MMNOHSTOKMYA TEKNKLER

Bugn immnohistokimyadan bahsedeceim. Dnem 1de de biraz bahsedilmiti bu konudan.

lk nce onlarn zerinden ksaca geeceiz. mmnohistokimyadaki teknikler nelerdi, nasl
yaplyordu. Neler iaretli, neler iaretsiz oluyordu onlardan bahsedeceiz. Daha sonra teknii
uygularken ne gibi eylere dikkat etmemiz gerekiyor? Onlardan bahsedeceiz. Dolaysyla
antikorlarn zellikleri nedir? Bu neydi? mmnohistokimyann sensivitesini artrmak
istiyorsanz neler yapmalsnz onlar konuacaz.

mmnohistokimya ve immn iaretleme dediimizde temel iki yapmz var. Birincisi
hcrenin ya da dokunun zerindeki antijenler, dieri de bunlara zgn olarak balanan
antikor, dier adyla immnoglobilinler. Temel prensip antijenle antikoru balayp bu
kompleksi kullandmz ynteme bal olarak k, floresan veya elektron mikroskopunda
grnr hale getirmek. mmnohistokimyada temel amacmz bu. Peki bunun iin k ya da
elektron mikroskopunda bu balant kompleksini grnr hale getireceksek bunlara farkl
iaretleyiciler balamamz gerekir. Antikorlarmzn iaretli iaretsiz olmasna bakarak onlar
1.resimde peroksidaz ya da ABC
yntemi kullanlm.
Diaminobenzidil(DAB)
(kahverengi grld iin)
2.resim floresan yntem
kullanlm.
renklendiriyorsunuz. Aslnda bizim histokimyada dokular boyayp grnr hale getirmemizle
ayn prensibe dayanr.
Elektron mikroskopunda yaplar daha kolay grnr hale getirebilmek iin farkl
byklkteki altnlar kullanyorsunuz. Altnn bykln bildiimiz iin -ka nanometre
olduunu- elektron mikroskopunda da bu komplekslerin olduu yerde altnn varlyla
kolayca ayrt edebiliyoruz. Peki biz peroksidaz yntemini kullanarak elektron mikroskopunda
grntleme yapamaz myz? Yapabiliriz. Daha boya keltisi gibi grlyor. Daha koyu
antikorlar var.

Yine molekler biyoloji dersinden de hatrlayacanz gibi, B hcrelerindeki plazma hcreleri
tarafndan uygun antijenin uyarm ile birlikte salglanr.


Peki immnoglobinlerin yani bu antikorlarn zerindeki antijenlere balanan spesifik
blgelerin adnn epiptop, antijenik determinant olduunu biliyoruz. Burada hem hcre
yzeyindeki antijenleri biz saptayabiliyoruz hem de hcre iindeki sitoplazmadaki ya da
ekirdekteki antijenleri biz saptayabiliyoruz. Bu yntemde 2 kritik nokta var. Hcre
yzeyindeki bir antijeni saptayacaksak bu ok kolay, antikorunu koyduumuz zaman antijen
antikoru kolaylkla balayabilir. Ancak ekirdekteki bir antijeni ya da sitoplazmadaki bir
antijeni saptayacaksanz, o zaman da ite zc baz ajanlar da immn iretlemeden nce
katmamz gerekiyor. Bu ok nemli ve kritik bir nokta. Peki ilk nce ne olmas gerekiyor o
zaman? Uygun antikorlarn bulunmas. Bunlar ticari olarak satn alnabilir. Baz
labaratuvarlarda antikor retilebiliyor. Ama bu ok pahal bir yntem. Antikoru ticari olarak
satn almak ok daha ucuz.
Biz immnohistokimyay patolojik tan amal cok fazla kullanyoruz. Bu adan ok nemli.
(Sinir sistemi dersinde de bahsetmi hoca) gliatblerasidik protein immnohistokimyas
astrositomlarn ayrc tansnda anahtar rol stlenmekte. Eer HFAP pozitif ise bu
tmrlerin kkeni astrositomdur diyebiliryoruz. Karsino embriyolojik antijende,
immnohistokimyasal olarak bunlar lokalize edip baz tmr tanlarnda kullanabiliyoruz.

