Contaminao por Cryptosporidium spp. em esterco utilizado como adubo em hortas urbanas Contamination with Cryptosporidium spp. in manure used as fertilizer in urban gardens Adriana J. Almeida 1 , Vernica S. Lima 2 , Ana B.F. Rodrigues 1 , Paula A. Di Filippo 1 1 Laboratrio de Clnica e Cirurgia Animal (LCCA), Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias (CCTA), Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF). Av. Alberto Lamego, 2000, Parque Califrnia, Campos dos Goytavazes, RJ, CEP 28013-602. 2 Bio Bichos Clnica Veterinria, Rua So Paulo, 2253, Itoupava Seca, Blumenau, SC. CEP 8903-000. Resumo: Esta pesquisa teve como objetivo a deteco de Cryp- tosporidium spp., um protozorio entrico, do qual algumas espcies podem apresentar carter zoontico, em esterco uti- lizado como adubo em hortas urbanas localizadas em Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil, assim como determinar possveis fatores de risco para a contaminao do esterco. Foram esco- lhidas 15 hortas urbanas que adicionam compostos orgnicos de origem bovina ao solo aps a tcnica de compostagem para o plantio. Foram coletados 200 g de esterco em trs pontos: pice, interior e base do montante de esterco. As amostras fo- ram xadas em soluo de formol a 10%, concentradas atravs da Tcnica de Ritchie modicada, e coradas pela Tcnica de Ziehl-Neelsen modicada para observao dos oocistos. Os resultados obtidos demonstraram que 53% das hortas esta- vam contaminadas por Cryptosporidium spp., e que diferentes condies de higiene, origem do esterco e do abastecimento hdrico, e o processo de compostagem no foram capazes de eliminar o parasito do adubo. Palavras-chave: Contaminao ambiental, Cryptosporidium, hortalia, diarria. Summary: This research aimed the detection of Cryptospo- ridium spp., a zoonotic enteric protozoan, in manure used as fertilizer in urban gardens located in Campos dos Goytacazes, RJ, Brazil, and to determine possible risk factors for manure contamination. There were chosen 15 urban gardens that usu- ally add organic compounds to the ground after the composting technique for planting. About 200 g of manure were collec- ted at three points of the manure amount: apex, interior and base. The samples were xed in formalin 10%, concentrated by modied Ritchie technique, and stained by Ziehl-Neelsen modied technique for oocysts observation. Results obtained showed that 53% of the gardens were positive for Cryptospo- ridium spp., and that different conditions of hygiene, manure source and water supply, and the composting process have not been able to eliminate the parasite from the fertilizer. Keywords: Environmental contamination, Cryptosporidium, vegetables, diarrhea. Introduo Protozorios do gnero Cryptosporidium so reco- nhecidos por serem causa de diarria em pessoas, sen- do os casos mais graves detectados em crianas, espe- cialmente em pases em desenvolvimento. Os sintomas incluem vmitos, nuseas e dor abdominal e a forma assintomtica da doena relatada com freqncia (Chalmers e Davies, 2010). Acredita-se que a contaminao atravs da ingesto de gua e alimentos contendo oocistos do parasito pos- sa ser a maior fonte de infeco da doena, aumentan- do a sua importncia em sade pblica (Bouzid et al., 2008). Em indivduos portadores do vrus HIV, a criptos- poridiose manifesta-se de forma intensa, com quadros altamente espoliativos, podendo levar desidratao e evoluir para a sndrome da m-absoro intestinal e caquexia (Pantenburg et al., 2009). A doena tambm capaz de causar diarria persistente, febre e dor ab- dominal (Ribeiro et al., 2004). A presena de oocistos de C. parvum em fezes de bovinos implica necessariamente na contaminao ambiental por estes parasitos (Mawdsley et al., 1996), inclusive quando h a utilizao de esterco para a adu- bao de solos a serem usados para o cultivo de horta- lias, tcnica utilizada com o objetivo de obteno de melhorias nas propriedades fsicas e qumicas do solo (Kuczynska et al., 2005). A importncia da adubao orgnica em hortalias amplamente