1

ESTUDIO DE LAS ESTUDIO DE LAS

INTERACCIONES PLANTA INTERACCIONES PLANTA- -
HONGOS PATOG HONGOS PATOG NICOS NICOS
Clase I Clase I - - conceptos conceptos
Marciel J. Stadnik
U
F
S
C
V
CC U
F
S
C
V
CC
LABFITOP
stadnik@cca.ufsc.br
Pr egunt as Pr egunt as? > ? > Respuest as Respuest as
Cual Cual rgano y tejido es infectado por el hongo? rgano y tejido es infectado por el hongo?
Como ocurre la infecci Como ocurre la infecci n? directa o indirecta? n? directa o indirecta?
Cuales c Cuales c lulas del hu lulas del hu sped son colonizadas? sped son colonizadas?
(epidermis, (epidermis, mes mes filo filo, etc.) , etc.)
Cu Cu les son los mecanismos involucrados con les son los mecanismos involucrados con
la defensa de la planta contra el hongo? la defensa de la planta contra el hongo?
Cl asi f i c ac i Cl asi f i c ac i n de hongos: n de hongos:
Cuanto a la relaci Cuanto a la relaci n parasitaria: n parasitaria:
Par Par sitos obligados sitos obligados: Ciclo de vida ocurre : Ciclo de vida ocurre
exclusivamente en el tejido vivo del hu exclusivamente en el tejido vivo del hu sped sped
Par Par sitos no obligados sitos no obligados
Sapr Sapr fitos fitos facultati vos facultati vos
Pat Pat genos facultati vos genos facultati vos
Cl asi f i c ac i Cl asi f i c ac i n de hongos n de hongos
Cuanto a las relaciones nutricionales ( Cuanto a las relaciones nutricionales (Luttrell Luttrell,1974): ,1974):
Necrotr Necrotr fico fico ( (Pertotrofico Pertotrofico): ): pat pat geno mata geno mata
las c las c lulas do hu lulas do hu sped antes de colonizarlas sped antes de colonizarlas
Alternaria Alternaria spp. spp.
Hemibiotr Hemibiotr fico fico: : pat pat geno forma inicialmente una asociaci geno forma inicialmente una asociaci n n
con c con c lulas vivas del hu lulas vivas del hu sped, y mas tarde se vuelve sped, y mas tarde se vuelve
necrotr necrotr fico fico
Ex: Ex: Colletotrichum Colletotrichum spp. spp.
Biotr Biotr fico fico: : pat pat geno se nutre de tejido vivo geno se nutre de tejido vivo
O O dios dios, Rojas , Rojas
Car ac t er Car ac t er st i c as st i c as
or gani smos or gani smos bi ot r bi ot r f i c os f i c os
estructuras de infecci estructuras de infecci n altamente n altamente
desarrolladas desarrolladas
baja actividad de enzimas l baja actividad de enzimas l ticas ticas
camadas interfaciales que separan las camadas interfaciales que separan las
membranas plasm membranas plasm ticas del hongo y planta ticas del hongo y planta
mecanismos de supresi mecanismos de supresi n de defensa del n de defensa del
hu hu sped sped
haust haust rios rios
( (Mendgen Mendgen & & Hahn Hahn, 2002). , 2002).
2
Modo de i nf ec c i Modo de i nf ec c i n y n y
c ol oni zac i c ol oni zac i n n
Rojas Rojas ( (basidiomycota basidiomycota) )
O O dios dios ( (ascomycota ascomycota) )
Colletotrichum Colletotrichum lindemuthianum lindemuthianum y y
Colletotrichum Colletotrichum gloeosporioides gloeosporioides
= presentan diferentes tipos y grados de = presentan diferentes tipos y grados de
desarrollo desarrollo biotr biotr fico fico. .
