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Artculo:
Citometra de flujo: vnculo entre la
investigacin bsica y la aplicacin
clnica
Derechos reservados, Copyright 2004:
Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
Revista del Instituto Nacional de
Enfermedades Respiratorias
Nmero
Number
1
Enero-Marzo
January-March
2004
Volumen
Volume
1 7
edigraphic.com
42
REVI STA I NSTI TUTO NACI ONAL DE ENFERMEDADES RESPI RATORI AS M G Ener o- M ar zo 2004 Segunda poca, Vol . 17 N
o
1
w w w .iner.gob.mx
edigraphic.com
Palabras clave: Ci-
t o met r a d e f l u j o ,
inmunof enot ipif ica-
ci n, l avado br on-
q u i o al v eo l ar , en -
f ermedades pul mo-
nares, VIH.
Key words: Fl o w
cyt omet ry, immuno-
phenot yping, bron-
choalveolar lavage,
lung diseases, HIV.
REVISI N
LOURDES M ARA BARRERA RAM REZ
*
M A. ELISA DRAGO SERRANO

JULIA PREZ RAM OS

ANA CECILIA ZAM ORA

,II
FABIOLA GM EZ ARROYO

TERESITA DEL ROSARIO SAINZ ESPUES

FELIPE M ENDOZA PREZ

* ,
* Depart ament o de Biologa M olecular. INER.

Sist emas Biolgicos. Universidad Aut noma M et ropolit ana.

Unidad Xochimilco.

Hospit al Universit ario Dr. Jos E. Gonzlez . M ont errey, Nuevo

Len.
I I
Servicio Clnico 1, INER.

Depart ament o de M icrobiologa e Inmunologa. Facult ad de

Vet erinaria, UNAM .
Trabaj o recibido: 17- II- 2004; Acept ado: 26- III- 2004
Cit omet ra de flujo:
vnculo ent re la invest igacin bsica
y la aplicacin clnica
RESUMEN
La ci t omet r a de f l uj o es un mt odo anal t i co que
permit e la medicin rpida de ciert as caract erst icas
f si cas y qumi cas de cl ul as o par t cul as
suspendidas en lquido que producen una
seal de f orma i ndi vi dual al i nt erf eri r con
una f uent e de luz. Una de las caract erst i-
cas analt icas ms import ant es de los cit -
met ros de f l uj o es su capaci dad de medi r
mlt iples parmet ros celulares, como el t a-
mao, f orma y complej idad y, por supues-
t o, cualquier component e celular o f uncin
que pueda ser marcada con un f luorocromo. Las apli-
caciones ms relevant es de la cit omet ra de f luj o en
la prct ica mdica se relacionan con la hemat ologa
e i nmunol oga cl ni cas, mi di endo parmet ros como
nmero y clasif icacin de clulas sanguneas. Est a t c-
nica es empleada t ambin en el cont eo de subpobla-
ciones de linf ocit os en pacient es con el virus de la in-
munodef iciencia humana, as como la caract erizacin
de leucemias agudas y sndromes linf oprolif erat ivos
crnicos, ent re ot ros padecimient os. En los lt imos 20
aos, el anlisis de enf ermedades pulmonares de ori-
gen inmunolgico por cit omet ra de f luj o ha j ugado
un papel import ant e en el ent endimient o y diagns-
ABSTRACT
Fl ow cyt omet ry i s an anal yt i cal met hod t hat al l ow s
t he rapid measurement of cert ain physical and chem-
i cal charact eri st i cs of cel l s or part i cl es suspended i n
liquid and produce signals w hen t hey pass individu-
ally t hrough a beam of light . An import ant analyt ical
f eat ure of f low cyt omet ers is t heir abilit y t o measure
mul t i pl e cel l ul ar paramet ers such as cel l si ze, shape
and int ernal complexit y and, of course any cell com-
ponent or f unct ion t hat can be det ect ed by a f luores-
cent dye. The most prominent uses of f low cyt ome-
t r y i n medi cal pr act i ce ar e i n t he r el at ed f i el ds of
laborat ory hemat ology and clinical immunology, f or
a vari et y of t asks i nvol vi ng bl ood cel l count i ng and
classif icat ion. This t echnique is also used f or count ing
l y mphocy t e subpopul at i ons i n pat i ent s w i t h HI V,
charact erizat ion of acut e leukemias and chronic lym-
phomas bet w een ot her di seases. O ver t he l ast 20
years, analysis of immunologica lung diseases by f low
cyt omet ry has played a maj or role in t he underst and-
ing and as t ool of diagnosis, such as sarcoidosis, eosi-
nophilic pneumonia or hypersensit ivit y pneumonit is.
So t he applicat ions of f low cyt omet ry are numerous,
and t his has lead t o t he w idespread use of t his inst ru-
ment s in biological research and medical f ields. O ver-
REV INST NAL ENF RESP M EX
VO LUM EN 17 - NM ERO 1
ENERO - M ARZO 2004
PGINAS: 42- 55
43
REVI STA I NSTI TUTO NACI ONAL DE ENFERMEDADES RESPI RATORI AS M G Ener o- M ar zo 2004 Segunda poca, Vol . 17 N
o
1 REVI STA I NSTI TUTO NACI ONAL DE ENFERMEDADES RESPI RATORI AS
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edigraphic.com
all t his review show s a brief overview of basic prin-
ciples of and show s t his as a reproducible t ool appli-
cable t o a w ide range of medical approaches as w ell
as it s use in lung diseases f ield.
t i co de enf er medades como sar coi dosi s, neumona
eosi nof l i ca o neumoni t i s por hi per sensi bi l i dad. Las
aplicaciones de la cit omet ra de f luj o son numerosas,
lo cual ha permit ido el empleo de est os inst rument os
de manera amplia en los campos, t ant o de la inves-
t igacin biolgica como mdica. Est a revisin brinda
un panorama general de los principios bsicos de la
cit omet ra de f luj o y la muest ra como una herramien-
t a r epr oduci bl e y apl i cabl e a una gr an var i edad de
campos mdicos, as como su empleo en el campo de
las enf ermedades pulmonares.
