Universidade Tecnolgica Federal do Paran

Campus Campo Mouro

Curso de Engenharia de Alimentos
Disciplina de Microbiologia dos Alimentos
Prof
a
. Leila Larisa M. Marques

Contagem de coliformes a 35C(totais) e 45C
(termotolerantes) em alimentos

Parte 2: caracterizao de E. coli













- Todas as subculturas positivas em caldo EC so
repicadas para gar EMB, com auxlio de ala de
platina, fazendo estrias (por esgotamento). Para cada
tubo positivo em caldo EC corresponder uma placa de
gar EMB, identificada para a perfeita correspondncia;
OBS.: Meio EMB- Eosina e azul de metileno so
corantes inibidores de Gram +. O microrganismo
ao crescer fermenta a lactose, produzindo cido e
precipitando a eosina e o azul de metileno, que ao
se interagir, fornecem o brilho verde metlico
caracterstico da E. coli.
- Incubar a 35C por 18-24h;
- Transcorrido este tempo, verificar o crescimento de
colnias com caractersticas de E. coli, ou seja, 2 a 3
mm de dimetro, com brilho metlico esverdeado ou
com o centro escuro abrangendo praticamente toda a
colnia;
- De cada placa de EMB correspondente a cada tubo
de EC, repicar de 2 a 3 colnias caractersticas para
tubo com gar nutriente inclinado, e incubar por 18-24h
a 35-37C;
Efetuar de cada cultura em gar nutriente, as seguintes
provas bioqumicas:
1. Indol;
2. Vermelho de metila-VM;
3. Voges-Proskauer-V;
4. Citrato.
Este grupo de prova denominado IMVIC.

- Considerar a cul tura positiva para E. coli, quando
forem obtidos os seguintes resultados para o IMVIC:

Indol VM VP Citrato Tipo
+ + - - E. coli tpica
- + - - E. coli atpica

- Considerar positivo o tubo de caldo EC para E. coli,
quando pelo menos uma cultura dele proveniente for
positiva no teste do IMVIC;
- Verificar na Tabela de NMP o nmero correspondente
aos tubos de EC positivos para a presena de E. coli e
expressar o resultado em NMP de E. coli/g ou mL.

1. Prova do Indol.
a) Procedimento: transferir o microrganismo a ser
testado para o meio de cultura (caldo triptona).
Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs.
b) Objetivo: esta prova para testar a habilidade de
alguns microrganismos de degradarem a molcula de
triptofano em indol.
c) Princpio: bactrias que possuem a enzima
triptofanase so capazes de hidrolisar o triptofano,
produzindo indol, piruvato (cido pirvico) e amnia.
Estes dois ltimos produtos so utilizados diretamente
no metabolismo da clula, enquanto o indol acumula-se
no meio. A presena de indol pode ser detectada pela
adio do reativo de Kovacs ao meio de cultura que
resultar na formao de uma colorao vermelha na
superfcie do lquido.

Bactria+triptofano indol + c. Pirvico + amnia

d) Resultado: aps incubao a 37C por 48 horas e
adio do reativo, tem-se:
Positivo: a presena de uma colorao
vermelha na superfcie do lquido;
Negativo: a presena de uma colorao
amarela (cor de reativo de kovacs) na
superfcie do lquido.

2. Vermelho de metila-VM.
a) Procedimento: transferir o microrganismo a ser
testado para tubos de ensaio com caldo VM-VP (meio
de Clark e Lubs). Incubar os tubos a 37C por 24 a 48
horas. Na leitura adicionado 5 gotas de uma soluo
de vermelho de metila.
b) Objetivo: determinar a habilidade de algumas
bactrias em oxidar a glicose e levar produo de
cidos orgnicos como produto final.
c) Princpio: muitas bactrias utilizam glicose para
suprir suas necessidades nutricionais. Apesar disso, os
produtos finais resultantes da oxidao da glicose
podem variar dependendo das vias metablicas
presentes em cada microrganismo. Algumas bactrias,
ao fermentarem a glicose, produzem cidos orgnicos
(frmico, actico, ltico, succnico, etc) que reduzem o
pH do meio. Essas diferenas metablicas podem ser
evidenciadas, ento, pela adio de uma soluo de
vermelho de metila (indicador de pH) ao meio onde foi
cultivado o microrganismo de interesse. Em meios
acidificados, com pH menor que 4,0, o indicador torna-
se vermelho. Em meios com o pH maior ou igual a 6,0,
o indicador adquire cor amarela.

