DOI: 10.1074/jbc.M111.

330100 Code: 4A94

GP4, PL3
Fonte Biolgica
Inibidor de Carboxipeptidases de caracol marinho -
espcie Nerita versicolor

Carboxipeptidase origem humana, homo sapiens
Metalocarboxipeptidase - MCP
EC: 3.4.17

3. Hidrolase
3. 4. Peptidase
3.4.17. Metalocarboxipeptidase

CPA 3 Digesto das protenas pelos mastcitos
CPA 4 - Envolvido na progresso tumoral
CPA 5 No bem estudada
CPA 6 Presente na matriz extracelular onde ativa
human carboxypeptidase A4 hCPA4
Atividade
Exopeptidase: quebra as ligaes peptdicas entre
os aminocidos na regio C-terminal.


Envolvida em processos como:
Digesto
Coagulao/Fibrinlise do sangue
Inflamao
Processamento de prohormonas e neuropptidos
Progresso de alguns cancros
Inibio
Localizao biolgica:









Inibidores j estudados:

PCI potato carboxypeptidase inhibitor de Solanum tuberosum
LCI leech carboxypeptidase inhibitor de Hirudo medicinalis
TCI tick carboxypeptidase inhibitor de Rhipicephalus bursa
ACI Ascaris carboxypeptidase inhibitior de Ascaris suum







Pequeno
tamanho
(39-75 resduos)

Estabilizao
por pontes de
dissulfito
Nerita Versicolor carpoxypeptidase
inhibitor - NvCI
53 resduos de aminocidos
Composto por 2 folhas b anti-paralelas, ligadas por 3 loops
Cauda C-terminal inibitria
Estabilizao por 3 pontes de dissulfito.

Liga-se fortemente a M14A subfamlia das carboxipeptidases
bCPA1 bovine carboxypeptidase A1
CPA1 human carboxypeptidase A1
hCPA4 human carboxypeptidase A4


Inibio bastante eficiente
relativamente a outros inibidores
exgenos
Objetivo:
Caraterizar estruturalmente o NvCI e o complexo
formado quando se liga hCPA4

Estudar o seu modo de atuao numa subfamlia de
carboxipeptidases

Comparar atividade com outros inibidores j
estudados

Procedimento Experimental
1. Expresso e Purificao de NvCI recombinante
2. Expresso e Purificao de hCPA4 recombinante
3. Formao e Purificao do complexo NvCi hCPA4
4. Cristalizao e Organizao dos dados
5. Determinao da estrutura e Refinamento
6. Determinao das constantes de inibio
Produo de NvCI recombinante
Sequncia de aminocidos

Degradao de Edman e
MALDI-TOF-MS
Concentrao da
protena no
sobrenadante
Mtodo BCA e atividade
inibitria contra bCPA1
O resduo N-terminal marcado e clivado,
deixando intactas todas as outras ligaes
peptdicas
Tcnica de ionizao usada em espetrometria de
massa, permitindo a anlise de biomolculas que
se fragmentam quando ionizadas por mtodos
convencionais.
Semelhante ao mtodo de Lowry no
entanto o reagente cido bicinchonnico
- mais estvel em condies alcalinas.
Purificao do NvCI recombinante
Combinao de dois processos de
cromatografia de troca inica:


Pureza do NvCI recombinante
determinada pela sua massa
molecular, obtida por:
MALDI-TOF-MS
Tris/Tricina/SDS-PAGE
Atividade funcional contra bCPA1
As protenas movem-se atravs da coluna
a velocidades determinadas pela sua
carga efetiva e pelo pH a ser usado
Sistema de electroforese de preferncia
para a resoluo de protenas mais
pequenas do que 30 kDa
1. Troca catinica
fraca
20 mM Tris-HCl
pH 7.0
Gradiente de
fora inica (at
1 M NaCl)
2. Troca aninica
Gradiente linear
de 0-100% de 20
mM Tris-HCl
contendo 1 M
NaCl
Produo e purificao de hCPA4
recombinante
Produo: feita da mesma forma que o
descrito para NvCI.

Purificao: combinao de
cromatografia de interao hidrofbica e
cromatrografia de fraca troca aninica.

Pureza: determinada por SDS-PAGE.

Atividade enzimtica funcional:
hidrlise de um substrato sinttico, N-(4-
methoxiphenylazoformyl)phenylalanine.

Baseia-se em interaces hidrofbicas entre as
protenas e os ligandos na fase estacionria.
Formao e purificao do
complexo NvCI-HCPA4
Incubao de ambos
(razo molar de 1:2 enzima/inibidor)
30 min
50 mM de Tris-HCl
pH 8.5
150 mM de NaCl
37 C
16 mg de rhCPA4
5.5 mg de rNvCi
Volume reacional: 70
ml
Cromatografia de
excluso por tamanho
(filtrao em gel)
Ultracentrifugao
Complexo
concentrado a 17.6
mg/ml
Separa as molculas dissolvidas com
base no seu tamanho, bombeando-as
por colunas especializadas que
contm material de preenchimento
de tamanhos diferentes
Complexo purificado
Cristalizao
0.04 M NH
4
NO
3
25 % (m/v) PEG 3350
T = 18C
4 dias
Crio-
conservao
em azoto
lquido e 12%
glicerol
A estrutura do complexo foi determinada por difrao
de raio-X a 1.7 , usando hCPA4 como modelo, atravs
do cdigo 2 PCU do Protein Data Bank.

