto
de desacreditar la teora de la generacin espontnea para los
animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los recin
descubiertos animlculos, de modo que aunque se acept la
continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no todos
estaban dispuestos a admitir el ms amplio Omne vivum ex vivo
aplicado a los microorganismos.
Hubo que esperar un siglo ms hasta que una serie de
naturalistas recomenzaran el ataque a la teora preformacionista.
Lazzaro Spallanzani (1729-1799) sostuvo una disputa con J.T.
Needham (1713-1781) en la que el primero demostr que los
infusorios no aparecan en muestras de maceraciones animales o
vegetales sometidas durante tiempo suficiente a ebullicin en frascos
hermticamente cerrados, pero volvan a aparecer si se practicaban
agujeros en el recipiente. Sin embargo los preformacionistas no se
daban por vencidos; el mismo Needham, recogiendo una idea ya
expresada por Huygens, amigo de Leeuwenhoek, replic -con
argumentos vitalistas muy propios de la poca- que el calor haba
destruido la fuerza vegetativa de las infusiones y haba cambiado
la cualidad del aire dentro de los frascos.
Durante el primer tercio del siglo XIX la doctrina de la
arquegnesis o generacin espontnea recibi un ltimo refuerzo
antes de morir, debido por un lado a razones extracientficas (el auge
del concepto de transmutacin producido por la escuela de la
filosofa de la naturaleza), y por otro al descubrimiento del oxgeno
y de su importancia para la vida, de modo que los experimentos de
Spallanzani se interpretaron como que al calentarse las infusiones, el
oxgeno del aire se destrua, y por lo tanto desapareca la fuerza
vegetativa que originaba la aparicin de microorganismos. Theodor
Schwann (1810-1882) present en 1836 un mtodo seguro para
refutar la teora abiognica: calent maceraciones en frascos a los
que se haba eliminado previamente el aire, pero no continu
trabajando en esta lnea.
Para complicar ms las cosas, la publicacin de Sobre el
origen de las especies por Darwin en 1859, fue utilizada por
algunos preformacionistas para apoyar sus argumentos. El mismo
Haeckel, en una fecha tan tarda como 1866, se mostraba escptico
ante las pruebas aportadas por Pasteur.

Pasteur
Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que
asest el golpe definitivo y zanj la cuestin a favor
de la teora biognica. En un informe a la Acadmie
des Sciences de Pars, en 1860 (Expriences
rlatives aux gnrations dites spontanes) y en
escritos posteriores comunica sus sencillos y
elegantes experimentos: calent infusiones en
matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el
cuello, hacindolo largo, estrecho y sinuoso, y
dejndolo sin cerrar, de modo que el contenido
estuviera en contacto con el aire; tras esta operacin
demostr que el lquido no desarrollaba
microorganismos, con lo que elimin la posibilidad de
que un aire alterado fuera la causa de la no
aparicin de grmenes. Antes bien, comprob que los
grmenes del aire quedaban retenidos a su paso por
el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no
alcanzaban el interior del recipiente donde se
encontraba la infusin, quedando sta estril
indefinidamente. Slo si se rompa el cuello lateral o
si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de
lquido a la porcin de cuello, los grmenes podan
contaminar la infusin y originar un rpido
crecimiento.

Frasco con "cuello de cisne" de
Pasteur, con el que refut las ideas
sobre la generacin espontnea
En 1861 Pasteur publica otro informe en el que explica cmo
se pueden capturar los cuerpos organizados del aire con ayuda de
un tubo provisto de un tapn de algodn como filtro, y la manera de
recuperarlos para su observacin microscpica. De esta forma
quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos,
y se abra la Edad de Oro del estudio cientfico de las formas de vida
no observables a simple vista.
Los ltimos escpticos quedaron silenciados cuando en 1877
John Tyndall (1820-1893) aplic su sistema de esterilizacin por
calentamiento discontinuo (hoy conocida precisamente como
tindalizacin), que evidenci la existencia de formas microbianas de
reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco ms
tarde por Ferdinand Cohn al descubrir las esporas bacterianas.



2.4 EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS
Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia
microbiolgica fue el establecimiento de la relacin que une ciertas
transformaciones qumicas que se dan en las infusiones con el
crecimiento de los grmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en
1836, y Schwann y Ktzing en 1837 haban sugerido que las
levaduras eran las causantes de la fermentacin alcohlica por la que
el azcar pasa a alcohol etlico y dixido de carbono, pero se
encontraron con la crtica adversa de los grandes qumicos de la
poca (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, haba
realizado importantes confirmaciones a la teora mineral sobre la
nutricin de las plantas, enfrentndose a la teora del humus
sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas
heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras
como plantas microscpicas, se supona que los procesos de
fermentacin y putrefaccin se deban a fenmenos qumicos de
descomposicin y muerte encuadrables en el marco de la teora
mineral de la fisiologa vegetal. Su convencimiento de que toda
actividad vital se poda explicar en trminos de qumica y fsica
retras por algn tiempo la adscripcin de estos fenmenos a clulas
vivas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las
propiedades pticas de los cristales de tartrato, vena suponiendo que
estos compuestos tenan un orgen orgnico) quien de nuevo
intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostr que los
agentes de la fermentacin lctica eran microorganismos, trabajando
sobre un problema que haba surgido entre los destiladores de Lille
cuando en sus cubas la fermentacin alcohlica se vio sustituida por
una indeseable fermentacin lctica. Este fue el inicio de una larga
serie de estudios que habra de durar hasta 1876, en los que Pasteur
identific distintos microorganismos responsables de diferentes
clases de procesos fermentativos. As, en 1860 adscribe
inequvocamente la fermentacin alcohlica a ciertos tipos de
levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le vin resume sus hallazgos
al respecto, inaugurando la Microbiologa Aplicada, una de las
primeras derivaciones prcticas no empricas emanadas de la
Biologa. A finales del siglo XIX eminentes bilogos como Hansen,
en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en
industrias y destileras.
Trabajando sobre los agentes de la fermentacin butrica,
Pasteur descubri la presencia de microorganismos que se
desarrollaban en ausencia de oxgeno, lo cual desmenta la creencia
de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acu los
trminos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente,
a la vida en presencia y en ausencia de oxgeno.
Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur
comprendi las distintas implicaciones energticas subyacentes a la
utilizacin de sustratos orgnicos en presencia y en ausencia de
oxgeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento
(medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no
poder realizarse la degradacin total de las correspondientes
sustancias.
Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg
cuando en 1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una
preparacin enzimtica (zimasa) que era capaz de realizar la misma
transformacin de fermentacin que las clulas vivas. Este
descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig,
supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y
biolgico: las fermentaciones eran procesos qumicos catalizados
por enzimas presentes dentro de clulas vivas, que podan ser
estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica, nacida
como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena
especializando en la enzimologa, encontr una alianza fructfera y
duradera con la joven Microbiologa.
2.5 LOS AVANCES TCNICOS
La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del
siglo XIX, mantena que los microorganismos adoptaban formas y
funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales.
A estas ideas se oponan frontalmente investigadores como Koch,
Pasteur y Cohn, que estaban convencidos de la especificidad y
constancia morfolgica y fisiolgica de cada tipo de
microorganismo (monomorfismo). El pleomorfismo haba surgido
como una explicacin a la gran variedad de formas y actividades que
aparecan en un simple frasco de infusin, pero ya Pasteur, en sus
estudios sobre la fermentacin, se haba percatado de que los
cultivos que aparecan podan considerarse como una sucesin de
distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a
resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composicin de
la comunidad microbiana. La solucin definitiva a esta cuestin
dependa, de nuevo, de un desarrollo tcnico, que a su vez iba a
suministrar una de las herramientas caractersticas de la nueva
ciencia: los mtodos de cultivo puro.
Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el miclogo
Brefeld, quien logr aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre
medios slidos a base de gelatina. Por su menor tamao, este
mtodo se haca inviable para las bacterias, por lo que se recurri a
un mtodo basado en diluciones: Lister, en 1878 realiz diluciones
secuenciales de cultivos mixtos, hasta lograr muestras en las que
exista una sola clula. Pero la tcnica era larga y tediosa y, adems,
normalmente slo se lograban aislar clulas del tipo bacteriano ms
abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvi
para confirmar la naturaleza particulada de los agentes de las
fermentaciones.

Robert Koch
Por aquella poca Koch buscaba con ahnco
mtodos ms sencillos de cultivo puro,
indispensables para proseguir sus
investigaciones sobre bacterias patgenas.
Primero (y quiz de forma un tanto casual)
emple rodajas de patata como sustrato
slido nutritivo sobre el que se podan
desarrollar colonias macroscpicas de
bacterias que presentaban morfologa
caracterstica, que Koch interpret como
resultantes del crecimiento a partir de clulas
individuales. Pero enseguida recurri a
compactar el tpico caldo de cultivo a base de
carne (diseado por Loeffler) aadindole
gelatina (1881). El medio slido as logrado
era transparente, lo que permita visualizar
fcilmente los rasgos coloniales, y contena
los nutrientes adecuados para el crecimiento
de una amplia gama de bacterias. stas eran
inoculadas en la superficie del medio con un
hilo de platino pasado previamente por la
llama, por la tcnica de siembra en estra. Sin
embargo, la gelatina presentaba los
inconvenientes de ser atacada por
determinados microorganismos, y de tener un
bajo punto de fusin; ambos problemas se
solventaron cuando en 1882 el mdico
alemn Walter Hesse, siguiendo una
sugerencia de su mujer Fanny, introdujo el
agar-agar (polisacrido extrado de algas
rojas) como nuevo agente solidificante. El
trabajo de Koch ya citado tuvo la
trascendental consecuencia de derribar las
ideas pleomorfistas, y supuso la primera
propuesta del concepto de especie dentro del
mundo bacteriano. En 1887 Petri, un
ayudante de Koch, sustituy las engorrosas
bandejas de vidrio cubiertas con campanas,
usadas hasta entonces para los cultivos
slidos, por un sistema manejable de placas
de cristal planas, que se conoce como cajas
de Petri.
El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue
una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por
Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros aos del siglo
XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoqumicos y
poseedoras de caractersticas fisiolgicas distintivas
(quimioauttrofas, fijadoras de nitrgeno, etc.). Estos medios, donde
se aplica a pequea escala el principio de seleccin natural, se
disean de forma que su composicin qumica definida favorezca
slo el crecimiento de ciertos tipos fisiolgicos de microorganismos,
nicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio.
Otra importante aportacin a este perodo de cultivo dentro
del desarrollo de la Microbiologa surgi del uso de medios
diferenciales, en los que se manifiesta algn rasgo bioqumico o
metablico, lo que contribuye a la identificacin microbiana. Fue
Wrtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH,
incorporados en los medios, lo cual permita revelar la produccin
de acidificaciones por fermentacin en ciertas bacterias.
Mientras tanto, en la ciudad de Jena se haba creado una
atmsfera de progreso donde confluan grandes naturalistas como
Haeckel, Strassburger o Abb interaccionando con una pujante
editorial especializada en Biologa y Medicina (Gustav Fischer) y
con una poderosa industria ptica y qumica. Estas influencias
recprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la
efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de Darwin (cfr.
Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria ptica de Abb y
Zeiss, que se mantena en conexin con la compaa vidriera Schott,
pudo satisfacer la necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio
compuesto, introduciendo lentes acromticas y una iluminacin
inferior provista de condensador. El mismo Abb desarroll en 1878
el objetivo de inmersin en aceite. Por otro lado, la industria
qumica BASF, que por aquella poca se encontraba en pleno auge
de patentes de nuevos colorantes, sumistr al laboratorio de Koch
una serie de derivados de anilina que tean las bacterias
permitiendo su fcil visualizacin al microscopio en frotis de tejidos
infectados. En 1875 Carl Weigert ti bacterias con pirocarmn, un
colorante que ya vena siendo usado desde haca unos aos en
estudios zoolgicos. En aos sucesivos se fueron introduciendo el
azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal. En
1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su mtodo de cido-alcohol
resistencia para teir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el
patlogo dans Christian Gram establece una tincin de contraste
que permite distinguir dos tipos bacterianos en funcin de sus
reaccin diferencial de tincin y que, como se vera mucho ms
tarde, reflejaba la existencia de dos grupos de bacterias con rasgos
estructurales distintivos. En 1890 Loeffler logra visualizar flagelos
bacterianos por medio de su tcnica de impregnacin argntica.
Como veremos ms adelante, la misma industria de colorantes
alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambin
para los comienzos de la quimioterapia.
Iluminacin del
microscopio,
fruto de la
colaboracin
entre Koch y
Abbe
Objetivo de
inmersin, fruto de la
colaboracin entre Koch y la
Industria ptica Carl Zeiss
Estas innovaciones tcnicas (mtodos de cultivo, microscopa
y tinciones) fueron fundamentales (junto con los sistemas de
esterilizacin abordados en el anterior apartado) para la
consolidacin de la Microbiologa como ciencia, permitiendo
eliminar las grandes dosis de especulacin que hasta entonces
haban predominado.
2.6 EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS
ENFERMEDADES.
Durante el siglo XIX la atencin de muchos naturalistas se
haba dirigido hacia las diversas formas de animales y plantas que
vivan como parsitos de otros organismos. Este inters se redobl
tras la publicacin de los libros de Darwin, estudindose las
numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos parsitos haban
adquirido en su peculiar estilo de vida. Sin embargo, la adjudicacin
de propiedades de parsitos a los microorganismos vino del campo
mdico y veterinario, al revalorizarse las ideas sobre el origen
germinal de las enfermedades infecciosas.
En 1835 Agostino Bassi (1773-1856) demostr que cierta
enfermedad del gusano de seda (mal di segno), que haba hecho su
aparicin en Lombarda, se deba a un hongo (Botrytis bassiana).
Cuatro aos ms tarde J.L. Schnlein descubri la asociacin de un
hongo con una enfermedad humana de la piel. En 1840 Henle, de la
escuela fisiolgica de Johannes Mller, plante la teora de que las
enfermedades infecciosas estn causadas por seres vivos invisibles,
pero de nuevo la confirmacin de estas ideas tuvo que esperar a que
la intervencin de Pasteur demostrara la existencia de
microorganismos especficos responsables de enfermedades.
Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa
(pebrina) comenz a diseminarse por los criaderos de gusano de
seda de toda Europa, alcanzando finalmente a China y Japn. A
instancias de su maestro Jean Baptiste Dumas, Pasteur acept el reto
de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba
dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca
hasta entonces se haba enfrentado con un problema de patologa. Es
ms que probable que Pasteur viera aqu la oportunidad de confirmar
si sus estudios previos sobre las fermentaciones podan tener una
extensin hacia los procesos fisiolgicos del hombre y de los
animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto
a aceptar la idea de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada
por un agente extrao, creyendo durante los dos primeros aos que
se trataba de alteraciones meramente fisiolgicas. Tras una serie de
tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le
obligaba a repasar continuamente los experimentos y las
conclusiones extradas, inmerso en el drama personal de la muerte
de su padre y de dos de sus hijas en un corto lapso de tiempo,
Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo Nosema
bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una
serie de medidas de control, sta comienza a remitir de modo
espectacular.
La intervencin de bacterias como agentes especficos en la
produccin de enfermedades fue descubierta a raz de una serie de
investigaciones sobre el carbunco o ntrax, enfermedad que afecta a
ganado y que puede transmitirse al hombre. C. Davaine, entre 1863
y 1868, encontr que en la sangre de vacas afectadas aparecan
grandes cantidades de microorganismos a los que llam bacteridios;
adems, logr inducir la enfermedad experimentalmente en vacas
sanas, inoculndoles muestras de sangre infectada. En 1872 el
mdico alemn C.J. Eberth consigui aislar los bacilos filtrando
sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910),
que haba sido alumno de Henle, quien con su reciente tcnica de
cultivo puro logr, en 1876, el primer aislamiento y propagacin in
vitro del bacilo del ntrax (Bacillus anthracis), consiguiendo las
primeras microfotografas sobre preparaciones secas, fijadas y
teidas con azul de metileno. Ms tarde (1881), Koch y sus
colaboradores confirmaron que las esporas son formas diferenciadas
a partir de los bacilos, y ms resistentes que stos a una variedad de
agentes. Pero ms fundamental fue su demostracin de que la
enfermedad se poda transmitir sucesivamente a ratones sanos
inoculndoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias
transferencias en medios lquidos.
Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de
una enfermedad fue llevado a una ulterior perfeccin en 1882, con la
publicacin de Die thiologie der Tuberkulose, donde se
comunica por primera vez la aplicacin de los criterios que Henle
haba postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al
nombre de Koch, son los siguientes:
1. El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos
enfermos.
2. El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser
crecido en cultivo puro.
3. La inoculacin del microorganismo crecido en cultivo puro a
animales sanos debe provocar la aparicin de sntomas
especficos de la enfermedad en cuestin.
4. El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador
infectado de forma experimental.
Fue asimismo Koch quien demostr el principio de
especificidad biolgica del agente infeccioso: cada enfermedad
infecciosa especfica est causada por un tipo de bacteria diferente.
Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la
Microbiologa Mdica sobre firmes bases cientficas.
Durante las dos dcadas siguientes la Microbiologa
experiment una autntica edad de oro, en la que se aislaron y
caracterizaron muchas bacterias patgenas. La Alemania del Reich,
que a la sazn se haba convertido en una potencia poltica y militar,
se decidi a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de
Koch, dada su enorme importancia social y econmica, creando un
Instituto de investigacin, siendo Koch su director en el
Departamento de Salud. De esta forma, en la Escuela Alemana se
aislaron los agentes productores del clera asitico (Koch, 1883), de
la difteria (Loeffler, 1884), del ttanos (Nicolaier, 1885 y Kitasato,
1889), de la neumona (Fraenkel, 1886), de la meningitis
(Weichselbaun, 1887), de la peste (Yersin, 1894), de la sfilis
(Schaudinn y Hoffman, 1905), etc. Igualmente se pudieron
desentraar los ciclos infectivos de agentes de enfermedades
tropicales no bacterianas que la potencia colonial se encontr en
ultramar: malaria (Schaudinn, 1901-1903), enfermedad del sueo
(Koch, 1906), peste vacuna africana (debida al ingls Bruce, 1895-
1897), etc.
Por otro lado, la Escuela Francesa, nucleada en el Instituto
Pasteur, se concentr en los estudios sobre los procesos infectivos, la
inmunidad del hospedador, y la obtencin de vacunas, sobre todo a
raz de la vacuna antirrbica ensayada por Pasteur (1885),
contribuyendo al nacimiento de la Inmunologa (ver apartado 2. 9)
2.7 DESARROLLO DE LA ASEPSIA, QUIMIOTERAPIA Y
ANTIBIOTERAPIA
Los avances de las tcnicas quirrgicas hacia mediados del
siglo XIX, impulsados por la introduccin de la anestesia, trajeron
consigo una gran incidencia de complicaciones post-operatorias
derivadas de infecciones. Un joven mdico britnico, Joseph Lister
(1827-1912), que haba ledo atentamente los trabajos de Pasteur, y
que crea que estas infecciones se deban a grmenes presentes en el
aire, comprob que la aplicacin de compuestos como el fenol o el
bicloruro de mercurio en el lavado del instrumental quirrgico, de
las manos y de las heridas, disminua notablemente la frecuencia de
infecciones post-quirrgicas y puerperales.
Ms tarde, Paul Ehrlich (1854-1919), que haba venido
empleando distintas sustancias para teir clulas y microorganismos,
y que conoca bien el efecto de tincin selectiva de bacterias por
ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a clulas
animales, concibi la posibilidad de que algunos de los compuestos
de sntesis que la industria qumica estaba produciendo pudieran
actuar como balas mgicas que fueran txicas para las bacterias
pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibi un programa
racional de sntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de stas
en infecciones experimentales. Trabajando en el laboratorio de
Koch, prob sistemticamente derivados del atoxilo (un compuesto
que ya Thompson, en 1905, haba mostrado como eficaz contra la
tripanosomiasis), y en 1909 inform de que el compuesto 606
(salvarsn) era efectivo contra la sfilis. Aunque el salvarsn
presentaba algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el
nico agente disponible contra enfermedades producidas por
espiroquetas, y sirvi para ilustrar brillantemente la validez del
enfoque de la llamada quimioterapia (trmino acuado por el mismo
Ehrlich), de modo que encauz toda la investigacin posterior.
En 1927 Gerhard Domagk, en conexin con la poderosa
compaa qumica I.G. Farbenindustrie, inici un ambicioso
proyecto de bsqueda de nuevos agentes quimioterpicos, siguiendo
el esquema de Ehrlich; en 1932-1935 descubre la accin del rojo de
prontosilo frente a neumococos hemolticos dentro del hospedador,
pero seala que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in
vitro. La explicacin la sumistra el matrimonio Trfoul, del
Instituto Pasteur, al descubrir que la actividad antibacteriana
depende de la conversin por el hospedador en sulfanilamida. El
mecanismo de accin de las sulfamidas (inhibicin competitiva con
el cido para-aminobenzoico) fue dilucidado por el estadounidense
Donald D. Woods. Las investigaciones de ste encaminaron a la
industria farmacutica hacia la sntesis de anlogos de metabolitos
esenciales, introduciendo un enfoque ms racional frente a la poca
anterior, ms emprica.
En 1874, el mdico ingls W. Roberts haba descrito las
propiedades antibiticas de ciertos cultivos de hongos (Penicillium
glaucum) contra las bacterias, e introdujo en Microbiologa el
concepto de antagonismo. Otros investigadores de finales del siglo
XIX realizaron observaciones similares, pero fue Fleming quien, en
1929, logr expresar ideas claras sobre el tema, al atribuir a una
sustancia qumica concreta (la penicilina) la accin inhibidora sobre
bacterias producida por el hongo Penicillium notatum. Fleming
desarroll un ensayo crudo para determinar la potencia de la
sustancia en sus filtrados, pudiendo seguir su produccin a lo largo
del tiempo de cultivo, y mostrando que no todas las especies
bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las
dificultades tcnicas para su extraccin, junto al hecho de que el
inters de la poca an estaba centrado sobre las sulfamidas,
impidieron una pronta purificacin de la penicilina, que no lleg
hasta los trabajos de Chain y Florey (1940), comprobndose
entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre
todo de Gram-positivas, y la ausencia de efectos txicos para el
hospedador.
Inmediatamente comenz una bsqueda sistemtica de
microorganismos del suelo que mostraran actividades antibiticas.
En 1944 A. Schatz y S. Waksman descubren la estreptomicina,
producida por Streptomyces griseus, siendo el primer ejemplo de
antibitico de amplio espectro. Los diez aos que siquieron al
trmino de la segundad guerra mundial vieron la descripcin de 96
antibiticos distintos producidos por 57 especies de
microorganismos, principalmente Actinomicetos.
En la dcada de los 60 se abri una nueva fase en la era de los
antibiticos al obtenerse compuestos semisintticos por
modificacin qumica de antibiticos naturales, palindose los
problemas de resistencia bacteriana a drogas que haban empezado a
aparecer, disminuyndose en muchos casos los efectos secundarios,
y amplindose el espectro de accin.
Aparte de la revolucin que supusieron en el campo de la
aplicacin clnica, los antibiticos ha permitido notables avances en
el desentraamiento de determinados aspectos de arquitectura y
funcin moleculares de las clulas susceptibles (paredes celulares
microbianas, ribosomas, sntesis proteica, etc.).
2.8 AUGE DE LA MICROBIOLOGA GENERAL.
Gran parte de los avances en Microbiologa descritos hasta
ahora se debieron a la necesidad de resolver problemas prcticos.
Pero hacia finales del siglo XIX una serie de investigadores -algunos
de ellos procedentes de reas ms clsicas de la Historia Natural-
desarrollaron importantes estudios bsicos que fueron revelando una
enorme variedad de microorganismos y sus actividades metablicas,
as como su papel crucial en ciclos biogeoqumicos, sus relaciones
con procesos de nutricin vegetal, etc. El descubrimiento de la
quimioautotrofa, obra del gran microbilogo ruso Sergei
Winogradsky (1856-1953), oblig a revisar los conceptos previos,
procedentes de la Fisiologa Vegetal, de que el crecimiento
autotrfico dependa de la presencia de clorofila. Winogradsky haba
comenzado investigando las bacterias del hierro descubiertas por
Cohn en 1875, observando que podan crecer en medios minerales,
por lo que supuso que obtenan su energa de la oxidacin de sales
ferrosas a frricas (1888). En 1889, combinando tcnicas de
observacin secuencial de cultivos microscpicos con ensayos
microqumicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa, Thiothrix),
infiri que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrgeno
hasta azufre elemental (acumulando ste como grnulos), y luego
hasta cido sulfrico, obteniendo de este modo su energa. Estas
observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de
litotrofa. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofa lleg
cuando al ao siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a
estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que
la energa obtenida de la oxidacin del amonio o del nitrito era usada
para fijar CO
2
(1889-1890). Ms tarde el mismo Winogradsky
extendi la demostracin a cultivos puros en los que el agente
solidificante de los medios era el gel de slice. La explicacin del
proceso de oxidacin de los compuestos de azufre no lleg hasta los
estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades
metablicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios
de las bacterias que oxidan hidrgeno o metano (Shngen, 1906).
El qumico Berthelot haba sealado (1885) que los
microorganismos del suelo podan incorporar nitrgeno molecular
directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el primero en
aislar una bacteria capaz de fijar nitrgeno atmosfrico (Clostridium
pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrgeno en la naturaleza
(1890), siendo el holands Martinus Beijerinck (1851-1931) el
descubridor de Azotobacter como bacteria aerobia fijadora de vida
libre (1901). Ms tarde Beijerinck demostr por mtodos qumicos
que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrgeno de la atmsfera
mientras crece (1908). La importancia de la fijacin de nitrgeno
para la nutricin vegetal lleg con los estudios sobre bacterias
formadoras de ndulos en las races de las leguminosas. Ya los
experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes,
realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, haban
indicado que las leguminosas asimilaban nitrgeno de la atmsfera.
En 1866 Voronin descubri las bacterias de los ndulos radicales de
esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostr que los ndulos
parecan inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y
Ward (1887) us bacterias procedentes de ndulos machacados para
inocular semillas, logrando la produccin de ndulos en suelo
estril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infeccin,
con su produccin de hifas (cordn de infeccin). Tras la
introduccin del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue
Schindler (1884) el primero en describir los ndulos radicales como
resultado de una simbiosis entre planta y bacterias. Los trabajos de
Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador Hermann
Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estacin Experimental
de Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en
Berln, en 1886, y publicados en un artculo ejemplar en 1888,
asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la
presencia de sus ndulos radicales, sealando que estos ndulos se
inducan por microorganismos especficos; de este modo lograron
una brillante sntesis de las observaciones microbiolgicas y
qumicas. El mismo ao de 1888 Beijerinck logr el cultivo puro in
vitro de las bacterias nodulares (a las que bautiz como Bacillus
radicicola), observando que no reducan nitrgeno en vida libre;
ms tarde (1890) aport la prueba definitiva de que las bacterias
aisladas eran capaces de nodular especficamente ciertas especies de
leguminosas, adquirindose de esta forma la facultad de fijar
nitrgeno en su asociacin con la raz de la planta. Irnicamente el
nombre definitivo para las bacterias de los ndulos de leguminosas
(Rhizobium) fue propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo
se haba negado a reconocer los resultados de Hellriegel y Willfahrt,
y que haba oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijacin
de nitrgeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las
estructuras intranodulares observadas a microcopio (bacteroides)
eran grnulos de reserva (incluidas las que l mismo observ en
plantas no leguminosas de los gneros Alnus y Eleagnus, originadas
por una bacteria bautizada en su honor -Frankia); incluso cuando se
convenci de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o
mixomicetes), pensaba que stas slo estimulaban a que las plantas
fijaran nitrgeno en sus hojas; su conversin (y an as incompleta
y con reticencias) no lleg hasta 1892. El aislamiento de los
bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relacin entre
su formacin y la fijacin de nitrgeno (Nobbe y Hiltner, 1893)
complet esta primera oleada de investigacin sobre este tema que
tanta trascendencia presentaba para la Agronoma. Estos estudios
estn en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiologa
Agrcola, de modo que esta especiliadad fue incorporada
tempranamente a los laboratorios cientficos y estaciones
experimentales.
Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck
abrieron un nuevo horizonte para el estudio de la diversidad
microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad Tcnica de
Delft, fue continuada por por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo
este ltimo el padre de la escuela norteamericana desde su
establecimiento en California, ya que form a figuras tan
importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La
escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra
fructfera colonia en la ciudad alemana de Konstanz, donde N.
Pfennig continu el trabajo emprendido junto a van Niel en Delft.
Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando
contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias,
descubriendo la variedad de las bacterias fotosintticas, los tipos de
organismos litotrficos, y profundizando en multitud de aspectos
estructurales y fisiolgicos de las bacterias recin descubiertas.
Como dice T.D. Brock en una recensin de Kluyver (1961) los
hombres de la escuela de Delft de Microbiologa General fueron
pioneros en una poca en la que la mayora de los investigadores
estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina,
agricultura o industria, como para preocuparse por microorganismos
quimiosintticos o fotosintticos, o por aquellos que muestran
fermentaciones inusuales.... Pero, como en tantas otras ocasiones,
este enfoque de ciencia bsica ha sido extraordinariamente frtil, y
aparte de la profundizacin en la unidad y diversidad de la vida ha
dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas
planteados, tarde o temprano, a las ciencias biolgicas.
2.9 DESARROLLO DE LA INMUNOLOGA
La inmunologa es, en la actualidad, una ciencia autnoma y
madura, pero sus orgenes han estado estrechamente ligados a la
Microbiologa. Su objeto consiste en el estudio de las respuestas de
defensa que han desarrollado los animales frente a la invasin por
microorganismos o partculas extraos, aunque su inters se ha
volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente
evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria,
frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no-propios, as
como de su neutralizacin y degradacin.
Como tantas otras ciencias, la Inmumologa presenta un
prolongado perodo pre-cientfico, de observaciones y
aproximaciones meramente empricas. La resistencia a ulteriores
ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de
la antigedad; el historiador griego Tucdides (464-404 a.C.) narra
que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los
enfermos eran atendidos solo por aquellos que haban sobrevivido
previamente a la enfermedad, en la seguridad de que stos no
volveran a ser contagiados. Igualmente, en la antigua China se
haba observado que las personas que en su niez haban padecido la
viruela no la adquiran ms adelante en su vida. Los mismos chinos,
en el siglo XI a. C., fueron los primeros en intentar una aplicacin de
estas observaciones que indicaban la induccin de un estado
protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la
inhalacin de polvo de escaras de viruela provocaba un ataque suave
que confera resistencia ante infecciones posteriores. Una
modificacin fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por
Pylarini y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaa por Lady
Mary Wortley Montagu, esposa del embajador ingls en
Constantinopla, tras una serie inicicial de pruebas sobre
voluntarios (sic, en realidad prisioneros). Sin embargo, este tipo
de prcticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban
exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de
transmisin de otras enfermedades.
El primer acercamiento a la inmunizacin con criterios
racionales fue realizado por el mdico ingls Edward Jenner (1749-
1823), tras su constatacin de que los vaqueros que haban adquirido
la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que slo
produca pstulas en las manos) no eran atacados por la grave y
deformante viruela humana. En mayo de 1796 inocul a un nio
fluido procedente de las pstulas vacunales de Sarah Nelmes;
semanas despus el nio fue inyectado con pus de una pstula de un
enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la
enfermedad. Jenner public sus resultados en 1798 (An enquiry into
the causes and effects of the variolae vaccinae...), pronosticando
que la aplicacin de su mtodo podra llegar a erradicar la viruela.
Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar estudios
clnicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de
la necesidad de contar con controles fiables.
La falta de conocimiento, en aquella poca, de las bases
microbiolgicas de las enfermedades infecciosas retras en casi un
siglo la continuacin de los estudios de Jenner, aunque ciertos
autores, como Turenne, en su libro La syphilization (1878)
lograron articular propuestas tericas de cierto inters.
El primer abordaje plenamente cientfico de problemas
inmunolgicos se debi, de nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria
responsable del clera aviar (ms tarde conocida como Pasteurella
aviseptica), observ (1880) que la inoculacin en gallinas de
cultivos viejos, poco virulentos, las protega de contraer la
enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos
normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a
base de microorganismos atenuados. Fue precisamente Pasteur quien
dio carta de naturaleza al trmino vacuna, en honor del trabajo
pionero de Jenner. En los aos siguientes Pasteur abord la
inmunizacin artificial para otras enfermedades; concretamente,
estableci de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis
atenuados por incubacin a 45C conferan inmunidad a ovejas
expuestas a contagio por carbunco. Una famosa demostracin
pblica de la bondad del mtodo de Pasteur tuvo lugar en Pouilly le
Fort, el dos de junio de 1881, cuando ante un gento expectante se
pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no
inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados.
Aos despus, abordara la inmunizacin contra la rabia,
enfermedad de la que se desconoca el agente causal. Pasteur
observ que ste perda virulencia cuando se mantenan al aire
durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados,
por lo que dichos extractos se podan emplear eficazmente como
vacunas. Realiz la primera vacunacin antirrbica en humanos el 6
de julio de 1885, sobre el nio Joseph Meister, que haba sido
mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron
otros muchos, lo que vali a Pasteur reconocimiento universal y
supuso el apoyo definitivo a su mtodo de inmunizacin, que abra
perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas enfermedades.
Estos logros determinaron, en buena medida, la creacin del
Instituto Pasteur, que muy pronto reuni a un selecto grupo de
cientficos, que enfocaran sus esfuerzos en diversos aspectos de las
inmunizaciones y de sus bases biolgicas. A su vez, los
norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los mtodos
serolgicos de Pasteur, lo que les permiti producir y conservar ms
fcilmente sueros tipificados contra la peste porcina.
caricatura deMetchnikov
A finales del siglo XIX existan dos teoras opuestas sobre los
fundamentos biolgicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el
zologo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-1916), que haba realizado
observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de
agua, estableci, a partir de 1883, su Teora de los fagocitos, tras
estudiar fenmenos de englobamiento de partculas extraas por los
leucocitos de conejo y de humanos. Inform que existan fenmenos
de eliminacin de agentes patgenos por medio de clulas
devoradoras (fagocitos) que actuaban en animales vacunados
contra el carbunco, y explic la inmunizacin como una
habituacin del husped a la fagocitosis. Ms tarde, ya integrado
en el Instituto Pasteur, propugn la idea de que los fagocitos
segregan enzimas especficos, anlogos a los fermentos digestivos
(1900). Esta teora de los fagocitos constituy el ncleo de la teora
de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba
como la base principal del sistema de defensa inmune del
organismo.
Por otro lado, la escuela alemana de Koch haca hincapi en la
importancia de los mecanisnos humorales. Emil von Behring (1854-
1917) y Shibasaburo Kitasato (1856-1931), a resultas de sus trabajos
sobre las toxinas del ttanos y de la difteria, observaron que el
cuerpo produce antitoxinas (ms tarde conocidas como
anticuerpos) que tendan a neutralizar las toxinas de forma
especfica, y evidenciaron que el suero que contiene antitoxinas es
capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal de la toxina
correspondiente (1890). La intervencin de Ehrlich permiti obtener
sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos
como para conferir una proteccin eficaz, e igualmente se pudo
disponer de un ensayo para cuantificar la antitoxina presente en
suero. Ehrlich dirigi desde 1896 el Instituto Estatal para la
Investigacin y Comprobacin de Sueros, en Steglitz, cerca de
Berln, y, a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado
Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este ltimo
periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra
cientfica, en la que va ahondando en la comprensin de la
inmunidad humoral. En 1900 da a luz su Teora de las cadenas
laterales, en la que formula una explicacin de la formacin y
especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base qumica
para la interaccin de stos con los antgenos. Por su lado, R. Kraus
visualiza por primera vez, en 1897, una reaccin antgeno-
anticuerpo, al observar el enturbiamento de un filtrado bacteriano al
mezclarlo con un suero inmune especfico (antisuero). En 1898 Jules
Bordet (1870-1961) descubre otro componente srico relacionado
con la respuesta inmunitaria, al que bautiza como alexina,
caracterizado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e
inespecificidad. (Ms tarde se impondra el nombre de
complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarroll,
en 1901, el primer sistema diagnstico para la deteccin de
anticuerpos, basado en la fijacin del complemento, y que inici una
larga andadura, que llega a nuestros das.
La conciliacin de las dos teoras se debi a Almorth Wrigth y
Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas,
anticuerpos presentes en los sueros de animales inmunizados y que,
tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad
fagoctica de los leucocitos.
El rea de la inmunopatologa inicia su andadura con la
descripcin del fenmeno de anafilaxia producido por introduccin
en un animal de un suero de una especie distinta (Portier y Richet,
1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abrira la posibilidad de
mtodos de serodiagnstico, con aplicaciones mltiples en
Medicina, Zoologa, y otras ciencias biolgicas. En 1905 Pirquet
sugiere que la enfermedad del suero (un fenmemo de
hipersensibilidad) tiene relacin directa con la produccin de
anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el trmino de
alergia para referirse a la reactividad inmunolgica alterada.
La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras
dcadas del siglo XX con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-
1943). Su primera contribucin de importancia haba sido la
descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de
antgenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902),
completada (en colaboracin con Von Dungern y Hirzfeld), con las
subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmsin hereditaria.
Estos trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el
desentraamiento de la especificidad qumica de los antgenos que
determinan la formacin de anticuerpos. Landsteiner estudi
sistemticamente las caractersticas de inmunogenicidad y
especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos, valindose
de la modificacin qumica de antgenos, denominando haptenos a
aquellos grupos qumicos que por s mismos no desencadenan
formacin de anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a
protenas portadoras.
La cuestin de las reacciones antgeno-anticuerpo se convirti
en otra polmica entre escuelas hasta finales de los aos 20.
Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenan que estas reacciones
tienen una base puramente qumica, Bordet y sus discpulos las
explicaban como fenmenos fsicos de reacciones entre coloides. La
resolucin del debate debi aguardar hasta finales de los aos 30, al
incorporarse avances tcnicos como la electroforesis, la
cromatografa en papel, la ultracentrifugacin y el microscopio
electrnico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a
partir de sueros por disociacin de precipitados. Tiselius (1939)
demostr que los anticuerpos constituyen la fraccin gamma-
globulnica del suero. Veinte aos despus R.R. Porter y G.M.
Edelman establecen la estructura de las inmunoglobulinas. Durante
este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de anticuerpos
ocurre en las clulas plasmticas, aunque stas no son puestas en
relacin an con los linfocitos; durante muchos aos se sigui
creyendo que los linfocitos eran clulas pasivas, sin funcin inmune.
Por aquella poca se describe, tambin, la diversidad de
inmunoglobulinas, llegndose al establecimiento de una
nomenclatura. Enseguida comienza la era de los mltiples
experimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre
bursectoma en aves, as como los de reconstitucin de animales
irradiados, con timocitos y clulas de la medula sea, y que permiten
afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos
funcionales T y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular
y humoral, respectivamente.
Una importante faceta de la inmunologa de la primera mitad
del siglo XX fue la obtencin de vacunas. Se lograron toxoides
inmunognicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por
tratamiento con formol: toxoide tetnico (Eisler y Lowenstein, 1915)
y toxoide diftrico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna
BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de
Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de Calmette-Gurin. La
utilizacin de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y
Piroy.
La inmunogentica nace cuando Bernstein describe en 1921 el
modelo de transmisin hereditaria de los cuatro grupos sanguneos
principales, basndose en el anlisis estadstico de sus proporciones
relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y Levne (1927)
de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones
sanguneas interespecficas permitieron distinguir la gran
complejidad de los antgenos sanguneos, explicables segn unos
300 alelos mltiples.
Una contribucin esencial a las ideas sobre el mecanismo de
formacin de los anticuerpos la realiz el australiano Macfarlane
Burnet (1899-1985), al establecer su teora de la seleccin clonal;
sta argumenta que cada linfocito B sintetiza un nico tipo de
anticuerpo, especfico para cada antgeno (determinante antignico),
de modo que la unin del antgeno causa la proliferacin clonal del
linfocito B, con la consecuente sntesis incrementada de anticuerpos
especficos. Igualmente, Burnet lanz una hiptesis sobre el
mecanismo subyacente a la auto-tolerancia inmunolgica, que fue
confirmada experimentalmente por Peter Medawar. Ms
recientemente Niels Jerne ha realizado nuevas aportaciones y
refinamientos a la teora de la seleccin clonal, proponiendo un
modelo de regulacin inmune conocido como teora de las redes
idiotpicas.
Los avances en Inmunologa durante los ltimos aos han sido
espectaculares, consolidando a sta como ciencia independiente, con
su conjunto propio de paradigmas, ya relativamente escindida de su
tronco originario microbiolgico. Entre los hitos recientes hay que
citar la tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales a partir
de hibridomas, desarrollada originalmente por Csar Milstein y
Georges Kohler en 1975, y que presenta una enorme gama de
aplicaciones en biomedicina, o el desentraamiento de los
fenmenos de reorganizacin gentica responsables de la expresin
de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa.
2.10 ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGA
La Virologa ha sido la ciencia microbiolgica de origen ms
tardo, habiendo surgido como resultado del hallazgo de
enfermedades infecciosas en las que la demostracin de implicacin
de microorganismos se demostraba esquiva con los medios
habituales disponibles a finales del siglo XIX. La euforia que se
viva en los mbitos cientficos y mdicos, al socaire de la edad de
oro de aislamiento de bacterias patgenas, se plasm en el prejuicio
de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de
ciertas enfermedades se deba a una tcnica inapropida o mal
aplicada.
El botnico ruso Dimitri Iwanovski haba observado (1892)
que la enfermedad del mosaico del tabaco poda ser reproducida
experimentalmente usando el fluido que atravesaba los filtros de
porcelana que normalmente retenan a las bacterias, pero siendo
incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandon la
investigacin. Pocos aos ms tarde (1898), y probablemente sin
tener noticias del trabajo de Iwanovski, Beijerink realiz
experimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su
genio, enfrentndose a los conceptos de la poca, avanz la idea de
que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, segn su
expresin), deba de incorporarse al protoplasma vivo del
hospedador para lograr su reproduccin. Este tipo de agentes
infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados
en principio virus filtrables, quedando ms tarde su denominacin
simplemente como virus. Aquel mismo ao de 1898 Loeffler y
Frosch descubren los virus animales al comprobar que un virus
filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901 Reed
descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909
Landsteiner y Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de
siglo Copeman desarrolla su tcnica de multiplicacin de virus
animales en embriones de pollo, con la que P. Rous aisla y cultiva el
virus del sarcoma aviar (1911).
Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W.
Twort, si bien su trabajo no alcanz la elegancia y claridad del
desarrollado poco ms tarde por el canadiense Flix d'Hrelle
(1917); fue ste quien acu el trmino bacterifago, y supuso
correctamente que el fenmeno de lisis por estos agentes deba de
estar ampliamente difundido entre las bacterias. Aunque su
esperanza en la aplicacin de los fagos como elementos bactericidas
para uso mdico no pudo satisfacerse, la contribucin de los virus
bacterianos al avance de la gentica y biologa moleculares ha sido
decisiva: de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre
replicacin virsica se realizaron sobre fagos de Escherichia coli, lo
que suministr modelos aplicables a otros virus, incluidos los de
animales. En 1925 Bordet y Bal describen por primera vez el
fenmeno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos ltico y
lisognico de los fagos no fueron aclaradas hasta los estudios de
Andr Lwoff (1950).
La primera visualizacin de un virus se debe a las
observaciones a microscopio ultravioleta del bacterilogo ingls
Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera fotografa de un
virus a microscopio electrnico. Pero los avances ms significativos
en el estudio de la composicin y estructura de los virus se inician
con la purificacin y cristalizacin, por Wendell M. Stanley, del
virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935), aplicando
procedimientos tpicos de la cristalizacin de enzimas. Inicialmente
Stanley comprob que el TMV contena gran proporcin de
protena, pero poco ms tarde detecta, adems, la presencia de cido
nucleico. A partir de aqu, la Virologa entra en una fase de ciencia
cuantitativa, en la que participan numerosos fsicos, bioqumicos y
genetistas, en un esfuerzo interdisciplinar que da origen a la
moderna Biologa Molecular.
Un importante avance metodolgico para el estudio de los
virus animales se debi a Enders, Weller y Robbins (1949), al
desarrollar por primera vez un mtodo para la multiplicacin
virsica sobre cultivos de tejidos de mamferos, tcnica que fue
perfeccionada ms tarde por el equipo de Renato Dulbecco.
Los recientes progresos en las numerosas tcnicas de biologa
molecular han propiciado una autntica explosin de
descubrimientos sobre la biologa de los virus y de sus clulas
hospedadoras; baste citar la replicacin del genomio de ARN de los
retrovirus por reversotranscripcin a ADN, los fenmenos de
transformacin oncognica virsica y su aplicacin a los estudios
generales del cncer, el diseo de vacunas recombinantes por
manipulacin in vitro de genomios virsicos, la prxima aplicacin
clnica de la primeras terapias gnicas en humanos recurriendo a
vectores virsicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la
metodologa existente ha permitido la rpida identificacin y
caracterizacin del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se
est traduciendo en una intensa y racional bsqueda de
procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de
SIDA.
En aos recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de
entidades infectivas, subvirsicas: T.O. Diener describi en 1967 la
existencia de ARN desnudos infectivos en plantas, a los que llam
viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que determinadas
enfermedades de mamferos se deben a partculas proteicas
aparentemente desprovistas de material gentico, a las que bautiz
como priones.
2.11 RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGA Y OTRAS
CIENCIAS BIOLGICAS.
El auge de la microbiologa desde finales del siglo XIX se
plasm, entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de
cepas silvestres de microorganismos, lo que suministr un enorme
volumen de nuevo material biolgico sobre el que trabajar,
aplicndose una serie de enfoques que eran ya habituales en las
ciencias naturales ms antiguas; as, haba que crear un marco
taxonmico (con sus normas de nomenclatura) para encuadrar a los
organismos recin descubiertos, era factible desarrollar trabajos
sobre morfologa y fisiologa comparadas, sobre variabilidad y
herencia, evolucin, ecologa, etc. De este modo la joven
Microbiologa fue objeto, en pocos aos, de la utilizacin, a un ritmo
acelerado, de los mtodos taxonmicos y experimentales que haban
ido surgiendo y madurando desde el siglo XVIII en los mbitos de la
Historia Natural clsica.
Aunque nos referiremos en otro apartado (vase cap. 2) a los
avances de Taxonoma Microbiana, vale la pena resear aqu los
esfuerzos tempranos para lograr un clasificacin bacteriana por parte
de Cohn (1875) y Migula (1894), que sustentaban su concepto de
especie predominantemente sobre caracteres morfolgicos. Pero
hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo
de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso
de caracteres bioqumicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de
rasgos morfolgicos, bioqumicos, patognicos y de tincin
(Buchanan, 1915). El sistema de taxonoma bacteriana adquiri un
nuevo impulso a partir de la 1 edicin del Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology (1923), y de las propuestas de Kluyver
y van Niel (Prospects for a natural system of classification of
bacteria, 1936). En cuanto a la nomenclatura, no fue hasta 1958 en
que cuaj un Cdigo Internacional de Nomenclatura Bacteriolgica,
aunque ya se vena aplicando desde haca tiempo el procedimiento
tipolgico para los microorganismos, con criterios similares a los de
la Zoologa y la Botnica.
El establecimiento de relaciones taxonmicas precis el
recurso a mtodos cada vez ms amplios y afinados de anlisis
gentico, estructural o fisiolgico. En un apartado anterior ya vimos
las conexiones tempranas entre la Bioqumica y la Microbiologa a
propsito del descubrimiento de la base enzimtica de las
fermentaciones, lo cual abri el camino para dilucidar el
metabolismo energtico microbiano, y para demostrar su similitud
qumica con rutas metablicas de organismos superiores. Otro paso
importante en la percepcin de la unidad bioqumica del mundo vivo
deriva del descubrimiento de las vitaminas (trmino acuado por
Funk en 1911), al establecerse que determinados factores de
crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran
qumicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los
animales, y que este tipo de compuestos representa precursores
biosintticos de coenzimas del metabolismo celular. As pues, este
tipo de investigaciones sent claramente la idea de la unidad
qumica de los seres vivos, independientemente de su encuadre
taxonmico, y encauz una buena parte de los trabajos bioqumicos
hacia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de
manejo y cultivo en laboratorio.
En cuanto a las conexiones de la Microbiologa con la
Gentica, ya Beijerink, en 1900, tras analizar la teora de la
mutacin de De Vries, haba predicho que los microoganismos
podran convertirse en objetos de investigacin ms adecuados que
los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras conexiones
entre ambas ciencias arrancan de la necesidad que hubo, a principios
del siglo XX, de determinar la sexualidad de los hongos con fines
taxonmicos. En 1905 Maire demostr la existencia de meiosis en la
formacin de ascosporas, y Claussen (1907) evidenci fusin de
ncleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los
aos 30 haba recogido un gran volumen de informacin sobre
procesos sexuales en Basidiomicetos. El sueco Lindegren (1936)
realiza las primeras cartografas genticas en cromosomas de
Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de
Morgan; este ltimo, propugnador de la teora de los genes (1926),
confiaba desde haca aos en ampliar sus xitos, logrados en
Drosophila, hacia el estudio de la gentica microbiana. En 1941,
otros dos discpulos de Morgan, Beadle y Tatum, aislan mutantes
auxotrficos de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la
base bioqumica de la herencia, y convierten a este hongo en una
valiosa herramienta de trabajo en esta lnea de investigacin.
Las estrategias diseadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas
por Luria y Delbrck (1943) a cultivos bacterianos, investigando la
aparicin de mutaciones espontneas resitentes a fagos o
estreptomicina. La conexin de estos experimentos con las
observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformacin del
neumococo, llev a Avery y colaboradores (1944) a demostrar que
el principio transformante portador de la informacin gentica es
el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra bioqumicamente la
transmisin gentica mediante ADN en Escherichia coli , y en 1952
Alfred Hershey y Martha Chase, en experimentos con componentes
marcados de fagos, ponen un elegante colofn a la confirmacin de
la funcin del ADN, con lo que se derribaba el antiguo y asentado
paradigma de las protenas que hasta mediados de siglo intentaba
explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiologa
experimental se sita en pleno centro del nacimiento de la Gentica
molecular, de la mano de los avances paralelos en Bioqumica
(anlisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice
Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble
hlice del ADN, etc.), dando origen esta confluencia a lo que se ha
llamado la Edad de Oro de la Biologa Molecular.
3 OBJETO DE ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGA
El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos
apartados: objeto material y objeto formal.
3.1 OBJETO MATERIAL: LOS MICROORGANISMOS
La Microbiologa es la ciencia que se ocupa del estudio de los
microorganismos, es decir, de aquellos organismos demasiado
pequeos para poder ser observados a simple vista, y cuya
visualizacin requiere el empleo del microscopio. Esta definicin
implica que el objeto material de la Microbiologa viene delimitado
por el tamao de los seres que investiga, lo que supone que abarca
una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y
taxonmicos: desde partculas no celulares como los virus, viroides
y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las
bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. De esta
manera la Microbiologa se distingue de otras disciplinas
organsmicas (como la Zoologa y la Botnica) que se centran en
grupos de seres vivos definidos por conceptos biolgicos
homogneos, ya que su objeto de indagacin se asienta sobre un
criterio artificial que obliga a incluir entidades sin ms relacin en
comn que su pequeo tamao, y a excluir a diversos organismos
macroscpicos muy emparentados con otros microscpicos.
A pesar de esto (o incluso debido a ello), la Microbiologa
permanece como una disciplina perfectamente asentada y
diferenciada, que deriva su coherencia interna del tipo de
metodologas ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamao se
sita por debajo del lmite de resolucin del ojo humano, aportando
un conjunto especfico de conceptos que han enriquecido la moderna
Biologa.
Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de
tamao microscpico dotados de individualidad, con una
organizacin biolgica sencilla, bien sea acelular o celular, y en este
ltimo caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocticos,
coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciancin en tejidos u
rganos, y que necesitan para su estudio una metodologa propia y
adecuada a sus pequeas dimensiones. Bajo esta denominacin se
engloban tanto microorganismos celulares como las entidades
subcelulares.
3.1.1 MICROORGANISMOS CELULARES
Comprenden todos los procariotas y los microorganismos
eucariticos (los protozoos, los mohos mucosos, los hongos y las
algas microscpicas). El encuadre de todos estos grupos
heterogneos ser abordado en el prximo captulo.
3.1.2 VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS
Otro tipo de objetos de estudio de la microbiologa son las entidades
no celulares, que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo
que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad
biolgica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia.
Los virus son entidades no celulares de muy pequeo tamao
(normalmente inferior al del ms pequeo procariota), por lo que
debe de recurrirse al microscopio electrnico para su visualizacin.
Son agentes infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria
intracelular, que necesitan su incorporacin al protoplasma vivo para
que su material gentico sea replicado por medio de su asociacin
ms o menos completa con las actividades celulares normales, y que
pueden transmitirse de una clula a otra. Cada tipo de virus consta
de una sola clase de cido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos),
con capacidad para codificar varias protenas, algunas de las cuales
pueden tener funciones enzimticas, mientras que otras son
estructurales, disponindose stas en cada partcula virsica (virin)
alrededor del material gentico formando una estructura regular
(cpsida); en algunos virus existe, adems, una envuelta externa de
tipo membranoso, derivada en parte de la clula en la que se
desarroll el virin (bicapa lipdica procedente de membranas
celulares) y en parte de origen virsico (protenas).
En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes,
al carecer de la maquinaria de biosntesis de protenas, de
replicacin de su cido nucleico y de obtencin de energa. Esto les
obliga a un modo de vida (sic) parasitario intracelular estricto o fase
vegetativa, durante la que el virin pierde su integridad, y
normalmente queda reducido a su material gentico, que al
superponer su informacin a la de la clula hospedadora, logra ser
expresado y replicado, producindose eventualmente la formacin
de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo.
Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas,
subvirsicas, descubiertas en 1967 por T.O. Diener en plantas. Estn
constituidos exclusivamente por una pequea molcula circular de
ARN de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura
secundaria alargada debido a un extenso, pero no total,
emparejamiento intracatenario de bases por zonas de homologa
interna. Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta
semejanza con los intrones autocatalticos de clase I, por lo que
podran representar secuencias intercaladas que escaparon de sus
genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles de su modo
de multiplicacin, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma,
existiendo pruebas de la implicacin de la ARN polimerasa II en su
replicacin, por un modelo de crculo rodante que genera
concatmeros lineares. Esta replicacin parece requerir secuencias
conservadas hacia la porcin central del viroide. Los viroides
aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones
patolgicas. El mecanismo de patogenia no est aclarado, pero se
sabe que muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quiz
podran interferir; sin embargo, no existen indicios de que alteren la
expresin gnica (una de las hiptesis sugeridas); cada molcula de
viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la
virulencia.
En 1986 se descubri que el agente de la hepatitis delta
humana posee un genomio de ARN de tipo viroide, aunque requiere
para su transmisin (pero no para su replicacin) la colaboracin del
virus de la hepatitis B, empaquetndose en partculas similares a las
de este virus. A diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad
codificadora de algunas protenas.
Los ARNs satlites son pequeas molculas de tamao similar
al de los viroides de plantas (330-400 bases), que son empaquetados
en cpsidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no
muestran homologas). Se replican slo en presencia del virus
colaborador especfico, modificando (aumentando o disminuyendo)
los efectos patgenos de ste.
Los virusoides constituyen un grupo de ARNs satlites no
infectivos, presentes en el interior de la cpsida de ciertos virus, con
semejanzas estructurales con los viroides, replicndose
exclusivamente junto a su virus colaborador.
Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente
nuevo y original, descubiertas por Stanley Prusiner en 1981,
responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema
nervioso central de mamferos (por ejemplo, el scrapie o prurito
de ovejas y cabras), incluyendo los humanos (kuru, sndrome de
Gerstmann-Strassler, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob). Se definen
como pequeas partculas proteicas infectivas que resisten la
inactivacin por agentes que modifican cidos nucleicos, y que
contienen como componente mayoritario (si no nico) una isoforma
anmala de una proteina celular. Tanto la versin celular normal
(PrP
C
) como la patgena (PrP
Sc
en el caso del scrapie) son
glicoprotenas codificadas por el mismo gen cromosmico, teniendo
la misma secuencia primaria. Se desconoce si las caractersticas
distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los
respectivos oligosacridos que adquieren por procesamiento post-
traduccional.
A diferencia de los virus, los priones no contienen cido
nucleico y estn codificados por un gen celular. Aunque se
multiplican, los priones de nueva sntesis poseen molculas de PrP
que reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia
de la molcula del PrP que caus la infeccin previa. Se desconoce
su mecanismo de multiplicacin, y para discernir entre las diversas
hiptesis propuestas quiz haya que dilucidar la funcin del
producto normal y su posible conversin a la isoforma patgena
infectiva.
Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de la
enfermedades por priones son simultneamente infectivas y
genticas, una situacin inslita en la Patologa humana, habindose
demostrado una relacin entre un alelo dominante del PrP y la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El gen del prin (Prn-p) est
ligado genticamente a un gen autosmico (Prn-i) que condiciona en
parte los largos tiempos de incubacin hasta el desarrollo del
sndrome.
3.2 OBJETO FORMAL
Todos los aspectos y enfoques desde los que se pueden
estudiar los microorganismos conforman lo que denominamos
objeto formal de la Microbiologa: caractersticas estructurales,
fisiolgicas, bioqumicas, genticas, taxonmicas, ecolgicas, etc.,
que conforman el ncleo general o cuerpo bsico de conocimientos
de esta ciencia. Por otro lado, la Microbiologa tambin se ocupa de
las distintas actividades microbianas en relacin con los intereses
humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias perjudiciales
(y en este caso estudia los nichos ecolgicos de los correspondientes
agentes, sus modos de transmisin, los diversos aspectos de la
microbiota patgena en sus interacciones con el hospedador, los
mecanismos de defensa de ste, as como los mtodos desarrollados
para combatirlos y controlarlos), como de las que reportan
beneficios (ocupdose del estudio de los procesos microbianos que
suponen la obtencin de materias primas o elaboradas, y de su
modificacin y mejora racional con vistas a su imbricacin en los
flujos productivos de las sociedades).
Finalmente, la Microbiologa ha de ocuparse de todas las
tcnicas y metodologas destinadas al estudio experimental, manejo
y control de los microorganismos, es decir, de todos los aspectos
relacionados con el modo de trabajo de una ciencia emprica.
4 IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGA
La Microbiologa es una ciencia biolgica extraordinariamente
relevante para la humanidad, dado que los microorganismos estn
presentes en todos los hbitats y ecosistemas de la Tierra y sus
actividades presentan una gran incidencia en numerossimos mbitos
de inters:

Los microorganismos han sido los primeros en aparecer en la
evolucin, y constituyen seguramente la mayor parte de la
biomasa de nuestro planeta. Se calcula que slo hemos descrito
menos del 10% de los microorganismos existentes, por lo que los
bilogos tienen una gran tarea por delante para estudiar esta parte
de la biodiversidad.

Las actividades microbianas sustentan los ciclos biogeoqumicos
de la Tierra: los ciclos del carbono, del nitrgeno, del azufre o del
fsforo dependen de modo fundamental de los microorganismos.

Las actividades metablicas microbianas son excepcionalmente
variadas, siendo algunas de ellas exclusivas del mundo
procaritico. La biolologa bsica tiene aqu un gran campo de
estudio.

El aspecto aplicado y la incidencia econmica y social de los
microorganismos es ingente, y aqu daremos unas breves
pinceladas:

Aspectos beneficiosos:

Todas las culturas desarrollaron de modo emprico multitud de
bebibas y alimentos derivados de fermentaciones microbianas:
vino, cerveza, pan, verduras fermentadas, etc.

Produccin de multitud de productos industriales: alcoholes,
cidos orgnicos, antibiticos, enzimas, polmeros, etc.

La ingeniera gentica empez con los microorganismos, que
siguen desempeando un papel fundamental en la nueva
generacin de medicamentos recombinantes y de terapias
novedosas

En su aspecto perjudicial, la Microbiologa dedica una especial
atencin a los microorganismos patgenos, sobre todo a los que
afectan a la humanidad

Las enfermedades microbianas han sido causa de grandes males
a nuestra especie. Baste recordar que la peste (muerte negra)
caus a mediados del siglo XIV la muerte de la tercera parte de
la poblacin europea, y ya en la primera mitad del siglo XV
lleg a afectar a ms del 75%. Basta leer la literatura o ver las
pinturas de la poca para darse cuenta del impacto terrorfico
que supuso, lo que a su vez supuso un factor esencial en el
surgimiento de las ideas del Renacimiento.

Desde la poca del descubrimiento de Amrica, las
exploraciones han conllevado el intenso trasiego de agentes
patgenos de un lugar a otro. La desaparicin de buena parte de
la poblacin indgena se debi en buena parte a no tener
defensas frente a la viruela europea, pero a su vez los
descubridores importaron la sfilis a Europa.

No hace falta resaltar el papel que ha tenido la microbiologa
mdica, desde la poca de Pasteur y Koch, en la lucha contra las
enfermedades infecciosas (antisepsia, desinfeccin,
esterilizacin, quimioterapia). Y aunque ahora tengamos nuevos
retos (SIDA, fiebres hemorrgicas, etc.), no cabe duda de que la
Microbiologa est contribuyendo a no perder esta permanente
batalla contra los grmenes patgenos.

Aparte de todas estas actividades de los microorganismos sobre
los humanos, hay que tener en cuenta que existen grmenes que
afectan a animales, plantas, instalaciones industriales, que
afectan a alimentos, etc., representando otras tantas reas de
atencin para la Microbiologa.
5 UBICACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL
MUNDO VIVO
Tras el descubrimiento de los microorganismos, a los
naturalistas de la poca les pareci normal intentar encuadralos
dentro de los dos grandes reinos de seres vivos conocidos entonces:
animales y plantas. De este modo, a finales del siglo XVIII las algas
y los hongos quedaron en el reino Plantae, mientras que los
llamados infusorios se encuadraron en el reino Animalia.
A mediados del siglo XIX se empez a ver que esa
clasificacin era demasiado sencilla, y que el grupo de los infusorios
era muy heterogneo. En 1866 Haeckel, seguidor de Darwin,
propone un famoso rbol filogentico con tres reinos:

Animalia

Plantae

Protista: todos los seres vivos sencillos, sean o no fotosintticos o
mviles. Dentro de l consideraba los siguientes grupos:

Protozoos

Protozoos

Algas

Hongos

Moneras (=bacterias)
Pero esta clasificacin iba a ser puesta en entredicho a
mediados del siglo XX, cuando las tcnicas de microscopa
electrnica y bioqumicas demuestran la gran diferencia de las
bacterias respecto del resto de organismos. De hecho, ya en los aos
60 se reconoce que esta diferencia representa la mayor
discontinuidad evolutiva del mundo vivo. En 1974, el Manual
Bergeys (la biblia oficiosa de la clasificacin bacteriana) considera
que la clasificacin al mximo nivel del mundo vivo debe reconocer
la existencia de dos Reinos:

Procaryotae (material gentico no rodeado de membrana nuclear)

Eucaryotae (ncleo autntico)
Pero en los aos recientes, la incorporacin a la taxonoma de los
mtodos de biologa molecular, especialmente la secuenciacin de
ARN ribosmico y la genmica, estobligando a nuevos
planteamientos. Para resumir, hoy se asume lo siguiente:

Existen dos tipos de organizacin celular, la procaritica y la
eucaritica.

Dentro de los seres vivos con organizacin procaritica, existen
dos grandes dominios o imperios: Bacteria (las eubacterias o
bacterias clsicas) y Archaea (antes llamadas arqueobacterias)

A su vez, el dominio eucaritico comprende numerosas lneas
filogenticas, muchas de ellas de microorganismos. Los mismos
Protozoos es un grupo muy heterogneo, que comprende lneas
filogenticas diversas y a veces muy separadas en el tiempo
evolutivo.
.




NDICE
1 CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS
2 COMPOSICIN QUMICA BSICA DE LA CLULA
PROCARITICA
3 ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CLULA
PROCARITICA

1 CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS
Vamos a exponer los rasgos distintivos de los procariotas en
forma de tabla comparativa con los eucariotas, de modo que se
aprecien mejor los rasgos distintivos de cada tipo de organizacin
celular:
Procariotas Eucariotas
Genforo Un solo cromosoma Nucleoplasma Varios
cromosomas
ADN c.d., c.c.c.
(cadena doble,
circular cerrado
covalentemente)
ADN c.d. lineal,
terminado en
telmeros
No existe
membrana nuclear
Existe membrana
nuclear
No histonas Histonas
Replicacin del material
gentico: no mitosis
Replicacin del material gentico:
mitosis
Organizacin del citoplasma Organizacin del citoplasma
No orgnulos de
tipo eucariticos
Orgnulos
(mitocondrias,
cloroplastos,
retculo
endoplsmico,
Golgi, lisosomas,
etc)
No citosqueleto (no Citosqueleto y
corrientes
citoplsmicas)
corrientes
citoplsmicas
Ribosomas 70S Ribosomas 80S
Aparte de estos que acabamos de citar, existen otros rasgos
que, aunque no universales, caracterizan a numerosos procariotas:

Sus membrana plasmticas carecen de esteroles, salvo los
micoplasmas (pero en este caso los esteroles proceden del
hospedador eucaritico al que parasitan), algunas especies de
cianobacterias y de bacterias melitotrofas.

La movilidad no es universal, pero muchas bacterias se mueven en
medios acuticos debido a unas estructuras llamadas flagelos, que
nada tienen que ver con los flagelos eucariticos.

Las eubacterias (dominio Bacteria) poseen, salvo los
micoplasmas, una pared celular a base de una peptidoglucano (una
macromolcula que no existe en eucariotas). Muchas arqueas
(dominio Archaea) poseen pared celular, diferente a las del
dominio Bacteria.
2 COMPOSICIN QUMICA BSICA DE LA CLULA
PROCARITICA
El contenido en agua de una clula vegetativa bacteriana tpica es de
un 70%, mucho menor que el de los eucariotas (que ronda el 90%).
Una clula de Escherichia coli, creciendo de forma equilibrada
en un medio a base de glucosa y sales minerales, a 371C, tiene la
composicin:
tipo de
componente
Porcentaje
sobre peso seco
protena 55.0
ARN 20.5
ADN 3.1
Lpidos 9.1
Lipopolisacrido 3.4
Peptidoglucano 2.5
Glucgeno 2.5
total
macromolculas:
96.1
Pequeas molculas
orgnicas:
2.9
Iones inorgnicos: 1.0
Obsrvese que:

las macromolculas constituyen la porcin mayoritaria de la masa
celular (96%);

las protenas representan ms de la mitad de esta cantidad;

las bacterias poseen una proporcin de ARN superior a la de los
eucariotas;

la mayor parte de los compuestos son semejantes a los de
eucariotas, pero dentro de las macromolculas encontramos dos
que son exclusivas de los procariotas (concretamente, de
eubacterias, aunque no de todas): lipopolisacrido (exclusivo de
Gram-negativas); peptidoglucano (presente en eubacterias Gram-
positivas y Gram-negativas).
3 ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CLULA
PROCARITICA
Veamos de qu partes principales se compone una clula
procaritica (consultar la figura). Haremos una enumeracin desde
el exterior al interior celular. Los nombres en rojo indican los
componentes obligatorios de cualquier bacteria, mientras que los
dems son dispensables en el sentido de que no son universales,
sino que estn presentes en grupos ms o menos amplios de
procariotas:

cpsula o capa mucilaginosa

capa S paracristalina

vaina

botones de anclaje

pared celular

protoplasto, que a su vez se compone de

membrana citoplsmica (que puede tener o no invaginaciones)

citoplasma, que incluye:

genforo, constituido por

un cromosoma

en algunas especies, uno o varios plsmidos (elementos
genticos extracromosmicos)

ribosomas

inclusiones

orgnulos

Pueden existir, adems, apndices filamentosos:

Flagelos

Fimbrias (= pelos)

Imagen "idealizada"
de la estructura de
una clula
procariota, con
algunos de sus
componentes ms
caractersticos.
En los prximos temas abordaremos el estudio de estos
componentes de la clula procaritica, centrndonos en su
composicin qumica, estructura y sus funciones o papeles.


1 TAMAO DE LOS PROCARIOTAS
1.1 Consecuencias del pequeo tamao de las bacterias
2 FORMA
3 AGRUPACIONES BACTERIANAS
4 FENMENOS DE MULTICELULARIDAD EN BACTERIAS

1 TAMAO DE LOS PROCARIOTAS
El tamao es un parmetro que est determinado
genticamente, pero los valores concretos para cada raza o cepa de
bacterias vienen influidos por una serie de condiciones ambientales
(nutrientes, sales, temperatura, tensin superficial, etc).

Las bacterias suelen presentar un pequeo tamao, por lo
general menor que el de una clula eucaritica tpica. (Obsrverse en
el esquema la comparacin entre el tamao de una bacteria tpica
como Escherichia coli (0.5 x 2 m) y el de una clula eucariota).
Sin embargo, existe un amplio rango de tamaos, segn las especies:

Una bacteria grande es Beggiatoa gigantea, con un tamao similar
al de muchas clulas eucariticas (40 m).

Sin embargo, los autntico gigantes entre las bacterias se han
descubierto hace poco:

En 1993 se desubri una bacteria que mide 0,5 mm de longitud.
Se trata de Epulopiscium, un comensal del intestino del pez
cirujano.

En 1999 se descubri en un lago de Namibia una bacteria (a la
que se bautiz como Thiomargarita) que alcanza los 700 m.

Bacillus megaterium mide 1.3 x 3 m.

Una bacteria relativamente pequea es Haemophilus influenzae,
que mide 0.25 x 1.2 m.

Los organismos celulares cultivables ms pequeos que existen
son los micoplasmas, muchos de los cuales no superan los 0.2 m
de dimetro.

Las nanobacterias o ultramicrobacterias miden en torno a 0.05 m,
pero la mayora no se han podido cultivar, y slo se pueden
estudiar al microscopio.
1.1 Consecuencias del pequeo tamao de las bacterias:
Metodolgicas:

Se necesita recurrir a microscopios para su visualizacin, y
emplear tcnicas especiales adecuadas al pequeo tamao;

Para sacar conclusiones sobre muchas caractersticas de las
bacterias hay que hacer estudios promediados, es decir,
obtenidos a partir de una gran poblacin de clulas, y no sobre un
solo individuo. (El estudio de clulas bacterianas aisladas es
posible, pero es complicado y no se emplea en la mayor parte de la
investigacin habitual sobre procariotas).
Propiedades fsicas: se derivan del comportamiento como partculas
coloidales:

movimiento browniano (movimiento aleatorio derivado del
empuje de molculas de agua alrededor de la bacteria);

capacidad de dispersar la luz (el llamado efecto Tyndall). Por esta
razn, las suspensiones acuosas relativamente densas de bacterias
tienen una apariencia turbia (traslcida);

aumentan la viscosidad del medio donde van suspendidas.
Por tener carga elctrica: migran en un campo elctrico y aglutinan y
precipitan a altas concentraciones de sales.
Propiedades biolgicas:


La relacin superficie/volumen (S/V) es muy alta. En efecto,
supongamos una clula esfrica; en dicha clula, la relacin S/V es
3/r, (la superficie de una esfera es 4r
2
mientras que su volumen es
4/3r
3
). O sea, cuanto menor sea el radio (r) mayor ser esta
relacin. Esto significa que el pequeo tamao de las bacterias
condiciona un mayor contacto directo con el medio ambiente
inmediato que las rodea, lo que se traduce en que reciben las
influencias ambientales de forma inmediata.

El pequeo tamao condiciona una alta tasa de crecimiento. La
velocidad de entrada de nutrientes y la de salida de productos de
desecho es inversamente proporcional al tamao de la clula, y a
su vez, estas tasas de transporte afectan directamente a la tasa
metablica. Por lo tanto, en general, las bacterias crecen (se
multiplican) de forma rpida.
2 FORMA

Los principales tipos de formas bacterianas son:

cocos (clulas ms o menos esfricas);

bacilos (en forma de bastn, alargados),

que a su vez pueden tener varios aspectos:

cilndricos

fusiformes

en forma de maza, etc.

Atendiendo a los tipos de extremos, stos pueden ser:

redondeados (lo ms frecuente)

cuadrados

biselados

afilados

espirilos: al igual que los bacilos, tienen un eje ms largo que otro,
pero dicho eje no es recto, sino que sigue una forma de espiral, con
una o ms de una vuelta de hlice.

vibrios: proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de
coma, pero en el espacio suelen corresponder a una forma espiral
con menos de una vuelta de hlice.