reconhecida, principalmente nas folhosas, visando compensar as perdas de nutrientes ocorridas durante seu cultivo, havendo aumento na produo ao utilizar-se esterco bovino (Kimoto, 1993). Para tal, torna-se conveniente a fermentao e/ou compostagem destes resduos objetivando a estabilizao do material orgnico, reduo dos riscos de disseminao de pat- *Correspondncia: jardim@uenf.br; drijardim@yahoo.com.br Tel: (22) 2748-6072, (22) 2748-6056 Almeida AJ et al. RPCV (2013) 108 (585-586) 23-27 24 genos e aumento da disponibilidade de nutrientes para as culturas (Sediyama et al., 2000). Aps este processo, o material orgnico adicionado ao solo, podendo ser- vir como meio de exposio populao humana, in- clusive atravs da conseqente contaminao da gua, reetindo em grave problema em sade pblica. J foi demonstrado que oocistos do gnero Cryptosporidium so capazes de permanecer em diversos tipos de solos (Mawdsley et al., 1996), resistindo a variaes de tem- peratura e pH (Fayer e Nerad, 1996). Estes parasitos so capazes de continuarem infectantes no ambiente por perodos de at 18 meses, particularmente quando esto associados ao material fecal (Yang et al., 1996). As fontes de contaminao de guas e alimentos por oocistos de Cryptosporidium spp. no Brasil so desco- nhecidas devido carncia de estudos epidemiolgicos no pas. Todavia, a rota de transmisso do oocisto do animal para os sistemas de abastecimento hdricos e para o alimento atravs do ambiente deve ser determi- nada, para que medidas estratgicas de controle sejam implementadas, visando a preveno da contaminao destes sistemas. Este trabalho teve como objetivo a deteco de Cryp- tosporidium spp. em esterco utilizado como adubo em hortas urbanas localizadas em Campos dos Goytaca- zes, RJ, Brasil, assim como determinar possveis fato- res de risco para a contaminao do esterco. Material e mtodos Foi realizado um estudo preliminar para o levanta- mento das hortas localizadas na rea urbana da cidade de Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro atravs de listagem fornecida pela Prefeitura Municipal. Foram escolhidas 15 hortas urbanas que adicionam compos- tos orgnicos de origem bovina ao solo aps a tcnica de compostagem para o plantio. Este estudo foi reali- zado atravs de sadas para geo-referenciamento dos locais escolhidos. Foram coletados 200 g de esterco aps o processo de compostagem. As coletas foram feitas em trs pontos: superfcie, meio e base do montante de esterco, sendo coletados 200 g de cada ponto. As amostras foram co- locadas em tubos cnicos, identicados e refrigerados. As mesmas foram levadas ao Laboratrio de Sanidade Animal, do Centro de Cincias e Tecnologias Agrope- curias para a continuidade dos procedimentos. Os responsveis pelas propriedades foram entrevis- tados, com intuito de avaliar o tipo de cultivo, a fonte de gua utilizada para irrigao, as condies de higie- ne e a provenincia do esterco. Para as condies de higiene foram utilizados parmetros como livre aces- so de animais domsticos e/ou seus dejetos s hortas, presena de tocas de roedores e presena de lixo ou entulhos no local. Cerca de 1g de cada amostra foi xado em soluo de formol a 10% em tubos cnicos. As amostras fo- ram concentradas atravs da Tcnica de Ritchie modi- cada (Allen e Ridley, 1970), e coradas pela Tcnica de Ziehl-Neelsen modicada (Henriksen e Pohlenz, 1981). Aps secagem, as lminas foram observadas ao microscpio ptico, em objetiva de 100x (imerso). Os resultados foram analisados estatisticamente atra- vs do Teste de Fisher (Fisher Exact Test), com 95% de intervalo de conana, utilizando-se o programa Gra- phPad InStat (1996). Resultados e discusso Foram identicados oocistos do gnero Cryptospo- ridium nas amostras de esterco em oito hortas, sendo que, em todos os montantes positivos, tanto o pice quanto a base e o interior apresentaram oocistos do protozorio. Portanto 24 (53,3%), das 45 amostras foram consideradas positivas. As localizaes apro- ximadas das hortas, bem como as hortas positivas e negativas para o protozorio podem