INTRODUCCIN
En los lt imos aos, el diagnst ico clnico ha ex-
periment ado prof undas modif icaciones debidas,
en gran medida, a los avances producidos por los
nuevos mt odos cuant it at ivos de anlisis celular.
De ent re ellos dest aca la cit omet ra de f luj o, que
ha alcanzado gran relevancia, adems de la que
ya t ena en la invest igacin bsica.
La cit omet ra const it uye un complement o valio-
so de las t cnicas clsicas ut ilizadas para el est udio
de la morf ologa, biologa y bioqumica celular.
Aunque, desde el punt o de vist a cronolgico, la
cit omet ra de f luj o es una t ecnologa relat ivamen-
t e recient e, sus caract erst icas especiales como t c-
nica de anlisis celular han hecho que en la lt ima
dcada su uso se haya ext endido de f orma rpida,
desde los laborat orios de invest igacin bsica hast a
los laborat orios clnicos
1
.
La ci t omet r a de f l uj o ha encont r ado ampl i a
ut i l i dad en ci enci as como l a i nmunol oga, he-
mat ol oga, oncol oga, anat oma pat ol gi ca y
bi ol oga cel ul ar
2
. La conj ugaci n de marcado-
res f l uorescent es con ant i cuerpos monocl ona-
l es o pol i cl onal es ha hecho posi bl e l os est udi os
de l a densi dad y l a di st ri buci n de det ermi nan-
t es y recept ores de l a superf i ci e y del ci t opl as-
ma celular, permit iendo ident if icar subpoblacio-
nes cel ul ares
3
.
Por ot ra part e, en comparaci n con l os m-
t odos bioqumicos de anlisis celular, en los que
se obt i ene un r esul t ado pr omedi o par a t oda l a
muest ra, l a ci t omet ra de f l uj o es capaz de pro-
por ci onar una i nf or maci n cuant i t at i va sobr e
cada clula en part icular y permit e ident if icar en
una muest ra subpoblaciones de clulas dif eren-
t es, i ncl uso cuando est n escasament e r epr e-
sent adas.
QU ES LA CITOMETRA DE FLUJO?
La cit omet ra de f luj o represent a un mt odo r-
pido obj et ivo y cuant it at ivo de anlisis de clu-
las, ncleos, cromosomas, mit ocondrias u ot ras
part culas en suspensin.
El principio en el que se basa est a t ecnologa
es simple: hacer pasar clulas u ot ras part culas
en suspensi n al i neadas y de una en una por
delant e de un haz luminoso. La inf ormacin pro-
ducida puede agruparse en dos t ipos f undamen-
t ales: la generada por la dispersin de la luz y la
relacionada con la emisin de luz por los f luoro-
cromos present es en la clula o part cula al ser
excit ados por el rayo luminoso. Las seales lumi-
nosas det ect adas se t r ansf or man en i mpul sos
elct ricos que se amplif ican y se conviert en en
seal es di gi t al es que son pr ocesadas por una
comput adora (Figura 1)
4
.
CONCEPTOS SOBRE
INMUNOFLUORESCENCIA
El t r mi n o i n mu n o f l u o r escen ci a se u sa p ar a
descri bi r l as t cni cas en que se empl ea un f l uo-
r o cr o mo p ar a mar car u n an t i cu er p o . Ya en
1941, Coons
5
i nf orm de l a apl i caci n de est a
t cni ca par a l ocal i zar ant genos y ant i cuer pos
en secciones de t ej ido. El descubrimient o de los
ant icuerpos monoclonales por Kohler y M ilst ein
en 1975
6
, i ncr ement dr amt i cament e el uso
de la inmunof luorescencia para la ident if icacin
de ant genos de superf i ci e cel ul ar.
La f luorescencia ha sido usada para visualizar
ciert as molculas y est ruct uras por medio de la
microscopia pt ica durant e muchos aos. Est a ha
encont rado una ext ensa rea de aplicacin en la
cit omet ra de f luj o. La capacidad para det ect ar
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si mul t neament e l a f l uorescenci a de dos, t res,
cuat ro o act ualment e hast a 13 f luorocromos de
dif erent es longit udes de onda, abre complet a-
ment e el campo del anlisis mult iparamt rico.
Cuando una molcula absorbe luz, y por t ant o
energa, algunos de sus elect rones pueden alcan-
zar una rbit a de mayor energa. Se dice ent on-
ces que la molcula ha alcanzado un est ado de
ex ci t aci n, y puede v ol v er a su est ado basal
cuando est os elect rones vuelven a su rbit a de
menor energa. En algunos compuest os el elec-
t rn excit ado cae rpidament e, usualment e en
nanosegundos, al est ado basal , emi t i endo un
cuant o de luz o f ot n y desprendiendo energa.
Est a t ransicin radiant e se denomina f luorescen-
cia
7
. A est e t ipo de compuest os se les denomi-
na f luorescent es o f luorocromos.