Otros tipos de formas

filamentos, ramificados o no

anillos casi cerrados

formas con prolongaciones (con prostecas)
Estos distintos tipos de morfologas celulares deben de haberse
originado por mecanismos evolutivos, a saber, por seleccin y
estabilizacin adaptativa frente a las distintas presiones ambientales
presentes en diferentes nichos ecolgicos.
Relaciones entre tamao y forma

Difusin citoplsmica: Este aspecto lo ilustraremos con una
bacteria tpica de forma bacilar. Una protena de unos 50 kDa
difundira desde la periferia del citoplasma al eje longitudinal en
menos de medio segundo, mientras que si difundiera desde un polo
de la clula al opuesto, tardara unos 5 segundos. Como vemos, el
tiempo de difusin es muy breve.

Difusin desde el medio exterior: el entorno inmediato de las
bacterias es bastante peculiar, debido al bajo valor de nmero de
Reynolds que poseen.
El nmero de Reynolds (R) es un parmetro muy empleado en
Ingeniera y Arquitectura para expresar la tensin o estrs que
soporta una estructura determinada inmersa en el medio local
que la sustenta. R equivale a la relacin entre la fuerza de
inercia y fuerza de friccin
Teniendo en cuenta la masa y velocidad de movimiento de una
bacteria como E. coli:
m = 10
-12
g
v = 30 m/s
tenemos que el valor R para esta bacteria es de 10
-5
.
De aqu se deduce que la inercia es irrelevante, mientras que
predominan las fuerzas viscosas. Por lo tanto, las bacterias
llevan, en su avance, un entorno local debido a la resistencia
por viscosidad. Este entorno es una fase fluida cuya forma
reproduce, ampliada, la forma de la bacteria en cuestin.
Mejora en las propiedades hidrodinmicas o de flotacin:
Es posible que la forma tambin tenga relacin con
propiedades hidrodinmicas. Por ejemplo, las bacterias
mviles raramente son esfricas; la forma ptima sera aqu la
bacilar. De hecho, existen pocos casos de cocos flagelados.

Como veremos oportunamente, existe un grupo de bacterias
alargadas pero con morfologa espiral y que estn muy bien
adapatadas a avanzar en medios muy viscosos. Esta
morfologa de las espiroquetas ha debido ser seleccionada
evolutivamente precisamente por este factor ecolgico.

Por otro lado, las formas con prostecas, prolongaciones, las
morfologas en disco o en lmina parecen estar
especializadas en facilitar la flotacin.

Las bacterias adoptan formas en las que optimizan la
relacin S/V, y por consiguiente su entorno local. Veamos
algunos ejemplos de valores S/V:

los menores valores los poseen las bacterias esfricas
(cocos), en las que S/V = 5.8. La forma esfrica permite
una mayor resistencia frente a la desecacin;

los bacilos alcanzan valores de S/V de alrededor de 10;

las formas espirales y las bacterias con prolongaciones
vivas (prostecas) tienen valores mayores que los de los
bacilos;

la mejor relacin S/V conocida (de 16) la posee la curiosa
bacteria cuadrada de Walsby.
3 AGRUPACIONES BACTERIANAS
Las bacterias normalmente se multiplican por fisin transversal
binaria. En muchas especies, las clulas hijas resultantes de un
evento de divisin por fisin tienden a dispersarse por separado al
medio, debido a la actuacin de fuerzas fsicas (movimiento
browniano, cizallamiento, corrientes de conveccin, etc). Esto hace
que al observar al microscopio una poblacin de estas bacterias
veamos mayoritariamente clulas aisladas. Pero en algunas especies
las clulas hijas pueden permanecer unidas entre s (al menos
durante un cierto tiempo tras la divisin de la que proceden) debido
a que el tabique sea incompleto o a la existencia de capas mucosas
que retienen juntos los productos de la divisin.
Si la tendencia a permanecer unidas es baja, tendremos
agrupaciones de dos clulas, que dependiendo que sean de
morfologa esfrica o alargada, se denominan como:

diplococos

diplobacilos
Si la tendencia a permanecer unidas es mayor (por ms
tiempo), nos encontramos con varias posibilidades, dependiendo del
nmero de planos de divisin y de la relacin entre ellos:

Si los tabiques son paralelos entre s (o sea, existe un solo plano de
divisin): estreptococos (cadenetas arrosariadas de cocos) y
estreptobacilos (cadenetas de bacilos).

Si existe ms de un plano de divisin, en el caso de cocos
podemos encontrar tres posibilidades:

dos planos perpendiculares: ttradas (4 cls. en un plano) o
mltiplos;

tres planos ortogonales: sarcinas (paquetes cbicos);

muchos planos de divisin: estafilococos (racimos irregulares).
En el caso de bacilos, se pueden dar variantes adicionales, debido a
la posibilidad de que se produzcan movimientos postfisionales (en
algunos casos con desgarro):

bacilos en empalizada o en paquetes de cigarrillos (debido a
giros de 180
o
)

dos bacilos en ngulo (en forma de letra V o L)

varios bacilos formando letras chinas.
4 FENMENOS DE MULTICELULARIDAD EN BACTERIAS
Ciertos grupos de bacterias exhiben una pluricelularidad
incipiente, de modo que se dan conjuntos de clulas asociadas
permanentemente. En muchos casos, dentro de estos grupos
celulares existen formas celulares diferenciadas y especializadas.
Por supuesto, en ninguna instancia se puede hablar de diferenciacin
de tejidos (algo exclusivo de eucariotas).

Mixobacterias. Como estudiaremos oportunamente, se trata de
bacterias con dos fases dentro de su ciclo de vida: una fase a base
de enjambres donde todas las clulas se mueven
coordinadamente, y otra fase a base de cuerpos fructificantes en
los que se aloja un tipo especializado de clula llamado
mixospora.

Filamentos (= tricomas) de ciertos grupos de Cianobacterias.
En ellos las clulas vegetativas individuales estn unidas entre s
por puentes citoplasmticos (permitiendo, por tanto, comunicacin
intercelular). Ciertas cianobacterias filamentosas poseen, adems,
clulas especializadas (heteroquistes, aquinetos). Los filamentos
no son exclusivos de cianobacterias, ya que tambin se dan en
ciertas bacterias Gram-negativas no fotosintticas.

Cuerpos circulares del gnero Thermus: unas 14 clulas se
encuentran englobadas por una pared externa comn.

Filamentos cenocticos ramificados de los Actinomicetos:
constituyen las denominadas hifas (por analoga con las de los
hongos), que a su vez originan micelios.

Cuerpos
fructificantes de A)
Myxococcus fulvus;
(B) Stigmatella
aurantiaca; y (C)
Chondromyces
crocatus. S.
aurantiaca mide
unas 150 micras.
(De M. Dworkin,
Microbiol Rev,
60:70-102, 1996)

Micrografas
electrnicas de
barrido de cuerpos
fructificantes de
Myxococcus
xanthus. A la
derecha se puede
ver detalle de un
cuerpo abierto,
mostrando la
disposicin de las
mixosporas.


NDICE:
1 CPSULA
1.1 CONCEPTOS GENERALES
1.2 MTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO
1.3 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA
1.4 FUNCIONES
1.4.1 PROPIEDADES O PAPELES GENERALES
1.4.2 PROPIEDADES PARTICULARES
2 CAPA S (CAPA SUPERFICIAL PARACRISTALINA)
3 VAINAS
4 BOTONES DE ANCLAJE
BIBILIOGRAFA

1 CPSULA
1.1 CONCEPTOS GENERALES
La cpsula se puede definir como una estructura superficial
que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales,
consistente en acumulacin de material mucoso o viscoso, situado
externamente respecto de la pared celular (o, en su caso, respecto de
la capa S y de la vaina). Las cpsulas se pueden describir en funcin
de:

su grado de asociacin con la superficie celular subyacente (sobre
todo pared):0

Integral: ntimamente asociada con la superficie celular, a saber,
con la P.C.

Perifrica: asociada a la sup. celular slo en determinadas
condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior.

su consistencia y sus lmites externos:

Rgida: con suficiente consistencia estructural como para evitar
la entrada de partculas como las de tinta china o nigrosina. Suele
tener un lmite exterior definido.

Flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partculas.
Adems, es deformable y carente de lmites precisos.
Hay una cierta confusin en la nomenclatura de las cpsulas.
Nosotros usaremos los siguientes conceptos:

Cpsulas en sentido estricto son aquellas de tipo rgido e
integral.

Capas mucilaginosas son las de tipo flexible y perifrico.

Glucoclix es el conjunto de estructuras superficiales bacterianas,
exteriores respecto de la pared celular, y compuestas de
polisacrido.
Las cpsulas son estructuras inertes, no vivas, carentes de
papel activo (metablico), pero que confieren a las bacterias
importantes propiedades:

Adhesin a clulas hermanas, generando microcolonias y
consorcios.

Adhesin a sustratos inertes o vivos, lo que les permite `la
colonizacin de sus nichos ecolgicos (p. ej., tejidos de
organismos superiores)

Proteccin contra agentes antibacterianos.
1.2 MTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO
Su observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya
que su ndice de refraccin es similar al del medio. Al ser una
estructura muy hidratada (99% de agua), su observacin con las
tcnicas habituales de microscopa electrnica de transmisin
(MET) y de barrido (MEB) revela una notable contraccin de su
estructura. Adems, los colorantes habituales tienen poca afinidad
hacia ella.

Imagen a microscopa ptica de la
cpsula del neumococo (Streptococcus
pneumoniae)

A microscopa ptica: Se recurre a tincin negativa por medio de
nigrosina o tinta china (resaltan como un halo transparente sobre el
fondo oscuro del porta).

A microscopa electrnica: Hay que recurrir a la estabilizacin
previa de la estructura capsular (para evitar su contraccin ulterior)
por medio de anticuerpos anticapsulares o de lectinas. Tras esta
operacin, se procede a la tincin por una ferritina catinica (p. ej.,
el rojo de rutenio), con afinidad hacia polianiones.
Para investigar ms sobre la estructura de la cpsula se recurre
igualmente a difraccin de rayos X del polisacrido capsular.
Aislamiento del material capsular:

El material de las capas mucosas (es decir, de las cpsulas
flexibles y perifricas) es muy fcil de aislar, ya que tiende a
dispersarse continuamente en el medio de cultivo. Por lo tanto, se
puede aislar directamente de los sobrenadantes resultantes de la
centrifugacin del cultivo correspondiente.

El material de las cspulas rgidas e integrales puede aislarse
tratando al cultivo con agua caliente o con cidos o lcalis dbiles.
1.3 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA
En general, el material capsular se compone de
macromolculas asimtricas que, en muchos casos constan de una
serie de unidades repetitivas: polisacridos o polipptidos.
1) cpsulas polisacardicas
a) Heteropolisacridos aninicos, cuyas unidades repetitivas
constan de azcares (osas), aminoazcares, cidos urnicos,
polioles (en muchos casos con radicales fosfato, formiato,
succinato, etc.).
b) Homopolisacridos neutros, como
i) levanos (polmeros de unidades de fructosa unidas por |(2
6)
ii) dextranos
iii) celulosa
c) alginatos (p. ej., en Azotobacter, Pseudomonas), consistentes
en una alternancia de distintos tipos de cidos urnicos.
2) cpsulas polipeptdicas (slo encontradas en el gnero Bacillus).
Estn formadas por glutamil-polipptidos. As p. ej., en B.
anthracis el pptido es slo de D-glutmico.
Las cpsulas y capas mucilaginosas bacterianas constituyen el
llamado antgeno K (capsular). Una misma especie puede constar
de distintas razas, cada una de ellas con un Ag K distintivo,
distinguible del de las dems por su composicin qumica y su
inmunorreactividad. Por ejemplo, en Escherichia coli se encuentran
unos 70 tipos diferentes de especificidades de Ag K.
Las cpsulas polisacardicas estn unidas a la superficie
subyacente, sobre todo a la pared celular.
La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una
ordenacin regular radial, o a veces, en lminas concntricas.
1.4 FUNCIONES
En laboratorio, muchas bacterias suelen perder la capacidad de
formar cpsulas al cabo de varios subcultivos. As pues, la posesin
o no de cpsula es algo que no afecta a la viabilidad de las bacterias.
Pero en medios naturales, las cpsulas confieren a las bacterias una
serie de propiedades, que dependen del nicho ecolgico particular
donde viva cada bacteria. Estudiaremos una serie de propiedades o
papeles generales, comunes a todas las cpsulas, para concluir con
algunos ejemplos de papeles especficos.
1.4.1 PROPIEDADES O PAPELES GENERALES
1) Mejora en las propiedades de difusin de nutrientes hacia la
clula. Los polisacridos extracelulares aninicos funcionan
como una resina de intercambio.
2) Proteccin contra la desecacin
3) Proteccin contra la predacin por parte de protozoos.
4) Proteccin contra agentes antibacterianos:
a) contra metales pesados
b) contra bacterifagos
c) contra clulas fagocticas (p. ej., la cpsula del neumococo)
d) contra detergentes
e) contra anticuerpos
5) Adhesin a sustratos:
a) sobre sustratos inertes: propiedad importante, sobre todo en
medios acuticos. La mayora de las bacterias acuticas no son
planctnicas, sino que viven en interfases (superficies,
sedimentos), donde los nutrientes difunden mejor. Veamos
cmo se produce el proceso:
i) la bacteria se adhiere por la cpsula al sustrato;
ii) la cpsula supone un aumento de superficie bacteriana, lo
que se traduce en una mejora en la capacidad de absorber
nutrientes;
iii) la bacteria se multiplica, formndose una microcolonia
donde los individuos estn ms protegidos frente a los
agentes antibacterianos;
iv) se forman consorcios con otros microorganismos. Ello
permite una alianza o colaboracin metablica entre
distintas especies, por la que se produce la degradacin
concertada de sustratos insolubles.
Esta propiedad tiene una serie de importantes secuelas
econmicas:
- corrosin y obstruccin de caeras;
- formacin de placa dental y caries;
- formacin de biopelculas en catteres y prtesis
quirrgicas
b) sobre sustratos vivos (tejidos de organismos superiores):
i) En sistemas normales (efectos benficos): La flora (=
microbiota) autctona que coloniza los epitelios de los
animales superiores est englobada en glucoclix, estando
las bacterias adheridas a la superficie tisular. Es decir, las
cpsulas pueden actuar como adhesinas (molculas para la
adhesin). Otro ejemplo de ello lo da la microflora
autctona de la simbiosis del rumen
ii) En sistemas patolgicos: La cpsula es uno de los factores
de virulencia, de los que depende el inicio de muchas
infecciones por parte de bacterias patgenas. Si, adems, la
flora autctona del individuo afectado est alterada o
disminuida, esto supone un nicho ecolgico vaco o
perturbado, que puede ser colonizado por bacterias
patgenas, en parte gracias a su glucoclix, que adems las
protege frente a surfactantes, clulas fagocticas,
anticuerpos, etc. Muchas cpsulas polisacardicas no son
reconocidas como material extrao por el sistema inmune,
debido a que su estructura mimetiza estructuras del propio
hospedador. Otras cpsulas sobrapasan la capacidad de
respuesta del sistema inmune, o bien no activan
eficientemente al sistema complemento.

Imagen animada que muestra el
modo en que la cpsula
bacteriana evade la accin del
complemento del hospedador
mamfero: El componente C3b
del complemento tiende a fijarse
sobre la superficie bacteriana,
pero esto es ms difcil si la
bacteria posee cpsula. Por otro
lado, la clula fagoctica, provista
del receptor para C3b no puede
interacionar bien con la bacteria,
de modo que se evita la
fagocitosis.
1.4.2 PROPIEDADES PARTICULARES
Entre las propiedades conferidas por las cpsulas a algunas bacterias
tenemos:
1) Como receptores para ciertos bacterifagos.
2) En las bacterias tropicales fijadoras de N
2
atmosfrico, de los
gneros Derxia y Beijerinckia la gruesa y espesa cpsula acta
como barrera frente a la difusin de O
2
, con lo cual evitan la
inactivacin de la enzima nitrogenasa.
3) En Rhizobium (fijador de N
2
en simbiosis con las races de
leguminosas) el polisacrido extracelular acta en la fase de
reconocimiento entre la bacteria y la planta especfica, a travs de
lectinas de esta ltima.
4) En Acetobacter xylinum la cpsula es a base de fibrillas de
celulosa que retienen burbujas de aire, lo cual hace que la bacteria
flote hasta su nivel adecuado.
2 CAPA S (CAPA SUPERFICIAL PARACRISTALINA)
Capa que, en muchas eubacterias (sobre todo Gram-positivas),
envuelve a la pared celular, formada por el ensamblaje regular de
subunidades idnticas de protenas o glucoprotenas. En Gram
negativas la capa S se une a la membrana externa, mientras que el
Gram positivas lo hace al peptidoglucano. En muchas Arqueas es la
nica capa que rodea al protoplasto, por lo que en ellas cumple
funciones de autntica pared celular.
Disposicin unidades
morfolgicas
simetra binaria:
filas oblicuas
paralelas
dmeros
simetra
cuadrangular:
tetrmeros
simetra hexagonal: hexmeros
La unin entre los monmeros se realiza por enlaces no covalentes:

hidrfobos

inicos, bien directos, o por mediacin de cationes

puentes de hidrgeno
Papel:

En eubacterias provistas de pared celular. la capa S cumple varios
papeles

como tamiz molecular protector que impide la entrada de
agentes antibacterianos

Parece que en muchos casos tambin protege frente a
fluctuaciones inicas y de pH, estrs osmtico, etc.

En algunas bacterias patgenas, puede ser un factor de virulencia,
al proteger a la bacteria frente al ataque del complemento y de
los fagocitos.

En Arqueas da forma y rigidez a muchas especies, ejerciendo
papeles equivalentes al de una pared celular.

En arqueas halfilas (p. ej., Halobacterium) la capa S de
glucoprotena contiene glucopptidos especiales, y est
estabilizada por altas concentraciones de sodio, presentes en su
nicho.

En arqueas termoacidfilas (Sulfolobus) existen glucoprotenas
en matrices hexagonales, ricas en aminocidos polares (Ser, Thr),
estando la capa S estabilizada por los bajos pH del medio.
3 VAINAS
Son estructuras tubulares (ramificadas o no) compuestas de un
heteropolmero, a base de protena, lpido y polisacrido, que
engloban a conjuntos de clulas bacilares en cadenetas o filas. La
vaina est en contacto con la pared celular subyacente, pero no hay
enlaces entre ambas. En Sphaerotilus y Leptothrix las vainas se
recubren de acmulos de xidos e hidrxidos de Fe y Mn. Conforme
se dividen por fisin binaria, las clulas de los extremos del
filamento van sintetizando nuevo material de la vaina que las va
rodeando.
Las Arqueas Methanothrix y Methanospirillum poseen vainas
proteicas con subunidades dispuestas en anillos, y son las que
confieren la forma.
4 BOTONES DE ANCLAJE
Son acmulos de mucopolisacridos cidos, segregados en
puntos concretos de la clula, a nivel de pared celular, extremos de
prostecas y pednculos o de tallos inertes en algn momento del
ciclo de vida de ciertas bacterias. Facilitan la unin de las bacterias
que los poseen a sus sustratos. Como ejemplo, los discos adhesivos
(holdfast) en el extremo de las prostecas de Caulobacter .

1 INTRODUCCIN
2 PAREDES DE LAS EUBACTERIAS
2.1 EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIN QUMICA Y
ESTRUCTURA
2.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA
BSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO
2.1.2 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-
NEGATIVAS
2.1.3 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-
POSITIVAS
2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN
EN EL PEPTIDOGLUCANO
2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR
DE BACTERIAS GRAM-POSITIVAS: LA MATRIZ
2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CIDO
ALCOHOL RESISTENTES
2.5 LA PARED DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS
2.5.1 LA MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS GRAM-
NEGATIVAS
2.5.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA DE
LA MEMBRANA EXTERNA
2.5.1.1.1 Fosfolpidos (FL)
2.5.1.1.2 Lipopolisacrido (LPS)
2.5.1.1.3 La lipoprotena (LPP, lipoprotena de Braun)
2.5.1.1.4 Protenas de la membrana externa
2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA
EXTERNA
2.5.2 EL ESPACIO PERIPLSMICO
3 PAREDES DE LAS ARQUEAS
BIBLIOGRAFA

1 INTRODUCCIN
La mayor parte de los procariotas posee una pared celular
(P.C.) rgida rodeando al protoplasto. Las excepciones son los
micoplasmas (dentro del dominio Bacteria) y algunas arqueas, como
Thermoplasma.
Al microscopio electrnico se puede observar como una capa
en ntimo contacto con la membrana citoplsmica, con un espesor
que oscila entre 10 y 80 nm (segn especies) -frente a los 8 nm de la
membrana celular- , y con una estructura ms o menos compleja,
segn los tipos bacterianos.
a) Las paredes celulares ms frecuentes en eubacterias siguen dos
modelos alternativos que, como veremos comparten un
componente comn: paredes de tipo Gram-positivo o de tipo
Gram-negativo.
b) Unas pocas eubacterias (como las del gn. Planctomyces)
poseen paredes a base de protenas.
c) Las Arqueas poseen paredes diferentes a las de eubacterias y se
pueden agrupar en diversos tipos.
El grueso de este captulo est dedicado al estudio de las paredes
Gram-positivas y Gram-negativas, con sus principales variantes,
pero finalizaremos con una alusin a los principales modelos de
paredes arqueanas.
Aunque el alumno realizar en prcticas de labororatorio la
tincin de Gram, vamos a explicarla aqu brevemente. La tincin de
Gram es la ms importante entre las tinciones llamadas diferenciales
(aquellas que no tien de la misma manera a todos los tipos de
bacterias). Resumiendo, esta tincin consta de varios pasos:

1. Imaginemos un
frotis en porta de
vidrio con una
muestra de varios
tipos de bacterias,
que se han fijado
por calor. En la
primera fase, esta
preparacin de trata
con un primer
colorante llamado
violeta cristal o
violeta de genciana.
2. A continuacin se
aade una solucin
de lugol (yodo-
ioduro), que acta
como mordiente,
formando una laca
relativamente
resistente con el
violeta. En este
momento todas las
bacterias estn
teidas de color
violeta.

3. Ahora realizamos
una descoloracin
diferencial con
etanol o una mezcla
de etanol y acetona.
Lo que ocurre es
que algunas
bacterias (las que
llamaremos Gram-
negativas) pierden el
color violeta
(quedaran
prctimante
transparentes al
microscopio),
mientras que otras
(las Gram-positivas)
resisten el
tratamiento, y
retienen el colorante
violeta.
4. Finalmente, tratamos
el porta con un
segundo colorante
(colorante de
contraste): se trata
de un colorante de
color rojo o rosa,
como la fucsina o la
safranina. Este
colorante tie ahora
a las bacterias
previamente
descoloradas por el
etanol. Por lo tanto,
el resultado en la
observacin al
microscopio es que
las bacterias Gram-
positivas se ven de
color violeta, y las
Gram-negativas de
color rosa o rojo.
Como veremos enseguida, esta diferencia de comportamiento ante la
tincin de Gram refleja el hecho de que ambos tipos de eubacterias
poseen dos tipos estructuralmente diferentes de pared celular,
aunque ambas posean en comn la posesin de peptidoglucano. A
continuacin estudiaremos con cierto detalle la pared celular de
eubacterias.
2 PAREDES DE LAS EUBACTERIAS
Consisten en un
esqueleto
macromolecular rgido,
llamado
peptidoglucano (=
mucopptido o
murena), que

en Gram-positivas se
encuentra inmerso en
una matriz aninica
de polmeros
azucarados;


y en Gram-negativas
est rodeada por una
membrana externa, e
inmersa en un
espacio periplsmico.
Comenzaremos abordando esa macrolcula tan peculiar llamada
peptidoglucano, para despus estudiar globalmente y por separado la
pared de Gram-positivas y Gram-negativas, con algunas variantes
que se pueden presentar.
2.1 EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIN QUMICA Y
ESTRUCTURA
En las bacterias Gram-positivas el peptidoglucano representa
el componente mayoritario de la pared celular (50-80% en peso),
mientras que en Gram-negativas supone slo del 1 al 10%.
2.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA BSICAS
DEL PEPTIDOGLUCANO
Est formado por repeticiones de una unidad disacardica
fundamental unida a su vez a un tetrapptido. Distintas cadenas
(formadas por el esqueleto de azcares) se unen entre s por
determinados enlaces peptdicos entre tetraptidos de cadenas
diferentes. Veamos todo ello en su concrecin qumica:
La unidad disacardica repetitiva: consiste en N-
acetilglucosamina (NAG) unida por enlace (14) a N-
acetilmurmico (NAM). Obsrvese que el NAM es el 3-O-D-lactil-
ter de la NAG (o sea, se deriva de unir el cido D-lctico con el OH
del C-3 de la NAG).
Las distintas unidades disacardicas se van uniendo entre s por
enlaces (14) entre el NAM de una unidad y la NAG de la
siguiente. Este enlace es susceptible a la rotura catalizada por el
enzima lisozima. El nmero de repeticiones (n) puede oscilar entre
10 y 100.
La cadena tetrapeptdica: Desde el grupo carboxilo de cada cido
NAM, y mediante un enlace amido, se encuentra unido el
tetrapptido. Un tetrapptido tpico de muchas bacterias es:
L-alanina---D-glutmico---meso-diaminopimlico---D-alanina
Obsrvese la alternancia de aminocidos D y L en el tetrapptido.

La estructura global: Las distintas cadenas polisacardicas, con sus
respectivos tetrapptidos, se unen entre s por medio de puentes o
enlaces peptdicos, entre un aminocido de una cadena (p. ej., el
aminocido n3, como el meso-DAP del ejemplo) y otro aminocido
de una cadena adyacente (la D-ala terminal). De este modo, la
estructura global es una sola macromolcula gigante que envuelve
al protoplasto, formando un sculo rgido, a modo de tejido
continuo, que tiene el volumen y la forma de la bacteria respectiva.


En bacterias Gram-negativas este sculo est formado por una sola
capa (o unas pocas) de cadenas de PG.

En Gram-positivas existen varias capas (hay varios niveles de PG).
A continuacin describiremos por separado el PG de Gram-
positivas y Gram-negativas, dando indicaciones de sus principales
variantes.
2.1.2 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-
NEGATIVAS
En la mayor parte de Gram-negativas el peptidoglucano
corresponde a la composicin y estructura que acabamos de
describir. Sin embargo, en las espiroquetas, el diaminocido en
posicin 3, en vez de ser meso-DAP, est sustituido por la L-ornitina
(que tambin es un diaminocido).
El enlace entre cadenas polisacardicas se realiza normalmente
mediante unin peptdica directa entre el grupo carboxilo de la
D-ala terminal y el grupo c-amino del meso-DAP. Ahora bien, en
este enlace participan solamente el 50% de los tetrapptidos. Los
dems pptidos no participan en enlaces, y entre estos ltimos se
encuentran incluso dipptidos y tripptidos.
El resultado es una capa simple de PG (de 1 nm de espesor), a
modo de malla floja, y con grandes poros (los huecos dejados por
las zonas donde no hay enlace peptdicos). Ello explica el
comportamiento de las bacterias Gram-negativas en la tincin de
Gram: al aadir el alcohol, se produce una deshidratacin que tiende
a contraer la estructura del PG, pero los poros son grandes y por
ellos sale el primer colorante (el violeta de genciana). El ulterior
tratamiento de la preparacin con el colorante de contraste (fuchsina
o safranina) tie a estas bacterias de rojo.
2.1.3 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-
POSITIVAS
Es ms variado que el de Gram-negativas, sobre todo en
funcin de ciertas variantes en la composicin del tetrapptido y
del tipo de enlaces entre los tetrapptidos.

Variantes en composicin del tetrapptido:

En bacterias Corineformes:

el grupo -CO- en o del D-glu (2) puede estar amidado o unido a
una glicina (Gly);

el aa (1) puede ser Gly o L-Ser, en lugar de la L-ala;

el hidroxilo en 6 del NAM puede estar acetilado, lo que hace
que el PG de estas bacterias sea resistente a la lisozima.

Muchas bacterias Gram-positivas carecen de meso-DAP (3), y
en su lugar puede existir:

LL-DAP

L-diaminobutrico (DAB)

L-lisina

L-homoserina

L-ornitina

Modalidades de uniones interpeptdicas:

enlace directo entre la D-ala(4) y el -NH
2
libre del diaminocido
en (3)

enlace D-ala(4)--X--diaminocido(3), donde X representa un
puente, que puede consistir en:

un solo aminocido: L-ala, o D-iso-Asn

un pptido corto:

{L-ala--L-ala}

{L-ala}
3


{L-ala}
3
-- L-ornitina

{Gly}
5


enlace D-ala(4) ---{mismo tetrapptido}--- diaminocido (3)

enlace entre D-ala(4) y el D-glu(2) (y no el aa en 3), por medio
de un pptido en el que debe de existir obligatoriamente un
diaminocido (p. ej., D-lys, D-ornitina).
Desde el punto de vista estructural, el PG de Gram-positivas se
caracteriza por la existencia de mltiples capas, existiendo
entrecruzamientos tanto entre cadenas adyacentes en el mismo nivel
como entre niveles distintos. El resultado es una red tridimensional
gruesa (hasta 50 capas en algunos Bacillus), y ms compacta que en
Gram-negativas. De todas formas, el grado de compacidad vara
entre especies, y depende de:

n de NAM que contengan tetraptidos que participen en
entrecruzamientos;

longitud del puente peptdico
Ello condiciona a su vez la intensidad de la gram-positividad en la
tincin de Gram.
2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN EN
EL PEPTIDOGLUCANO
La arquitectura molecular del sculo de murena est an sujeta
a debate. Sin embargo, uno de los modelos recientes ms aceptado
se podra resumir de la siguiente manera:

Los resultados de difraccin de rayos X parecen indicar que las
unidades disacardicas de las cadenas estn giradas unas respecto
de otras, formando una estructura helicoidal de orden 4 o 5. A
resultas de ello, los pptidos protruyen alternativamente: hacia
arriba, a la izquierda, hacia abajo, a la derecha, y vuelta a empezar,
etc. Esta organizacin permite que una cadena de PG se pueda unir
con cadenas cercanas de su mismo nivel, as como con cadenas
por encima y por debajo de su nivel, formando un perfecto
entramado tridimensional (al menos en las Gram-positivas).

La orientacin de las cadenas azucaradas en relacin con la
superficie celular an est debatida. Parece que se disponen casi
paralelas a la superficie celular, con una tendencia a una forma
espiral por encima de la membrana citoplsmica. Si consideramos
una bacteria de forma bacilar, esta espiral cerrada se dispone
siguiendo el permetro circular (y no siguiendo el eje longitudinal).
Los grupos tetrapeptdicos salen perpendicularmente de los NAM,
en sentido vertical hacia la membrana. Sin embargo, cuando dos
tetraptidos de un nivel se unen entre s, forman un puente casi
horizontal, formando ngulos de unos 90
o
repecto de los
esqueletos carbonados, y siguiendo el eje longitudinal de la clula.
Esta estructura confiere una serie de importantes propiedades:
1) Gran rigidez, que contrarresta las fuerzas osmticas a que est
sometido el protoplasto (aguanta presiones de unas 5 a 15
atmsferas). Esta rigidez depende de:
a) el grado de entrecruzamiento;
b) el hecho de que el enlace (1 4) es muy compacto. La
alternancia regular entre anillos piransicos de NAG y de
NAM genera uno de los polisacridos ms estables desde el
punto de vista termodinmico, que recuerda en su estilo a la
quitina y a la celulosa;
c) la alternancia en el tetrapptido, de aminocidos en
configuraciones D y L supone una factor adicional que
confiere an ms fuerza estructural, y adems permite que
todas las cadenas laterales de estos aminocidos se dispongan
hacia el mismo lado, facilitando la formacin de puentes de H.
2) Pero, al mismo tiempo, la estructura permite una notable
flexibilidad. Ello colabora, junto con su rigidez, a soportar
variaciones amplias de la tensin osmtica del protoplasto.
3) Condiciona la forma celular. Aunque la qumica del PG, por s
misma, no determina la forma, es su disposicin espacial la
responsable principal de esta forma.
2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE
BACTERIAS GRAM-POSITIVAS: LA MATRIZ
Como ya dijimos, el PG de las bacterias Gram-positivas se
encuentra inmerso en una matriz, que puede representar hasta el
50% del peso de la pared celular, y que est constituida por largos
polmeros denominados cidos teicoicos, pudiendo existir tambin
(o en su lugar) los cidos teicurnicos y los lipoteicoicos. Estos
componentes llegan a sobresalir de la superficie celular y
suministran especificidad antignica.

cidos teicoicos:
Estn presentes en muchas bacterias Gram-positivas, pero no
en todas. Son polmeros de hasta 30 unidades de glicerol-fosfato o
ribitol-fosfato, unidas entre s por enlaces fosfodister, en los que la
mayora de los grupos -OH estn sustituidos por -H, azcares,
aminoazcares o D-alanina.
Los cidos teicoicos estn unidos covalentemente al
peptidoglucano, concretamente al -OH en posicin 6 del NAM, a
travs de una unidad de enlace, variable segn las especies. (Por
ejemplo, en una especie de Micrococcus, el elemento de enlace
consiste en {glicerol-P}
3
--NAG-P).
cidos teicurnicos:
Ciertas bacterias Gram-positivas, cuando se someten a un
rgimen de limitacin de fosfato son incapaces de sintetizar cidos
teicoicos, pero en su lugar producen cidos teicurnicos. Los
teicurnicos consisten en polmeros aninicos formados por la
alternancia de cidos urnicos (que tienen grupos -COOH libres) y
aminozcares como la N-acetil-galactosamina.
cidos lipoteicoicos:
Estn presentes en todas las bacterias Gram-positivas, aun en
condiciones de carencia de fosfato. Se trata simplemente de cidos
glicerol-teicoicos que se encuentran unidos a la membrana
citoplsmica, concretamente se unen por enlace fosfodister con
glucolpidos de membrana, mientras que el otro extremo de la
cadena queda expuesto al exterior.
En Streptococcus pyogenes las cadenas de lipoteicoicos se
encuentran asociadas con la llamada protena M, originando una
microfibrillas que sobresalen notablemente hacia el exterior celular
(observables a microscopio electrnico), y que facilitan la unin a
las clulas de animales en que parasitan estas bacterias.
Funciones de los polmeros de la matriz:

Parece ser que su papel principal es suministrar una carga neta
negativa a la pared celular, lo que permite captar cationes
divalentes (p. ej., Mg
++
), que a su vez se necesitan para muchas
actividades enzimticas de la membrana citoplsmica o del
espacio periplsmico, que participan de la morfognesis y divisin
de la pared celular.

Como ya dijimos, los cidos teicoicos y teicurnicos son buenos
antgenos. Cuando no estn cubiertos por estructuras ms externas
(como cpsulas), constituyen el antgeno somtico O de las
bacterias Gram-positivas.

Finalmente, en algunas bacterias, sumistran, junto con el PG,
receptores especficos para la adsorcin de ciertos bacterifagos.
2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CIDO
ALCOHOL RESISTENTES
Determinadas bacterias Gram-positivas (corineformes,
Nocardia y, en especial Mycobacterium) presentan una pared celular
muy compleja, con abundancia de lpidos (algo excepcional entre
las Gram-positivas).
Estas bacterias no se tien con los colorantes normales, pero
una vez que se han teido con fucsina (forzando mediante
calentamiento de la preparacin), tienen resistencia a decolorarse
por una mezcla de cido clorhdrico al 3% en etanol de 96
o
. Por ello
se denominan como bacterias cido-alcohol resistentes. Esta
propiedad depende esencialmente de la presencia, en su pared
celular de unos lpidos llamados cidos miclicos.
Qumicamente, esta pared celular consiste en un esqueleto
formado por dos tipos de polmeros, unidos covalentemente entre s:

un peptidoglucano especial (la diferencia ms importante es que en
vez de N-acetil murmico existe N-glucolil-murmico);

un arabinogalactano de gran peso molecular.

Ambos polmeros se encuentran enlazados a travs de fosfodister
entre una unidad de murmico y una de las arabinosas. Pero a su
vez, este esqueleto se une covalentemente a los cidos miclicos.
Los cidos miclicos son -hidroxicidos grasos ramificados
en o , cuya longitud de cadena es grande (desde C
78
a C
91
en
Mycobacterium). Estn unidos al esqueleto de la P.C. de forma
uniforme, a travs de enlaces con los -OH en 5 de las unidades de
arabinosa.
Por lo tanto, el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en:
peptidoglucano---arabinogalactano---cidos miclicos.
Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias
cido-alcohol resistentes exhibe una variedad de lpidos:
1) Glucolpidos:
a) Micolatos de trehalosa: dos unidades de trehalosa unidas
entre s por enlace o (11), y en donde los grupos 6 y 6
estn unidos con cidos miclicos. Constituyen el llamado
factor de crecimiento en cuerdas, debido a que son
responsables de la agregacin de los individuos bacterianos en
forma de cuerdas.
b) Sulfolpidos de trehalosa: estn localizados en la periferia de
la P.C., y parecen ser impartantes factores de virulencia. En
Mycobacterium tuberculosis (el bacilo de la tuberculosis) estos
sulfolpidos de trehalosa funcionan como evasinas, es decir,
facilitan el que la bacteria escape a la accin de los macrfagos
inhibiendo la fusin del fagosoma con el lisosoma, lo cual
puede explicar el hecho de que estosmicroorganismos tengan
xito como parsitos intracelulares.
c) Micsidos: Localizados en la periferia, consisten en la unin
por enlace ster entre cidos miclicos y azcares (incluyendo
cidos urnicos, desoxiosas, aminozcares, etc.).
2) Ceras: Unin de cidos miclicos con ftioceroles (alcoholes
ramificados de alto peso molecular: C
30
- C
34
).
El alto contenido en lpidos confiere una serie de propiedades a estas
bacterias (aparte de la cido-alcohol resistencia ya citada):

aspecto y consistencia crea de sus colonias;

crecen formando grumos en medios lquidos;

gran impermeabilidad de la P.C., que a su vez condiciona una gran
resistencia a la desecacin y gran resistencia a sustancias
antibacterianas (detergentes, oxidantes, cidos, bases, etc).
2.5 LA PARED DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS
La pared de las bacterias Gram-negativas es estructuralmente
ms compleja que la de Gram-positivas, cosa que se puede
comprobar al observar un corte transversal al microscopio
electrnico: por encima de la membrana citoplsmica y hasta el
exterior se pueden apreciar 5 capas, alternndose las claras (L
2
, L
5
) y
las oscuras (ms densas a los electrones: L
1
, L
3
, L
4
).
La capa densa L
4
corresponde al peptidoglucano (ya
estudiado), que se encuentra inmerso en la capa clara L
5
, que
consiste en un espacio periplsmico, limitado entre la membrana
citoplsmica y una membrana externa. La delgada capa de
peptidoglucano no constituye ms del 5-10% de la pared. A
continuacin estudiaremos la peculiar membrana externa de las
bacterias Gram-negativas y el espacio periplsmico.
2.5.1 LA MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS GRAM-
NEGATIVAS
Se trata de una estructura de bicapa lipdica exclusiva de las
bacterias Gram-negativas. Como otras bicapas lipdicas, consta de
una doble capa de lpidos, junto con protenas de matriz (estas
ltimas atravesando total o parcialmente la bicapa). Por supuesto, en
la bicapa lipdica, los grupos polares quedan hacia afuera, mientras
que los hidrfobos tienden al interior.
Ahora bien, la composicin qumica y la disposicin de los
elementos de esta membrana externa son muy distintos a los de una
membrana tpica:

la bicapa es altamente asimtrica:

en la capa externa existe un 60% de protenas y un 40% de una
macromolcula exclusiva de esta membrana externa: el
lipopolisacrido (LPS);

en la capa interna no hay LPS, existiendo fosfolpidos (FL),
lipoprotenas (LPP) y otras protenas.
El conjunto es un mosaico fluido que permite el desplazamiento
lateral de los fosfolpidos, del LPS, y de las protenas, pero no de las
lipoprotenas unidas covalentemente al peptidoglucano. Sin
embargo, esta fluidez es menor que la de la membrana
citoplsmica.
2.5.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA DE LA
MEMBRANA EXTERNA
La membrana externa se encuentra unida con el
peptidoglucano subyacente a travs de distintos componentes y tipos
de enlaces:

enlaces inicos, mediados por cationes divalentes, entre distintas
protenas de la membrana externa y el PG;

enlaces hidrfobos entre fosfolpidos y protenas de la capa
interior de la membrana externa con el PG;

enlaces covalentes entre algunas molculas de lipoprotena y el
PG.
Parece ser que la membrana externa est en contacto directo con la
plasmtica en numerosos puntos, denominados zonas de adhesin.
Puede que se trate de regiones en las que produzca una autntica
fusin entre estos dos tipos de membrana, facilitando quiz el
transporte de ciertas sustancias desde el exterior al interior celular.
Estudiaremos a continuacin los componentes de la membrana
externa, aludiendo a su composicin qumica, estructura y
funciones.
2.5.1.1.1 Fosfolpidos (FL)
Se localizan en la lmina interna de la m. ext. La composicin
en fosfolpidos es similar a la de la membrana citoplsmica, con un
ligero enriquecimiento en fosfatidil-etanolamina.
2.5.1.1.2 Lipopolisacrido (LPS)
Se trata de una macromolcula exclusiva de la lmina externa
de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, responsable
de muchas de las propiedades biolgicas de estas bacterias. Se le
conoce tambin con el nombre de endotoxina (toxina termoestable,
no difusible). Se trata de un glucolpido complejo, que podemos
considerar compuesto de tres regiones o dominios:

lpido A, que es la porcin ms proximal, y de carcter
hidrofbico;

regin intermedia, llamada oligosacrido medular;

regin distal (cadena lateral especfica, polisacardica) a base de
repeticiones de unos pocos azcares. Es de carcter hidroflico y
constituye el antgeno somtico O de las 6bacterias Gram-
negativas.
i) El lpido A: esta regin es prcticamente idntica en todas las
bacterias Gram-negativas. Consiste en un disacrido formado por
dos unidades de glucosamina unidas por enlace (16), pero donde
todos los grupos -OH (menos uno) y -NH
2
estn sustituidos (unidos
a otras molculas): Obsrvese que

existen 5 (a veces 6) cidos grasos, todos ellos saturados, con
predominio de -hidroximirstico (un cido graso C
14
).

El -OH original en 4 est sustituido por arabinosamina-fosfato.

El -OH en 1 est sustituido por fosforil-etanolamina (a veces
pirofosforil-etanolamina).
ii) El oligosacrido medular (tambin llamado corazn o ncleo):
se une al lpido A a travs del -OH en 3. Se pueden considerar dos
fracciones:

la fraccin del ncleo interno, a base de dos tipos de azcares
exclusivos de Gram-negativas: 2-ceto-3-desoxioctnico (KDO) y
L-glicero-D-manoheptosa (Hep). Alguna de las Hep y alguno de
los KDO pueden a su vez estar unidos a fosforil-etanolamina (o
pirofosforil-etanolamina). Esta regin es muy rica en grupos
cargados, especialmente con carga negativa (de los fosfatos y
KDO).

La fraccin del ncleo externo est constituida a base de hexosas
(glucosa, galactosa, NAG, y a veces algunas hexosas ms raras).
iii) Cadena lateral especfica: polisacrido repetitivo, que se
proyecta hacia el exterior celular, y que constituye el Ag somtico
O de bacterias Gram-negativas. Consiste en la repeticin (hasta 40
veces) de unidades tri-, tetra- o pentasacardicas (en estos dos
ltimos casos uno de los azcares de cada repeticin queda lateral
respecto del esqueleto lineal que forman los dems).
De todas estas regiones del LPS la nica indispensable para
la viabilidad es el lpido A. Los mutantes incapaces de sintetizar las
cadenas laterales o el oligosacrido medular dan colonias rugosas y
estn afectados en distintas propiedades biolgicas, pero pueden
sobrevivir.

PAPELES Y FUNCIONES DEL LPS
1. Papel estructural: el LPS es el componente esencial de la
membrana externa. La porcin hidrofbica (las cadenas de
cidos grasos del lpido A) se proyectan hacia el interior de
esta membrana. Precisamente es la estructura del lpido A la
principal responsable de la menor fluidez de dicha membrana,
y por lo tanto de la mayor resistencia fsica. (Obsrvese que,
mientras cualquier fosfolpido tiene dos cadenas de cido
graso, el lpido A posee 5 o 6, todas ellas unidas al mismo
disacrido, generando una molcula ms masiva.).
2. A su vez, la propiedad anterior hace que sea menos soluble a
detergentes y ms resistente a disolventes orgnicos.
3. Es menos permeable a muchas molculas hidrofbicas,
incluyendo antibiticos, debido a las largas cadenas laterales
hidroflicas.
4. Se une a cationes divalentes (como Mg
++
o Zn
++
), lo que
contribuye a la mayor estabilidad de la membrana externa.
Esta presencia de cationes suministra un ambiente adecuado
para muchas funciones de la P.C. (Si aadimos un agente
quelante como el EDTA, o eliminamos el Mg
++
y lo
sustituimos por Ca
++
, se produce la desorganizacin de la
membrana externa).
5. Como ya dijimos, el LPS constituye la endotoxina de las
bacterias Gram-negativas. La funcin como endotoxina se
debe a la regin del lpido A. Sus propiedades como
endotoxina estn en el origen de muchos sntomas patolgicos
propiciados por patgenos Gram-negativos:
a. pirogenicidad (induccin de fiebre)
b. hipotensin
c. en casos graves, choque letal, por fallo cardaco
d. actividad necrtica de tejidos.
6. Pero igualmente, tiene efectos beneficiosos: estimula una serie
de mecanismos defensivos del hospedador, incluyendo la
activacin del complemento, que puede ocasionar la lisis de la
bacteria, mejora las propiedades de los fagocitos, etc. Es decir,
a pesar del nombre de endotoxina, el LPS no es
intrnsecamente txico, sino que su efecto depende de la
respuesta del hospedador. El macrfago es la clula del
hospedador principal responsable de la mediacin de los
efectos del LPS, tanto los positivos como los negativos. El
macrfago posee receptores de membrana para detectar el LPS
bacteriano, y en respuesta a l, libera una serie de molculas
mediadoras (citoquinas) que actan a su vez sobre diversas
partes del sistema inmunitario. De hecho, los efectos negativos
se deben a comportamientos incontrolados desencadenados en
el propio sistema inmunitario.
7. El LPS, y concretamente las cadenas laterales constituyen el
antgeno somtico O, cuya especificidad viene determinada
por la secuencia repetitiva de azcares. Esta porcin
condiciona la virulencia de las bacterias Gram-negativas
patgenas, por lo que debe de ser esencial en la interaccin
hospedador-parsito.
2.5.1.1.3 La lipoprotena (LPP, lipoprotena de Braun)
Su porcin polipeptdica es una pequea protena (7.2 kDa)
muy abundante en la membrana externa, y es la responsable de la
unin covalente entre sta y el peptidoglucano. La protena tiene una
configuracin mayoritaria en o-hlice, que atraviesa el espacio
periplsmico, y parece que se agrega formando trmeros. Una de las
LPP del trmero (por trmino medio) se une covalentemente con el
peptidoglucano.
El aminocido N-terminal es una cistena cuyo grupo
sulfhidrilo est unido por enlace tioter a un diglicrido, y cuyo
grupo amino se une por enlace amido con un cido graso (p. ej.,
palmtico). De este modo, la porcin N-terminal de la LPP est
embebida en la lmina interna de la membrana externa.
El aminocido C-terminal es una lisina. Una de cada tres
molculas de LPP usa esta Lys para establecer un enlace peptdico
entre su propio grupo -NH
2
libre y el -COOH libre del meso-DAP
del PG. Por trmino medio, por cada diez unidades disacardicas del
PG, existe un enlace covalente con la LPP.
La principal (y probablemente nica) funcin de la
lipopprotena es meramente estructural: estabilizar el complejo entre
peptidoglucano y membrana externa. Esta unin es tan fuerte que
permite aislar la membrana externa y el peptidoglucano como una
unidad.
2.5.1.1.4 Protenas de la membrana externa
Estn intercaladas en esta membrana, participando en la
estabilizacin de la arquitectura tridimensional, interaccionando
unas con otras y con los lpidos. Entre ellas, las ms importantes son
las porinas.
Las porinas son protenas de unos 35 kDa, que se
agregan formando trmeros con canales interiores, y que
atraviesan la membrana de parte a parte. Su funcin es
permitir el paso de sustancias a travs de dichos canales
interiores, siempre que su peso molecular sea compatible con
el tamao de los canales (suelen ser molculas entre 500 y
700 dalton). En las enterobacterias, las porinas colaboran en
la proteccin contra las sales biliares que existen en el
ecosistema intestinal donde pasan parte de su vida.
Existen otras protenas minoritarias parecidas a porinas, que
actan como canales especficos que permiten el paso de ciertas
molculas: vitamina B
12
, quelatos de Fe, nuclesidos,
maltodextrinas, etc. Algunas de ellas sirven simultneamente como
receptores de fagos.
2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA
EXTERNA
1) Acta como tamiz molecular, que permite la difusin
nicamente de molculas relativamente pequeas. Esto supone
una proteccin frente a muchos agentes antibacterianos:
colorantes, cidos biliares, antibiticos, enzimas (p. ej., la
lisozima, que podra alcanzar y atacar al PG). Recurdese que las
porinas slo permiten el paso de sustancias hidroflicas por
debajo del tamao especificado por el dimetro de los canales.
2) Condiciona propiedades de superficie:
a) grado de humedad (humectabilidad)
b) adhesividad
c) carga elctrica.
3) Es la estructura donde se fijan los componentes del
complemento (sistema defensivo de los animales superiores que
conduce a la insercin, en la membrana externa, de una serie de
protenas llamadas complejo de ataque a la membrana, que
agujerea dicha membrana y ocasiona la lisis de la bacteria).
4) Ciertas protenas y cadenas laterales del LPS pueden ser lugares
de adsorcin (receptores especficos) de fagos y bacteriocinas.
5) Punto de anclaje del anillo externo (L) del corpsculo basal de
los flagelos.
2.5.2 EL ESPACIO PERIPLSMICO
Entre la membrana externa y la membrana citoplsmica existe
un compartimento acuoso baando al peptidoglucano, denominado
periplasma o espacio periplsmico. El volumen de este
compartimento puede llegar a representar un 20-40% del volumen
celular total. El contenido del periplasma (el gel periplsmico)
incluye:

RNasa y fosfatasa, que digieren molculas que por s mismas no
pueden pasar al citoplasma.

Penicilinasa: degrada penicilina, evitando destruccin de PG

protenas de transporte de nutrientes (p. ej., de maltosa)

protenas de transporte de nutrientes (p. ej., de maltosa)

protenas de unin a estmulos qumicos.

En bacterias desnitrificantes y quimiolitoautotrofas, existen
protenas implicadas en el transporte de electrones.
El periplasma cumple una funcin de osmorregulacin: El
periplasma es una solucin densa, con alta concentracin de
macromolculas, y que participa en la regulacin de la osmolaridad
celular frente a la tonicidad del medio exterior. Para ello, existe en
este espacio periplsmico un oligosacrido derivado de la
membrana citoplsmica (ODM, o segn sus iniciales inglesas,
MDO), a base de 10 unidades de -D-glucosa (unidas entre s por
enlaces 12) con sustituyentes cidos.

En medios de alta osmolaridad (por ejemplo, en los fluidos
corporales), disminuye la concentracin del oligosacrido.

En ambientes de baja osmolaridad (p. ej., aguas fecales), aumenta
mucho la concentracin de dicha molcula. De este modo, la
presin de turgor del protoplasto se transmite contra el
peptidoglucano, que como sabemos ya, es la estructura de la pared
celular. que aguanta las variaciones de presin osmtica.
3 PAREDES DE LAS ARQUEAS
Aunque las arqueas pueden comportarse como Gram-positivas
o como Gram-negativas, no se suele aludir a esto en este dominio de
procariotas, ya que sus paredes tienen poco que ver con las de
eubacterias. Exceptuando el gnero Thermoplasma, carente de pared
celular, las dems arqueas poseen, por encima de la membrana
citoplsmica, algn tipo de estructura con funciones de pared
celular.

En muchos casos las funciones de pared celular son ejercidas
simplemente por una capa S paracristalina (vase tema 4), a base
de disposicin regular de subunidades idnticas de una protena o
glucoprotena (p. ej., Methanococcus, Methanogenium). Recuerde
que en ciertas arqueas de ambientes extremos, esta capa S est
estabilizada por factores de esos ambientes: En el halfilo
obligado Halobacterium las subunidades de glucoprotena se
estabilizan por altas concentraciones de in Na
+
. En el
termoacidfilo Sulfolobus la estabilidad la confieren los bajsimos
pH.

En Methanospirillum y en Methanothrix varias clulas, cada una
con su capa S, se encuentran englobadas por una vaina comn, a
base de protenas y carbohidratos, con una estructura a base de
anillos paralelos.

En Methanosarcina y Halococcus la capa S se encuentra rodeada
de metanocondroitina, un polmero a base de N-acetil-
galactosamina, glucurnico, glucosa y manosa. (Esta
metanocondroitina es similar al condroitn sulfato presente en
tejido conjuntivo de animales).

Finalmente, los miembros del orden Methanobacteriales poseen
una pared de pseudomurena, un extrao peptidoglucano no
basado en NAM. Consiste en un esqueleto de unidades repetitivas
de NAG unidas por enlace (13) con N-acetil-
talosaminournico (NAT, un azcar exclusivo de estos
organismos). El grupo -NH
2
del NAT va unido a su vez con un
tetrapptido, pero en ste slo participan aminocidos de la serie
L. Al igual que en la murena de las eubacterias, las diversas
cadenas se unen entre s por enlaces peptdicos entre el aminocido
terminal (4) de un tetrapptido y el diaminocido (3) de otra
cadena.


Actualizado el
NDICE:
1 INTRODUCCIN
2 BIOSNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MURENA
3 CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR
3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA
GRAM-NEGATIVA: Escherichia coli ...........................................
3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIN EN UNA BACTERIA
GRAM-POSITIVA: Enterococcus faecalis
4 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS
5 FORMAS L
BIBLIOGRAFA
1 INTRODUCCIN
En el captulo anterior estudiamos la composicin qumica,
estructura y funciones de los principales tipos de paredes celulares
procariticas. En este captulo trataremos un aspecto dinmico del
tema de las paredes: cmo se sintetiza el peptidoglucano de las
eubacterias, y cmo se produce el proceso general de crecimiento de
la pared, incluyendo el evento particular de formacin del septo
transversal que marca el nacimiento de dos clulas hijas. Nos
concentraremos en la biosntesis del peptidoglucano, debido a su
inters intrnseco y aplicado (sobre este proceso actan diversos
antibiticos, algunos de gran importancia clnica).

Desde el punto de vista topolgico, todas las capas de las
envueltas bacterianas (membranas, pared celular) son superficies
cerradas sobre s mismas, fsicamente continuas para mantener la
integridad y viabilidad de la clula.

Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse durante
el crecimiento por incorporacin de nuevos materiales. Adems,
todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e
incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las
bacterias Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a
parar a diferentes localizaciones: periplasma, PG, membrana
externa, e incluso medio exterior.

Durante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de
las envueltas (y concretamente, de la pared celular que nos ocupa
ahora) deben de facilitar la divisin de la clula en una
descendencia de dos clulas hijas.

Finalmente, queda el problema de la energa. Los procesos
biosintticos requieren aporte de energa qumica, pero el ATP y
compuestos similares no pueden salir del protoplasto.
Precisamente en este captulo vamos a ver algunas de las estrategias
bioqumicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para
solventar estos puntos para el caso del peptidoglucano. Veremos que
la estrategia implica varias fases:

Sntesis de precursores en el citoplasma

Ensamblaje parcial en membrana

Transporte a la cara externa externa de la membrana

Ensamblaje final en el exterior, mediante reacciones que no
precisan energa
2 BIOSNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MURENA
Consta de 4 etapas:
1. Sntesis de precursores solubles en el citoplasma.
2. Estos precursores son transferidos a un transportador lipdico
situado en la membrana citoplsmica (un poliisoprenol fosfatado
llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades
disacardicas con el pentapptido.
3. Las unidades disacardicas se polimerizan en cadenas lineales
fuera de la membrana, pero an unidas al undecaprenil-fosfato de
la membrana.
4. Unin del polmero lineal as formado al peptidoglucano
preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al
menos) parte de sus pptidos respectivos.
A estas etapas hay que aadir una fase adicional de regeneracin del
transportador lipdico, una vez que ha cumplido su misin, para que
pueda ser operativo en un nuevo ciclo de sntesis.
Veamos, pues, en ms detalle, cmo ocurre este interesante proceso:

Fase 1:. Los monosacridos que luego van a constituir la unidad
disacardica repetitiva del esqueleto del peptidoglucano (NAM y
NAG) se activan al unirse a uridn difosfato (UDP). (En general,
los monosacridos que han de incorporarse a polmeros de pared
celular bacteriana se activan mediante su unin con nuclesidos-
fosfato.)
Por lo tanto, en esta fase se sintetizan por separado:

NAG-UDP

NAM-UDP
Luego se va produciendo la adicin secuencial y ordenada de los
distintos aminocidos al NAM (en reacciones que requieren
energa e iones Mn
++
):
1. L-ala
2. D-glu
3. m-DAP (u otro diaminocido; p. ej. L-lys en
Staphylococcus aureus)
4. D-ala-D-ala
Observar que no se produce un tetrapptido, sino un
pentaptido. El ltimo paso de adicin de aminocidos es la unin
del dipptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases:

una racemasa convierte la L-ala a D-ala;

creacin de enlace peptdico entre dos D-ala.
Fase 2: El UDP-NAM-pentapptido se transfiere ahora a un
transportador de membrana, llamado undecaprenil-fosfato (que
abreviaremos como Lip-P), en una reaccin catalizada por una
translocasa especfica.
El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 tomos de
C (C
55
, derivado de la repeticin 11 veces de la unidad isoprenoide,
con un fosfato terminal). Se le conoce tambin con el nombre de
bactoprenol, pero hoy se sabe que no es exclusivo de bacterias. El
bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que,
como los azcares, son hidroflicas, y no podran pasar por s
mismas la barrera hidrofbica de la membrana.
Una vez que el NAM-pentaptido est unido al undecaprenil
(por medio de pirofosfato), una transferasa transfiere a ste la NAG
desde el UDP-NAG. Se genera pues el enlace (14) entre NAG y
NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-P-NAM(pentapptido)-NAG.
En esta situacin es cuando se producen la modificaciones
que ya estudiamos en la estructura bsica del PG. Por
ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-
glutmico en posicin (2) es amidado (pasa a --CO-NH
2
. Por
otro lado, se introducen los puentes peptdicos, que en el
caso de esta bacteria consisten en una pentaglicina, que se
une al grupo amino terminal de la L-Lys en posicin (3).
Tanto la traslocasa como la transferasa est localizadas en el
lado citoplsmico de la membrana, de modo que el precursor
Lip-P-P-NAM(pentapptido)-NAG, en este momento est
colgando hacia el citoplasma, anclado a la lmina interna de
la membrana a travs de bactoprenol.
Fase 3: Polimerizacin de varias unidades disacardicas:
Ahora el bactoprenol se da la vuelta en la membrana (una
especie de flip-flop desde la capa interna hasta la externa), de
modo que logra que el precursor resultante de la fase 2
quede expuesto hacia el medio acuoso exterior a la
membrana. Entonces tiene lugar la polimerizacin de varias
unidades disacardicas: ello se logra en una reaccin de
transglucosidacin. Consiste en la unin de cada unidad
disacardica (con su pentapptido) unida a su respectivo Lip-
P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena
preexistente que a su vez est unida a otra molcula de Lip-
P-P.
En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el
undecaprenil, pero en forma pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P
acta una fosfatasa especfica, que elimina el fosfato terminal,
regenerndose el undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para
otro ciclo como el descrito.
Fase 4: El polmero surgido de la fase anterior es una cadena lineal
de PG sin entrecruzar, y unido an al transportador lipdico de
membrana. Ahora este polmero naciente (con sus pentapptidos)
reacciona, por transpeptidacin, con un PG aceptor preexistente.
En esta reaccin se ven implicados el grupo C=O de la D-ala (4) del
PG naciente y el grupo -NH
2
libre del diaminocido (3) del PG
aceptor (o del ltimo aminocido del puente peptdico).
Esto es lo mismo que decir que el enlace peptdico entre D-
ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro
enlace peptdico, entre dicha D-ala (4) y el diaminocido del
PG naciente.

La energa para esta reaccin la suministra la hidrlisis
concomitante del enlace peptdico entre las dos D-ala terminales. Es
decir, en cada reaccin de transpeptidacin se libera una D-ala,
correspondiente a la que ocupaba la posicin (5).
Ya dijimos en el captulo anterior que no todos los
tetrapptidos participan en entrecruzamientos. Las D-ala terminales
(en 5) de los pptidos no implicados en tales entrecruzamientos son
eliminadas por una enzima llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta
enzima explica no slo que en el PG maduro existan tetrapptidos (y
no los pentapptidos originales), sino tambin la existencia de
tripptidos.
Muchas bacterias controlan el grado de entrecruzamiento de su
PG maduro. Incluso algunas pueden eliminar totalmente muchos de
los pptidos originalmente unidos al NAM, mediante enzimas
conocidas genricamente con el nombre de autolisinas. As por
ejemplo, Micrococcus luteus -un coco Gram-positivo- merced a su
actividad NAM-L-ala-amidasa, presenta un PG que no est
entrecruzado en un 50-70%.
Antibiticos que actan a nivel de la biosntesis de
peptidoglucano:
Estos antibiticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias
en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos
del ciclo de sntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulacin
de precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la
activacin de las autolisinas de la bacteria, que degradan el PG y
que finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotnicos), por
entrada masiva de agua a la clula.
1. Fosfomicina: acta inhibiendo la formacin del 3-O-D-lactil-ter
de la NAG (o sea, del NAM). Parece ser que la base molecular
estriba en la semejanza estructural entre el este antibitico y el
PEP (es decir, la fosfomicina es anlogo estructural del PEP, lo
que lleva a la inactivacin de la enzima correspondiente a esta
reaccin).
2. Cicloserina: Se comporta como anlogo estructural de la D-
alanina, por lo que inhibe la actuacin de la racemasa que
convierte la L-ala a D-ala, as como de la reaccin de unin de
dos D-ala.
3. Tunicamicina: inhibe la traslocasa que cede el NAM unido hasta
entonces al UDP y lo pasa al bactoprenol (fase 2).
4. Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda
transglucosidacin (fase 3), es decir, la unin de diversas
unidades disacardicas.
5. Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su
desfosforilacin, e impidiendo por lo tanto, la regeneracin del
transportador de membrana.
6. Antibiticos -lactmicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas):
inhiben la reaccin de entrecruzamiento por transpeptidacin.
(Estudiaremos su mecanismo de accin en ms detalle en el
captulo 20 sobre Quimioterpicos y Antibiticos).
3 CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR
Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la pared
celular es una estructura cerrada y sin solucin de continuidad, debe
permitir su expansin (crecimiento), y esto supone que se han de
romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se
ensamble con el preexistente mediante nuevas uniones, es decir,
debe existir una accin concertada de muren-hidrolasas y de
muren-sintasas. Por otro lado, hay que tener en cuenta que en el
crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos: la
expansin (aumento de tamao) de esa pared, y la formacin del
tabique transversal en el centro de la clula.
El crecimiento y septacin del peptidoglucano estn basados
en la actividad controlada y localizada en puntos determinados, de
una gama de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad
transglucosidasa y/o transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son
los sitios de accin de las penicilinas (y otros antibiticos -
lactmicos), se les conoce tambin con el nombre de PBP (de
penicillin-binding proteins; vase la tabla 1).
TABLA 1
Propiedades de las PBPs de Escherichia coli
PBP N
molculas/
clula
Actividad
enzimtica
conocida
Posibles funciones
PBP
1, 1B
100 cada
una
Transglucosilasa/tra
nspeptidasa
Sntesis de PG durante
la elongacin celular
PBP 2 20 Transpeptidasa Crecimiento de la
forma bacilar
PBP 3 50 Transglucosidasa/tr
anspeptidasa
Sntesis de PG durante
la septacin (tabique)
PBP 4 110 D-D-
endopeptidasa/
D-
Dcarboxipeptidasa
Hidrlisis de los
entrecruzamientos
durante la elongacin
PBP 5 1800 D-D-
carboxipeptidasa
Destruccin del
pentapptido no
entrecruzado
3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA
GRAM-NEGATIVA: Escherichia coli
El crecimiento de la pared en E. coli se puede considerar dividido en
dos fases:
1. Crecimiento en longitud (elongacin), mientras la clula crece en
tamao.
2. Produccin del tabique transversal (septacin), que conduce a la
formacin de dos clulas hijas.
Elongacin

Las PBPs 1 son las encargadas de la elongacin de las cadenas de
PG naciente (por transglucosidacin de las unidades disacardicas)
y simultneamente, por transpeptidacin, logran el
entrecruzamiento.

Las cadenas nacientes del PG se intercalan en la parte cilndrica
del sculo de PG gracias a que las PBP4 y PBP5 cortan enlaces
del PG preexistente. La PBP2 interviene aqu tambin para
transpeptidacin. La cadena de PG se va elongando
unidireccionalmente alrededor de la circunferencia de la clula. Se
calcula que existen unos 200 sitios de insercin de nuevo material
en cada clula, dispersos de forma ms o menos uniforme por
toda la superficie de la clula. La maquinaria biosinttica tarda 8
minutos en completar cada circunferencia de elongacin.
Formacin del tabique transversal
La divisin de la bacteria por fisin binaria simtrica se logra por
medio de una invaginacin circular de las envueltas (membrana
citoplsmica y peptidoglucano) en mitad de la clula madre. En el
inicio de este proceso tiene un papel esencial la protena FtsZ, y ms
tarde intervienen otras protenas Fts.
FtsZ es una protena imprescindible, presente tanto en
eubacterias como en arqueas, que muestra parecido con las tubulinas
eucariticas. Al parecer, al igual que las tubulinas, la FtsZ se une a
GTP, con lo que se promueve su polimerizacin. Bajo control del
ciclo celular, la FtsZ se ensambla poco antes de la divisin en el
centro de la clula, formando un anillo citocintico en el lado
citoplsmico de la membrana celular. Existen indicios fuertes de que
la formacin de este anillo de FtsZ sealiza el sitio por donde se
producir la divisin y se activar el crecimiento del peptidoglucano
del tabique transversal. Una vez que FtsZ ocupa el lugar del futuro
septo, entran en accin otras protenas Fts, formando un complejo
llamado divisoma.
En las fotografas a microscopio electrnico se ve cmo bajo
la invaginacin de membrana que constituye la avanzadilla
del septo, se localizan las molculas de FtsZ.
La hiptesis seala que los polmeros de FtsZ se van contrayendo,
de modo que tiran de las envueltas hacia el interior, provocando la
tpica invaginacin alrededor del centro del bacilo, y que
simultneamente, la FtsZ provoca la activacin de la PBP3 (=FtsI),
que es una transglucosidasa/transpeptidasa especfica del tabique
transversal.
A microscopio electrnico se observa que este tabique est
formado por dos lminas de PG (densas a los electrones) separadas
entre s por otra transparente. El final de la divisin ocurre como
consecuencia de la invaginacin de la membrana externa entre las
dos lminas de PG.
Cmo se ensambla la membrana externa con relacin al PG?
Parece ser que esta membrana se ensambla en buena medida por
procesos espontneos guiados por interacciones entre el LPS y
protenas, sirviendo el PG subyacente como andamio que facilita el
montaje de toda la estructura. Parece ser que las zonas de adhesin
(junturas de Bayer) son importantes para la correcta colocacin de
LPS y protenas de la membrana externa.

3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIN EN UNA BACTERIA
GRAM-POSITIVA: Enterococcus faecalis
A diferencia de lo visto en E. coli, en el enterococo
(Enterococcus faecalis) el crecimiento del PG no es difuso, sino
zonal, comenzando en el centro (zona ecuatorial) y avanzando hacia
afuera.
Vase en la figura el experimento de marcado de pared celular
con anticuerpos fluorescentes, con ulterior seguimiento del marcaje
al microscopio:

tras unos 15 minutos despus del marcado se observa que existe
una banda ecuatorial oscura (no marcada, por lo tanto est
constituida por material nuevo recin insertado), mientras que los
polos de las clulas siguen enteramente marcados.

Tras 30 o 60 minutos observamos clulas enteramente sin marcar,
intercaladas entre clulas con uno de sus polos marcados.
El proceso se puede describir as:
1. En la clula adulta antes de la divisin aparece una banda
ecuatorial donde la pared celular se hace ms gruesa.
2. Debajo de esta zona engrosada (hacia el interior del citoplasma)
se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la
formacin del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca
en la banda ecuatorial.
3. El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la
superficie celular, sigue avanzando, hasta que...
4. ... se completa. Simultneamente a los pasos 3 y 4 la zona de
nueva sntesis de P.C. superficial alcanza el ecuador de las cellas
hijas nacientes.
5. El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos
mitades desde el exterior hacia el centro, por accin de
autolisinas. De esta forma se le adjudica a cada clula hija la
nueva pared correspondiente a uno de sus polos (el otro procede,
intacto, de la clula madre).
Vase igualmente la figura que muestra en ms detalle la formacin
del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que
posee una sola zona de crecimiento de PG, con dos regiones de
deposicin de nuevo material: la regin del tabique transversal
propiamente dicho, y la regin adyacente, ya en la superficie celular,
responsable de la expansin de la pared perifrica, a ambos lados del
tabique.
4 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS
Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr
eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. Se
denominan protoplastos las clulas bacterianas a las que se ha
desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos
son aquellas clulas bacterianas que poseen restos de pared.
Obtencin. Existen dos posibles mtodos alternativos:
1. Por destruccin del entramado del PG mediante enzimas lticas
(lisozima, peptidasas). En el caso de bacterias Gram-negativas,
previamente hay que desorganizar la membrana externa para
hacerla permeable a estas enzimas. Ello se logra usando el
quelante EDTA y/o sometiendo las clulas a bajas temperaturas.
2. Por inhibicin de la formacin de nuevo PG en las clulas en
crecimiento, tratndolas p. ej., con penicilina. Si se parte de un
mutante auxotrofo para un componente del PG basta hacer crecer
a la bacteria en un medio carente de dicho componente.
Estos mtodos permiten:

en el caso de Gram-positivas, la desorganizacin total de su pared,
por lo que se obtienen protoplastos;

en el caso de las Gram-negativas, quedan restos de membrana
externa y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se
obtienen esferoplastos.
En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la
forma normal eliminando el tratamiento (retirando la lisozima, o la
penicilina).

Los
protoplastos
son
osmticament
e sensibles:

En un medio
hipotnico,
estallan (lisis
osmtica)

En un medio
iso- o
hipertnico
se
mantienen.
Protoplastos y esferoplastos son formas osmticamente
sensibles debido precisamente a que al no existir o estar
desorganizado parcialmente el PG, ya no se pueden contrarrestar las
fuerzas de presin osmtica existentes en los medios hipotnicos en
que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. Por lo tanto,
si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que
obtenerlas en medios o soluciones isotnicos o ligeramente
hipertnicos, para evitar su lisis:

soluciones de NaCl 0,25-0,5 M;

sorbitol o sacarosa 0,1-0,5 M;

polietilnglicol (PEG) al 7,5%.
En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas
esfricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria
con pared de que proceden.
Se emplean en varios aspectos de investigacin bsica:

mtodo suave para luego obtener extractos libres de clulas y
fracciones subcelulares.

en algunas bacterias, mtodo para hacerlas permeables al ADN, en
experimentos de transformacin gentica.

para realizar fusin entre protoplastos de diferentes cepas de la
misma especie e incluso entre especies distintas. Se trata de un
mtodo de obtencin de recombinantes somticos usado para
determinados estudios genticos en bacterias que no tengan
sistemas naturales de transferencia gentica.
5 FORMAS L
Son clulas bacterianas carentes total o casi totalmente de P.C.,
con formas pleomrficas, irregulares y globulares, que se producen
de forma espontnea en algunas especies bacterianas (p. ej.,
Streptobacillus moniliformis) cuando se cultivan en medios a base
de suero (que son hipertnicos).
Las colonias de las formas L naturales son muy caractersticas:
en huevo frito, bifsicas.
Se pueden obtener de forma inducida formas L en diversas
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, tratndolas con
penicilina en medios hipertnicos.
Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y
pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen
algo de PG, aunque ste se encuentra alterado respecto al PG de la
clula normal.
Las formas L estables se producen por tratamientos ms
prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayora carecen
totalmente de peptidoglucano.
As pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado
total o parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de
aceptor de nuevo PG.