Roj as Roj as
( (bi ot r bi ot r f i c os f i c os del del mes mes f i l o) f i l o)
Uromyces Uromyces appendiculatus appendiculatus
For mac i For mac i n de n de apr es apr es r i o r i o en en
r espuest a a c ar ac t er r espuest a a c ar ac t er st i c as st i c as
t opogr t opogr f i c as f i c as
Allen et al. (1991)
Roj a de l a soj a Roj a de l a soj a
( (Phak opsor a Phak opsor a pac hyr hi zi pac hyr hi zi ) )
Penetracin directa !
Koch et al. (1983)
Mi c r osc op Mi c r osc op a a de l uz de l uz
Tests Tests in in vitro vitro sobre papel sobre papel celof celof n n
3
Padr Padr n de expresi n de expresi n de n de ARD1 ARD1
- - Arabitol Arabitol Desidrogenase Desidrogenase
( (A A) ) Representaci Representaci n de las n de las
estructruras estructruras de infecci de infecci n de la n de la
roja: roja: 1, 1, ured ured sporo sporo (SP); 2, tubo (SP); 2, tubo
germinativo (GT) 4 h despu germinativo (GT) 4 h despu s de s de
la germinaci la germinaci n; 3 n; 3 6, estructuras de 6, estructuras de
infecci infecci n n in in vitro vitro en en estad estad os os
siguientes: 3, siguientes: 3, apres apres rio rio (AP) (6 h); (AP) (6 h);
4, ves 4, ves cula cula subestomatal subestomatal (SV) (12 (SV) (12
h); 5, hifa de infecci h); 5, hifa de infecci n (IH) (18 h); n (IH) (18 h);
6, c 6, c lula lula- -madre madre haustorial haustorial (HM) (HM)
estad estad o o (21 h); 7, (21 h); 7, haust haust rio rio (HA); (HA);
8, hojas infectadas; 9, no 8, hojas infectadas; 9, no
infectadas (estructuras 2 infectadas (estructuras 2 6 6 obtidas obtidas
in in vitro vitro).; NB, gola do ).; NB, gola do pesco pesco o o; ;
EM, matriz EM, matriz extrahaustorial extrahaustorial. .
( (B B) ) Gele Gele de agarosa de agarosa
( (C C) ) Northern Northern blot blot de de geles geles
descritos en ( descritos en (B B). ).
Link et al. (2005)
An An l i si s l i si s i nmunoc i t ol i nmunoc i t ol gi c as gi c as y gel es y gel es
O O di os di os
( (bi ot r bi ot r f i c os f i c os de de l a l a epi der mi s epi der mi s) )
Blumeria graminis
Pr oc eso de i nf ec c i Pr oc eso de i nf ec c i n de n de
Bl umer i a Bl umer i a gr ami ni s gr ami ni s
MICROSCOPA DE
FLUORENCIA
COMPUESTOS FENLICOS
MICROSCOPA
ELECTRNICA DE
VARREDURA
SUPERFICIE
Mi c r osc opi a de Mi c r osc opi a de
f l uor esc enc i a f l uor esc enc i a (MF) (MF)
Luz incidente 100 a 400nm Luz incidente 100 a 400nm
Filtro antes de Filtro antes de la la lente objetiva permite apenas lente objetiva permite apenas
el el pasaje pasaje de luz excitada de luz excitada
Componentes Componentes autofluorescentes autofluorescentes (ex. (ex.
compuestos compuestos fen fen licos) licos)
Fluorocromos Fluorocromos como sondas como sondas
En En materiales materiales fijados fijados y no y no fijados fijados
Prote Prote nas fluorescentes ( nas fluorescentes (expresadas expresadas o o
microinyectadas microinyectadas) ) en en c c lulas vivas. lulas vivas.
4
T T c ni c as mi c r osc c ni c as mi c r osc pi c as par a pi c as par a l a l a
eval uac i eval uac i n n de de anast omosi s anast omosi s c oni di al c oni di al
Livecell imaging
Scanning
Electron microscopy
Staining Transmission Labelling
GFP
Calcofluor White
DAPI
DiCO
6
CarboxyDFDA
El ec t r on El ec t r on mi c r osc opy mi c r osc opy
Spores Spores collected collected by by
touching touching a 15 a 15- -day day old old
culture culture with with nylon nylon
hybridisation hybridisation membrane membrane, ,
or or fixed fixed and and mounted mounted
directly directly from from de de bean bean
pod pod. .