El obj et ivo del anlisis por inmunof luorescencia
en cit omet ra de f luj o es asignar a cada clula a un
grupo especf ico de clulas que compart an propie-
dades comunes. El primer paso es ident if icar las
clulas de int ers. Por ej emplo, para el anlisis de
subpoblaciones linf ocit arias se requiere seleccionar
un rea de t rabaj o dist inguiendo los leucocit os por
sus propiedades de dispersin de luz (t amao con-
t ra complej idad celular). Una vez que las clulas de
int ers han sido dist inguidas de los ot ros t ipos ce-
lulares, se puede usar la inmunof luorescencia para
det erminar la proporcin o el nmero de clulas
que poseen un det erminado marcador, por ej em-
plo, del marcador CD4 para monit orear el progreso
de la enf ermedad por el virus de la inmunodef i-
ciencia humana (VIH)
8
, ent re muchas ot ras aplica-
ciones clnicas.
PARMETROS QUE SE PUEDEN
ANALIZAR POR CITOMETRA DE FLUJO
La cit omet ra de f luj o permit e medir dif erent es
parmet ros de una clula. st os se dividen en (Fi-
gura 2):
Parmet ros nucleares
Parmet ros cit oplsmicos
Parmet ros de superf icie
Parmet ros ext racelulares
En l a Tabl a I se r esumen l os par met r os que
pueden ser medi dos por medi o de est a t cni -
ca. Un aspect o i mpor t ant e y que r epr esent a
una vent aj a de el l a, es l a posi bi l i dad de medi r
t an t o s p ar met r o s co mo an t i cu er p o s se d i s-
pongan par a el l o, mar cados con di st i nt os f l uo-
r ocr omos. As, es posi bl e car act er i zar una c-
l ul a por su f enot i po de super f i ci e ( Fi gur a 3) y,
al mi smo t i empo, conocer el est ado i nt r acel u-
l ar q u e g u ar d a l a cl u l a co mo su p at r n d e
Figura 1. Principio
general de la cit o-
met ra de f luj o.
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secr eci n de ci t oci nas, o bi en, l a et apa del ci -
cl o cel ul ar en l a que se encuent r a.
APLICACIONES CLNICAS DE LA
CITOMETRA DE FLUJO
Inmunof enot ipif icacin
La cit omet ra de f luj o es una t cnica que permit e
un anl i si s cel ul ar mul t i par amt r i co de f or ma
rpida, sensible y especf ica. La disponibilidad de
amplios paneles de react ivos de gran calidad f a-
cilit a la aplicacin de est e mt odo analt ico en el
diagnst ico, clasif icacin, evaluacin pronst ica
y valoracin de enf ermedad mnima residual. La
cit omet ra de f luj o permit e el anlisis de un gran
nmero de clulas (habit ualment e ent re 10,000
clulas por muest ra y, ms de un milln en los
est udi os de enf er medad mni ma r esi dual ) . La
apl i caci n de l a ci t omet r a de f l uj o al anl i si s
cel ul ar per mi t e conocer aspect os f si cos de l a
cl ul a (t amao y compl ej i dad) y det ermi nar l a
presencia o ausencia de det erminados ant genos
( habi t ual ment e ent r e 3 y 4) en l os di f er ent es
compar t i ment os cel ul ar es ( super f i ci e cel ul ar ,
cit oplasma, mit ocondria y ncleo) lo que cont ri-
Tabl a I. Par met r o s q u e se p u ed en an al i zar p o r ci t o met r a d e f l u j o .
Par m et r o s Par m et r o s b asad o s - Co n t en i d o d e A D N - Pl o i d a d e A D N
n u cl ear es en A D N - Co n t en i d o d e p ar es GC/ A T - Ci cl o cel u l ar
- Su p er en r o l l am i en t o d e A D N - A p o p t o si s- n ecr o si s
- Est r u ct u r a d e l a cr o m at i n a - Car i o t i p o en f l u j o
- Ro t u r as d e h eb r as d e A D N
ADN + ot r os par met r os - ADN/ ARN - Regul aci n ci cl o cel ul ar
- A D N / p r o t en as t o t al es - Ci cl o cel u l ar d e
- A D N / an t g en o s n u cl ear es p o b l aci o n es esp ecf i cas
- A D N / an t g en o s cel u l ar es
Par m et r o s n o b asad o s - Recep t o r es n u cl ear es
en A D N - Ex p r esi n d e g en es
i n d i cad o r es ( r ep o r t er o s )
- M o r f o l o g a n u cl ear
- Co m p o n en t es n u cl ear es
Par m et r o s d e Est r u ct u r as d e l a - Recep t o r es d e su p er f i ci e
su p er f i ci e su p er f i ci e cel u l ar - Si t i o s d e u n i n a l ect i n as
- D en si d ad d e su p er f i ci e
- Par ed cel u l ar
D i n m i ca d e l a - U n i n d e l i g an d o s
su p er f i ci e cel u l ar - Tr an sp o r t e/ i n t er n al i zaci n
d e l i g an d o s
- Ef l u j o d e so l u t o s
- Ex p o si ci n d e r ecep t o r es
- Po t en ci al d e m em b r an a
Par m et r o s Co m p o n en t es - Pr o t en as t o t al es
ci t o p l asm t i co s i n t r acel u l ar es - Pr o t en as est r u ct u r al es
- Pr o t en as f u n ci o n al es
- Gl i co p r o t en as i n t r acel u l ar es
- Lp i d o s i n t r acel u l ar es
- Ti o l es l i b r es
Fu n ci o n es i n t r acel u l ar es - A ct i v i d ad en zi m t i ca
- Sn t esi s d e p r o t en as
- Po t en ci al es d e m em b r an a
En t o r n o i n t r acel u l ar - Co n cen t r aci n d e i o n es
- M o v i m i en t o d e i o n es
- Lp i d o s y p r o t en as o x i d ad o s
Par m et r o s D i n m i ca d e l a - Cap t u r a d e p r o t en as secr et ad as - A ct i v aci n cel u l ar
ex t r acel u l ar es secr eci n cel u l ar - En say o s d e cu an t i f i caci n en su er o - D i f er en ci aci n cel u l ar
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Figura 3. Procedimient o regular de marcaj e o t incin f enot pica para clulas humanas.