Actualizado el
NDICE:
1 MEMBRANA CITOPLSMICA
1.1 COMPOSICIN QUMICA
1.1.1 CARENCIA, EN GENERAL, DE ESTEROLES
1.1.2 LPIDOS
1.1.3 PROTENAS
1.2 ESTRUCTURA
1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA
1.3.1 PARTICIPACIN EN PROCESOS
BIOENERGTICOS
1.3.2 PARTICIPACIN EN BIOSNTESIS DE
POLMEROS DE LAS ENVUETAS
1.3.3 PUNTO DE ANCLAJE DEL CROMOSOMA Y DE
ALGUNOS PLSMIDOS
1.3.4 BARRERA SELECTIVA
1.3.5 EXPORTACIN DE MOLCULAS DE SUPERFICIE
2 TRANSPORTE DE NUTRIENTES
2.1 TRANSPORTE PASIVO INESPECFICO O DIFUSIN
SIMPLE
2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECFICO O DIFUSIN
FACILITADA
2.3 TRANSPORTE ACTIVO
2.3.1 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
PROTONES
2.3.2 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
IONES SODIO
2.3.3 TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP
2.3.4 TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION
DE GRUPOS
2.4 TRANSPORTE DE HIERRO
3 ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS
INTRACITOPLSMICAS
3.1 MESOSOMAS
3.2 CROMATFOROS
3.3 OTRAS INVAGINACIONES
3.4 TILACOIDES
BIBLIOGRAFA
ENLACES

1 MEMBRANA CITOPLSMICA
1.1 COMPOSICIN QUMICA
La membrana citoplsmica bacteriana es la estructura de tipo
bicapa proteo-lipdica que delimita al protoplasto. Su proporcin
protenas: lpidos es superior a la de las membranas celulares
eucariticas, llegando a alcanzar valores relativos de 80:20.
1.1.1 CARENCIA, EN GENERAL, DE ESTEROLES
Las membranas procariticas, a diferencia de las de eucariotas,
carecen de esteroles (con las salvedades de Cianobacterias, ciertas
bacterias metilotrofas; adems, los micoplasmas presentan
colesterol, pero lo secuestran de las clulas eucariticas a las que
parasitan).
Pero en cambio, en muchas bacterias existe una peculiar clase
de compuestos policclicos, denominados hopanoides
(triterpenoides pentacclicos) que parecen condicionar parte de la
rigidez de las membranas citoplsmicas. Los hopanoides se
sintetizan a partir del mismo tipo de precursores que los esteroles.
(Por cierto, como dato curioso diremos que los sedimentos de
combustibles fsiles como el petrleo presentan cantidades
gigantescas de hopanoides, lo que confirma el papel que tuvieron las
bacterias en su formacin).
1.1.2 LPIDOS
Abundan sobre todo los fosfolpidos derivados del cido fosfatdico:

fosfatidiletanolamina

fosfatidilglicerol

cardiolipina (difosfatidilglicerol)
En bacterias Gram-positivas, adems se encuentran glucolpidos y
glucofosfolpidos.
La composicin y proporcin concretas de los distintos tipos
de lpidos son variables entre distintas cepas bacterianas, y dentro de
cada cepa, en funcin de las condiciones de cultivo (temperatura,
pH, etc.).
Los cidos grasos esterificados con el glicerol en los fosfolpidos
son principalmente:
1) saturados, como p. ej.:
a) palmtico (16:0)
b) mirstico (14:0)
c) de cadena ramificada (muy frecuentes en muchas bacterias
Gram-positivas)
2) monoinsaturados (sobre todo en Gram-negativas), como p. ej.:
a) palmitoleico (cis-9, 16:1)
b) cis-vaccnico (cis-11, 18:1)
A diferencia de eucariotas, no existen cidos grasos
poliinsaturados, con la excepcin de las Cianobacterias. Este grupo
de bacterias fotosintticas tiene, adems, la capacidad de modificar
mediante desaturasas el grado de saturacin de sus cidos grasos, lo
que representa un mecanismo adaptativo frente a cambios de
temperatura.
Las bacterias pueden modificar la proporcin entre cidos
grasos insaturados y saturados, con objeto de mantener un estado
de fluidez adecuado en la membrana, como adaptacin a cambios de
temperatura:

a altas temperaturas, aumenta la proporcin de cidos grasos
saturados,

a bajas, aumenta la de los insaturados. Las bacterias psicrfilas
(amantes del fro) presentan casi todos sus cidos grasos de tipo
insaturado.
En Arqueas, en lugar de los habituales lpidos a base de steres
de cidos grasos con glicerol, existen lpidos a base de teres de
alcoholes de cadena larga con glicerol (p. ej., difitanil-glicerol-
diteres). Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este
tipo de membranas son ms rgidas que las de eubacterias. Incluso
existen arqueas con membranas a partir de tetrafitanil-diglicerol-
tetratereres, que consituyen bicapas monomoleculares.
Como ya vimos en el tema anterior, la membrana citoplsmica
alberga un transportador lipdico de tipo politerpenoide, llamado
undecaprenil-fosfato, presente en pequea cantidad (<1%).
Igualmente se dan quinonas isoprenoides (como la menaquinona o
la ubiquinona) que, como veremos en otro captulo, participan en
cadenas de transporte de electrones. En algunas bacterias existen
igualmente variedades de pigmentos carotenoides.
1.1.3 PROTENAS
Constituyen la mayor parte de la membrana bacteriana (hasta
el 80% en peso seco). Existe una gran variedad de tipos de protenas
en una misma bacteria (hasta 200), pero la composicin y
proporcin concreta vara segn las condiciones de cultivo.
Segn su localizacin en la membrana, y su grado de unin
con la porcin lipdica, se distingue entre:

protenas integrales de membrana (=endoprotenas): son
protenas estrechamente unidas a la membrana, por lo general
atravesadas en plena bicapa lipdica. Son difciles de extraer,
tenindose que recurrir a detergentes y/o disolventes orgnicos
para separarlas respecto de los lpidos. Las protenas integrales
pueden desplazarse lateralmente en la bicapa lipdica, pero no son
capaces de rotar, por lo que siempre presentan una determinada
orientacin o polaridad. Algunas presentan hidratos de carbono
que sobresalen hacia la superficie externa (glucoprotenas).

Protenas perifricas (= epiprotenas): unidas a la superficie de
la membrana, de forma ms dbil, por lo que son ms fciles de
extraer y purificar. Incluso algunas establecen contactos slo
transitorios con la membrana.


1.2 ESTRUCTURA
Mtodos de observacin y estudio
A microscopio ptico, se recurre a la tincin con Azul
Victoria. A microscopio electrnico, en cortes ultrafinos, se
observan una estructura de unos 7 nm de grosor, con dos capas
externas densas a los electrones limitando una capa central
transparente.
Los estudios mediante difraccin de rayos X y de resonancia
magntica nuclear (RMN) demuestran una estructuracin bsica a
base de cadenas de fosfolpidos en una bicapa, segn se describe a
continuacin.
Estructura
Consiste en una bicapa lipdica, con los grupos polares
(hidrfilos) hacia afuera, y las cadenas hidrofbicas de cidos grasos
(o, en el caso de Arqueobacterias, de alcoholes) hacia adentro,
ajustndose al modelo de mosaico fluido de Singer y Nicholson.
Inmersas en esta bicapa se encuentran las abundantes protenas, que
pueden moverse lateralmente en el mosaico de molculas de lpidos,
igualmente dotados de una rpida movilidad. Parece ser que no
existe movilidad de lpidos entre las dos capas.
La membrana citoplsmica es asimtrica (aunque no tanto
como la membrana externa de Gram-negativas). Esto se traduce en
el hecho de que muchos de los procesos que tienen lugar en la
membrana sean vectoriales (tengan una direccin determinada).
1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA
La membrana citoplsmica de los procariotas es una notable
estructura multifuncional (como uno podra esperar de la
constatacin del gran nmero de tipos de protenas), siendo el sitio
donde se producen muchos procesos metablicos complejos, en un
grado desconocido en el resto del mundo vivo.
Citemos brevemente las principales funciones de la membrana
procaritica (aunque en este y otros temas las estudiaremos en
detalle):

Barrera osmtica (que mantiene constante el medio interno),
impidiendo el paso libre de sales y de compuestos orgnicos
polares

Es el lmite metablicamente activo de la clula: establece la
frontera entre el protoplasto y el medio externo, impidiendo la
prdida de metabolitos y macromolculas del protoplasto.

Ahora bien, merced a sistemas de transporte, permite
selectivamente el paso de sustancias entre el exterior y el interior
(y viceversa).

Interviene, adems, en procesos bioenergticos (fotosntesis,
respiracin)

Participa en la biosntesis de componentes de membrana, de
pared y de cpsulas,

En la secrecin de protenas.
Desglosaremos brevemente estos diversos tipos de papeles de la
membrana.
1.3.1 PARTICIPACIN EN PROCESOS BIOENERGTICOS
Contiene todos los componentes requeridos para la
transduccin de energa y la produccin de ATP, por procesos
respiratorios. En el caso de una bacteria quimiotrofa, esto incluye:

deshidrogenasas

cadenas de transporte de electrones (con quinonas, citocromos,
etc.)

ATP-asas (ATP sintasas/hidrolasas)
Algunas bacterias fotosintticas anaerobias tambin incluyen este
tipo de componentes en la membrana citoplsmica.
En un captulo posterior veremos en ms detalle cmo explica
la teora quimiosmtica de Mitchell el acoplamiento entre el
funcionamiento de las cadenas de transporte electrnico (o de la
ATP-hidrolasa) y la generacin de un gradiente de protones a travs
de la membrana (potencial electroqumico o fuerza protn-motriz),
el cual a su vez puede:

generar ATP (desarrollo de un trabajo qumico)

promover transporte de ciertos nutrientes (trabajo osmtico)

promover movimiento flagelar (trabajo mecnico).
1.3.2 PARTICIPACIN EN BIOSNTESIS DE POLMEROS
DE LAS ENVUETAS
Como ya hemos visto en temas anteriores, la membrana
alberga transportadores (como el undecaprenil-P) y enzimas
relacionados con fases de la biosntesis de polisacridos de la
cpsula, peptidoglucano, cidos teicoicos y teicurnicos y
lipopolisacrido. Igualmente en ella se localizan los enzimas
implicados en la sntesis de los lpidos de la propia membrana.
1.3.3 PUNTO DE ANCLAJE DEL CROMOSOMA Y DE
ALGUNOS PLSMIDOS
Como veremos, sigue estando debatido si un tipo de
invaginacin de la membrana, llamado mesosoma (ver ms adelante,
en este captulo, apartado 3.1) es o no un artefacto, pero parece fuera
de duda que el cromosoma se ancla de alguna manera a la cara
interna de la membrana (sea a los mesosomas, o como proponen
otros, a la cara interna de los anillos perispticos). En la zona de
anclaje parecen residir algunos de los enzimas encargado de la
replicacin. La membrana tiene igualmente un papel en la
separacin (segregacin) de las dos copias del cromosoma replicado
a las clulas hijas.
1.3.4 BARRERA SELECTIVA
Mantiene la constancia del medio interno (impidiendo la salida
de iones, metabolitos y macromolculas), pero simultneamente
permite o promueve activamente la entrada de nutrientes y la
salida de los productos de desecho o de ciertas molculas
excretadas. La funcin de transporte de nutrientes ser tratada en
detalle ms adelante en este captulo.
1.3.5 EXPORTACIN DE MOLCULAS DE SUPERFICIE
Se trata de un sistema por el que ciertas protenas son trasladadas a
su localizacin definitiva en la membrana citoplsmica, por la
intervencin de la protena YidC, que interacciona con zonas
hidrofbicas de aquellas. Un ejemplo de protenas insertadas de este
modo lo constituye la ATP-sintasa de eubacterias. Este sistema, al
parecer filogenticamente primitivo, aparece en eubacterias, parte de
arqueas (euriarqueas) y en mitocondrias (donde se denomina Oxa1)
y cloroplastos (Alb3), pero no en eucariotas.
2) SISTEMA Sec
El sistema Sec es un sistema universal para la secrecin de
protenas, es decir, aparece en los tres dominios de la vida, aunque
con variantes en cada uno de ellos. Nosotros vamos a describir el
caso de las eubacterias.

Las protenas secretadas se sintetizan como pre-protenas dotadas
en el extremo N-terminal de un pptido seal, de unos 20-30
aminocidos. Dicha zona consta a su vez de un extremo N-
terminal cargado positivamente, seguida de un trecho hidrofbico,
y termina con una zona ms polar dotada al final del sitio que va a
ser roto por la peptidasa del lder.

Cuando an est en el citoplasma, la pre-protena naciente se une a
la protena SecB (una chaperona especfica de esta ruta), la cual
impide que la pre-protena se pliegue totalmente.

La protena SecA, que forma un homodmero, reconoce el
complejo SecB-preprotena, y lo traslada al complejo de protenas
de membrana SecYEG, que tiene un canal interior de unos 20-30
. (Al parecer el canal consta de 3-4 complejos SecYEG).

Ahora, la protena SecA, con gasto de ATP, logra que los primeros
20-30 aminocidos de la pre-protena entren a travs del canal Sec,
con lo que el pptido seal aparece por el lado exterior de la
membrana.

Una vez que el pptido seal asoma por el otro lado de la
membrana, es cortado en el sitio especfico por la peptidasa lder,
lo que ayuda a liberar al exterior la parte madura de la protena
secretada.
3) SISTEMA SRP
El sistema SRP procaritico es mucho ms sencillo que el homlogo
SRP que se encuentra en la membrana del retculo endoplsmico de
eucariotas. En este sistema, el extremo N-terminal de la protena
naciente es reconocido por la partcula de reconocimiento de seal,
conocida por sus siglas SRP.

La SRP eubacteriana consta de un pequeo ARN y una protena
(Ffh).

Una vez que la SRP reconoce el extremo N-terminal de la protena
naciente, parece que provoca la detencin momentnea de la
traduccin, y conduce a esa protena naciente hasta el receptor de
la partcula SRP (SR), a nivel de membrana citoplsmica.

A su vez esto provoca la interaccin del pptido naciente con el
complejo Sec, que ser el que logre la secrecin o insercin en
membrana de la protena madura.
4) SISTEMA Tat
Este sistema se ha empezado a caracterizar recientemente, y solo se
ha descubierto en procariotas y en cloroplastos, pero no en
mitocondrias ni en eucariotas. Se caracteriza por trasladar al exterior
(o al espacio periplsmico de Gram-negativas) protenas ya en su
configuracin nativa, y en su caso, dotadas ya de sus cofactores
(grupos FeS, molibdopterina, cofactores nucleotdicos, etc.). Es
decir, a diferencia de los anteriores, las protenas se pliegan /y en su
caso adquieren los cofactores) antes de ser trasladadas. Este sistema
se llama Tat debido a que reconoce una secuencia seal en la que
existen dos argininas gemelas (una a continuacin de otra, twin
arginine transport). Consta de al menos tres tipos de protenas de
membrana: TatA, TatB y TatC. Varias unidades de TatA atraviesan
la membrana formando una empalizada que deja un gran canal de
unos 60 . Cmo se logra el transporte a travs de este gran agujero
en la membrana sin que se pierda su capacidad de barrera selectiva
es una hazaa que se est investigando.
2 TRANSPORTE DE NUTRIENTES
Lo primero que tiene que hacer un microorganismo a la hora
de su nutricin es captar los nutrientes que necesite desde el medio
exterior. Debido a que la bicapapa lipdica acta como barrera que
impide el paso de la mayor parte de las sustancias, esto significa que
deben existir mecanismos especficos para lograr la entrada de los
nutrientes. Adems, teniendo en cuenta que las bacterias suelen vivir
en medios diluidos, deben realizar un trabajo para trasladar
muchos de esos nutrientes en contra del gradiente de concentracin.
Tradicionalmente se viene considerando tres mtodos
principales de transporte de sustancias a travs de la membrana:

transporte pasivo inespecfico (= difusin simple);

transporte pasivo especfico (= difusin facilitada);

transporte activo.
Como veremos, los ms importantes en procariotas son los sistemas
de transporte activo.
2.1 TRANSPORTE PASIVO INESPECFICO O DIFUSIN
SIMPLE
Este transporte consiste en la difusin pasiva de ciertas
sustancias para las que la membrana es impermeable, debido a la
diferencia de concentracin (AC) a ambos lados de dicha membrana
(la sustancia tiene mayor concentracin fuera que dentro de la
clula). Aparte de esta diferencia de concentracin, en la difusin
pasiva influyen:

la constante de permeabilidad (P), es decir, el grado de
permeabilidad de la membrana a la sustancia en cuestin;

el rea o superficie total (A) a travs de la que se produce el
transporte.
Las membranas citoplsmicas son impermeables en s mismas
a la mayor parte de las molculas. Slo se da en el caso de O
2
, CO
2
,
NH
3
, agua y otras pequeas sustancias polares no ionizadas.
La difusin simple se produce por el paso de estas sustancias a
travs de poros inespecficos de la membrana citoplsmica.
2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECFICO O DIFUSIN
FACILITADA
Es un proceso que permite el paso de compuestos por difusin
a travs de transportadores estereoespecficos y (al igual que en el
caso anterior) sobre la base de un gradiente de concentracin (en la
direccin termodinmicamente favorable).
El transportador suele ser una protena integral de membrana
(permeasa o facilitador), cuya conformacin determina un canal
interior, y por el cual un determinado sustrato puede alcanzar el
interior, sin gasto de energa. Se piensa que cuando el soluto se une
a la parte de la permeasa que da al exterior, esta protena sufre un
cambio conformacional que libera la molcula en el interior. Como
al entrar la molcula, enseguida entra en el metabolismo y
desaparece como tal, esto basta para mantener el gradiente de
concentracin que permite esta difusin. La difusin facilitada
exhibe propiedades similares a las de las reacciones enzimticas:

Especificidad de sustrato: cada permeasa transporte un solo tipo de
sustratos qumicamente parecidos.

Cintica de saturacin de tipo Michaelis-Menten, es decir, la
velocidad de transporte aumenta con la concentracin de sustrato,
hasta un valor lmite (V
max
) por encima del cual ulteriores
aumentos del soluto no aumentan dicha velocidad (debido a que
todas las porinas disponibles estn ya totalmente ocupadas):
Velocidad de entrada: V
ent
= V
mx
[S
ext
] /K
m
+ [S
ext
]
Velocidad de salida: V
sal
= V
mx
[S
int
] /K
m
+ [S
int
]
Aunque este sistema de transporte es muy comn en
eucariotas, es muy raro encontrarlo en bacterias. La explicacin
evolutiva es que los procariotas suelen vivir en ambientes con pocas
concentraciones de nutrientes, y por lo tanto no es frecuente que se
den gradientes adecuados. Una de las pocas excepciones la
constituye el glicerol, que es transportado por difusin facilitada en
una amplia gama de bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-
negativas. Conforme el glicerol entra, es rpidamente convertido a
glicerol-fosfato; por lo tanto, la concentracin interna de glicerol
como tal es prcticamente nula, lo que facilita esta difusin incluso a
bajas concentraciones exteriores de esta sustancia. En Zymomonas
existe un facilitador de membrana que transporta glucosa.

2.3 TRANSPORTE ACTIVO
Consiste en el transporte de sustancias en contra de un
gradiente de concentracin, lo que requiere un gasto energtico.
En la mayor parte de los casos este transporte activo (que supone un
trabajo osmtico) se realiza

a expensas de un gradiente de H
+
(potencial electroqumico de
protones) previamente creado a ambos lados de la membrana,
por procesos de respiracin y fotosntesis;

por hidrlisis de ATP.
Los sistemas de transporte activo son los ms abundantes entre
las bacterias, y se han seleccionado evolutivamente debido a que en
sus medios naturales la mayora de los procariotas se encuentran de
forma permanente o transitoria con una baja concentracin de
nutrientes.
Los sistemas de transporte activo estn basados en permeasas
especficas e inducibles. El modo en que se acopla la energa
metablica con el transporte del soluto an no est dilucidado, pero
en general se maneja la hiptesis de que las permeasas, una vez
captado el sustrato con gran afinidad, experimentan un cambio
conformacional dependiente de energa que les hace perder dicha
afinidad, lo que supone la liberacin de la sustancia al interior
celular.
Estudiaremos los siguientes tipos de transporte activo:

transporte activo ligado a simporte de protones;

transporte activo ligado a simporte de iones Na
+


transporte activo dirigido por ATP

transporte acoplado a translocacin de grupos.
2.3.1 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
PROTONES
Como se recordar, el simporte se puede definir como el
transporte simultneo de dos sustratos en la misma direccin, por un
mismo transportador sencillo. En el caso del transporte activo ligado
a simporte de protones, lo que ocurre es que uno de los sustratos
(H
+
) ha creado previamente un gradiente de concentracin, cuya
disipacin es aprovechada por el otro sustrato para entrar con l.
Este otro sustrato puede ser:

una molcula de carga negativa: en este caso, su simporte ligado a
protones tiende a disipar slo el gradiente de concentracin.
Ejemplos: transporte de iones fosfato, de glutamato, etc.

una molcula neutra: en este caso, su simporte tiende a disipar no
slo el gradiente de concentracin, sino tambin el gradiente
elctrico. Ejemplo: en Escherichia coli, la lactosa usa una -
galactsido-permeasa, que es una de las permeasas bacterianas
ms intensamente estudiadas.
Por otro lado, ciertas molculas catinicas (iones K
+
, lisina), son
transportadas directamente a travs de permeasas, en ausencia de
simporte de protones.
2.3.2 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
IONES SODIO
Se puede considerar una versin modificada del anterior:
algunas sustancias no son transportadas activamente de forma
directa por el potencial electroqumico de protones, sino
indirectamente, a travs de un gradiente de Na
+
que a su vez se
origina a expensas de dicha fuerza protn-motriz (fpm).
El sustrato entra por una permeasa, junto con iones Na
+
, pero a
su vez este sodio se recicla por un sistema de antiporte, a expensas
de la disipacin del potencial de protones.
Ejemplo: el azcar melibiosa, en el caso de la enterobacteria E.
coli.
Estos dos tipos de transporte activo ligados a simporte quedan
inhibidos si tratamos las clulas con algn agente ionforo (p. ej., el
antibitico valinomicina), que destruye el potencial electroqumico
de protones.
El transporte activo ligado a simporte de iones (H
+
, Na
+
)
resulta muy econmico, ya que slo se gasta un protn por cada
molcula transportada, mientras que por cada ATP sintetizado se
suelen gastar 3 protones que se disipan en las ATPasas. Las
permeasas que realizan este transporte suelen ser protenas integrales
de membrana provistas de unos 12 segmentos transmembranosos en
configuracin de o-hlice.
2.3.3 TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP
El tipo paradigmtico de este tipo de transporte se denomina de
transportadores ABC o ATPasas de trfico, y se conocen muchos
ejemplos en eubacterias y arqueas. Vamos a describir el caso de un
sistema ABC en enterobacterias (como E. coli). Se trata de un
sistema de varios componentes, en el que existen protenas
periplsmicas que captan el sustrato con gran afinidad, y lo llevan
hasta unas protenas de membrana, las cuales acoplan el paso de
dicho sustrato hasta el citoplasma (sin alteralo qumicamente) con la
hidrlisis de ATP.
La denominacin de "transportadores ABC" se debe a que en
todos ellos existe una o dos protenas perifricas de
membrana citoplsmica que poseen un dominio (de unos 200
aminocidos) conservado evolutivamente, denominado
"cassette de unin a ATP" (las iniciales de ATP-binding
cassette generan la sigla "ABC"). Al parecer este dominio
ABC conservado es muy antiguo, y parece que ya exista
antes de la divergencia evolutiva entre procariotas y
eucariotas. Existen muchos ejemplos de protenas ABC, tanto
en procariotas como eucariotas (de hecho constituyen la
mayor familia de protenas filogenticamente relacionadas de
todo el mundo vivo). Los primeros ejemplos de esta gran
familia estaban implicados en transportar sustancias a uno u
otro lado de la membrana. En otro tema veremos ejemplos de
transportadores ABC que funcionan "al revs" de los de este
tema: son "exportadores" de protenas recin sintetizadas que
deben insertarse en las envueltas bacterianas o ser
excretadas al medio. Pero se ha descubierto que la gran
familia de protenas ABC est implicada en otros procesos
(regulacin gentica, reparacin de ADN, patogenicidad, etc).
Elementos de este tipo de sistema:

Porinas u otras protenas de membrana externa para lograr la
difusin del sustrato desde el medio hasta el espacio periplsmico.

Protena(s) solubles de espacio periplsmico que se unen al
sustrato con gran afinidad.

Un heterodmero formado por dos protenas integrales de
membrana (cada una de ellas posee 5 o 6 trechos en o-hlice que
atraviesan la membrana citoplsmica), que son la permeasa
propiamente dicha del sistema (el canal por donde pasa el
sustrato).

Dos protenas perifricas de membrana citoplsmica, adosadas al
lado citoplsmico, que incluyen el mdulo conservado ABC que
acopla la hidrlisis de ATP con el transporte unidireccional del
sustrato a travs de la membrana.
Modelo del mecanismo de este sistema:
1. El sustrato exgeno normalmente entra al periplasma a travs de
algn canal inespecfico o porina de membrana externa (por
ejemplo, en enterobacterias se pueden usar las porinas generales
conocidas como OmpF y OmpC).
2. La protena periplsmica especfica, antes de su unin al sustrato
tiene una determinada configuracin (denominada abierta), con
dos grandes lbulos globulares unidos formando un ngulo (la
forma recuerda una almeja a medio abrir). Cuando el sustrato
pasa al periplasma, la correspondiente protena de unin
periplsmica se une a l con gran afinidad (0.1-1 M), y al unirse
cambia de conformacin. En esta configuracin, llamada
cerrada, el sustrato se encuentra enterrado entre los dos
lbulos de la protena (almeja cerrada).
3. Mientras tanto, el dmero de protenas integrales de membrana
(antes de la unin con la protena periplsmica) se encuentra en
un estado energizado pero incapaz de transportar sustrato. En esta
situacin, puede unirse (por la parte que da al periplasma) al
complejo formado por la protena periplsmica (en configuracin
cerrada) ligada al sustrato. Al hacer esto, el heterodmero de
membrana cambia de conformacin, de modo que ahora muestra
mayor afinidad hacia la protena periplsmica y se abre su canal
para dejar entrar el sustrato.
4. Entonces, el complejo de membrana alcanza su estado de mnima
energa, y con ello descarga el sustrato en el citoplasma y se logra
la separacin de la protena periplsmica (que vuelve a su
configuracin abierta).
5. Finalmente, la hidrlisis de ATP catalizada por las protenas
perifricas ABC (adosadas a la membrana y asociadas a las
protenas integrales) suministra la energa para que el
heterodmero de membrana vuelva a su estado energizado inicial,
preparado as para otro ciclo de transporte.

El sistema ABC de bacterias Gram-negativas, queda
puesto de manifiesto cuando lo impedimos por algn
procedimiento que altere o elimine la membrana externa
(conversin a esferoplastos): Por ejemplo: tratemos E. coli
con el quelante EDTA en una solucin tamponada
isotnica (con un 20% de sacarosa). Centrifugamos y el
sedimento de clulas lo resuspendemos en una solucin
de MgCl
2
en fro (0C). El resultado es que las protenas
del periplasma escapan al medio externo. Esto es un caso
de tratamiento por choque osmtico que origina prdida
de contenidos del periplasma. Se comprueba que ciertos
sistemas de transporte quedan inutilizados, debido a que
requieren para su funcionamiento, amn de protenas de
membrana citoplsmica, otras especficas del espacio
periplsmico. Por contra, este sistema no se ve afectado
por los agentes ionforos. Por esta razn, a este sistema
en Gram-negativas se le ha llamado durante mucho tiempo
transporte activo sensible a choque osmtico.
Los sistemas ABC de bacterias Gram-positivas estn menos
estudiados, pero en general se parecen a los de Gram-negativas,
salvo que carecen del transportador libre periplsmico. En su lugar
existe una protena con funciones equivalentes (captar el nutriente
del exterior), pero que est anclada al lado externo de la membrana
citoplsmica, cerca del heterodmero integral de membrana (la unin
es mediante su cistena N-terminal, que se une a un fosfolpido).
Existen muchos ejemplos de transportadores procariticos de
tipo ABC, y cada uno de ellos est especializado en transportar un
sustrato especfico o varios sustratos parecidos. Ejemplo de sustratos
transportados de esta forma:

Monosacridos como arabinosa, galactosa, maltosa, ribosa, xilosa,
etc.

Oligosacridos

Iones orgnicos e inorgnicos

Aminocidos como histidina, glicina, leucina, etc.

Oligopptidos

Algunas vitaminas y metales.

Siderforos con hierro
2.3.4 TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE
GRUPOS
Es un sistema de transporte que acopla la entrada del sustrato
con su modificacin qumica por unin covalente con un grupo
qumico. Estrictamente hablando, no es un transporte activo, porque
no funciona en contra de un gradiente de concentracin, pero se
considera de hecho como activo, ya que la concentracin del
sustrato modificado dentro de la clula supera con creces a la del
sustrato sin modificar en el exterior.
Este sistema supone un ahorro de energa metablica: aunque
en el transporte se gasta un enlace rico en energa, el sustrato queda
modificado en su paso a travs de la membrana en la forma que la
bacteria emplea como primer intermediario de su ruta metablica. Es
decir, con un solo proceso se cumplen dos funciones distintas:
transporte y preparacin qumica para la ruta, que de todas formas
habra que realizar. No es de extraar que este tipo de transporte
haya sido seleccionado frecuentemente en la evolucin bacteriana, y
que hoy lo encontremos en muchos procariotas, especialmente en
bacterias anaerobias o aerobias facultativas que recurren a
fermentaciones (recordar que las fermentaciones tienen un
rendimiento energtico menor que los procesos respiratorios; por lo
tanto, es lgico que se seleccionen mecanismos ahorradores como
el descrito).
El caso mejor estudiado de esta clase de transporte lo
constituye el llamado sistema de fosfotransferasa de azcares
(segn las casi inevitables iniciales inglesas: PTS).
En E. coli el sistema PTS permite el transporte de glucosa,
manosa, fructosa y los polioles sorbitol y manitol.
Consta de varios componentes que funcionan como una cadena
de transportadores del grupo fosfato de alta energa del
fosfoenolpirvico (PEP) hasta el azcar a transportar en cuestin.

Las dos primeras protenas son inespecficas respecto del azcar
(son comunes a los diversos sustratos a transportar), tienen
localizacin citoplsmica y su sntesis es constitutiva. Se
conocen como

Enzima-I (EI)

HPr (esta ltima es una pequea protena termoestable, rica en
histidina).

El otro componente, llamado Enzima II (EII) es especfico de
cada azcar, y su sntesis es inducible por el correspondiente
sustrato: Suele estar compuesto por tres subunidades o dominios:

EIIA (hasta hace poco llamado EIII) es citoplsmico y soluble;

EIIB es un dominio perifrico de membrana: aunque es hidrfilo,
se liga al lado citoplsmico de la membrana a travs de EIIC.

EIIC es una protena integral de membrana
Veamos cmo funciona el sistema:
1. Por un lado, el azcar se une al enzima EIIC especfico, pero ste
por s mismo no puede liberar al azcar sin modificar en el
interior celular.
2. Mientras tanto, la EI cataliza (en presencia de Mg
++
) la
transferencia del fosfato de alta energa del PEP a la HPr.
3. La HPr fosforilada (HPr-P) transfiere el fosfato al enzima IIA
especfico del azcar [p. ej., la glucosa (EIIA
Glc
) o el manitol
(EIIA
Mtl
)].
4. La EIIA-P rpidamente, y en presencia de Mg
++
, transfiere el
fosfato a la enzima-IIB especfica con la que se asocia (p. ej.,
EIIB
Glc
), que a su vez fosforila el azcar (en el caso de la glucosa
convirtindola en glucosa-6-P): en este momento la EIIC pierde
su afinidad por el azcar modificado, que de esta forma entra en
el citoplasma, preparado ya para actuar como sustrato de la
primera reaccin del catabolismo de este azcar.
Otros ejemplos de transporte acoplado a translocacin de grupos:

Entrada de cidos grasos mediante un sistema de transferencia de
Coenzima A, que los transforma en acil-CoA.

Entrada de purinas y pirimidinas, mediante un sistema de
fosforribosil-transferasas:
purina o pirimidina (exterior) + PRPP NMP (interior) + P
(PRPP = fosforribosil-pirofosfato)
(NMP = nuclesido monofosfato)
En bacterias es frecuente encontrar varios sistemas de
transporte para un mismo nutriente (p. ej., Escherichia coli posee
cinco sistemas para transportar la galactosa y tres sistemas para
algunos de los aminocidos. Los diversos sistemas se diferencian en
cuanto a su requerimiento energtico, su afinidad, su regulacin, etc.
Lgicamente, la evolucin ha debido seleccionar esta redundancia
de sistemas de transporte con objeto de permitir que el
microorganismo sobreviva bajo diversas circunstancias ambientales.
2.4 TRANSPORTE DE HIERRO
El hierro es un cofactor de muchas enzimas y citocromos, por
lo que las bacterias necesitan captarlo. La captacin de hierro se
complica porque el in frrico (Fe
3+
) es muy insoluble. Adems, las
bacterias que viven dentro de animales superiores tienen un
problema: en los fluidos y tejidos de sus patrones el hierro libre es
muy poco abundante (el hierro suele estar acomplejado con
protenas), por lo que se vuelve vital aprovisionarse con este
elemento de alguna manera.
Muchas bacterias secretan unas molculas de bajo peso
molecular llamadas en general siderforos, que son capaces de
formar quelatos (complejos) con el hierro frrico. Por ejemplo,
Escherichia coli secreta un siderforo llamado enterobactina.
Cuando la enterobactina se une al hierro, forma un complejo
octadrico, que luego se engarza con un receptor especfico de la
membrana externa, tras lo que el hierro se libera al espacio
periplsmico, desde donde entra al citoplasma por medio de una
protena de unin periplsmica acoplada a un sistema ABC similar
al visto ms arriba.
3 ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS
INTRACITOPLSMICAS
3.1 MESOSOMAS
Son estructuras membranosas intracitoplsmicas que se
observan en la mayor parte de las bacterias, constituidas por
invaginaciones de la membrana citoplsmica.
Observacin:
A microscopio ptico se pueden detectar con tincin negativa
con cido fosfotngstico. A microscopio electrnico se observa que,
por lo general, el mesosoma se ubica en determinadas
localizaciones: sitios donde se inicia la divisin celular; tabiques
transversales en crecimiento (incluyendo los que delimitan el
compartimento de la endospora); zonas cercanas a los nucleoides
(cuerpos nucleares). Desde hace mucho tiempo se viene discutiendo
si los mesosomas son en realidad estructuras autnticas de la
bacteria, o como dicen otros, meros artefactos de las tcnicas
microscpicas empleadas. El debate an no est apagado, segn
algunos destacados microbilogos.
Estructura y composicin:
Los mesosomas ms caractersticos y patentes son los de
bacterias Gram-positivas. Su aspecto al microscopio electrnico es
el de repetidas invaginaciones de la membrana: una invaginacin
primaria en forma de sculo irregular, de la que surge una
invaginacin secundaria, llamada tbulo mesosmico, que rellena el
hueco de la invaginacin primaria. El tbulo mesosmico suele
consistir en un conjunto de pequeas vesculas arrosariadas, o
tbulos, conectados entre s, a veces con aspecto de cebolla.
Los mesosomas de Gram-negativas son menos conspicuos y
menos complejos: se manifiestan como pequeas invaginaciones de
la membrana, con forma laminar o a base de tubos dispuestos de
forma verticilada.
Funciones:

La porcin de membrana del mesosoma correspondiente a la
invaginacin primaria (pero no as a la secundaria) posee una
composicin semejante a la de la membrana citoplsmica, por lo
que se le pueden aplicar los papeles que ya hemos estudiado
(transporte de electrones, sntesis de componentes de las
envueltas...).

Probable papel en la sntesis del septo transversal, quiz regulando
las autolisinas implicadas en la divisin celular (vase tema 5bis).

Puntos de anclaje del cromosoma bacteriano (y quiz de algunos
plsmidos), actuando en la segregacin de los cromosomas hijos a
las clulas hermanas (y en el caso de las bacterias esporuladas, en
la segregacin de los cromosomas a los compartimentos de la
clula madre (esporangio) y de la preespora.

Zonas de secrecin de ciertas exoenzimas (p. ej., penicilinasa en
Bacillus).
3.2 CROMATFOROS
Son invaginaciones de la membrana citoplsmica de las
bacterias purpreas (un grupo de bacterias fotosintticas
anoxignicas) que albergan su aparato fotosinttico. Dependiendo de
las especies, pueden adoptar formas variadas:

A modo de vesculas huecas;

capas de repliegues concntricos, a modo de lminas paralelas,
cercanas a la membrana citoplsmica;

formando tbulos, aislados o en haces.
Los cromatforos suponen obviamente una adaptacin para
aumentar la superficie de membrana til capaz de realizar las
funciones propias de la fotosntesis.
3.3 OTRAS INVAGINACIONES
En muchas bacterias quimiolitoautrofas (especialmente las
nitrificantes) existen invaginaciones de la membrana (a menudo
denominadas citomembranas) que permiten una mayor superficie
para la realizacin de sus actividades respiratorias. Sus formas y
disposiciones son igualmente muy variadas (vanse
fotomicrografas).
En Azotobacter, una bacteria aerobia fijadora de nitrgeno
atmosfrico, y que presenta una altsima tasa respiratoria, se pueden
detectar tambin invaginaciones de membrana que aumentan la
superficie disponible para sus intensos procesos de oxidacin.
3.4 TILACOIDES
Son sacos membranosos aplastados presentes en las
cianobacterias, que no estn en continuidad con la membrana
citoplsmica; en su cara externa se disponen filas de ficobilisomas
(vase captulo 7). El conjunto de membrana tilacoidal +
ficobilisomas es el responsable de la fotosntesis oxignica en este
grupo de procariotas.






Actualizado el
NDICE:
1 MEMBRANA CITOPLSMICA
1.1 COMPOSICIN QUMICA
1.1.1 CARENCIA, EN GENERAL, DE ESTEROLES
1.1.2 LPIDOS
1.1.3 PROTENAS
1.2 ESTRUCTURA
1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA
1.3.1 PARTICIPACIN EN PROCESOS
BIOENERGTICOS
1.3.2 PARTICIPACIN EN BIOSNTESIS DE
POLMEROS DE LAS ENVUETAS
1.3.3 PUNTO DE ANCLAJE DEL CROMOSOMA Y DE
ALGUNOS PLSMIDOS
1.3.4 BARRERA SELECTIVA
1.3.5 EXPORTACIN DE MOLCULAS DE SUPERFICIE
2 TRANSPORTE DE NUTRIENTES
2.1 TRANSPORTE PASIVO INESPECFICO O DIFUSIN
SIMPLE
2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECFICO O DIFUSIN
FACILITADA
2.3 TRANSPORTE ACTIVO
2.3.1 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
PROTONES
2.3.2 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
IONES SODIO
2.3.3 TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP
2.3.4 TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION
DE GRUPOS
2.4 TRANSPORTE DE HIERRO
3 ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS
INTRACITOPLSMICAS
3.1 MESOSOMAS
3.2 CROMATFOROS
3.3 OTRAS INVAGINACIONES
3.4 TILACOIDES
BIBLIOGRAFA
ENLACES

1 MEMBRANA CITOPLSMICA
1.1 COMPOSICIN QUMICA
La membrana citoplsmica bacteriana es la estructura de tipo
bicapa proteo-lipdica que delimita al protoplasto. Su proporcin
protenas: lpidos es superior a la de las membranas celulares
eucariticas, llegando a alcanzar valores relativos de 80:20.
1.1.1 CARENCIA, EN GENERAL, DE ESTEROLES
Las membranas procariticas, a diferencia de las de eucariotas,
carecen de esteroles (con las salvedades de Cianobacterias, ciertas
bacterias metilotrofas; adems, los micoplasmas presentan
colesterol, pero lo secuestran de las clulas eucariticas a las que
parasitan).
Pero en cambio, en muchas bacterias existe una peculiar clase
de compuestos policclicos, denominados hopanoides
(triterpenoides pentacclicos) que parecen condicionar parte de la
rigidez de las membranas citoplsmicas. Los hopanoides se
sintetizan a partir del mismo tipo de precursores que los esteroles.
(Por cierto, como dato curioso diremos que los sedimentos de
combustibles fsiles como el petrleo presentan cantidades
gigantescas de hopanoides, lo que confirma el papel que tuvieron las
bacterias en su formacin).
1.1.2 LPIDOS
Abundan sobre todo los fosfolpidos derivados del cido fosfatdico:

fosfatidiletanolamina

fosfatidilglicerol

cardiolipina (difosfatidilglicerol)
En bacterias Gram-positivas, adems se encuentran glucolpidos y
glucofosfolpidos.
La composicin y proporcin concretas de los distintos tipos
de lpidos son variables entre distintas cepas bacterianas, y dentro de
cada cepa, en funcin de las condiciones de cultivo (temperatura,
pH, etc.).
Los cidos grasos esterificados con el glicerol en los fosfolpidos
son principalmente:
1) saturados, como p. ej.:
a) palmtico (16:0)
b) mirstico (14:0)
c) de cadena ramificada (muy frecuentes en muchas bacterias
Gram-positivas)
2) monoinsaturados (sobre todo en Gram-negativas), como p. ej.:
a) palmitoleico (cis-9, 16:1)
b) cis-vaccnico (cis-11, 18:1)
A diferencia de eucariotas, no existen cidos grasos
poliinsaturados, con la excepcin de las Cianobacterias. Este grupo
de bacterias fotosintticas tiene, adems, la capacidad de modificar
mediante desaturasas el grado de saturacin de sus cidos grasos, lo
que representa un mecanismo adaptativo frente a cambios de
temperatura.
Las bacterias pueden modificar la proporcin entre cidos
grasos insaturados y saturados, con objeto de mantener un estado
de fluidez adecuado en la membrana, como adaptacin a cambios de
temperatura:

a altas temperaturas, aumenta la proporcin de cidos grasos
saturados,

a bajas, aumenta la de los insaturados. Las bacterias psicrfilas
(amantes del fro) presentan casi todos sus cidos grasos de tipo
insaturado.
En Arqueas, en lugar de los habituales lpidos a base de steres
de cidos grasos con glicerol, existen lpidos a base de teres de
alcoholes de cadena larga con glicerol (p. ej., difitanil-glicerol-
diteres). Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este
tipo de membranas son ms rgidas que las de eubacterias. Incluso
existen arqueas con membranas a partir de tetrafitanil-diglicerol-
tetratereres, que consituyen bicapas monomoleculares.
Como ya vimos en el tema anterior, la membrana citoplsmica
alberga un transportador lipdico de tipo politerpenoide, llamado
undecaprenil-fosfato, presente en pequea cantidad (<1%).
Igualmente se dan quinonas isoprenoides (como la menaquinona o
la ubiquinona) que, como veremos en otro captulo, participan en
cadenas de transporte de electrones. En algunas bacterias existen
igualmente variedades de pigmentos carotenoides.
1.1.3 PROTENAS
Constituyen la mayor parte de la membrana bacteriana (hasta
el 80% en peso seco). Existe una gran variedad de tipos de protenas
en una misma bacteria (hasta 200), pero la composicin y
proporcin concreta vara segn las condiciones de cultivo.
Segn su localizacin en la membrana, y su grado de unin
con la porcin lipdica, se distingue entre:

protenas integrales de membrana (=endoprotenas): son
protenas estrechamente unidas a la membrana, por lo general
atravesadas en plena bicapa lipdica. Son difciles de extraer,
tenindose que recurrir a detergentes y/o disolventes orgnicos
para separarlas respecto de los lpidos. Las protenas integrales
pueden desplazarse lateralmente en la bicapa lipdica, pero no son
capaces de rotar, por lo que siempre presentan una determinada
orientacin o polaridad. Algunas presentan hidratos de carbono
que sobresalen hacia la superficie externa (glucoprotenas).

Protenas perifricas (= epiprotenas): unidas a la superficie de
la membrana, de forma ms dbil, por lo que son ms fciles de
extraer y purificar. Incluso algunas establecen contactos slo
transitorios con la membrana.


1.2 ESTRUCTURA
Mtodos de observacin y estudio
A microscopio ptico, se recurre a la tincin con Azul
Victoria. A microscopio electrnico, en cortes ultrafinos, se
observan una estructura de unos 7 nm de grosor, con dos capas
externas densas a los electrones limitando una capa central
transparente.
Los estudios mediante difraccin de rayos X y de resonancia
magntica nuclear (RMN) demuestran una estructuracin bsica a
base de cadenas de fosfolpidos en una bicapa, segn se describe a
continuacin.
Estructura
Consiste en una bicapa lipdica, con los grupos polares
(hidrfilos) hacia afuera, y las cadenas hidrofbicas de cidos grasos
(o, en el caso de Arqueobacterias, de alcoholes) hacia adentro,
ajustndose al modelo de mosaico fluido de Singer y Nicholson.
Inmersas en esta bicapa se encuentran las abundantes protenas, que
pueden moverse lateralmente en el mosaico de molculas de lpidos,
igualmente dotados de una rpida movilidad. Parece ser que no
existe movilidad de lpidos entre las dos capas.
La membrana citoplsmica es asimtrica (aunque no tanto
como la membrana externa de Gram-negativas). Esto se traduce en
el hecho de que muchos de los procesos que tienen lugar en la
membrana sean vectoriales (tengan una direccin determinada).
1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA
La membrana citoplsmica de los procariotas es una notable
estructura multifuncional (como uno podra esperar de la
constatacin del gran nmero de tipos de protenas), siendo el sitio
donde se producen muchos procesos metablicos complejos, en un
grado desconocido en el resto del mundo vivo.
Citemos brevemente las principales funciones de la membrana
procaritica (aunque en este y otros temas las estudiaremos en
detalle):

Barrera osmtica (que mantiene constante el medio interno),
impidiendo el paso libre de sales y de compuestos orgnicos
polares

Es el lmite metablicamente activo de la clula: establece la
frontera entre el protoplasto y el medio externo, impidiendo la
prdida de metabolitos y macromolculas del protoplasto.

Ahora bien, merced a sistemas de transporte, permite
selectivamente el paso de sustancias entre el exterior y el interior
(y viceversa).

Interviene, adems, en procesos bioenergticos (fotosntesis,
respiracin)

Participa en la biosntesis de componentes de membrana, de
pared y de cpsulas,

En la secrecin de protenas.
Desglosaremos brevemente estos diversos tipos de papeles de la
membrana.
1.3.1 PARTICIPACIN EN PROCESOS BIOENERGTICOS
Contiene todos los componentes requeridos para la
transduccin de energa y la produccin de ATP, por procesos
respiratorios. En el caso de una bacteria quimiotrofa, esto incluye:

deshidrogenasas

cadenas de transporte de electrones (con quinonas, citocromos,
etc.)

ATP-asas (ATP sintasas/hidrolasas)
Algunas bacterias fotosintticas anaerobias tambin incluyen este
tipo de componentes en la membrana citoplsmica.
En un captulo posterior veremos en ms detalle cmo explica
la teora quimiosmtica de Mitchell el acoplamiento entre el
funcionamiento de las cadenas de transporte electrnico (o de la
ATP-hidrolasa) y la generacin de un gradiente de protones a travs
de la membrana (potencial electroqumico o fuerza protn-motriz),
el cual a su vez puede:

generar ATP (desarrollo de un trabajo qumico)

promover transporte de ciertos nutrientes (trabajo osmtico)

promover movimiento flagelar (trabajo mecnico).
1.3.2 PARTICIPACIN EN BIOSNTESIS DE POLMEROS
DE LAS ENVUETAS
Como ya hemos visto en temas anteriores, la membrana
alberga transportadores (como el undecaprenil-P) y enzimas
relacionados con fases de la biosntesis de polisacridos de la
cpsula, peptidoglucano, cidos teicoicos y teicurnicos y
lipopolisacrido. Igualmente en ella se localizan los enzimas
implicados en la sntesis de los lpidos de la propia membrana.
1.3.3 PUNTO DE ANCLAJE DEL CROMOSOMA Y DE
ALGUNOS PLSMIDOS
Como veremos, sigue estando debatido si un tipo de
invaginacin de la membrana, llamado mesosoma (ver ms adelante,
en este captulo, apartado 3.1) es o no un artefacto, pero parece fuera
de duda que el cromosoma se ancla de alguna manera a la cara
interna de la membrana (sea a los mesosomas, o como proponen
otros, a la cara interna de los anillos perispticos). En la zona de
anclaje parecen residir algunos de los enzimas encargado de la
replicacin. La membrana tiene igualmente un papel en la
separacin (segregacin) de las dos copias del cromosoma replicado
a las clulas hijas.
1.3.4 BARRERA SELECTIVA
Mantiene la constancia del medio interno (impidiendo la salida
de iones, metabolitos y macromolculas), pero simultneamente
permite o promueve activamente la entrada de nutrientes y la
salida de los productos de desecho o de ciertas molculas
excretadas. La funcin de transporte de nutrientes ser tratada en
detalle ms adelante en este captulo.
1.3.5 EXPORTACIN DE MOLCULAS DE SUPERFICIE
Se trata de un sistema por el que ciertas protenas son trasladadas a
su localizacin definitiva en la membrana citoplsmica, por la
intervencin de la protena YidC, que interacciona con zonas
hidrofbicas de aquellas. Un ejemplo de protenas insertadas de este
modo lo constituye la ATP-sintasa de eubacterias. Este sistema, al
parecer filogenticamente primitivo, aparece en eubacterias, parte de
arqueas (euriarqueas) y en mitocondrias (donde se denomina Oxa1)
y cloroplastos (Alb3), pero no en eucariotas.
2) SISTEMA Sec
El sistema Sec es un sistema universal para la secrecin de
protenas, es decir, aparece en los tres dominios de la vida, aunque
con variantes en cada uno de ellos. Nosotros vamos a describir el
caso de las eubacterias.

Las protenas secretadas se sintetizan como pre-protenas dotadas
en el extremo N-terminal de un pptido seal, de unos 20-30
aminocidos. Dicha zona consta a su vez de un extremo N-
terminal cargado positivamente, seguida de un trecho hidrofbico,
y termina con una zona ms polar dotada al final del sitio que va a
ser roto por la peptidasa del lder.

Cuando an est en el citoplasma, la pre-protena naciente se une a
la protena SecB (una chaperona especfica de esta ruta), la cual
impide que la pre-protena se pliegue totalmente.

La protena SecA, que forma un homodmero, reconoce el
complejo SecB-preprotena, y lo traslada al complejo de protenas
de membrana SecYEG, que tiene un canal interior de unos 20-30
. (Al parecer el canal consta de 3-4 complejos SecYEG).

Ahora, la protena SecA, con gasto de ATP, logra que los primeros
20-30 aminocidos de la pre-protena entren a travs del canal Sec,
con lo que el pptido seal aparece por el lado exterior de la
membrana.

Una vez que el pptido seal asoma por el otro lado de la
membrana, es cortado en el sitio especfico por la peptidasa lder,
lo que ayuda a liberar al exterior la parte madura de la protena
secretada.
3) SISTEMA SRP
El sistema SRP procaritico es mucho ms sencillo que el homlogo
SRP que se encuentra en la membrana del retculo endoplsmico de
eucariotas. En este sistema, el extremo N-terminal de la protena
naciente es reconocido por la partcula de reconocimiento de seal,
conocida por sus siglas SRP.

La SRP eubacteriana consta de un pequeo ARN y una protena
(Ffh).

Una vez que la SRP reconoce el extremo N-terminal de la protena
naciente, parece que provoca la detencin momentnea de la
traduccin, y conduce a esa protena naciente hasta el receptor de
la partcula SRP (SR), a nivel de membrana citoplsmica.

A su vez esto provoca la interaccin del pptido naciente con el
complejo Sec, que ser el que logre la secrecin o insercin en
membrana de la protena madura.
4) SISTEMA Tat
Este sistema se ha empezado a caracterizar recientemente, y solo se
ha descubierto en procariotas y en cloroplastos, pero no en
mitocondrias ni en eucariotas. Se caracteriza por trasladar al exterior
(o al espacio periplsmico de Gram-negativas) protenas ya en su
configuracin nativa, y en su caso, dotadas ya de sus cofactores
(grupos FeS, molibdopterina, cofactores nucleotdicos, etc.). Es
decir, a diferencia de los anteriores, las protenas se pliegan /y en su
caso adquieren los cofactores) antes de ser trasladadas. Este sistema
se llama Tat debido a que reconoce una secuencia seal en la que
existen dos argininas gemelas (una a continuacin de otra, twin
arginine transport). Consta de al menos tres tipos de protenas de
membrana: TatA, TatB y TatC. Varias unidades de TatA atraviesan
la membrana formando una empalizada que deja un gran canal de
unos 60 . Cmo se logra el transporte a travs de este gran agujero
en la membrana sin que se pierda su capacidad de barrera selectiva
es una hazaa que se est investigando.
2 TRANSPORTE DE NUTRIENTES
Lo primero que tiene que hacer un microorganismo a la hora
de su nutricin es captar los nutrientes que necesite desde el medio
exterior. Debido a que la bicapapa lipdica acta como barrera que
impide el paso de la mayor parte de las sustancias, esto significa que
deben existir mecanismos especficos para lograr la entrada de los
nutrientes. Adems, teniendo en cuenta que las bacterias suelen vivir
en medios diluidos, deben realizar un trabajo para trasladar
muchos de esos nutrientes en contra del gradiente de concentracin.
Tradicionalmente se viene considerando tres mtodos
principales de transporte de sustancias a travs de la membrana:

transporte pasivo inespecfico (= difusin simple);

transporte pasivo especfico (= difusin facilitada);

transporte activo.
Como veremos, los ms importantes en procariotas son los sistemas
de transporte activo.
2.1 TRANSPORTE PASIVO INESPECFICO O DIFUSIN
SIMPLE
Este transporte consiste en la difusin pasiva de ciertas
sustancias para las que la membrana es impermeable, debido a la
diferencia de concentracin (AC) a ambos lados de dicha membrana
(la sustancia tiene mayor concentracin fuera que dentro de la
clula). Aparte de esta diferencia de concentracin, en la difusin
pasiva influyen:

la constante de permeabilidad (P), es decir, el grado de
permeabilidad de la membrana a la sustancia en cuestin;

el rea o superficie total (A) a travs de la que se produce el
transporte.
Las membranas citoplsmicas son impermeables en s mismas
a la mayor parte de las molculas. Slo se da en el caso de O
2
, CO
2
,
NH
3
, agua y otras pequeas sustancias polares no ionizadas.
La difusin simple se produce por el paso de estas sustancias a
travs de poros inespecficos de la membrana citoplsmica.
2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECFICO O DIFUSIN
FACILITADA
Es un proceso que permite el paso de compuestos por difusin
a travs de transportadores estereoespecficos y (al igual que en el
caso anterior) sobre la base de un gradiente de concentracin (en la
direccin termodinmicamente favorable).
El transportador suele ser una protena integral de membrana
(permeasa o facilitador), cuya conformacin determina un canal
interior, y por el cual un determinado sustrato puede alcanzar el
interior, sin gasto de energa. Se piensa que cuando el soluto se une
a la parte de la permeasa que da al exterior, esta protena sufre un
cambio conformacional que libera la molcula en el interior. Como
al entrar la molcula, enseguida entra en el metabolismo y
desaparece como tal, esto basta para mantener el gradiente de
concentracin que permite esta difusin. La difusin facilitada
exhibe propiedades similares a las de las reacciones enzimticas:

Especificidad de sustrato: cada permeasa transporte un solo tipo de
sustratos qumicamente parecidos.

Cintica de saturacin de tipo Michaelis-Menten, es decir, la
velocidad de transporte aumenta con la concentracin de sustrato,
hasta un valor lmite (V
max
) por encima del cual ulteriores
aumentos del soluto no aumentan dicha velocidad (debido a que
todas las porinas disponibles estn ya totalmente ocupadas):
Velocidad de entrada: V
ent
= V
mx
[S
ext
] /K
m
+ [S
ext
]
Velocidad de salida: V
sal
= V
mx
[S
int
] /K
m
+ [S
int
]
Aunque este sistema de transporte es muy comn en
eucariotas, es muy raro encontrarlo en bacterias. La explicacin
evolutiva es que los procariotas suelen vivir en ambientes con pocas
concentraciones de nutrientes, y por lo tanto no es frecuente que se
den gradientes adecuados. Una de las pocas excepciones la
constituye el glicerol, que es transportado por difusin facilitada en
una amplia gama de bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-
negativas. Conforme el glicerol entra, es rpidamente convertido a
glicerol-fosfato; por lo tanto, la concentracin interna de glicerol
como tal es prcticamente nula, lo que facilita esta difusin incluso a
bajas concentraciones exteriores de esta sustancia. En Zymomonas
existe un facilitador de membrana que transporta glucosa.

2.3 TRANSPORTE ACTIVO
Consiste en el transporte de sustancias en contra de un
gradiente de concentracin, lo que requiere un gasto energtico.
En la mayor parte de los casos este transporte activo (que supone un
trabajo osmtico) se realiza

a expensas de un gradiente de H
+
(potencial electroqumico de
protones) previamente creado a ambos lados de la membrana,
por procesos de respiracin y fotosntesis;

por hidrlisis de ATP.
Los sistemas de transporte activo son los ms abundantes entre
las bacterias, y se han seleccionado evolutivamente debido a que en
sus medios naturales la mayora de los procariotas se encuentran de
forma permanente o transitoria con una baja concentracin de
nutrientes.
Los sistemas de transporte activo estn basados en permeasas
especficas e inducibles. El modo en que se acopla la energa
metablica con el transporte del soluto an no est dilucidado, pero
en general se maneja la hiptesis de que las permeasas, una vez
captado el sustrato con gran afinidad, experimentan un cambio
conformacional dependiente de energa que les hace perder dicha
afinidad, lo que supone la liberacin de la sustancia al interior
celular.
Estudiaremos los siguientes tipos de transporte activo:

transporte activo ligado a simporte de protones;

transporte activo ligado a simporte de iones Na
+


transporte activo dirigido por ATP

transporte acoplado a translocacin de grupos.
2.3.1 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
PROTONES
Como se recordar, el simporte se puede definir como el
transporte simultneo de dos sustratos en la misma direccin, por un
mismo transportador sencillo. En el caso del transporte activo ligado
a simporte de protones, lo que ocurre es que uno de los sustratos
(H
+
) ha creado previamente un gradiente de concentracin, cuya
disipacin es aprovechada por el otro sustrato para entrar con l.
Este otro sustrato puede ser:

una molcula de carga negativa: en este caso, su simporte ligado a
protones tiende a disipar slo el gradiente de concentracin.
Ejemplos: transporte de iones fosfato, de glutamato, etc.

una molcula neutra: en este caso, su simporte tiende a disipar no
slo el gradiente de concentracin, sino tambin el gradiente
elctrico. Ejemplo: en Escherichia coli, la lactosa usa una -
galactsido-permeasa, que es una de las permeasas bacterianas
ms intensamente estudiadas.
Por otro lado, ciertas molculas catinicas (iones K
+
, lisina), son
transportadas directamente a travs de permeasas, en ausencia de
simporte de protones.
2.3.2 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE
IONES SODIO
Se puede considerar una versin modificada del anterior:
algunas sustancias no son transportadas activamente de forma
directa por el potencial electroqumico de protones, sino
indirectamente, a travs de un gradiente de Na
+
que a su vez se
origina a expensas de dicha fuerza protn-motriz (fpm).
El sustrato entra por una permeasa, junto con iones Na
+
, pero a
su vez este sodio se recicla por un sistema de antiporte, a expensas
de la disipacin del potencial de protones.
Ejemplo: el azcar melibiosa, en el caso de la enterobacteria E.
coli.
Estos dos tipos de transporte activo ligados a simporte quedan
inhibidos si tratamos las clulas con algn agente ionforo (p. ej., el
antibitico valinomicina), que destruye el potencial electroqumico
de protones.
El transporte activo ligado a simporte de iones (H
+
, Na
+
)
resulta muy econmico, ya que slo se gasta un protn por cada
molcula transportada, mientras que por cada ATP sintetizado se
suelen gastar 3 protones que se disipan en las ATPasas. Las
permeasas que realizan este transporte suelen ser protenas integrales
de membrana provistas de unos 12 segmentos transmembranosos en
configuracin de o-hlice.
2.3.3 TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP
El tipo paradigmtico de este tipo de transporte se denomina de
transportadores ABC o ATPasas de trfico, y se conocen muchos
ejemplos en eubacterias y arqueas. Vamos a describir el caso de un
sistema ABC en enterobacterias (como E. coli). Se trata de un
sistema de varios componentes, en el que existen protenas
periplsmicas que captan el sustrato con gran afinidad, y lo llevan
hasta unas protenas de membrana, las cuales acoplan el paso de
dicho sustrato hasta el citoplasma (sin alteralo qumicamente) con la
hidrlisis de ATP.
La denominacin de "transportadores ABC" se debe a que en
todos ellos existe una o dos protenas perifricas de
membrana citoplsmica que poseen un dominio (de unos 200
aminocidos) conservado evolutivamente, denominado
"cassette de unin a ATP" (las iniciales de ATP-binding
cassette generan la sigla "ABC"). Al parecer este dominio
ABC conservado es muy antiguo, y parece que ya exista
antes de la divergencia evolutiva entre procariotas y
eucariotas. Existen muchos ejemplos de protenas ABC, tanto
en procariotas como eucariotas (de hecho constituyen la
mayor familia de protenas filogenticamente relacionadas de
todo el mundo vivo). Los primeros ejemplos de esta gran
familia estaban implicados en transportar sustancias a uno u
otro lado de la membrana. En otro tema veremos ejemplos de
transportadores ABC que funcionan "al revs" de los de este
tema: son "exportadores" de protenas recin sintetizadas que
deben insertarse en las envueltas bacterianas o ser
excretadas al medio. Pero se ha descubierto que la gran
familia de protenas ABC est implicada en otros procesos
(regulacin gentica, reparacin de ADN, patogenicidad, etc).
Elementos de este tipo de sistema:

Porinas u otras protenas de membrana externa para lograr la
difusin del sustrato desde el medio hasta el espacio periplsmico.

Protena(s) solubles de espacio periplsmico que se unen al
sustrato con gran afinidad.

Un heterodmero formado por dos protenas integrales de
membrana (cada una de ellas posee 5 o 6 trechos en o-hlice que
atraviesan la membrana citoplsmica), que son la permeasa
propiamente dicha del sistema (el canal por donde pasa el
sustrato).

Dos protenas perifricas de membrana citoplsmica, adosadas al
lado citoplsmico, que incluyen el mdulo conservado ABC que
acopla la hidrlisis de ATP con el transporte unidireccional del
sustrato a travs de la membrana.
Modelo del mecanismo de este sistema:
1. El sustrato exgeno normalmente entra al periplasma a travs de
algn canal inespecfico o porina de membrana externa (por
ejemplo, en enterobacterias se pueden usar las porinas generales
conocidas como OmpF y OmpC).
2. La protena periplsmica especfica, antes de su unin al sustrato
tiene una determinada configuracin (denominada abierta), con
dos grandes lbulos globulares unidos formando un ngulo (la
forma recuerda una almeja a medio abrir). Cuando el sustrato
pasa al periplasma, la correspondiente protena de unin
periplsmica se une a l con gran afinidad (0.1-1 M), y al unirse
cambia de conformacin. En esta configuracin, llamada
cerrada, el sustrato se encuentra enterrado entre los dos
lbulos de la protena (almeja cerrada).
3. Mientras tanto, el dmero de protenas integrales de membrana
(antes de la unin con la protena periplsmica) se encuentra en
un estado energizado pero incapaz de transportar sustrato. En esta
situacin, puede unirse (por la parte que da al periplasma) al
complejo formado por la protena periplsmica (en configuracin
cerrada) ligada al sustrato. Al hacer esto, el heterodmero de
membrana cambia de conformacin, de modo que ahora muestra
mayor afinidad hacia la protena periplsmica y se abre su canal
para dejar entrar el sustrato.
4. Entonces, el complejo de membrana alcanza su estado de mnima
energa, y con ello descarga el sustrato en el citoplasma y se logra
la separacin de la protena periplsmica (que vuelve a su
configuracin abierta).
5. Finalmente, la hidrlisis de ATP catalizada por las protenas
perifricas ABC (adosadas a la membrana y asociadas a las
protenas integrales) suministra la energa para que el
heterodmero de membrana vuelva a su estado energizado inicial,
preparado as para otro ciclo de transporte.

El sistema ABC de bacterias Gram-negativas, queda
puesto de manifiesto cuando lo impedimos por algn
procedimiento que altere o elimine la membrana externa
(conversin a esferoplastos): Por ejemplo: tratemos E. coli
con el quelante EDTA en una solucin tamponada
isotnica (con un 20% de sacarosa). Centrifugamos y el
sedimento de clulas lo resuspendemos en una solucin
de MgCl
2
en fro (0C). El resultado es que las protenas
del periplasma escapan al medio externo. Esto es un caso
de tratamiento por choque osmtico que origina prdida
de contenidos del periplasma. Se comprueba que ciertos
sistemas de transporte quedan inutilizados, debido a que
requieren para su funcionamiento, amn de protenas de
membrana citoplsmica, otras especficas del espacio
periplsmico. Por contra, este sistema no se ve afectado
por los agentes ionforos. Por esta razn, a este sistema
en Gram-negativas se le ha llamado durante mucho tiempo
transporte activo sensible a choque osmtico.
Los sistemas ABC de bacterias Gram-positivas estn menos
estudiados, pero en general se parecen a los de Gram-negativas,
salvo que carecen del transportador libre periplsmico. En su lugar
existe una protena con funciones equivalentes (captar el nutriente
del exterior), pero que est anclada al lado externo de la membrana
citoplsmica, cerca del heterodmero integral de membrana (la unin
es mediante su cistena N-terminal, que se une a un fosfolpido).
Existen muchos ejemplos de transportadores procariticos de
tipo ABC, y cada uno de ellos est especializado en transportar un
sustrato especfico o varios sustratos parecidos. Ejemplo de sustratos
transportados de esta forma:

Monosacridos como arabinosa, galactosa, maltosa, ribosa, xilosa,
etc.

Oligosacridos

Iones orgnicos e inorgnicos

Aminocidos como histidina, glicina, leucina, etc.

Oligopptidos

Algunas vitaminas y metales.

Siderforos con hierro
2.3.4 TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE
GRUPOS
Es un sistema de transporte que acopla la entrada del sustrato
con su modificacin qumica por unin covalente con un grupo
qumico. Estrictamente hablando, no es un transporte activo, porque
no funciona en contra de un gradiente de concentracin, pero se
considera de hecho como activo, ya que la concentracin del
sustrato modificado dentro de la clula supera con creces a la del
sustrato sin modificar en el exterior.
Este sistema supone un ahorro de energa metablica: aunque
en el transporte se gasta un enlace rico en energa, el sustrato queda
modificado en su paso a travs de la membrana en la forma que la
bacteria emplea como primer intermediario de su ruta metablica. Es
decir, con un solo proceso se cumplen dos funciones distintas:
transporte y preparacin qumica para la ruta, que de todas formas
habra que realizar. No es de extraar que este tipo de transporte
haya sido seleccionado frecuentemente en la evolucin bacteriana, y
que hoy lo encontremos en muchos procariotas, especialmente en
bacterias anaerobias o aerobias facultativas que recurren a
fermentaciones (recordar que las fermentaciones tienen un
rendimiento energtico menor que los procesos respiratorios; por lo
tanto, es lgico que se seleccionen mecanismos ahorradores como
el descrito).
El caso mejor estudiado de esta clase de transporte lo
constituye el llamado sistema de fosfotransferasa de azcares
(segn las casi inevitables iniciales inglesas: PTS).
En E. coli el sistema PTS permite el transporte de glucosa,
manosa, fructosa y los polioles sorbitol y manitol.
Consta de varios componentes que funcionan como una cadena
de transportadores del grupo fosfato de alta energa del
fosfoenolpirvico (PEP) hasta el azcar a transportar en cuestin.

Las dos primeras protenas son inespecficas respecto del azcar
(son comunes a los diversos sustratos a transportar), tienen
localizacin citoplsmica y su sntesis es constitutiva. Se
conocen como

Enzima-I (EI)

HPr (esta ltima es una pequea protena termoestable, rica en
histidina).

El otro componente, llamado Enzima II (EII) es especfico de
cada azcar, y su sntesis es inducible por el correspondiente
sustrato: Suele estar compuesto por tres subunidades o dominios:

EIIA (hasta hace poco llamado EIII) es citoplsmico y soluble;

EIIB es un dominio perifrico de membrana: aunque es hidrfilo,
se liga al lado citoplsmico de la membrana a travs de EIIC.

EIIC es una protena integral de membrana
Veamos cmo funciona el sistema:
1. Por un lado, el azcar se une al enzima EIIC especfico, pero ste
por s mismo no puede liberar al azcar sin modificar en el
interior celular.
2. Mientras tanto, la EI cataliza (en presencia de Mg
++
) la
transferencia del fosfato de alta energa del PEP a la HPr.
3. La HPr fosforilada (HPr-P) transfiere el fosfato al enzima IIA
especfico del azcar [p. ej., la glucosa (EIIA
Glc
) o el manitol
(EIIA
Mtl
)].
4. La EIIA-P rpidamente, y en presencia de Mg
++
, transfiere el
fosfato a la enzima-IIB especfica con la que se asocia (p. ej.,
EIIB
Glc
), que a su vez fosforila el azcar (en el caso de la glucosa
convirtindola en glucosa-6-P): en este momento la EIIC pierde
su afinidad por el azcar modificado, que de esta forma entra en
el citoplasma, preparado ya para actuar como sustrato de la
primera reaccin del catabolismo de este azcar.
Otros ejemplos de transporte acoplado a translocacin de grupos:

Entrada de cidos grasos mediante un sistema de transferencia de
Coenzima A, que los transforma en acil-CoA.

Entrada de purinas y pirimidinas, mediante un sistema de
fosforribosil-transferasas:
purina o pirimidina (exterior) + PRPP NMP (interior) + P
(PRPP = fosforribosil-pirofosfato)
(NMP = nuclesido monofosfato)
En bacterias es frecuente encontrar varios sistemas de
transporte para un mismo nutriente (p. ej., Escherichia coli posee
cinco sistemas para transportar la galactosa y tres sistemas para
algunos de los aminocidos. Los diversos sistemas se diferencian en
cuanto a su requerimiento energtico, su afinidad, su regulacin, etc.
Lgicamente, la evolucin ha debido seleccionar esta redundancia
de sistemas de transporte con objeto de permitir que el
microorganismo sobreviva bajo diversas circunstancias ambientales.
2.4 TRANSPORTE DE HIERRO
El hierro es un cofactor de muchas enzimas y citocromos, por
lo que las bacterias necesitan captarlo. La captacin de hierro se
complica porque el in frrico (Fe
3+
) es muy insoluble. Adems, las
bacterias que viven dentro de animales superiores tienen un
problema: en los fluidos y tejidos de sus patrones el hierro libre es
muy poco abundante (el hierro suele estar acomplejado con
protenas), por lo que se vuelve vital aprovisionarse con este
elemento de alguna manera.
Muchas bacterias secretan unas molculas de bajo peso
molecular llamadas en general siderforos, que son capaces de
formar quelatos (complejos) con el hierro frrico. Por ejemplo,
Escherichia coli secreta un siderforo llamado enterobactina.
Cuando la enterobactina se une al hierro, forma un complejo
octadrico, que luego se engarza con un receptor especfico de la
membrana externa, tras lo que el hierro se libera al espacio
periplsmico, desde donde entra al citoplasma por medio de una
protena de unin periplsmica acoplada a un sistema ABC similar
al visto ms arriba.
3 ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS
INTRACITOPLSMICAS
3.1 MESOSOMAS
Son estructuras membranosas intracitoplsmicas que se
observan en la mayor parte de las bacterias, constituidas por
invaginaciones de la membrana citoplsmica.
Observacin:
A microscopio ptico se pueden detectar con tincin negativa
con cido fosfotngstico. A microscopio electrnico se observa que,
por lo general, el mesosoma se ubica en determinadas
localizaciones: sitios donde se inicia la divisin celular; tabiques
transversales en crecimiento (incluyendo los que delimitan el
compartimento de la endospora); zonas cercanas a los nucleoides
(cuerpos nucleares). Desde hace mucho tiempo se viene discutiendo
si los mesosomas son en realidad estructuras autnticas de la
bacteria, o como dicen otros, meros artefactos de las tcnicas
microscpicas empleadas. El debate an no est apagado, segn
algunos destacados microbilogos.
Estructura y composicin:
Los mesosomas ms caractersticos y patentes son los de
bacterias Gram-positivas. Su aspecto al microscopio electrnico es
el de repetidas invaginaciones de la membrana: una invaginacin
primaria en forma de sculo irregular, de la que surge una
invaginacin secundaria, llamada tbulo mesosmico, que rellena el
hueco de la invaginacin primaria. El tbulo mesosmico suele
consistir en un conjunto de pequeas vesculas arrosariadas, o
tbulos, conectados entre s, a veces con aspecto de cebolla.
Los mesosomas de Gram-negativas son menos conspicuos y
menos complejos: se manifiestan como pequeas invaginaciones de
la membrana, con forma laminar o a base de tubos dispuestos de
forma verticilada.
Funciones:

La porcin de membrana del mesosoma correspondiente a la
invaginacin primaria (pero no as a la secundaria) posee una
composicin semejante a la de la membrana citoplsmica, por lo
que se le pueden aplicar los papeles que ya hemos estudiado
(transporte de electrones, sntesis de componentes de las
envueltas...).

Probable papel en la sntesis del septo transversal, quiz regulando
las autolisinas implicadas en la divisin celular (vase tema 5bis).