Mi c r osc Mi c r osc pi o pi o pt i c o & pt i c o &
GUS e GFP GUS e GFP
Expresi Expresi n n g g nica nica a a nivel nivel celular mediante celular mediante el el uso de uso de
genes rep genes rep rteres visualmente rteres visualmente detectables detectables
GUS ( GUS ( - -D D- -glucoronidasa glucoronidasa) )
Marcadores histoqu Marcadores histoqu micos y genes rep micos y genes rep rteres rteres
Son Son introducidos introducidos em em el el hongo hongo de de inter inter s s. . Amuestras Amuestras
son son colectadas colectadas y colocadas para y colocadas para reaccionar reaccionar con con el el
substrato de GUS(5 substrato de GUS(5- -bromo bromo- -4 4- -cloro cloro- -3 3- -indolyl indolyl- - - -D D- -
glucor glucor nido nido ( (X X- -GlcA GlcA) ) precipitado azul precipitado azul
http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4 http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4
0/fulltext.pdf 0/fulltext.pdf
Li ve Li ve- -c el l c el l i magi ng i magi ng
1 1- - Staining Staining
- - Conidia Conidia collected collected from from 7 7- -16 16 old old cultures cultures and and
suspended suspended in in water water (1x10 (1x10
6 6
conidia conidia/mL) /mL)
inoculate inoculate PDB in slide PDB in slide culture culture chamber chamber. .
- - Incubated Incubated for 24h,48 for 24h,48 and and 72h. 72h.
- - Calcofluor Calcofluor White(0,12 M) White(0,12 M) for for cell cell wall wall
- - DAPI DAPI for for nuclei nuclei
- - DiCO DiCO
6 6
for for mitochondria mitochondria
- - Carboxy Carboxy- -DFDA DFDA for for vacuoles vacuoles
- - Inverted Inverted microscope microscope equipped equipped with with blue blue
diode diode and and argon argon ion ion lasers lasers
2 2- - Labelling Labelling with with GFP GFP
- - Protoplast Protoplast obtained obtained from from young young mycelia mycelia in in NaCl NaCl as as osmotic osmotic
stabilizer stabilizer
- - Incubation Incubation of of protoplasts protoplasts for 3h for 3h with with Lyzing Lyzing Enzymes Enzymes. .
- - Tranformation Tranformation of of protoplasts protoplasts with with the the plasmid plasmid pMF357 pMF357 which which
carried carried hH1 hH1- -sgfp sgfp gene gene and and hph hph gene for gene for hygromycin hygromycin
resistance resistance
- - Mixture Mixture transfered transfered to to regeneration regeneration agar agar and and hygromycin hygromycin B B
- - Conidia Conidia obtained obtained from from transformants transformants were were spread spread onto onto PDA PDA
containing containing hygromycin hygromycin. .
- - Single Single conidia conidia expressing expressing hH1 hH1- -sFGP sFGP were were selected selected using using a a
fluorescence fluorescence stereo stereo microscope microscope with with GFP GFP filter filter set set
5
Propidium iodide
(nuclei)
DAPI(nuclei) CarboxyDFDA (vacuoles)
Calcofluor White(cell walls) hH1GPF
Met odol og Met odol og a a b b si c a si c a
DISCOS FOLIARES
SOLUCIN PARA
CLAREAMENTO
SOLUCIN DE CONSERVACIN
Met odol ogi a Met odol ogi a
1) Colecta de discos de tejido foliar despus de la inoculacin
1) Solucin I: (etanol/cido actico glacial; 3:1, v/v) para fijacin y clareamento de
los tejidos.
- 24 -48 h/ cambios de soluciones
2) Solucin II: lactoglicerol (c. ltico, glicerol y agua)
para continuar el clareamento y conservacin.
4) Visualizacin al microscopio ptico (hasta 3 meses)
Puntos importantes:
- Conduccin con mximo cuidado para evitar el desprendimiento de esporas adheridos
suavemente en las hojas.