Figura 2. Parmet ros medi-
bles por cit omet ra de f luj o
buye a aument ar, t ant o la especif icidad como la
sensibilidad de la prueba. En ot ras reas como en
el diagnst ico y clasif icacin de las inmunodef i-
ciencias primarias, en el monit oreo de enf erme-
dades aut oinmunes como la esclerosis mlt iple
9
,
el lupus erit emat oso sist mico
10
y la art rit is reu-
mat oide
11
, la cit omet ra de f luj o ha demost rado
su ut ilidad. Tambin se ha demost rado t il en el
seguimient o de la recuperacin inmune t ras el
t rasplant e de mdula sea
12
, en la ident if icacin
precoz del rechazo en pacient es que han recibi-
do un t rasplant e alognico
13
, o en el monit oreo
t eraput ico de los enf ermos con anemia aplsi-
ca
14
. En la Tabla II se condensan algunas de las
aplicaciones clnicas ms import ant es y con ma-
yor empleo en la act ualidad.
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Tabl a II. A p l i caci o n es cl n i cas g en er al es d e l a ci t o met r a d e f l u j o .
A p l i caci o n es g en er al es A p l i caci o n es p o r r ea Par m et r o s su j et o s d e an l i si s
D i ag n st i co b asad o Car act er i zaci n d e Par m et r o s est r u ct u r al es
en el an l i si s cel u l ar cl u l as n o r m al es Tam a o
Co m p l ej i d ad
A n t g en o s d e su p er f i ci e
I d en t i d ad
Li n aj e
Fu n ci n
A ct i v aci n
A D N , A RN y p ar m et r o s r el aci o n ad o s
Pl o i d a
Est ad o p r o l i f er at i v o
Est ad i o d e m ad u r aci n
Ex p r esi n g n i ca
Bi o q u m i ca i n t r acel u l ar
Co n d i ci o n es b asal es
Resp u est a b i o q u m i ca a est m u l o s co n t r o l ad o s
I d en t i f i caci n y A l t er aci o n es en l a m o r f o l o g a cel u l ar
d et ecci n d e cl u l as Cam b i o s en t am a o
an o r m al es Cam b i o s en g r an u l ar i d ad
A l t er aci o n es en el i n m u n o f en o t i p o
I n m u n o p r o l i f er aci n / i n m u n o d ef i ci en ci a
A l t er aci o n es en el g en o t i p o
Cam b i o s en el co n t en i d o d e A D N ( p l o i d a)
Cam b i o s en l a ex p r esi n d e g en es
A l t er aci o n es en l a b i o q u m i ca i n t r acel u l ar
Cam b i o s en l a sn t esi s y co n cen t r aci n d e m o l cu l as
Cam b i o s en l a act i v i d ad d e en zi m as y en el f l u j o a
t r av s d e r u t as
A l t er aci o n es en el n m er o y l a f u n ci n d e o r g n u l o s
su b cel u l ar es
Cam b i o s en l a r esp u est a b i o q u m i ca a est m u l o s
co n t r o l ad o s
D et ecci n d e cl u l as d e b aj a f r ecu en ci a
D et ecci n d e cl u l as t u m o r al es ci r cu l an t es
D et ecci n d e cl u l as f et al es en san g r e m at er n a
D et ecci n d e cl u l as act i v ad as o an t g en o - esp ecf i cas
ci r cu l an t es
A p l i caci o n es Co r r el aci n d e Est u d i o s r et r o sp ect i v o s co n m at er i al d e ar ch i v o
p r o n st i cas p ar m et r o s ci t o m t r i co s Est u d i o s p r o sp ect i v o s
co n o t r o s p ar m et r o s
cl n i co s b i en est ab l eci d o s
Par m et r o s i m p l i cad o s A n l i si s d e m u est r as esp ecf i cas d e l a p at o l o g a
d i r ect am en t e en el A n l i si s d e p ar m et r o s esp ecf i co s d e l a p at o l o g a
p r o ceso p at o l g i co
Par m et r o s i m p l i cad o s A n l i si s d e m u est r as i n d i cad o r as
i n d i r ect am en t e en el A n l i si s d e p ar m et r o s i n d i cad o r es d e l a p at o l o g a
p r o ceso p at o l g i co A n l i si s d e p ar m et r o s p r ed i ct i v o s d e r i esg o
Ev al u aci n y Sel ecci n d e cl u l as en A n l i si s d e p r o g en i t o r es en el t r asp l an t e au t l o g o
m o n i t o r i zaci n d el l a t er ap i a cel u l ar Pr u eb as cr u zad as d e t r asp l an t es h et er l o g o s
t r at am i en t o D et ecci n y cu an t i f i caci n d e l eu co ci t o s r esi d u al es
en h em o p r ep ar ad o s
A n l i si s d e l a acci n Cam b i o s en p ar m et r o s est r u ct u r al es
t er ap u t i ca a n i v el cel u l ar Cam b i o s en p ar m et r o s f u n ci o n al es
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APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE
FLUJO A LA INVESTIGACIN BSICA
Son innumerables las aplicaciones de la cit omet ra
de f luj o a la invest igacin bsica, desde campos
como la microbiologa, hemat ologa, inmunolo-
ga, cit ologa, pat ologa, biologa celular y mole-
cular, ent re ot ros. Sin embargo, es posible int en-
t ar cl asi f i car di chas apl i caci ones segn el r ea
especf ica en la que es posible ut ilizar la cit ome-
t ra de f luj o como herramient a de invest igacin
(Tabla III). La cit omet ra de f luj o ha sido ut ilizada
en el monit oreo del cont enido de ADN
15
, expre-
si n f enot pi ca, t ransport e de drogas, f l uj o de
calcio
16
, prolif eracin y apopt osis
17
. Virt ualment e
es posible marcar cualquier molcula que sea de
int ers siempre que se disponga de un ant icuer-
po acoplado a un f luorocromo que pueda ser de-
t ect ado por el cit met ro de f luj o, est o hace posi-
ble que las aplicaciones del cit met ro de f luj o se
adapt en prct icament e a cualquier necesidad de
invest igacin. Act ualment e, la relacin ent re la
aplicacin bsica y clnica es cada vez ms est re-
cha dando la oport unidad a su vez a la aplicacin
diagnst ica, pronst ica y de t rat amient o en ml-
t iples enf ermedades.
CITOMETRA DE FLUJO Y LA
INVESTIGACIN EN ENFERMEDADES
PULMONARES
En los lt imos 20 aos, la cit omet ra de f luj o ha
j ugado un papel primordial en el avance del en-
t endi mi ent o y habi l i dad para di agnost i car una
variedad de desrdenes linf oprolif erat ivos
18
. Una
de las aplicaciones nuevas ms int eresant es es en
l a eval uaci n de paci ent es con enf er medades
inmunolgicas del pulmn
19
. Una muest ra t pi-
ca es aquella que es recolect ada a part ir de la-
vados bronqui oal veol ares (LBA), cuya ut i l i dad
diagnst ica ha quedado ampliament e demost ra-
da
20- 25
. Cuando el lavado es realizado en pulmo-
nes normales, la clula present e ms predomi-
n an t e es el m acr f ag o , el cu al est en u n
porcent aj e de aproximadament e 90% o ms de
celularidad. Los linf ocit os usualment e represen-
t an menos del 10% de la poblacin celular, los
gr anul oci t os r epr esent an l a pobl aci n cel ul ar
minorit aria con el 1- 2%
26
. En f umadores, el por-
cent aj e de linf ocit os es an menor
27
. En muchos
pacient es con enf ermedades pulmonares inmu-
nolgicas, el LBA puede est ar acompaado por
un increment o en linf ocit os o eosinf ilos. Cuan-
A n l i si s d e l a acci n D et ecci n d e r eci d i v as y en f er m ed ad m n i m a r esi d u al
t er ap u t i ca a n i v el d e Est ab l eci m i en t o d e p at r o n es p r o n st i co s d e x i t o
p aci en t e t er ap u t i co
D et ecci n y an l i si s A n l i si s d e l a cap aci t aci n y r et en ci n d e f r m aco s
d e r esi st en ci a a l a t er ap i a A n l i si s d el m et ab o l i sm o d e f r m aco s
A n l i si s d e l a l esi n D et ecci n d e cl u l as d e Cam b i o s en p ar m et r o s est r u ct u r al es
y m u er t e cel u l ar l esi n cel u l ar su b l et al Cam b i o s en p ar m et r o s f u n ci o n al es
Cu an t i f i caci n d e l a D et er m i n aci n d e ef ect o s ci t o t x i co s g l o b al es
v i ab i l i d ad cel u l ar Co n t r o l d e cal i d ad d e l as p r ep ar aci o n es cel u l ar es
Car act er i zaci n d e l o s I d en t i f i caci n y an l i si s d e cl u l as ap o p t t i cas
m ecan i sm o s d e m u er t e I d en t i f i caci n d e cl u l as n ecr t i cas
cel u l ar
A p l i caci o n es en A n l i si s d e an t g en o s I n m u n o f en o t i p o d e su p er f i ci e
i n m u n o h em at o l o g a D et ecci n d e an t g en o s i n t r acel u l ar es
D et ecci n d e an t g en o s ci r cu l an t es
A n l i si s d e an t i cu er p o s D et ecci n d e an t i cu er p o s ci r cu l an t es
D et ecci n d e an t i cu er p o s u n i d o s a cl u l as
A n l i si s d e f u n ci n cel u l ar A n l i si s d e p r o l i f er aci n cel u l ar
A n l i si s d e b i o q u m i ca i n t r acel u l ar
A n l i si s d el n d i ce d e m u er t e cel u l ar
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Tabla III. Aplicaciones generales de la cit omet ra de f luj o a la invest igacin bsica.