Puntos de anclaje del cromosoma bacteriano (y quiz de algunos
plsmidos), actuando en la segregacin de los cromosomas hijos a
las clulas hermanas (y en el caso de las bacterias esporuladas, en
la segregacin de los cromosomas a los compartimentos de la
clula madre (esporangio) y de la preespora.

Zonas de secrecin de ciertas exoenzimas (p. ej., penicilinasa en
Bacillus).
3.2 CROMATFOROS
Son invaginaciones de la membrana citoplsmica de las
bacterias purpreas (un grupo de bacterias fotosintticas
anoxignicas) que albergan su aparato fotosinttico. Dependiendo de
las especies, pueden adoptar formas variadas:

A modo de vesculas huecas;

capas de repliegues concntricos, a modo de lminas paralelas,
cercanas a la membrana citoplsmica;

formando tbulos, aislados o en haces.
Los cromatforos suponen obviamente una adaptacin para
aumentar la superficie de membrana til capaz de realizar las
funciones propias de la fotosntesis.
3.3 OTRAS INVAGINACIONES
En muchas bacterias quimiolitoautrofas (especialmente las
nitrificantes) existen invaginaciones de la membrana (a menudo
denominadas citomembranas) que permiten una mayor superficie
para la realizacin de sus actividades respiratorias. Sus formas y
disposiciones son igualmente muy variadas (vanse
fotomicrografas).
En Azotobacter, una bacteria aerobia fijadora de nitrgeno
atmosfrico, y que presenta una altsima tasa respiratoria, se pueden
detectar tambin invaginaciones de membrana que aumentan la
superficie disponible para sus intensos procesos de oxidacin.
3.4 TILACOIDES
Son sacos membranosos aplastados presentes en las
cianobacterias, que no estn en continuidad con la membrana
citoplsmica; en su cara externa se disponen filas de ficobilisomas
(vase captulo 7). El conjunto de membrana tilacoidal +
ficobilisomas es el responsable de la fotosntesis oxignica en este
grupo de procariotas.

Actualizado el
NDICE:
1 FLAGELOS
1.1 INTRODUCCIN: LA MOVILIDAD EN LAS
BACTERIAS
1.2 ASPECTOS MORFOLGICOS
1.3 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA
1.3.1 FILAMENTO
1.3.2 CODO O GANCHO
1.3.3 CORPSCULO BASAL
1.4 ENSAMBLAJE DEL FLAGELO
1.5 MOVIMIENTO FLAGELAR
1.5.1 DESCRIPCION DEL MOVIMIENTO DE UNA
BACTERIA PERITRICA
1.5.2 MECANISMO DEL MOVIMIENTO ALEATORIO (EN
AUSENCIA DE ESTMULO)
1.5.2.1 EL MOTOR ES ROTATORIO Y GIRA EN AMBOS
SENTIDOS
1.5.2.2 COMPONENTES DEL MOTOR Y DEL
CONMUTADOR
1.5.2.3 ASPECTOS ENERGTICOS
1.5.3 LAS TAXIAS
1.5.3.1 DEFINICIONES
1.5.3.2 TIPOS DE TAXIAS
1.5.3.3 ESTUDIO DE LA QUIMIOTAXIA Y DE LA
ADAPTACIN
1.5.3.3.1 ESTMULOS DEL SISTEMA DE RECEPCIN,
TRANSDUCCIN DE SEAL Y ADAPTACIN
1.5.3.3.2 EL CICLO DE EXCITACIN-ADAPTACIN
2 FLAGELOS PERIPLSMICOS
3 FIMBRIAS O PELOS (= PILI)
3.1 FIMBRIAS ADHESIVAS
3.2 PELOS SEXUALES DE BACTERIAS GRAM-
NEGATIVAS
4 PROSTECAS
5 TALLOS O PEDNCULOS
ENLACES
DIAPOSITIVAS

1 FLAGELOS
1.1 INTRODUCCIN: LA MOVILIDAD EN LAS BACTERIAS
Los procariotas capaces de moverse lo hacen por alguno de estos
sistemas:

Por flagelos provistos de un motor rotatorio

Por pelos de tipo IV, que dan lugar a dos tipos de desplazamiento:

Por sacudidas o contracciones en ciertas especies (de los gneros
Neisseria y Pseudomonas)

Movilidad social por deslizamiento sobre superficies slidas en
mixobacterias

Por secrecin de sustancias mucosas a travs de toberas
(conjuntos de poros especiales) en la superficie celular: lo que da
origen a deslizamiento en ciertas cianobacterias y en
mixobacterias, a modo de patinaje de la clula sobre el moco
depositado sobre la superficie.

Por un mecanismo de trinquete, responsable del deslizamiento en
especies del grupo Cytophaga-Flavobacterium. En este caso
existen un doble juego de protenas, uno de membrana
citoplsmica y otro de membrana externa. Ambos juegos estn
engarzados entre s probablemente a nivel del peptidoglucano. Las
protenas de membrana citoplsmica se desplazan, y a su vez
provocan movimiento en las de membrana externa. Todo ello se
asemeja a una correa sin fin o cadena de un tanque, que al
moverse en un sentido sobre una superficie, impulsan a la clula
en el sentido opuesto.
El mejor estudiado de todos esos sistemas es de los flagelos. Los
flagelos eubacterianos tpicos son largos apndices filamentosos
extracelulares, helicoidales, responsables del desplazamiento en
medios lquidos de la mayor parte de las bacterias mviles. Aunque
empleamos la misma palabra para designar a los orgnulos
locomotores de procariotas y eucariotas, ambos son totalmente
diferentes, tanto en estructura como en mecanismo de
funcionamiento:

El filamento del flagelo bacteriano, que constituye su porcin
externa ms visible, consta generalmente de un solo tipo de
protena, y en l no se realiza ningn trabajo quimiomecnico.

El mecanismo del flagelo bacteriano es rotatorio, con un motor
reversible (funciona en los dos sentidos de giro).

La energa que propulsa a este motor no es ATP ni ninguna otra
molcula con enlaces energticos, sino que deriva directamente del
gradiente de protones (fuerza protn-motriz).
1.2 ASPECTOS MORFOLGICOS

En preparaciones en fresco a microscopa ptica normal no
se pueden detectar los flagelos individuales, debido a su
extrema delgadez (estn ligeramente por debajo del lmite
resolutivo del microscopio). El microscopio de contraste de
fases logra visualizar los penachos densos de flagelos de
ciertas bacterias.

En cambio, la microscopa ptica de alta intensidad en
campo oscuro, as como la microscopa fluorescente s
logra discernir los flagelos.

Pueden estudiarse fcilmente mediante impregnacin
argntica en preparaciones previamente fijadas por
procedimientos suaves que no destruyan la estructura
(alcohol-ter) y con mordientes que la engruesan
artificialmente: cido tnico, sales de Al y Cr. (remitimos al
alumno a la correspondiente prctica).
Los flagelos se observan como filamentos helicoidales largos y
finos. La longitud es variable (no est determinada de modo fijo): de
5 a 10 m, pero su anchura o dimetro es constante y uniforme para
cada especie: en Escherichia coli es de 20 nm. El carcter helicoidal
del filamento es propio e intrnseco: para cada especie los
parmetros de la hlice (longitud de onda y amplitud) son fijos y
caractersticos.
Existe una serie de especies Gram-negativas (Vibrio,
Photobacterium, Bdellovibrio) que poseen flagelos muy engrosados,
debido a que estn envueltos en una vaina que presenta continuidad
con la membrana externa.
El patrn de flagelacin (es decir, el nmero y localizacin de los
flagelos) vara entre especies, y reviste inters en la determinacin
taxonmica:

un solo flagelo: bacterias monotricas. Normalmente la insercin
del flagelo (en bacterias bacilares) es polar o subpolar.

dos o ms flagelos formando un penacho, normalmente en un
polo: lofotricas. (por ejemplo, en Spirillum volutans hay ms de
80 flagelos en el penacho).

dos penachos de flagelos, uno en cada polo: bacterias anfitricas.

flagelos repartidos por toda la superficie: bacterias peritricas. (Por
ejemplo, Escherichia coli posee 10 flagelos, mientras que Proteus
mirabilis posee cientos, dando aspecto muy denso a la disposicin
de stos).

Ciertas bacterias presentan flagelos de insercin lateral, bien en
penachos densos (Selenomonas), bien diseminados (Pectinatus).
Existe una serie de especies Gram-negativas (Vibrio,
Photobacterium, Bdellovibrio) que poseen flagelos muy engrosados,
debido a que estn envueltos en una vaina que presenta continuidad
con la membrana externa
1.2 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA
El flagelo eubacteriano es una de las estructuras procariticas ms
complejas, formada por ms de 20 tipos de protenas estructurales.
Ya a microscopa electrnica se pueden distinguir tres partes o
subestructuras:

filamento helicoidal largo; est conectado a un corto segmento
curvado denominado...

codo o gancho, que a su vez est unido al...

corpsculo basal. Este corpsculo basal est inmerso en las
envueltas (membrana citoplsmica y pared), y consta
esencialmente de un cilindro que ensarta 1 o 2 parejas de anillos.
En los ltimos aos se ha visto que, relacionado con este
corpsculo existen ms subestructuras. En conjunto, este
corpsculo ampliado que ahora conocemos tiene varias
funciones:

anclar el flagelo a las envueltas

suministrar el mecanismo del movimiento (un motor rotatorio
que puede girar en ambos sentidos)

albergar la maquinaria de exportacin de subunidades de
protenas para su ensamblaje en la estructura flagelar acabada

Estructura
de un
flagelo de
una
bacteria
Gram-
negativa
1.3.1 FILAMENTO
El filamento es una estructura cilndrica fina, hueca y rgida, con
aspecto helicoidal. Est constituido por el arrollamiento de miles de
subunidades idnticas de una protena llamada flagelina. La
flagelina es una protena globular relativamente elongada, con pesos
moleculares variados, segn las especies (desde unos 15 kDa en
algunos Bacillus hasta unos 62 kDa en algunas enterobacterias). Las
subunidades de flagelina se disponen formando una matriz
cilndrica, en la que se distinguen 11 hileras cuasi-axiales (casi
verticales) de subunidades; las hileras cuasi-axiales se denominan
fibrillas. El cilindro est hueco (deja un canal en su interior de unos
3 nm). El filamento es notablemente rgido, de modo que durante
el movimiento activo slo se producen pequeas deformaciones,
pero sin afectar a los parmetros de la hlice.
En el extremo distal del filamento existe un capuchn formado por
un pentmero de una protena distinta (HAP2). Entre el filamento y
el codo existen dos discos estrechos con dos tipos de protenas
(HAP3 y HAP1). Son estructuras adaptadoras que permiten la
correcta interaccin entre filamento y codo.
El filamento tiene un papel pasivo, actuando de manera anloga a
la hlice de un barco. El movimiento de rotacin del motor (situado,
como veremos, en el corpsculo basal) se comunica (a travs del
codo) al filamento helicoidal rgido, lo que permite el avance de la
bacteria.
Tanto la flagelina nativa aislada como los filamentos intactos son
buenos antgenos, constituyendo el denominado antgeno H
flagelar, especfico para cada especie e incluso para cada estirpe o
raza.
1.3.2 CODO O GANCHO
Es una estructura curvada, acodada, de 55 nm de longitud, y 22
nm de dimetro, que conecta el filamento al corpsculo basal.
Consta de unas 120 unidades de una protena elongada, distinta de la
flagelina (42 kDa), dispuestas igualmente en una matriz cilndrica de
11 fibrillas. Parece ser que el codo acta a modo de juntura
universal o flexible entre el filamento y el corpsculo basal.
Entre el codo y el filamento existen dos discos de protenas
accesorias del codo (HAP1 y HAP3). Cada uno de los discos
consiste en dos giros de hlice, e intervienen en el control del
ensamblaje del flagelo. Son estructuras adaptadoras que permiten la
correcta interaccin entre filamento y codo.
1.3.3 CORPSCULO BASAL
Entendido el corpsculo basal en su sentido actual (ms amplio de lo
que sabamos hace unos aos), es una notable estructura que,
inmersa en la membrana citoplsmica y en la pared celular, posee
varias funciones:

ancla el flagelo a la clula

est relacionada con la funcin del motor rotatorio y del
conmutador (cambio del sentido de giro)

alberga el aparato para la secrecin y correcto ensamblaje de la
mayor parte del flagelo
En Gram-negativas, consta de dos pares de anillos coaxiales
atravesados por un cilindro central hueco, junto con otra serie de
subestructuras anejas a todo lo anterior:

Los dos anillos exteriores se denominan L y P, y estn
relacionados respectivamente con la membrana externa y con el
peptidoglucano. (A veces estos dos anillos estn conectados por
una pared cilndrica que enmascara la porcin del cilindro central).

Los dos anillos interiores se denominan S y M: el S est en el
espacio periplsmico, inmediatamente por encima de la membrana
citoplsmica, y el M est inmerso plenamente en dicha membrana.
Como ambos anillos estn muy juntos, a veces se alude a ellos
como anillo MS.

Ya hacia el lado citoplsmico de la membrana, por debajo del
anillo M (y en contacto con l) existe un quinto anillo, llamado
anillo C, en el que existen tres protenas. Una de ellas, (FliG)
parece ser el elemento central del rotor, mientras que las tres
(FliG, FliM y FliN) estn implicadas en la conmutacin del
sentido del giro del motor: permiten que el motor pueda girar en
sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario al de las
agujas del reloj.

Rodeando al corpsculo basal, a modo de empalizada cilndrica,
existen subunidades de dos protenas integrales de membrana:
MotA y MotB. Su papel parece ser doble:

Constituyen el estator del motor. Se sabe que MotB se proyecta
hacia el espacio periplsmico, y probablemente establece
contactos con el peptidoglucano.

Por otro lado forman una especie de canal por donde pueden
entrar los protones al citoplasma, lo que constituye la base del
mecanismo que surte de energa al motor.

En el hueco interior formado por los anillos MS y C se aloja una
serie de protenas implicadas en la secrecin de los monmeros de
componentes del flagelo.
Con todo ello, la hiptesis que se maneja hoy es que, con el
carburante de protones, el rotor gira respecto del estator. Este giro
se comunica al cilindro central, que a su vez debe de estar bien
engarzado con al menos alguno de los otros cuatro anillos. El giro se
transmite al codo y, de ste al filamento. Como el filamento es una
hlice rgida, al girar hace avanzar a la bacteria en el medio acuoso.
En Gram-positivas la estructura del corpsculo basal es ms
sencilla: cilindro central y una sola pareja de anillos (el M y el S).
Probablemente el anillo S est conectado con el peptidoglucano
(sera anlogo en realidad al anillo P de las Gram-negativas).
1.4 ENSAMBLAJE DEL FLAGELO
En la construccin del flagelo bacteriano intervienen unas 50
protenas, entre protenas estructurales que formarn parte de la
estructura definitiva (unas 20), y protenas accesorias que slo sirven
durante este ensamblaje (unas 30). Debido a esta complejidad, y a
que, adems, diversas partes del flagelo deben de interaccionar con
las envueltas bacterianas (membrana, pared), no es de extraar que
este ensamblaje est bien ajustado ni que la sntesis de las diversas
piezas est sometida a un estricto control gentico.
El orden de ensamblaje es en su mayor parte lineal y secuencial:
tiene lugar desde las subestructuras ms proximales hasta las ms
distales.

Los componentes integrales de membrana (excluyendo a las
protenas Mot), el doble anillo MS y el anillo C emplean la
habitual ruta Sec (procesamiento de pre-protenas con escisin
del pptido lder).

Pero la mayor parte de las protenas cuyo destino est ms all de
la membrana citoplsmica usan una ruta especial, que es una
variante del denominado sistema III de exportacin. Como
dijimos, el aparato para esa exportacin se alberga en el hueco de
los anillos MS. Este aparato va exportando ordenadamente las
subunidades de las distintas subestructuras, las cuales viajan en
fila india a travs del canal interior continuo (que a su vez se va
construyendo) del cilindro codo filamento. Las subunidades
se van aadiendo en el correspondiente extremo distal de la
subestructura en formacin, y evitan su escape al medio merced a
unas protenas de capuchn en dichos extremos distales.

Por ejemplo, el filamento en construccin siempre dispone en su
extremo distal de un capuchn del pentmero de la protena
HAP2. Dicho capuchn es plano hacia el exterior, pero posee
cinco patas hacia abajo, que forman una especie de cavidad
relativamente amplia. Cuando por el hueco interior viaja una
nueva unidad de flagelina (an sin terminar de plegar), al llegar a
la cavidad, hay un cambio de conformacin en las patas de HAP2
que a su vez favorece el plegamiento adecuado de la flagelina y
su insercin en el lugar correcto. Cada vez que llega una
subunidad de flagelina, el pentmero sufre el cambio
conformacional, y para acomodar la nueva subunidad se desplaza
rotacionalmente, es decir, en el ensamblaje, el pentmero de
HAP2 est girando continuamente.
1.5 MOVIMIENTO FLAGELAR
En este apartado nos vamos a plantear dos objetivos de estudio
principales:

descripcin del movimiento por flagelos (apartados 1.5.1)

mecanismo del movimiento en ausencia de estmulos (1.5.2)

cmo se ve modificado el mecanismo flagelar bsico ante la
llegada de estmulos ambientales captados en la superficies celular
(1.5.3).
1.5.1 DESCRIPCION DEL MOVIMIENTO DE UNA
BACTERIA PERITRICA
Vamos a estudiar en primer lugar cmo se produce el movimiento
en bacterias peritricas como Escherichia coli o Salmonella
tiphymurium.
1. En ausencia de estmulos, en un medio ambiente uniforme, se
puede observar un movimiento tridimensional aleatorio, formado
por periodos de unos pocos segundos de natacin en linea recta o
ligeramente curvada (carreras o corridas), interrumpidos por
breves episodios (dcimas de segundo) de un movimiento angular
catico de la bacteria (viraje o cabeceo), tras de lo cual la clula
entra en una nueva fase de natacin en lnea aunque con una
nueva direccin.
2. En un gradiente espacial de un estmulo ambiental, la bacteria
responde modificando el anterior patrn. Se alteran las
probabilidades relativas de carreras y de virajes, de modo que la
bacteria prolonga estadsticamente los periodos de natacin hacia
la direccin favorable (es decir, acercndose hacia un estmulo
positivo y alejndose de uno negativo), y disminuye la frecuencia
de cabeceo. De esta manera se obtiene una locomocin aleatoria
pero estadsticamente sesgada, que propicia el avance neto en la
direccin favorable. Este movimiento se denomina taxia.
3. El comportamiento txico dura un tiempo limitado, que oscila de
segundos a minutos, dependiendo de la naturaleza e intensidad
del gradiente. Tras la fase de excitacin inicial y de taxia, la
bacteria se va adaptando al estmulo, de modo que regresa
finalmente al patrn aleatorio de movimiento, sin avance neto en
ninguna direccin.
As pues, en las prximas pginas veremos la base de estos
fenmenos:

existencia de un rotor flagelar de tipo rotacional, que es reversible.

Veremos que la bacteria tiene mecanismos para detectar un
gradiente espacial de un estmulo, y comprobaremos que este
mecanismo acta como si la bacteria estuviera detectando de
hecho un gradiente temporal.

Conectado con el sistema de deteccin de estmulos, hay un
sistema que hace que se vuelva al patrn aleatorio ante la
persistencia del estmulo (mecanismo de adaptacin).
1.5.2 MECANISMO DEL MOVIMIENTO ALEATORIO (EN
AUSENCIA DE ESTMULO)
Vamos a resumir lo que veremos con ms detalle a continuacin:

El motor es rotatorio y tiene dos estados: giro en sentido
antihorario, es decir contrario a las agujas del reloj (CAR), y
sentido horario, igual al de las agujas del reloj (AR)

Componentes y funcionamiento del motor y del conmutador y su
relacin con la movilidad por carreras y con las volteretas

Aspectos energticos del motor: el carburante del motor es la
disipacin de protones a travs de cierta parte del corpsculo
basal.
1.5.2.1 EL MOTOR ES ROTATORIO Y GIRA EN AMBOS
SENTIDOS
Desde hace varios aos, por experimentos en los que las
bacterias quedaban unidas a cubreobjetos por anclaje a ellos de los
filamentos flagelares, se dedujo que el motor flagelar funciona
como una mquina rotacional reversible, o sea, tiene dos
sentidos: el de las agujas del reloj (AR) y el contrario (CAR).
Veamos a continuacin las relaciones que se dan entre estos estados
funcionales del motor y los fenmenos de rotacin en lnea y virajes
bruscos.

La natacin en lnea (carrera) se debe a la rotacin continua,
durante un periodo de unos segundos, del motor, en sentido CAR.
En las bacterias peritricas, las fuerzas hidrodinmicas y mecnicas
hacen que los filamentos de los distintos flagelos se enrollen
formando un haz o penacho paralelo al eje longitudinal de la
clula. En este penacho, cada flagelo gira independientemente. El
giro de los diversos filamentos helicoidales del penacho, empuja a
la clula, originando la natacin en linea recta, con una velocidad
de unos 25 m/seg.

Cuando el motor gira en sentido inverso, o sea AR, la nueva
carga torsional que hace que el flagelo cambie de conformacin.
Mientras est cambiando esa conformacin, cada filamento tira
independientemente de un lado de la clula, lo que hace que esta
pegue una voltereta que la reorienta de modo aleatorio.
1.5.2.2 COMPONENTES DEL MOTOR Y DEL
CONMUTADOR
Como ya dijimos, parece que la empalizada de protenas integrales
Mot A y Mot B forman parte del estator del motor. Esta
empalizada rodea al doble anillo MS, y probablemente sobre esta
base fija gira el rotor (FliG) situado bajo el doble anillo MS. Por
debajo de ste, el anillo C, con sus tres tipos de protenas (FliG, M y
N) acta como conmutador del sentido de giro. El giro se transmite
solidariamente al cilindro central, de l al codo, y de ah al filamento
helicoidal.
Si no existiera sistema de conmutacin del sentido de giro, el motor
girara siempre en sentido antihorario o sea, el sentido intrnseco
(por defecto) de rotacin del motor flagelar es el CAR. Pero el
motor recibe la influencia del sistema conmutador del anillo C, que
de vez en cuando invierte el sentido de giro (AR). Como veremos
luego, a su vez el sistema conmutador recibe informacin sensorial
lo que se supondr que se alteraren las proporciones de tiempo en
que el motor gira en un sentido o en otro.
1.5.2.3 ASPECTOS ENERGTICOS
En condiciones normales con disponibilidad de nutrientes
energticos en el medio ambiente de la bacteria, la forma de energa
que alimenta el motor flagelar es la fuerza protn motriz (f.p.m.),
es decir, el potencial electroqumico de protones (y en las bacterias
marinas y alcalfilas, la fuerza motriz de los iones Na
+
).
La hiptesis actual sobre la manera en que se acopla el flujo de
protones al motor con la rotacin dice lo siguiente: cuando los
protones cruzan la membrana citoplsmica, se unen a un
determinado asprtico de la protena MotB, lo cual le provoca un
cambio conformacional. Este cambio conformacional del estator
hace que el motor realice un paso de rotacin (una fraccin de un
giro). Luego, ese protn sale de la protena MotB y entra al
citoplasma, con lo que se regenera la configuracin original del
estator. Para que el motor haga un giro completo, se necesitan unos
1000 protones. A su vez, el motor gira a la vertiginosa velocidad
de 1000 revoluciones por minuto. De todas formas, la velocidad de
rotacin es variable, y depende de la intensidad del gradiente de
protones.
De ese modo, la bacteria nada a altas velocidades relativas, de hasta
100 m/seg., (si un coche corriera a la misma velocidad
relativarompera la barrera del sonido!).
1.5.3 LAS TAXIAS
1.5.3.1 DEFINICIONES
En ausencia de un gradiente de estmulo, el movimiento de
cada clula es a base de perodos de 2-4 segs de natacin separados
por virajes. El movimiento en un gradiente de estmulo se logra
variando la frecuencia de virajes: si la concentracin de un atrayente
aumenta, o la de un repelente disminuye, las clulas no viran tan
frecuentemente como lo haran en un entorno uniforme. Por lo tanto,
el resultado es que nadan en la direccin favorable ms tiempo, y
este sesgo respecto de la natacin aleatoria hace que exista un
movimiento neto en relacin con el gradiente.
Este mecanismo no es una taxia en sentido estricto (se le puede
llama clinocinesis, aunque este trmino apenas se emplea); es un
50% menos efectivo que una taxia autntica, pero probablemente
requiere mucha menos inversin en maquinaria sensorial y motora.
1.5.3.2 TIPOS DE TAXIAS
Se distinguen principalmente aerotaxia, fototaxia y quimiotaxia.
1) aerotaxia: respuesta de migracin ante un gradiente de oxgeno
molecular.

Bacterias anaerobias aerotaxia negativa.

Bacterias microaerfilas atradas a tensiones ptimas de O
2

(menores que la atmosfrica).

Todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas aerotaxia
positiva.
La aerotaxia positiva, al menos en enterobacterias, y en
bacterias purpreas en crecimiento heterotrfico, tiene un
mecanismo diferente del mecanismo txico hacia otros atrayentes
qumicos: no existe en realidad un receptor especfico del oxgeno.
La seal estimulatoria consiste en la utilizacin del oxgeno como
aceptor final de electrones en las cadenas transportadoras
respiratorias. Esto provoca una alteracin de la f.p.m., que de alguna
manera provoca un cambio que aumenta la probabilidad de giro del
rotor en sentido CAR.
2) Las fototaxias de las bacterias fotosintticas anxicas dependen
de un mecanismo similar: detectan un gradiente de intensidad de luz,
no mediante un receptor especial, sino por medio del transporte de
ee
-
fotosinttico, que a su vez provoca un cambio en el gradiente
electroqumico de H
+
. Este cambio afecta al motor flagelar.
3) Las quimiotaxias, especialmente las de Enterobacterias, son las
taxias mejor estudiadas. Las abordaremos a continuacin con cierto
detalle.
1.5.3.3 ESTUDIODE LA QUIMIOTAXIA
Cuando se coloca a una bacteria en un gradiente de estmulo
qumico se observa a lo largo del tiempo una respuesta con 3 fases
distintas:

fase de latencia (que dura unos 0.2 seg.), en la que el patrn de
rotacin no se modifica.

rpida excitacin (medida aqu como la probabilidad de encontrar
al rotor girando en sentido CAR).

fase de adaptacin lenta, hasta que se restablece el patrn inicial.
El comportamiento de quimiotaxia se pone en marcha cuando un
estmulo qumico determinado (un quimioefector) se une en la
superficie bacteriana a un receptor especfico, lo que a su vez
desencadena un proceso de transduccin intracelular de esta
seal, que finalmente llega al complejo conmutador del corpsculo
basal flagelar, lo que cambiar las proporciones iniciales de giro en
sentido CAR y AR. Si el quimioefector produce una taxia positiva,
se denomina quimioatrayente, mientras que si desencadena una taxia
negativa se denomina quimiorrepelente.

El sistema sensorial de la bacteria, ante un gradiente espacial de
atrayente o repelente, origina una migracin neta (acercamiento o
alejamiento, respectivamente) haciendo que la duracin de una
carrera en la direccin favorable sea mayor, y para ello influye
sobre el conmutador flagelar binario que determina el sentido de
rotacin.

La bacteria capta ese gradiente espacial, detectndolo de hecho
como si fuera un gradiente temporal autogenerado por ella
misma mientras va movindose. Como veremos, la bacteria
compara, mediante el mismo receptor de membrana que capt el
estmulo, la concentracin actual de la sustancia con la que tena
en los segundos anteriores.

Adems, la bacteria vuelve al patrn aleatorio de movimiento tras
varios segundos o minutos del contacto inicial con el gradiente:
existe un mecanismo de adaptacin al estmulo que, como
veremos, implica una modificacin covalente de los receptores.
Estos son los aspectos que vamos a pasar a considerar a
continuacin.
1.5.3.3.1 ELEMENTOS DE RECEPCIN, TRANSDUCCIN
DE SEAL y DE ADAPTACIN
En enterobacterias se ha estudiado bien la quimiotaxis dependiente
de un tipo de protenas sensoras de estmulos qumicos denominadas
MCP, acrnimo ingls de protenas quimiotcticas aceptoras de
metilo, o simplemente transductores. En Escherichia coli se han
identificado cinco MCP, y cada una responde a un conjunto
determinado de quimiatrayentes y/o quimiorrepelentes. Por ejemplo,
la MCP llamada Tar detecta los atrayentes asprtico y maltosa y los
repelentes cobalto y nquel.
Todas las MCP son protenas integrales de membrana citoplsmica,
con un dominio periplsmico preparado para unirse a los
quimioefectores y un dominio citoplsmico dotado a su vez de dos
zonas funcionales: una de ellas es la regin transductora que
genera la seal intracelular que va a llegar al motor flagelar, y la otra
es la regin metilable, con varios glutmicos que pueden aceptar
radicales metilo (-CH
3
).
Los transductores MCP transmiten informacin al flagelo por medio
de una cascada de transduccin intracelular de la seal, en la que
estn implicadas seis protenas: CheA, CheW, CheY, CheZ, CheR y
CheB.

CheA: Es una protenquinasa que se autofosforila en una His
concreta cuando el MPC se une a un quimioefector. Es el
regulador central del sistema quimiotctico, ya que en su forma
fosforilada (CheA-P) fosforila a CheY y a CheB.

CheW: es necesaria para el acoplamiento entre CheA y el dominio
citoplsmico del MCP.

CheY: la protena CheY es fosforilada en un determinado
asprtico por la CheA-P, y en su forma CheY-P interacciona con
el conmutador del anillo C del flagelo, lo cual incrementa la
probabilidad de una inversin del giro desde el CAR al AR, con lo
que aumenta la probabilidad de virajes.

CheZ: contrarresta la seal de viraje al facilitar la desfosforilacin
de CheY-P en CheY.

CheR: es una metil-transferasa que cataliza la transferencia de
grupos metilo desde la S-adenosil-metionina (SAM) hasta los
glutmicos del dominio citoplsmico del MCP.

CheB: cuando esta protena es fosforilada por la CheA-P, se
convierte en una metilasa (CheB-P) que retira los metilos
previamente unidos a los glutmicos del MCP.
Como veremos, la memoria celular para que la bacteria detecte
gradientes de concentracin en funcin del tiempo es el resultado de
la metilacin de las MCP por la CheR, y de su desmetilacin por
CheB-P.
1.5.3.3.2 EL CICLO DE EXCITACIN-ADAPTACIN
1. En un ambiente neutro (ausencia de estmulo), la MCP tiene un
nivel basal de metilacin (una media de un solo glutmico
metilado en su dominio citoplsmico). En esta situacin, la CheA
tiene un nivel basal de fosforilacin, que sirve para fosforilar a
CheY y a CheB. El motor flagelar presenta un patrn de giro de
unos cuantos segundos en sentido CAR ( natacin en lnea
recta), y breves perodos de sentido AR ( virajes), que es la
base del movimiento aleatorio de la bacteria. Ahora veremos
cmo este flujo basal de informacin hacia el flagelo y de
metilacin del MCP se altera con una sustancia atrayente.
2. Cuando aadimos el atrayente, ste se une al dominio
periplsmico del MCP, lo que provoca un cambio conformacional
que se transmite hasta el dominio citoplsmico, de modo que se
produce una modificacin de la regin efectora de este dominio
que transmite la seal hacia el motor flagelar. El tiempo que tarda
en llegar al motor explica el periodo de latencia. Durante esta fase
el nivel de metilacin no se altera, pero el cambio conformacional
deja activados a los glutmicos metilables.
3. Transduccin intracelular de la seal: el cambio
conformacional del dominio citoplsmico tiene el efecto de
inhibir la activacin de la CheA, de modo que desciende el
nivel basal de su autofosforilacin, lo que se traduce en que se
fosforilan menos molculas de CheY y de CheB. Al haber
menos CheY-P, llegan menos seales al conmutador flagelar de
que cambie a sentido igual al de las agujas del reloj. Por lo tanto,
se prolongan los perodos de natacin en lnea recta (y es ms
probable que la bacteria se acerque al estmulo qumico).
4. Mientras tanto, ha estado actuando la metiltransferasa (CheR),
que ha ido aadiendo metilos a los glutmicos del dominio
citoplsmico de la MCP. Si pasa un cierto tiempo y el dominio
periplsmico sigue ocupado por el quimioatrayente, se alcanza un
gran nivel de metilacin en ese dominio citoplsmico. Esto hace
que el dominio efector citoplsmico vuelva a una configuracin
nula, o sea, deja de emitirse seal excitadora. A ello colabora
igualmente que el nivel de metilesterasa (la protena CheB-P, es
decir la forma fosforilada) sea bajo. Esta es la explicacin
molecular de por qu ocurre al cabo de unos segundos la
adaptacin lenta al estmulo. Como la metilacin es relativamente
lenta, esto significa que si en un determinado momento la
concentracin actual de quimioefector (detectada por el grado de
ocupacin del dominio periplsmico) es similar a la
concentracin unos segundos antes (manifestada por el nivel de
metilacin del dominio citoplsmico), la bacteria sabe que lleva
ya un cierto tiempo acercndose al estmulo. Si la metilacin se
ha estabilizado a un nivel alto, se produce un cambio
conformacional por el que el MCP deja de emitir seal (estado
nulo), y la bacteria se ha adaptado al estmulo.
Como ejercicio, veamos qu pasara si ponemos un
repelente: la unin del repelente al MCP provoca un cambio
conformacional que hace que el dominio citoplsmico
interaccione ahora con el complejo CheWCheA de modo que
se aumenta la tasa de autofosforilacin de CheA. Ahora esta
CheA-P fosforila tanto a CheY como a CheB. La CheY-P
difunde a la base del flagelo e interacciona con el conmutador
(anillo C), y "da la orden" de que se cambie ms a menudo a
giro en sentido de las agujas del reloj (AR), lo que hace que la
bacteria vire caticamente ms a menudo. Con ello aumentan
sus probabilidades de que encuentre una direccin de
natacin ms favorable (en sentido opuesto al gradiente), en
cuyo caso tendramos un patrn similar a cuando se une un
atrayente. Mientras tanto, la CheR ha encontrado ms difcil
acceder a los glutmicos, y el mayor nivel de la metilesterasa
(CheB-P) hace que se eliminen metilos.

Esquema del
funcionamient
o del sistema
de
transduccin
de la seal de
un
quimioatrayent
e (lee el texto
para una
explicacin
completa)
2 FLAGELOS PERIPLSMICOS
Son un tipo de flagelos que presenta exclusivamente el grupo
de las Espiroquetas. Estas bacterias Gram-negativas son
extremadamente finas y de forma helicoidal. Estn compuestas de:

cilindro protoplasmtico, formado por el protoplasto rodeado de
la capa de peptidoglucano. El sculo de murena de este PG tiene
forma helicoidal, y es responsable de la tpica morfologa de estas
bacterias;

membrana externa;

entre el cilindro protoplasmtico y la membrana externa se
encuentran los peculiares flagelos, insertados subpolarmente y
enrollados alrededor del cilindro. Estos flagelos se denominan
flagelos periplsmicos (= endoflagelos = fibrillas axiales).
Estructura: Cada flagelo, en s mismo, es similar al tipo de flagelo
clsico ya estudiado:

corpsculo basal, con dos pares de anillos (excepto en Leptospira,
con slo un par);

codo

filamento, a base de subunidades de flagelina.
Ahora bien, lo caracterstico es la disposicin de los flagelos que
salen de cerca de cada extremo, en relacin con el cuerpo celular:

Esquema
de los
flagelos
periplsmic
os de las
espiroqueta
s

En la mayora de las especies, cada flagelo se extiende a lo largo
del eje bacteriano, paralelo a la superficie del cilindro
protoplasmtico, hasta alcanzar los 2/3 de la longitud total;
esto se traduce en que los flagelos que salen de cada extremo se
solapan en la zona central (la excepcin la tenemos en el gn.
Leptospira, en que no se solapan).

Las distintas fibrillas provenientes de cada extremo discurren
paralelas y cercanas. El conjunto de estas fibrillas se manifiesta
como filamento axial, recubierto por membrana externa.
Obsrvese en el esquema el corte transversal de Cristispira,
con sus numerosas fibrillas (=flagelos) axiales, que
conjuntamente determinan un filamento axial prominente
(cresta), envuelto, por supuesto, en membrana externa.
Papel de los endoflagelos en la movilidad de las espiroquetas
Los flagelos de estas bacterias, paralelos al eje longitudinal de
la clula, estn anclados al cilindro protoplasmtico, que es rgido
(mientras que la membrana externa es flexible). Al girar los flagelos
de los dos extremos en el mismo sentido, obligan a girar al cilindro
rgido en un sentido, y a la membrana externa en sentidos
contrarios. El efecto es que el cilindro protoplasmtico gira en
torno del filamento axial formado por los flagelos periplsmicos.
Esta es la base de los distintos tipos de movimientos que podemos
observar en estas bacterias:

En medios lquidos se mueven

por avance muy rpido a modo de torniquete (el cuerpo
bacteriano se comporta como un sacacorchos)

se pueden ver tambin contorsiones, latigazos, etc.

Sobre la superficie de medios slidos:

por rodamiento de la hlice. Esto se debe a que el filamento axial
confiere movimiento de rotacin a la membrana externa, lo que
se traduce en que la bacteria pueda rodar. (Tome el alumno un
muelle, depostelo sobre una mesa y dle un empujn).

Flexiones. Se provocan ondas propagables del cilindro. La
bacteria puede avanzar a modo de las larvas de las mariposas
gemetras
Todos estos tipos de movimiento son adaptaciones evolutivamente
conseguidas que permiten el rpido avance en medios de alta
densidad (fangos espesos, mucosas de los animales, etc), medios
donde los flagelos tpicos ya no pueden servir adecuadamente. La
evolucin ha hecho que las espiroquetas se adapten, por su peculiar
estructura y la de sus flagelos, a medios muy viscosos: de hecho, se
mueven con mayor rapidez a 300-500 cP que a 10-50 cP.
Presentan, adems taxias positivas hacia esos medios viscosos.
3 FIMBRIAS O PELOS (= PILI)

Son apndices filamentosos rectos y rgidos, ms cortos y
ms finos (3-10 nm de dimetro) que los flagelos, y que
aparecen en muchas bacterias (sobre todo Gram-
negativas). La mayora estn compuestos por un solo tipo
de protena (la pilina), de unos 17-25 kDa, cuyas
subunidades se disponen en una matriz helicoidal que deja
un pequeo hueco central.

Estn implantados a nivel de membrana citoplsmica.

Nmero variable: desde 1 a varios cientos o miles por
clula.

Disposicin: alrededor de todo el permetro celular, y a
veces, de insercin polar.

Aislamiento: por simple agitacin mecnica de las clulas,
seguido de ultracentrifugacin.

Composicin: ensamblaje de subunidades de pilina,
protena globular muy hidrfoba.

Ensamblaje: insercin de subunidades de pilina en la base
del pelo en crecimiento, a partir de pre-pilina, que se
procesa por escisin del correspondiente pptido-lder a su
paso por la membrana citoplsmica.

Existen dos tipos principales de pili (pilus, en singular):

fimbrias adhesivas

pelos sexuales
3.1 FIMBRIAS ADHESIVAS
Son pelos de 4 a 7 nm de dimetro (segn especies),
repartidas por toda la superficie y que funcionan como adhesinas,
es decir como estructuras para la adhesin a sustratos vivos o
inertes. Condicionan varias propiedades biolgicas, derivadas de sus
propiedades adhesivas:

microcolonias y velos (los velos son pelculas formadas por
acmulos de bacterias en medios estticos -en reposo-).

adhesin a superficies inertes

adhesin superficies vivas. En el caso de bacterias patgenas, esta
capacidad tiene que ver con su virulencia, invasividad del tejido.
Ejemplos de funcin como adhesinas:

en la formacin de la placa dental, por coagregacin de
individuos de distintas especies sobre el diente;

factores de colonizacin de tejidos, por ejemplo en el gonococo
(Neisseria gonorrhoeae) y en las cepas uropatognicas de
Escherichia coli.
La funcin de adhesina no reside en la pilina que constituye la
inmensa mayora de la fimbria, sino en una protena especial de la
punta del pelo. La mayora de estas protenas de la punta
pertenecen a la clase de las llamadas lectinas, es decir, protenas o
glucoprotenas capaces de unirse con gran afinidad a cadenas
laterales de polisacridos presentes en la membrana citoplsmica
de las clulas del hospedador a las que se adhieren.
Aspectos genticos:

Los genes codificadores de las protenas de los pelos adhesivos
son de localizacin cromosmica.

En muchas bacterias patgenas se da un fenmeno de variacin
de fase: se trata de cambios rpidos y reversibles por los que
clulas piliadas (Fim
+
) pueden convertirse en no piliadas (Fim
--
), y
viceversa. El significado adaptativo es que los individuos Fim
+
son
los ms capaces de iniciar la colonizacin del animal hospedador,
pero son ms sensibles a la fagocitosis, mientras que una vez que
han colonizado el epitelio, el cambio a Fim
--
permite que los
individuos resistan mejor la fagocitosis.

Pero adems, existe otro interesante mecanismo adaptativo: las
clulas Fim
+
de algunas especies experimentan fenmenos de
variacin antignica, es decir, por una serie de mecanismos
genticos, cambian la especificidad antignica de su pilina, lo
que supone una estrategia de evitacin contra el sistema inmune
del hospedador (un caso ms de esa carrera de armamentos
evolutiva que se libra entre microorganismos y organismos
superiores).
Algunas pilinas (por ejemplo, en los gneros Moraxella y
Neisseria) sirven tambin como parte del aparato necesario para la
transformacin gentica por ADN exgeno.
3.2 PELOS SEXUALES DE BACTERIAS GRAM-
NEGATIVAS
Son ms largos y ms gruesos (unos 10 nm de dimetro) que
las fimbrias adhesivas. Aparecen en menor nmero (de 1 a 10 por
clula), y su funcin es la de permitir los contactos iniciales en la
conjugacin, como rgano de reconocimiento entre la bacteria
donadora, dotada del pelo sexual, y la receptora, carente de l. Sus
genes son de localizacin plasmdica.
Hay dos clases principales de pelos sexuales: los de de tipo F y
los de tipo I, cada uno con un tipo de protena distinta
(genricamente conocida como pilina sexual). Son usados como
receptores especficos por parte de algunos fagos.
Hablaremos de los pelos sexuales cuando abordemos el
captulo de Conjugacin bacteriana.
4 PROSTECAS
Son prolongaciones semirrgidas vivas, propias de ciertas
bacterias, con un dimetro menor que el cuerpo celular. Es decir, son
apndices del cuerpo celular rodeados por membrana y pared
celulares.
Funciones:
1) En algunas bacterias prostecadas funcionan en la reproduccin
(prostecas reproductivas o hifas). Ejemplos:
Hyphomicrobium, Hyphomonas.
2) En Caulobacter acta como apndice para unin a sustratos
inertes o para la formacin de rosetas de varios individuos,
merced al botn de anclaje situado en el extremo
3) En general, suponen un modo de aumentar la relacin
superficie/volumen, lo cual redunda en:
a) mayor capacidad de flotabilidad para ciertas bacterias
planctnicas;
b) mayor superficie para la captacin de nutrientes en ambientes
oligotrficos.
Ejemplos: Ancalomicrobium, Prosthecomicrobium, Stella, etc.
5 TALLOS O PEDNCULOS
Son estructuras filamentosas no vivas, terminadas en botones
de anclaje (discos adhesivos), producidas por secrecin continua de
materiales polisacardicos en una zona concreta de la superficie
bacteriana.
Funcin: Permite la unin de ciertas bacterias de hbitats acuticos
a sustratos slidos, vivos o no.
Ejemplos:

Gallionella: es una bacteria con forma de media luna, de cuyo lado
cncavo surgen de 3 a 40 filamentos helicoidales, terminados en
botones de anclaje.

Planctomyces: es una bacteria con forma de pera, con flagelo
subpolar, que pasa parte de su vida anclada a sustratos por medio
de un tallo constituido por numerosas fibras rectas.




Actualizado el
NDICE:
1 LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIN
1.1 INTRODUCCIN A LA ESPORULACIN
BACTERIANA
1.2 OBSERVACIN DE LAS ESPORAS
1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUIMICA DE LA
ENDOSPORA
1.3.1 PROTOPLASTO O NCLEO
1.3.2 PARED DE LA ESPORA
1.3.3 CORTEZA O CRTEX
1.3.4 CUBIERTAS
1.3.5 EXOSPORIO
1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIN
1.5 FASES DE LA ESPORULACIN
1.6 GENTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIN
1.7 CUERPOS PARASPORALES
1.8 PROPIEDADES BIOLGICAS DE LAS ESPORAS: SU
FUNDAMENTO
1.9 GERMINACIN DE LA ENDOSPORA
1.9.1 PREACTIVACIN
1.9.2 ACTIVACIN
1.9.3 INICIACIN O GERMINACIN EN SENTIDO
ESTRICTO
1.9.4 TERMINACIN Y CRECIMIENTO ULTERIOR
2 EXOSPORAS
3 DIFERENCIACIONES EN LOS ACTINOMICETOS
4 QUISTES BACTERIANOS
5 DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS
ENLACES

Hasta ahora hemos abordado la estructura y funciones de las
diversas partes de la clula procariota. Para terminar esta seccin del
programa, en este captula vamos a tratar de algunos casos de
diferenciacin celular en bacterias, es decir, procesos por los que a
partir de clulas normales (vegetativas) se producen formas
celulares especializadas. Algunas de ellas son formas de reposo,
capaces de aguantar mucho tiempo en ausencia de nutrientes (caso
de la endospora). Muchas de ellas pueden resistir circunstancias
ambientales adversas (la endospora es, de hecho, la forma bacteriana
ms resistente a calor, desecacin, luz UV, etc).
1 LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIN
1.1 INTRODUCCIN A LA ESPORULACIN BACTERIANA
Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente
de los gneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y
Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia adaptativa
cuando se ven sometidas a privacin de nutrientes en su medio
ambiente: si los niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de
un umbral, esto constituye una seal a la clula de que se avecina un
largo perodo de privacin de nutrientes. Entonces, la clula se
implica en una serie de complejos cambios genticos, metablicos,
estructurales, etc. (proceso de esporulacin o esporognesis), que
conducen a la diferenciacin, en el interior de la clula vegetativa
original, de una clula durmiente (la endospora). La clula-madre
(o sea, la clula vegetativa original que gener la endospora)
finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz de
permanecer en estado criptobitico, durmiente, varios decenios, -
incluso siglos. Las esporas son fcilmente diseminadas por el aire;
cuando caen en medios ricos en nutrientes, se desencadena su
germinacin, se reinicia la actividad metablica, de modo que cada
espora genera una nueva clula vegetativa, capaz de divisn binaria,
etc.
O sea, la esporulacin se puede considerar como un proceso de
supervivencia en ltima instancia, la ltima carta que se juegan
ciertas bacterias Gram positivas cuando se enfrentan a condiciones
severas de hambre de nutrientes.
Significado adaptativo: Estas bacterias suelen vivir en medios
nutricionalmente pobres (suelos, hierba seca, etc.). La esporulacin
es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en una
lnea filogentica de bacterias Gram-positivas, y que les permite
sobrevivir largos perodos de carencia nutricional. (Atencin: NO
son estrictamente formas de resistencia).
Las endosporas son formas de reposo (y no formas reproductivas),
que representan una etapa del ciclo de vida de ciertas bacterias, y
que se caracterizan por una estructura peculiar, diferenciada respecto
de las clulas vegetativas, por un estado metablico prcticamente
detenido, y por una elevada resistencia a agentes agresivos
ambientales.
La esporulacin bacteriana es un sistema modelo donde se
pueden estudiar, con relativa sencillez, determinados problemas
biolgicos ms generales: qu bases moleculares y genticas tiene
la diferenciacin de un tipo de clula a otro tipo distinto?, cmo
se regula el proceso en funcin del tiempo y del espacio?, cmo
se reparten los papeles los tipos celulares implicados?, etc. Por
esta razn, presenta un enorme inters para los bilogos, interesados
en escudriar las bases ntimas de este tipo de importantes
cuestiones, tan frecuentes en los organismos superiores.
1.2 OBSERVACIN DE LAS ESPORAS
Al microscopio ptico, en fresco (sin teir), aparecen como
cuerpos esfricos, ovoides e incluso en algunas especies, cilndricos,
muy refringentes, libres, o an incluidos en la clula vegetativa
(clula madre).
Esporangio = clula madre + espora
El tamao relativo de la espora, y su situacin en el esporangio, son
criterios taxonmicos importantes en las bacterias esporulantes.

Segn que el dimetro de la espora sea o no mayor que el de la
clula vegetativa:

Esporas deformantes

Esporas no deformantes

Segn la localizacin de la espora dentro del esporangio:

Terminal

Subterminal

Central

Los esporangios deformantes de Clostridium son caractersticos:

en forma de cerilla o palillo de tambor (plectridios)

en huso (clostridios)
Tincin:
No se tien por los colorantes normales. Hay que forzar por
calor y/o mordientes (por ejemplo, tras teir reforzadamente con
fuchsina, resisten decoloracin por alcohol-ClH). Otra tincin muy
empleada es la reforzada con verde de malaquita (que es la que el
alumno realiza en nuestras prcticas de laboratorio).
1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUIMICA DE LA
ENDOSPORA
Partes que comprende la endospora:

Protoplasto o ncleo (core, en ingls), con la membrana
citoplsmica de la espora (membrana esporal interna).

Pared de la espora (= Germen de la pared de la futura clula
vegetativa).

Corteza o crtex, rodeado externamente de la membrana esporal
externa.

Cubiertas

Exosporio (no universal: las esporas de algunas especies carecen
de l).

Micrografa electrnica
que muestra las partes
principales de una
endospora
1.3.1 PROTOPLASTO O NCLEO
El citoplasma de la espora est muy deshidratado. Sus
componentes estn inmovilizados en una matriz de quelatos de
iones Ca
++
y cido dipicolnico.
El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de
ion Ca
++
(1-3% del peso seco de la espora), y de cido dipicolnico
(DPA) (10% en peso); ambos estn formando un quelato, llamado
dipicolinato clcico (DPC), una sustancia exclusiva de las esporas
bacterianas.
Papel del DPC: Como veremos, es una reserva de Ca
2+
, que
durante la esporulacin secuestra este in, lo que tendr un papel
importante en la deshidratacin del protoplasto; durante la
germinacin, la liberacin del Ca
2+
ser fundamental en este
proceso.
El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado,
y todos los componentes indispensables para reiniciar el crecimiento
vegetativo cuando la espora germine, pero carece de muchos
componentes tpicos de la clula vegetativa:

posee una pequea dotacin de ribosomas, junto con
componentes estables de la maquinaria de sntesis de protenas
(ARNt, cofactores, etc.)

ARN polimerasa.

nuclesidos mono- y difosfatados, pero no NTP (no hay ATP)

carece de componentes inestables: no hay ARNm, ni enzimas
biosintticas, ni aminocidos ni bases nitrogenadas libres, ni
cofactores reducidos (NADH; CoA)

pero en cambio, existe una gran cantidad de una serie de pequeas
protenas especiales (llamadas SASP, del ingls small acid-
soluble proteins). Cuando se produzca la germinacin, estas
protenas sern hidrolizadas rpidamente, y los aminocidos
resultantes sern empleados en la sntesis de nuevas protenas
necesarias en la germinacin y crecimiento ulterior. Adems, las
SASPs estn acomplejando al ADN (induciendo en l un cambio
conformacional hacia la rara forma A, en vez de la B habitual),
protegindolo del dao por luz UV.

la moneda energtica de la espora es el 3-fosfoglicerato, otra
molcula estable del protoplasto, que ser convertido rpidamente
a 2-fosfoglicerato, y de l a PEP (fosfo-enol-pirvico) al germinar
la espora (el PEP es donador de P para generar ATP).
Rodeando al protoplasto est la membrana citoplsmica
(membrana interna de la espora), una bicapa lipdica carente de
fluidez, posiblemente como resultado de su estructura policristalina.
1.3.2 PARED DE LA ESPORA
Situacin: inmediatamente por encima de la membrana interna de la
espora (ver micrografa a microscopio electrnico, o el esquema de
la ultraestructura).
Composicin: a base de un peptidoglucano (PG) similar al de la
clula vegetativa, con sus caractersticos enlaces entre los
tetrapptidos.
Funciones: al germinar la espora, dar lugar a la pared celular de la
nueva clula vegetativa, confirindole, mientras tanto, resistencia
osmtica.
Origen: se sintetiza a partir de la prespora, atravesando los
precursores la membrana interior que hemos citado arriba.
1.3.3 CORTEZA O CRTEX
(Obsrvese su aspecto a microscopio electrnico: transparente a los
electrones, relativamente gruesa, a base de lminas concntricas).
Composicin: un peptidoglucano (PG) especial, diferente en
composicin al PG de la clula vegetativa:

30% del NAM tiene tetrapptidos normales, pero el grado de
entrecruzamiento es muy bajo (6%).

15% del NAM tiene solo la L-ala inicial, en lugar de tetraptido.

55% de una modificacin del cido murmico (lactama del cido
murmico), producida por condensacin del -COOH lactilo con el
-NH
2
, para formar la lactama correspondiente).
Origen: Se sintetiza a partir de la clula madre, con sus
intermediarios ensamblados a nivel de la membrana externa que
rodea a la corteza.
Propiedades de la corteza:
1) Tiene un bajo grado de puentes entre tetrapptidos (slo un 6%).
Ello condiciona:
a) una estructura ms laxa, floja y flexible que el peptidoglucano
normal, capaz de expandirse en ausencia de cationes que
neutralicen sus grupos negativos (sobre todo del mDAP y del
glutmico de los tetrapptidos). Esto es la base de su
apariencia de gel.
b) su rpida autolisis, durante la germinacin de la espora.
2) la lactama del murmico condiciona una gran resistencia a la
lisozima.
La corteza est limitada por la membrana esporal externa,
procedente de invaginacin de la membrana citoplsmica de la
clula vegetativa madre. Posee una polaridad opuesta a la de la
membrana esporal interna.
1.3.4 CUBIERTAS
Composicin y estructura: la composicin depende de las especies,
pero en general, a base de una o varias protenas de tipo queratina,
todas muy ricas en cistena y en aminocidos hidrfobos, y que
llegan a constituir el 60% en peso seco de la espora. Buena parte de
la cistena se aade post-traduccionalmente, por modificacin de la
protena inmadura. A microscopio electrnico se puede comprobar
el gran grosor (volumen) de las cubiertas, y su aspecto relativmante
denso a los electrones.
Propiedades: son muy insolubles e impermeables, e impiden la
entrada de numerosos agentes qumicos, incluyendo sustancias
txicas. La abundancia de puentes S-S las hace muy compactas y
muy estables qumicamente.
1.3.5 EXOSPORIO
En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a
modo de saco cerrado, delgado y flojo, envolviendo al resto de la
espora de una forma suelta, despegado en principio respecto de las
cubiertas (tras la liberacin de la espora, al perderse el contenido
acuoso que haba entre exosporio y cubiertas, aquel se pega a stas).
En B. subtilis y B. megaterium, el exosporio est envolviendo a
la espora de una forma ms estrecha, estableciendo algunos
contactos fsicos con la superfie de las cubiertas.
Composicin qumica: mezcla de protenas, polisacridos
complejos, y lpidos.
Propiedades: muy resistente a enzimas proteolticas, lo que sugiere
(pero no prueba directamente) que el exosporio puede representar
algn papel como barrera de defensa externa de la espora.
1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIN
Para que se produzca la esporulacin, se necesitan dos condiciones
previas:
1) los cultivos bacterianos han de estar en buenas condiciones;
2) cuando cesa el crecimiento exponencial, la mayora de las
clulas entran en esporulacin, aunque el proceso no es
sincrnico (hay desfases entre unas clulas y otras), de modo que
en un lapso de tiempo relativamente breve (5,5-8 horas en
Bacillus subtilis) casi todo el cultivo aparece en forma de esporas,
habiendo desaparecido las clulas vegetativas. La divisin
celular tpica de la fase de crecimiento exponencial y la
esporulacin son procesos mutuamente excluyentes.
Qu estmulo es el responsable de desencadenar la esporulacin?
Lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara la
esporulacin es un estado de inanicin, de carencia de nutrientes.
El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulacin
puede ser: la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno o incluso la
carencia de fosfatos.
1.5 FASES DE LA ESPORULACIN

Vamos a estudiar la esporulacin en Bacillus subtilis o en B.
megaterium, dos de las bacterias esporuladas mejor investigadas, y
que completan la esporulacin al cabo de unas 7-8 horas de su
inicio, a 37C. Se pueden distinguir siete fases consecutivas (adems
de la fase 0 anterior a la esporulacin). Cada fase se denota con un
nmero romano, y su duracin en horas se expresa como subndice
de t, p. ej., t
2
. Como veremos enseguida, cada fase se distingue por
un(os) evento(s) citolgico(s) peculiar(es) y por una serie de
cambios bioqumicos propios:
Fase 0 (clula vegetativa):
Al final del periodo de crecimiento exponencial, la clula vegetativa
contiene dos cromosomas.
Fase I (t
0
-t
1
):

El material gentico (los dos cromosomas) se condensa
constituyendo un filamento axial ancho, que ocupa el centro de la
clula, segn su eje longitudinal. Cada nucleoide est unido a uno
de los extremos de la clula.

En vez de iniciarse una divisin celular simtrica (con septo
central), se forman dos espculas de la pared celular cerca de los
polos hacia el interior, rodeadas de la correspondiente
invaginacin de la membrana citoplsmica. Cada espcula est
sealando una zona donde se est formando el anillo de FtsZ
(protena contrctil de tipo tubulina: vase el tema 5)

Se sintetizan y se liberan al medio antibiticos y varias
exoenzimas. Una serie de proteasas se encargan del turnover de
protenas intracelulares, cuyos aminocidos constituyentes sern
empleados para sintetizar nuevas protenas especficas de la
esporulacin.
Fase II (t
1
-t
2
):

Se termina por formar un septo transversal acntrico, cerca de un
polo de la clula, por invaginacin de la membrana citoplsmica, y
deposicin de nuevo peptidoglucano entre las dos membranas
adyacentes.

Cada nucleoide queda segregado en uno de los dos
compartimentos que se han formado:

un cromosoma va al compartimento pequeo (compartimento de
la preespora);

la otra copia del cromosoma va al compartimento grande (clula
madre).

En esta fase contina la sntesis de los antibiticos y de las
exoenzimas (serina-proteasas, metalo-proteasas, ribonucleasas, o-
amilasa, etc).
Fase III (t
2
-t
3
):

Independizacin del protoplasto de la preespora respecto de la
clula madre. Para ello, lo primero que ocurre es la degradacin
selectiva del peptidoglucano del septo que se haba depositado en
la fase II (esta degradacin comienza por el centro, es decir, por
donde se haba cerrrado, y sigue hacia la periferia, y en ella
intervienen los productos de varios genes). Entonces, la membrana
citoplsmica de la clula madre va creciendo unidireccionalmente
alrededor de la preespora, hasta que sta queda libre en el
citoplasma del esporangio.

Obsrvese que el citoplasma de la preespora queda rodeado por
dos membranas de polaridad opuesta: la interior tiene la
polaridad normal, pero la exterior, derivada del crecimiento de la
membrana de la clula madre, tiene polaridad invertida

A partir de esta fase el turnover (renovacin) de protenas slo
tendr lugar en la clula madre, detenindose en el compartimento
de la preespora.
Fase IV (t
3
-t
4
):

Se forma casi por completo la corteza de la espora, por deposicin
de peptidoglucano entre las dos membranas. Sin embargo este PG
an no est maduro (no tiene todava las caractersticas que
estudiamos en el apartado 1.3.3).

Tambin se deposita el peptidoglucano de la pared celular (que
constituye el germen de la pared celular de la futura clula
vegetativa).

Coincidiendo con esto, la preespora adquiere su aspecto refrctil
al microscopio ptico en fresco.

Comienza la sntesis del cido dipicolnico (DPA), as como la
acumulacin de Ca
2+
.

En las bacterias que lo poseen, en esta fase comienza la sntesis del
exosporio.
Fase V (t
4
-t
5,5
):

Los materiales de las cubiertas (que se haban ido sintetizando
durante las fases II y III en el compartimento de la clula madre),
comienzan a depositarse por fuera de la membrana esporal
externa.

Al final de esta fase se adquiere la resistencia al octanol.

Contina la acumulacin de DPA, que sigue secuestrando iones
Ca
2+
(formacin del quelato de dipicolinato clcico, DPC).
Fase VI (t
5,5
-t
7
):

La preespora madura hasta espora.

Madura la corteza (para generar el caracterstico PG cortical, ms
laxo, con su bajo porcentaje de entrecruzamientos -por actuacin
de endopeptidasas- y la lactama del NAM).

Maduran las cubiertas.

El citoplasma de la espora se hace ms homogneo y ms denso a
los electrones.

Por una serie de razones an no totalmente aclaradas, la espora se
hace resistente al calor y al cloroformo.

Se adquiere resistencia a las radiaciones ultravioleta (UV).

Se adquiere resistencia a la lisozima.
Fase VII (t
7
-t
8
):

Liberacin de la espora madura por autolisis de la clula madre.

las bacterias que han producido exosporio, cuando la espora sale al
exterior, este exosporio pierde su contenido de citoplasma
(procedente de la clula madre), quedando como un saco vaco y
plegado, unido a las cubiertas.

La parte superior de la figura muestra un grfico de los principales
cambios que acabamos de comentar, expresados en funcin del
tiempo transcurrido desde el inicio de la esporulacin.
1.6 GENTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIN
Las clulas pueden detener el proceso de la esporulacin si
durante las 4 primeras fases se les suministra el nutriente que estaba
limitando y que fue responsable del desencadenamiento (efecto de
desbloqueo metablico). Pero a partir de la fase V el aporte de
nutrientes no tiene ya ese efecto inhibidor: el proceso de la
esporulacin ya es irreversible, y se dice que la clula est
comprometida (= obligada) a esporular.
El proceso de la esporulacin es muy ordenado en el tiempo
y en el espacio. En su base gentica existe un conjunto de varios
operones especficos de la esporulacin (operones spo), sometidos a
un finsimo control gentico espacial y temporal. El conjunto de
estos operones (que se encuentran en cuatro zonas distintas del
cromosoma), se denomina esporuln, y comprende ms de 125
genes. Las principales caractersticas de los operones del esporuln
son:

Los operones estn inactivos durante el crecimiento vegetativo;

se van activando de modo ordenado y secuencial, para luego ser
reprimidos (una vez han actuado);

estn sometidos a interacciones pleiotrpicas unidireccionales;

existe una comunicacin regulatoria entre el compartimento de
la espora y de la clula madre (interacciones espaciales);

dentro de los mecanismos genticos implicados en la expresin y
regulacin de los distintos operones correspondientes a fases
distintas de la esporulacin, un papel muy importante es el jugado
por las subunidades sigma (o) alternativas de la ARN-
polimerasa.
1.7 CUERPOS PARASPORALES
Algunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis, B.
popiliae y algunas especies de Clostridium, forman cristales
proteicos en el esporangio simultneamente a la formacin de la
endospora: son los llamados cuerpos parasporales.
Cada clula madre exhibe una sola inclusin, que se puede
presentar libre en el citoplasma, o bien englobada en el exosporio de
la espora. Los cuerpos parasporales pueden ser amorfos, pero los
ms tpicos son pseudocristales octadricos (bipiramidales). Estn
compuestos de la agregacin regular de subunidades de una
glucoprotena de unos 120 kDa, sintetizada durante la fase IV.
La funcin de estos cuerpos parasporales en la esporulacin es
desconocida (e incluso puede que de hecho, no tenga tal tipo de
funcin). Bajo condiciones alcalinas, se disuelven y la protena se
convierte en una poderosa toxina para larvas de lepidpteros y
otros insectos, cuando las ingieren va oral (pero no por va
parenteral). Veamos cmo se produce el proceso de la toxicidad:
1. La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El
cuerpo parasporal se libera junto con la espora, cuando la clula
madre se autolisa.
2. Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la
oruga (que es alcalino), la protena sufre proteolisis, lo que la
transforma en una toxina.
3. Esta toxina altera la permeabilidad del epitelio intestinal de la
oruga, de modo que los lquidos alcalinos del intestino pasan a la
hemolinfa, que incrementa su pH por encima de 8, lo cual
termina provocando la parlisis rpida del insecto, y finalmente
su muerte.
El significado biolgico ms probable de este fenmeno es
que la produccin de cuerpos parasporales sea una variante de la
esporulacin que evolucion durante la adaptacin de estas bacterias
a sus nichos ecolgicos, como una manera de asegurar la
germinacin de las endosporas: la oruga ingiere los cristales junto
con las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que se
pudre. La oruga muerta y en putrefaccin asegurara un entorno
adecuado en nutrientes para que se alimentaran y multiplicaran las
clulas vegetativas que surgieran de la germinacin de esas esporas.
Desde hace tiempo ciertos grupos de agricultores vienen
usando inculos de bacterias esporuladas de las especies productoras
de cuerpos parasporales para rociar sus plantas y protegerlas de
insectos: estamos ante un autntico insecticida biolgico,
biodegradable, selectivo hacia las plagas e inofensivo para los seres
superiores.
La moderna Ingeniera Gentica ha logrado insertar y expresar
genes codificadores de las toxinas parasporales de Bacillus
thuringiensis en plantas de cultivo. Hoy da existen millones de
hectreas de cultivo de plantas transgnicas "Bt" (sobre todo
algodn, maz, y patata) que dependen menos de los insecticidas
qumicos merced a estos genes bacterianos (aunque ello no ha
evitado las crticas de ciertos grupos ecologistas opuestos por
sistema a todo lo que suene a manipulacin gentica por tcnicas de
ADN recombinante).
1.8 PROPIEDADES BIOLGICAS DE LAS ESPORAS: SU
FUNDAMENTO
Las endosporas son clulas en estado de dormancia, con una
bajsima tasa metablica (hipometabolia, la menor que existe en el
mundo vivo), y capaces de conservar su vitalidad durante
largusimos perodos. Son muy resistentes a la accin de diversos
agentes qumicos (octanol, cloroformo) y fsicos (altas temperaturas,
congelacin, desecacin, radiaciones).
1) Hipometabolia: Poseen la ms baja tasa respiratoria de todos los
seres vivos. Por ello son capaces de sobrevivir en ausencia de
nutrientes durante largos perodos de tiempo.
2) Dormancia: Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora
tiene una gran inercia a los sustratos exgenos. Como veremos, la
espora slo perder la dormancia cuando se haya activado para la
germinacin.
3) Resistencia al calor: Las esporas de ciertas especies resisten el
calor hmedo de 120
o
C durante 10 min, lo cual condiciona los
parmetros para esterilizar materiales (vase el captulo 13 titulado
Accin de agentes fsicos sobre las bacterias). Esta elevada
resistencia a las altas temperaturas es un subproducto de los cambios
evolutivos que condujeron a la deshidratacin como medio para
lograr la hipometabolia y la dormancia. Por lo tanto, la
deshidratacin es la clave de las anteriores propiedades. (En cambio,
como dijimos antes, al menos parte de la resistencia al calor seco, es
decir, en ausencia de vapor de agua, se debe a las protenas SASP,
que protegen al ADN de los daos oxidativos de este tipo de calor).
4) Deshidratacin: El muy bajo contenido en agua de la espora (0.3
g de agua/g de peso seco frente a los 3-4 g de agua/g de peso seco
de la clula vegetativa) hace que la espora sea muy refrctil al
microscopio ptico en fresco. Ello condiciona las propiedades 1,
2 y 3. Cul es el mecanismo de la deshidratacin, base a su vez
de tantas propiedades biolgicas de las endosporas? El tema es
an objeto de debate. Vamos a exponer brevemente una hiptesis
(1989), segn la cual habra 3 etapas en la consecucin de la
espora deshidratada y resistente al calor:
a) En las fases III y IV el cido dipicolnico va entrando al
protoplasto de la prespora. Simultneamente el Ca
2+
entra
desde el exterior a la clula madre por transporte activo, y de
ella al protoplasto de la prespora por difusin facilitada. Se
forma el correspondiente quelato de dipicolinato clcico
(DPC). Este es un proceso con retroalimentacin positiva, ya
que conforme el Ca
2+
queda secuestrado en forma de quelato
(lo que significa que no hay de hecho iones Ca
2+
libres en el
interior de la prespora), se facilita ms la entrada de mayores
cantidades de Ca
2+
. Parte del Ca
2+
y de otros cationes se
acomplejan tambin con macromolculas del protoplasto.
Todo ello redunda en que la corteza se queda sin cationes;
por lo tanto, no hay posibilidad de neutralizar las cargas
negativas del peptidoglucano cortical las cargas negativas
de la corteza se repelen se produce la expansin del
peptidoglucano cortical en su expansin, la corteza se
topa con las cubiertas rgidas, por lo que presiona sobre el
protoplasto sale ms agua del protoplasto.
b) Resultado final: termoestabilizacin (= termorresistencia)
del protoplasto. La gran prdida de agua hace que los diversos
compuestos del protoplasto se compacten entre s, lo que
facilita sus interacciones con los cationes. El resultado es la
formacin de un gel a base de una matriz constituida por
complejos supramoleculares, macromolculas y pequeas
molculas densamente empaquetados, unidos entre s e
inmovilizados. Parece ser que esta es la base principal de la
enorme resistencia al calor hmedo por parte de la endospora.
5) Resistencia a los rayos UV: Parece que depende de varios
componentes:
a) absorcin de luz UV por las cubiertas;
b) por el DPC;
c) pero cada vez est ms claro que las protenas SASP tienen un
papel central en esta resistencia a los UV. Como ya dijimos,
las SAPS de tipo / acomplejan al ADN y favorecen su
configuracin de tipo A, lo cual a su vez provoca un cambio en
su fotoqumica (ver apartado siguiente);
d) cambio en la fotoqumica del ADN de la espora: se puede
explicar parcialmente por la misma deshidratacin del
protoplasto, que impide que se formen dmeros de pirimidina
entre pirimidinas adyacentes de una misma cadena del ADN.
Como veremos en el captulo 13, estos dmeros de pirimidina
constituyen el principal tipo de fotoproductos generados por
rayos UV en el ADN de la clula vegetativa, base de la mayor
parte de los efectos deletreos de estas radiaciones. Por otro
lado, las SASP de tipo / que acomplejan el ADN hacen que
en la espora la luz UV provoque otro tipo de alteracin,
llamada fotoproducto de la espora (que consiste en 5-timinil-
5,6-dihidrotimina) que se produce en menor cantidad. Aunque
la acumulacin de fotoproductos de la espora puede ser igual
de letal que la de los dmeros de pirimidina, cuando germina la
espora se pone inmediatamente en marcha un eficiente sistema
de reparacin especfico de ese fotoproducto.
6) resistencia a agentes qumicos: La resistencia de la endospora
a agentes como octanol, cloroformo, etc. se debe a la
impermeabilidad de las cubiertas, gracias a su gran grosor y
su peculiar composicin a base de protenas ricas en
aminocidos hidrfobos y con abundantes puentes disulfuro
(cistinas). La resistencia a la lisozima se debe por un lado a la
propia impermeabilidad de las cubiertas, y a la resistencia de la
corteza.
1.9 GERMINACIN DE LA ENDOSPORA
La germinacin es el proceso por el cual una espora se
convierte al estado vegetativo. Es mucho ms rpida que la
esporulacin (dura unos 90 minutos). Podemos considerar en ella
cuatro etapas, segn el modelo de Foster y Johnstone (1990):
1. preactivacin
2. activacin
3. iniciacin (o germinacin en sentido estricto)
4. crecimiento ulterior (entrada en fase vegetativa)
1.9.1 PREACTIVACIN
Antes de que la espora est en condiciones de germinar se
requiere que sus cubiertas se alteren. En la naturaleza esto ocurre
por erosin por envejecimiento progresivo. Artificialmente, en
laboratorio, se puede recurrir a algn procedimiento para alterar esas
cubiertas:

tratando las esporas a altas temperaturas, pero inferiores a su
inactivacin (100
o
C durante unos minutos);

por radiaciones ionizantes;

por pH bajos;

por tratamiento con sustancias que posean grupos -SH libres (p.
ej., mercaptoetanol).
1.9.2 ACTIVACIN
La activacin es una etapa an reversible, desencadenada por
un agente qumico externo (germinante) presente en el medio. Este
agente es variable segn las especies:

iones inorgnicos (Mn
2+
, Mg
2+
);

L-alanina en B. subtilis;

glucosa u otros azcares;

adenina u otras bases nitrogenadas.
El germinante es detectado por un receptor alostrico a nivel
de la membrana esporal interna. Una vez que dicho receptor se
activa, adquiere una capacidad proteoltica especfica que le permite
romper una proenzima que hasta ese momento se encontraba unida
covalentemente al peptidoglucano de la corteza. La enzima
resultante reconoce la lactama del NAM y comienza a hidrolizar el
peptidoglucano cortical. La consecuencia es que comienza a entrar
agua al protoplasto de la espora, por lo que la espora pierde su
caracterstica refringencia, y se comienza a perder la resistencia al
calor.
Durante toda esta etapa el metabolismo est an latente.
1.9.3 INICIACIN O GERMINACIN EN SENTIDO
ESTRICTO
En esta etapa la germinacin se hace ya irreversible, y se
rompe definitivamente el estado de dormancia, si bien el
metabolismo es endgeno (no depende todava de sustancias
externas). Los principales acontecimientos bioqumicos son:

se pierde DPA, lo que supone prdida de Ca
++
;

este Ca
++
pasa al crtex, donde neutraliza las cargas negativas
se favorece la rehidratacin del protoplasto y su hinchamiento,
favorecido por la concomitante contraccin del crtex, mientras
contina y se completa rpidamente la hidrlisis del PG cortical;

el 3-fosfoglicrico (3-PG) se convierte en 2-PG, y ste en PEP,
que a su vez dona su fosfato de alta energa para producir ATP;

las pequeas protenas SASPs se hidrolizan por una proteasa
especfica que hasta ese momento estaba inactiva. De este modo
los aminocidos constituyentes de las SASPs se reutilizan para la
sntesis de nuevas protenas por parte de la pequea dotacin de
ribosomas y dems molculas accesorias;

La ARN polimerasa comienza a sintetizar ARN (comienza la
transcripcin de genes vegetativos).
1.9.4 TERMINACIN Y CRECIMIENTO ULTERIOR
Aparece ya el metabolismo exgeno, de modo que la espora
puede tomar nutrientes del exterior y metabolizarlos. Los eventos
bioqumicos y estructurales ms notorios son:

se sintetiza ADN;

el protoplasto crece an ms;

la pared de la espora sirve como cebador (germen) para la
produccin de la pared de la clula vegetativa naciente;

la clula vegetativa sale por rotura de las cubiertas, que puede
ser de tipo polar o ecuatorial. Hay que aclarar que al salir, esta
clula vegetativa se tie como Gram-negativa, y slo adquirir su
tpica grampositividad despus de la primera divisin.

