Beauveria y Metarhizium

i
UNIVERSIDAD MICHOACANA DE
SAN NICOLS DE HIDALGO

FACULTAD DE AGROBIOLOGIA
PRESIDENTE JUREZ

Reactivacin, evaluacin y formulacin de
Beauveria bassiana (Bals) Vuill. y Metarhizium
anisopliae (Metsch) Sor. contra Acanthoscelides
obtectus (Say.)

T E S I S

COMO REQUISITO PARCIAL
PARA OBTENER EL TTULO DE:

INGENIERO AGRNOMO
ESPECIALISTA EN PARASITOLOGA AGRCOLA

PRESENTA

EDGAR DANIEL SNCHEZ TORRES

URUAPAN, MICHOACAN, MEXICO 2008

Firmado digitalmente
por AUTOMATIZACION
Nombre de
reconocimiento (DN):
cn=AUTOMATIZACION,
o=UMSNH, ou=DGB,
email=soporte@bibliotec
a.dgb.umich.mx, c=MX
Fecha: 2010.11.08
12:34:56 -06'00'
ii

Reactivacin, evaluacin y formulacin de Beauveria bassiana (Bals) Vuill y Metarhizium
anisopliae(Metsch) Sor. contra Acanthoscelides obtectus (Say.)

T E S I S

QUE SE SOMETE A CONSIDERACIN DEL H. JURADO COMO REQUISITO
PARCIAL PARA OBTENER EL TTULO DE:

INGENIERO AGRNOMO ESPECIALIDAD EN PARASITOLOGA

PRESENTA:

EDGAR DANIEL SNCHEZ TORRES.

Dra. Martha Elena. Pedraza Santos
Presidente de tesis.

Dr. Pedro Antonio Garca Saucedo. Dr. Jose Luciano Morales Garcia
Sinodal Sinodal

Ing. Roman Negrete Nolasco Ing. Teresita del Carmen vila Val
Sinodal Sinodal

Dra. Ana Tztzqui Chvez Barcenas.
Sinodal.

iii

A G R A D E C I M I E N T O S.

A Dios por prestarme vida y haberme permitido concluir este trabajo en compaa de mis
seres queridos.

A la Facultad de Agrobiologa Presidente Jurez y al departamento de Parasitologa
Agrcola, por permitir realizar mis estudios profesionales.

A la Doctora Martha E. Pedraza Santos con respeto, por brindarme su apoyo y dedicacin
en la asesora del presente trabajo.

Al Ing. Hctor Daniel Snchez Crdenas por sus valiosos consejos, sus sugerencias y
valiosa asesora y disponibilidad en todo momento.

Al Centro de Estudios Para El Desarrollo y Equidad (CEPADYEQ) por haberme apoyado
en la realizacin de esta tesis, en especial al Bilogo Hugo por su paciencia y por apostar en
mi favor.

A la M. B. Mariana Miranda Armbula profesor del CIBA-IPN Tlaxcala por su
paciencia que mostr para conmigo y su apoy brindado para la realizacin de la presente
tesis.

A la Dra. Mara del Carmen Villegas Hernndez subdirectora del CIBA-IPN Tlaxcala
por su gran motivacin y calidad humana.

A los doctores Pedro Antonio Garca Saucedo, Ana T. Chvez Brcenas, Jos Luciano
Morales Garca, como tambin a los ingenieros Teresita de Jess vila Val y Romn
Negrete Nolasco por haberme brindado su apoyo, consejos y disposicin para conmigo.

A mis compaeros y amigos de generacin por los momentos compartidos durante la carrera
profesional, especialmente a: Judith, Irais, Romn y Ernesto.

Y a todos aquellos que al leer esta tesis digan: ah que mala onda a mi no me pusiste!

iv

DEDICATORIA:

A mis padres:
Margarita Torres Bentez.
Hctor Daniel Snchez Crdenas.