Aplicacin general Parmet ros suj et os de anlisis Inf ormacin que proporciona
Inmunof enot ipif icacin Ident if icacin de subpoblaciones Linaj e celular
de superf icie celulares mediant e ant icuerpos Est adio de maduracin hemat opoyt ica
monoclonales Implicacin en la respuest a inmune
Grado de act ivacin celular
Ident if icacin de subpoblaciones Diagnst ico y clasif icacin de
celulares en la hemat opoyesis enf ermedades hemat olgicas
Leucemias agudas y crnicas
Linf omas
Inmunodef iciencias
Hemoglobinuria paroxst ica noct urna
Det eccin de enf ermedad mnima resi-
dual
Enumeracin de precursores
hemat opoyt icos CD34+
Diagnst ico de enf ermedades
congnit as plaquet arias
Tromboast enia de Glanzmann
Sndrome de Bernard- Soulier
Ant genos Det eccin de prot enas int racelulares Produccin de cit ocinas int racelulares
int racelulares con ant icuerpos f luorescent es
Fenot ipo int racelular de leucemias y Det eccin de clulas t umorales
linf omas circulant es
Expresin de reguladores del ciclo Cadenas ligeras de Ig int racelulares: y
celular: ciclina D1 Ant genos de superf icie que t odava no se
expresan en superf icie: CD3, CD22
Enzimas int racelulares
Expresin de prot enas
ant iapopt t icas: BCl- 2, Rb
Expresin de prot enas supresoras
de t umores: p53
Anlisis de cit ocinas int racelulares Fenot ipo Th0, Th1 y Th2
Ant genos circulant es Det eccin de aut oant icuerpos Ant icuerpos ant iplaquet arios
circulant es Ant icuerpos ant ineut rf ilos
Det eccin de aloant icuerpos Pruebas cruzadas pret rasplant es
circulant es Uso de esf eras recubiert as con HLA
especf icos
Det eccin de ant icuerpos unidos
a clulas de la sangre
Inmunoprolif eracin Anlisis monoparamt rico del ciclo celular Cont enido de ADN
Anlisis mult iparamt rico del ciclo celular Fenot ipo de superf icie y cont enido
Anlisis de la hist oria de divisin celular de ADN
Cont enido de ADN y ant genos
relacionados con el ciclo
Trazadores celulares y f enot ipo de
superf icie
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Bioqumica int racelular Funciones bioqumicas de la Snt esis y secrecin de cit ocinas
inmunidad especf ica Expresin de molculas de adhesin
M ovimient os inicos t ras la act ivacin
celular
Funciones bioqumicas de la Fagocit osis y dest ruccin de
inmunidad innat a microorganismos
Generacin int racelular de especies
react ivas de oxgeno
Act ividad prot eolt ica int racelular
Respuest as quimiot ct icas
Expresin de molculas de adhesin
Explosin oxidat iva
Funciones bioqumicas de las Act ivacin y agregacin plaquet arias
plaquet as
M uert e celular en Anlisis de clulas ef ect oras cit olt icas Ident if icacin f enot pica de subpoblaciones
el sist ema inmune CD8 y NK
Anlisis de la cit ot oxicidad mediada
por clulas Int eraccin ent re clulas blanco
y ef ect oras
Anlisis de la cit ot oxicidad
dependient e de ant icuerpos
M onit orizacin de la t erapia con
Anlisis del proceso y mecanismo ant icuerpos monoclonales
de muert e celular
Ident if icacin y cuant if icacin de
clulas apopt t icas
Ident if icacin y cuant if icacin de
clulas necrt icas
Anlisis de parmet ros celulares durant e
la apopt osis
Anlisis f uncional Anlisis cint ico in sit u Det eccin de ef ect os t empranos o
t ransit orios
Anlisis secuencial Evaluacin de procesos dinmicos
do las clulas que est n increment adas son los
linf ocit os, result a import ant e saber qu subpo-
blacin se encuent ra elevada. La cit omet ra de
f luj o es ideal para est a evaluacin. La proporcin
relat iva de linf ocit os, macrf agos y granulocit os
se det ermina f cilment e a part ir de grf icas de
t amao (Forw ard scat t er FSC) cont ra complej i-
dad cel ul ar (Si de scat t er SSC). Los est udi os de
f l uorescenci a empl eando di f erent es f l uorocro-
mos permit en det erminar f cilment e la compo-
si ci n de subconj unt os de l i nf oci t os ( CD4
+
y
CD8
+
). De est a manera, es posible ensayar has-
t a siet e colores, con cit met ros modernos, que
represent an si et e marcadores di f erent es sobre
pobl aci ones cel ul ar es, r equi r i ndose sl o una
pequea cant idad de muest ra (250,000 clulas
en 50L) a part ir de un LBA.
Por ej emplo, un increment o en el nmero de
cl ul as i nf l amat ori as en un LBA sugi ere una al -
veol i t i s
28
. El t i po de cl ul as en el l avado puede
correlacionar con el t ipo de inf lamacin vist o en
l as par edes al v eol ar es de l a bi opsi a. Aunque
esas correl aci ones no son di agnst i cas, pueden
ayudar en el di agnst i co cuando son combi na-
das con ot ros dat os.