Salida de la
nueva
clula
vegetativa
al final de
la
germinaci
n. Observa
la rotura de
las
cubiertas
2 EXOSPORAS
Determinadas bacterias (Methylosinum, Rhodomicrobium)
forman esporas reproductivas por gemaciones sucesivas al final
de sus prostecas. Estas exosporas poseen una envuelta a base de
pared rodeada de una cpsula o cubierta gruesa.
3 DIFERENCIACIONES EN ACTINOMICETOS
Los actinomicetos constituyen un grupo amplio y complejo de
bacterias Gram positivas con tendencia a un tipo de crecimiento
micelial y un estilo de vida similar a los hongos. Muchos de los
taxones de Actinomicetos y bacterias relacionadas poseen clulas
diferenciadas de tipo reproductivo, genricamente conocidas como
esporas. Estudiaremos brevemente la diferenciacin en dos gneros
tpicos.
Gnero Actinoplanes
Las especies de este gnero producen micelios vegetativos de
sustrato (subterrneos). Algunos de estos micelios generan hifas
verticales que sobresalen a la superficie. El extremo de cada una de
estas hifas se diferencia para constituir un saco llamado
esporangio, que se fragmenta en un conjunto de esporas mviles
(flageladas) llamadas zigosporas o esporangiosporas.
Gnero Streptomyces
Forma un micelio de sustrato ramificado, interrumpido de
vez en cuando por pared transversal (son por lo tanto organismos
cenocticos, es decir, el segmento de micelio limitado por dos
tabiques sucesivos contienen varios cuerpos nucleares). Cuando hay
limitacin de nutrientes se comienza a formar un micelio areo a
partir de ramificaciones de las hifas subterrneas. En los extremos
de algunas de estas hifas areas las clulas se diferencian en
cadenas de esporas. Durante la formacin de estos micelios areos
y de las esporas la poblacin de micelios subterrneos sufre una
lisis masiva.
Propiedades de las esporas de los estreptomicetos:

la pared celular de la espora es ms gruesa que la de la clula
vegetativa;

no hay cambio cualitativo en el peptidoglucano;

no hay crtex ni cubiertas;

son muy hidrofbicas: se resisten a ser suspendidas en agua. Esto
parece que se debe a una vaina que rodea a la pared celular,
compuesta a base de tbulos auto-ensamblables.

resisten ms al calor y a la desecacin en comparacin a las
clulas vegetativas, pero menos que las endosporas.

son metablicamente durmientes (clulas en reposo).
4 QUISTES BACTERIANOS
Son clulas que se producen en algunas especies por
engrosamiento de la pared celular de la clula vegetativa, por
deposicin de nuevos materiales externamente a la membrana
citoplsmica, al mismo tiempo que se acumulan materiales de
reserva en el citoplasma. Poseen metabolismo endgeno, y
resisten al calor, a la desecacin y a agentes qumicos ms que la
correspondiente clula vegetativa (pero menos que las endosporas).
Ejemplos:

Quistes de Azotobacter y Bdellovibrio.

Microquistes de Mixobacterias, llamados mixosporas: sus
envueltas constan de una corteza, rodeada de cubiertas (interna y
externa). Estas cubiertas se componen de una glucoprotena muy
rica en polisacridos.
5 DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS
En las cianobacterias filamentosas (que forman tricomas) se
pueden observar dos tipos principales de clulas diferenciadas a
partir de las vegetativas: heteroquistes y acinetos.
Heteroquistes (= heterocistes)
Son clulas de trmino, sin funcin reproductiva,
especializadas en la fijacin de nitrgeno molecular (N
2
), de
mayor tamao que las clulas vegetativas.
La conexin entre clulas vegetativas y heteroquistes se
establece a travs de un estrangulamiento de los polos de stas. La
unin est atravesada por una serie de finos canales llamados
microplasmodesmos, que reducen al mnimo el intercambio de
sustancias entre ambas clulas.
Por fuera de la pared celular (que es de tipo Gram-negativo), existen
tres cubiertas:

una capa laminada interna a base de glucolpidos exclusivos de
cianobacterias;

una capa homognea central a base de polisacridos;

una capa fibrosa externa, tambin polisacardica, pero menos
compactada.
Estas tres capas evitan la difusin del O
2
al interior del
heteroquiste, lo que representa uno de los mecanismos para la
proteccin de la nitrogenasa (complejo enzimtico que reduce el
N
2
a NH
4
+
, y que es muy sensible al oxgeno).
Pero el heteroquiste dispone de ms estrategias para la proteccin
de la nitrogenasa:

aparte de los microplasmodesmos, en las uniones con las clulas
vegetativas adyacentes se forman sendos tapones de cianoficina;

los tilacoides se disponen como un retculo polar y perifrico, y
carecen de ficobilisomas, por lo que no pueden realizar la fase
II de la fotosntesis. Por lo tanto, los heteroquistes no generan
oxgeno, ya que slo realizan la fotofosforilacin cclica.
Acinetos (=aquinetos)
Son formas de reposo que se originan a partir de clulas
vegetativas, por acumulacin de nuevas capas de materiales
polisacardicos por fuera de la pared celular, y por formacin de
acmulos de reserva en el citoplasma.
Resisten ms que las clulas vegetativas los perodos de
desecacin y de congelacin, pero no al calor.
Cuando las condiciones ambientales mejoran, se producen
sucesivas divisiones transversales en el acineto, que finalmente se
convierte en un filamento ms corto y menos grueso que los
tricomas, llamado hormogonio.





NDICE:
1 CONCEPTOS GENERALES
2 DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS
2.1 FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN
DESINFECTANTE
2.2 ALGUNOS EJEMPLOS DE DESINFECTANTES Y
ANTISPTICOS Y DE SUS APLICACIONES
3 QUIMIOTERPICOS
3.1 QUIMIOTERPICOS DE SNTESIS
3.1.1 ANLOGOS DE FACTORES DE CRECIMIENTO
MICROBIANO
3.1.1.1 SULFAMIDAS
3.1.1.2 OTROS ANLOGOS DE FACTORES DE
CRECIMIENTO
3.1.2 OTROS QUIMIOTERPICOS DE SNTESIS: LAS
QUINOLONAS
3.2 ANTIBIOTICOS
3.2.1 INTRODUCCION
3.2.2 INHIBIDORES DE LA BIOSINTESIS DE LA PARED
CELULAR BACTERIANA
3.2.2.1 VANCOMICINA
3.2.2.2 ANTIBIOTICOS -LACTAMICOS
3.2.3 ANTIBIOTICOS QUE INTERFIEREN EN LA
BIOSINTESIS DE PROTEINAS
3.2.3.1 INHIBIDORES DE LA FASE INICIAL DE LA
ELONGACION: TETRACICLINAS
3.2.3.2 INDUCTORES DE ERRORES EN LA LECTURA
DEL ARNm: AMINOGLUCSIDOS
3.2.3.3 INHIBIDORES DE LA TRANSLOCACION:
MACRLIDOS
3.2.4 INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION DE LAS
EUBACTERIAS: RIFAMICINAS

1 CONCEPTOS GENERALES
Existen ciertas sustancias qumicas que influyen negativamente
sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes:

bacteriostticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;

bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, si no slo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier
tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes
microbiostticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma
sustancia qumica, la lnea de demarcacin entre un efecto
microbiosttico y otro microbicida depende muchas veces de la
concentracin de dicha sustancia y del tiempo durante el que acta.
Cmo podemos saber que un microorganismo est muerto?
El nico criterio vlido es la prdida irreversible de la capacidad de
divisin celular, es decir, de la prdida de viabilidad, y se suele
comprobar empleando tcnicas con placas de Petri (es decir,
confirmando que no crecen en medios slidos adecuados).
Antes de proceder al estudio de las diversas molculas que
pueden afectar el crecimiento o la viabilidad de los
microorganismos, veamos unas cuantas definiciones bsicas.

Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivacin
total de todas las formas de vida microbiana (o sea, su muerte o
prdida irreversible de su viabilidad). (Tambin existen agentes
fsicos esterilizantes, como ya vimos en los dos captulos
anteriores).

Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo
qumicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos
patgenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos
casos suelen) presentar efectos txicos sobre tejidos vivos, por lo
que se suelen emplear slo sobre materiales inertes.

Agentes antispticos son sustancias qumicas antimicrobianas que
se oponen a la sepsis o putrefaccin de materiales vivos. Se trata
de desinfectantes con baja actividad txica hacia los tejidos vivos
donde se aplican.

Quimioterpicos son compuestos qumicos con actividad
microbicida o microbiosttica, con una toxicidad suficientemente
baja como para permitir su administracin a un organismo
superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable
un cierto tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces
como antimicrobianos dentro del organismo.
Todos los das usamos agentes qumicos para controlar el
crecimiento microbiano: detergentes y jabones para el cuerpo y la
ropa, cloracin de las aguas potables, antispticos para la piel y el
tratamiento de heridas, desinfectantes para tratar superficies en la
industria y en los laboratorios, quimioterpicos y antibiticos para
tratar enfermedades bacterianas, etc.
2 DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS
Como se recordar cuando tratamos el tema del calor como
agentes esterilizante, la muerte de una poblacin bacteriana se poda
representar como una curva exponencial, expresin de la cintica de
primer orden. Este tipo de cintica tambin es aplicable a la muerte
microbiana cuando se aplica un agente qumico a una concentracin
suficientemente alta. Sin embargo, cuando se aplican menores
concentraciones del agente, se pueden encontrar cinticas diferentes,
expresables como curvas sigmoidales.
2.1 FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN
DESINFECTANTE
1) Concentracin del agente y tiempo de actuacin
2) pH: El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria
como al grado de ionizacin del agente. En general, las formas
ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a travs de las
membranas biolgicas, y por lo tanto son ms efectivos.

Los agentes aninicos suelen ser ms efectivos a pH cidos.

Los agentes catinicos muestran ms eficacia a pH alcalinos.
3) Temperatura. Normalmente, al aumentar la temperatura
aumenta la potencia de los desinfectantes. Para muchos
agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de
muerte.
4) Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a
la poblacin microbiana

segn la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste
los hipocloritos mejor que otras bacterias;

segn la fase de cultivo;

dependiendo de la presencia de cpsulas o de esporas (suelen
conferir ms resistencia);

dependiendo del nmero de microorganismos iniciales.
5) Presencia de materiales extraos: La existencia de materia
orgnica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus)
afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo
oxidante (como los hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de
protenas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos
en cuanto a su poder desinfectante o esterilizante. Por lo tanto,
para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar
con este factor, determinando previamente el gasto de materia
orgnica inerte, o calculando la potencia neta del desinfectante
en presencia de la materia orgnica.
2.2 ALGUNOS EJEMPLOS DE DESINFECTANTES Y
ANTISPTICOS Y DE SUS APLICACIONES
Tanto en los laboratorios como en industrias alimentarias es
necesario a menudo tratar superficies inertes (mesas, suelos,
paredes, maquinaria) con desinfectantes, a ser posible con efecto
microbicida. Por ejemplo se pueden usar sales cuaternarias de
amonio como el cloruro de benzalconio. El formaldehido es un
agente alquilante que en solucin al 3-8% sirve bien para tratar
superficies.
Los materiales termosensibles que no se pueden esterilizar por
calor se pueden esterilizar en fro mediante ciertos agentes:

En los hospitales, para esterilizar termmetros, catteres,
instrumentos, etc., se suele recurrir a un tipo de autoclave que usa
el gas xido de etileno o formaldehido gaseoso (ambos son
agentes alquilantes)

Pequeos objetos se pueden esterilizar en perxido de hidrgeno
(agente oxidante).

Las cmaras de cra de animales libres de grmenes se esterilizan
con cido peractico, un fuerte agente oxidante.
Los halgenos son agentes oxidantes muy potentes, y que tienen
usos muy importantes:

El yodo es un magnfico antisptico de la piel (el mejor que se
conoce)

El cloro se presenta como cloro gaseoso (Cl
2
), hipocloritos y
cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberacin de cloro
libre (Cl
2
); a su vez, el Cl
2
reacciona con el agua para dar cido
hipocloroso (ClOH), que a pH cido o neutro es un oxidante
fuerte.

Cloro gaseoso: a 1-3 ppm se usa en la cloracin de aguas para
bebida y de aguas de piscinas. Su actividad se ve muy influida
(mermada) por la presencia de materia orgnica; por ello, se
suele determinar la demanda de cloro del agua a tratar.
Descontada dicha demanda, el cloro gaseoso mata rpidamente
(15-30 segundos) a slo 1 ppm.

Soluciones de hipocloritos: hipocloritos de sodio, de calcio o de
litio. A 200 ppm de cloro se usan ampliamente, ya como lquidos
(lejas), o en polvo, en industrias alimentarias y lcteas (para
desinfectar el equipamiento y maquinaria que ha de entrar en
contacto con los alimentos a procesar), en restaurantes, hoteles,
hospitales, etc.
Ciertos cidos orgnicos se usan como conservantes de alimentos.
Tal es el caso del cido benzoico y del cido srbico. Por otro lado,
los alimentos fermentados producen sus propios conservantes, como
el cido actico, lctico y propinico.
3 QUIMIOTERPICOS
Los quimioterpicos son sustancias con actividad
antimicrobiana (microbicida o microbiosttica) con toxicidad
suficientemente baja como para poder ser administrados a un
organismo por la va adecuada, hasta alcanzar y mantener
concentraciones eficaces en los tejidos. Aunque en el captulo 1 ya
hablamos del arranque y desarrollo de la Quimioterapia, recordemos
aqu esta pgina notable de la historia de la Microbiologa:
1900-15 Ehrlich concibe la idea de usar compuestos qumicos
de sntesis como balas mgicas selectivas hacia
microorganismos, pero inofensivas para las personas
o animales superiores. En 1909 descubre que el
salvarsn es efectivo contra la sfilis. Acua el
trmino quimioterapia.
1932-35 Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la
accin del rojo de prontosilo (la primera sulfamida)
sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo
1940 Woods descubre el mecanismo de accin de las
sulfamidas. Estamos en plena Edad de oro de la
Quimioterapia de sntesis.
1929 Fleming descubre la penicilina, el primer antibitico
natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La
industria farmacutica se muestra "indiferente.
1940 Chain y Florey purifican la penicilina. Se usa en la 2
Guerra Mundial. Comienza la era de los antibiticos
naturales
1944 Waksman, un microbilogo de suelos, ha iniciado una
bsqueda de microorganismos productores de
antibiticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la
poca dorada de los antibiticos (quimioterpicos
naturales), y la bsqueda racional rinde decenas de
nuevos antimicrobianos procedentes de
Actinomicetos, otras bacterias y hongos.
Las propiedades deseables de un quimioterpico ideal seran las
siguientes:
1) Que tenga toxicidad selectiva, es decir, actuar segn el
principio de bala mgica que daa al microorganismo
respetando al hospedador
2) Que sea microbicida, es decir, que mate o inactive
irreversiblemente el microorganismo, provocando la prdida
total de viabilidad. En el mundo real, sin embargo, hay muchos
quimioterpicos microbiostticos. En estos casos, los sistemas
de defensa natural del hospedador (mecanismos de inmunidad)
hacen el resto, eliminando el agente microbiano previamente
inhibido por el quimioterpico.
3) Los microorganismos susceptibles no deberan desarrollar
resistencias al quimioterpico. Pero desgraciadamente, en
muchos casos, al cabo de un tiempo de uso del antimicrobiano
comienzan a surgir cepas microbianas resistentes al mismo. La
quimioterapia es una autntica escalada de armamentos entre
los microorganismos y los humanos, en los que ante una nueva
arma de estos ltimos los microbios pueden responder al cabo
del tiempo con estrategias de resistencia, lo que obliga a un
uso racional de los quimioterpicos, y a una bsqueda continua
de nuevos agentes.
4) Que el quimioterpico sea efectivo contra un amplio espectro
de microorganismos. Pero no existe (ni existir) un solo
agente capaz de inhibir a todos los microorganismos. Algunos
antibiticos son de amplio espectro, pero no son eficaces
contra todos los microorganismos. Por otro lado, existen
quimioterpicos de espectro estrecho, pero muy selectivos
contra ciertas bacterias que son patgenas importantes.
5) Que no sea alergnico, y que no tenga efectos secundarios.
6) Que permanezca de forma activa en plasma, tejidos, etc.
durante el tiempo necesario. A ser posible, que sea soluble en
agua y que alcance pronto la concentracin teraputica en los
tejidos.
3.1 QUIMIOTERPICOS DE SNTESIS
3.1.1 ANLOGOS DE FACTORES DE CRECIMIENTO
MICROBIANO
3.1.1.1 SULFAMIDAS
Los primeros quimioterpicos de sntesis fueron las
sulfamidas. Como ya hemos comentado, su descubrimiento y la
comprobacin de su accin quimioterpica, marcaron el comienzo
de la Quimioterapia con criterios racionales. Despertaron gran
inters cuando se mostr que su mecanismo de accin depende del
hecho de que funcionan como anlogos de metabolitos, actuando
como inhibidores competitivos respecto de cierta enzima. La
primera sulfamida fue la sulfanilamida (para-aminobenceno
sulfonamida).
Las sulfamidas tienen un efecto bacteriosttico. Su accin
antibacteriana se debe al hecho de que funcionan como anlogos
estructurales del cido para-aminobenzoico (PABA), inhibiendo
competitivamente por el acceso a la enzima dihidropteroil-
sintetasa en la ruta de sntesis del cido tetrahidroflico (THF).


Como se puede ver, la dihidropteroil-sintetasa cataliza la
condensacin del PABA con el 2-amino,4-hidroxi, 6-hidroximetil
dihidropteroil-pirofosfato, que lleva a la sntesis de cido
dihidropteroico (una de las fases intermedias de la sntesis del
tetrahidroflico -THF). En la figura se puede apreciar que el
PABA y las sulfamidas son muy parecidas. De hecho, la sulfamida
es usada por la enzima como un sustrato alternativo al PABA.
En este caso, la enzima cataliza una reaccin que genera un
producto que no puede actuar como intermediario en los siguientes
pasos de la ruta de sntesis del THF.

Los microorganismos son sensibles a las sulfamidas porque sus
necesidades de THF las han de satisfacer sintetizndolo a partir de
PABA usando la ruta de la que estamos hablando. Sin embargo,
los animales son resistentes, debido a que carecen de esta ruta, y
en cambio, se aprovisionan de flico directamente en su dieta.
A partir de la sulfanilamida se sintetizaron desde entonces gran
nmero de derivados por sustitucin de uno de los hidrgenos del
grupo sulfonamida, formando estos derivados la llamada familia de
las sulfamidas. Lo que tienen en comn las sulfamidas con
actividad antibacteriana es:

tener libre el grupo amino en para

grupo sulfona (-SO
2
-) unido al anillo bencnico;
La sustitucin del grupo amido unido a la sulfona, aunque no
modifica sustancialmente la actividad antibacteriana, puede suponer
una serie de ventajas de tipo farmacolgico.
3.1.1.2 OTROS ANLOGOS DE FACTORES DE
CRECIMIENTO
Las sulfonas son derivados de la dapsona (=4,4'-diamino-
difenilsulfona). Aunque no se usa contra infecciones normales, ha
encontrado una importante aplicacin en el tratamiento de la lepra
(producida por Mycobacterium leprae); de hecho es el
quimioterpico de eleccin para esta enfermedad. Probablemente su
mecanismo de accin est basado en actuar como competidor del
PABA.
La isoniazida es la hidrazida del cido isonicotnico (tambin
conocida por sus iniciales inglesas, INH). Como se puede ver, es un
anlogo estructural de dos vitaminas: la nicotinamida y el piridoxal.
Tiene efecto bactericida incluso a bajas concentraciones (1g/ml) e
incluso intracelularmente, lo que permite su empleo contra las
especies patgenas de Mycobacterium , y en general contra bacterias
cido-alcohol resistentes (Nocardia, Corynebacterium). Es el
tratamiento ms usado contra el bacilo de la tuberculosis
(Mycobacterium tuberculosis). Ejerce varios efectos:

interferencia -por mecanismo an desconocido- con la biosntesis
de la pared celular de las bacterias AAR, que conduce a
desorganizar los cidos miclicos;

actuacin como antimetabolito de nicotinamida y piridoxal.
3.1.2 OTROS QUIMIOTERPICOS DE SNTESIS: LAS
QUINOLONAS
Las quinolonas son quimioterpicos de sntesis que bloquean
la ADN-girasa bacteriana, unindose a la subunidad de tipo A.
Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de
topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen
superenrollamiento negativo en la doble hlice del ADN. La ADN-
girasa est constituida por dos subunidades de tipo A y dos de tipo B
(A
2
B
2
); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en
la doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que
proporcionan la energa para la reaccin. El bloqueo de las
quinolonas sobre la girasa supone que sta queda congelada en la
fase en que el ADN est unido al enzima. Ello provoca la
acumulacin de roturas de doble cadena, lo que conduce a la muerte
de la bacteria.

El cido nalidxico (=4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetiz en 1962,
siendo el prototipo de quinolona de primera generacin. Encontr
su aplicacin en el tratamiento de infecciones por Gram-negativas
del tracto urinario, donde se concentra.

Recientemente se han sintetizado las llamadas fluoroquinolonas,
como por ejemplo el ciprofloxacn. Presentan 600 veces ms
actividad que el nalidxico, y actualmente se recetan
frecuentemente como quimioterpicos de amplio espectro.

Ciprofloxacino,
un ejemplo de
fluroquinolona
3.2 ANTIBITICOS
3.2.1 INTRODUCCIN
Los antibiticos son sustancias normalmente de bajo peso
molecular producidas por seres vivos (antibiticos naturales) o
modificadas artificialmente a partir de ellas (antibiticos
semisintticos), que a pequeas concentraciones tienen efectos
antimicrobianos (microbicidas o microbiostticos), tras ser
administrados por va adecuada a un organismo receptor.
La mayor parte de los antibiticos proceden del metabolismo
secundario de microorganismos procariotas (actinomicetos, Bacillus,
etc.) o eucariotas (hongos de los gneros Penicillium,
Cephalosporium, etc.).
Se conocen unos 5.000 antibiticos distintos, y cada ao se
descubre unos 300 nuevos, pero en clnica solo se usa un 1% de los
descubiertos. Su importancia econmica se pone de manifiesto al
pensar en las 100.000 Tm. de antibiticos producidas al ao, por un
valor equivalente a 3.000 millones de euros, lo cual representa una
de las industrias biotecnolgicas ms importantes.

Porcentajes
de
produccin
de diversas
familias de
quimioterpic
os
La mayor parte de los antibiticos comerciales se emplea para
tratar enfermedades de etiologa bacteriana, aunque algunos se usan
contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad
antitumoral.
Desde el punto de vista qumico, se clasifican en grandes familias:

antibiticos que contienen carbohidratos;

lactonas macrocclicas;

quinonas y compuestos relacionados;

antibiticos peptdicos y con aminocidos;

heterociclos del N;

heterociclos del O;

aromticos;

alifticos, etc.
La mayora de los antibiticos son molculas relativamente
pequeas pero complejas, con regiones hidrofbicas que facilitan el
transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos
de los cuales mejoran la interaccin de la molcula con su diana
macromolecular.
Para estudiarlos es ms til agrupar a los antibiticos no por
clases segn su naturaleza qumica, sino en funcin de las dianas
sobre las que actan y con las que interfieren:
A) antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular
B) antibiticos que actan sobre la membrana celular
C) antibiticos que inhiben la sntesis de protenas
D) antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos.
Los antibiticos ms abundantes, y los mejor estudiados, son
los que interfieren con enzimas de la biosntesis del peptidoglucano
de las eubacterias, y los que interfieren con la funcin del ribosoma
eubacteriano (obviamente, esto cumple el requerimiento de balas
mgicas). A continuacin estudiaremos algunos grupos importantes
de antibiticos, dando importancia a sus mecanismos de accin.
3.2.2 INHIBIDORES DE LA BIOSNTESIS DE LA PARED
CELULAR BACTERIANA
3.2.2.1 VANCOMICINA
Es un glucopptido complejo producido por Streptomyces
orientalis. Se une rpida e irreversiblemente con l extremo D-alanil-
D-alanina del pentapptido del precursor del peptidoglucano que se
halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana citoplsmica),
de modo que inhibe la reaccin de transglucosidacin.
3.2.2.2 ANTIBITICOS -LACTMICOS
Todos los antibiticos de este grupo contienen un anillo
caracterstico: el anillo -lactmico. De ellos, los ms importantes
son las penicilinas y las cefalosporinas-cefamicinas.
3.2.2.2.1 PENICILINAS
Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros
antibiticos naturales en descubrirse, pero en general, todos los -
lactmicos tienen el mismo mecanismo de accin. Actualmente las
penicilinas suponen un 17% del mercado total de antibiticos.
El grupo comn a todas las penicilinas es el cido 6-
aminopenicilnico (6-APA), que en realidad es un dipptido ciclado
por condensacin de L-cys y D-val, que genera el anillo -lactmico
(anillo A) y el anillo tiazolidnico (anillo B). Las distintas
penicilinas se pueden considerar derivadas del 6-APA, sustituyendo
el hidroxilo (-OH) del grupo carboxilo por un radical acilo (-R). Este
radical acilo es variable de unas penicilinas a otras.

Estructura
general de las
penicilinas.
Observa que el
ncleo de 6-
APA consta del
anillo
betalactmico y
del anillo
tiazolidnico. En
celeste se
muestra el
radical acilo,
que se puede
modificar para
generar distintas
penicilinas
semisintticas
con propiedades
diferentes a la
penicilina
natural
La penicilina natural, purificada por primera vez en los aos
40, es la penicilina-G (o benzil-penicilina), en la que el radical acilo
es el grupo bencilo (=fenilactico). Esta penicilina presenta una serie
de limitaciones e inconvenientes:

tiene un espectro estrecho: acta frente a estreptococos y otros
cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayora de bacterias
Gram-negativas, porque estas ltimas son impermebles debido a
su membrana externa.

Es sensible a cidos, por lo que no puede ser administrada va oral
(se inactiva a su paso por el estmago).

Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas
por muchas bacterias.
Para solventar estos problemas se fueron creando variantes
de esta penicilina que mejoraban algunas de sus cualidades. La
mayor parte de estas variantes son penicilinas semisintticas, que
se obtienen de la natural introduciendo artificialmente nuevos
grupos radicales (-R) con carboxilo en el cido 6-aminopenicilnico.
1. Resistentes a penicilinasas (p. ej., meticilina, oxacilina). Se usan
sobre todo frente a cocos Gram-positivos (Staphylococcus aureus,
S. epidermidis). Adems, son resistentes en medio cido, lo que
permite su administracin va oral.
2. De espectro ampliado. Permiten un uso efectivo frente a muchas
bacterias Gram-negativas (Haemophilus influenzae, E. coli,
Proteus, Salmonella, Shigella, etc). Dentro de este grupo,
destacamos las aminopenicilinas, como la ampicilina, o la
amoxicilina: el grupo -NH
2
del radical acilo permite que estas
penicilinas puedan atravesar la membrana externa de las bacterias
Gram-negativas. Resisten los cidos, pero desgraciadamente slo
tienen la mitad de actividad contra Gram-positivas, y algunas son
inactivadas por -lactamasas.
3. Penicilinas anti-Pseudomonas. La carbenicilina se usa frente a
Pseudomonas, un patgeno oportunista muy peligroso cuando
coloniza grandes quemaduras, heridas quirrgicas, etc.
Mecanismo de accin de las penicilinas y otros antibiticos -
lactmicos:
Todas las penicilinas (incluidas las semisintticas), son
bactericidas sobre bacterias en crecimiento, y poseen el mismo
mecanismo: Inhiben el sistema enzimtico implicado en la reaccin
de transpeptidacin del peptidoglucano naciente, o sea que
impiden los entrecruzamientos entre cadenas de PG. Ello
origina:

acumulacin de precursores del PG, sin ensamblar;

activacin de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas),
que hidrilozan el PG maduro de la bacteria; si la bacteria se
encuentra en un medio hipotnico, termina lisndose.
Por lo tanto, la accin bactericida y ltica de las penicilinas
depende de que la bacteria se encuentre creciendo en un medio
hipotnico (en un medio hipertnico se originan protoplastos y
esferoplastos). Cuando la bacteria no est creciendo, no est
haciendo renovacin (turnover) de su pared celular, lo que implica
que la penicilina no tiene diana sobre la que actuar; por lo tanto,
en estas condiciones la bacteria puede sobrevivir.
Las penicilinas tienen como dianas a una serie de autolisinas
llamadas protenas de unin a la penicilina (PBPs). Como ya
vimos en el captulo 5, las PBPs son protenas implicadas en las
ltimas fases de la sntesis y maduracin del PG. Concretamente, las
PBPs 1 a 3 son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las
penicilinas que explican la actividad bactericida.
3.2.2.2.2 CEFALOSPORINAS Y CEFAMICINAS
El ncleo de estos |-lactmicos es el cido 7-
aminocefalospornico. El anillo B es el anillo dihidrotiazina
(esqueleto de 6 tomos) en lugar del anillo tiazolidina (esqueleto de
5 tomos). Las cefalosporinas estn producidas por hongos del
gnero Cephalosporium, mientras que las cefamicinas lo son por
ciertas especies de actinomicetos del gnero Streptomyces. Estos
antibiticos son muy usados actualmente en clnica, suponiendo casi
el 40% del total.
La cefalosporina natural tiene poca actividad, pero
sustituyendo artificialmente R
1
y R
2
se obtienen derivados
semisintticos muy activos. Como es habitual con muchos
antibiticos de uso clnico, a lo largo de los aos la industria
farmacutica ha ido creando sucesivas generaciones de estos
compuestos, con aplicaciones y ventajas diferentes. Las
cefalosporinas y cefamicinas de tercera generacin han sustituido en
muchos casos a las penicilinas, debido a su mayor espectro de
accin y a que resisten mejor las |-lactamasas.
3.2.3 ANTIBITICOS QUE INTERFIEREN EN LA
BIOSNTESIS DE PROTEINAS
Los antibiticos que interfieren en la sntesis de protenas son
muy variados y abundantes, y la mayora de ellos funcionan
interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los que se unen a protenas
ribosmicas o a alguno de los ARN ribosmicos. Nosotros vamos a
detenernos principalmente en aquellos antibiticos que afectan a la
elongacin de la cadena naciente del polipptido. Obviamente, los
ms tiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los
ribosomas 70S procariticos, pero no sobre los 80S eucariticos.
Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento de
la elongacin de la cadena polipeptdica, podemos agruparlos segn
la fase concreta de la elongacin sobre la que actan:
1. inhibicin del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt)
hacia el sitio A del ribosoma;
2. introduccin de errores en la lectura de los ARNm;
3. inhibicin de la reaccin de formacin del enlace peptdico;
4. inhibicin de la traslocacin del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde
el sitio A al sitio P.
5. bloqueo de los factores de elongacin.
3.2.3.1 INHIBIDORES DE LA FASE INICIAL DE LA
ELONGACIN: TETRACICLINAS
Las tetraciclinas son antibiticos de muy amplio espectro
(frente a Gram-positivas, Gram-negativas, Rickettsias y Clamidias, e
incluso Micoplasmas), producidos por distintas especies de
Streptomyces. Se basan en el cudruple anillo del naftaceno. Actan
como bacteriostticos, siempre y cuando las bacterias estn en
crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son tiles
incluso contra bacterias que viven como parsitos intracelulares
(como las Rickettsias), debido a que su carcter hidrofbico
facilita su difusin a travs de membranas.
Mecanismo de accin: provocan que la unin del aa-ARNt al sitio
A del ribosoma sea inestable y est distorsionada, con lo cual se
evita la elongacin de la cadena. In vitro actan tanto frente a
ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, por qu in vivo
slo inhiben a las bacterias? La explicacin est en el hecho de que
las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma
suicida, cosa que no ocurre en eucariotas.
3.2.3.2 INDUCTORES DE ERRORES EN LA LECTURA DEL
ARNm: AMINOGLUCSIDOS
Los aminoglucsidos constituyen un grupo amplio y variado
de antibiticos de amplio espectro, producidos por diversas especies
de Streptomyces. Como se puede ver en las figuras, todos tienen en
comn varios rasgos qumicos: son muy polares, policatinicos;
presentan un anillo de aminociclitol (un ciclohexitol o inositol con
grupo amino); uno o ms azcares, incluyendo al menos un
aminoazcar (aparte del aminociclitol); as, por ejemplo, la
estreptomicina contiene como aminociclitol la llamada estreptidina,
mientras que otros aminoglucsidos presentan la 2-
desoxiestreptamina).
Ejemplos de de uso clnico bacteria productora
Estreptomicina Streptomyces griseus
Kanamicina S. kanamyceticus
Amikacinas (derivados semisintticos de la
kanamicina)
Neomicina S. fradiae
Gentamicina Micromonospora purpurea
Mecanismo de accin: se unen a los polirribosomas que estn
traduciendo el ARNm, provocando errores en la lectura del
ARNm, al distorsionar la estructura del ribosoma. Por lo tanto,
la bacteria comienza a sintetizar protenas defectuosas; con un
efecto final que es bactericida.
La estreptomicina ya no se emplea en clnica humana, pero fue
importante histricamente, debido a que constituy el primer agente
eficaz contra la tuberculosis. Actualmente la produccin de
aminoglucsidos solo constituye el 3% del total de antibiticos, y se
emplean como antibiticos de reserva cuando otros fallan.
3.2.3.3 INHIBIDORES DE LA TRANSLOCACIN:
MACRLIDOS
Los macrlidos son antibiticos con grandes anillos lactona
unidos a uno o unos pocos azcares. Suponen un 11% del total de
produccin de antibiticos. El macrlido prototipo es la
eritromicina, pero actualmente se usan mucho en clnica dos
derivados semisintticos de ella: la roxitromicina y la claritromicina.
La produce un actinomiceto llamado Saccharopolyspora erithraea,
y es un agente bacteriosttico que se administra en infecciones de
vas respiratorias ocasionadas por Mycoplasma pneumoniae,
Legionella pneumophila (legionelosis), Corynebacterium dyphteriae
(difteria) y Bordetella pertussis (tosferina).
Mecanismo de accin: se une a la protena L15, que forma parte del
centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma 70S.
Bloquea el paso de translocacin interfiriendo especficamente con
la liberacin del ARNt desacilado, es decir, impide que el ARNt
descargado (una vez que ha cumplido su misin al transferirse el
pptido naciente al aa-ARNt del sitio A) salga del sitio P; por lo
tanto, el pp-ARNt cargado y situado en el sitio A no puede
translocarse al sitio P, y se produce la parada de la sntesis de
proteinas.
3.2.4 INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIN DE LAS
EUBACTERIAS: RIFAMICINAS
Las ARN polimerasas de virus, de bacterias y de mamferos
difieren mucho entre s, por lo que los tipos de antibiticos que las
afecten suelen ser bastante selectivos. Recurdese que las ARN
polimerasas eubacterianas constan de un ncleo {a
2
'} y que
requieren el factor o para la iniciacin de la transcripcin.
Las rifamicinas son antibiticos producidos por Streptomyces
mediterranei, con buena actividad contra bacterias Gram-positivas y
contra Mycobacterium tuberculosis. Se han usado en clnica
molculas naturales (como la rifampicina) as como derivados
semisintticos (como la rifampina). Constan de un anillo cromforo
aromtico atravesado por un largo puente de naturaleza aliftica. Su
mecanismo de accin estriba en la inhibicin del inicio de la
transcripcin, unindose de modo no covalente a la subunidad
de la ARN polimerasa eubacteriana.

Modo de
accin de los
principales
quimioterpic
os de
sntesis y
antibiticos

[ Introduccin e Historia ] [ Rasgos generales procariotas ] [ Tamao
y forma ] [ Estructuras superficiales ] [ Paredes procariotas ] [
Sntesis peptidoglucano ] [ Membrana y transporte ] [ Citoplasma y
su contenido ] [ Apndices filamentosos procariotas ] [
Diferenciaciones celulares ] [ Captacin de energa ] [ Nutricin
microbiana ] [ Ciclo celular y crecimiento ] [ Agentes fsicos ] [
Agentes qumicos ] [ Regulacin gnica ] [ Mutaciones en
procariotas ] [ Recombinacin. Transformacin ] [ Conjugacin ] [
Transduccin ]







Actualizado el mircoles, 15 febrero 2006 20:38 +0100
1 INTRODUCCIN
2 REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN
2.1 REGULACIN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIN
2.1.1 REGULACIN POR SUBUNIDADES o
ALTERNATIVAS
2.1.2 REGULACIN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIN
POR PROTENAS REGULADORAS
2.1.2.1 EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E
INDUCIBLE: REGULACIN DEL OPERN lac DE E. coli
2.1.2.2 EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y
REPRIMIBLE: EL CASO DEL OPERN trp DE E. coli
2.1.2.3 CONTROLES POSITIVOS
2.2 REGULACIN POR ATENUACIN DE LA
TRANSCRIPCIN
3 SISTEMAS DE REGULACIN DE DOS COMPONENTES:
SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTA
4 MECANISMOS REGULADORES GLOBALES
4.1 RESPUESTA SOS ANTE GRANDES DAOS EN EL
ADN
4.2 RESPUESTA AL CHOQUE TRMICO
4.3 QUORUM SENSING"
ENLACES

1 INTRODUCCIN
Con este tema comenzamos el estudio de la gentica bacteriana, que
va a estar centrado alrededor de las variaciones bacterianas.
Entendemos por tales los cambios moleculares y eventualmente
fenotpicos que se producen en las bacterias por causas genticas.
Dentro de ellos podemos distinguir dos categoras principales:

Variaciones bacterianas por adaptacin al medio: son cambios
moleculares y fenotpicos que ocurren sin modificacin del
material hereditario (sin variacin del genotipo), siendo debidos a
diversos mecanismos de regulacin de la expresin de los genes.
(Las trataremos en el presente tema)

Variaciones bacterianas asociadas a cambios genotpicos. Dentro
de esta categora podemos incluir:

Variaciones hereditarias no asociadas con transferencia de
material gentico: principalmente se trata de los diversos tipos de
mutaciones. (Tema 16)

Variaciones hereditarias asociadas con transferencia de material
gentico entre una bacteria donante y otra receptora. Entre ellas
se encuentran:

Variaciones debidas a transformacin (Tema 17)

Variaciones debidas a conjugacin (Tema 18)

Variaciones debidas a transduccin (Tema 19)
Comenzamos, pues, con el estudio de la regulacin gnica en
procariotas. Desde el punto de vista de la expresin gentica, los
operones bacterianos se pueden dividir en dos grandes tipos:

operones de expresin constitutiva (es decir, aquellos que se
transcriben permanentemente, independientemente de las
condiciones ambientales). Por ejemplo, operones para las ADN- y
ARN-polimerasas; operones para las protenas de las cadenas
transportadoras de electrones; operones para las protenas
ribosmicas, etc.

operones cuya expresin est regulada en funcin de las
condiciones ambientales. Dentro de esta categora, se distinguen a
su vez: operones de expresin inducible y operones de expresin
reprimible.
En principio, por su modo la regulacin puede ser de dos tipos :

Induccin: sntesis de ciertos enzimas (o aumento de su sntesis)
debida a la presencia en el medio de sustratos metabolizables
adecuados, o en trminos ms generales, por la existencia de
determinados estmulos ambientales (no necesariamente de tipo
nutricional). Ejemplo tpico: la produccin de |-galactosidasa es
inducible en determinadas bacterias cuando en el medio aparece
un azcar de tipo |-galactsido (como la lactosa)

Represin: desconexin rpida de la ruta biosinttica de un
determinado compuesto, cuando ste aparece aportado en el medio
de la bacteria. Ejemplo tpico: si E. coli crece en ausencia de
triptfano (Trp), la ruta para su biosntesis est funcionando hasta
que ese aa. aparezca en el medio. La represin no siempre tiene
que ver con estmulos nutricionales: se pueden desconectar genes
para evitar que su expresin interfiera con otros procesos que ya
estn en curso en la clula.
En resumen, y en relacin con el modo de expresin gentica
que subyace a sustancias relacionadas con el metabolismo, la norma
general es que:

la induccin permite el ajuste rpido para el uso de sustratos
metabolizables;

la represin permite el ajuste para la sntesis de una sustancia que
interviene como intermediario metablico.
TIPOS DE MECANISMOS DE REGULACIN GENTICA
Casi cada uno de los niveles de los que depende la expresin
de informacin gentica puede estar sometido en principio a algn
tipo de regulacin, aunque el ms frecuente es sobre la transcripcin.
1) Nivel transcripcional y sobre el ARNm
a) A nivel del inicio de la transcripcin
i) sustitucin del factor o de la ARN-polimerasa
ii) por interaccin de protenas regulatorias sobre secuencias
de ADN cercanas al promotor:
(1) fenmenos de induccin gnica
(2) fenmenos de represin gnica
A su vez, estos fenmenos pueden realizarse por:

mecanismos de control positivo

mecanismos de control negativo
b) Terminacin prematura de la transcripcin: fenmenos de
atenuacin de la transcripcin.
c) Procesamiento de ARN (casos muy raros en procariotas)
2) Nivel traduccional. Ejemplos:
a) regulacin de la sntesis de las protenas ribosmicas.
b) regulacin por ARN antisentido, que interfiere con la
traduccin del ARNm
3) Nivel postraduccional. Aqu ya no estamos ante mecanismos
puramente de regulacin gentica. Algunos ejemplos:
degradacin de protenas y modificacin covalente de protenas
(p. ej., fosforilacin). Regulacin alostrica por retroalimentacin
(feed-back) de la actividad de las protenas enzimticas.
4) Sistemas globales de regulacin
Cuando varios operones estn regulados coordinadamente por
un mismo tipo de estmulos, constituyen una red de regulacin que
se suele denominar con el nombre de reguln (p. ej., el reguln de
los operones spo de la esporulacin en las especies del gnero
Bacillus).
Casi todos los productos de genes bacterianos estn regulados
en al menos uno de estos niveles, y a menudo lo estn en varios
niveles al mismo tiempo.
Como veremos enseguida, muchos de estos mecanismos se
disparan en el interior celular debido a pequeas molculas que
informan a la bacteria de un determinado cambio ambiental.
2 REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN
2.1 REGULACIN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIN
2.1.1 REGULACIN POR SUBUNIDADES o
ALTERNATIVAS
Se trata de una estrategia muy directa y sencilla, en la que la
subunidad o estndar de la clula vegetativa normal se ve
desplazada y sustituida por otro(s) tipo(s) de o diferentes
(codificadas por genes distintos). La holoenzima de la ARN
polimerasa con la nueva o reconoce ahora e inicia la transcripcin a
partir de un tipo distinto de promotor. Esto hace que se transcriban
operones que hasta entonces permanecan silenciosos (sin
expresin).
Veamos algunos ejemplos:

Uno de los casos mejor estudiados se da en las especies del gn.
Bacillus, durante el proceso de la esporulacin: Durante el
crecimiento vegetativo, B. subtilis posee una holoenzima tpica
o
2
||'+ o
43
(= o
A
), que reconoce los promotores estndar de los
operones vegetativos. Al iniciarse la esporulacin, se sintetiza en
la preespora una nueva o, llamada o
F
, que desplaza parcialmente a
la o
A
(vegetativa). Ahora, la holoenzima reconoce los promotores
de algunos operones spo (que estaban inactivos durante el
crecimiento vegetativo), que codifican funciones requeridas
durante las primeras fases de la esporulacin. Uno de los genes
que ahora se expresa corresponden a otra subunidades o (o
G
)
distinta de las dos citadas, y que permite a la polimerasa transcribir
en la preespora una nueva oleada de operones spo, ms tardos. En
una fase ms avanzada de la esporulacin, se expresan en la clula
madre otros genes spo debido a la activacin de una nueva o (o
K
).
Cada nueva holoenzima reconoce un tipo distinto y caracterstico
de promotor (con secuencias de nucletidos peculiares), que no
puede ser reconocido por las otras versiones de la ARN polimerasa
dotadas de subunidades o diferentes.

En Escherichia coli existe una subunidad o estndar, que es la
o
70
, implicada en el inicio de la transcripcin de la mayora de los
genes relacionados con el crecimiento en condiciones normales.
Sin embargo, para ciertas condiciones y procesos especiales, la
expresin de ciertos genes requiere el uso de subunidades o
especiales:

La respuesta al choque por calor (heat-shock): si E. coli se
somete a una agresin de altas temperaturas, se produce la
induccin de ms de 30 genes (genes de la respuesta al calor, o
de respuesta al estrs), cuyos productos tienden a evitar ciertos
daos ocasionados por este agente. Esta respuesta est mediada
por una nueva subunidad o (llamada o
H
o o
32
) que desplaza a la
o
70
de la clula normal. La nueva holoenzima reconoce los genes
de la respuesta al calor, todos los cuales poseen un promotor con
una regin -10 totalmente diferente a la estndar.

Cuando las enterobacterias sufren hambre de N (por ejemplo, no
existe amonio), una nueva subunidad o (llamada o
54
o o
N
)
desplaza a la o
70
, y entonces la holoenzima reconoce promotores
distintos, correspondientes a operones cuyos productos permiten
utilizar otras fuentes de N ms raras.

El factor o
38
se usa cuando la bacteria est en la fase estacionaria,
as como cuando tiene que hacer frente a estrs oxidativo u
osmtico.

Muchos genes implicados en la sntesis del flagelo bacteriano y
de la quimiotaxis (ver tema 8) se transcriben con un ARN-
polimerasa que emplea una subunidad o especial (o
F
o o
28
).
2.1.2 REGULACIN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIN POR
PROTENAS REGULADORAS
Como ya apuntamos, podemos encontrar dos tipos de fenmenos:

induccin: el desencadenante del ajuste se denomina inductor;

represin: el desencadenante del ajuste se denomina correpresor.
En general, los desencadenantes de la respuesta se llaman
efectores, y suelen ser molculas de pequeo tamao. Si estamos
tratando con respuestas adaptativas metablicas, podemos hacer la
siguiente generalizacin:

El inductor suele ser el sustrato de una ruta catablica, o una
molcula muy semejante al sustrato natural.

El correpresor suele ser el producto de una ruta biosinttica, o
una molcula parecida.
El funcionamiento de estas molculas en su papel de efectores
no depende de su interaccin metablica en la ruta correspondiente.
Lo que hacen los efectores es interactuar con protenas reguladoras
especficas para cada sistema (de cada opern o de cada grupo de
operones). Y, a su vez, las protenas reguladoras interactan con una
zona del opern cercana al promotor. Es frecuente que muchas
protenas reguladoras bacterianas compartan un dominio
tridimensional caracterstico denominado hlice-giro-hlice, que las
capacita para reconocer determinadas secuencias del ADN al
comienzo del opern, cerca del promotor (o incluso superspuesto al
promotor).
Tanto la induccin como la represin gnicas de funciones pueden
deberse a su vez a:

controles positivos;

controles negativos.
As pues, en la regulacin del sistema tenemos varios tipos de
elementos:
a) efectores: pequeas molculas que informan del ambiente
exterior;
b) un elemento regulatorio que acta en trans (a distancia): un
gen regulador que codifica una protena cuya nica funcin
consiste en controlar la expresin (a nivel de inicio de
transcripcin) de un opern de genes estructurales.
c) genes estructurales (normalmente agrupados en operones,
donde los genes se co-transcriben en forma de ARNm
policistrnico). Estos genes pueden codificar protenas
estructurales, o protenas enzimticas o simplemente
transcribirse a ARNr o ARNt.
La funcin controladora de la protena reguladora se ejerce por
su interaccin con secuencias especficas al comienzo del opern,
cerca del promotor. Estas secuencias son, pues, elementos que
actan en cis dentro del circuito regulatorio: esto significa que su
efecto depende de que estn ligadas genticamente con los genes
estructurales que van a ser sometidos a control gentico. Son
secuencias que no codifican productos difusibles que pudieran
actuar a distancia.
Cmo se puede distinguir y discriminar entre las funciones de un
regulador que acta en trans (a distancia) de una secuencia en
cis? Esto se puede lograr a partir de la observacin de los efectos
fenotpicos de sus respectivas mutaciones y de los tests de
complementacin (aunque las bacterias son haploides, se pueden
realizar ensayos de complementacin gnica en diploides
parciales por medio de algn sistema de transferencia gentica,
como por ejemplo el uso de conjugacin con factores F-primas
(F'): vase tema 18):
1) La mutacin inactivante de un gen regulador tiene efectos
recesivos en trans y pleiotrpicos, que varan segn que el
control sea de tipo positivo o negativo:
a) en el caso de control negativo, la mutacin tiene efectos
constitutivos;
b) en el caso de control positivo, la mutacin tiene efectos
ininducibles.
2) La mutacin de un operador tiene efectos dominantes en cis.
3) Por otro lado, la inactivacin mutacional de un gen estructural
simplemente priva a la clula de la funcin correspondiente.
Comparemos ahora las regulaciones genticas de tipo positivo y
negativo:
1) Control negativo: el sistema se expresa a menos que sea
desconectado por la accin de una protena reguladora, a la que se
denomina represor. Dentro de este control podemos distinguir, a
su vez:
a) Control negativo con efectos inductores (ej: en el opern
lac): el represor, per se es activo, pero se inactiva en presencia
del inductor.
b) Control negativo con efectos represores (ej: en el opern
trp): el represor, per se es inactivo (aporrepresor), pero en
presencia del correpresor se activa (adquiere su capacidad
funcional), y es entonces cuando reprime al opern estructural.
2) Control positivo: los genes estructurales no se transcriben (o en
todo caso lo hacen a un nivel basal bajo) a no ser que exista una
protena reguladora activa llamada apoinductor o activador.
Tambin aqu puede haber dos categoras:
a) Control positivo por induccin: la protena activadora, por s
misma es inactiva, pero queda activada cuando se le une el
inductor.
b) Control positivo por represin: la protena activadora, per se,
es activa, pero se inactiva cuando se le une el correpresor.

Control negativo con induccin Control negativo con represin
Obsrvese, pues, que el estado activo del opern vara segn que se
trate de un sistema inducible o reprimible:

en los sistemas inducibles, el estado activo es el inducido;

en los sistemas reprimibles, el estado activo es el desreprimido.
2.1.2.1 EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E INDUCIBLE:
REGULACIN DEL OPERN lac DE E. coli
Iniciamos ahora el estudio de los controles genticos en un
sistema paradigmtico: el opern lac (metabolismo de la lactosa) del
colibacilo (Escherichia coli), que histricamente fue el primero en
investigarse (por Jacob y Monod, aos 50, y que les hizo ganar el
premio Nobel en 1965). En este epgrafe abordaremos el
comportamiento de este opern bajo regulacin negativa
(incorporando detalles ulteriores al trabajo de Jacob y Monod). Ms
adelante (2.1.2.3), veremos que el opern lac tambin posee un
control positivo.
El opern lac, est constituido por:

tres genes estructurales:

Gen lacZ: codifica la -galactosidasa (tetrmero de un
polipptido de 116 kDa), la enzima que hidroliza la lactosa en
galactosa y glucosa;

Gen lacY: determina la -galactsido permeasa (46 kDa);
protena de membrana que realiza el simporte de H
+
y lactosa.

Gen lacA: determina -galactsido acetilasa, prescindible y de
papel desconocido.

un promotor para la unin de la holoenzima de la ARN polimerasa

un elemento regulador en cis: el operador, parcialmente
superpuesto con el promotor
Este opern est controlado por el producto de un gen situado cerca
del opern (pero que no forma parte de l; este es el elemento
regulatorio en trans): el gen lacI, que codifica un represor que por s
mismo es activo como tal. El polipptido de 38 kDa producido por
este gen se agrega espontneamente formando tetrmeros, que son la
forma funcional del represor.

Veamos el funcionamiento del sistema:

Mientras en el medio no exista lactosa, el tetrmero del represor
presenta una alta afinidad de unin hacia las secuencias del
operador, y as impide que la ARN polimerasa reconozca y se una
al promotor; por lo tanto, no existe apenas transcripcin del opern
de la lactosa. La actividad de unin al operador reside en el
extremo N-terminal, que presenta un diseo caracterstico en
hlice-bucle-hlice. El operador al que se une presenta una
secuencia palindrmica imperfecta.

Si en el medio existe lactosa (u otro azcar de tipo -galactsido)
como nica fuente de C, dicho azcar acta como inductor del
opern: se une a una zona de las subunidades del tetrmero del
represor (codificado por lacI), con lo que se produce un cambio
conformacional alostrico del represor; con ello disminuye la
afinidad del tetrmero hacia la secuencia del operador, por lo que
ahora la ARN polimerasa puede iniciar la transcripcin. El
represor inactivo emigra a zonas inespecficas y aleatorias del
ADN, distintas del operador.
Algunas ideas adicionales

En realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa,
sino el ismero alolactosa, que se origina nada ms entrar
aquella a la clula.

En el laboratorio se suelen emplear los llamados inductores
gratuitos: se trata de molculas artificiales (aunque |-
galactsidos) que si bien pueden interaccionar con el represor,
no pueden ser metabolizadas (a diferencia de la lactosa). Un
ejemplo es el llamado IPTG (isopropil-|-D-tiogalactsido).

Se ha visto que el opern lac tiene de hecho tres secuencias de
tipo operador. La denominada O
1
es la clsica, parcialmente
superpuesta con el promotor, pero tambin hay que contar con
la O
2
, centrada hacia la coordenada +440 del ARNm, y la O
3
,
bastante aguas arriba respecto del promotor (centrada hacia -
82). Se ha propuesto que los tetrmeros del represor reconocen
simultneamente dos de estas secuencias, obligando al ADN a
curvarse de modo pronunciado, evitando as que pueda actuar la
ARN-polimerasa.

En Ingeniera gentica se suele usar a menudo algn
componente del opern lac. Por ejemplo, se puede recurrir al
promotor lac (bien sea en su versin silvestre o en algn
mutante) para lograr la expresin de ciertos genes. Uno de los
usos ms extendidos es el del gen lacZ, determinante de la |-
galactosidasa. Cuando las clulas de Escherichia coli silvestres
respecto de lacZ crecen en presencia del X-gal (un galactsido
artificial), las colonias tiene un aspecto azul, debido a que la |-
galactosidasa transforma dicho X-gal en una sustancia de color
azul. Pero si el gen lacZ est inactivado (p. ej., porque tenga
una deleccin o una insercin), las colonias son de color blanco.
Este tipo de dispositivo regulador es propio de rutas
catablicas, donde el principio de economa debe garantizar que las
enzimas de la ruta slo se induzcan en presencia del sustrato
adecuado.
2.1.2.2 EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y
REPRIMIBLE: EL CASO DEL OPERN trp DE E. coli
La regulacin negativa y reprimible es muy apropiada y
econmica para desconectar la transcripcin de los genes de rutas
biosintticas de intermediarios metablicos (como aminocidos,
bases nitrogenadas y vitaminas) cuando los productos finales de
estas rutas estn disponibles a la bacteria a partir del medio de
crecimiento. En estos sistemas, a diferencia de la regulacin de
operones catablicos, la protena reguladora es inactiva en s misma,
por lo que recibe el nombre de aporrepresor. El efector que
desencadena la represin se denomina correpresor, y suele ser la
sustancia del medio equivalente al producto final de la ruta
biosinttica. La unin del correpresor con el aporrepresor genera un
complejo denominado represor activo.
El opern trp de Escherichia coli est compuesto por:

Cinco genes estructurales en la secuencia trpEDCBA. Codifican
cinco polipptidos que a su vez constituyen tres enzimas
implicadas en el paso de corsmico a triptfano.

Promotor

Operador (superpuesto al promotor).
A la zona del operador se pueden unir dmeros del elemento
regulatorio en trans: un represor codificado por el gen trpR (que est
lejos del opern estructural). Entre el promotor y el inicio del primer
gen estructural existe una zona regulatoria compleja (lder ms
atenuador) que interviene en un tipo de regulacin distinta que
estudiaremos ms adelante (atenuacin). (Como ya dijimos, son muy
frecuentes los sistemas genticos sometidos a varios niveles de
regulacin).
As pues, en esta apartado consideraremos slo el funcionamiento
del sistema trp en cuanto al mecanismo de represin-desrepresin:

En un medio pobre en aminocido triptfano: el gen trpR se
expresa: se sintetiza el aporrepresor inactivo, por lo que la ARN
polimerasa puede transcribir el opern de genes estructurales
(trpEDCBA). Hay sntesis de las enzimas del opern a sus niveles
desreprimidos.

En un medio rico en triptfano: el gen trpR se expresa
igualmente, es decir, se sintetiza aporrepresor inactivo, pero al
unirse a dos molculas de triptfano que la bacteria ha captado del
medio se produce un cambio de conformacin que genera el
represor activo (aporrepresor + correpresor): ahora reconoce y se
une a la secuencia del operador (que est solapado con el
promotor). As se impide la transcripcin del opern, aunque no
totalmente. Esto da lugar al nivel de expresin basal o reprimido
(que en el caso de este opern representa 1/60 del nivel
desreprimido).
Adems, en medio rico en triptfano, el gen regulador trpR se
ve reprimido por su propio producto (aporrepresor + triptfano).
Estamos ante un ejemplo de regulacin autgena: el nivel de
represor est autocontrolado:

Si existe demasiado represor, se impide la sntesis de ms represor;

Si existe poco represor se posibilita la transcripcin del gen trpR.
2.1.2.3 CONTROLES POSITIVOS
Algunos operones bacterianos poseen promotores tales que no
pueden ser usados eficientemente por la ARN polimerasa de forma
directa para el inicio de la transcripcin, sino que adems, requieren
protenas auxiliares activadoras. Es decir, la transcripcin de estos
operones no ocurre (o en todo caso ocurre a un nivel basal bajo), a
no ser que la protena activadora se una a zonas del ADN cercanas al
promotor (normalmente al lado 5' respecto del promotor). Este tipo
de promotores carecen de las secuencias tpicas -35 y -10 a las que
ya hemos aludido anteriormente.
Como ejemplo de regulacin positiva del inicio de
transcripcin estudiaremos la que existe en el opern lac de E. coli:
Para comenzar, veamos el
comportamiento de una
poblacin de esta bacteria
cuando en su medio de cultivo
existen dos fuentes de
carbono: glucosa y lactosa: se
da un crecimiento en dos
fases llamado crecimiento
diuxico: durante una primera
fase, las bacterias aprovechan
solamente la fuente ms rica
de carbono (la glucosa),
creciendo de modo
exponencial durante unas
cuantas generaciones, hasta
que agotan esta glucosa. A
continuacin se entra en una
corta fase de tipo estacionario,
que conduce a una nueva fase
de crecimiento exponencial
(aunque con un coeficiente
menor que el de la fase

exponencial anterior) debido a
que en sta las bacterias han
pasado a metabolizar la
lactosa. Mientras exista
glucosa en el medio de cultivo,
no se degrada la lactosa,
debido al fenmeno conocido
como represin catablica o
efecto glucosa: el
catabolismo de la glucosa
impide de alguna manera
que se expresen los genes del
opern de la lactosa. Pero una
vez que la glucosa se agota,
el opern lac se activa y se
expresa: se sintetizan las
enzimas que permiten
metabolizar la lactosa. La
corta fase estacionaria
representa entre las dos
exponenciales representa el
tiempo que tardan las
bacterias en conectar y
expresar los genes del
catabolismo de la lactosa una
vez agotada la glucosa.
El nombre de represin catablica se puso en un momento
en el que se desconoca la base molecular de su funcionamiento. A
pesar de que sigamos usando este nombre por motivos histricos,
hoy sabemos que este fenmeno es la manifestacin de un proceso
de regulacin gentica positiva. A continuacin pasamos a
describirlo a nivel molecular:
En breves palabras, lo que ocurre es que en presencia de una
fuente preferencial de carbono (como es la glucosa) el mecanismo
de regulacin positiva del opern lac se inactiva. Por contra, en
ausencia de glucosa y en presencia de la lactosa, este mecanismo
positivo es funcional, lo que permite la estimulacin del inicio de la
transcripcin del opern.
Elementos del circuito regulatorio:

gen crp: codifica la protena regulatoria, un polipptido que forma
espontneamente dmeros, constituyendo la denominada protena
relacionada con la represin catablica (CRP), tambin conocida
como protena que une AMPc (CAP). Tal como es sintetizada por
el gen crp, la protena CAP es inactiva (apoinductor inactivo).
Pero cuando la bacteria posee niveles adecuados de AMPc (que
acta como inductor endgeno), ste se une a la CAP, lo que
conduce a que el dmero cambie de conformacin: en esta nueva
configuracin el complejo CAP-AMPc reconoce una secuencia
palindrmica cercana al promotor del opern lac (hacia su lado 5'),
y acta como activador del inicio de transcripcin de este opern.

gen cya: codifica la adenilato-ciclasa, enzima que convierte el
ATP en AMPc.

opern lac: a la descripcin que ya dimos, solamente aadir que a
la izquierda (o sea, al lado 5' o aguas arriba) del promotor existe
una secuencia palindrmica caracterstica, que como acabamos
de ver es el lugar de reconocimiento del complejo activador CAP-
AMPc.
Veamos, pues, el funcionamiento del circuito regulatorio:

Ante todo, hay que tener presente que el nivel intracelular de
AMPc est en relacin inversa con la velocidad de crecimiento de
la bacteria. A su vez, la velocidad de crecimiento est en relacin
directa con la riqueza de la fuente de C.

En presencia de glucosa (fuente rica de C): como se recordar
(tema 6), en Enterobacterias la glucosa es transportada por el
sistema de fosfotransferasa (sistema PTS
GLC
, un ejemplo tpico de
transporte activo acoplado a translocacin de grupos). Como es
sabido, en este sistema hay dos enzimas especficas del azcar a
nivel de membrana, que reciben secuencialmente el fosfato (P),
que a su vez ser transferido a la glucosa, que de esta forma entra
al citoplasma. Mientras exista glucosa, el sistema PTS
GLC
estar
funcionando, de modo que apenas habr nivel de E-IIA
GLC

fosforilada, porque rpidamente el fosfato es transferido a la
glucosa en su trnsito por la membrana (bajo E-II
GLC
~P). Ello
supone una seal que inhibe a la enzima adenilato-ciclasa. En
resumen, en presencia de glucosa los niveles de AMPc son bajos.
Por lo tanto, el apoinductor CAP, aunque se est sintetizando,
permanece inactivo, ya que al no haber apenas AMPc no puede
cambiar de conformacin. Esta es la base molecular del fenmeno
de represin catablica: observa que en realidad no es una
autntica represin, sino que se trata de la no activacin de la
protena activadora, debida en ltima instancia al catabolismo de
la glucosa.

En ausencia de glucosa: el sistema PTS
GLC
no est transportando
glucosa, por lo que ahora s hay altos niveles de E-IIA
GLC
~P (y
bajos de la versin no fosforilada). El sistema ahora no enva la
seal inhibidora de la actividad adenil-ciclasa : se sintetizan
niveles elevados de AMPc. ste se une a los dmeros de CAP
(=CRP); el concomitante cambio de conformacin permite al
complejo CAP-AMPc reconocer su secuencia-diana palindrmica
cerca del promotor de lac. En esta interaccin con su secuencia-
diana, la CAP obliga al ADN a curvarse unos 90
o
. Ahora la CAP
interacciona con las subunidades o de la ARN polimerasa, de
modo que ahora s puede efectuar el inicio de la transcripcin con
gran eficiencia.

As pues, hemos completado el estudio de la regulacin del opern
lac. En resumidas cuentas, cabe resaltar que se trata de un opern
sometido a dos tipos de controles del inicio de la transcripcin:

regulacin negativa, (represin en ausencia de lactosa, pero
induccin en presencia de lactosa)

regulacin positiva, por activacin (en ausencia de glucosa y con
lactosa presente)
Por lo tanto, el opern lac, para que pueda transcribirse a pleno
rendimiento requiere que se cumplan dos condiciones
simultneamente:
1. No debe haber en el medio una fuente ms rica de azcar (como
la glucosa), lo que libera la represin catablica por el
mecanismo de regulacin positiva a travs de CAP
2. Debe existir el inductor exgeno (la lactosa), que inactiva el
mecanismo de regulacin negativa.
En Enterobacterias, lo que acabamos de describir para el
opern lac lo podemos hacer extensivo a otros muchos operones
(que comprenden ms de 300 genes) correspondientes al
catabolismo de otras fuentes de C ms pobres que la glucosa. Es
decir, mientras exista glucosa en el ambiente de la bacteria, sta ser
usada en primer lugar, de modo que mientras se metaboliza est
operando el fenmeno de represin catablica. Pero una vez
agotada, y suponiendo que exista una fuente alternativa de C, sta
pasar a ser usada, merced a la activacin gentica mediada por el
complejo CAP-AMPc.
Ejemplos de otros operones controlados positivamente por CAP-
AMPc:

opern ara (del catabolismo de la arabinosa);

opern gal (del catabolismo de la galactosa);

opern mal (del catabolismos de la maltosa).
Este conjunto de operones diferentes que estn regulados por la
protena CAP se denomina reguln CAP.
En otras bacterias el fenmeno de represin catablica no
depende de AMPc-CAP, sino que la regulacin positiva de operones
catablicos de azcares distintos de la glucosa est mediada por
protenas activadoras diferentes.
No podemos olvidar aqu un tipo de operones transcribibles
por holoenzimas de la ARN-polimerasa con subunidades o
alternativas a la estndar o
70
que requieren para su
transcripcin eficiente la colaboracin de protenas activadoras
especiales que reconocen secuencias de ADN situadas a
bastante distancia aguas arriba respecto del respectivo
promotor. Por ejemplo, en muchas bacterias Gram-negativas
hay operones con un tipo de promotor especial (cuyas
secuencias conservadas, centradas en -24 y -12 son diferentes a
las citadas hasta ahora) reconocido slo por la versin de la
ARN-polimerasa provista de la subunidad o
54
. Pues bien, para
la transcripcin de este tipo de operones (llamados ntr) se
requiere la concurrencia de la protena reguladora NtrC
fosforilada, que reconoce una secuencia palindrmica a unas
100 pb aguas arriba del promotor. Al parecer, la unin de
oligmeros de NtrC~P a sus secuencias de reconocimiento
hace que el ADN se curve, de modo que esas NtrC~P hacen
contacto con la ARN-polimerasa, y tras gastar ATP ayudan en
el inicio de la transcripcin.
2.2 REGULACIN POR ATENUACIN DE LA
TRANSCRIPCIN
La atenuacin es un mecanismo de control que se da en ciertos
operones de rutas biosintticas (sobre todo de aminocidos), por el
cual una onda de transcripcin recin iniciada puede terminar
prematuramente en una zona denominada atenuador, antes de
alcanzar al primer gen estructural de ese opern. A nivel de ADN, el
atenuador est situado entre el promotor y el inicio del primer gen
estructural, dentro de la porcin que a nivel de ARN representa al
lder. A diferencia de los mecanismos de regulacin que hemos
visto en la seccin anterior, la atenuacin no depende de protenas
reguladoras.
La atenuacin se produce por un control ejercido por la
traduccin, que a su vez responde al nivel intracelular del ARNt
cargado con el aminocido de la ruta biosinttica en cuestin:

si existe suficiente nivel de ese aa-ARNt, habr atenuacin de la
transcripcin;

si no existe suficiente de ese aa-ARNt, no habr atenuacin, y por
lo tanto la transcripcin continuar hasta el final.
La presencia o ausencia del aa-ARNt concreto determina si el
ribosoma puede traducir, o no, una zona temprana del ARNm
(dentro de la porcin del lder): si el ribosoma puede traducir esa
zona (porque existe nivel de ese aa-ARNt), el avance del ribosoma
detrs de la ARN polimerasa impide ciertos emparejamientos
intracatenarios dentro del ARNm naciente, pero permite otros
emparejamientos alternativos de modo que se forma una estructura
secundaria de tipo terminador simple (independiente de ). Por lo
tanto la ARN- polimerasa se atranca en esta horquilla y finalmente
se separa, detenindose as la transcripcin antes de que la onda de
transcripcin haya alcanzado al primer gen estructural.
Mecanismo molecular de la atenuacin: lo estudiaremos con el
caso del opern de la biosntesis del triptfano (trp), el primero en
investigarse (por Yanofsky).
Descripcin del opern trp (consultar figura): observa la zona del
promotor-operador (sobre la que ya vimos en un apartado anterior
que se ejerce un mecanismo de control negativo por represin);
observa la secuencia lder, al comienzo del ARNm, antes de la
porcin codificadora del primer gen (trpE). Este lder consta de 162
bases, y en su interior alberga una corta regin con capacidad
potencial de ser traducida por ribosomas (es decir, un marco abierto
de lectura u ORF segn sus iniciales inglesas): ntese que el pptido
que se sintetizara a partir de esta porcin es rico en trp, es decir,
tiene una alta proporcin del mismo aminocido objeto de la
sntesis dependiente del opern trp.
Como ya dijimos antes, la clave de la regulacin estriba
precisamente en el lder (incluyendo la porcin del pptido rico en
triptfano). La porcin de ARNm correspondiente al lder forma
parte de una zona que puede adoptar estructuras secundarias
distintas y alternativas, debido a la posibilidad de establecer
emparejamientos intracatenarios:

bien se emparejan la zona 1:2 y la 3:4;

o bien se empareja la 2:3, quedando la 1 y la 4 sin emparejar.
Pues bien, la estructura en horquilla formada por el
emparejamiento de 3:4 constituye un tpico terminador de la
transcripcin independiente de .
Pasemos, pues, al funcionamiento del mecanismo de atenuacin:
Si existe suficiente
triptfano en el
medio: la bacteria
capta triptfano, y
sintetiza el triptofanil-
ARNt (ARNt
trp
); habr
reserva suficiente de
este ARNt
trp
como para
poder ser usado
normalmente en la
sntesis de protenas.
La ARN polimerasa va
transcribiendo el
opern trp, y detrs de
ella los ribosomas
comienzan a cubrir la
zona del pptido
dentro de lder del
ARNm. Tras traducir la
porcin 1 del lder, el
ribosoma cubre
enseguida y traduce la
porcin 2. Mientras
tanto, la ARN-
polimerasa acaba de
transcribir las
porciones 3 y 4. La
porcin 3 se empareja
espontneamente con
la 4. (Observa que a la
porcin 3 no le queda
ms remedio, ya que
la porcin 2, con la
que tericamente
tambin puede

emparejarse no est
disponible, ya que est
oculta -cubierta- por
el ribosoma).
Consecuencia: al
formarse la horquilla
3:4, seguida por la
ristra de uracilos (U),
se constituye un tpico
terminador de
transcripcin
independiente de : se
termina
prematuramente la
transcripcin (antes de
que la onda de
transcripcin haya
alcanzado al primer
gen estructural, trpE):
este es precisamente
el fenmeno de
atenuacin.
Si el triptfano es
limitante en el medio:
la bacteria dispondr
de pocos ARNt
cargados on el
aminocido triptfano
(o sea, el pool
intracelular de ARNt
trp

estar a bajos niveles).
El ribosoma, al llegar a
los codones de
triptfano dentro de la
porcin codificadora
del lder, se quedar
atrancado, debido a
que no encuentra el
ARNt
trp
que introduzca
el triptfano frente a
dos codones seguidos
para ese aminocido.
El ribosoma se queda,
pues, detenido en la
porcin 1. Mientras
tanto, la ARN
polimerasa le va
sacando ventaja al
ribosoma, de modo
que transcribe la
porcin 2, luego la
porcin 3... pero antes
de terminar con la
porcin 4, la 2 y la 3 se
emparejan entre s (de
modo que es ahora la
4 la que se queda sin

emparejarse). Esto
implica que ya no se
puede formar la
estructura secundaria
3:4 seguida de varios
U: por lo tanto, no hay
terminacin de la
transcripcin, sino que
sta contina y abarca
a todo el opern trp, y
finalmente se
sintetizan las enzimas
biosintticas que
conducirn a la
sntesis del
aminocido triptfano.
Otros casos de atenuacin:
La atenuacin es un sistema de control gentico de una amplia
variedad de operones biosintticos, especialmente de
aminocidos. Otros ejemplos descubiertos despus del sistema
trp:

opern his: sntesis de histidina

opern phe: sntesis de fenilalanina;

opern leu: sntesis de leucina;

opern thr: sntesis de treonina;

opern ilv: sntesis de isoleucina y de valina.
Algunos de estos operones (como el his) slo poseen
atenuacin como mecanismo de control, mientras que otros
gozan, adems de regulacin por represin.
Los ARNm de cada uno de estos operones posee en su inicio
una porcin lder ms o menos larga, pero con las caractersticas
que ya hemos visto:

contiene un marco de lectura
abierta (ORF=open reading
frame) con capacidad
potencial de codificar un
pptido rico en el
aminocido que la ruta
correspondiente debe
sintetizar. Por ejemplo: La
ORF del lder del opern his
codifica un pptido de 17
aa., de los cuales 7 son
histidina. La ORF del lder
del opern leu codifica un
pptido de 28 aa., de los
cuales 4 son leucinas.


el lder del ARNm puede formar estructuras secundarias
alternativas, incluyendo un atenuador (es decir, una estructura
en horquilla seguida de ristra de uracilos, que acta como un
poderoso terminador prematuro de la transcripcin).
En resumen: La atenuacin es un mecanismo que permite detectar
los bajos niveles intracelulares del aminocido en cuestin (bajo la
forma de aminoacil-ARNt), los cuales dependen a su vez de bajos
niveles del aminocido en el medio, de modo que la bacteria
responde a las necesidades inmediatas de ese aminocido (que se
requiere para la sntesis proteica). El mecanismo estriba en la
capacidad o incapacidad del ribosoma para atravesar la regin lder,
lo que a su vez determina la formacin de estructuras secundarias
alternativas en el lder. Como se puede constatar, la atenuacin es un
mecanismo que depende totalmente del estrecho acoplamiento que
existe en bacterias entre transcripcin y traduccin.
3 SISTEMAS DE REGULACIN DE DOS COMPONENTES:
SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTA
Los sistemas de regulacin que hemos estudiado hasta ahora se
ponen en marcha cuando un estmulo ambiental qumico,
normalmente una pequea molcula relacionada con el metabolismo
(el efector), entra en la clula e interacciona con una protena
reguladora, que a su vez se une (o deja de unirse) con una secuencia
de ADN al comienzo del opern. Pero hace relativamente pocos
aos se descubri que las bacterias poseen tambin numerosos
sistemas en los que la seal ambiental no entra a la clula, sino que
es detectada por un sensor a nivel de membrana, el cual reemite
(transduce) el estmulo hacia una protena citoplsmica, la cual a su
vez interacciona con secuencias determinadas al comienzo del
opern, para regularlo, generando as la respuesta adaptativa
correspondiente a la seal ambiental. Como en la mayor parte de los
casos el sistema funciona con dos protenas (la sensora y la
reguladora), a este tipo de sistemas se los conoce con el nombre de
sistemas de regulacin de dos componentes.
Los distintos sensores, a pesar de que cada uno detecta un
estmulo diferente, se parecen entre s en al menos parte de su
secuencia, y lo mismo ocurre con los reguladores de respuesta, por
lo que se habla de dos familias de protenas (cada una con un
probable origen evolutivo comn):
1. Familia de histidn-proten-quinasas (HPK): Este tipo de
protenas son las sensoras de algn tipo de estmulo ambiental.
Muchas de ellas son autofosforilables, pero su funcin esencial es
la de fosforilar al correspondiente segundo miembro de la pareja
(el regulador). Los distintos sensores suelen tener en comn su
porcin carboxiterminal, denominada dominio transmisor (que
incluye la histidina fosforilable). Los sensores suelen ser
protenas integrales de membrana citoplsmica. Cada sensor tiene
un dominio aminoterminal caracterstico, inmerso en el espacio
periplsmico, y de este modo detectan algn estmulo
procedente del ambiente. Al hacerlo, parece que cambian de
conformacin, de modo que el dominio transmisor
intracitoplsmico se autofosforila y luego fosforila al
correspondiente regulador de respuesta.
2. Familia de reguladores de respuesta (RR): cada regulador de
respuesta, tras ser fosforilado en cierto asprtico por su
correspondiente HPK, ejerce algn efecto regulatorio.
Normalmente, los RR fosforilados actan como activadores de la
transcripcin de ciertos operones. Los distintos reguladores
comparten un mismo tipo de dominio aminoterminal,
denominado dominio receptor, que incluye el asprtico que
recibe el fosfato del sensor correspondiente. Los reguladores que
actan como activadores de transcripcin suelen incluir un
dominio carboxiterminal a base del tpico motivo hlice-giro-
hlice, capaz de interactuar con ciertas secuencias de ADN.