Glicose


cido pirvico


Fermentao cido mista


pH 4,4 (cor vermelha)

d) Resultado: aps a incubao a 37C por 48 horas,
adicionar o reagente (vermelho de metila), tem-se:
Positivo: colorao vermelha (pH menor que
4,0);
Negativo: cor original (amarela) do meio (pH
maior ou igual a 6,0).

3. Prova do Voges Proskauer (VP)
a) Procedimento: transferir a bactria a ser testada
para o meio VM-VP (meio de Clark e Lubs). Incubar os
tubos a 37C por 24 a 48 horas. Retirar 2ml da cultura
para novo tubo e adicionar a cada tubo 15 gotas do
reagente -naftol 5% (reagente A) e 5 gotas de
soluo de KOH a 40% (reagente B); por cada mL de
meio de cultura. Agitar levemente o tubo.
b) Objetivo: evidenciar a produo de compostos no
acdicos obtidos a partir da fermentao da glicose.
c) Princpio: bactrias que fermentam a glicose e
levam produo final de compostos no acdicos,
como a acetona (acetilmetilcarbinol), podem ser
identificadas pela adio ao meio de cultivo dos
reagentes A e B. Na presena deles, a acetona
oxidada transformando-se em diacetil, o que leva ao
aparecimento de uma colorao rseo-avermelhada,
na superfcie do meio em torno de 15 a 20 minutos
aps a adio dos reagentes.
Glicose

cido pirvico

Acetilmetilcarbinol (acetona)

+ -naftol + KOH 40%

Diacetil complexado com naftol

Composto vermelho

d) Resultado: para cada mL da cul tura incubada
durante 48 horas, adicionar os reagentes, agitando
sempre aps a incluso de cada soluo, deixar em
repouso por 5 a 30 minutos.
Positivo: desenvolvimento de uma colorao
rsea a vermelho rubro;
Negativo: ausncia de colorao rsea ou
vermelha.

4. Citrato.
a) Procedimento: transferir a bactria a ser testada
para gar citrato de Simmmons. Incubar os tubos a
37C por 24 a 48 horas. Aps a incubao, examinar
as culturas contidas nos tubos com o meio inclinado e
avaliar a presena ou a ausncia de crescimento da
bactria, verificando qualquer alterao na cor do meio
de verde para azul.
b) Objetivo: caracterizar microrganismos capazes de
utilizar o citrato como a nica fonte de carbono, os
quais provocam a elevao do pH do meio de cultivo
devido a metabolizao de ons citrato.
c) Princpio: para utilizar o citrato como nica fonte de
carbono, necessrio que a bactria possua a enzima
citrato permease que facilita o transporte do citrato pra
o interior da clula. Do metabolismo do citrato so
produzidos piruvato e CO2. Este ltimo, ao reagir com o
sdio presente no meio, forma o carbonato de sdio,
de natureza alcalina. O meio gar citrato de Simmons
possui o citrato de sdio como nica fonte de carbono,
e o azul de bromotimol como indicador de pH. Com o
aumento do pH do meio, o azul de bromotimol adquire
uma cor azul, o que indica resultado positivo para o
teste de utilizao do citrato.
d) Resultado: aps a incubao a 37C, tem-se:
Positivo: o meio se torna azul intenso,
principalmente no pice;
Negativo: a cor natural do meio no muda,
permanecendo verde.



Referncias Bibliogrficas
SIQUEIRA, R. S. Manual de microbiologia de
alimentos. Rio de Janeiro: Embrapa, 1995.
OKURA, H. M; RENDE, J. C. Microbiologia roteiros de
aulas prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008.