Antikorlar immn yntemle baladktan sonra bunlar renklendirme aamasnda kromojenleri
kullanyoruz. Eer kullandnz antijen antikkor kompleksindeki iaretleriniz enzimse o
zaman kromojenleri kullanrz. Ancak kullandmz iaret enzim deil, floresan bir madde ise
rodaminse, herhangi bir kromoforsa bunlar kromojen aamasna gerek duymadan direkt
floresan mikroskopunda incelemeye alabiliyoruz.
Hatrlamak iin, immnogloblinlerin yapsn biliyorduk ve immnogloblinlerin antijen
balayc blgelerinin Y nin bacaklarnn olduu ksm- antikorlar kendilerine spesifik olan
antijenleri tanyorlar onun iin bir immn bir iaretleme yaparken de aldmz antikor, sadece
spesifik olan antijen iindir. Onun iin bir immnohistokimyasal alma planlarken ilk
aamada primer antikorlarn seimi ok nemli. Primer antikoru setikten sonra buna
balayacamz sekonder antikorlar nemli. Hereyden nce labaratuvar imkanlarna ve
benim amacm neye ynelik? Buna karar vermeliyiz.

Diyelim ki hasta aktini grntleyeceiz. Dokumuz insan. Antijenimize ilk nce primer
antikor balayacaz. Yani antijenimize spesifik bir antikor. Buna primer antikor diyoruz. te
bu primer antikorlarmz 2ekilde retilebilir. 1.monoklonal 2.poliklonal Bunlar arasndaki
fark nedir? Polikonal dediimizde nce bu spesifik antijeni alyorsunuz ve hayvana enjekte
ediyorsunuz. Hayvana verip hayvan da o antijene yabanc olduu zaman o hayvanda o
antijene kar antikor retiliyor. Hayvann serumundan da bu antikorlar izole ettiimiz zaman
biz bunlara polikonal diyoruz. Yani burada o antijenin birok epitopunu tanyan antikorlar
elde etmi oluyoruz. Monoklonalda ise hcre kltrnde oaltlarak elde ediliyor. Yaine
antijeni hayvana veriyoruz. O hayvann antikor reten hcrelerini alyoruz. Bunlar kltr
ortamnda tmr hcreleriyle epiidoma yapyoruz. Onlar devaml oaltyoruz. Dolaysyla
sadece o spesifik antijene zg hcrelerde oalyor ve devaml antikor retiliyor.
Monoklonal antikorlar daha pahal. Ancak daha spesifik. Antijenin belli epiptoplarna zg
oaldklar iin daha hassas oluyor.
Primer antikorumuzu aldk. Burada dikkat etmemiz gereken ne? Kullandm dokunun ne
olduu. Eer dokum insan dokusuysa o zaman benim primer antikorum antihuman olacak.
Yani insana kar ve bu antihuman mesela Mouse olacak ya da rub rubbit farkl bir
hayvanda retilmi insana kar. Primerlerimizi aldk. imdi kullanacamz immn ynteme
bal olarak bizim sekonder antikorlarmz almamz lazm. Ya da almayabiliriz. Eer
sekonder antikor almayacaksak, yani direkt yntemle boyayacaksak, o zaman primer
antikorumuzun iaretli olmas gerekir. Yani enzim ya da floresan floroforlar primer antikorda
olmas gerekiyor.

Bunun boyama aamas kolay. Hemen antijeni antikora bala, mikroskopta incele. Ancak
iaretli primer antikorlar ok ok pahal. Bu da ok byk bir dezavantaj oluturuyor. Ayrca
nonspesifik boyamalar grme ansmz direkt yntemde daha fazla.
imdi ilk bata primer alkolmz baladk. Eer prime alkol buradaki gibi iaretliyse buna
direkt yntem diyoruz. Eer antijenimize antikoru baladk buna da baka bir antikor
baladk: sekonder antikor. Yani primer antikor iaretli deil ise bu iaretsiz (indirekt)
yntem. Direk yntemde primer antikor iaretli, indirekte iaretsiz. ki yntem arasndaki en
nemli fark bu.