ser visualizadas na Figura 1. Figura 1 - Localizao aproximada das 15 hortas urbanas em Campos dos Goytacazes - RJ utilizadas para a colheita do ester- co e entrevistas. As setas indicam locais onde houve positividade para Cryptosporidium spp. As origens da contaminao de alimentos por proto- zorios geralmente so as fezes, solo e gua contendo materiais fecais e desprovidos de tratamento (Smith, 1998). A contaminao indireta por oocistos de Cryp- tosporidium inclui a utilizao de esterco para aduba- o do solo, e a distribuio do gado, fatos que podem ser agravados por chuvas fortes, levando os parasitos at lenis de gua subterrneos e demais fontes de gua (Carvalho, 2009) e, consequentemente, a diversos hospedeiros em diferentes regies. Surtos em humanos Almeida AJ et al. RPCV (2013) 108 (585-586) 23-27 25 relacionados gua supercial foram descritos, e as origens de contaminao foram atribudas ao despejo de esgoto e ao escoamento de guas provindas de reas agrcolas, principalmente pastagens ou locais em que o esterco contaminado havia sido aplicado ao solo (Fri- cker et al., 2002). J foi demonstrado que o adubo de origem fecal adi- cionado ao solo capaz de fazer com que a rea se torne um fator de risco para a criptosporidiose em hu- manos, e que trabalhadores rurais, possuem maior pro- babilidade de desenvolver a doena (Lake et al., 2007). A contaminao do esterco e posteriormente da gua ainda possui alguns agravantes: as densidades de con- taminao ambiental infectantes so sucientes para poluir o ambiente aqutico, e os oocistos so bastante pequenos para atravessarem as barreiras fsicas utiliza- das no processo de tratamento da gua alm de serem resistentes aos desinfetantes comumente empregados em seu tratamento (Smith, 1998). Atravs das entrevistas realizadas com os respons- veis pelas hortas foi observado que os locais dos culti- vos so terrenos cedidos pela prefeitura do municpio de Campos dos Goytacazes RJ. O esterco utilizado obtido tanto atravs da prefeitura, quanto de particu- lares, geralmente carroceiros, que coletam o esterco e vendem para os produtores. Em relao ao cultivo, 100% das hortas plantavam alface, agrio, cebolinha, cheiro-verde, couve chinesa, chicria, salsa e espinafre, e o destino deste plantio era para consumo prprio, comercializao no prprio lo- cal e/ou pequenos comrcios e uma parte da plantao era enviada para algumas creches da prefeitura. O abastecimento uvial em cinco das 15 hortas ocor- ria atravs de poos no prprio local da horta, j nas de- mais hortas, a gua era oriunda da companhia de gua. Analisando a Tabela 1, nota-se que no houve dife- rena signicativa entre a positividade para Cryptos- poridium spp. em adubos utilizados para o cultivo de hortalias e para o cultivo de leguminosas, havendo portanto, contaminao em ambos os tipos de planta- es, sendo p = 0,11. Adicionalmente, pode-se observar que no houve diferena signicativa para a positividade de Cryptos- poridium spp. nas hortas as quais utilizavam diferentes fontes de gua, j que p = 0,11, demonstrando que exis- te a contaminao do esterco independente da fonte de gua utilizada. Em pesquisa desenvolvida no Canad, bezerros cuja principal fonte de gua provm de poo esto associados com menores concentraes de oo- cistos eliminados nas fezes, ao contrrio de animais com acesso a fontes de gua tratada parada (Heitman et al., 2002). Oocistos de Cryptosporidium podem permanecer viveis na gua por mais de 140 dias. Nos EUA exis- tem relatos de contaminao por oocistos em cerca de 90% das guas superciais, como rios e lagos (Sim- mons III et al., 2001), assim como existem diversos relatos de presena de oocistos do gnero Cryptospo- ridium em guas de rio e nascentes no Japo (Tiang- tip e Jongwutiwes, 2001), Taiwan (Watanabe et al., 2005), Brasil (Farias et al., 2002), entre outros. Com relao origem do esterco utilizado na horta, foi demonstrado que no houve diferena signicati- va entre o esterco de origem conhecida e desconhe- cida, sendo p=0,31. O produto, quando de origem desconhecida, era