En ot ro ej emplo, un nmero elevado de eosi-
n f i l o s su g i er e u n a n eu mo n a eo si n o f l i ca
29
,
asma
30, 31
, t oxi ci dad por dr ogas o asper gi l i osi s
51
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Figura 4. Est udio de cont eo t ot al de linf ocit os T CD4/ CD8 en un pacient e con VIH en est ado t emprano de la
inf eccin (A) con una cuent a de linf ocit os T CD4
+
de 17% y en est ado t ardo, (B) con una cuent a de linf ocit os
T CD4
+
de 3% . Est udio de rut ina realizado en el laborat orio de VIH del INER.
broncopulmonar alrgica. Los nmeros ms al-
t os de cuent as de eosinf ilos son vist as en una
neumona eosinof lica. Esos pacient es t ienen t -
picament e t ambin un increment o moderado de
linf ocit os con clulas plasmt icas ocasionales. El
cuadro t pico del lavado insert ado en el cont ex-
t o clnico adecuado es alt ament e sugerent e de
neumona eosinof lica y podra evit ar que al pa-
cient e se le pract icara una biopsia a cielo abier-
t o. La linf ocit osis en un LBA se puede asociar con
varias enf ermedades pulmonares inf lamat orias.
La di st r i buci n r el at i va de subpobl aci ones de
clulas T puede suminist rar inf ormacin adicio-
nal t il. Un nmero elevado de linf ocit os T CD4
+
da como result ado que la relacin CD4/ CD8 sea
mayor que uno, y est o es vist o en pacient es con
sarcoidosis
32
y ot ras enf ermedades que producen
granulomas, ent re las que se encuent ran la t u-
berculosis
33
, asbest osis
34
y art rit is reumat oide
35
.
En gener al , una enf er medad pul monar act i va
est asociada con una relacin CD4/ CD8 eleva-
da. Aproximadament e un 90% de los pacient es
con sarcoidosis t ienen una alveolit is linf ocit aria.
En el caso de la sarcoidosis, aproximadament e el
60% de los pacient es t ienen una relacin CD4/
CD8 mayor de 3.5. Para rel aci ones CD4/ CD8
mayores de 5 y cercanas a 10 la especif icidad de
un diagnst ico de sarcoidosis es mayor
36
. Es ca-
ract erst ico de la alveolit is alrgica ext rnseca un
increment o import ant e en la proporcin de lin-
f ocit os, siendo st a de al menos el 50% del t o-
t al de las clulas present es en el LBA
37,38
. En al-
52
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sust radode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
cihpargidemedodabor
:rop odarobale FDP
VC ed AS, cidemihparG
arap
acidmoiB arut aret iL :cihpargi-
deM
sust radode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
gunos casos los neut rf ilos y eosinf ilos pueden
verse increment ados. Dicha linf ocit osis es predo-
minant ement e CD8 (+ ) dando como result ado
una disminucin de la relacin CD4/ CD8
39
. Los
t rabaj os publicados al respect o son cont radict o-
rios
40- 43
y en nuest ro laborat orio hemos observa-
do que pacient es alveolt icos a dif erent es et apas
de la enf ermedad (subagudos y crnicos), mues-
t ran dif erent es relaciones de CD4/ CD8 (dat os no
publicados). Las clulas NK pueden t ambin es-
t ar present es y se observa asi mi smo evi denci a
cl ar a de act i vaci n de cl ul as T por medi o de
marcadores como CD69 y HLA- DR
44- 46
. En est e
mismo sent ido, cabe aclarar que la evaluacin de
l as muest ras de LBA de l os di f erent es t i pos de
alveolit is no permit e dist inguir ent re los dif eren-
t es cuadros clnicos, pero puede ayudar a excluir
ot ros. Las aplicaciones en el rea de las enf erme-
dades pul monar es de or i gen i nmunol gi co se
ext ienden an ms, se ha est udiado con el auxi-
lio de la cit omet ra de f luj o el papel que j uegan
ciert as cit ocinas en enf ermedades como neumo-
ni t i s por hi persensi bi l i dad
47
. O l a expresi n de
ciert os recept ores de quimiocinas y sus ligandos
asociados con algunos padecimient os como re-
chazo a t rasplant es pulmonares
48
, asma
49
, alveo-
lit is
50
o sarcoidosis
51
, as como la incidencia y f un-
ci n d e l as cl u l as N K
5 2 , 5 3
en est as m i sm as
enf ermedades int erst iciales. Asimismo, la preva-
lencia de las subpoblaciones de linf ocit os T ga-
mma- delt a ha most rado ser import ant e para al-
g u n as en f er med ad es co mo l a sar co i d o si s
54
,
neumonit is por hipersensibilidad
55
o f ibrosis pul-
monar idiopt ica
56
.
Act ualment e, est n en proceso prot ocolos de
invest igacin en el Inst it ut o Nacional de Enf er-
medades Respirat orias (INER) que cont emplan la
det erminacin de un amplio perf il f enot pico que
proporciona inf ormacin f undament al sobre el
est ado celular de la neumonit is por hipersensi-
bilidad inducida por ant geno aviario, la de ma-
yor incidencia en M xico, en sus diversas et apas
clnicas, as como en la f ibrosis pulmonar idiop-
t ica. M ediant e est a t cnica hemos realizado t am-
bin mediciones de carct er f uncional sobre la
act ividad celular, como det eccin int racelular y
secrecin de cit ocinas (dat os no publicados). La
caract erizacin de est as enf ermedades int erst i-
ciales en M xico, permit ir visualizar los meca-
nismos inmunes que se est ablecen y que como
consecuencia det erminan los dist int os est ados de
dichas enf ermedades pulmonares.