imdi ne dedik? Benim dokum insand. Primerimi Mouse antihuman aldm. O zaman
sekonderim Mouse a kar olacak ki bu komplekse gelip balansn. O zaman sekonderimin
antimouse olmas lazm. Ne olabilir? Rubbit antimouse, rut antimouse nemli olan
antimouse olmas. Yani fareye kar olan fare dnda bir hayvandan gelitirilmi bir antikor
kullanlmas. Tabi sekonder antikor olarak. Artk indirek ynteme geldiimizde sekonder
antikorumu iaretli alyorum. Yani peroksidaz iaretli olabilir. Ya da flouresan iaretli olabilir.
Daha sonra da bunu grntleyeceiz. Amacmz hep antijen-antikor komleksinin olumas.
Bir soru: insan olsa olur mu? Tercih etmiyoruz. Neden? Hibir zaman sekonderin buradaki
dokuyla ayn olmasn istemiyoruz. Neden ? daha sonra spesifik balanmalar olabilir.
Dokunun zerindeki yerlere balanabilir. Ve non spesifik sonular verebilir.
Primer antikor hcre yzeyindeki ya da hcre iindeki antijene balanyor. Daha sonra da
iaretli bir sekonder antikor gelerek primer antikora balanyor. imdi bu balanma hcre
yzeyinde ise hi sorun yok. Eer antijen ekirdekte ya da sitoplazmada ise o zaman daha bu
primer antikoru damlatmadan nce bizim bir geirgen kullanmamz gerekiyor. Hcre
membrann bozucu bir madde kullanmamz gerekiyor. Bunun iin de genelde tritom x
kullanyoruz. Bunu primer antikorlar sulandrdmz solsyonun iine koyuyoruz. Bylece
tritom hcre membrann ayor ve antikor (primer antikor) sonrasnda da sekonder
antikorlarmz hcre membranndan kolaylkla geiyor. Hcre iine balanm oluyor. Burada
enzim olarak peroksidaz yada floresan bir madde randomin kullanabiliriz.
Dedik ki direk yntem dediimizde unutmuyoruz primerlerimiz iaretli indirek yntem
dediimizde sekonderlerimiz iaretli. Burada grdmz gibi (immn iaretleme terminolojisi figre 12)
sekonder antikora byk kompleksler balanabilir. PAP kompleksi, peroksidaz-
antiperoksidaz kompleksi, ya da avidin-biyotin kompleksi. Bunlarn artmas bize neyi
gsterir? Bunlarn artmas NSAB, anvizyon gibi farkl firmalarn gelitirdii spesifiteyi
artran, hassasiyeti artran yeni iaretli molekller gelitiriyor. rnein byk byk
karbonhidrat zincirleri kullanan yntemler var. Hangi antijeni gstermek istiyorsanz, rn
aldnz firmadan uygun sekonder tiplerini tercih etmeniz gerekiyor. Diyelim ki DAPO dan
bir bir antikor alyorsunuz. DAPO nun 7-8 tane farkl kiti var. Bu antijen LSAV+kit ile alr.
Bu antijen anvizyonla alr diye data sheat lerinide verir. Ve ona gre almanz gerekir ok
hassas sonular elde edebilmek iin.
Eer immunfloresan yapacaksanz floresan iaretli bir yntem tercih edersiniz.
Eer primer antikoru floresan iaretli alrsanz ok pahal. Floresan iaretlerinin bir
dezavantaj da hemen, yaptnz boyamay fotoraflamanz lazm. Ne kadar karanlkta
saklarsanz saklayn, alkalen fosfataz, ABC, peroksidaz, indirek peroksidaz yaptnz
yntemlerdeki gibi yllarca saklayamyorsunuz. Solar, floresan zelliini kaybeder. Daha
sonra geriye dnp incelemeniz gerektiinde inceleyemiyorsunuz.

Tekrar etmek gerekirse, direk yntemde primer antikorlar yzeyinde bir iaret var. Bu iaret
direk primere bal olduu iin tek aamada grntlemi oluyoruz. Unutmayn floresan
kullanyorsanz balayp mikroskopta inceliyorsunuz. Eer peroksidaz kullanyorsanz
mutlaka kromojen kullanmalsnz. Bu seferde sekonder aamasn atlam oluyorsunuz.