adquirido atravs de vendedores ambulantes, que costumam levar o esterco at a horta. Hoar et al. (1999), pesquisaram a prevalncia de Cryptosporidium no esterco de bovinos connados e em amostras coletadas no ambiente, e concluram que 0,17% estavam positivos. Estes resultados so semelhantes ao estudo realizado por Walker et al. (2001) em que 0,18% das amostras coletadas pos- suam oocistos do protozorio. Quando a pesquisa Resultado Varivel Total Valor de p 1 Fonte de gua Poo Tratada Positivo 1 7 8 0,11 Negativo 4 3 7 Produto cultivado Hortalias Leguminosas Positivo 1 7 8 1,00 Negativo 1 6 7 Origem do esterco Prefeitura/Particular Desconhecida Positivo 5 3 8 0,31 Negativo 2 5 7 Higiene do local Boa Ruim Positivo 8 0 8 0,20 Negativo 5 2 7 Tabela 1 - Risco relativo da presena de Cryptosporidium spp. em amostras de esterco de 15 hortas urbanas em relao s variveis analisadas 1 Fishers Exact Test (CI=95%) Almeida AJ et al. RPCV (2013) 108 (585-586) 23-27 26 foi feita com fezes frescas, o resultado foi seis vezes maior, sugerindo que o material fecal, aps deposita- do no ambiente, pode sofrer inuncias ambientais que reduziriam a carga efetiva do parasito no esterco (Walker et al., 2001). Estes dados demonstram que o tempo e as inuncias ambientais no foram capazes de eliminar os oocistos do material fecal. A maioria das hortas visitadas possua condies de higiene consideradas boas (86,7%) e em outras, cujas condies de higiene foram consideradas ruins, havia a presena de animais como ces, roe- dores, galinhas, gatos, alm de ausncia na proteo de poos e de locais de armazenamento da gua uti- lizada para irrigao. Observando-se ainda os dados da Tabela 1, pode-se notar que no houve diferena signicativa a positividade para Cryptosporidium entre hortas com condies de higiene boas e em outras cujas condies de higiene foram considera- das ruins, p = 0,20. Almeida et al. (2008) no observaram diferenas signicativas na positividade para este parasito entre criaes de bovinos com condies de higiene consi- deradas boas (41%) e em outras cujas condies de higiene foram consideradas ruins (20%). Da mesma maneira, Maldonado-Camargo et al. (1998), no ob- servaram diferenas signicativas entre a eliminao de oocistos e as prticas higinicas em animais de produo, o que nos leva a sugerir que os protozo- rios esto presentes nos animais e no ambiente, inde- pendentemente das condies de higiene encontradas nas diferentes propriedades rurais e urbanas. As amostras de esterco foram coletadas de trs pon- tos diferentes do montante de esterco: pice, interior e base, e foram detectadas 24 amostras positivas e 21 negativas. Com relao aos pontos de coleta, o gnero Cryptos- poridium esteve presente em todo o montante de ester- co independente de sua altura e armazenamento. Ou seja, mesmo quando o pice e a base tiveram em maior contato com a luz solar, os oocistos persistiram. Concluso Observou-se contaminao por Cryptosporidium spp. em grande parte das hortas urbanas em Campos dos Goytacazes RJ. Diferentes condies de higie- ne, origem do esterco e do abastecimento hdrico, o processo de compostagem e a localizao do ponto de coleta no monte de esterco no foram capazes de eliminar o parasito do adubo. Bibliograa Almeida AJ, Oliveira FCR, Teixeira CS (2008). Risco relativo da infeco por parasitos do Gnero Cryptosporidium em be- zerros bovinos no Norte do Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinria, 17, 243-248. Allen AVH, Ridley DS (1970). Further observations on the formol ether concentration technique parasites. Journal of Clinical Pathology, 23, 545-546. Bouzid M, Steverding D, Tyler KM (2008). Detection and surveillance of waterborne protozoan parasites. Current Opinion Biotechnology, 19, 302-306. Carvalho TTR (2009). Estado atual do conhecimento de Cryp- tosporidium e Giardia. Revista de Patologia Tropical, 38, 1-16. Chalmers RM, Davies AP (2010). Minireview: clinical cryp- tosporidiosis. Experimental Parasitology, 124, 138-46. 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