Refinamento: CNS e PHENIX.






Bom modelo



A maioria dos resduos
encontram-se nas regies
preferenciais do Grfico de
Ramachandran
Determinao das constantes de
inibio
Variao da concentrao de inibidor
Variao do tempo de incubao
Concentrao fixa de enzima
Concentrao fixa de substrato (0.1 mM N-(4-
methoxiphenylazoformyl)phenylalanine)




pH = 7.5 T = 37 C
8 alfa-hlices
8 folhas beta
Resultados experimentais:
Estrutura da hCPA4
Motivo a/b
Centro cataltico:

Zn
2+
coordenado a H
2
O,
His-69, His-196, Glu-72
Resultados experimentais:
Estrutura do NvCI
Duas folhas b antiparalelas ligadas por 3
major loops e duas caudas (N e C
terminal)
3 pontes dissulfito (Cys 9 e 23, Cys 15 e 51
e Cys 27 e 38)


Centro hidrofbico perto do C
terminal da protena
Resduos hidrofbicos expostos ao
solvente reduo da solubilidade
Interaes apolares com a cadeia
lateral do Trp-42
2 pontes dissulfito do inibidor

Cauda C-terminal: ligao aos resduos do centro ativo e tambm ao Zn
2+
Tyr- 52
Ala- 53
Resultados experimentais:
Estrutura do NvCI
Dmero: dois
complexos
idnticos
Cada
monmero:
estrutura binria
hCPA4 + NvCI
Resultados experimentais: Estrutura
do complexo hCPA4 - NvCI
Ligando H
2
O substitudo
por grupo carboxilato do
C-terminal do inibidor
(coordenao bidentada)
na ligao ao Zn
2+

Mudana: movimento da
cadeia lateral da Tyr-248
em 180 para acomodar a
cadeia C-terminal do
inibidor
Resultados experimentais:
Estrutura do complexo hCPA4 - NvCI
Mais pequeno que os outros inibidores (2 resduos da
cauda C-terminal P1 e P2) e 53 resduos no total.

Resultados experimentais:
Porqu o NvCI?
NvCI Outros inibidores
P1- Presena de Nitrato P1 aminocido aleatrio
Interage muito mais fortemente com os
resduos do centro ativo da protena
onde se liga o substrato
P1 - resduos alifticos (Ala)
P2 resduos geralmente aromticos (Tyr)
Resultados experimentais: Porqu
o NvCI ? qumica do C-terminal
Estabilizao da Tyr-248
Forte inibio do NvCI
Ala-53
Liga-se pelo seu grupo carboxilato de forma bidentada ao zinco
O seu grupo amino estabelece pontes de H com o O da Tyr-248
Protena Ki/ pM
bCPA1 5,8
hCPA1 1,2
hCPA4 4,9
Resultados experimentais: Determinao
das constantes de inibio (K
i
)
NvCI apresenta as mais fortes constantes de inibio
(grandeza picomolar), ao contrrio dos outros inibidores
estudados, que geralmente apresentam K
i
de grandeza
nanomolar.
Menor Ki
Inibio mais forte
Resultados experimentais:
NvCI e outros inibidores um exemplo de
evoluo convergente
C-terminal
mimetiza a ligao
do substrato


Interao do C-
terminal do NvCI
semelhante de
outros inibidores
exgenos

Resduos P1
e P2 da C-
terminal
conservados
Mecanismo
de inibio
semelhante
Conformao
e estrutura
da C-
terminal
parecidas
Origem de
organismos
diferentes
Resduo P3 (Gly-51) diferena estrutural curiosa
NvCI a exceo
Formaao de 2 pontes de H extra com Glu-163 da hCPA4
Inibio mais forte do NvCI,
reduo de K
i
Estabilizao da formao
do complexo NvCI hCPA4
Interao
Secundria Contactos entre
resduos das folhas
B de NvCI com
resduos distantes
do centro ativo da
hCPA4
Interaes
Van der Walls
Aumento do
carter
inibitrio de
NvCI
Pontes de H:
Gln39-Asn123
Glu37-Arg130 (CPK)
Arg7-Asn159
Cauda C-terminal mais pequena em NvCI no h clivagem
Estruturas diferentes, cauda C-terminal semelhante
Afinidade entre inibidor-carboxipeptidase maior em NvCI
interao Glu163-Cys51
Biotecnologia e Biomdica:
- Formas de atuao na Natureza com a evoluo
- Descobrir mecanismo geral de inibio
Discusso de Resultados/
Perspetivas Futuras