Neleri kromojen olarak kullanyoruz?
Diaminobenzidin- kahverengi renk verir
Aminoetilkarbonil- krmz renk verir
4 karbonnaftal- mavi renk verir.
Peroksidaz kullanyorsak DAB kullanmay tercih ediyoruz. Alkalan fosfataz ya da ABC
kullanrsak da AEC genellikle kullanlr.
Fakat double boyama yapacaksanz, ayn anda iki tane antikoru iaretleyeceksiniz ve ikisini
birden mikroskopta greceksiniz. Hcre yzeyindeki A antijeni ve B antijeni boyamak
istiyorsanz o zaman bunlar renklendirirken farkl kromojen kullanmanz gerekir. Birini DAB
ile dierini AEC ile grnr hale getirmeniz gerekir.
En sk kullanlan kromojenler DAB ve AEC
Floresan yntem kullanacakdanz elinizdeki floresan mikroskopun zelliklerini iyi bilmeniz
gerekiyor. Filtrelerinizin dalga boylar ok kritik. Seeceimiz florofor maddeler; teksas
krmzs ya da radomin olabilir. Bunlarn dalga boylarnn floresan mikroskopunun
filtrelerinin dalga boylarna uygun olmas gerekir. ,
mmniaretlemenin indirek yntemlerinde antijene bal primer antikora kar olan sekonder
antikor iaretlidir. Bu da daha spesifik iaretleme salar. Balanan kompleksler artnca
hassasiyet artyor.
Unutmayn indirek yntemde primer antikor iaretli deil, sekonder antikor iaretli. Ve
sekonder antikor primer antikora balanyor. Primer antikoru damlatnz. Sonra mutlaka
ykamanz gerekiyor dokuyu. Ykama ilemini de primer antikorunuzu sulandrdnz tampon
solsyonla yapyorsunuz.
Primer baland. Nonspesifikleri uzaklatrdk. Balanmamlar uzaklatrdk. Daha sonra
sekonderleri damlatacaksnz. Sekonder antikordan sonra yine tampon solsyonuyla
ykayacaksnz ki nonspesifik balanmalar yok edin.
ndirek iaretleme tekniinde sekonder antikorumuza bir kompleks yada enzim balyoruz.

PAP ve APAAP tekniklerinde ise sekondere bir kompleksi balyoruz. Eer peroksidaz
antiperoksidaz kullandysak PAP teknii, alkalen fosfataz antialkalen fosfataz kullandysak
APAAP teknii adn veriyoruz.
Btn bunlar yine ticari olarak satlyor. te kiti aldmz zaman sekonderiniz, kompleksimiz
hepsi orada grnyor. Ve srayla onlar damlatyorsunuz. Unutmamz gereken ey her
aamadan sonra mutlaka ykama yapmamz gerekiyor.
Avidin ve biotinin birbirne kar afinitesi var ve bundan yararlanlr.
Enzimle antienzim birleti ve PAP kompleksi olutu. Primer baland. Sekonder baland. Bu
arada mutlaka ykamalar var. Daha sonra da PAP kompleksi baland. PAP kompleksi
balandktan sonra da kromojen kullanmanz gerekiyor.





ABC tekniinde iaretli avidin
var. Biyotine gelip balanr bir
kompleks oluur. Primer sekonder
baland. Sonra da kompleks
baland.
kili iaretlemede de ayn anda bir hcrede 2
farkll antijeni lokalize etmek istiyorsunuz
kullanlr. nce 1. Antijen iin primer
kullanld. Onun sekonderini kullanyorsunuz
ve ona balayacaz. Kompleks daha sonra da
2. Antijeni ona balayacamz iaretleyiciyi
kullanyorsunuz. Daha sonra da bunlar
mikroskopta grntlyorsunuz.

Unutmayn ki floresan yntemler pahal ve kolay solduu iin eer hemen inceleme
imkannz varsa kullanabilirsiniz ama onun dnda daha pahalya gelir.