Los sistemas de dos componentes son muy abundantes en bacterias.
Por ejemplo, en E. coli se han descubierto unos 50, entre los cuales
podemos citar:

Sistema Ntr de utilizacin de fuentes de nitrgeno, que responde
ante los niveles de amonio, y que permite el uso de fuentes
alternativas de nitrgeno.

Sistema de respuesta ante osmolaridad: el aumento de presin
osmtica es detectado por la HPK sensora llamada EnvZ, que
fosforila al regulador OmpR. A su vez, este regulador controla las
proporciones relativas de dos porinas, OmpC y OmpF, haciendo
que predomine la porina de poro ms pequeo (OmpC).
4 MECANISMOS REGULADORES GLOBALES
Para finalizar este recorrido por los principales tipos de
mecanismos de regulacin de la expresin gnica en bacterias,
vamos a referirnos brevemente a algunos ejemplos de grandes
sistemas de operones que se ven sometidos a una regulacin
coordinadada comn, encaminada a la superviviencia de la bacteria
en determinadas circunstancias ambientales extremas o a realizar
grandes ajustes metablicos para adaptarse a cambios bruscos en las
condiciones nutricionales.
4.1 RESPUESTA SOS ANTE GRANDES DAOS EN EL
ADN
Repasemos algo que ya vimos en el captulo 13 (Influencia de
los agentes fsicos sobre las bacterias): en determinados procariotas
existe un sistema inducible de reparacin a los daos severos al
ADN ocasionados por agentes como la luz UV o las sustancias
alquilantes. Los genes SOS se desreprimen segn el siguiente
esquema:
Cuando el ADN de la bacteria est seriamente daado, existen
zonas de ADN de cadena sencilla sin reparar. Esto constituye una
seal por la que la protena RecA (que est en este momento a una
concentracin basal relativamente baja) se modifica y se convierte
en una proteasa muy especfica (RecA
*
): la RecA
*
rompe a la
protena LexA, que estaba reprimiendo una serie de operones,
incluyendo a recA, uvrABC, umuDC, etc. Por lo tanto, estos genes se
expresan ahora a alto nivel:

la expresin de uvrABC induce una mejora de la reparacin por
escisin resntesis;

la expresin de recA mejora la reparacin por recombinacin;

la expresin de umuDC favorece una sntesis de emergencia de
ADN, por la que se introducen frecuentes errores: hay aumento de
la mutagnesis;

se altera la regulacin del crecimiento y divisin celular: las
clulas se hacen filamentosas, muy largas, con formas anmalas.
Todos estos cambios, a pesar de las alteraciones que provocan
en las clulas, suponen la salvaguardia, en ltima instancia de su
viabilidad. Cuando las circunstancias agresivas (UV) desaparezcan,
el mismo circuito regulador se encarga de que las clulas vuelvan
rpidamente a su metabolismo normal.
4.2 RESPUESTA AL CHOQUE TRMICO
La llamada respuesta al choque trmico es un mecanismo
adaptativo compartido por prcticamente todos los seres vivos,
consistente en el aumento rpido de la sntesis de una serie de
protenas (denonimadas protenas Hsp, iniciales del ingls heat
shock proteins) ante la elevacin brusca de la temperatura por
encima de la ptima, con un ulterior descenso lento a sus niveles
basales. A pesar de que esta respuesta se descubri precisamente
ante aumentos de temperatura, se sabe ahora que en realidad se
induce ante otros tipos de agresiones o estrs ambientales (como por
ejemplo, presencia de etanol u otros solventes orgnicos en el
medio, o dao al ADN). Las protenas Hsp protegen a las clulas del
dao que les causara una posterior elevacin adicional de la
temperatura. Obviamente, este sistema parece que constituye un
mecanismo adaptativo de proteccin que, una vez que detecta
incrementos anmalos de temperatura, prepara a la bacteria para
soportar perodos relativamente largos a temperaturas por encima de
la ptima de crecimiento.
En Escherichia coli la mayor parte de los 36 genes
codificadores de protenas Hsp forman un reguln, y los
correspondientes operones son transcritos por la versin de la ARN-
polimerasa provista de la subunidad o
32
.
La mayor parte de las protenas Hsp se expresan a niveles
basales durante el crecimiento normal, pero tras la agresin
ambiental, aumentan abruptamente y luego vuelven lentamente al
nivel normal (aun cuando p. ej., la temperatura siga alta). Algunas
de las Hsp son protenas celadoras (chaperonas; vase tema 7) que
intervienen en el plegamiento adecuado de otras protenas. Entre
estas celadoras se encuentran GroE, DnaK, DnaJ y GrpE. Otras Hsp
son proteasas (como la Lon) que degradan protenas demasiado
anmalas. Estos papeles de las protenas Hsp explican por qu la
respuesta al choque por calor es transitoria:

Inmediatamente despus de la agresin ambiental, las protenas, al
no tener las concentraciones de sales y otros componentes
adecuados a su estabilidad, tienden a desnaturalizarse. La
respuesta adaptativa viene enseguida, aumentando los niveles de
protenas celadoras (que ayudan a replegarse a las protenas
defectuosas, parcialmente desnaturalizadas) y de proteasas (que
eliminan protenas intiles desnaturalizadas).

Pero una vez que ha pasado un tiempo, el medio interno de la
clula ya se ha adaptado a las nuevas condiciones, por lo que ya no
hace falta un nivel tan alto de Hsp, por lo que la respuesta va
remitiendo.
Los operones del reguln del choque por calor se transcriben a partir
de promotores especiales (con su propia secuencia consenso) cuando
son reconocidos por la holoenzima de la ARN-polimerasa con la
subunidad o
32
. Durante el crecimiento en condiciones normales, hay
muy pocas molculas de o
32
en la clula, debido a que se degrada
rpidamente (en uno o dos minutos), pero cuando sube la
temperatura de 30 a 42 C, los niveles suben 15 veces, de modo que
aumenta la transcripcin de los genes del choque trmico. Al
parecer, esos niveles de o
32
vienen regulados postraduccionalmente
por alguna de las propias chaperonas.
El modelo actual dice lo siguiente:

en condiciones normales las protenas celadoras (chaperonas)
DnaK, DnaJ y GrpE se unen a polipptidos nacientes ayudndoles
a plegarse adecuadamente. Pero por otro lado, la DnaK se une
tambin a la poca o
32
, de modo que sta no slo no puede ayudar
al inicio de transcripcin de los operones Hsp, sino que adems
queda inestabilizada y es ms susceptible de ataque por proteasas.

Cuando hay un choque por calor, al cambiar bruscamente las
condiciones del medio celular, las protenas en general tienden a
desnaturalizarse, por lo que en un primer momento las chaperonas
se dedican a intentar replegar correctamente el mayor nmero de
protenas. Esto significa que ahora la DnaK tiende preferentemente
a unirse a protenas diferentes del factor o
32
. Por lo tanto, la o
32

intacta se va acumulando en la clula e incrementa su actividad, y
se puede producir el aumento de expresin de los operones Hsp,
incluyendo el mismo dnaK. Esto explica igualmente el fenmeno
ya comentado de que la expresin de las Hsp va volviendo poco a
poco a su nivel basal: cuando se ha acumulado una buena cantidad
de DnaK suficiente para ayudar a replegarse a las protenas
celulares, y cuando ha dado tiempo a que las condiciones internas
se ajusten a las condiciones del estrs ambiental, vuelve a haber
DnaK libre como para volver a unirse a la o
32
, de modo que
lentamente se vuelve al nivel normal de transcripcin de los genes
de las protenas del choque trmico.
4.3 QUORUM SENSING
Hace unos pocos aos se descubri en eubacterias un nuevo tipo de
mecanismo regulador, cuya seal desencadenante depende de que
las bacterias correspondientes alcancen en su medio una densidad
celular umbral. Por ello se le ha dado el nombre de quorum
sensing (percepcin del qurum o autoinduccin). Este mecanismo
implica una comunicacin y colaboracin entre multitud de
individuos de la misma especie para dar una respuesta coordinada
baja determinadas circunstancias ambientales.
El mecanismo general consiste en lo siguiente: Mientras las
bacterias estn creciendo, van sintetizando una pequea molcula
sensora (autoinductora), que difunde al medio exterior, de modo que
cuando llega a tener una determinada concentracin, indica a la
poblacin de esa bacteria que ha alcanzado un cierto nivel crtico o
umbral (qurum), con lo que pone en marcha la respuesta
adaptativa. Esto garantiza que la respuesta de la poblacin se
produzca en el momento adecuado, y no antes, ya que la eficiencia
de la respuesta depende de la poblacin como tal y no de las clulas
aisladas o en pequeos grupos. Por ejemplo, la eficacia de la
respuesta adaptativa de ciertas bacterias puede depender de la
secrecin de ciertas enzimas a cierto nivel alto; tal nivel se garantiza
una vez que la poblacin bacteriana llega a una concentracin alta, y
para ello las bacterias necesitan saber que han alcanzado dicha
concentracin, precisamente debido a que detectan un nivel alto de
la propia molcula sensora que han estado produciendo y
secretando.
El mecanismo se ha estudiado mejor en bacterias Gram-negativas.
En estas, las pequeas molculas sensoras-inductoras son lactonas
de homoserina acilada (LHA), consistentes en una cadena aclica C4
a C14 unida por enlace amido a una homoserina-lactona. Al parecer,
la LHA puede difundir libremente entre ambos lados de la
membrana. Cuando el cultivo alcanza una cierta densidad (es decir,
se alcanza el qurum), la concentracin externa de LHA es
suficiente para que a su vez se logre un nivel interno de la misma en
cada individuo, lo que permite su unin a una protena activadora;
entonces esta protena cambia su conformacin y ejerce su papel
activador sobre los correspondientes operones, que al expresarse,
producen protenas dependientes de qurum, responsables de la
respuesta de adaptacin al medio en la poblacin. El gen
responsable de la sntesis de la LHA forma parte a su vez del opern
inducido, por lo que aqu nos encontramos con un bucle
autoinductor que se amplifica a s mismo (una especie de efecto
bola de nieve gentico).

El primer ejemplo descubierto de quorum sensing fue la
regulacin de la bioluminiscencia en la bacteria marina Vibrio
fischeri, que vive simbiticamente en rganos especiales de ciertos
calamares (como p. ej., el hawaiano Euprymna scolopes) y peces.
El opern lux est implicado en la formacin del enzima
luciferasa, responsable de que estas bacterias emitan luz en
presencia de oxgeno. Pero esta luminiscencia slo se pone en
marcha cuando hay una concentracin suficiente de bacterias. Al
principio del crecimiento, las bacterias no emiten luz (porque el
opern estructural lux no se expresa), pero estn produciendo y
secretando al medio una lactona de homoserina acilada, codificada
por el gen luxI. Cuando esta LHA alcanza un nivel suficiente (al
llegarse a cierta densidad celular en la que la concentracin de la
LHA se equilibra entre el exterior y el citoplasma), se une a una
protena reguladora codificada por el gen luxR, y el complejo
activa a los genes lux, entre los cuales est el que codifica la
luciferasa, de modo que se manifiesta la bioluminiscencia.
[1]


En la bacteria patgena oportunista Pseudomonas aeruginosa (que
puede ser peligrosa en grandes quemados o en pacientes con
catteres), la percepcin de qurum interviene en la formacin de
biopelculas sobre superficies, donde las bacterias estn ms
protegidas. Y adems, el qurum sensing est implicado en el
desencadenamiento de los mecanismos de patognesis para atacar
los tejidos del hospedador o paciente.

En bacterias Gram-positivas la pequea molcula sensora del
qurum suele ser un oligopptido previamente secretado por los
individuos. Ejemplos de qurum sensing en Gram-positivas:

La conjugacin en Enterococcus faecalis

La induccin de la competencia en la transformacin con ADN
del neumococo (Streptococcus pneumoniae) y en Bacillus
subtilis

Produccin de toxinas y factores de virulencia por
Staphylococcus aureus

Desarrollo del micelio areo en Streptomyces
NOTAS

[1]
El opern de genes de la bioluminiscencia de Vibrio fischeri
est, adems sometido a represin catablica, es decir, su
expresin en bajos niveles de glucosa depende tambin de la
protena CAP (CRP). Esto nos recuerda, una vez ms, que a
menudo los operones bacterianos poseen dos o ms
sistemas superpuestos de control gentico.



NDICE:
1 INTRODUCCIN A LAS VARIACIONES
HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE
MATERIAL GENTICO
2 MUTACIONES ESPONTNEAS.
2.1 MUTACIONES PUNTUALES
2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES
PUNTUALES
2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIN
PUNTUAL
2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE
(=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA [FRAMESHIFTS]
2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)
2.4 INVERSIONES
2.5 TRANSLOCACIONES
2.6 DUPLICACIONES EN TNDEM
2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS
GENTICOS TRANSPONIBLES
2.8 REPASO DE CONCEPTOS TILES EN EL TRABAJO
CON MUTANTES BACTERIANOS
3 CARACTERIZACIN DE LAS MUTACIONES
4 TASA DE MUTACIN
5 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES
BACTERIANAS
5.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES
DIRECTAS INTRAGNICAS
5.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES
DIRECTAS INTERGNICAS
5.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS
POR ARNt MUTANTES
6 AGENTES MUTAGNICOS E INDUCCIN DE
MUTACIONES
6.1 AGENTES FSICOS
6.1.1 RADIACIN UV
6.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES
6.2 AGENTES QUMICOS
6.2.1 ANLOGOS DE BASES
6.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES
6.2.3 AGENTES ALQUILANTES
6.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES
6.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL
EMPAREJAMIENTO DE BASES
7 LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE
SUSTANCIAS MUTAGNICAS Y POTENCIALMENTE
CARCINOGNICAS (TEST DE AMES)
8 ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS
EN LABORATORIO
8.1 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS
EN LABORATORIO
8.1.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS
MORFOLGICOS DE LAS COLONIAS
8.1.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
8.1.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A
FAGOS
8.1.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE
AZCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGA
9 VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIN DE
PLSMIDOS
INTRODUCCIN GENERAL A LOS SIGUIENTES TEMAS:
VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS
EN EL GENOTIPO
Los diversos cambios morfolgicos, estructurales y
funcionales ocurridos a lo largo de la evolucin de los seres vivos
tienen como base los cambios en los genotipos, que esencialmente
pueden ser de dos tipos:

mutaciones. A pesar de que el mecanismo de la herencia gentica
es fiel y tiende a la conservacin, esta fidelidad no es absoluta e
inflexible. Las mutaciones son cambios bruscos ocurridos en el
genotipo, y que son transmitidos a las generaciones siguientes.

recombinaciones subsiguientes a intercambio gentico. En la
mayora de los eucariotas, pueden ocurrir recombinaciones entre
genotipos individuales de una misma poblacin. En los fenmenos
de sexualidad se origina una variedad casi infinita de nuevas
ordenaciones o genotipos, sin necesidad del aporte de nuevas
mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede
actuar la seleccin, de modo que las poblaciones pueden ir
evolucionando con el paso del tiempo, en funcin de presiones
ambientales.
Qu ocurre en bacterias?

Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generacin:
se reproducen rpidamente y pueden dar origen en poco tiempo a
grandes poblaciones. Por supuesto, experimentan fenmenos de
mutacin, por lo que las poblaciones pueden acumular gran
nmero de mutaciones. Estudiaremos la mutacin (y los modos
posibles de su eliminacin) en el presente captulo.

Pero la mutacin no es el nico tipo de variacin genotpica en
bacterias. Aunque los procariotas carecen de fenmenos de
sexualidad autntica, existen variaciones genticas asociadas a la
adquisicin por una bacteria de parte del material gentico de
otra bacteria o de un bacterifago. Los posibles mecanismos de
transferencia de informacin gentica entre bacterias son:

transformacin (que estudiaremos en el captulo 17);

conjugacin (ver captulo 18);

transduccin (ver captulo 19).
Los fenmenos de recombinacin gentica asociados a la
transferencia sern abordados en la primera parte del captulo 17.
1 INTRODUCCIN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS
NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE MATERIAL
GENTICO
Definiciones bsicas:
Desde un mero punto de vista fenotpico, mutacin es la
aparicin brusca y espontnea de una variacin fenotpica de un
individuo, la cual se transmite hereditariamente a la progenie.
Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la
herencia, podemos plasmar una definicin ms ajustada, desde el
punto de vista genotpico: Mutacin es cualquier alteracin de la
secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un
gen o a un locus (sea ste transcribible o no), aun cuando esta
alteracin no se refleje en forma de cambio fenotpico observable o
detectable.

Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede
presentarse un gen.

alelo silvestre: forma (secuencia) de un gen en las bacterias
aisladas de su hbitat natural (estirpes silvestres). En la
naturaleza es muy frecuente la existencia de
polimorfismo:existen diversos alelos silvestres diferentes para
un mismo locus.

alelos mutantes: las distintas formas (secuencias) que resultan
de mutaciones del alelo silvestre.
Una pareja de conceptos que tambin conviene incluir aqu es la
diferenciacin entre mutaciones espontneas y mutaciones
inducidas:

Mutaciones espontneas: son resultado de la actividad normal de
la clula, o de sus interacciones con su medio natural. La mayora
aparecen por errores en los procesos de replicacin, reparacin o
recombinacin del ADN. (O sea, para abreviar, seran aquellas
mutaciones no provocadas de forma experimental).

Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteracin
experimental del ADN, bien sea directamente, o indirectamente,
por agentes fsicos o qumicos denominados mutgenos.
2 MUTACIONES ESPONTNEAS.
Los principales tipos son:
1) Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden
ser:
a) transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py Pu:Py;
b) transversiones: cambio de una pareja Pu:Py Py:Pu.
2) Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco)
de lectura [frameshift]. Se deben a:
a) eliminacin de uno o un corto nmero de nucletidos;
b) incorporacin de uno o un corto nmero de nucletidos.
3) Grandes delecciones (o borraduras)
4) Inversiones
5) Traslocaciones
6) Duplicaciones en tndem
7) Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genticos
transponibles.
Los estudiaremos a continuacin, comentando algo sobre su base
molecular.
2.1 MUTACIONES PUNTUALES
Las transiciones suponen cambios de una pareja purina:
pirimida a otra purina:pirimidina:
A:T G:C
Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a
una pirimida:purina (o viceversa):
A:T T:A
G:C C:G
2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES
PUNTUALES
2.1.1.1 Base molecular de las transiciones
Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontnea, durante la
replicacin, de formas raras tautomricas de las bases nitrogenadas.
Los desplazamientos tautomricos del protn cambian las
propiedades de formacin de puentes de H, de tal modo que:
forma tautomrica Se comporta como
A* (imino) G
G* (enol) A
C* (imino) T
T* (enol) C
Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas
tautomricas seran:
A* : C
C* : A
T* : G
G* : T
2.1.1.2 Base molecular de las transversiones
(Modelo de Topal & Fresco:observen en el grfico los
emparejamientos de las formas sin y anti)
El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un
par de bases depender de:

constante de equilibrio (k) de tautomerizacin del par de bases
(unos 10
-4
- 10
-5
);

frecuencia de dNTPs en forma sin. (G
sin
aparece con frec. de 10
-1
,
A , con 5 10
-2
).
De este modo, tericamente deberan darse las siguientes
frecuencias de mutaciones puntuales:

frec. prevista de transiciones: 10
-4
- 10
-5


frec. prevista de transversiones: 10
-5
- 10
-6
(para la G) y 5 10
-6
-
5 10
-7
(para la A)
Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son
mucho ms bajas (del orden de 10
-10
). Esto implica que debe de
existir un sistema que corrija los emparejamientos errneos: como
ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una capacidad
correctora de pruebas (editing): cada paso de elongacin es
seguido inmediatamente por una comprobacin del emparejamiento.
Si este emparejamiento es errneo, la polimerasa usa su actividad
exonucleasa 3'5' para elimininar la base mal emparejada, y a
continuacin vuelve a polimerizar en el mismo lugar (por su
actividad polimerasa 5'3').
Ejemplo: Durante la replicacin puede ocurrir que la citosina pase a
su forma imino, que se empareja con la adenina:
1) C C
imino
: A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)
2) Ahora la C
imino
vuelve rpidamente a su forma normal, con lo que
queda
3) C : A (este emparejamiento anmalo es detectado por la
polimerasa)
4) La actividad exonucleasa 3'5' elimina la A recin incorporada
5) Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'3', que incorpora
G
6) El resultado final es el emparejamiento correcto C G
De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es
aproximadamente equivalente al cuadrado de la correspondiente cte.
(k) de tautomerizacin.
Parece ser que en la naturaleza existe una seleccin natural que
propicia una frecuencia baja, pero no nula, de errores durante la
replicacin. El significado biolgico es que de esta forma se
combina una alta tasa de fidelidad en la replicacin, pero con
suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para generar
innovaciones sobre las que pueda actuar la presin selectiva, lo cual
permite evolucin.
Puntos calientes de mutacin (hot-spots): son puntos o zonas
dentro del genomio donde se concentran mutaciones con una
frecuencia mayor que la esperada si se distribuyeran al azar.
Ejemplo: en el gen lacI hay una zona especialmente caliente
cerca de la base 200, donde la probabilidad de encontrar
mutaciones es muy superior a la del resto de la secuencia de
ADN de ese gen.
Explicacin: algunas bases, dentro de un determinado contexto
de secuencia, son modificadas qumicamente por accin de
alguna enzima (normalmente una metilasa), y ello provoca una
mayor susceptibilidad a la aparicin de mutaciones puntuales:
La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:
C C A G G
G G T C C
es metilada por una metilasa especfica (que reconoce precisamente
a esas dos citosinas dentro de esa secuencia), para dar 5-
metilcitosina. La 5-metil citosina experimenta espontneamente una
desaminacin oxidativa, que la convierte en timina, de manera que
se produce finalmente una transicin: C:G 5-metil-C:G T:G
(emparejamiento anmalo) T:A
2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIN
PUNTUAL
Si la mutacin afecta a una regin en 5' que acta en cis:

Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que
la ARN polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor
queda inactivado y no se produce la expresin de los genes del
opern.

En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordar
que el promotor del opern lac tiene una secuencia -10 atpica, que
obliga a que la expresin a alto nivel requiera el concurso de la
protena CAP activa. Pues bien, por medio de mutaciones
puntuales se puede lograr que esa secuencia atpica adquiera las
caractersticas de las secuencias -10 tpicas (a base de TATA, o
similar). En este caso, el efecto de estas mutaciones es que el
opern lac se vuelve independiente de la protena CAP para su
expresin eficiente: el opern se har independiente de la
represin catablica.

En los operones sometidos a control negativo, determinadas
mutaciones en el operador provocan una menor afinidad de la
protena reguladora (del represor). El efecto es el de crear una
expresin constitutiva (es decir, el opern se expresa incluso en
presencia del represor activo, debido a que ste no reconoce al
operador mutante).
Si la mutacin afecta a una zona codificadora: se produce la
alteracin de un codn. Las consecuencias de la alteracin pueden
ser muy variadas:
1) Si la nueva tripleta (codn) codifica el mismo aa. que la antigua
(debido a la sinonimia o degeneracin del cdigo gentico, que
afecta sobre todo a la tercera base del codn) se origina una
mutacin neutra, que es silenciosa (no hay ningn cambio en
el fenotipo).
2) Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original,
tenemos varias posibilidades:
a) mutaciones de sentido errneo o alterado (missense):
i) si el nuevo aa. es de un tipo qumico similar al antiguo,
puede cumplir una funcin semejante en la protena
mutante, por lo que el fenotipo sera tambin una mutacin
silenciosa por sustitucin de aa.
ii) En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad
estructural, que puede reflejarse en que la protena sea
termosensible o criosensible, o ms susceptible a efectores
alostricos. La protena termosensible es funcional a
temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente altas, a las cuales la correspondiente protena
silvestre es activa. La protena criosensible es funcional a
temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente bajas, a las cuales la protena silvestre es
activa. La protena ms susceptible a efectores alostricos es
aquella que se inhibe por efectores de forma ms acusada.
En esta categora entran tambin las protenas con actividad
residual.
iii) Por otro lado, podemos encontrar protenas que pierden su
actividad biolgica debido a que la sustitucin del aa.
provoca la alteracin de la estructura secundaria y terciaria
de la protena: por ejemplo, la aparicin por mutacin de
una prolina en mitad de una o-hlice destruye esta
estructura, y puede originar inactivacin de la funcin.
iv) La alteracin del centro activo suele provocar
inactivacin total o parcial. NOTA: Aqu se plantea la
siguiente pregunta: si la mutacin inactiva totalmente la
capacidad funcional de la protena, cmo podemos
reconocer que esa protena alterada est presente en la
clula? La protena se puede identificar por medio de
anticuerpos (Ac) obtenidos frente a la protena silvestre. Si
ponemos en contacto estos Ac con un extracto de las clulas
mutantes, se producir una reaccin antgeno-anticuerpo.
Las protenas inactivas caracterizadas de esta manera se
suelen denominar como CRM iniciales de cross-reactive
material (material que da reaccin cruzada respecto de la
protena silvestre).
b) mutaciones sin sentido (nonsense), o sea, aquellas que
cambian un codn original a una de las tres tripletas que
significan seal de parada de la traduccin:UAG (codn
mbar), UAA (codn ocre), UGA (codn palo).
Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin sentido es
producir la detencin de la lectura del ARNm por parte de los
ribosomas. Por lo tanto se produce una protena truncada,
que suele ser inactiva.
Si la mutacin sin sentido se produce en un gen de un opern
policistrnico, y si esa mutacin cae cerca de una zona del ARNm
capaz de formar estructuras secundarias en horquilla, aparte del
efecto de mutacin sobre el gen afectado, se detectar un fenmeno
de polaridad, debido a que el acoplamiento transcripcin-
traduccin provoca la no transcripcin de la regin situada ms all
(en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habr
transcripcin de los genes distales del opern.
2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE
(=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA
[FRAMESHIFTS]
Se pueden originar por prdida o ganancia de un pequeo n de
nucletidos (que no sea 3 o mltiplo de 3)
Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias
repetitivas. En este tipo de secuencias, durante la replicacin o la
recombinacin, se pueden producir malos alineamientos por
desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.
Ejemplo:
G T C C G T C C G T C C G T C C
C A G G C A G G C A G G C A C C
Se produce un cambio total en el sentido del mensaje gentico, a
partir del sitio de la mutacin se sintetiza una protena inactiva, a
menudo truncada (debido a que al cambiar la pauta de lectura,
pueden aparecer tripletas sin sentido).
Si la prdida es de 3 nucletidos (o mltiplo de 3), y la pequea
deleccin no afecta a una zona importante de la protena, se puede
producir un producto que an tenga actividad biolgica.
2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)
Suponen la eliminacin de cientos e incluso miles de nucletidos.
Base molecular: Formacin de grandes bucles intracatenarios,
con posterior escisin de dichos bucles. Normalmente en los
extremos del material que se va a delecionar existen secuencias de
ADN que son repeticiones directas una de otra, lo que facilita algn
fenmeno de recombinacin que lleva a la eliminacin del material
(bucle) intercalado entre esas secuencias.
Consecuencias: Mutacin irreversible e inactivadora total de uno
o varios genes.
2.4 INVERSIONES
Cambio de orientacin de un segmento de ADN. En muchos casos
se deben a emparejamiento y ulterir recombinacin entre secuencias
inversamente repetidas en los extremos del material que sufre la
inversin.
Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotpicas,
ya que simplemente se ha invertido el orden de los genes del
segmento invertido en relacin al resto del genoma.1[1] A diferencia
de las deleciones, las inversiones suelen revertir, precisamente por
un nuevo proceso de recombinacin entre las secuencias
inversamente repetidas.
2.5 TRANSLOCACIONES
Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.
2.6 DUPLICACIONES EN TNDEM
Se trata de la aparicin de una copia de una zona de ADN a
continuacin de la localizacin del original. Suelen deberse al
emparejamiento y recombinacin entre secuencias similares en dos
molculas de ADN (en realidad, en este evento, de las dos molculas
de ADN, una se queda con una duplicacin mientras que la otra se
queda con una deleccin).
Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no
suele conducir a inactivacin gnica (ya que aunque en la juntura de
la duplicacin puede haber una mezcla de dos genes truncados,
sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en el mutante).
Una de las propiedades ms caractersticas de las duplicaciones
en tndem es su inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia
por nueva recombinacin dentro del segmento duplicado.
A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un
papel importante en la evolucin. Tras una duplicacin que se haya
estabilizado, hay dos copias de uno o varios genes, de modo que una
de las copias de cada pareja puede lentamente ir evolucionando e
incluso adquirir una nueva funcin.



2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS
GENTICOS TRANSPONIBLES
La insercin de una secuencia de insercin (IS) o de un
transposn (Tn) en de un gen origina la inactivacin insercional,
debida a:

desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos,
generan frecuentes seales de fin de traduccin;

terminacin de transcripcin dependiente de Rho, con efectos
polares (debido a que las IS llevan frecuentes seales de
terminacin compleja de la transcripcin, dependiente de ).
Una vez que ha ocurrido una insercin de una IS o de un Tn,
pueden producirse ulteriores delecciones secundarias de todo o de
parte del elemento transponible, y a veces tambin delecciones del
material gentico adyacente (fenmenos de escisin imprecisa del IS
o Tn).
Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas
a cierta distancia una de la otra, por fenmenos de recombinacin
propiciados por dichas IS se pueden producir:

inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de
insercin.
2.8 REPASO DE CONCEPTOS TILES EN EL TRABAJO
CON MUTANTES BACTERIANOS
Repasemos algunos conceptos y trminos que son igualmente
de uso comn en muchos estudios de gentica:
Dependiendo de que la mutacin gentica se manifieste o no a
nivel fenotpico, y segn el grado de afectacin fenotpica, podemos
clasificar las mutaciones de la siguiente manera:

mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotpico;

mutaciones que implican alteracin del fenotipo silvestre:

letales: si ocasionan la muerte o prdida de viabilidad del
microorganismo;

condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el
mutante pierde la viabilidad, pero bajo otras la mantiene.

mutaciones de alteracin fenotpica que suponen la prdida o la
merma de alguna funcin que no sea esencial para la viabilidad
del organismo. Dentro de ellos estn los mutantes condicionales
(su fenotipo alterado se manifiesta en determinadas
circunstancias).
Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente
letales) son muy tiles para estudiar aquellos genes esenciales para
la bacteria. En estos mutantes hay que distinguir dos tipos de
condiciones:

condiciones restrictivas (tambin llamadas no-permisivas): son
aquellas condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde
la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el producto
afectado por la mutacin pierde su actividad biolgica.

condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto
del gen mutado es an funcional.
Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en
gentica:

mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar
con las siglas ts. El producto del gen mutado es ms sensible al
calor que el producto silvestre

mutantes de biosntesis sensible al calor;

mutantes sensibles al fro (criosensibles)

mutantes sensibles a efectores alostricos

mutantes suprimibles por supresores extragnicos (por ejemplo,
por ARNt supresores, mutantes);

mutantes dependientes de estreptomicina;

mutantes estabilizados osmticamente (slo son estables en altas
concentraciones de sales).
En principio, y por definicin, es imposible obtener mutantes
letales estrictos de genes esenciales para la viabilidad de la bacteria
(p. ej., en genes de la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa, ADN-
ligasa, etc.), pero s es posible conseguir mutantes condicionalmente
letales, especialmente los termosensibles. Por ejemplo, si tras un
tratamiento mutagnico sembramos clulas de Escherichia coli en
placas y las cultivamos a 30C, y luego hacemos rplicas en placas
que se incuban a 42C, las colonias ausentes en estas ltimas nos
sealan correspondientes colonias de la placa matriz candidatas a
mutantes termosensibles.
Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en
bacterias son aquellos con mutaciones sin sentido. Como se
recordar, cuando el ribosoma llega al codn sin sentido, se detiene
la traduccin ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene
simultneamente una segunda mutacin de tipo supresor
extragnico, a saber, un ARNt mutante adecuado, se puede
restablecer el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).
3 CARACTERIZACIN DE LAS MUTACIONES
Para caracterizar genticamente una mutacin (es decir, para
conocer qu tipo de mutacin es) se recurre normalmente a pruebas
de reversin de cada mutante.

Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una
2 mutacin (ver ms adelante, en este mismo captulo).

Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de
lectura.2[2]




Las inserciones slo pueden revertir por una deleccin exacta del
material insertado.

Las delecciones no pueden revertir.

Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genticos
transponibles no aumentan su frecuencia por tratamiento con
agentes mutagnicos, mientras que el resto s lo hacen.
4 TASA DE MUTACIN
En una poblacin bacteriana se define la tasa de mutacin (T)
para un determinado fenotipo como la probabilidad de que una
clula mute a ese fenotipo en un determinado intervalo de tiempo.
Luria y Delbrck (1943) escogieron como intervalo de tiempo
unitario el correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una
generacin), que es el tiempo necesario para completar una ronda de
divisin celular. Por lo tanto:
T = m / d, donde m es el n de mutaciones surgidas en un tiempo t,
y d es el n de divisiones ocurridas en ese tiempo t.
Si expresamos d en funcin del nmero de clulas: T= m / (N-N
0
)
NOTA 1: La tasa T de mutacin espontnea es constante para cada
divisin celular a distintas tasas de crecimiento
En la expresin anterior hay que introducir un factor de correccin,
ya que en el momento de determinar el nmero de clulas (N), las
bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente ciclo celular,
de modo que el promedio real de divisiones es mayor que N en un
factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:
T= m ln2 /(N-N
0
) = 0,69 m / (N-N
0
)
A pesar de lo sencillo de esta frmula, el clculo en la prctica de la
tasa de mutacin no es tan fcil como sta parece dar a entender.
Ello se debe a que el parmetro m mide el nmero de eventos de
mutacin en un lapso de tiempo, que no equivale al nmero de
bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fcil que
suele ser cuantificar el nmero de mutantes, en el experimento, en
ese cantidad medida se incluyen los descendientes de eventos ms o
menos antiguos de mutacin a lo largo de ese experimento. Para
calcular m hay que recurrir a ciertos mtodos estadsticos.
Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y
Delbrck con la distribucin de Poisson. Imaginemos que
sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial
de bacterias sensibles a la estreptomicina e incubamos el mismo
tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N
0
sea
5.6X10
8
; imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11
de los 20 tubos no han surgido mutantes resistentes al antibitico.
De acuerdo con la aproximacin de Poisson a la distribucin normal,
la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un cultivo sera:
P
0
= m
0
e
-m
/0!
Aplicando esto a nuestro ejemplo:
P
0
= 11/20 = 1 e
-m
/1
Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20
= 0.59. Ahora podemos calcular la tasa de mutacin:
T = 0.6 0.59/5.6X10
8
= 7.3 10
-9

NOTA 2: Obsrvese que hemos definido la tasa de mutacin
respecto de un fenotipo. Esto significa que aquellos fenotipos que
dependan de varios genes tendrn tasas de mutacin superiores a las
de aquellos que dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de
mutacin hacia auxotrofa para la histidina o el triptfano (cuya
biosntesis depende de varios genes) est en torno a 10
-7
, mientras
que la tasa de mutacin a resistencia a estreptomicina (que, como se
recordar, depende de la alteracin del gen de la protena ribosmica
S12) es de slo 10
-10
o 10
-11
.
5 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES
BACTERIANAS
Las variaciones fenotpicas producidas por las mutaciones no-
silenciosas son transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez
producido el cambio, ste es permanente, pero no necesariamente
irreversible (como ya dijimos, solamente las grandes delecciones
son irreversibles).
La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una
segunda mutacin que restaura el fenotipo original. Esta 2 mutacin
puede ser de dos tipos principales, y varios subtipos:
1) Reversin (en sentido estricto), que restaura el genotipo
original. Esto equivale a una retromutacin (back-mutation).
2) Supresin: la 2 mutacin suprime los efectos de la 1 pero no
restaura el genotipo original. Por lo tanto, tras la mutacin
supresora, la clula queda con dos mutaciones. La supresin se
clasifica a su vez en:
a) Supresin indirecta: no se corrige el producto del primer
gen, pero la 2 mutacin anula las consecuencias
fenotpicas. Ejemplos:
i) Se abre una nueva va para la sntesis del producto afectado
por la 1 mutacin.
ii) El producto mutado de la 2 mutacin puede sustituir al
producto de la primera.
iii) Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace
que el producto alterado de la primera mutacin vuelva a ser
funcional.
b) Supresin directa: la 2 mutacin corrige el producto del
primer gen mutado. Puede ser de dos tipos principales:
i) Supresin intragnica: la 2 mutacin ocurre en el mismo
gen donde ocurri la primera.
ii) Supresin intergnica (= extragnica): la mutacin
supresora afecta a otro gen, que suele ser uno de los genes
implicados en la maquinaria de traduccin del ARNm:
ARNt y protenas ribosmicas.
5.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES
DIRECTAS INTRAGNICAS
1. Introduccin de un desfase de signo opuesto al de la primera
mutacin restauracin de la pauta de lectura alterada por una
previa mutacin de desfase de lectura (frameshift). La nica
zona alterada tras la mutacin supresora sera la que queda entre
ella y la 1 mutacin. Si esta zona es corta y no es esencial para la
actividad biolgica, se puede restablecer el fenotipo primitivo.
2. Supresiones en el mismo codn que qued afectado por la 1
mutacin, de modo que se codifica un aminocido distinto del
silvestre y distinto del aa. del primer mutante, pero que restaura la
funcionalidad de la protena. A este tipo de supresin se la
denomina tambin pseudorreversin.
3. Mutacin puntual compensatoria en un sitio distante respecto
de la primera mutacin: la 2 mutacin compensa a la 1, de modo
que se restaura la estructura tridimensional y/o el centro activo de
la protena.
5.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES
DIRECTAS INTERGNICAS
1) Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)
a) supresores de mutaciones que introducen codones de
parada de lectura (o sea, de codones sin sentido,
nonsense): son ARNt mutados en el anticodn, de modo
que este anticodn mutado puede emparejarse con alguno de
los tres tipos de codones sin sentido, insertando ahora los aa.
correspondientes que transportan; por lo tanto, impiden la
terminacin prematura de la traduccin. Ejemplos: El codn
sin sentido UAG (mbar) puede ser suprimido por versiones
mutantes (supresoras) de los siguientes ARNt:
Tipo de ARNt
supresor
Normalmente
reconoce
ARNt
Ser
UCG
ARNt
Gln
CAG
ARNt
Tyr
UC
ARNt
Lys
AAG
(La letra sombreada indica la base que cambia en la mutacin
supresora).
b) El codn sin sentido UAA (ocre) puede ser suprimido por
una versin mutante de ARNtGly GAA
c) Existen supresores ms raros que suprimen mutaciones de
sentido errneo (missense): Ejemplo: El ARNt
Gly
cuyo
anticodn es UCC, por mutacin se convierte en un ARNt
supresor cuyo anticodn es UCU, que entonces reconoce al
codn AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor inserta Gly
frente a cada codn AGA.
d) supresores de desfases de lectura de +1 nucletido: son
ARNt mutantes que tienen un anticodn con 4 nucletidos, en
lugar de los 3 habituales.Ejemplo: Existe un ARNt
Phe
que tiene
un anticodn que reconoce la secuencia UUUC.
2) Por protenas ribosmicas mutantes: Los ribosomas derivados
de la alteracin por mutacin de determinadas protenas
adquieren zonas de conformacin cambiada, de modo que
reconocen tripletas de forma errnea. Al introducir aminocidos
cambiados en codones que a su vez proceden de mutaciones,
pueden restaurar la funcionalidad de algunas protenas
mutantes.Ejemplos:
a) mutaciones ram, que afectan a las protenas S4 y S5 de la
subunidad 30S del ribosoma, de modo que ste puede suprimir
una gran variedad de mutaciones sin sentido y por desfases. (El
nombre de ram corresponde a las iniciales de ribosomas
ambiguos).
b) Mutaciones Str
R
: tienen afectada la protena S12 del ribosoma.
Hacen que las mutaciones sin sentido sean menos defectuosas
(leaky = dbiles).
5.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR
ARNt MUTANTES
Cada supresor tiene una eficacia caracterstica de supresin,
que se refleja en la proporcin de cadenas polipeptdicas mutantes
que son terminadas de forma normal (en lugar de quedarse
truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:

la concentracin del ARNt supresor en la clula;

afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;

afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los
factores de terminacin de traduccin que reconocen el mismo
codn sin sentido (de parada de lectura).
La mutacin supresora, por s misma disminuye la velocidad
de crecimiento de la bacteria, debido a que, aparte de su capacidad
supresora, introduce errores de lectura en los ARNm normales.
Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como
para no hacer que la clula muera por introduccin de demasiados
errores en la lectura de los ARNm normales (es decir, la mayor parte
de las veces, los supresores introducen el aminocido correcto). Pero
por otro lado, han de ser suficientemente eficicientes como para
poder introducir aminocidos en codones mutantes con la frecuencia
adecuada para suprimir la mutacin primaria. Normalmente, los
supresores tpicos suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la mayora
de las veces se introduce el aa. correcto frente al codn correcto.
6 AGENTES MUTAGNICOS E INDUCCIN DE
MUTACIONES
Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce
mutaciones concretas (p. ej., el antibitico no provoca la aparicin
de los mutantes resistentes). Ahora bien, lo que s pueden hacer
determinadas condiciones ambientales es elevar la tasa global de
aparicin de mutaciones.
Determinados agentes ambientales fsicos o qumicos pueden
daar el ADN o interferir con la maquinaria replicativa, de modo
que provocan una mayor frecuencia de aparicin de mutaciones
(y en este sentido hablamos de mutaciones inducidas). A dichos
agentes se les llama mutgenos o agentes mutagnicos. As pues,
en ltima instancia, los mutgenos causan alguna alteracin en el
ADN que

bien no puede ser reparada convenientemente,

o bien es un dao tan extenso que sobrepasa la capacidad de los
mecanismos celulares normales de reparacin (consultar en el
tema 13 el apartado sobre Mecanismos de Reparacin de los
daos al ADN).
6.1 AGENTES FSICOS
6.1.1 RADIACIN UV
Es el mutgeno fsico ms empleado en el laboratorio para
obtener mutaciones en las bacterias. Como ya estudiamos en su
momento, su efecto principal es originar dmeros de pirimidina
intracatenarios (con creacin de una anillo ciclobutano entre dos Py
consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:

50% T-T

40% T-C

10% C-C
Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia
del mecanismo posreplicativo de reparacin propenso a error (o sea,
el sistema SOS). Con menor frecuencia la luz UV ocasiona
hidratacin de la C, lo que da origen a transiciones.
6.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES
Tienen mayor poder de penetracin que los rayos UV, pero son
de difcil manejo, por lo que se emplean poco en bacterias. Los
rayos X ocasionan daos reparables por el sistema SOS.
Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos ) provocan
labilizaciones en el ADN, que terminan en roturas en las hebras del
ADN (por ataque al enlace fosfodister), que finalmente pueden
conducir a delecciones.
6.2 AGENTES QUMICOS
Se pueden agrupar en varias categoras:
1) Anlogos de bases, que se incorporan durante la replicacin del
ADN.
2) Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.
3) Agentes alquilantes.
4) Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hlice del
ADN, entre pares de bases consecutivas.
5) Bloqueadores del emparejamiento de las bases.
6.2.1 ANLOGOS DE BASES
Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases
naturales de los cidos nucleicos, pero con propiedades qumicas
diferentes. Como ejemplos tenemos:

5-bromouracilo (5-BrU)

2-aminopurina (2AP).
Estas molculas entran a las clulas y son convertidas a los
correspondientes dNTP, de modo que su estructura les permite ser
incorporados durante la replicacin del ADN.
1) El 5-BrU es anlogo de la T. Propicia transiciones T:A G:C
debido a que experimenta frecuentes cambios tautomricos desde su
forma ceto a su forma enol:
BU
ceto
:ABU
enol
:G
Si partimos de una pareja A=T y en la 1 ronda de replicacin la
ADN-polimerasa introducen un BU
ceto
frente a la adenina, los
acontecimientos hasta llegar a la mutacin se pueden resumir as:
A:T (la primera replicacin incorpora BU) A:BU
ceto

(tautomerizacin y 2 replicacin) G:BU
enol
(3 replicacin)
G:C
2) La 2-AP es un anlogo de la A. Provoca transiciones A:T C:G
debido a sus frecuentes tautomerizaciones (AP
amino
AP
imino
).
Veamos el proceso:
A:T (primera replicacin) AP
amino
:T (tautemerizacin y 2
replicacin) AP
imino
:C (3 replicacin) G:C
6.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES
Alteran las Pu o las Py, de modo que:

causan errores en el emparejamiento, o bien

labilizan las bases, de modo que stas espontneamente se
modifican qumicamente con gran frecuencia.
1) cido nitroso: provoca una desaminacin oxidativa de A y C,
lo que origina transiciones

sobre C dU, que se empareja con la A.

sobre A (6-aminopurina) hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que
en su forma ceto se empareja con la citosina: A:T HX
ceto
:C
G:C
El nitroso tambin desamina oxidativamente a la G, pero en este
caso no hay mutacin: G xantina, que al igual que la G, se
empareja con la C.
2) Hidroxilamina (NH
2
OH): acta especficamente sobre la
citosina, aadindole un hidroxilo a su grupo -NH
2
.
6.2.3 AGENTES ALQUILANTES
Introducen radicales alqulicos en una cadena (los alquilantes
monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN,
produciendo efectos letales y mutagnicos.

Los efectos letales fueron estudiados en el captulo 19 (Accin de
los agentes qumicos).

Los efectos mutagnicos dependen sobre todo de la reaccin con
el O
6
de la G.
Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por
ejemplo:

Cl-CH
2
-CH
2
-S-CH
2
-CH
2
-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.

etil-etano-sulfonato (EES): CH
3
-CH
2
-SO
2
-O-CH
2
-CH
3


etil-metano-sulfonato (EMS): CH
3
-SO
2
-O-CH
2
-CH
3


nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-
nitrosoguanidina.
Todos estos agentes, excepto la NTG, actan tanto in vivo
como in vitro. La NTG slo acta in vivo, ya que su efecto lo ejerce
sobre la horquilla de replicacin del ADN. La NTG es uno de los
mutgenos ms potentes que se conocen, pero es un agente sucio,
en el sentido de que genera varias mutaciones en la misma clula.
Induce reparacin SOS propensa a error, dando origen a
transiciones, transversiones y desfases del marco original del lectura.
Como hemos dicho, estos agentes originan un dao
premutagnico principal consistente en alquilacin del O
6
de la G.
Ello provoca una gran distorsin en la doble hlice, que
posteriormente se plasma en transiciones del tipo G:C A:T.
Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema especfico
para reparar las lesiones de la O
6
-alquil-guanina, que funciona de
la siguiente manera:
1) La bacteria posee una O
6
-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace
N-glucosdico entre la O
6
-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto
provoca la creacin de un sitio apurnico (sitio AP).
2) El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora
(apurinasa), que rompe el enlace fosfodister del lado 5' del sitio
apurnico.
3) Se produce una reparacin por escisin-resntesis de un pequeo
n de nucletidos, pero si el dao es muy grande se produce una
situacin SOS que tiende a ser reparada por el sistema propenso
a error ya estudiado, lo que provoca introduccin de errores, que
conducen a transiciones y transversiones.
6.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES
Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen
a prdida o ganancia de nucletidos (o sea, generan mutaciones de
cambio de la pauta de lectura del mensaje gentico). Estas sustancias
son molculas planares con 3 o 4 anillos conjugados, que presentan
un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se
pueden incorporar covalentemente al esqueleto de ste, sino que se
intercalan entre dos pares de bases consecutivas, con lo que
provocan distorsiones de la doble hlice.
Algunos ejemplos:

derivados de la acridina, como el naranja de acridina

bromuro de etidio (ver nota3[3])

derivados de la flavina (como la proflavina).
Estabilizan emparejamientos errneos durante la replicacin y
la recombinacin del ADN, dando origen a desplazamientos de la
pauta de lectura.
Aplicaciones: Algunos se estn ensayando en cuanto a su capacidad
de inhibir tumores cancergenos, o como antivirsicos, o contra el
protozoo causante de la malaria.
6.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL
EMPAREJAMIENTO DE BASES
Este grupo incluye potentes carcingenos como:

benzo-a-pireno

aflatoxina-B
1

Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN,
que inducen el sistema SOS de reparacin, lo que finalmente implica
reparacin propensa a error. Las aflatoxinas son unas micotoxinas
(producidas por hongos, como Aspergillus).



7 LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE
SUSTANCIAS MUTAGNICAS Y POTENCIALMENTE
CARCINOGNICAS
Uno de los ms claros indicios de que el cncer surge a
menudo como consecuencia de fenmenos mutagnicos es que la
mayora de los carcingenos son tambin mutgenos.
Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los aos
70, una prueba rpida, sencilla y econmica por la que se pueden
ensayar compuestos como posibles carcingenos. Su base consiste
precisamente en ver si son mutgenos frente a bacterias (es decir, se
comprueba si tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la
sustancia en cuestin, aumenta la tasa de aparicin de mutantes.
TEST DE AMES
Usa una serie de cepas his
-
de Salmonella typhimurium, muy
bien caracterizadas a nivel gentico-molecular.
1) Una suspensin de la bacteria se siembra masivamente (unas 10
8
)
en placas Petri que llevan un medio mmino (MM) -por lo tanto,
sin aminocidos- .
2) A continuacin, en el centro de la placa se coloca un pequeo
disco de papel de filtro impregnado con la sustancia que se desea
ensayar. Acto seguido, las placas se incuban en estufa a la
temperatura ptima de crecimiento de la bacteria (37
o
C).
3) Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se
cuentan las colonias surgidas en cada placa, comparndolas con
las colonias de una placa control que no llevaba la sustancia. Las
colonias habrn surgido por el crecimiento de bacterias que hayan
experimentado reversiones (=retromutaciones). Cada reversin en
el alelo original his
--
restituye el fenotipo silvestre His
+
, y por lo
tanto capacita a la bacteria a crecer y dividirse en el medio
mnimo.
Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce
altas tasas de mutacin sobre la bacteria), es muy probable que el
compuesto ensayado sea tambin carcingeno, por lo que habr que
continuar estudindolo a estos niveles. (El 90% de los compuestos
que dan positivo en el Test de Ames se ha demostrado que son
carcingenos).
Ulteriores mejoras en el test de Ames
En los ltimos aos esta prueba ha sido modificada para
mejorarla o adaptarla a situaciones especiales. Veamos algunas de
estas modificaciones:

uso de cepas de Salmonella defectivas en reparacin (uvrA
--
, uvrB
--
, uvrC
--
, etc). En estas cepas, cualquier dao al ADN no puede ser
corregido con total eficiencia. Esto hace que estas cepas sean ms
sensibles frente a sustancias con menor potencial carcinognico.

Muchos agentes son mutgenos en humanos slo tras su
activacin metablica por el hgado, pero son inactivas por s
mismas. Para detectar a estas sustancias, el test de Ames puede
modificarse incorporando un extracto microsomal estril (fraccin
libre de clulas de hgado animal o de cultivos de tejidos). El
extracto microsomal posee oxigenasas que originan epxidos a
partir de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de
tipo epxido los que verifican la accin mutagnica.

Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria
debido al efecto de barrera de la membrana externa de la pared
celular. Para solventar esto, se recurre a emplear mutantes LPS
--
de
Salmonella (o sea, mutantes alterados en el lipopolisacrido, LPS),
que facilitan la entrada de molculas hidrofbicas.
8 ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN
LABORATORIO
8.1 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN
LABORATORIO
8.1.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS
MORFOLGICOS DE LAS COLONIAS:
Los rasgos culturales de las bacterias son muy fciles de ver en
los cultivos en placas de Petri, por lo que igualmente es fcil
detectar cambios en los aspectos de las colonias que pudieran
deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir brevemente
tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:

colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo;
convexas obtusas (plano-convexas); superficie lisa y brillante; se
dispersan fcilmente en agua, dando suspensiones homogneas.

colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas
ms agudas; textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se
arrastra un moco).

colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o
festoneado; son planas; textura rugosa, y aspecto mate (no
brillante); no se dispersan bien en agua, dando grumos ms o
menos gruesos.
Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar
fenmenos de disociacin de tipos de colonias en cultivos, debido
a mutaciones que alteran molculas de las envueltas (p. ej., de la
membrana externa de las bacterias Gram-negativas, de la cpsula,
etc.). Veamos algunos ejemplos:

En algunas bacterias se puede observar una disociacin M S,
que se suele deber a la prdida de la capacidad de sintetizar
cpsula.

En algunas bacterias Gram-positivas la disociacin S R se debe
a prdida de la cpsula.

En bacterias Gram-negativas, las disociacin S R se debe a
menudo a la prdida de la capacidad de sintetizar las cadenas
laterales polisacardicas del LPS (antgeno somtico O).
Muchas de estas disociaciones tienen bastante inters clnico,
ya que en bacterias patgenas, el fenotipo mutado (sobre todo el
rugoso) implica la prdida de propiedades de virulencia y de
especificidad antignica.
8.1.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS
NUTRICIONALES
En estudios de gentica bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar
mapas genticos), es muy habitual recurrir al empleo de mutantes
auxotrficos (es decir, mutantes afectados en algn gen de alguna
ruta biosinttica -de aminocidos, bases nitrogenadas, vitaminas-).
Por supuesto, estos mutantes presentan inters por s mismos, ya que
su estudio permite diseccionar la base gentica de las vas
metablicas.
Veamos a continuacin un par de maneras de aislar y
seleccionar mutantantes bacterianos auxotrofos:
1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):
cultivo original tratar con mutgeno lavar siembra placas de
medio mnimo (MM)+ suplementos nutricionales rplica a MM
Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con
suplementos nutricionales) con las colonias que hayan aparecido en
la placa de rplica (carente de suplementos). La ausencia de colonia
en la placa de rplica en una posicin en la que existe colonia en la
placa-matriz incica que la colonia de la placa matriz que no tiene
gemela en la rplica es un mutante auxotrfico.
Una vez que sabemos que una colonia es un mutante
auxotrfico, hay que determinar qu requerimiento nutricional le
hace falta (es decir, qu compuesto o compuestos no puede sintetizar
debido a la mutacin). Para ello se realiza una sencilla prueba en
placas de Petri, denominada auxonograma.
Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente
mutagnico, la frecuencia de aparicin de un determinado fenotipo
mutante es relativamente baja. Esto significa que en el experimento
anterior, tendramos que sembrar y replicar numerosas placas con
grandes nmeros de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de
probabilidad para detectar mutaciones auxotrficas. Para solventar
este inconveniente, se suele recurrir a una modificacin del mtodo
anterior basada en enriquecer en mutantes auxotrofos el cultivo
tratado con el mutgeno:
2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de
mutantes auxotrficos (resumen de un protocolo):
cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)

tratamiento con el mutgeno

mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) +
bacterias vivas, entre ellas unos pocos mutantes de diversos tipos

el cultivo se transfiere a un medio lquido rico, para permitir la
recuperacin y la expresin fenotpica (lag fenotpico)

incubar unas cuantas horas

el cultivo se lava y se pasa a un medio lquido mnimo

aadir penicilina e incubar

la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no
mueren, porque no crecen en MM (muerte selectiva de los
parentales prototrofos)

plaquear en medio slido rico

hacer rplica a medio slido mmino

identificar los auxotrofos (no crecen en MM)

recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y
caracterizarlos (hacer auxonograma)
8.1.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS
Los mutantes resistentes a antibiticos surgen por varios tipos
de mecanismos, entre los que se encuentran:

alteracin de algn gen que codifica una diana (sitio de unin) del
antibitico;

alteracin de algn gen responsable de permeabilidad al
antibitico.
Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteracin
de receptores de la superficie celular, sobre los que se adsorben los
fagos.
Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para
marcar cepas bacterianas en experimentos de gentica
(especialmente los que implican algn proceso de transferencia de
material gentico desde una estirpe donadora a otra receptora). Estos
marcadores genticos permiten seleccionar directamente la cepa que
los porte aadiendo al medio de cultivo el correspondiente agente
selectivo (antibitico o fago), que obviamente mata o inhibe el
crecimiento de las cepas sensibles.
8.1.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE
AZCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGA
Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar
determinados sustratos, pero pueden recurrir a otros alternativos.
Para aislar estos mutantes se puede recurrir en muchos casos al uso
de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que
cambian de color en funcin del uso o no del sustrato en cuestin.
Por ejemplo: si quisiramos aislar mutantes Lac
--
de E. coli,
sembraramos en Agar Mac Conckey. Los mutantes Lac
--
dan
colonias transparentes, mientras que el fenotipo silvestre Lac
+
da
colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de sales biliares
(recordar el uso de este medio en las prcticas).
9 VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIN DE
PLSMIDOS
Como ya sabemos, los plsmidos son material gentico
extracromosmico que se replican independientemente del
cromosoma (replicones autnomos), y que no son indispensables
para la viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plsmidos
crpticos que no dan ningn fenotipo detectable (funcin
desconocida), pero existen muchos plsmidos que codifican
funciones como resistencia a antibiticos o a metales pesados,
virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrgeno
atmosfrico, etc.
Como es lgico, el material gentico plasmdico es susceptible
de experimentar mutaciones. Pero la posesin de plsmidos por
muchas bacterias puede condicionar otro tipo de variaciones
genotpicas heredables: la curacin, consistente en la prdida del
plsmido, lo que acarrea obviamente la prdida concomitante de las
funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se afecte la
viabilidad de la bacteria.
Mtodos de curacin de plsmidos:

Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas
a la temperatura mxima);

Tratamiento del cultivo con agentes qumicos que se intercalan en
el ADN, interfiriendo con la replicacin, estabilidad o reparto del
plsmido a las clulas hijas (bromuro de etido, naranja de acridina,
etc.).

Actualizado el mircoles, 15 febrero 2006
NDICE
1 INTRODUCCIN A LAS VARIACIONES POR CAMBIOS
EN EL GENOTIPO ASOCIADAS CON TRANSFERENCIA DE
MATERIAL GENTICO
2 RECOMBINACIN
2.1 CONCEPTOS GENERALES
2.2 RECOMBINACIN GENERAL U HOMLOGA
2.3 RECOMBINACIN ESPECFICA DE SITIO
CONSERVATIVA
2.3.1 INTEGRACIN DEL GENOMIO DEL FAGO EN EL
CROMOSOMA DE E. COLI
2.3.2 INVERSIN DE SEGMENTOS DE ADN POR
RECOMBINACIN ESPECFICA CONSERVATIVA
2.4 RECOMBINACIN ESPECFICA ILEGTIMA:
PROPICIADA POR ELEMENTOS GENTICOS
TRANSPONIBLES
2.4.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS
ELEMENTOS GENTICOS MVILES Y DE LA
TRANSPOSICIN EN LAS BACTERIAS
2.4.2 TIPOS DE ELEMENTOS GENTICOS
TRANSPONIBLES EN BACTERIAS
2.4.3 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA
TRANSPOSICION
2.4.4 REGULACION DE LA TRANSPOSICION Y POSIBLE
SIGNIFICADO EVOLUTIVO
2.4.5 CONSECUENCIAS GENTICAS DE LA
TRANSPOSICION
3 SISTEMAS DE RESTRICCIN Y MODIFICACIN
3.1 INTRODUCCION Y APROXIMACIN HISTRICA
3.2 SISTEMAS M-R DE TIPO I
3.3 SISTEMAS M-R DE TIPO II
4 TRANSFORMACIN
4.1 INTRODUCCIN A LA TRANSFORMACIN
(CONCEPTO Y APROXIMACIN HISTRICA)
4.2 TRANSFORMACIN NATURAL
4.2.1 CARACTERES GENERALES DE LA
TRANSFORMACIN NATURAL
4.2.2 TRANSFORMACIN EN BACTERIAS GRAM
POSITIVAS
4.2.2.1 EN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
4.2.2.1.1 DESARROLLO DE LA COMPETENCIA (Y
MODO DE UNIN DEL ADN A LA SUPERFICIE CELULAR)
4.2.2.1.2 ENTRADA DEL ADN Y FASE DE ECLIPSE
4.2.2.1.3 DESTINO DEL ADN DEL EXOGENOTE
4.2.2.2 EN BACILLUS SUBTILIS
4.2.2.2.1 DESARROLLO DE LA COMPETENCIA
4.2.2.2.2 ENTRADA DEL ADN Y FASE DE ECLIPSE
4.2.3 TRANSFORMACIN EN BACTERIAS GRAM
NEGATIVAS
4.2.3.1 TRANSFORMACIN EN HAEMOPHILUS Y
NEISSERIA
4.2.3.2 TRANSFORMACIN EN HELICOBACTER
4.2.4 SIGNIFICADO BIOLGICO DE LA
TRANSFORMACIN NATURAL
4.3 TRANSFECCIN
4.4 TRANSFORMACIN ARTIFICIAL
ENLACES

1 INTRODUCCIN A LAS VARIACIONES POR CAMBIOS
EN EL GENOTIPO ASOCIADAS CON TRANSFERENCIA
DE MATERIAL GENTICO
En la introduccin al captulo 15 ya realizamos un encuadre
general de los distintos tipos de variaciones genotpicas,
distinguiendo las que no implican transferencia de material gentico
(mutacin y curacin) de las que derivan de transferencia de ADN
entre bacterias. A partir de ahora nos vamos a ocupar de estas
ltimas.
Rasgos generales de la transferencia gentica en bacterias:

La transferencia es unidireccional, es decir, tiene una determinada
polaridad, existiendo clulas donadoras y clulas receptoras.

La transferencia del genomio de una clula a otra no suele ser
total, sino parcial.

Parte del material gentico, una vez introducido en la clula
receptora, sufre inmediatamente un fenmeno de recombinacin
con el genomio de la receptora. El resto del material de la
donadora o no se replica, o se ve destruido.

Como se puede deducir, tras los procesos de transferencia gentica
bacteriana, no surge una diploida total (como es el caso en
eucariotas), sino una diploida parcial, que recibe el nombre de
merodiploida. Las clulas bacterianas diploides parciales reciben
la denominacin de merodiploides o merozigotos. Adems, la
merodiploida suele ser transitoria.
Este tipo de intercambio gentico unidireccional, con diploida
transitoria parcial, se denomina meromixia, para distinguirlo de la
reproduccin sexual de eucariotas.

El genomio de la clula receptora se suele denominar endogenote.

La porcin de genomio de la cl. donadora que se transfiere se
llama exogenote.
Los procesos de transferencia gentica en bacterias son de tres
grandes tipos, ms una variante adicional de uno de ellos:

TRANSFORMACIN: captacin y asimilacin de ADN libre
(desnudo), a partir del medio, por parte de una clula receptora (lo
estudiaremos en la segunda parte de este captulo).

CONJUGACIN: transferencia directa de material gentico,
promovida por un plsmido, desde una clula donadora a otra
receptora, por medio de contactos ntimos entre ambas (puentes de
unin). Una variante de la conjugacin es la SEXDUCCIN: en
ella, un trozo definido de mat. gentico de la donadora es
transferido como parte de un plsmido conjugativo (cap. 18).

TRANSDUCCIN: el material gentico es transportado desde la
cl. donadora a la receptora por medio de un virus bacteriano (o
sea, un bacterifago o simplemente, fago), que acta como vector
(ver cap. 19).

Pero antes de abordar estos sistemas de transferencia gentica,
vamos a considerar el destino posible del material gentico
transferido por estos procesos (primera parte del presente tema).
Dejando aparte la posibilidad de que el material transferido sea por
s mismo un replicn, y por lo tanto, al llegar a la clula receptora
pueda replicarse y mantenerse por s mismo, el exogenote puede
sufrir dos destinos muy distintos:

Por un lado, puede verse implicado en un tipo de proceso de
recombinacin gentica, que lo incorpora de alguna forma al
endogenote.

Por otro lado, el exogenote puede ser reconocido como extrao
por parte de la clula receptora, en cuyo caso ser destruido.
2 RECOMBINACIN
2.1 CONCEPTOS GENERALES
La recombinacin es el proceso por el que la informacin
gentica se ve redistribuida, tras la transferencia del exogenote al
endogenote. La recombinacin permite barajar grandes conjuntos
de genes, suministrando una fuente de variacin y seleccin para la
evolucin, ms rpida que la mutacin.
En bacterias encontramos los siguientes tipos principales de
recombinacin:
1) Recombinacin general u homloga
2) Recombinacin especfica (no-homloga), en la que a su vez
distinguimos:
a) Rec. especfica legtima, conservativa;
b) Rec. especfica ilegtima, propiciada por elementos genticos
transponibles.
A continuacin, y antes de abordar cada tipo de
recombinacin, daremos las definiciones generales de cada uno de
estos procesos recombinativos:
Recombinacin general u homloga

Puede ocurrir en cualquier lugar del genomio, por emparejamiento
entre pares de secuencias que presenten una homologa
suficientemente extensa.

Depende de la intervencin de un equipo enzimtico caracterstico,
en el que la protena RecA (o equivalente) es central en el proceso.
Recombinacin especfica legtima (conservativa)

Requiere cortas secuencias de homologa entre el exogenote y el
endogenote (por eso se llama tambin especfica de sitio), que
son reconocidas por protenas especficas.

Es independiente de RecA.

Este tipo de recombinacin es tpica de la integracin de genomios
de fagos en sitios concretos del genomio de bacterias
hospedadoras.
Recombinacin especfica ilegtima: fenmenos de transposicin

No depende de homologas (ni siquiera cortas) entre el exogenote
(en este caso, un elemento gentico transponible, como IS o Tn) y
el endogenote.

Tambin es independiente de RecA.

El elemento transponible codifica una enzima (genricamente se
les denomina transposasas) que reconoce secuencias especficas
inversamente repetidas en los extremos del propio elemento, lo
cual se requiere para el proceso de transposicin.

Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un
mecanismo replicativo de transposicin: es decir, al transponerse
dejan una copia de s mismos en el sitio original, y generan una
copia nueva en el sitio a donde se transponen (recombinacin
especfica duplicativa).
2.2 RECOMBINACIN GENERAL U HOMLOGA
Anteriormente ya definimos sus caractersticas generales. A
continuacin vamos a describir un modelo molecular de esta
recombinacin, basado en el clsico de Meselson y Radding,
modificado con los ltimos avances. No se olvide que estamos ante
un modelo, es decir, una propuesta hipottica para explicar un
conjunto de datos experimentales. No todos los puntos de este
modelo estn totalmente aclarados o demostrados:
Supongamos que tenemos un exogenote y un endogenote,
ambos consistentes en dobles hlices. En los modelos de
recombinacin, al exogenote se le suele denominar como ADN
donador, y al endogenote como ADN receptor.
1) Inicio de la recombinacin: La recombinacin homloga
comienza con una incisin endonucleotdica en una de las
cadenas de la doble hlice donadora. La responsable de este
proceso es la nucleasa RecBCD (=nucleasa V), que acta de la
siguiente manera: se une aleatoriamente al ADN del donador, y se
va moviendo por la doble hlice hasta que encuentra una
secuencia caracterstica denominada _ (letra griega chi), que es
un punto caliente recombinativo(4[1]):
5' GCTGGTGG 3'
3' CGACCACC 5'
Una vez reconocida la secuencia, la nucleasa RecBCD corta a 4-6
bases a la derecha (lado 3') de la cadena superior (tal como las
hemos escrito arriba). Entonces, esta misma protena, actuando
ahora como una helicasa, va desenrollando la cadena cortada,
haciendo que se desplace una zona de ADN de cadena sencilla
(ADN c.s.) con su extremo 3 libre
2) El hueco que ha dejado la porcin desplazada de la cadena
cortada del donador es rellenado mediante sntesis reparativa de
ADN.
3) La zona de cadena sencilla desplazada del ADN donador es
recubierta por subunidades de la protena RecA (a razn de un
monmero de RecA por cada 5-10 bases). De este modo, esa
cadena sencilla adopta una configuracin helicoidal extendida.
4) Asimilacin o sinapsis: Este es el momento clave de actuacin
de la RecA. De alguna manera, la RecA unida al ADN c.s. del
donador facilita el encuentro de ste con la parte de doble hlice
complementaria del receptor, de modo que en principio se forma



una triple hlice. A continuacin, con la hidrlisis de ATP, la
RecA facilita que la cadena del donador desplace a la cadena
homloga del receptor, y por lo tanto se empareje con la
complementaria de ese receptor. En este proceso, la porcin de
cadena del receptor homloga del donador se ve desplazada,
originndose la llamada estructura en D.