CITOMETRA DE FLUJO Y VIH
El monit oreo de subpoblaciones linf ocit arias en
el sn d r o me d e i n mu n o d ef i ci en ci a ad q u i r i d a
(SIDA), f undament alment e la cuant if icacin en
sangre perif rica de las clulas CD4+ y los lin-
f ocit os CD8+ aport a un valor diagnst ico y pro-
nst ico en est a pat ologa
57
. En la act ualidad, re-
p r esen t a u n a t cn i ca d e r u t i n a en m u ch o s
l abor at or i os, ant e l a necesi dad de est abl ecer
co n t r o l es p er i d i co s d el n mer o d e cl u l as
CD4+ en est os pacient es
58
. El ant geno CD4 es
el recept or para el VIH. Cuando st e inf ect a hu-
manos, las clulas que con ms f recuencia inf ec-
t a son las CD4+ , que se mult iplican para com-
bat ir inf ecciones y producir ms copias del VIH.
El nmero absolut o de linf ocit os T CD4+ es el
parmet ro celular asociado ms est rechament e
a la progresin de la enf ermedad causada por el
VIH y al pronst i co del paci ent e
59
. La rel aci n
en t r e l o s l i n f o ci t o s T CD4 + y CD8 + ( CD4 /
CD8), se conoce como la relacin cooperador/
supresor. En personas sanas est a relacin se en-
cuent ra ent re 0.9 y 1.9, lo que signif ica que hay
una a dos clulas CD4 por cada clula CD8
60
. A
part ir de 1992, en los pases desarrollados, se ha
est abl eci do una ser i e de l i neami ent os par a l a
realizacin correct a del cont eo de clulas CD4/
CD8. Se propone el uso de cit omet ra de f luj o y
un panel de 12 ant icuerpos monoclonales com-
binados: CD45/ CD14 (para enmarcar una ven-
t ana); CD3/ CD4 (para medir linf ocit os T coope-
r ad o r es) ; CD3 / CD8 ( p ar a med i r l i n f o ci t o s T
supresores); CD3/ CD19 (para separar la pobla-
cin de linf ocit os T y B); CD3/ CD56 (para sepa-
rar las clulas NK); y, el cont rol de ant icuerpos
de isot ipo. Asimismo, en M xico se han publica-
do t rabaj os donde se sugiere la conveniencia de
ut i l i zar un panel semej ant e par a el cont eo de
clulas CD4+ , considerando un mnimo de seis
ant icuerpos
61
. En el INER, el SIDA es la principal
causa de mort alidad hospit alaria en personas de
18 a 45 aos de edad y ocupa, desde hace va-
ri os aos, una de l as ci nco pri meras causas de
mort alidad general de los pacient es hospit aliza-
dos. Desde hace cinco aos la cit omet ra de f luj o
se ut iliza en el INER para realizar el cont eo de
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linf ocit os T, t ant o en los pacient es int ernados en
el hospit al como a los que se prest a est e servi-
ci o de maner a ext r ahospi t al ar i a como segui -
mient o de la enf ermedad (Figura 4). Se at ienden
un pr omedi o de 300 paci ent es mensual es, l o
cual muest ra la import ancia clnica, t ant o diag-
nst ica como pronst ica que la cit omet ra de f lu-
j o t iene en est e rengln dent ro del INER.
LA CITOMETRA DE FLUJO A LA
VANGUARDIA EN EL INER: FACSAri a
Act ual ment e se cuent a ya con el ci t met r o de
f l uj o que ha r evol uci onado l a er a moder na de
l a ci t omet r a, el FACSAr i a de Beckt on Di cki n-
son. Graci as a l a f undaci n Gonzal o Ro Arron-
t e, I AP, el I NER adqui r i el pr i mer FACSAr i a
que l l ega a nuest r o pas y, el pr i mer o t ambi n
en Amri ca Lat i na y que se pone al servi ci o del
I nst i t ut o en el r ea de i nvest i gaci n bsi ca. Se
t r at a de un separ ador cel ul ar de al t a vel oci dad
y desempeo, capaz de medi r hast a 11 par -
met r os de maner a si mul t nea. Est e i nst r umen-
t o cuent a con al i neaci n aut omt i ca de l ser
y una nueva pl at af or ma de anl i si s en si st ema
W i ndow s. Cuent a con un si st ema de l i mpi eza
aut omt i co ent r e muest r as, as como l i mpi eza
gener al del i nst r ument o. Gr aci as a su si st ema
t ot al ment e di gi t al es capaz de adqui r i r 70, 000
event os (cl ul as o par t cul as) por segundo y es
posi bl e separ ar 25, 000 cl ul as con una pur e-
za al menos del 98% .
Las apl i caci ones en i nvest i gaci n bsi ca del
FACSAr i a son i nnumer abl es, van desde l a ca-
r act er i zaci n f enot pi ca de si et e col or es, has-
t a anl i si s de par met r os i nt r acel ul ar es, anl i -
si s d e cr o m o so m as, o r g an el o s cel u l ar es,
apopt osi s, est udi os f unci onal es, as como se-
par aci n cel ul ar al t ament e especf i ca con f i nes
de cl onaci n. As, el I NER se encuent r a ya a l a
vanguar di a en ci t omet r a de f l uj o a ni vel mun-
di al y con l a capaci dad ci ent f i ca par a desar r o-
l l ar i nvest i gaci n bsi ca en enf er medades pul -
monares con cal i dad i nt ernaci onal
Agradeci mi ent os
A la qumica Edna Hannia Rodrguez Aguirre por
f acilit arnos la imagen caract erst ica de un pacient e
con VIH en est ado avanzado y t ardo t rat ado en
el INER.
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I nst i t ut o Naci onal de Enf er medades
Resp i r at o r i as. Cal zad a d e Tl al p an
4502, Col oni a Secci n XVI . M xi co,
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