Bir laboratuvarda nelerin bulunmas gerekir? mmnohistokimyasal almalar, donmu
kesitlerde ya da parafin kesitlerde yapabiliriz. Donmu kesitte yapmak ok daha avantajl.
aretsiz yntemlerde her
eklediimiz molekl sinyali daha
da glendirir. Daha spesifik
iaretlenmeleri salyor
nonspesifik balanmalar her
aamada uzaklatmz iin.
Dokuyu aldnz. Sv azotta (-196 C) dondurduktan sonra direk hemen immn boyamaya da
geebilirsiniz. Ya da saklamak istiyorsanz burada grdnz azot tanklarnda
saklayabilirsiniz. Bu tanklarn iinde gzler var ya da ekmeceleri var. Buralarda dokuyu
saklayabilirsiniz. Dokuyu immn boyama yapacanz zaman karyorsunuz. Kriyo
mikrotomda kesiyorsunuz. Daha sonra da fiksasyon yapyorsunuz. Ama baz lablarda
otomatik immn boyama makineleri var.
Genelde kitlerin iinde kromojeni de olur. Kromojeni yoksa kitin iinde bir kromojen almanz
gerekiyor. Bunlar da ayn yemek yapar gibi nce sekonderi sonra kompleksi damlatarak
boyamalar yapyoruz.
Dokuyu saklamak iin tank yoksa ideali -80c de saklamak. Baka derecelerde de olabilir.
Fakat -20c yi nermiyoruz. Doku ok daha abuk bozulur.
Boyama ncesi kesitlerinizi aldnz. Kesitlerin mutlaka odda scaklnda 5dakika mutlaka
beklemesi gerekiyor. Ya da kesitlerin iine nemden korumak iin silikojen jel koyup bir
kutuda azn kapatp -80c e koyarak da saklayabilirsiniz.
Preparat oda scaklnda 5 dakika beklettikten sonra donmu kesit olduu iin kimyasal
fiksatif uygulamtnz. imdi kimyasal fiksasyonu yapmanz gerekiyor. Bunun iinse aseton,
etonol veya metanol tercih edilir. Genelde aseton nerilir. Ancak baz antijenler iin metanol
veya etanol nerilebilir. Bu da yine data sheatlerinde yazar. Fiksatif (aseton, metanol, veya
etanol) -20c de 30dk de soutulur. Soutulmu fiksatifle oda scaklnda 5-10 dk fiksasyon
yaplr. Fiksasyondan sonra tamponla ykayp sonra primer, sekonder kromojen
aamalrnuygulayp boyama ilerine devam edilir.

Frazen kesitler kolay ancak parafin kesitte boyama yapacaksnz. Biraz daha uzuyor. Dokuyu
aldnz. Rutin k mikroskkopu doku takip yntemine gre takip edeceksiniz. Parafine
gmeceksiniz parafin kesitlerinizi aldnz. Hemen immn boyama yapamazsnz. nce
parafini uzaklatrmanz gerekiyor. Yani deparafinize etmeniz gerekiyor. Su dolu dokuyu
rehidrete etmeniz gerekiyor. Sonra parafin histokimyann en skntl aamalarndan birbirine
geliyorsunuz. Antijeni aa karma.
yi bir fiksasyon yaptnzda dokuyu bozulmadan koruyorsunuz. Ama bu srada proteinlerle
apraz balar oluuyor. te burada metilen kprleri oluuyor. Oluan metilen kprleri
proteinle apraz balar yaptnda antijenler kprlerin arkasnda kald. Ben eer antijenleri
aa karmadan boyama yaparsam hi sinyal alamam.
Antijenleri aa kardktan sonra artk normal immnohistokimyasal boyamay yapyoruz.
Kromojen aamasndan sonra hemotoksilenle ekirdek boyamas yapp dokular dehidrete
edip kapatp mikroskopta inceliyorsunuz.
.


mmnohistokimyasal yntemi
kullanacaksnz dokular %10
ntral formalinle tespit
etmelisiniz. Bomle, pikrik asitle
ya da baka fiksatifle tespit
edilmi olanlarda
immnohistokimya yapmak daha
zor. Her antijen bu fiksatiflerle
almyor. alacanz antijen
iin almanzn balangcnda
data sheatleri okuyarak bunlar
mutlaka kontrol etmelisiniz.
Ancak antikorlarn ou
formalinle alyor.
Parafinden uzaklasn diye bir
gece etvde bekleteceksiniz.
Daha sonra ksilole koyucaksnz.
Dokunun iindeki parafini de
iyice alabilmek iin. Burada
%100 lk ve %95 lik alkol
kullanyorsunuz. Metanol tercih
etmiyoruz.