Es importante resaltar que este proceso propiciado por RecA
depende de que el donador y el receptor presenten gran
homologa de secuencia (del 100 al 95%), y de que estos
segmentos de homologa tengan ms de 100 bases de longitud.

Observar que esta sinapsis implica la formacin de una porcin de
heterodplex en la doble hlice receptora: hay una zona en la
que cada cadena procede de un ADN c.d. parental distinto
(donador y receptor).
5) Se supone que la cadena recin desplazada del ADN receptor
(estructura en D) es digerida por nucleasas.
6) Unin covalente de los extremos originados en las dos cadenas
homlogas. Esto da como resultado un entrecruzamiento
simple por el que las dos dobles hlices se encuentran atadas.
La estructura global resultante se denomina estructura o juntura
de Holliday.
7) Migracin de las ramas: al punto de cruce de la estructura de
Holliday se une un complejo formado por las protenas RuvA y
RuvB, que con hidrlisis de ATP logran el desplazamiento del
punto de cruce de Hollyday: de esta forma se va agrandando la
porcin de heterodplex en ambas dobles hlices.
8) Isomerizacin: para visualizarla fcilmente, imaginar que
rotamos los dos segmentos de uno de los ADN c.d. 180
o
respecto
del punto de entrecruzamiento, para generar una estructura plana
que es ismera de la anterior (estructura en X).
9) Resolucin de esta estructura: este paso est catalizado por la
protena RuvC, que corta y empalma entre s dos de las cadenas
entrecruzadas en la juntura de Hollyday. El resultado de la
resolucin puede variar segn que se corten y empalmen las
cadenas que antes no participaron en el entrecruzamiento, o que
vuelvan a ser stas las implicadas en esta segunda operacin de
corte y sellado:
a) Si los cortes y empalmes afectan a las cadenas de ADN que
antes no participaron en en el entrecruzamiento, el resultado
ser dos molculas recombinantes recprocas, donde cada
una de las 4 cadenas son recombinantes (ha habido
intercambio de marcadores entre donador y receptor)
b) Si los cortes y empalmes afectan a las mismas cadenas que ya
haban participado en el primer entrecruzamiento, el resultado
consistir en dos dobles hlices que presentan solamente
sendas porciones de ADN heterodplex.
Este modelo, como dijimos es aplicable a bacterias. Sin
embargo, dejando aparte los aspectos enzimticos (protenas Rec y
Ruv), los aspectos mecnicos (principalmente los requerimientos de
grandes zonas de homologa, sinapsis, estructuras de Holliday,
formacin de heterodpex, etc.) son aplicables tambin a los
organismos superiores (quiz el alumno haya estudiado o estudiar
un modelo parecido en la asignatura de Gentica). De todas formas,
hay que volver a insistir en una notable diferencia entre la
recombinacin homloga de las bacterias y la de los organismos
superiores de reproduccin sexual: en las bacterias la recombinacin
afecta a porciones relativamente pequeas del genoma donador,
mientras que en los eucariotas cada cromosoma completo se
empareja con el homlogo (si bien slo se producen unos pocos
entrecruzamientos).
2.3 RECOMBINACIN ESPECFICA DE SITIO
CONSERVATIVA
Caracteres generales:

Es independiente de RecA (u otras enzimas de rec. homloga).

Es independiente de grandes regiones de homologa entre exo- y
endogenote.

El proceso est catalizado por enzimas especficas llamadas en
general recombinasas, que tienen un mecanismo de accin
similar al de las topoisomerasas de tipo I.

No hay replicacin de ADN durante el evento de recombinacin
especfica de sitio, por lo que tambin se la llama conservativa.
Estudiaremos dos ejemplos de esta clase de recombinacin: el
clsico caso de la integracin del genomio del fago en un punto
concreto del cromosoma de E. coli, y la variacin de fase flagelar
por inversin de un segmento de ADN de Salmonella typhimurium.
Existen otros elementos genticos que codifican integrasas: los
denominados integrones y algunas islas genmicas (ver captulo 7).
2.3.1 INTEGRACIN DEL GENOMIO DEL FAGO EN EL
CROMOSOMA DE E. COLI
Introduccin al concepto de fago moderado (avance de lo que
veremos en la seccin de Virologa):

Ciclo ltico (vegetativo) y ciclo lisognico.

En el estado lisognico, el ADN de se integra en el cromosoma
de E. coli, y mantiene todas sus funciones lticas desconectadas.
En esta situacin se le llama profago, y se comporta como una
porcin normal del genomio de su hopedador. Eventualmente, el
profago puede inducirse, es decir, sus funciones lticas se activan:
el profago se escinde del cromosoma bacteriano, se circulariza y
conecta todos los genes cuya expresin conducir a la produccin
de muchas partculas del virus, que terminan lisando la clula, y
liberndose para reiniciar el proceso.

Observen las diferencias en el mapa del ADN del fago: cuando se
encuentra dentro de la partcula del virus (ADN c.d. lineal:
A.....attP....R), pero al entrar a la bacteria, se circulariza. Como
profago tambin es lineal, pero con un orden distinto al de la
partcula del fago antes de la infeccin (......A R........).
El paso del ADN del fago desde su forma circular (vegetativa)
a la forma de profago (ciclo lisognico) se debe a un fenmeno de
recombinacin especfica de sitio, en el que estn implicadas las
secuencias attP (del fago) y attB (de la bacteria). La zona attB est
situada entre los operones gal y bio del cromosoma de E. coli.
Cada una de las zonas att est compuesta de una secuencia
central (ncleo, O), de 15 p.b., y de dos regiones adyacentes,
llamadas brazos. Los ncleos de attP y de attB son exactamente
idnticos, mientras que los 4 brazos (los dos del fago, P y P', y los
dos de la bacteria, B y B') son diferentes del ncleo y diferentes
entre s.
El evento de integracin se puede representar as:
attP X attB attL + attR
Si atendemos a la nomenclatura a base de ncleos y brazos,
tenemos:
POP' X BOB' BOP' + POB'
Este proceso requiere la actuacin de dos tipos de protenas:

Int: la integrasa, codificada por el gen int del fago .

IHF (=factor de integracin del hospedador), codificado por dos
genes de la bacteria (himA, himD).
La escisin es, desde el punto de vista mecnico, la inversa
de la reaccin anterior para regenerar el ADN circular del fago,
mediante la recombinacin especfica:
attL X attR attP + attB
(BOP' X POB' POP' + BOB')
Ahora bien, para esta reaccin hace falta, aparte de las
protenas Int e IHF, una segunda protena producida por : protena
Xis (llamada tambin escisionasa). La razn de una protena
adicional para revertir el proceso de la integracin cobra su sentido
si pensamos en que la combinacin de brazos que rodea a los
ncleos es distinta en la integracin y en la escisin. La protena Xis
confiere la especificidad para reconocer las secuencias attL y attR.
Por lo dems el proceso de escisin implica un mecanismo similar al
de la integracin (que es lo que vamos a estudiar a continuacin).
Aspectos moleculares de la integracin del fago
Se reconocen cortas secuencias de homologa entre el ADN del
fago y de la bacteria: concretamente las zonas homlogas O tienen
solamente 15 p.b.
Se producen cortes especficos en cada una de las cadenas,
en posiciones equivalentes, de modo que quedan extremos
protuberantes 5' con 7 nucletidos en cadena sencilla.
La reaccin de la integrasa se parece a la de las topoisomerasas
de tipo I: rompe una cadena de ADN en cada uno de los sitios att,
manteniendo fijos los extremos recin cortados. La cadena intacta de
cada sitio att pasa a travs del hueco abierto. A continuacin, el
extremo 3' de un sitio att es unido al extremo 5' del otro sitio att. La
operacin que acabamos de describir se repite con las otras cadenas
que antes haban quedado intactas. Al igual que las topoisomerasas
de tipo I, la integrasa no requiere ATP, ya que la energa del enlace
fosfodister cortado se conserva en forma de enlace covalente entre
el extremo recin cortado y la propia enzima. Esta energa es la
que luego se emplea en la operacin de empalme (creacin de un
nuevo enlace fosfodister).
El proceso que hemos descrito ocurre por medio de una gran
partcula formada por muchas unidades de Int y de IHF (unas 70
copias de IHF y de 20-40 de Int). Esta partcula reconoce primero
el sitio attP (del fago), siempre que el ADN est superenrollado
negativamente. El ADN del fago de la zona attP se arrolla
alrededor de la partcula multiproteica, a la manera en la que se
empaqueta el ADN en los nucleosomas. Por esta razn, a esta
partcula que lleva arrollado el ADN del fago se la denomina
intasoma. Una vez que el attP ha establecido los contactos
especficos con las protenas Int e IHF del intasoma, ste captura a
la secuencia attB de la bacteria, haciendo que ambas att queden
perfectamente alineadas para proceder a la recombinacin
especfica.
2.3.2 INVERSIN DE SEGMENTOS DE ADN POR
RECOMBINACIN ESPECFICA CONSERVATIVA
(Nota aclaratoria: lo que vamos a describir a continuacin es
un proceso de recombinacin especfica dentro de un mismo
genomio. O sea, aqu no podemos hablar estrictamente de
exogenote ni endogenote, ya que no hay un fenmeno previo
de transferencia de ADN. Sin embargo, lo estudiamos en esta
seccin, ya que el mecanismo es del mismo tipo que el que
acabamos de ver para la integracin del fago ). Adems esta
inversin sirve como mecanismo de adaptacin al medio, ya
que permite la regulacin de ciertos genes bajo determinadas
condiciones.)
Desde hace tiempo se vena observando que ciertas
propiedades de algunas bacterias cambian su fenotipo con una
frecuencia varios rdenes de magnitud superior a la tasa de mutacin
espontnea. Adems, se da la circunstancia de que estos cambios son
tambin reversibles. Algunos ejemplos:

antigenicidad flagelar;

antigenicidad de pelos (fimbrias adhesivas);

adhesividad;

virulencia de ciertas cepas patgenas, etc.
Se ha visto que muchos de estos fenmenos de inestabilidad
fenotpica reversible se deben a un mecanismo de recombinacin
especfica de sitio, por el que un segmento definido de ADN
cambia su orientacin (o sea, se invierte respecto de su polaridad
anterior). Uno de los casos mejor estudiados es el de la transicin de
fase flagelar en Salmonella typhimurium:
Dado un clon original homogneo respecto del tipo de
flagelina, al cabo de poco tiempo de crecimiento, se puede observar
que se han producido dos subpoblaciones diferenciadas respecto del
tipo de flagelina:

subpoblacin con flagelos a base de flagelina H1;

subpoblacin con flagelos a base de flagelina H2.
Cada flagelina se produce por un gen distinto.
La transicin desde un tipo de flagelina al otro se da con alta
frecuencia (aprox. 10
--3
, frente a slo 10
--7
para la frecuencia de
mutacin espontnea). Veamos cmo ocurre:
El segmento invertible contiene el gen hin (que deriva su
nombre de H-inversion), el cual codifica una recombinasa especfica
(invertasa), que reconoce los terminales inversamente repetidos
(IR) de 14 pb que limitan a dicho segmento. El efecto de la enzima
es aproximar entre s a los dos IR, para luego efectuar los cortes y
empalmes especficos, actuando como una topoisomerasa de tipo I.
Otros ejemplos de inversin especfica de segmentos:

En ciertos fagos existe un segmento invertible de ADN, de modo
que en cierta orientacin el fago infecta a determinadas especies y
cepas bacterianas, mientras que la otra orientacin le suministra al
fago la capacidad de infectar otras cepas e incluso especies
distintas (ello se debe a que en cada orientacin el segmento
induce la sntesis de tipos distintos de fibras para adsorberse sobre
distintas bacterias) . Por ejemplo, el fago Mu: posee el segmento
G, invertible por el producto del gen gin; ello le permite cambiar
de bacteria hospedadora (puede cambiar de Escherichia coli a
Citrobacter); el fago P1: posee el segmento C, invertible por el
producto del gen cin. Los genes hin, gin, cin y otros estn
relacionados evolutivamente entre s y con otros genes
codificadores de recombinasas especficas, incluyendo las
resolvasas de algunos transposones (las resolvasas sern
estudiadas en el apartado sobre los elementos genticos
transponibles).

La sntesis de fimbrias adhesivas de ciertas cepas patgenas de
Escherichia coli viene regulada por una secuencia invertible.
Significado evolutivo del mecanismo de inversin especfica de
ADN:

Permite cambios adaptativos rpidos y reversibles ante posibles
cambios rpidos en determinadas condiciones del medio ambiente
que son importantes dentro del nicho ecolgico de la bacteria.

Algunas bacterias patgenas usan este sistema para escapar al
sistema inmunitario del hospedador al que parasitan. Por ejemplo,
la variacin de fase de fimbrias en Neisseria: en algunas
especies patgenas de este gnero (gonoco, p. ej.) existen varios
genes de pilina, cada uno capaz de codificar una pilina
antignicamente distinta de las dems. Cada clon de la bacteria
transcribe en cada momento solamente uno de estos genes,
permaneciendo los dems silenciosos. Pero con una elevada
frecuencia (10
--3
) se producen recombinaciones especficas entre
una copia silenciosa y la versin que hasta el momento estaba
activa. Esto hace que a partir de ahora sea la nueva versin la que
se exprese: da origen a una nueva pilina, para la que el sistema
inmune del hospedador no tiene anticuerpos, lo que da una ventaja
a la bacteria en su capacidad de patogenia.
2.4 RECOMBINACIN ESPECFICA ILEGTIMA:
PROPICIADA POR ELEMENTOS GENTICOS
TRANSPONIBLES
2.4.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS
ELEMENTOS GENTICOS MVILES Y DE LA
TRANSPOSICIN EN LAS BACTERIAS
Los elementos genticos transponibles saltan de un lugar a
otro de los genomas por un mecanismo de recombinacin no
homloga ilegtima, es decir, que no depende de homologas entre
el elemento y la zona de genomio a la que este elemento va a
transponerse (esta ltima se suele denominar secuencia diana).
En general, las enzimas que catalizan ese proceso se
denominan transposasas. La transposasa corta el ADN donador en
los extremos del elemento transponible, y luego los inserta en el
ADN diana, aunque los detalles varan entre las distintas clases de
elementos mviles. La mayor parte de los elementos transponibles
permanecen unidos durante el evento de transposicin a ADN
contiguo (es decir, nunca llegar a estar libres, sino permanecen
ligados por alguna de sus cadenas al ADN donador o al ADN diana).
Muchos elementos transponibles bacterianos tienen un
mecanismo replicativo: la transposicin se realiza por un tipo
especial de replicacin del elemento transponible, de modo que
queda una copia del mismo en la posicin original, mientras otra
copia se inserta en una nueva posicin, bien sea del mismo replicn,
bien sea de otro replicn distinto del original y presente en la misma
clula (p. ej., un plsmido). Por ello se habla en estos casos de
recombinacin ilegtima duplicativa. Pero tambin hay elementos
transponibles que siguen un modelo no duplicativo, a veces llamado
de cortar y pegar, porque el elemento se escinde de su localizacin
original y se inserta en una nueva.
Todos los elementos genticos transponibles poseen terminales
inversamente repetidos (IR), es decir, la secuencia de un extremo en
una cadena, leda en sentido 53 es idntica (o casi) a la
secuencia del otro extremo de la otra cadena, tambin leda en su
sentido 53.
Un rasgo general de la transposicin es que una vez acabada
sta, el elemento mvil aparece emparedado entre copias directas
de la secuencia diana. Ello se debe a que la transposicin implica la
duplicacin de dicha secuencia. Las secuencias diana suelen ser de
pocos pares de bases, y aunque dicha secuencia no suele ser
especfica (vara de un evento a otro de transposicin del mismo
elemento), cada elemento transponible suele conllevar la duplicacin
de secuencias de una longitud determinada (algunos elementos
tienen dianas de 4 pb., mientras otros las tienen de 9 pb, etc.).
Aunque el lugar de la transposicin no tiene especificidad de
secuencia diana, tampoco es un fenmeno aleatorio. Se sabe que
algunos transposones prefieren insertarse en sitios con determinadas
propiedades de ADN, como grado de superenrollamiento, de
metalicin, o susceptibilidad a la transcripcin.
2.4.2 TIPOS DE ELEMENTOS GENTICOS
TRANSPONIBLES EN BACTERIAS:
Secuencias de insercin (IS):

Son elementos pequeos (del orden de 1000 pb., o menos),
dotadas en sus extremos de terminales inversamente repetidos
(IR), de unos 15 a 25 pb.

Normalmente slo poseen un gen, que codifica la transposasa. Por
lo tanto, a diferencia de los transposones, no confieren fenotipo
seleccionable.

En los genomas de muchas bacterias existen varias copias de cada
tipo de IS. Por ejemplo, en Escherichia coli K12 existen unas 6
copias de IS1, 7 de IS2, etc. Los plsmidos, especialmente los
conjugativos suelen ser ricos en IS (un ejemplo de esto lo veremos
en el tema 18, cuando hablemos del plsmido F de E. coli).

La frecuencia de transposicin vara segn el tipo de IS, pero en
general oscila entre 10
--3
y 10
--4
por divisin celular. La insercin
de una IS en un gen concreto ocurre a una frecuencia de 10
--5
y 10
--
7
, es decir, del orden de la frecuencia de mutaciones espontneas
puntuales. La reversin de la insercin (por escisin exacta de la
IS) es menos frecuente: 10
--6
a 10
--10
por generacin.
Transposones (Tn):
Son elementos de mayor tamao que los IS (desde casi 3.000
pb hasta ms de 20.000 pb). Poseen al menos un gen para la
transposasa y un gen responsable de alguna funcin no relacionada
con la transposicin: concretamente, muchos transposones portan
genes cuya expresin da fenotipos fcilmente seleccionables o
detectables (p. ej.: resistencia a antibiticos o a metales pesados).
Estos genes marcadores son muy tiles, ya que facilitan
grandemente el estudio de estos transposones en laboratorio.
Dentro de los transposones bacterianos podemos distinguir dos
subtipos principales:

Transposones compuestos, cuyos extremos son dos secuencias de
insercin idnticas o casi idnticas. Dentro de esta clase, algunos
poseen las dos copias de IS en la misma orientacin, mientras que
otros las poseen en orientaciones opuestas; sin embargo, como a su
vez las IS poseen cortos terminales inversamente repetidos (IR),
todos los transposones citados tienen este tipo de secuencias IR. Se
comportan como las respectivas IS, que son las responsables de la
transposicin. Precisamente, la transposicin depende de una o de
ambas copias de la IS. En su mecanismo de transposicin pueden
dar, como productos finales, cointegrados de replicones y
transposiciones. Ejemplos:

Tn10: formado por dos IS10 casi idnticas, que emparedan a
un gen de resistencia a la tetraciclina (Tet
R
).

Tn5: dos copias casi idnticas de IS50 (de hecho, slo difieren en
un nucletido), que emparedan un gen de resistencia a
kanamicina (Km
R
) y un gen de resistencia a la estreptomicina
(Str
R
).

Tn9: dos copias idnticas y en la misma orientacin de la IS1,
enmarcando a un gen de resistencia a cloramfenicol (Cm
R
).

Transposones no compuestos: carecen de IS, y sus extremos son
dos cortas secuencias inversamente repetidas (IR). Llevan en su
porcin central un gen para la transposasa, y a veces tambin un
gen para la resolvasa y/o para la regulacin de la transposicin.
Suelen dar slo transposiciones, siendo los cointegrados
nicamente una fase transitoria que actan como intermediarios
del mecanismo de transposicin. Los cointegrados se deshacen (se
resuelven) por una resolvasa codificada por el mismo
transposn. Existen muchos ejemplos de este tipo, que se pueden
agrupar en familias que presentan un origen evolutivo comn:
Citaremos la denominada familia de TnA, que incluye Tn1
(Amp
R
), Tn3 (Amp
R
), Tn1000, etc. Los miembros de una misma
familia comparten el mismo tipo de sistema de
transposa/resolvasa, pero cada miembro puede contener genes de
resistencia (u otros) totalmente diferentes, que han debido de
aquirir independientemente a lo largo de la evolucin. Una clave
de cmo han podido adquirirlos la da una categora especial de
transposones, llamada integrones.

Integrones (In):
Los integrones son un nuevo tipo de
elementos transponibles dotados de terminales inversamente
repetidos (y a menudo con marcadores de resistencia a antibiticos o
a metales pesados) que se caracterizan por poseer un gen codificador
de una integrasa. Se transponen como una IS o un Tn, pero adems,
la integrasa les ha capacitado evolutivamente para realizar una
recombinacin especfica de sitio (al estilo de la Int del fago ) por
la que han incorporado a su estructura algn gen procedente de otro
elemento gentico. Los integrones pueden a su vez formar parte de
transposones mayores (p. ej., el Tn21 es un gran transposn que
codifica mltiples resistencias a antibiticos, y dentro de l se
encuentra el integrn In2, que contiene su propio gen int (integrasa),
que se sita al lado de un gen de resistencia a estreptomicina
capturado (por recombinacin especfica) de otro elemento
gentico (se ignora de dnde).
2.4.3 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA
TRANSPOSICION:

Las transposasas reconocen los terminales inversamente
repetidos del transposn, y cortan en los extremos (en este
sentido se dice que la transposicin es especfica, pero slo
respecto de las secuencias del elemento transponible).

Por otro lado, las transposasas cortan tambin en una
secuencia diana ms o menos aleatoria del sitio a donde se
van a transponer (inespecificidad respecto del
endogenote, por lo que se llama a esta recombinacin
ilegtima). Los cortes son en ambas cadenas, pero en
situaciones ligeramente separadas entre s en las dos
cadenas. Posteriormente hay empalmes entre las cadenas
cortadas del Tn y de la diana.

La transposicin duplicativa implica la replicacin de la corta
secuencia diana (dependiendo del transposn puede ser de
4 hasta 12 pb.) y la replicacin del propio transposn (por
ello se habla de recombinacin ilegtima duplicativa).

Al final de una transposicin duplicativa encontramos una
copia del Tn en el sitio original, y otra copia en el sitio
receptor, limitada por sendas repeticiones directas de la
corta secuencia diana (como acabamos de decir, una de
estas repeticiones surge por replicacin durante el proceso
de la transposicin).
Veamos un poco ms en detalle el mecanismo de transposicin de
un transposn tpico, el Tn3
Breve descripcin del Tn3: es un transposn de una 5 kb., cuyos
extremos son terminales inversamente repetidos de 38pb. Posee 3
genes, de los cuales dos estn implicados en la transposicin:


tnpA: codifica la transposasa (enzima de recombinac. ilegtima,
propia de este Tn).

tnpR: codifica la resolvasa (enzima de tipo recombinasa especfica
de sitio-conservativa, parecida a las que hemos estudiado en el
apartado 2.3). Como veremos, la resolvasa acta tambin como
reguladora de la transposicin).

bla: codifica una |-lactamasa (responsable del rasgo fenotpico
Amp
R
de resistencia a la ampicilina conferido por este
transposn).

Observar que, adems, existe una secuencia no codificadora,
llamada res (=IRS), que como veremos, interviene durante la fase
de resolucin de los cointegrados.
Modelo de transposicin de Tn3: ocurre en dos etapas:
1) Formacin de un cointegrado entre el replicn donador y el
replicn receptor, reaccin que depende de la transposasa. En ms
detalle:
a) la transposasa reconoce los terminales IR del Tn3, y realiza dos
cortes, uno en cada cadena, pero cada corte en un extremo
distinto;
b) la transposasa corta en el ADN diana, en cada cadena, en
posiciones separadas por unos pocos nucletidos;
c) cada extremo protuberante de la secuencia diana se une a un
terminal cortado del Tn3. Observar que en este momento
tenemos una estructura en X, pero con mellas de cadena
sencilla a ambos lados del Tn, correspondientes cada zona de
cadena sencilla a una de las hebras de la corta secuencia diana.
d) El extremo 3' que hay delante de cada mella sirve ahora como
cebador para un proceso de sntesis reparativa de ADN. As
pues, a partir de cada mella surge una horquilla de
replicacin, que avanza hacia el interior del transposn, hasta
llegar al otro extremo. cuando cada onda replicativa llega hasta
el extremo opuesto, se detiene, y vuelve a intervenir una
actividad ligasa que sella las cadenas.
e) El resultado final es un cointegrado, en el que los dos
replicones originales estn unidos a travs de dos copias
directas (en la misma orientacin) del transposn.
2) Resolucin del cointegrado: la resolvasa especfica
del transposn reconoce las dos secuencias res (una
por cada copia del Tn3), y realiza una reaccin de
recombinacin especfica conservativa, anloga a la
reaccin de escisin del fago . El resultado de esta
accin es que se regenera el replicn donador, con
una copia del Tn3, y aparece una nueva copia del
Tn3 en el replicn receptor, limitada por dos copias en la
misma orientacin de la secuencia diana. Observar que cada
copia del transposn es en realidad un mosaico: debido al
fenmeno de resolucin, cada cadena de cada copia consta de una
porcin de ADN de nueva sntesis, generada en el paso de
formacin de cointegrado. Es decir, no existe una copia vieja en
el lugar original y una copia nueva en el nuevo, sino que las dos
copias tienen partes parentales y de nueva sntesis en cada
cadena.
2.4.4 REGULACION DE LA TRANSPOSICION Y POSIBLE
SIGNIFICADO EVOLUTIVO
Muchos transposones, una vez que se han integrado en un
replicn, no pueden insertarse de nuevo en ese mismo replicn, sino
que han de hacerlo en otra molcula de ADN. Esto se debe a que
poseen mecanismos que impiden que el elemento transponible sature
de inserciones una misma molcula de ADN. Ejemplos:

la protena codificada por el gen tnpR del Tn3, adems de actuar
como resolvasa, interviene como represor del gen tnpA (que
codifica la resolvasa), y de su propio gen.

Algunos transposones, como Tn10, slo se transponen
inmediatamente despus de que haya pasado por ellos la horquilla
de replicacin. En esta situacin transitoria, el ADN del elemento
se encuentra hemimetilado, y al parecer es esta condicin la que
activa el promotor de su transposasa as como a sus terminales.
En general, los transposones se pueden considerar como
ejemplos de lo que se ha dado en llamar ADN egosta: porciones
de material gentico cuyo aparente nico objetivo es perpetuarse
en la clula por medio de su capacidad de crear copias transponibles
de s mismo, aunque no estn sometidos a presin selectiva directa
por parte del medio ambiente. Sin embargo, si los transposones
fueran demasiado egostas, podran llegar a saturar de sus copias
al genomio hospedador, llegando a inactivarlo. Parece ser que la
evolucin ha llegado a una especie de solucin de compromiso
entre la tendencia del transposn de moverse ilimitadamente (lo
cual provocara inactivacin insercional de numerosos genes), y la
necesidad de conservar la integridad de las funciones de la bacteria.
Esto se traduce precisamente en la existencia de distintos
mecanismos que limitan el nmero de inserciones de un mismo
elemento transponible dentro de un determinado replicn.
2.4.5 CONSECUENCIAS GENTICAS DE LA
TRANSPOSICION
Los transposones y secuencias de insercin causan una amplia
gama de alteraciones genticas que pueden a su vez ser fuente de
variabilidad gentica sobre la que pueden actuar las fuerzas
selectivas del ambiente, para alimentar los procesos evolutivos.0
Veamos algunas de las alteraciones genticas propiciadas por
elementos genticos mviles:
1) La ms obvia e inmediata es la inactivacin insercional de un
gen donde se hayan transpuesto: rompen la continuidad del gen,
generando mutaciones que inactivan la funcin de dicho gen. Si
el gen forma parte de un opern policistrnico, la mutacin tiene
efectos polares sobre la transcripcin de los genes distales del
opern, debido a que el elemento transponible suministra de
zonas susceptibles de generar horquillas en el ARNm que actan
como terminadores de transcripcin dependientes de . La
insercin de un elemento transponible en un gen u otra zona de
material gentico se representa indicando el nombre del
transposn, seguido de ::, y finalizando con el nombre del gen o
de la zona de ADN. Ejemplo, si una copia de IS1 se ha insertado
en el gen lacZ, esto se representa como IS1::lacZ.
2) Algunas secuencias IS (p. ej., IS2, IS3), y algunos transposones
(como Tn5 y Tn10) en una de sus orientaciones, pueden activar la
expresin de genes adyacentes al sitio de integracin. Esto se
debe a que estos elementos transponibles poseen potentes
promotores que propician transcripcin hacia fuera respecto del
propio elemento.
3) Algunos transposones e IS sufren escisiones anmalas que
arrastran consigo material gentico adyacente: esto provoca
grandes delecciones en los replicones donde previamente se
haban insertado.
4) Los Tn e IS pueden actuar como regiones porttiles de
homologa:
a) por ejemplo, dos transposones idnticos, situados en lugares
diferentes del cromosoma, pueden recombinarse por medio de
la enzima RecA de la recombinacin general, dando lugar a
inversiones del material intercalado (situado entre los dos
elementos).
b) Otro caso: dos transposones idnticos, cada uno situado en un
replicn distinto, pueden recombinarse por RecA, dando
fusin de replicones. Precisamente esta es la base de la
produccin de cepas Hfr a partir de las cepas F
+
: como
veremos en el tema de conjugacin, tanto el plsmido F como
el cromosoma poseen copias de determinadas IS; dichas copias
son reconocidas con cierta frecuencia por el sistema de
recombinacin homloga, que las recombina (recombinacin
con un solo crossing-over), lo cual lleva a la fusin del
plsmido F con el cromosoma bacteriano.
5) Produccin evolutiva de transposones complejos a partir de
IS o de transposones ms sencillos. Imaginen un gen que
codifique una resistencia a algn antibitico; supongamos que un
determinado IS se inserta en las cercanas de este gen. Pasado el
tiempo, puede ocurrir que otra copia de esa secuencia IS se
inserte cerca de ese gen, pero por el otro flanco. Observen que
ahora tenemos un transposn compuesto (de los que tienen
extremos que son IS). Este nuevo transposn se comporta como
una unidad, usando las funciones de transposicin de uno de los
IS. Esta es precisamente una de las bases genticas que explican
la aparicin y diseminacin de cepas bacterianas resistentes a
antibiticos: desde que el hombre inaugur la era de los
quimioterpicos a mediados de este siglo, estamos asistiendo a un
autntico proceso de evolucin rpida de transposones complejos,
algunos de los cuales portan varios genes de resistencia (frente a
varios antibiticos). Los transposones pueden pasar a gran
variedad de replicones, incluyendo plsmidos conjugativos, que
van diseminando al transposn por gran variedad de cepas
bacterianas, incluidas patgenas. Como se puede imaginar, esto
constituye un problema de primer orden, ya que puede limitar e
incluso impedir una adecuada terapia por antibiticos en
numerosas infecciones bacterianas. En el tema 18 hablaremos
ms sobre los plsmidos de resistencia (plsmidos R) y sobre su
carcter modular, es decir, el hecho de que en buena parte estn
cosntruidos a base de mdulos o cassettes formados por
transposones, IS, transposones anidados (un transposn dentro de
otro), etc. Como ya dijimos en el tema 7, aunque los genomas son
relativamente estables, la presencia de diversos y variados
elementos genticos transponibles permite un tipo de
flexibilidad por la que, de vez en cuando se producen nuevas
variantes por fusin o agregacin de elementos. Es como si los
genomas jugaran al Lego ensamblando nuevos mdulos a partir
de otros, y seguramente este es el origen de algunas de las islas
genmicas, que como vimos, dotan de ciertas ventajas adaptativas
a las poblaciones bacterianas que las poseen (patogenicidad,
simbiosis,etc.). En los plsmidos de resistencia a antibiticos es
frecuente encontrar casos en los que existe un enorme mdulo
gentico parecido a un gran transposn, que a su vez alberga
dentro transposones ms sencillos y secuencias de insercin.
3 SISTEMAS DE RESTRICCIN Y MODIFICACIN
3.1 INTRODUCCION Y APROXIMACIN HISTRICA
En la introduccin a este captulo ya aludimos a los varios
destinos que puede experimentar el material gentico del exogenote
una vez que entra al endogenote:

si el exogenote es un replicn funcional (que posee un origen de
replicacin capaz de ser reconocido por la maquinaria replicativa
de la clula receptora), este exogenote permanece como tal
replicn en estado autnomo (por ejemplo, plsmidos).

El exogenote puede recombinarse con el endogote, mediante
algunos de los procesos recombinativos descritos en la primera
parte de este tema.

Pero el exogenote puede sufrir otra alternativa: puede ser
reconocido como extrao por parte de la clula
hospedadora, por medio de un fenmeno enzimtico llamado
restriccin, que conduce a la destruccin de este exogenote. Este
va a ser el objeto de estudio de esta seccin del tema.
La restriccin es un sistema que poseen muchas cepas
bacterianas, y representa una especie de barrera frente a la
permanencia de ADN extrao que hubiera podido entrar por alguno
de los sistemas que estudiaremos en los captulos siguientes. De esta
forma, las bacterias evitan la promiscuidad en los intercambios
genticos. El posible significado adaptativo de este tipo de sistemas
es el de conferir inmunidad frente a exogenotes (por ejemplo,
fagos) que pudieran poner en peligro la individualidad gentica e
incluso la superviviencia de la bacteria en cuestin.
La restriccin va asociada a un sistema paralelo de
salvaguardia del ADN de la bacteria frente al propio sistema de
restriccin. Este sistema de proteccin del ADN propio se denomina
modificacin, y mediante l, el ADN queda marcado
qumicamente por metilacin de determinadas secuencias.
La restriccin y modificacin fue descubierta en 1968, a
resultas de una serie de estudios sobre la infeccin del fago en dos
cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas K12 y
B):
Observar que los fagos obtenidos por infeccin en
cada una de las cepas estn restringidos a crecer en el
mismo tipo de cepa del cual proceden.
Ahora bien, como se puede ver, cuando se intenta infectar una
cepa con fagos obtenidos a partir de la otra cepa, la restriccin no es
total: siempre hay un pequeo porcentaje (del orden de 1 en 10 000)
de fagos que escapan, y que despus de esto pueden crecer en la
otra cepa con eficiencia de 100%. Explicacin:

Cada cepa posee una actividad endonucleasa que reconoce como
extrao al ADN del fago crecido en la otra, y lo destruye. A este
tipo de endonucleasas se las denomina endonucleasas de
restriccin, o ms abreviadamente, restrictasas.

Con baja frecuencia, el ADN de un fago puede escapar a la
restriccin de la cepa opuesta a donde ha crecido. Una vez que ha
escapado, este ADN es reconocido como propio por parte de
esta cepa, de modo que este fago podr crecer con total eficiencia
(100%) en dicha cepa. La razn es que el ADN es modificado
qumicamente por el hospedador, de modo que queda protegido de
la correspondiente restrictasa de esa misma cepa. La modificacin
qumica consiste en la introduccin de grupos metilo (CH
3
-) en
determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN,
lo cual est catalizado por una metilasa especfica.
Se han descrito varios tipos distintos de sistemas de
modificacin-restriccin (M-R), segn sus mecanismos de accin
generales, pero nosotros slo trataremos los dos mejor concocidos:
M-R tipo I, tipo II.
3.2 SISTEMAS M-R DE TIPO I
Fueron los primeros en ser descritos. Precisamente el ejemplo
tpico lo constituye el caso al que acabamos de hacer referencia en la
pgina anterior. La cepa K12 de E. coli posee el sistema llamado
EcoK, y la cepa B posee el llamado EcoB. Lo caracterstico de los
sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificacacin y
las de restriccin estn producidas por un complejo multiproteico
(multimrico), que realiza los dos tipos de actividades. Ejemplo:
Complejo de EcoK posee 2 subunidades R (con actividad nucleasa
de restriccin), 2 subunidades M (con actividad de metilacin)y 1
subunidad S (confiere especificidad de reconocimiento de secuencia
al complejo).

Reconocen secuencias relativamente grandes, que no presentan
simetras.

La actividad endonucleasa (de las subunidades R) no corta dentro
de la secuencia reconocida, sino lejos de ella, a distancias
variables (del orden de unos 1000 pb., y en lugares inespecficos.

Por otro lado, la actividad nucleasa va acompaada de hidrlisis
de ATP

La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-
metionina (SAM) como donador de los grupos metilo.
Veamos en ms detalle el comportamiento del complejo del
complejo EcoB. Observen que el complejo se comporta de modo
diferente segn que acte sobre ADN de tipo parental previamente
metilado en ambos cadenas, o de que acte sobre ADN
hemimetilado (situacin que se produce inmediatamente despus de
la replicacin), o sobre ADN no metilado en la secuencia-diana (que
sera reconocido como extrao):

sobre ADN metilado: es reconocido como propio (merced a la
subunidad S); no sufre ninguna reaccin por parte de EcoB.

sobre ADN hemimetilado: las subunidades M metilan la cadena
no metilada (cadena hija de nueva sntesis).

sobre ADN no metilado: es reconocido como extrao.
Interviene la actividad restrictasa, con hidrlisis de ATP. El ADN
es destruido.
3.3 SISTEMAS M-R DE TIPO II
Observen las diferencias con respecto a los de tipo I:

Las actividades metilasa y restrictasa estn en protenas distintas
que no forman complejos multifuncionales.

No requieren ATP. Slo necesitan iones Mg
2+
para funcionar. La
metilasa, adems, usa SAM como donador de metilos.

Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce
la misma secuencia especfica de ADN.

La secuencia reconocida consiste siempre en un corto nmero de
pares de bases. Tpicamente consta de 4 o 6 p.b.(5[2]) que
constituyen una secuencia palindrmica o con una simetra
patente.

La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce
grupos metilo en una A o en una G (segn la metilasa en cuestin),



en ambas cadenas, dentro de la secuencia reconocida.

La restrictasa suele ser una protena formada por dos subunidades
del mismo tipo, ensambladas simtricamente. Muchas restrictasas
cortan dentro de la secuencia, dejando extremos protuberantes
mutuamente cohesivos, o extremos romos (segn la restrictasa en
cuestin). Algunas restrictasas dejan extremos protuberantes 5',
mientras que otras dejan extremos protuberantes 3'.

El sistema de restriccin-
modificacin EcoRI: tanto la
restrictasa como la metilasa de
este sistema reconocen la
misma secuencia
palindrmica. En a) se muestra
dnde corta la restrictasa en
cada una de las cadenas. En
este caso se generan extremos
protuberantes en 5 (de cuatro
bases). En b) se muestran las
dos adeninas (una por cadena)
que son metiladas dentro de la
secuencia reconocida por la
enzima modificante.
El mecanismo general de las restrictasas de tipo II es ms
sencillo que las de tipo I: cada subunidad del dmero reconoce la
misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del
palndromo, y realiza un corte en un lugar especfico, que
obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra
mitad del palndromo.
Existen cientos de restrictasas de tipo II (y se estn
descubriendo continuamente). Ms de la tercera parte de las cepas
bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas
de ellas son codificadas a partir de genes situados en plsmidos.
Se habla de isosquizmeros para referirse a aquellas
restrictasas que, siendo diferentes y procediendo de especies
distintas, reconocen y cortan la misma secuencia, dejando el
mismo tipo de extremos.
Las restrictasas de los sistemas de tipo II se nombran de modo
mnemotcnico a partir de la cepa de origen, usando las iniciales de
la especie de la que derivan. Por ejemplo, la llamada EcoRI procede
de cierta cepa de Escherichia coli. Si una cepa posee ms de un
sistema, a las iniciales se aaden nmeros romanos. Ejemplo, de
Haemophilus influenzae tenemos los sistemas HindII y HindIII.
No hace falta insistir en la importancia prctica de las restrictas
de tipo II, como herramientas bsicas -junto con la ADN ligasa- en
la Ingeniera Gentica. El bilogo cuenta con un impresionante
arsenal -comercializado- de enzimas (no slo las que acabamos de
citar) para manipular a placer el ADN de cualquier ser vivo...(pero
esta es ya otra historia, que el alumno interesado ir conociendo en
esta y en otras asignaturas).
4 TRANSFORMACIN
4.1 INTRODUCCIN A LA TRANSFORMACIN
(CONCEPTO Y APROXIMACIN HISTRICA)
La transformacin se puede definir como la variacin
hereditaria de una clula bacteriana susceptible, originada por la
captacin de ADN desnudo libre en el medio, con la posterior
recombinacin del exogenote con el genomio de la clula en
cuestin (endogenote). Tras la transformacin, la clula que ha
recibido el ADN se suele denominar transformante.
Recordemos brevemente los hitos histricos que jalonan el
descubrimiento de la transformacin en bacterias:

La transformacin fue el primer proceso de transferencia gentica
que se describi en los procariotas, y este hallazgo constituy la
base para suministrar el primer dato incontrovertible acerca de la
naturaleza qumica del material gentico: a partir de 1944 empez
a quedar claro que era el ADN el portador de la informacin
gentica de los seres vivos.

Todo comenz con los trabajos de Griffith (1928) sobre el
neumococo. Recurdense sus clsicos experimentos con las cepas
S (lisas, capsuladas y virulentas) y R (rugosas, no capsuladas y
avirulentas), inoculadas en ratones:

cepas S vivas inoculadas en ratones ratn muere

cepas R vivas inoculadas en ratones ratn vive

cepas S muertas por calor ratn vive

cepas S muertas por calor + R vivas ratn muere. La autopsia
revela la presencia de neumococos vivos virulentos (tipo S).

Ni Griffith ni los investigadores de la poca se dieron cuenta de la
importancia de este resultado, ni sacaron la conclusin pertinente:
que una sustancia que confiere una nueva propiedad heredable a
un organismo (la sustancia transformante procedente de las S
muertas y que captan las R vivas) debe a su vez ser capaz de
replicacin. (De hecho, y aunque ahora nos parezca mentira,
Griffith pensaba que el principio transformante era el polisacrido
capsular de las cepas S, ausente en las cepas R).

En 1944 el equipo formado por Avery, MacLeod y McCarty
descubri la naturaleza del misterioso principio transformante:
el cido desoxirribonucleico (ADN). Ellos lograron desarrollar un
sistema in vitro, en el que iban ensayando diversas fracciones (con
diferentes componentes) procedentes de las clulas S virulentas
frente a clulas R vivas. (A pesar de los elegante experimentos, la
comunidad cientfica no los acept inmediatamente (6[3]), en parte
debido a que se supona ms lgico que el material de la herencia
fuera algn tipo de protenas. Al fin y al cabo, las protenas tienen
una enorme variedad, a base de 20 tipos de aminocidos. Qu



diablos poda significar que el ADN fuera el material gentico,
cuando se saba que era una molcula montona e insulsa a base
de slo cuatro tipos de bases nitrogenadas en proporciones casi
semejantes?).

El siguiente paso importante sobre la transformacin lo da
Hotchiss (1949), que realiza ensayos in vitro al estilo de los de
Avery y compaa, pero con ADN extremadamente puro. Los
remisos contestatarios no tuvieron ms remedio que empezar a
batirse en retirada. Como sabemos, los ltimos incrdulos (que en
los aos 40 eran la mayora) slo se convirtieron (tras el
correspondiente arrepentimiento y propsito de enmienda) cuando
Hershey y Chase (1952) realizaron sus ingeniosos experimentos de
marcado del ADN y de las protenas de un fago. Poco ms tarde
irrumpieron Watson y Crick con su modelo de la doble hlice, que
sugera el modo de duplicacin de la informacin gentica ...pero
en fin, todo esto nos aleja de nuestra historia, y no queremos
convertir nuestra narracin en un caso de novela dentro de otra
novela, al estilo de Cervantes.
4.2 TRANSFORMACIN NATURAL
4.2.1 CARACTERES GENERALES DE LA
TRANSFORMACIN NATURAL
1. El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de ser de cadena
doble.
2. Para cada evento de transformacin basta la interaccin de una
sola molcula de ADN con la clula receptora. Por otro lado, el
nmero de molculas de ADN que puede tomar una misma clula es
limitado, y presenta una cintica de saturacin (meseta que indica
que ya no se pueden captar ms molculas). Observen la cintica de
orden 1 en la primera parte de la curva. A partir de cierta
concentracin de ADN transformante, se da la meseta de saturacin
(no aumenta el n de colonias transformadas).
3. No todas las clulas de un mismo cultivo son transformables en
cualquier momento del ciclo de crecimiento. La competencia es
el estado fisiolgico caracterstico que permite captar ADN
del medio exterior. Este estado de competencia es diferente para
cada especie bacteriana capaz de experimentar transformacin, y
dentro de cada especie est influido por una serie de parmetros
como:

densidad celular del cultivo

temperatura

pH

nutrientes (fuentes de C o de N, iones...)
Ejemplos:

En Streptococcus pneumoniae la competencia afecta al 100%
de las clulas en fase exponencial.

En cambio, en Bacillus subtilis solamente una minora (1-20%)
de clulas se hacen competentes, y slo durante la fase
estacionaria.
4. Se denomina fase de eclipse durante la transformacin al perodo
transitorio durante el cual, si se extrae el ADN recin entrado
(exogenote), este ADN es incapaz de volver a transformar. Es
decir, tras su entrada a la clula receptora, el ADN del exogenote
parece haber desaparecido transitoriamente a efectos de
capacidad transformadora (ya veremos por qu).
En la transformacin natural de diversas especies bacterianas se dan
una serie de fases comunes a todas ellas, aunque en cada caso
existen rasgos propios:
1. Competencia
2. Unin y entrada del ADN exgeno a la clula
3. Fase de eclipse
4. Destino del ADN exgeno (exogenote): recombinacin con el
endogenote.
En la naturaleza, la fuente de ADN exgeno suele ser la lisis
espontnea de clulas de la misma especie, que actan como
donadoras (una especie de inmolacin o suicidio altruista, para
mayor gloria -o sea, para mayor superviviencia- de la especie). En
otros casos no hay lisis, sino que parte de la poblacin bacteriana
extruye ADN, que pasa al medio.
Existen varios gneros con especies que poseen sistemas naturales
de transformacin:

Entre las bacterias Gram positivas los ejemplos ms estudiados
son los de:

Streptococcus

Bacillus

Entre las bacterias Gram negativas:

Haemophilus

Neisseria

Moraxella

Acinetobacter

Azotobacter

Pseudomonas

Cianobacterias del gn. Synechococcus
A continuacin describiremos algunos de los sistemas de
transformacin mejor conocidos. Primero abordaremos los de
bacterias Gram positivas, y posteriormente aludiremos ms
brevemente a los de Gram negativas, comentando las diferencias de
stas respecto de las primeras.
4.2.2 TRANSFORMACIN EN BACTERIAS GRAM
POSITIVAS:
Los sistemas de estas bacterias Gram positivas son
inespecficos respecto de la captacin de ADN exgeno: no
distinguen entre ADN homlogo (de la misma especie) o ADN
heterlogo (de otras especies). Sin embargo, aunque fsicamente
puede entrar ADN heterlogo, ste se recombina posteriormente con
el endogenote slo en el caso de presentar con l un grado de
homologa suficientemente alto. nicamente se recombinan
molculas de ADN de la misma especie (o en algunos casos, de
especies muy cercanas).
Veamos comparativamente los procesos de transformacin en el
neumococo (S. pneumoniae) y en B. subtilis:
4.2.2.1 EN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
4.2.2.1.1 DESARROLLO DE LA COMPETENCIA (Y MODO
DE UNIN DEL ADN A LA SUPERFICIE CELULAR)
Como dijimos, el estado de competencia se encuentra condicionado
por una serie de factores, como densidad celular, temperatura, pH,
etc.
En esta bacteria la competencia surge de repente al final del
periodo de crecimiento exponencial (fase logartmica), afectando
prcticamente a la totalidad de las clulas del cultivo (100% de
clulas competentes), se mantiene durante solo 10-15 min y luego
decae tan rpidamente como haba surgido.

Conforme las clulas van creciendo (se van multiplicando), van
sintetizando y excretando al medio un pptido especfico de 17
aminocidos llamado CSP (iniciales de pptido estimulador de la
competencia)

El pptido CSP se sintetiza a partir de un precursor (ComC),
procesado por un sistema de transportador ABC y de proteasa
(ComA y ComB).

Al llegar a cierta concentracin extracelular, el CSP se une a un
histidn-proten-quinasa sensora de membrana (ComD), que tras
autofosforilarse fosforila al regulador de respuesta (ComE).

La protena ComE~P activa la transcripcin de varios operones:

opern comCDE. Por lo tanto, esto supone un circuito
autocataltico, que explica la acumulacin de CSP y el desarrollo
sincrnico de la competencia en todo el cultivo

operones de competencia

y de un gen para una subunidad especializada (llamada ComX).

La ARN-polimerasa provista de ComX transcribe una serie de
operones tardos de competencia, que codifican la maquinaria para
la captacin del ADN exgeno y su entrada y recombinacin.

La ARN-polimerasa provista de ComX reconoce esos operones a
travs de unas secuencias denominadas cajas cin. Conservadas
en la zona reguladora de los operones com tardos.

Probablemente, el ADN de cd llega a una protena parecida a la
ComEA de B. subtilis con lo que se inicia la translocacin a
travs de la membrana.
4.2.2.1.2 ENTRADA DEL ADN Y
FASE DE ECLIPSE
La fase de eclipse se pone de
manifiesto en el laboratorio por el hecho de
que el ADN exgeno se convierte a una
forma resistente a la DNasa. Esto
significa que este ADN ha sido
transportado desde el medio externo al
interior celular (o al menos a algn
compartimiento donde se ve protegido
del ataque de la nucleasa).

Hay una actividad endonucleasa (EndA) especfica de la
competencia, que introduce primero cortes en una hebra y luego en
ambas. Esto suministra extremos libres de ADN. Una de las
cadenas entra al citoplasma, probablemente unida por su extremo
3 con una protena. La otra cadena es degradada hasta
oligonucletidos.

Conforme va entrando, la cadena (de unas 6.000 bases por trmino
medio) va siendo recubierta por monmeros (de unos 20 kDa) de
una protena especfica, hasta formarse el complejo de eclipse
(entre ese ADN de c.s. y las protenas). Dicho complejo cumple
dos funciones:

protege al exogenote del ataque de las nucleasas citoplsmicas;

prepara al exogenote para la ulterior fase de recombinacin.
(Si utilizramos este ADN de c.s. del complejo de eclipse para
intentar una nueva transformacin, no podra ser reconocido
por el complejo receptor que describimos anteriormente. Esta
es la razn de la existencia de lo que hemos denominado
perodo de eclipse).
En cada clula receptora pueden entrar al mismo tiempo varios
fragmentos de exogenote, que conjuntamente pueden
representar hasta el 5% del genoma.
4.2.2.1.3 DESTINO DEL ADN DEL EXOGENOTE
Se da una recombinacin homloga (dependiente de RecA, que
previamente haba sido inducida por la competencia) de la cadena
sencilla del exogenote con la zona complementaria del endogenote,
previo desplazamiento y ulterior degradacin de la cadena homloga
de ste. Esta recombinacin homloga es muy eficiente (un 50% del
ADN transportado se integra, y puede afectar hasta al 10% del
genoma receptor). Como resultado de esta integracin se forma un
heterodplex. Si el heterodplex posee malos emparejamientos de
bases (debido a que la secuencia del exogenote no es idntica a la
del endogenote), acta un sistema de reparacin de malos
emparejamientos, denominado sistema Hex. Los resultados de ese
sistema son diferentes, segn que acte antes o despus de que pase
la onda de replicacin:

Si el sistema Hex acta de modo pre-replicativo, escinde toda la
cadena del exogenote y sintetiza ADN usando como molde la
cadena del endogenote. De este modo se restablece el ADN
original del endogenote,

Pero si antes de que intervenga el sistema Hex pasa la onda de
transcripcin por el heterodplex, cada cadena servir de molde
para una nueva doble hlice, pasando cada una a una clula hija.
De este modo, a partir de este evento de recombinacin surge una
progenie mixta: existe un subclon recombinante y otro que no lo
es.

Es de destacar que, el sistema Hex que restablece el mensaje
original es ms eficiente cerca de ciertos sitios del ADN (sitios
hex, reconocidos por cierta protena del sistema). Si el exogenote
se integra lejos de uno de los sitios reconocidos por Hex, tiene ms
probabilidades de escapar a la correccin, y por lo tanto toda la
progenie podr heredar el marcador nuevo procedente del
exogenote.

Puesto que cada clula, como dijimos antes, puede captar
simultneamente varios fragmentos de exogenote, su eventual
recombinacin y escape al sistema Hex significa que una bacteria
transformada puede adquirir uno o varios alelos nuevos al mismo
tiempo.
4.2.2.2 EN BACILLUS SUBTILIS
Las principales diferencias respecto del modelo del
neumococo, en esta fase inicial de competencia, son las siguientes:

La competencia se desarrolla despus de la fase exponencial,
durante el inicio de la fase estacionaria.

Los cultivos competentes son heterogneos: existe una minora
de clulas (< 25%) autnticamente competentes, y se encuentran
en un estado metablico alterado:

no replican ms su cromosoma;

se embarcan en pocas actividades biosintticas;

aumenta el nmero de mesosomas, muchos de ellos concentrados
en la regin ecuatorial.
4.2.2.2.1 DESARROLLO DE LA COMPETENCIA
La competencia en B. subtilis est sometida a tres tipos de controles:
1. Primer control, segn la fase de crecimiento por un sistema de
percepcin de qurum
2. Segundo control, de tipo nutricional. Para que se induzca la
competencia, el medio de crecimiento ha de poseer glucosa como
fuente de C, junto con una mezcla de aminocidos. Las seales
nutricionales que detecta la bacteria para provocar el estado de
competencia parecen depender (al menos en parte) del
agotamiento de algunos aminocidos y de alguna seal derivada
del metabolismo de la glucosa.
3. Tercer control, segn el tipo celular. Como acabamos de decir,
existen clulas competentes y no competentes. Es an un misterio
cmo se desarrolla este dimorfismo para la competencia. Lo
que s se sabe es que durante todo el crecimiento, algunas clulas
(probablemente las no-competentes) excretan al medio ADN de
alto peso molecular, que ser la fuente del ADN transformante.
De esos controles, el mejor conocido hasta ahora es el relacionado
con la densidad celular, basado en la deteccin de feromonas
peptdicas, y que depende de un sistema de qurum-sensing y de
un sistema regulador de dos componentes
La competencia se desarrolla en la transicin entre la fase
exponencial y la de esporulacin, y se inicia por dos pptidos
extracelulares: ComX y CSF (iniciales de factor de competencia y
esporulacin), que durante la fase exponencial van siendo liberados
al medio e incrementan su concentracin en paralelo con la densidad
celular.
Sistema de ComX:

Mientras B. subtilis va creciendo, va segregando un pptido,
denominado ComX. Obviamente, en un sistema cerrado, dicho
pptido se va acumulando en el medio.

Cuando se alcanza cierto nivel de ComX (y esto slo sucede a
partir de ciertas densidades altas de cultivo), interacciona con una
protena de membrana denominada ComP. ComP es una histidn-
proten-quinasa, del tipo de los sensores autofosforilables. Cuando
se le une CompX, la ComP se autofosforila, y entonces fosforila a
su vez a una protena citoplsmica llamada ComA.

La ComA~P es un regulador de respuesta, que en ese estado
fosforilado acta como activador de la transcripcin de varios
genes, incluyendo el gen comS.

La protena ComS se une a un aparato proteoltico, causando la
liberacin de ComK, y protegiendo a esta ltima de la proteolisis.

A su vez, el ComK liberado acta como activador de la
transcripcin de su propio gen, de modo que en poco tiempo
aumenta su concentracin, y entonces el ComK activa la
transcripcin de una serie de genes de competencia tardos, que
codifican las protenas necesarias para establecer ese estado de
competencia
Sistema de CSF:
Mientras ocurre lo anterior, en paralelo se da otra serie de
fenmenos: el pptido CSF, por su parte, al llegar a cierta densidad,
interacciona con un transportador de membrana especializado en
oligopptidos (oligopptido-permeasa), con lo cual el CSF entra al
citoplasma. Una vez all, el CSF inhibe la fosfatasa que quita el
fosfato de la ComA. Por lo tanto, este sistema confluye con el
anterior, manteniendo niveles altos de ComA~P (el regulador de
respuesta).
(Curiosamente, parecen existir vnculos entre desarrollo de la
competencia y esporulacin y no slo mera coincidencia de sus
respectivos desencadenamientos en el tiempo, ya que hay genes que
intervienen en la regulacin de ambos procesos).
4.2.2.2.2 ENTRADA DEL ADN Y FASE DE ECLIPSE

El ADN exgeno interacciona en primer lugar, a nivel de
pared celular, con un sistema de pseudopelos formado por
protenas ComG: una NTPasa de trfico (ComGA), una
protena de membrana politpica (ComGB) y pseudopilinas.
Es posible que este sistema modifique de algn modo la
pared celular, quiz creando un canal, por el que el ADN
puede llegar hasta el lado externo de la membrana
citoplsmica.

Entonces, el ADN de cadena doble llega hasta la
maquinaria de translocacin de ADN a nivel de membrana:

el receptor de membrana para el ADN (ComEA) es una
protena dotada de capacidad de unir ADN a travs de un
dominio hlice-vuelta-hlice, aunque no tiene especificidad
de secuencia.

La ComEA tiene a su vez la capacidad de pasar el ADN a
la siguiente protena del complejo, un canal de membrana
formado por un dmero de ComEC.

La energa para el transporte del ADN es suministrada por
el ATP unido a la protena ComFA, una translocasa de
ADN dirigida por ATP, que muestra dominios de tipo
Walter (de los transportadores de tipo ABC). Es posible
que la hidrlisis de ATP por esta protena suministre la
energa para el paso de ADN de cadena sencilla a travs
de la membrana (por el canal de ComEC).

Como acabamos de ver, aunque la maquinaria de
translocacin de ADN une ADN de cadena doble, al
citoplasma solo entra cadena sencilla. Probablemente este
sistema va acoplado a una degradacin de ADN.
4.2.3 TRANSFORMACIN EN BACTERIAS GRAM
NEGATIVAS
4,2.3.1 TRANSFORMACIN EN HAEMOPHILUS Y
NEISSERIA
Una diferencia caracterstica de los sistemas de estas bacterias
Gram-negativas con respecto a los de Gram-positivas es que el
estado de competencia no depende de seal activadora segregada al
medio, sino que se induce internamente.
Otra importante diferencia es que sistema de entrada del ADN
discrimina entre ADN de la especie (o, en todo caso de especies
cercanas) y ADN de otras procedencias: solamente capta ADN de
especies del mismo gnero, y con gran eficiencia. La secuencia se
denomina DUS (DNA uptake sequence), y est repetida varias veces
a lo largo del genoma.

Para Haemophilus la DUS es 5'AAGTGCGGTCA-3'. Dicha
secuencia aparece repetida y repartida en el genoma de H.
influenzae unas 600 veces, a una media de una copia cada 4 kb.
Como se puede comprobar, esta frecuencia es muy superior (3
rdenes de magnitud) a la que predice el clculo de probabilidades
en el caso de que apareciera aleatoriamente (4000 kb). As pues, el
genoma de estas bacterias est preparado (mediante la existencia
sobreabundante y no-aleatoria de esta secuencia) para participar en
eventos de reconocimiento especfico por parte de receptores
encaminados a la entrada de ADN propio por medio de fenmenos
de transformacin.

Para Neisseria: 5-GCCGTCTGAA-3. Ahora que se ha
secuenciado el genoma (2.15 Mb) de una cepa de N. gonorheae se
sabe que contiene 1965 copias de DUS, lo que supone una media
de una DUS cada 1096 pb.
La competencia afecta al 100% de la poblacin. En Haemophilus se
da en la fase estacionaria, mientras que en las especies del gnero
Neisseria las clulas se mantienen competentes durante todo el ciclo
de crecimiento, cosa excepcional dentro de los sistemas naturales de
transformacin.
Veamos un resumen de lo que se sabe de la transformacin del
gonococo (N. gonorhoeae).
1.1.1.1.1 Fase1: Donacin del ADN
De dnde procede el exogenote? En N. gonorheae intervienen dos
mecanismos: un sistema de secrecin de tipo IV y la autolisis.
Hoy se sabe que el 80% de los aislados de gonococo poseen islas
genmicas que codifican sistemas de secrecin de tipo IV (T4SS),
que como ya vimos en otro captulo, muestran trazas de haber sido
adquiridas por transferencia horizontal. Estos sistemas parece que
son responsables de una parte del ADN exgeno que luego ser
captado por bacterias competentes que comparten el mismo medio.
El restante 20% de cepas de gonococo, y todas las de meningococo
liberan ADN solamente por autolisis. Se han estudiado algunas
muramidasas en estas especies, pero no est claro su papel en esta
autolisis. Incluso existen ciertos indicios de que pueda haber un
mecanismo de muerte celular programada, que afectara a una
fraccin aleatoria del cultivo.
1.1.1.1.2 Fase 2: Unin y captacin del ADN
Aunque como decamos, estas especies solo son transformadas por
ADN de la misma especie o especies relacionadas a travs del
reconocimiento de las secuencias DUS repartidas por el genoma, no
se conoce el supuesto receptor especfico.
Se sabe que en la captacin del ADN est implicado un sistema de
pseudopelos relacionado con los pelos de tipo IV (T4P) y los
sistemas de secrecin de tipo II. Al parecer, la captacin no requiere
pelos funcionales, pero s parte de las protenas implicadas en la
formacin de esos pelos. Se ha especulado con que el supuesto
receptor para las DUS (que debera estar en la membrana externa) al
unirse al ADN de forma especfica permite la apertura de la
secretina PilQ de la membrana externa, que forma parte del
pseudopelo. La funcin de este pseudopelo sera conducir el ADN
hasta la maquinaria de translocacin a nivel de membrana
citoplsmica, que permitir que el exogenote entre en el citoplasma.
Descripcin del hipottico sistema de entrada basado en
pseudopelos de tipo IV: Se tratara de un pseudopelo de
competencia, relacionado con el pelo de tipo IV, pero no idntico.
(No se necesitan pelos funcionales para la transformacin, pero s
parte de su maquinaria).
El extremo distal consistira en la secretina PilQ de membrana
externa. La secretina se ensambla en la membrana externa
formando multmeros con forma de donut, que dejan un canal
interior. En el caso de un pelo de tipo IV, esa canal permite que el
pelo pueda proyectase desde el periplasma hasta el exterior (el pelo
atraviesa el canal de la secretina). En el caso de la transformacin,
parece que la secretina igualmente alberga un pseudopelo cuyo
componente mayoritario es la pilina PilE (como en el pelo de tipo
IV), y probablemente va acompaado de la protena estabilizante
PilC.
El pseudopelo se ancla a la membrana citoplsmica probablemente
a travs de la protena politpica PilG, que a su vez tiene asociado,
por el lado citoplsmico de la membrana la NTPasa de trfico PilF.
El modelo (Chen y Dubnau, 2004):

las secuencias DUS del ADN exgeno son reconocidas por un
receptor especfico (sin identificar an), y pudieran inducir la
apertura del canal de la secretina;

El ADN pasa al pseudopelo de competencia, interaccionando con
la secretina PilQ de la membrana externa. El ADN quiz entre por
el canal del polmero en donut de la secretina, una vez abierto.

De esta forma el ADN entrara al periplasma, y probablemente
estara interaccionando con el pseudopelo de pilina PilE, que est
inserto en la membrana citoplsmica mediante la PilG, asociada a
su vez con la NTPasa PilF.

Todo ello facilitara la interaccion del ADN con la translocasa de
membrana.
La maquinaria de translocacin a travs de la membrana
Se han identificado homlogos de lo visto en B. subtilis:

ComE es el ortlogo de ComEA. En el genoma de H. gonorhoeae
existen 4 copias del gen comE, cuya sucesiva mutacin va
disminuyendo la eficiencia de la transformacin. Se ha propuesto
que se une al ADN en el periplasma, sirviendo de puente entre el
pseudopelo y la maquinaria a nivel de membrana.

ComA es el ortlogo de ComEC. Es una protena politpica de
membrana, que quiz forma un canal para el transporte del ADN
al citoplasma.

(No se ha identificado en Gram-negativas ortlogos de la ATPasa
ComFA de B. subtilis).
1.1.1.1.3 Fase 3: Entrada y procesamiento del ADN
La situacin sobre el procesamiento del exogenote al pasar por la
membrana no est tan clara como en Gram-positivas. Parece que
parte del ADN cromosmicos entra como cadena sencilla (y no
doble, como se pensaba), pero no se han identificado an las
actividades enzimticas de esa conversin. Ese ADN de cadena
sencilla parece que se genera ya en el periplasma. Al entrar de esta
manera, queda protegido frente al arsenal de endonucleasas (que en
cambio, s afectan al ADN plasmdico, que por lo tanto s pudiera
entrar como ADN de cadena doble). El tamao del ADN importado
al citoplasma parece estar en torno a 10 kb.
1.1.1.1.4 Fase 4: Recombinacin homloga entre
exogenote y endogenote
En el gonococo parecen darse las dos ramas de la recombinacin
homloga dependientes de RecA (rama RecBCD y rama RecF). Los
gonococos recA
-
no son transformables, y la recombinacin parece
depender de la rama RecBCD, pero no de la RecF.
4,2.3.2 TRANSFORMACIN EN HELICOBACTER PYLORY
La transformacin de este patgeno gstrico humano es diferente a
las vistas hasta ahora. Implica un aparato relacionado con los
sistemas de secrecin de tipo IV. (Estos sistemas estn implicados
en el sistema Vir de transferencia conjugativa del ADN-T entre
Agrobacterium y la planta y en la exportacin de protenas al medio
o al hospedador eucaritico por parte de ciertos patgenos Gram-
negativos).
En H. pilori existe un opern comB, con cuatro ORF homlogas de
vir de A. tumefaciens. ComB7 es una lipoprotena quiz de la
membrana externa, y forma un puente disulfuro con ComB9.
ComB8-ComB10 estn estrechamente asociadas con la membrana
citoplsmica y probablemente constituyan un puente entre sta y la
membrana externa. La ATPasa es ComB4. La translocacin del
ADN al citoplasma parece depender de un ortlogo de ComEC de B.
subtilis, es decir, H. pilory usa un sistema especial para captar el
ADN, pero lo transloca al citoplasma mediante mediante un sistema
similar al de las otras bacterias competentes.
4.2.4 SIGNIFICADO BIOLGICO DE LA
TRANSFORMACIN NATURAL
Como acabamos de ver, los sistemas naturales de transformacin
representan mecanismos bastante sofisticados de transferencia
gnica en ciertas bacterias, y no deben en absoluto considerarse
como meras curiosidades o accidentes de algunos procariotas.
Gneros como Haemophilus, Streptococcus o Bacillus presentan
exquisitos refinamientos moleculares encaminados, en ltima
instancia, a facilitar expresamente la recombinacin gentica tras un
proceso especfico de transformacin, induciendo una serie de
funciones totalmente exclusivas para tal propsito. Estos
mecanismos han debido de evolucionar debido probablemente a
ciertas presiones selectivas del ambiente, y han sido aprovechados
para producir un plus de diversidad gentica, que debe de jugar un
papel importante en la dinmica ecolgica de las especies que lo
poseen.

As, por ejemplo, parece ser que el sistema de transformacin de
Neisseria gonorrhoeae (el gonococo) permite que esta bacteria
cambie ms fcilmente determinadas molculas de superficie, de
modo que estos cambios antignicos suponen una ventaja
adaptativa para evadir el sistema inmune del hospedador
mamfero. El genoma de una cepa secuenciada del gonoco muestra
seis islas genmicas, probablemente adquiridas por
transformacin.

Lo mismo se puede decir del neumococo, en el que la
transformacin parece tener un gran papel para dotarlo de
flexibilidad adaptativa: Por ejemplo, le permite producir distintos
y cambiantes tipos de cpsulas, que le ayudan en la invasin de su
hospedador humano, y disponer de genes mosaico para protenas
de unin a penicilina, PBPs, con menor afinidad hacia el
antibitico, lo que les permite resistirlo. Adems, puesto que S.
pneumoniae convive con otras especies del gnero Streptococcus,
y puesto que su sistema de transformacin deja entrar cualquier
tipo de ADN, en esta especie es la recombinacin homloga (que
se permite con ADN cercano evolutivamente) la encargada de
discriminar, pero permitiendo experimentos naturales en los que
se recombinan exogenotes de especies cercanas. Hoy existen
pruebas de que el neumococo evoluciona y se adapta en sus
mecanismos de virulencia en parte gracias a la transformacin
interespecfica (con ADN de otras especies de estreptococos, como
S. oralis, S. mitis). De hecho, parece que el sistema del neumococo
est pensado para maximizar la transformacin con ADN
heterlogo: en la cepa silvestre Hex
+
de neumococo, la eficiencia
de transformacin es proporcional a la divergencia entre exo y
endogenote.
Una pregunta ms difcil de responder es la del origen
evolutivo de la capacidad de transformacin. Aqu caben diversas
hiptesis.

Hiptesis de la reparacin de ADN: sugiere que la capacidad de
competencia apareci en B. subtilis. (esporulante) como un
sistema de obtener moldes de ADN para la reparacin. La
argumentacin sigue el siguiente curso: se sabe que la
competencia en esta especie est regulada por controles que son en
parte comunes con los del desencadenamiento de la esporulacin
(recordar que decamos que en B. subtilis la competencia se induce
en fase estacionaria, lo cual tambin ocurre con la esporulacin).
Por otro lado, tambin se recordar que al final de la fase
exponencial ocurren grandes cambios metablicos en esta bacteria,
siendo uno de ellos el que pasa de un metabolismo fermentativo a
uno oxidativo. En el metabolismo oxidativo se producen
numerosos radicales libres, que pueden provocar daos en el
ADN. Por lo tanto -concluye esta hiptesis- , no sera extrao que
la competencia hubiera evolucionado como una forma de obtener
ADN de repuesto, que capataran ciertos individuos de la
poblacin, para usarlos en la reparacin de sus genomios.
Posteriormente el sistema se refinara y sevira para incrementar la
variabilidad gentica y la capacidad de adaptacin. (De hecho, en
B. subtilis y en S. pneumonie se ha visto que el gen recA de la
recombinacin homloga se induce en respuesta al desarrollo de la
competencia.

Hiptesis de la nutricin: Quiz pudo surgir como una manera de
obtener nutrientes adicionales a partir de ADN exgeno.

Hiptesis de la recombinacin: pudo haber una presin selectiva
que favoreciera el desarrollo de un mecanismo de intercambio y
recombinacin de ADN, por los que las poblaciones de ciertas
bacterias podran poner a prueba nuevas combinaciones de genes
(algo parecido a lo que pas con el desarrollo de la sexualidad en
los eucariotas). Ello aumentara la diversidad y podra acelerar la
evolucin. De hecho, algunas de las especies transformables de
modo natural excretan ADN durante el crecimiento. Ese ADN,
captado en el caso de Haemophilus o Neisseria de un modo muy
especfico, puede favorecer la adaptacin de otros miembros de la
especie. De hecho, en esas y otras especies (incluyendo el
neumococo), la transformacin aumenta la diversidad antignica, y
por lo tanto son mejores las probabilidades de sobrevivir en el
husped al que parasitan. Puesto que en la recombinacin solo
unas cuantas combinaciones van a ser beneficiosas, se necesitan
altas densidades celulares para aumentar la probabilidad de que
aparezcan y se seleccionen esas raras combinaciones. Ello
justificara el que en al menos algunas especies la competencia
dependa de un mecanismo de percepcin de qurum.
4.3 TRANSFECCIN
Se define la transfeccin como la infeccin de una clula
hospedadora mediante ADN obtenido de un virus. El ADN del virus
as introducido, al expresar su programa gentico en la clula,
termina desencadenando la produccin de nuevas partculas de virus
dentro, que al igual que en la infeccin clsica por virus
completos, conduce a la muerte y lisis de la clula, con la liberacin
de la progenie de nuevos viriones. Las caractersticas de unin de
ADN y entrada dependern del sistema de clulas competentes que
se est empleando, mientras que el resultado de la transfeccin
depende (al igual que en los ciclos lticos naturales de los virus) del
programa del virus en cuestin.
4.4 TRANSFORMACIN ARTIFICIAL
Muchas especies bacterianas carecen de sistemas naturales de
transformacin. En los ltimos aos se ha logrado desarrollar
sistemas artificiales para producir clulas competentes en algunas
de ellas (como Escherichia coli, Salmonella typhimurium y algunas
especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los estudios
genticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro: por
ejemplo, la transformacin artificial de E. coli con ADN plasmdico
es una de los mtodos bsicos de la Ingeniera Gentica.
La obtencin de clulas competentes en E. coli consiste en ir
concentrando un cultivo recogido en fase logartmica, mediante
lavados sucesivos en una solucin fra (4C) de Cl
2
Ca, tras lo cual la
mezcla de clulas y ADN se someten a unos 2 min. a 42C (choque
por calor). Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo la
membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN. Los
plsmidos entran a la clula como molculas de cadena doble
intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma
forma, son degradados por nucleasas citoplsmicas (RecBCD). Los
transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algn
o algunos antibiticos conferidos por los plsmidos artificiales
usados en Ingeniera Gentica.
En otras bacterias (p. ej., en ciertas Gram-positivas) el mtodo
consiste en obtener protoplastos en medio hipertnico, y posterior
tratamiento de stos mezclados con el ADN con un agente como el
polietilnglicol, que fomenta la fusin de protoplastos y el
englobamiento de ADN exgeno.
Ms recientemente se ha introducido la tcnica de la
electroporacin: las clulas se someten a cortos pulsos de corriente
elctrica de alto voltaje, lo cual altera las envueltas y permite la
captacin de ADN en una amplia variedad de bacterias, tanto Gram-
positivas como Gram-negativas.