- Las estructuras del hongo son teidas con azul de anilina en lactofenol (0,1%) o Coomansie
blue o tripan blue.
- El porcentaje de germinacin, la formacin de apresrios y la penetracin son evaluados
sobre cada disco foliar, observando-se 100 esporas/disco.
Stadnik e Buchenauer (2000):
Fitopatologia Brasileira, 31 (supl.) 79-80, 2006
Cr ec i mi ent o Cr ec i mi ent o del del hongo hongo i n i n
pl ant a pl ant a
Incubacin con solucin de
coloracin (azul de tripan
2,5mg/mLemlactofenol +2
volmenes de etanol) a
100Cpor1min.
Resfriar el
materialpor1ha
temperatura
ambiente.
Remover la solucin
de coloracin y
adicionar cloral
hidratado(2,5g/mL).
Incubar por 12 h y
substituir la solucin
de clareamento por
glicerol70%.
Incubar por 6 h y
substituir la solucin
de clareamento por
unanueva.
Weigel eGlazebrook (2002)
Incubar en solucin
de diaminobenzidina
(1mg/mL)por8h
Decoloracin en
etanol100%por3h.
Solucin de
conservacin
(glicerol70%)
Det ec c i Det ec c i n n de de l a l a r eac c i r eac c i n n de de
hi per sensi bi l i dad hi per sensi bi l i dad en en
Ar abi dopsi s Ar abi dopsi s
Weigel eGlazebrook (2002)
6
Conservacin en
cidolctico:glicerol:
agua (1:1:1,v/v/v)
Solucin de
diaminobenzidina
(1mg/mL)
Decoloracin en cido
tricloroactico0,15%
p/v;en etanol:
clorofrmio(4:1)
Det ec c i Det ec c i n n de de l a l a r eac c i r eac c i n n de de
hi per sensi bi l i dad hi per sensi bi l i dad en en por ot o por ot o
Hckelhoven (1999)
Fot os: Fot os: Cr ec i mi ent o Cr ec i mi ent o del del hongo hongo
i n pl ant a i n pl ant a
Plantas inoculadas Plantas inoculadas con con una gota de 10uL de una una gota de 10uL de una
suspensi suspensi n n de esporas de de esporas de A. A. brassicicola brassicicola (10 (10
6 6
con con dios/mL) dios/mL)
Evaluaci Evaluaci n n realizada a realizada a los los 4 dias 4 dias despu despu s s de de la la
inoculaci inoculaci n n
Fot o: Fot o: Reac c i Reac c i n n de de
hi per sensi bi l i dad hi per sensi bi l i dad
Met odol og Met odol og a a b b si c a si c a
DISCOS FOLIARES
SOLUCIN PARA
CLAREAMIENTO
SOLUCIN DE CONSERVACIN
Desar r ol l o Desar r ol l o bi ot r bi ot r f i c o f i c o de de
l os o l os o di os di os
A
T T c ni c as c ni c as hi st oqu hi st oqu mi c as mi c as
Johansen Johansen (Cap (Cap tulo IX) tulo IX)
Clareamiento Clareamiento y y tinci tinci n n de de los los tejidos tejidos
7
Ti pos de haust Ti pos de haust r i os r i os
O O di o di o del del Pepi no Pepi no
Podosphaer a Podosphaer a x ant hi i x ant hi i
Hemi bi ot r Hemi bi ot r f i c os f i c os
(dos (dos f ac es f ac es de de un un pat pat geno geno) )
Hemi bi ot r Hemi bi ot r f i c os f i c os
( (Col l et ot r i c hum Col l et ot r i c hum l i ndemut hi anum l i ndemut hi anum) )
Antracnose Antracnose del del frijol frijol
Colletotrichum Colletotrichum lindemuthianum lindemuthianum
8
Colletotrichum lindemuthianum (24 hai)
Colletotrichum gloeosporioides (48 hai)
Col l et ot r i c hum Col l et ot r i c hum gl oeospor i oi des gl oeospor i oi des
Manzano Manzano
?