Antijeni aa karmada s baml almalarda yukardaki basn kaplarndan birini
kullanacaksnz. Direk dokuyu alp bunlarn iine koymuyorsunuz. Ya sodyum sitratl ya da
tris/EDTA l tampona koyuyorsunuz. Yine hangi yntemi kullanacanz yazar. Genelde
EDTA kullanlr.
Preparatlar solsyonunun iine koyuyorsunuz. zel alelerin iine koyuyorsunuz. nk
yksek s olduu iin cam patlatabilir. Bunlar alp ddkl tencereye yerletiriyoruz.
Kapan kapatp yine antijenik zelliine gre deien srelerde tutuyorsunuz. Mikrodalga
kullanyorsanz dokularnz fokur fokur kaynatmayacaksnz. Kaynatrsanz dokularnz
preparattan dklr. Tam kaynama noktasna yakn aamada tutarak en az 10 dk tamponla
kaynatarak balar krp antijenleri aa karyorsunuz. Is baml yntem biraz daha zor.
Eer enzimatik neriliyorsa; o zaman bu enzimlerin aktif olduu sda bu preparatlar
tutmamz gerekiyor. Tripsin ieren solsyon hazrlanyorsanz bu enzim 37c de aktif. 37c deki
etvn ierisinde nerilen sreye gre tutuyoruz. Antijeni aa karyoruz. Hem parafin
kesitte hem de donmu kesitte bundan sonraki aamalar nemli kutuda gerekletiriyorsunuz.

Soldaki ekil: dentrit hcreler iin bir antikor kullanlm.
Sadaki ekil: floresanla boyanm rnek. Mikrotbllere kar antikor kullanlm.
Bunlar floresan yntem.
Bunlarn iine biraz su veya
nemli bez koyarak nemli olmas
salanr. Primer antikoru
damlattnz andan itibaren
kutunun az kapal, nemli
olacak. Dokularn kurumamas
ok nemli. Kurursa yanl
sonular alnr. Hibir aamay
az ak kutuda yapmyoruz. Her
zaman nemli kutu. Eer kurursa
anlamsz bir boyama grrsnz.
Ik mikroskopunda ekilmi.
Tip4 kollojene kar antikor
kullanlm. Kromojen olarak
AEC kullanlm. Bunu krmz
renkte olmasndan anladk.
Laminine kar antikor
kullanlm. Epiteli ve epitelin
altnda bazal membranda laminin
olduu iin bazal membrann
kolaylkla seebiliyoruz. izgili
kaslar etrafnda eksternal
laminada da laminin olduu iin
immn peroksidazla pozitif
reaksiyon vermi. Kromojen
olarak DAB kullanlm.
Kahverengi olmasnda anladk.


Son olarak floresan yntemi parafinde veya frozende kullanlabilir mi?
Parafinin kendisinin de otofloresan zellii var. Onun iin parafin histokimyada floresan
tercih etmiyoruz.
BAARILAR
Sol st: lenfositlere kar bir
antikor kullanlm. Yzey
antikoru olduu iin hcre yzeyi
izilmi. Ama hcre ii bir
antikor olsayd hcreleri tamamen
boyanm olarak grlrd.
Sol alt: aksonlara ynelik bir
antikor kullanlm. Medulla
spinaliste aksonlar gryoruz.
Sa alt: keratine kar antikor
kullanlm. Dolaysyla ok katl
epitel grnyor.
Sol st: bazal membran spesifik
bir antikor kullanlm.
Sa st: dentritik hcrelere kar
bir antikor kullanlm.
Sol alt: sinire spesifik bir antikor
kullanlm. Sinirin uzunlamasna
kesitleri de grlyor.
Sa alt: purkinje hcrelerine kar
antikor kullanlm kromojen
olarak DAB kullanlm.