NDICE
1 CONCEPTO Y APROXIMACIN HISTRICA
1.1 EXPERIMENTOS DE LEDERBERG Y TATUM
1.2 AISLAMIENTO DE LAS CEPAS Hfr POR
LEDERBERG Y HAYES
1.3 EL MODELO DE CAMPBELL
1.4 EXPERIMENTOS DE LOS CRUCES
INTERRUMPIDOS DE JACOB Y WOLLMAN
2 ESTUDIO DE LA CONJUGACION PROMOVIDA POR EL
PLASMIDO F DE E. COLI ...........................................................
2.1 DESCRIPCIN DEL PLSMIDO F Y DE SUS
FUNCIONES BSICAS
2.2 FISIOLOGA Y BIOLOGA MOLECULAR DE LA
CONJUGACIN
2.2.1 CONTACTOS ENTRE CLULAS F
+
Y F
--

2.2.2 TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN
CONJUGATIVO
2.3 REGULACION GENTICA DE LA CONJUGACION
3 INTERACCIONES DEL PLSMIDO F CON EL
CROMOSOMA
3.1 FORMACIN Y CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS
Hfr
3.2 REVERSIN DE LAS CEPAS Hfr, ORIGEN DE LAS
F', Y SEXDUCCIN
3.3 SEXDUCCIN
4 ALGUNAS IDEAS ADICIONALES SOBRE BIOLOGA DE
LOS PLSMIDOS
4.1 TIPOS DE PLSMIDOS
4.2 MS IDEAS ACERCA DE PLSMIDOS EN
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
4.3 PLSMIDOS R
4.4 CONJUGACION EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS
4.5 TRANSPOSONES CONJUGATIVOS EN
ENTEROCOCCUS
4.6 TRANSFERENCIA CONJUGATIVA ENTRE REINOS

1 CONCEPTO Y APROXIMACIN HISTRICA
La conjugacin bacteriana es el proceso de transferencia de
informacin gentica desde una clula donadora a otra receptora,
promovido por determinados tipos de plsmidos, y que requiere
contactos directos entre ambas, con intervencin de estructuras
superficiales especializadas y de funciones especficas.
El descubrimiento de la transformacin haba revelado ya la
existencia de recombinacin gentica entre porciones de genomios
bacterianos. En mitad de los aos 40, la pregunta que se planteaba
era: existe algn tipo de recombinacin bacteriana que suceda al
estilo de la reproduccin sexual de los eucariotas?
Se descubri que ciertas bacterias presentan una forma de
recombinacin que recordaba en algunos rasgos a la sexualidad: un
tipo de clula donadora (macho) donaba directamente parte de su
material gentico a otro tipo (la receptora, equivalente a la
hembra), con ulterior recombinacin entre ambos. A este
fenmeno se le denomin conjugacin, por su similitud aparente
con lo que sucede en eucariotas. Sin embargo, como veremos
enseguida, la conjugacin no es una forma autntica de sexualidad al
estilo de los eucariotas.
Con la perspectiva de los aos, se puede decir que el
descubrimiento de la conjugacin bacteriana fue uno de los ms
fortuitos, pero al mismo tiempo, de los ms felices y trascendentales
de toda la Biologa del siglo XX. Muchos bilogos haban intentado
infructuosamente demostrar conjugacin de tipo sexual en
bacterias. Lederberg y Tatum (1946), que a la sazn investigaban en
la Universidad de Yale, tuvieron la enorme suerte de escoger (sin
saberlo a priori) una de las pocas especies bacterianas (Escherichia
coli) que presentan sistemas naturales de conjugacin, y an ms, la
cepa concreta denominada K12, que llevan uno de estos sistemas...
Pero todava mejor: como se descubrira muchos aos despus, el
sistema conjugativo de dicha cepa es casi nico por su capacidad de
conjugacin permanente, no estando sometido a los controles
negativos tpicos de la inmensa mayora de los dems sistemas que
luego se descubrieron. En resumen, un extraordinario golpe de
suerte en el ao 1946 dio el pistoletazo de salida para una de las
pocas ms gloriosas de la Biologa, contribuyendo de modo
excepcional al origen de la Biologa Molecular.
A continuacin expondremos los hitos ms importantes en el
estudio de la conjugacin en Escherichia coli K12 (consulten los
esquemas).
1.1 EXPERIMENTOS DE LEDERBERG Y TATUM
Joshua Lederberg y Edward Tatum (1946) mezclaron dos
cepas doblemente auxotrofas, dotadas de distintos marcadores
genticos:
Cepa A (Met
--
, Bio
--
, Thr
+
,
Leu
+
)
cepa B (Met
+
, Bio
+
, Thr
--
, Leu
--
)
Sembrar 2 10
8
cls de
A
Sembar 10
8
cls de
A + 10
8
cls de B
Sembrar 2 10
8
cls de
B
plaquear en medio mnimo e incubar varios das
No crecimiento Colonias prototrofas a
una frecuencia de 10
-5

- 10
-6
, muy superior a
la frecuencia esperada
de doble reversin
(10
-14
).
No crecimiento
Estos prototrofos deban haber surgido por recombinacin
Qu proceso de transferencia gentica haba dado origen a los
recombinantes? Se descart que fuera por transformacin:

No haba recombinantes si se usaban extractos libres de una cepa y
se mezclaban con clulas enteras de la otra cepa.

Si en el experimento original se aada DNasa, no cambiaban los
resultados.

Se vio que se necesitaban contactos directos entre las clulas de las
dos cepas, mediante el experimento del tubo en U de Davis: si
en cada rama de la U se coloca una cepa distinta, y ambas estn
separadas fsicamente (en la base de la U) por un filtro con poros
de tamao inferior al del dimetro de las bacterias, no aparecan
recombinantes.
En ulteriores experimentos se comprob que existan dos tipos
de cepas de cara a la produccin de recombinantes:

cepas frtiles (F
+
): aquellas que al mezclarlas con otras, daban
lugar a recombinantes;

cepas infrtiles (F
-
).
Los cruces de tipo F
+
x F
--
dan origen a recombinantes;
Los cruces de tipo F
--
x F
--
no dan origen a recombinantes.
Por otro lado, se observaron dos importantes propiedades de los
cruces F
+
x F
-
:

casi la totalidad de las clulas infrtiles (F
--
), al final de la
conjugacin, adquiran la capacidad de fertilidad (se convertan en
clulas F
+
);

sin embargo, los recombinantes aparecan con mucha menor
frecuencia (alrededor de 10
-5
).
El origen de ambos fenmenos estriba en la posesin, por parte
de las clulas F
+
, del llamado factor sexual o factor de fertilidad F,
(que hoy sabemos que es un plsmido, pero tal extremo se
desconoca an en esa poca). Por lo tanto, de alguna manera el
factor F deba de tener la doble capacidad de transferirse con alta
frecuencia (casi el 100%) a las clulas F
--
, y de dar origen en ellas a
recombinantes, pero con mucha menor frecuencia (10
--5
). Cmo
explicar esta doble capacidad del factor F, con dos frecuencias tan
diferentes? Las bases para la respuesta a esta pregunta fueron
colocadas en el siguiente gran captulo de esta historia:
1.2 AISLAMIENTO DE LAS CEPAS Hfr POR LEDERBERG
Y HAYES
En los aos de 1950 Joshua Lederberg y William Hayes, cada
uno por separado, aislaron un nuevo tipo de cepas frtiles a partir de
las cepas F
+
originales, cuyas propiedades distintivas respecto de las
cepas F
+
eran:
a) Provocaban fertilidad (o sea, daban recombinantes al cruzarlas
con F
--
) con una frecuencia muy alta (unas 1000 veces
superior a la de las cepas F
+
). Por ello, el nombre que se dio a
este nuevo tipo de cepas frtiles fue el de Hfr (iniciales, en
ingls, de alta frecuencia de recombinacin).
b) A diferencia de las F
+
, las cepas Hfr no suelen convertir en
frtiles a las cepas F
--
tras el cruce conjugativo con ellas.
Entonces, la pregunta obvia era: qu relacin existe entre las
clulas Hfr y las clulas F
+
de las que parecen derivar?
1.3 EL MODELO DE CAMPBELL
Alan Cambell propuso en 1962 un modelo hipottico que
posteriormente se vio confirmado por otros experimentos, y que
daba cuenta del comportamiento de las cepas F
+
de Lederberg y de
las Hfr de Lederberg y Hayes:

En las clulas F
+
el factor de fertilidad F se encuentra en forma de
plsmido de replicacin autnoma, independiente del cromosoma.
En este estado, el factor F slo puede provocar su propia
transferencia conjugativa a las clulas F
--
, de modo que stas
adquieren a su vez dicho factor F.

En una poblacin de clulas F
+
, de vez en cuando (con una
frecuencia de 10
-5
), el factor F interacciona con el cromosoma: se
integra en l, y entonces se replica conjuntamenente con el
genforo de la bacteria (actuando, pues, como episoma). En esta
situacin, el factor F puede arrastrar al cromosoma y transferir
parte de l a la clula receptora F
--
. Sin embargo, en esta situacin
el factor F no se transfiere completo a la clula receptora, razn
por la cual los cruces Hfr x F
--
no suelen conferir el carcter F
+
a
los exconjugantes del receptor.

En resumen: cada cepa Hfr es clon procedente de un evento de
integracin del factor F en un sitio del cromosoma de E. coli. En
estos clones todas las clulas tienen la capacidad de transferir
porciones de cromosoma y por ello confieren alta frecuencia de
recombinacin. As pues, en un cultivo F
+
normal, existe una
pequea proporcin de clulas Hfr. Esa minora de clulas Hfr son
las responsables de la baja frecuencia de recombinantes que
provocan los cultivos F
+
.
El anlisis del proceso de conjugacin y de la transferencia de
marcadores cromosmicos se vio grandemente impulsado una vez
disponibles las cepas Hfr puras. Se fueron obteniendo diversas cepas
Hfr, cada una de las cuales se caracterizaba por una mayor eficiencia
de transferencia de determinados marcadores. El siguiente gran
avance en el estudio de la conjugacin se produjo trabajando sobre
una de estas cepas, la denominada HfrH (la H, en honor de
Hayes):
1.4 EXPERIMENTOS DE LOS CRUCES INTERRUMPIDOS
DE JACOB Y WOLLMAN
Estos autores, que trabajaban en el Instituto Pasteur de Pars,
realizaron a partir de 1956 una importantsima serie de experiencias,
que demostraron que la transferencia conjugativa tiene una polaridad
(un sentido determinado): la transferencia de ADN por cada cepa
Hfr es unidireccional y linear, o sea, los genes del donador van
entrando al receptor en un orden determinado.

Imaginemos una cepa Hfr con un juego de marcadores (A
+
, B
+
, C
+
,
D
+
, F
--
, G
--
), y una cepa F
--
con el juego opuesto (A
--
, B
--
, C
--
, D
--
,
F
+
, G
+
). Mezclamos ambas cepas, y a distintos tiempos extraemos
alcuotas, y las agitamos fuertemente, con objeto de deshacer las
parejas que se estaban conjugando (de ah el nombre de cruces
interrumpidos que recibe el experimento).

Cada una de estas alcuotas es sembrada en un medio mnimo
suplementado con los requerimientos correspondientes a los
marcadores A, B, C y D. (Obviamente, en este medio, slo puede
crecer la cepa receptora). Tras incubar las placas, se obtienen
colonias derivadas de la cepa receptora, procedentes de las
mezclas de conjugacin.

Ahora realizamos rplicas en placa (p. ej., por el mtodo del
tampn de terciopelo), copiando los transconjugantes en sendas
placas de medio mnimo suplementadas con mezclas de 3 de los 4
requerimientos que originalmente le hacan falta a la cepa
receptora. Mediante esta forma, lo que pretendemos es ver la
posible adquisicin de las versiones silvestres de los marcadores
(mutantes) de esa cepa, versiones que obviamente habr debido de
adquirir tras transferencia conjugativa de partes de cromosoma
procedentes de la cepa donadora.

Se anota la frecuencia de aparicin de cada alelo silvestre, y los
resultados se representan en funcin de los tiempos a los que se
extrajeron e interrumpieron las muestras del cruce conjugativo
(ver grfica).
De la representacin grfica de porcentaje de recombinantes
(eje de ordenadas) en funcin del tiempo de conjugacin (abscisas)
se deduce lo siguiente:
1. Cuanto ms tiempo se deja la conjugacin sin interrumpir, ms
material gentico se transfiere.
2. Los genes van entrando ordenada y secuencialmente. La
frecuencia relativa obtenida para cada marcador (es decir, el n
final de recombinantes) est en relacin (inversa) con el tiempo
en que ste comienza a aparecer (a menor tiempo de aparicin,
mayor frecuencia final de ese marcador). Cada marcador tiene un
tiempo de entrada inicial caracterstico (que en la grfica se
manifiesta por el punto del eje de abscisas cortado por la curva).
3. Cada marcador da una curva con una pendiente caracterstica. El
hecho de que exista pendiente (y no que exista una recta en
vertical desde el momento de aparicin del marcador) implica que
cada marcador no entra a la poblacin de bacterias receptoras de
un tirn, sino que algunas clulas lo reciben antes y otras
despus, dentro de un cierto rango de tiempos. La existencia de
una meseta final significa que a partir de un punto ya no entra
ms marcador (es decir, ya se ha producido toda la transferencia
de ese marcador).
Resumiendo las consecuencias de este experimento: En la
conjugacin Hfr x F
--
el cromosoma entra en la clula receptora con
una orientacin determinada, de modo que los genes entran
ordenada y secuencialmente. El tiempo en que comienza a
detectarse un determinado marcador, as como la frecuencia final
de dicho marcador en los transconjugantes dan una estimacin
de su distancia respecto del origen de transferencia. La correlacin
entre tiempo de aparicin y frecuencia final del marcador sugiere
que las parejas de cruce donador-receptor se separan
espontneamente en algn momento de la conjugacin; de no
existir tal separacin espontnea, se terminaran obteniendo
frecuencias del 100% para cada marcador individual, incluidos los
ms alejados del origen de transferencia.

Precisamente esto ltimo es la base por la que se aprovecha el
sistema de conjugacin para la elaboracin de mapas genticos del
cromosoma bacteriano. Como este aspecto es tratado
oportunamente en la asignatura de Gentica, nosotros no vamos a
insistir ms en l, aparte de recordar que fue precisamente
utilizando distintas cepas Hfr como se comprob genticamente
que el cromosoma de E. coli es, en efecto, circular.

La unidad de medida en el mapa gentico de la bacteria es el
minuto. El cromosoma de E. coli tiene unos 100 minutos; si
tenemos en cuenta que el cromosoma mide 4.200.000 pares de
bases (pb), esto significa que la transferencia cromosmica
promovida por F se da a razn de 4.200 pb/min, es decir, unas 700
pb/ seg.

Existen 22 tipos distintos de cepas Hfr. Cada una se caracteriza
por poseer el factor F en un punto concreto del cromosoma de E.
coli, y de transferir ese cromosoma con un sentido determinado.
Existen pares de cepas Hfr cuyo factor F est integrado en la
misma localizacin del genforo, pero que transfieren cromosoma
en sentidos opuestos: los marcadores que una de ellas transfiere en
primer lugar son los ltimos que transfiere la otra cepa Hfr.
2 ESTUDIO DE LA CONJUGACION PROMOVIDA POR EL
PLASMIDO F DE E. COLI
2.1 DESCRIPCIN DEL PLSMIDO F Y DE SUS
FUNCIONES BSICAS
El factor responsable de la fertilidad de E. coli K12, o sea, el
plsmido F, es un ejemplo de plsmido conjugativo que tiene la
capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano para
integrarse en l (episoma). El factor F puede encontrarse en uno de
tres posibles estados:

autnomo, en las clulas F
+
;

integrado (como episoma), en las clulas Hfr;

autnomo, pero con un trozo de cromosoma, en las cepas F' (ver el
apartado sobre sexduccin).
En estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales.
Estructura fsica:

ADN circular de cadena doble, cerrado covalentemente (c.c.c.)

superenrollado negativamente (requiere la accin de la girasa);

tamao: 100 kilobases. El mapa fsico de F posee coordenadas en
kb de 0 a 100 (obviamente el 0 y el 100 son el mismo punto),
tomando como punto arbitrario de referencia (0/100) el borde
izquierdo de la secuencia de insercin IS3a.
Organizacin gentica y funcional: Se han identificado unos 60
genes en el plsmido F. Vamos a echar una ojeada al mapa de F para
describir los principales grupos de genes segn las funciones que
realizan:
1) Porcin tra (genes que codifican funciones relacionadas con la
transferencia conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos
en unas 33 kb (o sea, casi la tercera parte de F est dedicado a
genes de conjugacin). La mayor parte de esos genes estn
formando parte de un gran opern traYZ (unos 20 genes).
Los genes tra se pueden clasificar en:
a) Necesarios para la biosntesis y ensamblaje de los pelos
sexuales. Entre ellos est el gen traA, que codifica la pre-
propilina, es decir, el precursor que por maduracin se
convertir en la pilina F, la protena constitutiva de los pelos
sexuales de tipo F. Otros genes tra intervienen en la
maduracin de la pilina, y en el ensamblaje de las subunidades
para dar el pelo F.
b) Estabilizacin de los agregados de conjugacin: traG, traN.
c) Metabolismo del ADN durante la conjugacin: traI, traD,
traM, traY, traZ.
d) Regulacin gentica de la transferencia: traJ determina un
activador transcripcional del gran opern traYZ; finP, finO
formaran un sistema de control negativo sobre el gran opern
traY...Z, pero como veremos, este sistema no es funcional en el
plsmido F debido a que el finO tiene una inactivacin
insercional permanente por la secuencia de insercin IS3.
e) Exclusin de superficie: traS, traT.
2) Regiones para la replicacin vegetativa del plsmido F: la zona
RepFIA es la ms importante, y posee genes relacionados con la
replicacin vegetativa, con la incompatibilidad de F respecto de
otros plsmidos (Inc) de tipo similar, y con el reparto de las
copias replicadas de F a las clulas hijas.
3) Existen varias secuencias de insercin: dos copias de IS3, una
copia de IS2 y una copia de Tn1000 (antes llamado o, y que
pertenece a la misma familia que los transpones Tn1, Tn3, etc).
Precisamente son estas secuencias de insercin las que permiten
la integracin de F en varios lugares del cromosoma, por medio
de recombinacin homloga con elementos similares del
genforo bacteriano. Aludiremos a esto de nuevo, cuando
tratemos el origen de las cepas Hfr y de las cepas F'.
4) Observen que existen dos secuencias ori (es decir, orgenes de
replicacin). Una de ellas, la oriV acta como origen de
replicacin vegetativa, y la otra (oriT, de unas 300 pb) es el
origen para la transferencia conjugativa, que como veremos
enseguida, implica un tipo especial de replicacin.
2.2 FISIOLOGA Y BIOLOGA MOLECULAR DE LA
CONJUGACIN
Podemos distinguir en la conjugacin dos grandes fases:
1) contactos entre clulas F
+
(o, en su caso, Hfr) y F
--
;
2) transferencia del ADN.
2.2.1 CONTACTOS ENTRE CLULAS F
+
Y F
--

Las clulas F
+
(o las Hfr) forman de 1 a 10 pelos sexuales
(repasar aqu lo que se dijo oportunamente en el cap. 8 sobre este
tipo de pelos, que son distintos de las fimbrias de tipo adhesivo). El
pelo interacciona especficamente, a travs de su punta, con un
receptor de la clula F
--
(concretamente, parece ser que se trata de la
protena OmpA, de la membrana externa).
En los cruces se ha visto que ms que parejas de cruce existen
agregados de cruce, donde varias clulas de ambos tipos (hasta
unas 20) se encuentran relacionadas por contactos directos. Las
cosas ocurren de la siguiente manera:
1) Una clula F
+
contacta por medio de la punta de su pelo F con el
receptor de superficie de una F
--
.
2) El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca
la apariencia de que se va retrayendo. En ese movimiento de
retraccin, la clula F
--
se va acercando a la F
+
.
3) Cuando el pelo se termina de desintegrar, las clulas se ponen en
contacto directo pared-pared. Se forma un puente conjugativo que
pone en contacto los citoplasmas de ambas clulas.
4) Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la accin de
los genes traN y traG del plsmido F, y de ompA de la clula F
--
.
5) La protena producida por traD (localizada en ambas membranas,
citoplsmica y externa) parece que facilita el transporte del ADN
a la clula receptora.
6) Tras cierto tiempo de conjugacin, el agregado se desagrega de
forma activa.
Aqu hablaremos de un fenmeno interesante, que tiene que
ver con las interacciones entre superficies celulares: se trata de la
exclusin superficial, y consiste en un sistema por el que se evita
que las clulas de tipo F
+
puedan actuar como receptoras frente a
otras F
+
. Se sabe que la accin de dos genes del plsmido F realizan
esta funcin:

traT: su producto se sita en la membrana externa, impidiendo la
formacin de contactos con pelos sexuales de otra clula F
+
.

traS: su producto, situado en la membrana citoplsmica, evita la
entrada de ADN desde otra clula F
+
.
Otro fenmeno que se puede observar en los cruces F
+
x F
--
es
la zigosis letal. Ocurre cuando la proporcin de clulas F
+
es muy
superior a la de F
--
(p. ej., de 10:1). En este caso, las clulas
receptoras pueden morir, debido a que estn siendo modificadas en
muchos puntos de su superficie por numerosos contactos con clulas
F
+
.
2.2.2 TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN
CONJUGATIVO
La transferencia de ADN desde una clula F
+
a una F
--
es un
proceso especial de replicacin asimtrica por crculo rodante.

Una de las dos cadenas parentales del plsmido F pasa a la clula
receptora, replicndose en ella;

La otra cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez
como molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria.
Esto explica porqu las clulas F
+
siguen siendo F
+
tras la
conjugacin.
Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hlice
de F desaparezca del donador para aparecer en el receptor, sino que
al final, ambos miembros de la pareja poseen un plsmido F
completo.
Resumiendo el modelo que explicaremos luego, la
transferencia conjugativa del plsmido F ocurre de la siguiente
manera:

En la clula F
+
, una endonucleasa especfica codificada por uno de
los genes tra reconoce y corta en una de las cadenas de la
secuencia oriT del plsmido.

La cadena as cortada se ve desplazada por una helicasa codifica
por otro gen tra del plmido.

Los productos de otros genes tra transfieren la cadena cortada al
receptor. Al parecer, los extremos de esa cadena permanecen
anclados a otra protena Tra (es decir, durante el proceso nunca
quedan extremos libres como tales).

Cuando la cadena rota ha terminado de entrar al receptor, la
protena Tra que mantena los extremos 3 y 5, vuelve a unirlos
(se rehace el enlace fosfodister).

Durante el proceso de transferencia de la cadena rota en el
receptor, se estn dando dos procesos de sntesis de ADN: por una
lado, la cadena intacta de F del donador sirve como molde para
sintetizar la correspondiente cadena complementaria (que es
idntica, claro est, a la cadena desplazada hacia el receptor); y al
mismo tiempo, en el receptor, la cadena transferida, conforme va
entrando, va sirviendo para sintetizar la cadena complementaria.
De este modo, al final, el donador sigue siendo F
+
, y el receptor se
ha convertido en

F
+
.
Veamos el modelo actualizado que incorpora lo que se conoce
de este proceso (aunque por supuesto, an quedan puntos hipotticos
por aclarar):
1) Corte especfico de una de las cadenas de F a nivel de la
secuencia oriT (7[1]). El corte lo realiza el complejo
{TraY+TraZ}, que se localiza anclado en el poro o canal de
conjugacin. As pues, este complejo acta en este momento
como una endonucleasa especfica que corta en una sola de las
cadenas de F, dentro de la secuencia oriT.

7
[1]
.- Obsrvese en el mapa de F que la secuencia oriT est orientada de tal forma que la regin tra
es la ltima que se transfiere a la clula F
--
. Ello a su vez explica por qu en los cruces Hfr x F
--

raramente la clula receptora se convierte en frtil: para que a ella se transfiera la regin tra hace
falta que primero pase todo el cromososoma desde el punto oriT, y esto acaece pocas veces, ya que
como dijimos, las parejas de cruce se suelen desagregar espontneamente antes.
2) El producto del gen traM suministra la seal, por un mecanismo
desconocido, para desencadenar la transferencia.
3) El extremo 5' generado en el corte a oriT entra a la clula
receptora, pero dicho extremo permanece unido al complejo
{TraY+TraZ}. La transferencia progresa en el sentido 5' 3'. El
complejo {TraY+TraZ} acta ahora como una helicasa de tipo I,
de modo que va desenrollando la doble hlice del F, separando
las dos hebras, e hidrolizando ATP simultneamente (o sea, la
helicasa de F es una ATPasa dependiente de ADN). De esta
forma se va desenrollando la doble hlice a razn de unas 1200
pb/ seg.
4) Sntesis cnjugativa del ADN: Se producen dos procesos
simultneos de sntesis de ADN, uno en cada clula:
a) Sntesis de la cadena de reemplazo del donador (SCRD):
esta sntesis opera de modo continuo (sera equivalente a la
sntesis de la cadena adelantada de la replicacin normal). Esta
sntesis se inicia a partir de un ARN cebador (primer en
ingls) sintetizado por un primosoma que reconoce una
secuencia (n') situada cerca de oriT.
b) Sntesis de la cadena complementaria en el receptor
(SCCR): a diferencia de la anterior, es discontinua, a base de
fragmentos de Okazaki (por lo tanto, sera la equivalente de la
sntesis de la cadena retrasada).En ambos casos parece ser que
el primosoma responsable de los ARN cebadores no es
exactamente idntico al que se emplea en la replicacin
normal, sino que est modificado por alguna funcin
especfica codificada por el plsmido F (una primasa
especfica del factor F).
5) Circularizacin del ADN transferido y replicado, y
adquisicin de configuracin final: No se sabe exactamente
cmo ocurre la circularizacin (o sea, cmo se vuelven a ligar los
extremos generados por la rotura descrita en el apartado 1).
Parece ser que el complejo {TraY+TraZ} guarda la energa del
enlace fosfodister que l corta (conservndola al unirse con el
ADN cortado), y luego la vuelve a emplear para sellar el corte
una vez que las cadenas han sido replicadas-y-transferidas (o sea,
el complejo actuara al final como una ADN-ligasa).
Posteriormente, sobre esta molcula circular cerrada
covalentemente (c.c.c.) y an relajada, acta la ADN-girasa,
introduciendo superenrollamiento negativo. En esta
configuracin, el plsmido F queda intacto y funcional en el
transconjugante.
6) En el caso de cruces Hfr x F
--
, al menos una parte del fragmento
cromosmico arrastrado desde el donador al receptor se
recombina, con un doble sobrecruzamiento (por el sistema de
RecA) con la porcin homloga del endogenote, lo que lleva a
sustitucin de unas secuencias por las otras.
2.3 REGULACION GENTICA DE LA CONJUGACION
La mayor parte de los plsmidos conjugativos (pero
curiosamente no el F) tienen un control negativo de su transferencia,
de modo que slo se transfieren a alta frecuencia durante unas pocas
generaciones, al cabo de las cuales se establece una baja frecuencia
de conjugacin(8[2]). El resto del tiempo, los genes tra estn
reprimidos.
Vamos a referirnos a un plsmido que s tiene control negativo:
el R1, perteneciente a otro grupo de incompatibilidad (IncFII)
distinto del F, pero que por lo dems tiene funciones similares:

8
[2]
.- La cepa K12 de Lederberg y Tatum, con la que se realiz los primeros estudios conjugativos y
que sirvi de modelo de conjugacin, result ser "muy poco modlica" en cuanto a la regulacin, ya
que en su origen evolutivo perdi ese mecanismo de control negativo.
La regulacin negativa se produce por la accin de los genes
finO y finP, e implica un mecanismo basado en ARN regulatorio
antiparalelo (antisentido).

finO est situado distalmente respecto del gran opern traYZ.

finP est situado en la zona proximal, superpuesto de hecho con
el gen traJ , transcribindose en sentido opuesto, a partir de la
cadena opuesta a la que se usa para la transcripcin de traJ.

El ARN producido por transcripcin de finP es antiparalelo
respecto de una parte del ARNm del gen traJ. El producto de traJ
es un activador de la transcripcin del gran opern traY.....Z.
Ahora bien, el ARN antiparalelo de finP tiende a emparejarse con
la porcin 5' del ARNm de traJ, ocultando la secuencia de Shine-
Dalgarno. La conjuncin de la expresin de finP y de finO (que
produce una protena represora) tienden a dificultar la expresin
(a nivel traduccional y transcripcional) del gran opern tra.
La superposicin de un sistema de regulacin positiva (por
traJ) con otro de regulacin negativa (por finO + finP) es la
responsable de una importante caracterstica de muchos plsmidos
conjugativos: su dispersin espordica de tipo epidmico entre
poblaciones bacterianas:

Supongamos que partimos de una poblacin donde originalmente
casi todas las clulas son de tipo infrtil (F
--
o R
--
), y donde existe
una minora de clulas poseedoras de un plsmido conjugativo con
el tipo de regulacin que acabamos de describir. Cuando alguna de
las clulas infrtiles reciban por conjugacin una copia del
plsmido, tiene que pasar un tiempo (contado en generaciones de
divisiones celulares) hasta que se vayan acumulando los productos
de los genes finO y finP hasta que alcancen una concentracin
suficiente como para inhibir la conjugacin. Por lo tanto, durante
unas pocas generaciones el plsmido tiene una gran tendencia a
transferirse a clulas F
--
. Se dice que durante ese tiempo ocurre
una alta frecuencia de transferencia (HFT). De este modo, bastan
esas pocas generaciones para que el plsmido se disemine de
forma epidmica a casi toda la poblacin.

Al cabo de ese tiempo, la acumulacin del ARN de finP y de la
protena de finO llega a un nivel que ya es capaz de inhibir la
conjugacin eficazmente. El cultivo pasa, pues, a la modalidad de
baja frecuencia de transferencia conjugativa (LFT). Sin embargo,
para cuando se haya establecido este control, prcticamente todas
las clulas se habrn convertido ya en F
+
. Estamos, pues, ante un
sistema de conjugacin que permite prever su propia
desconexin (con el consiguiente ahorro), una vez que se ha
logrado el objetivo de haberse diseminado a la poblacin.
Significado adaptativo de este sistema de control: Como
acabamos de exponer, este sistema asegura la rpida dispersin
epidmica de los plsmidos, de modo que la represin de la
transferencia se produce coincidiendo con la situacin en la que de
hecho el plsmido conjugativo ha invadido toda o casi toda la
poblacin, ahorrndose la energa y materiales que tendra que
dedicar a fabricar pelos sexuales y dems funciones conjgativas en
unas circunstancias en las que seran superfluos.
Pero adems, como se recordar, los pelos sexuales son la zona
de reconocimiento de una diversidad de fagos (p. ej., para los pelos
F existen diversos fagos icosadricos de genomio ARN que se
adsorben a los laterales del pelo, y fagos filamentosos de ADN que
comienzan su infeccin unindose a la punta del pelo sexual). Cabe
imaginar que la represin de las funciones tra (entre ellas, claro est,
la fabricacin del pelo) son una ventaja para la bacteria, al evitar que
durante la mayor parte del tiempo puedan iniciar la infeccin dichos
fagos especficos.
3 INTERACCIONES DEL PLSMIDO F CON EL
CROMOSOMA
3.1 FORMACIN Y CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS
Hfr
Como ya dijimos, el plsmido F puede pasar desde su estado
autnomo a un estado integrado en el cromosoma bacteriano
(episoma), lo que es el origen de la creacin de las cepas Hfr.
Veamos ahora la base gentico-molecular de este proceso:
Se da una recombinacin entre secuencias homlogas
presentes simultneamente en el plsmido F y en el cromosoma, que
son secuencias de insercin. Concretamente, en F existen 2 copias
de IS3, 1 copia de IS2 y una copia de Tn1000 (que hasta hace poco
se denominaba o), y en el cromosoma hay varias copias de IS. Esta
recombinacin se da principalmente debido a la actuacin del
sistema de recombinacin homloga (dependiente de RecA), de
modo que las IS funcionan aqu como regiones porttiles de
homologa implicadas en eventos de recombinacin homloga con
un sobrecruzamiento (crossing-over) sencillo. Sin embargo, en
las cepas mutantes recA
--
, la recombinacin puede tener lugar por el
sistema de recombinacin ilegtima propio de los elementos
transponibles (el mecanismo sera el de la fusin de replicones, al
que aludimos cuando estudiamos la transposicin). En cualquiera de
los dos casos, el plsmido integrado, es decir, el episoma, aparece
emparedado entre dos copias de la IS implicada en la
recombinacin.
Cada recombinacin origina una Hfr distinta, dependiendo de
las secuencias IS implicadas, de su localizacin dentro del
cromosoma de E. coli, y de la orientacin. Ya dijimos que se han
identificado unas 22 cepas Hfr distintas, y que existen ejemplos de
parejas de Hfr que transfieren cromosoma a partir del mismo punto
cromosmico, pero en orientaciones opuestas.
Recordemos de nuevo que las Hfr codifican todas las
funciones del plsmido F. Al promover la transferencia conjugativa,
arrastran al cromosoma desde el oriT. Para que se transfiriera todo
el cromosoma, la pareja de cruce debera permanecer unida 100
minutos, y en ese caso, lo ltimo que se transfiere es la porcin del
plsmido F que queda al otro lado de oriT (y que es la que lleva la
regin tra). Pero como dijimos, ello ocurre raramente (porque antes
las parejas de cruce se deshacen espontneamente), y por lo tanto,
esta es la razn de que en los cruces HfrXF
--
los transconjugantes
siguen siendo F
--
.
As pues, en la mayer parte de los cruces HfrFXF
--
, lo que se
transfiere (el exogenote) es un fragmento ms o menos largo de
ADN cd lineal del donador, encabezado por una parte del plsmido
F y seguido por un trecho de cromosoma. Este fragmento no tiene
capacidad de replicacin autnoma, y su destino ser perderse a no
ser que se recombine con alguna porcin homloga del endogente.
Si ocurre esa recombinacin, y suponiendo (como ocurre en los
experimentos) que donador y receptor tienen marcadores distintos,
nosotros detectamos eso precisamente por la alta frecuencia de
recombinantes entre la poblacin de transconjugantes receptores. No
hace falta insistir (ya lo vimos en los experimentos de Jacob y
Wollman) que para cada cepa Hfr existe un gradiente de
marcadores transferidos, segn su frecuencia final en los
transconjugantes, que a su vez se correlaciona con el tiempo de
entrada al receptor (siendo esto la base de la elaboracin de mapas
genticos por conjugacin).
3.2 REVERSIN DE LAS CEPAS Hfr, ORIGEN DE LAS F',
Y SEXDUCCIN
La cepa Hfr puede revertir a F
+
, por una escisin precisa
(exacta), que implica los extremos del factor integrado (las
secuencias IS que lo emparedan). Cada cepa Hfr concreta presenta
una frecuencia caracterstica de reversin a F
+
. Algunas cepas son
muy inestables, de modo que revierten frecuentemente, lo que obliga
a purificarlas continuamente en el laboratorio para evitar que al final
se obtenga una poblacin F
+
. En cambio, otras cepas son muy
estables. La cepa HfrC es la ms estable, de modo que raramente
revierte por escisin.
Pero tambin pueden ocurrir escisiones imprecisas (en las que
estn implicadas secuencias repetidas diferentes a las IS que
flanquean al episoma), de modo que el factor F adquiere trozos de
genomio bacteriano adyacentes al lugar donde estaba integrado.
Estos plsmidos F autnomos que adquieren e incorporan
permanentemente un trozo de genomio bacteriano, se
denominan F' (F-primas). Dependiendo de qu se lleva en su
escisin anmala se pueden distinguir:
1) Escisiones que dejan parte de F en el genforo pero que
adquieren genes a uno u otro lado del sitio original de
insercin: generan las F' de tipo I, que a su vez pueden ser:
a) F de tipo Ia: adquiere genes del lado proximal (o sea, aquellos
que la cepa Hfr original transfera en primer lugar);
b) F' de tipo Ib: adquiere genes del lado distal (los que se
transferan tardamente por la cepa Hfr original).
2) Escisiones que no dejan ninguna porcin de F en el genomio
bacteriano, pero que incorporan genes a ambos lados del sitio
de insercin original: generan F' de tipo II.
A las cepas donde se genera originalmente cada F' concreto se
las llama con el nombre de cepas F' primarias. Cada plsmido F'
porta un segmento concreto y discreto de cromosoma, que
dependiendo de la cepa puede tener una longitud de hasta el 25% del
cromosoma bacteriano. Observen que una cepa F primaria tiene una
deleccin en su cromosoma, pero esa deleccin no es letal, porque el
trozo de ADN escindido sigue en la clula, aunque formando parte
ahora del F prima.
Si realizamos un cruce F' x F
--
, la clula receptora adquiere ese
plsmido F', y por lo tanto, los genes bacterianos portados por dicho
F'. Esta es la base del siguiente concepto:
3.3 SEXDUCCIN
La sexduccin consiste en el transporte de material gentico
desde una clula a otra por medio de plsmidos F'. Sus caracteres
distintivos respecto de los cruces F
+
x F
--
y de los Hfr x F
--
son:

A diferencia de los cruces F
+
x F
--
, el plsmido F' transfiere
regiones cromosmicas discretas a altas frecuencias (cercanas al
100%);

Pero a diferencia de los cruces Hfr x F
--
, el receptor se convierte en
frtil.
Las cepas generadas por transferencia a ellas de un F' desde
una cepa F' original se denominan F' secundarias. Tras la
sexduccin, si la cepa receptora es recA
+
, se produce una
recombinacin entre segmentos cromosmicos (procedentes de la
clula donadora) portados por el F' y marcadores cromosmicos
homlogos de esa cepa receptora. Se origina una cepa parecida a las
Hfr (pero que no se ha producido por recombinaciones a travs de
las IS), que es merodiploide (diploide parcial) por
recombinacin, y no un recombinante por sustitucin.
Si se cura una cepa F' primaria de su plsmido F', obviamente
quedar sin los genes cromosmicos que haba secuestrado el
factor F'. Si dichos genes eran esenciales para la viabilidad celular,
el resultado es que la clula muere. Si no eran esenciales, se
producir la prdida de funciones correspondientes, con la pertinente
alteracin del fenotipo.
El uso de factores F-primas fue muy til durante muchos aos
para hacer anlisis genticos en bacterias (por ejemplo, muchos de
los datos sobre el opern lac de Escherichia coli se obtuvieron con
F-primas, lo cual permita realizar pruebas de complementacin cis-
trans). Sin embargo, actualmente, al igual que otras tcnicas in vivo
desarrolladas durante la edad de oro de la gentica molecular
(aos 50-60), han sido prcticamente desplazadas por los mtodos
de Ingeniera Gentica.
4 ALGUNAS IDEAS ADICIONALES SOBRE BIOLOGA DE
LOS PLSMIDOS
Vamos a concluir el presente captulo con una rpida visin de
algunos aspectos importantes de la biologa de los plsmidos,
detenindonos en algunos sistemas plasmdicos distintos al tipo del
factor F que acabamos de estudiar.
4.1 TIPOS DE PLSMIDOS
Existe una amplia variedad de plsmidos. Los plsmidos
bacterianos son de muchos tipos distintos, pero a grandes rasgos
podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:
1) Segn que sean autotransmisibles por conjugacin o no:
a) plsmidos conjugativos
b) plsmidos no-conjugativos. Dentro de esta categora se
incluyen:
i) plsmidos no movilizables
ii) plsmidos movilizables por otros que s son conjugativos.
2) Segn su control de replicacin vegetativa:
a) Plsmidos de control estricto del nmero de copias: tienen bajo
nmero de copias por cromosoma en la misma clula. Suelen
ser plsmidos de tamaos medianos (unas 30 kb) a grandes
(cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por
cromosoma.
b) Plsmidos de control relajado: alto n de copias por
cromosoma (ms de 10). Suelen ser plsmidos pequeos
(menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de
replicacin especial, y son amplificables cuando a las bacterias
que los poseen se les aade cloramfenicol: este antibitico
detiene la sntesis de protenas, lo que afecta a la replicacin
del cromosoma, ya que para que se inicie cada ciclo de
replicacin cromosmica se necesita un nuevo pool de
determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicacin del
plsmido, que de este manera se amplifica y aumenta an
ms su proporcin respecto del cromosoma.
3) Segn el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los
plsmidos crpticos, de los que se desconoce su funcin
fenotpica):
a) Plsmidos R, que codifican una o ms resistencias a drogas
(antibiticos) y/o resistencia a metales pesados.
b) Plsmidos bacteriocinognicos, que codifican alguna
bacteriocina y simultneamente confieren inmunidad frente a
esa bacteriocina a la bacteria que lo posee. Dentro de ellos, de
los ms estudiados son los plsmidos Col, que producen
colicinas (bacteriocinas de E. coli).
c) Plsmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas
con la virulencia en muchas bacterias patgenas. Por ejemplo:
i) plsmido de la toxina tetnica en Clostridium tetani.
ii) plsmido de la toxina del ntrax en Bacillus anthracis.
d) Plsmidos que codifican factores de colonizacin (para la
invasin de los tejidos de su hospedador).
e) Plsmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas
metablicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y
energa sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:
i) plsmidos OCT (degradacin del octano);
ii) plsmidos TOL/XYL (degradacin del tolueno y xileno);
iii) plsmidos NAF (degradacin del naftaleno), etc.
f) Plsmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones
relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras
de nitrgeno en los ndulos radicales de las leguminosas
(pSym y otros tipos).
g) Plsmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la
produccin de tumores en numerosas plantas dicotiledneas.
h) Existen igualmente plsmidos que codifican ms de un tipo de
fenotipos: p. ej., plsmidos que suministran resistencia a
antibiticos y capacidad de virulencia.
4) Plsmidos segn el grupo de incompatibilidad. Recordar la
definicin de incompatibilidad entre plsmidos que se dio
oportunamente, y la base de este fenmeno: dos plsmidos son
incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma
clula) porque comparten un mismo sistema de replicacin y
segregacin de las copias. Como se sabe, los plsmidos se pueden
clasificar segn su pertenencia a un mismo grupo de
incompatibilidad.
a) As p. ej., el plsmido F pertenece al llamado grupo IncFI;
b) Los plsmidos R1 y R100, de resistencia a antibiticos,
pertenecen al grupo IncFII.
Obsrvese que dos plsmidos conjugativos pertenecientes a
grupos de incompatibilidad diferentes pueden poseer regiones tra
semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto es
precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el
R100.
4.2 MS IDEAS ACERCA DE PLSMIDOS EN BACTERIAS
GRAM NEGATIVAS
En Gram negativas existe una muy amplia variedad de
plsmidos. Podemos encontrar ejemplos de plsmidos conjugativos,
aunque no todos basados en el sistema que hemos estudiado para el
factor F. Muchos plsmidos conjugativos poseen pelos de tipo F
(por ej., los ya citados R1 y R100), pero existen otros tipos de
sistemas, con sus correspondientes clases de pelos sexuales. p. ej., el
plsmido colicinognico ColE1 posee pelos de tipo I.
Existen muchos casos de plsmidos no conjugativos, pero
algunos de ellos pueden ser transferidos a cepas receptoras cuando
conviven en la clula donadora con otro plsmido conjugativo
capaz de movilizarlos. Ello suele deberse a que estos plsmidos no
autotransmisibles pero movilizables carecen de la regin tra, pero
poseen una regin denominada mob (del ingls mobilizable), que
es reconocida por protenas Tra de conjugacin suministradas en
trans por el plsmido movilizador, aunque la regin mob del
plsmido movilizable suministra una regin en cis (la secuencia
oriT) y un par de funciones en trans (la endonucleasa especfica que
acta sobre oriT , y una helicasa).
En algunas bacterias Gram negativas, p. ej., en cepas de
Pseudomonas existe un tipo especial de plsmido conjugativo, que
tiene la facultad de transferirse a s mismo y transferir cromosoma
entre una amplia variedad de bacterias Gram negativas, incluyendo
entre gneros muy diferentes. A esta clase de plsmidos se le ha
dado el nombre de plsmidos promiscuos, y se han usado mucho
para realizar mapeos y anlisis genticos en bacterias que por s
mismas carecen de sistemas naturales de conjugacin. Ejemplos:

determinados plsmidos de resistencia a antibiticos
pertenecientes al grupo IncP1 (como el RP4 y el R68.45, ambos
con el fenotipo Amp
r
, Kan
r
, Tet
r
).

Plsmidos del grupo IncW (como el R388).

Plsmidos del grupo IncN (como el pKM101)
La existencia de plsmidos conjugativos, promiscuos o no, y
de plsmidos no conjugativos pero movilizables, explica la rpida
diseminacin de muchos plsmidos de resistencia a antibiticos a
una amplia diversidad de bacterias, incluyendo importantes
patgenas, lo que hace cada vez ms difcil la lucha por
quimioterapia contra estas ltimas. De hecho, un importante
problema sanitario lo suministran estas cepas multirresistentes,
muchas de las cuales estn acantonadas en los ambientes
hospitalarios, donde la presin selectiva es grande. A continuacin
nos detendremos precisamente en un comentario sobre los plsmidos
R, su significado evolutivo y su importancia epidemiolgica.
4.3 PLSMIDOS R
Los plsmidos de resistencia a antibiticos (plsmidos R)
fueron descubiertos en los aos 50 en Japn, cuando se investigaban
cepas de Shigella multirresistentes (Cm
r
, Sm
r
, Su
r
, Tet
r
) que haban
empezado a aparecer y proliferar, de modo que en pocos aos se
diseminaron rpidamente por todo el primer mundo. Enseguida se
encontraron en numerosos pases cepas de E. coli y de otras
enterobacterias con plsmidos similares.
Del intenso estudio a que han estado sometidos estos
plsmidos desde entonces se deduce que los plsmidos R son
maleables y que evolucionan rpidamente ante la presin
selectiva. Con las modernas tcnicas de Ingeniera Gentica y de
secuencicin de ADN ha sido posible medir el grado de similitud de
los genes plasmdicos de resistencia a antibiticos procedentes de
bacterias muy diferentes, y de orgenes geogrficos muy alejados
entre s, deducindose que estos genes han debido de pasar de
forma epidmica de unas cepas a otras, entre especies y gneros muy
distintos (transmisin horizontal de informacin gentica). Un
mismo gen, conservado en su secuencia en especies muy alejadas,
puede sin embargo estar situado en plsmidos de diferentes tipos y
grupos de incompatibilidad. Esto ya es un indicio de que los
plsmidos R son bastante moldeables, y que han venido
evolucionando rpidamente desde que el hombre introdujo los
quimioterpicos a mediados de este siglo.
Para hacernos una idea concreta del tipo de procesos
implicados en este gran experimento de evolucin bacteriana
desencadenado por el hombre, veamos la estructura del ya citado
plsmido R1, un tpico plsmido R conjugativo.
Observen en los mapas genticos que posee dos grandes regiones,
denominadas determinantes (det):

det-r: regin portadora de los genes de resistencia a distintos
antibiticos.

det-RTF: regin con los genes tra, responsable del carcter
conjugativo del plsmido.
Veamos en ms detalle el determinante r. Comprobaremos
que est compuesto de mdulos, algunos de los cuales son
transposones. El determinante r como un todo est limitado por
dos copias directas del IS1. Existe dentro un transposn, el Tn4, que
codifica Sm
r
y Su
r
, pero a su vez, dentro de l se insert otro
transposn, el Tn3 (que codifica Amp
r
). Por fuera del doble
transposn Tn4-Tn3 encontramos ms genes de resistencias: Cm
r
(a
la izquierda), y Kan
r
, Neo
r
. Las copias de IS1 hacen que todo el
determinante r se comporte a su vez como un enorme transposn
compuesto:

El r puede transponerse a otro plsmido totalmente diferente, o
incluso al cromosoma;

El r puede escindirse, es decir, puede separarse del RTF, por
recombinacin homloga entre las dos copias directas de IS1.

El r puede amplificarse: se originan varias copias de r dentro
del mismo plsmido, de manera que esto permite a la bacteria
resistir mayores concentraciones de los antibiticos.
Consecuencias evolutivas y epidemiolgicas: Aunque en la
naturaleza, e independientemente de la accin humana, ya existan
plsmidos R antes de la era de los antibiticos, est claro que desde
el uso masivo de los quimioterpicos se ha originado un aumento
espectacular del nmero de cepas bacterianas portadoras de
plsmidos R, as como el hecho de que los R que se estn aislando
recientemente llevan mayor nmero de genes de resistencia, lo que
est dificultando los tratamientos de ciertas enfermedades
infecciosas.
Estamos ante un espectacular experimento de gentica de
poblaciones, en el que la accin humana ha llevado a la
supervivencia y prevalencia de las cepas bacterianas ms aptas, por
adaptacin evolutiva frente a una fuerte presin selectiva.
Para ilustrar esto, basta hacer una sencilla comprobacin: si se
trata a un paciente con tetraciclina, al cabo de una semana las cepas
de E. coli que se aislen de sus heces sern casi en su totalidad Tet
r
.
Est claro que la prescripcin y uso indiscriminado de
antibiticos como terapia provoca una presin selectiva que favorece
la prevalencia de cepas portadoras de plsmidos R, que van
incorporando genes de resistencia a diversos quimioterpicos. El
uso de un antibitico provoca la seleccin automtica de las dems
resistencias a otros antibiticos, ya que los genes responsables
respectivos forman parte del mismo replicn, que adems, al ser en
muchos casos de tipo conjugativo, puede diseminarse a otras cepas
de la misma o de diferentes especies.
En muchos pases se usan antibiticos como suplementos de
dieta para los animales domsticos. Se ha comprobado que esto es
tambin una fuente de transmisin de cepas resistentes a humanos.
Otra cuestin evolutiva, an no resuelta, es la del origen ltimo
de los genes de resistencia que tan fcilmente parecen transferirse
entre especies bacterianas. Una hiptesis es que proceden de
bacterias del suelo del grupo de los Actinomicetos, sobre todo del
gnero Streptomyces, que son tpicos productores de antibiticos, y
que poseen de modo natural mecanismos de resistencia para evitar
que el antibitico que producen les afecte negativamente.
4.4 CONJUGACION EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Hasta ahora, y a diferencia de Gram negativas, se han
encontrado pocos sistemas conjugativos en Gram positivas. Existen
ejemplos de plsmidos autotransmisibles en especies de
Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium y Streptomyces,
y todos ellos son bastante diferentes de lo estudiado en Gram
negativas. Por ejemplo, en ninguno de estos hay implicacin de
pelos sexuales.
Los plsmidos conjugativos de los cocos en cadenas (gns.
Streptococcus y Enterococcus) han recibido cierta atencin en los
ltimos aos.

Algunos de estos plsmidos (p. ej., pAM1) promueven una
conjugacin poco eficiente en lquidos, pero muy eficiente cuando
las cepas donadoras y receptoras se mezlan sobre la superficie de
un filtro de tipo Millipore.

Otros plsmidos son muy eficientes en lquidos, como les ocurre a
ciertos plsmidos de Enterococcus faecalis. En estos casos el
sistema de conjugacin de la clula donadora portadora del
plsmido responde a la presencia en el medio de feromonas
sexuales excretadas por las clulas receptoras, carentes del
plsmido. Existen varios ejemplos de este tipo que funcionan
segn este modelo. En cada caso, cada tipo de clula donadora
(segn el plsmido concreto que lleve) responde a un tipo definido
de feromona. Las feromonas son pequeos pptidos de alrededor
de 1.000 dalton de peso molecular. Una cepa receptora puede
producir varias feromonas distintas, cada una dedicada a
provocar una respuesta conjugativa en diferentes cepas donadoras
segn el plsmido que porten. Cuando una determinada feromona
alcanza la superficie celular de la correspondiente clula donadora,
induce en esta una serie de funciones relacionadas con la
conjugacin, una de las cuales es la produccin de sustancias de
agregacin, que provocan la adhesin entre donadoras y
receptoras. Una vez que la clula originalmente receptora recibe el
plsmido, se convierte en donadora de ese plsmido, y se reprime
la produccin de la feromona correspondiente, aunque las otras
posibles feromonas se siguen sintetizando.

Por ejemplo, las clulas portadoras del plsmido pAD1 detectan
un tipo concreto de feromona, lo que genera la respuesta de
agregacin con las clulas que producen esa feromona.
4.5 TRANSPOSONES CONJUGATIVOS EN
ENTEROCOCCUS
En E. faecalis y otros cocos Gram positivos se ha descubierto
una clase especial de transposones que tienen la curiosa propiedad
de inducir conjugacin entre dos clulas para transponerse desde el
cromosoma de la donadora al de la receptora, pero sin producir
transferencia de marcadores cromosmicos. El mecanismo an se
desconoce en detalle, pero parece que implica la circularizacin del
transposn al escindirse del genforo donador. Al parecer, esta clase
de transposones conjugativos son los principales responsables de la
diseminacin de resistencias a antibiticos entre cepas de estos
estreptococos y a otras bacterias Gram-positivas. Ej.: Tn916, que
codifica Tet
r
y que mide unas 16 kb.
4.6 TRANSFERENCIA CONJUGATIVA ENTRE REINOS
Un sorprendente sistema de intercambio de material gentico
nada menos que entre una bacteria y plantas superiores lo tenemos
en el caso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que parasita
una amplia diversidad de plantas dicotiledneas. Como el estudiante
ver en la seccin de Taxonoma bacteriana, esta bacteria provoca el
llamado tumor en agalla en los tallos de muchas plantas, debido a
que posee un plsmido llamado Ti (iniciales inglesas de induccin
de tumoracin (=agalla en corona). Los productos de ciertos genes
del plsmido Ti detectan la presencia de la planta, y activan a los
genes tra, que promueven la transferencia a la clula vegetal de un
segmento del plsmido denominado ADN-T. Dicho ADN-T se
integra en el genoma vegetal, y all los genes que lleva, que son de
tipo eucaritico, obligan a la planta a fabricar hormonas vegetales
(responsables del crecimiento incontrolado de las clulas de la
planta) y a fabricar unas sustancias (las opinas) que slo puede usar
la bacteria como fuente de C y energa. Estamos ante un
extraordinario caso de colonizacin gentica de una bacteria sobre
un organismo superior.
Los humanos hemos aprendido, a nuestra vez, a domesticar
el sistema del plsmido Ti, de modo que actualmente, a partir de l
se puede realizar Ingeniera Gentica de plantas. La mayor parte de
las plantas transgnicas estn obtenidas con algn sistema de
plsmidos artificiales derivados de Ti, que funcionan como vectores
para introducir genes forneos en una amplia diversidad de especies
vegetales.


NDICE
1 PREMBULO: AVANCE DE CONCEPTOS SOBRE
BACTERIFAGOS
2 APROXIMACIN HISTRICA Y CONCEPTOS
GENERALES SOBRE LA TRANSDUCCIN .............................
3 TRANSDUCCIN GENERALIZADA
4 TRANSDUCCIN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA)

1 PREMBULO: AVANCE DE CONCEPTOS SOBRE
BACTERIFAGOS
Antes de entrar de lleno en el tema de la transduccin,
conviene que adelantemos algunas ideas generales sobre los virus
bacterianos con genoma de ADN, que nos sern tiles para el
presente captulo.

El proceso de la infeccin comienza cuando la partcula del fago
se adsorbe sobre receptores en la superficie de la bacteria.

Inyecta el ADN contenido en su cpsida. Entrada del ADN fgico
a la clula hospedadora. Este ADN tender a expresar su programa
gentico, pero el resultado final depender de que el fago sea de
tipo virulento o de tipo moderado:
A. Si el fago es de tipo virulento:
Se expresa el programa gentico vegetativo (ltico) de su
genomio, destinado a producir muchas copias de ese ADN fgico, y
muchas cpsidas proteicas. En el interior de cada cpsida se
introduce (se empaqueta) una copia del genomio del fago. Las
nuevas partculas (viriones), una vez completadas y ensambladas,
lisan a la bacteria, quedando libres en el medio y preparadas para
infectar nuevas clulas de la especie bacteriana hospedadora.
B. Si el fago es de tipo moderado pueden darse dos alternativas
distintas:

El ADN inyectado expresa su informacin vegetativa, de modo
que se produce un ciclo ltico, productivo de nuevos viriones,
similar al descrito para los fagos virulentos; o bien

Se pueden reprimir las funciones lticas del fago. En este caso el
ADN del fago establece una relacin benigna con su hospedador:
suele incorporarse por recombinacin especfica de sitio
conservativa (ver tema 17), integrndose en el genforo
bacteriano. A partir de este momento, el ADN del fago (que ahora
se llama profago) permanece en esta situacin, como una porcin
ms del genomio de la bacteria, replicndose como parte de ste.
El profago mantiene reprimidas todas sus funciones lticas
(vegetativas), expresando solamente una protena represora de
aquellas funciones (todo esto lo veremos en detalle en la seccin
de Virologa). La clula bacteriana portadora de un profago se
denomina lisognica, y el clon derivado de ella, clon lisognico.
Este tipo de relacin benigna es estable, pero de forma espontnea,
en algunas de las clulas del clon lisognico el profago despierta
y se activan sus funciones vegetativas: el profago se escinde del
genomio bacteriano (de nuevo por recombinacin especfica) y
expresa su programa ltico, que conduce a la produccin de nuevos
viriones, con lisis de la bacteria. Este fenmeno recibe el nombre
de induccin. Artificialmente se puede provocar la induccin de
casi todo el cultivo lisognico, tratndolo con determinados
agentes (luz UV, mitomicina, etc.) que daan el ADN y que
inducen el sistema SOS.
2 APROXIMACIN HISTRICA Y CONCEPTOS
GENERALES SOBRE LA TRANSDUCCIN
La transduccin fue cronolgicamente el ltimo sistema de
transferencia gentica bacteriana que se descubri.
En 1951 Joshua Lederberg y su colaborador Zinder estaban
investigando en Salmonella la posible existencia de un sistema de
conjugacin al estilo del que se acababa de descubrir en su pariente
Escherichia coli (ver captulo 18). Mezclaron dos cepas de
Salmonella, cada una con un juego distinto de marcadores genticos.
(Eureka! Obtuvieron recombinantes. Descartaron que se tratara de
transformacin, ya que los resultados eran similares si aadan
DNasa al sistema. Entonces, era un fenmeno de conjugacin?
Realizaron el experimento del tubo en U, con una membrana
separando los dos brazos de la U, en cada uno de los cuales se
colocaba una de las cepas. La membrana impide el paso de bacterias
y los contactos intercelulares directos entre las dos cepas. Pues
bien... segua habiendo recombinantes. Esto descartaba, pues, que se
tratara de conjugacin. Se postul que deba de existir un agente
filtrable resistente a las nucleasas, responsable ltimo de la
transferencia gentica.
Cul era la naturaleza exacta del misterioso agente filtrable?
Por experimentos independientes se saba que una de las dos cepas
de Salmonella produca un fago (llamado P22), de tipo moderado.
Con una serie de ensayos se demostr que era precisamente este
fago el responsable de los recombinantes:

el tratamiento de sobrenadantes de esa cepa con calor o con
antisuero provocaba la inactivacin tanto del fago como del agente
filtrable;

las cepas de Salmonella resistentes a P22 (porque no adsorben el
fago) no pueden interaccionar con el agente filtrable, y por lo tanto
tampoco dan recombinantes;

finalmente, se comprob que la cepa productora del agente
filtrable posea un fago moderado en forma de profago. La
induccin de esta cepa lisognica era la responsable de producir
algunas partculas de fagos portadoras de material gentico de la
cepa de origen, que los fagos inyectaban posteriormente a las
clulas de la cepa receptora.
As pues, se acababa de descubrir un nuevo sistema de
transferencia gentica entre bacterias, sistema que fue bautizado con
el nombre de transduccin.
La transduccin se puede definir como el proceso de
transferencia gentica desde una clula donadora a otra receptora
mediatizado por partculas de bacterifagos que contienen ADN
genmico de la primera. En la transduccin podemos distinguir dos
estapas diferenciadas:
1. Formacin de la partcula fgica transductora: un trozo de
material gentico de la clula donadora se introduce en el interior
de la cabeza de la cpsida de un fago. Las partculas transductoras
son en cierta manera subproductos anmalos del ciclo normal
del fago.
2. La partcula transductora inyecta de forma habitual el ADN que
porta a la clula receptora, donde este ADN puede eventualmente
recombinarse y expresar su informacin.
La transduccin descubierta por Lederberg y Zinder se llama
transduccin generalizada.

Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del
genforo del donador, con aproximadamente la misma
frecuencia relativa (de ah el calificativo de generalizada).

La transduccin generalizada se produce slo como consecuencia
de infecciones lticas.

El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido
en la partcula transductora suele ir sin acompaamiento de
ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partcula
consistente en cpsida del fago que encierra slo ADN
genofrico de la bacteria se la denomina pseudovirin.
Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos aos
ms tarde (1956), el mismo Lederberg (esta vez junto con su mujer,
y con Morse) hallaron un tipo nuevo de transduccin, mientras
estaban estudiando el sistema del fago moderado y su hospedador,
E. coli. Este tipo de transduccin recibi el nombre de transduccin
especializada, y sus caracteres distintivos son:

slo se transfieren marcadores cromosmicos cercanos al sitio
de integracin del ADN del fago (profago) en la clula lisognica
(p. ej., en el caso de , los marcadores gal o bio);

se produce nicamente como consecuencia de la induccin de la
clula lisognica por escisin del profago y consiguiente entrada
a fase ltica, productora de nuevas partculas de fago;

el ADN genmico de la bacteria transportado por la partcula
transductora va unido a ADN del fago;

la clula transductante se suele convertir en lisognica para el fago
correspondiente.
3 TRANSDUCCIN GENERALIZADA
Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier
trozo de genforo bacteriano, con tal de que tenga un tamao
compatible con la capacidad de empaquetado de ADN de la
cpsida del fago. La partcula transductora (pseudovirin) se forma
por empaquetamiento anmalo de ADN genofrico bacteriano. En
el interior de la cabeza del pseudovirin slo existe ADN
bacteriano, sin ADN del fago. Las partculas transductoras slo se
forman como consecuencia de infecciones lticas del fago.
Mecanismo de la transduccin generalizada promovida por el fago
P22 de S. typhimurium.
1 fase: produccin de las partculas fgicas transductoras
(=pseudoviriones): Por encapsidamiento ilegtimo de ADN
cromosmico. De vez en cuando, el sistema fgico encargado de
introducir su ADN en la cpsida (sistema pac), se equivoca, y en
su lugar introduce un trozo de tamao equivalente del genforo de la
bacteria donde est teniendo lugar la infeccin (9[1]).
Al parecer, el cromosoma bacteriano contiene secuencias que
eventualmente pueden ser reconocidas de vez en cuando por el
sistema del fago, de manera que puede introducirse un trozo de
ADN de Salmonella en la cpsida.
Al final de esta fase, la clula hospedadora se lisa. El lisado
(sobrenadante) contiene una mayora de viriones autnticos y un

9
[1]
.- Dependiendo del fago en cuestin, el tamao del fragmento encapsidado vara entre 0,5 hasta
2,5% del tamao total del genoma de la bacterias.
pequeo nmero de pseudoviriones, cada uno con un trozo aleatorio
distinto del genomio de la bacteria.
2 fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado
obtenido en la fase anterior con un cultivo de la cepa receptora
(dotada de marcadores genticos adecuados). Cada pseudovirin
inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede
tener varios destinos posibles:
a) puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplsmicas.
b) Puede recombinarse con la regin homloga del genforo
del receptor, mediante la actuacin del sistema de
recombinacin general dependiente de RecA. Se produce una
recombinacin con dos sobrecruzamientos (crossing-overs),
que conduce a la integracin de doble cadena de ese
exogenote, con eliminacin de la zona homloga del
endogenote.
c) Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni
recombinado; este ADN puede persistir en la clula sin
replicarse. La consecuencia de esto es que cuando la clula
que originalmente recibi ese ADN exgeno se divida, lo
pasar solo a una de las dos clulas hijas, la cual a su vez la
pasar a una hija en la siguiente divisin, y as sucesivamente.
Tenemos, pues, que el exogenote se va diluyendo en el clon
por transmisin unilinear: tras varias generaciones, el clon
consta de n-1 clulas sin exogenote y una sola clula con ese
exogenote. A este fenmeno se le conoce con el nombre de
transduccin abortiva, y es ms frecuente que la transduccin
completa derivada de recombinacin (ms de 90% frente a
slo 1-5%).
La clula que alberga el exogenote abortivo puede expresar los
genes de ste: por lo tanto, la clula transductante abortiva
contiene protenas derivadas del exogenote. Parte de las
protenas (en principio la mitad), pasarn a la clula hija que
no reciba el exogenote en la siguiente generacin. Las hijas de
la hija (las nietas no herederas del original) reciben la cuarta
parte, etc... es decir, aparte de la clula hija que en cada
generacin hereda el exogenote, sus parientes no-herederos
ms cercanos reciben protenas derivadas de la expresin
previa de los genes del exogenote. Esto significa que las
clulas no herederas pueden poseer, durante unas pocas
generaciones, la funcin o funciones del exogenote, hasta que
el producto correspondiente se diluya o se inactive.
Esto permite detectar fcilmente determinados tipos de
transductantes abortivos, distinguindolos de los
transductantes completos. Por ejemplo, si estamos
seleccionando transductantes en base a la adquisicin, por
parte de una cepa receptora auxotrofa, de la versin silvestre
del gen que tiene mutado, sembrando en placas de Petri con
medio mnimo, se distinguen dos dos tipos de colonias:

colonias grandes, correspondientes a transductantes
completos;

microcolonias, correspondientes a los transductantes
abortivos.
d) Si el exogenote es un plsmido, al llegar a la clula receptora,
puede replicarse autnomamente.
e) Si el exogenote contiene un transposn, ste puede insertarse
en el genoma de la clula receptora.
No todos los fagos virulentos pueden actuar como mediadores
de transduccin generalizada. Los fagos con esta capacidad suelen
ser aquellos que no degradan totalmente el ADN del hospedador
inmediatamente despus de entrar (de otra manera, no habra ADN
intacto que transducir). Adems, su sistema de empaquetamiento de
ADN no debe ser muy especfico: fagos como el P22 de Salmonella
typhimurium o el P1 de Escherichia coli tienen un mecanismo de
empaquetado secuencial de unidades de concatmeros, mecanismo
que reconoce secuencias que tambin existen con cierta frecuencia
en el genoma del hospedador.
La transduccin generalizada ha sido muy til en el anlisis
gentico de bacterias y la construccin de nuevas cepas. El alumno
seguramente estudiar en la asignatura de Gentica algunas
aplicaciones, incluida la elaboracin de mapas de ligamiento. En las
prcticas de Virologa del Departamento de Microbiologa de la
Facultad de Ciencias los estudiantes realizan un interesante
experimento de co-transduccin que permite aplicar algunas de estas
ideas.
4 TRANSDUCCIN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA)
Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg
(1956), mientras hacan experimentos de induccin de clulas de E.
coli lisogenizadas con el fago . Este tipo de transduccin consiste
en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos
en la induccin de un cultivo lisognico-, de un nmero limitado de
marcadores, correspondientes a los loci genticos adyacentes al
sitio de integracin del profago. La transduccin restringida nunca
ocurre por infecciones lticas. El ADN transducido va unido a ADN
del fago.
Mecanismo de la transduccin especializada promovida por el fago
de Escherichia coli
1 fase: Produccin de los fagos transductores: Supongamos una
cepa silvestre de E. coli K12 (
+
), o sea, lisognica para el fago .
Como ya sabemos, el profago se encuentra integrado entre los
operones gal y bio.

Inducimos artificialmente este cultivo lisognico (tratando, p. ej.,
con rayos UV, o con mitomicina-C). El profago desreprime sus
funciones vegetativas, de modo que va a entrar en un ciclo ltico,
comenzando por escindirse del lugar de integracin, por medio de
una recombinacin especfica conservativa entre sus extremos
(BOP' X POB'). Con una baja frecuencia (10
-5
-10
--6
) se producen
escisiones anmalas del profago: bucles anmalos, de modo que
se forman crculos que llevan una porcin adyacente del
cromosoma bacteriano (dependiendo de los casos, o gal o bio), y
en cambio, queda un trozo del genomio del fago. De esta forma se
pueden formar fagos defectivos (d) para alguna funcin fgica,
pero con la contrapartida de ser portadores de material
genofrico de la bacteria hospedadora (10[2]).

As pues, de esta forma se obtiene un lisado (llamado lisado LTF,
de baja frecuencia de transduccin), donde existe una pequea
proporcin (alrededor de 10
--6
) de partculas defectivas del fago
portadoras de ADN cromosmico. Estos viriones, por s solos no
podran establecer lisogenia, pero si en una misma clula
inyectaran su ADN un fago defectivo y otro silvestre, este ltimo
actuara como fago auxiliador (helper) de modo que el defectivo
s podra entonces establecer lisogenia. A continuacin veremos
precisamente cada una de estas dos posibilidades. (En ambos casos
vamos a suponer que las partculas transductoras portan el opern
silvestre gal
+
, y que empleamos una cepa receptora mutante gal
--
).
2 fase en el caso de infectar una cepa receptora con el lisado
anterior a baja multiplicidad de infeccin: Imaginemos que
mezclamos un cultivo de la cepa receptora con un lisado LTF, a una
multiplicidad de infeccin (m.d.i., o en ingls, m.o.i) de alrededor de
1 (o sea, cada bacteria recibe, por trmino medio una sola partcula
de fago).

Una partcula gal
+
inyectara de forma normal su ADN en la
bacteria gal
--
. El ADN lineal del fago se circulariza como de

10
[2]
.- No siempre las escisiones anmalas producen fagos o|oo defectivos (dgal o dbio), sino que
tambin se pueden producir fagos transductores no defectivos (pgal o pbio).
costumbre. Pero obsrvese que este ADN no posee un sitio att
normal, sino que presenta solamente el sitio BOP' (derivado de la
escisin anmala producida en el ciclo anterior), y adems, al ser
defectivo, cabe la posibilidad de que haya perdido el gen int que
codifica la integrasa. En este caso, la nica posibilidad de
integracin del ADN es mediante recombinacin homloga
simple (un solo crossing-over) propiciada por el sistema RecA de
la bacteria receptora.

El resultado de esta recombinacin homloga es la creacin de un
heterogenote gal
+
/gal
--
con un profago defectivo, que debido a
ese carcter defectivo no es inducible (no provoca lisogenia).
Observar que cada copia del gen gal es en realidad un mosaico,
con una porcin derivada del exogenote y otra del endogenote.
Este heterogenote con fenotipo Gal
+
es estable.
2 fase en el caso de infectar la cepa receptora con el lisado LTF
a una alta multiplicidad de infeccin: Imagimenos ahora que
mezclamos una media de 10 partculas de fago del lisado obtenido
en la primera fase con 1 clula de la bacteria receptora (o sea, una
m.o.i.=10).

Algunas bacterias reciben el ADN del fago defectivo (dgal
+
)
junto con el ADN del fago silvestre.

El ADN del fago silvestre se integrara de la forma habitual,
mediante su sistema de recombinacin especfica de sitio (POP' X
BOB'). Este ADN del fago silvestre acta como auxiliador
respecto del defectivo: le suministra sitios para la recombinacin y
la funcin de la integrasa. Por lo tanto, a continuacin se produce
otro evento de recombinacin especfica entre ambos ADN de .

El resultado es un heterogenote gal+/gal
--
que es doble lisognico
(
+
/d). Su fenotipo sera Gal
+
y
+
, capaz de producir, por
induccin partculas de fago silvestres y defectivas.

Supongamos que inducimos ahora este clon doble lisgeno: se
producen dos bucles en cada clula, uno que regenera el genomio
circular del silvestre, y otro que origina el de dgal
+
. Observar,
pues, que el resultado de esta induccin es un lisado donde existe
un 50% de
+
y un 50% de fagos portadores del gen gal
+
. Si este
lisado lo usamos para infectar de nuevo una cepa gal
--
, la
proporcin de transductantes Gal
+
ser muy alta. Por esta razn, al
lisado obtenido por induccin del doble lisgeno
+
/d se le
denomina lisado HTF (alta frecuencia de transduccin).
La transduccin especializada con el fago permiti los primeros
aislamientos (clonaciones) de genes in vivo, pero por supuesto,
desde mediados de los aos 70 la clonacin de genes se realiza ya
con mtodos de ADN recombinante (ingeniera gen