Con profundo cario y respeto a quienes me dieron la vida, amor y por su sacrificio para
haber realizado una ms de mis metas.

A mis hermanos:
Sandra Saray.
Alberto.

Con quienes he pasado momentos muy divertidos y llenos de felicidad, y por apoyarme y
depositar su confianza en mi.

A mi abuela:
Beatriz Crdenas Victoria.

Por su apoyo, respeto y cario.

A todos mis tos en general por apoyarme en todo momento por confiar en mi.

A los bilogos:
Hugo Alberto Barba lvarez
Everardo Gonzlez Allende

Con respeto y admiracin por el apoyo que me han brindado, por apostar a lo peor de cada
casa y por alentarme a salir adelante.

A mis amigos

Sue Irais Martinez.
Judith Torres.
Ernesto Snchez.
Roman Negrete.
Francisco Barba.

Por brindarme su amistad incondicional.

i

NDICE GENERAL
PGINA

INDICE DE CUADROS iii

INDICE DE FIGURAS v

RESUMEN vii

1 INTRODUCCIN 1

2 REVISIN DE LITERATURA 4

2.1 El frijol (Phaseolus vulgaris) L 4

2.1.1 Fenologa del cultivo 5

2.2 Acanthoscelides obtectus (Say.) 6

2.2.1 Taxonoma 8

2.2.2 Descripcin morfolgica 8

2.2.3 Biologa y hbitos 11

2.2.4 Daos en el frijol 11

2.3 Control con hongos entomopatgenos 12

2.4 Factores que intervienen en el desarrollo de micopatgenos 17

2.4.1 Temperatura 18

2.4.2 Humedad relativa 18

2.5 Propiedades de los hongos entomopatgenos 19

2.6 Beauveria bassiana (Bals.) Vuill 21

2.6.1 Antecedentes 21


2.6.3 Determinacin taxonmica 25
ii

2.6.4 Modo de accin 25

2.7 Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. 27

2.7.1 Antecedentes 27


2.6.3 Determinacin taxonmica 31

2.6.4 Modo de accin 32

2.8 Cordyceps spp. 33

2.9 Reactivacin de un entomopatgeno 34

2.10 Produccin masiva de hongos entomopatgenos 36

2.11 Formulacin de hongos entomopatgenos 39

3 MATERIALES Y MTODOS 40

3.1 Ubicacin del rea de trabajo 40

3.2 Seleccin de las cepas de los hongos B. bassiana y M. anisopliae 40

3.3 Reactivacin 41

3.3.1 In vivo 41

3.3.2 In vitro 42

3.4 Propagacin masiva de los entomopatgenos en arroz 43

3.5 Concentracin de conidias 46

3.6 Diseo experimental 48

3.6.1 Tratamientos evaluados 48

3.6.2 Unidad experimental 48

3.6.3 Identificacin de Acanthoscelides obtectus (Say) 49

iii

3.7 Aplicacin de los tratamientos evaluados 49

4 RESULTADOS Y DISCUSIN 51

4.1 Reactivacin de los entomopatgenos contra A. obtectus 51

4.2 Tratamientos y evaluacin de las cepas 52

4.3 Influencia de los entomopatgenos sobre A. obtectus 52

5 CONCLUSIONES 57

6 BIBLIOGRAFIA 58

7 APENDICE 62

iv

INDICE DE CUADROS

CUADRO Pg.

1. Clasificacin parcial de hongos con principales gneros de entomopatgenos. 20

2. Ventajas e inconvenientes de la Fermentacin en medios slidos 38

3. Claves para la determinacin taxonmica de Beauveria bassiana segn The
Hughes-Tubaki-Barron System of classification; Alternate Key to series and genera
(Moniliaceae and Dematiaceae) 62

3 a. Claves para la determinacin taxonmica de Beauveria bassiana segn The
(Moniliaceae and Dematiaceae) 63

4. Anlisis de varianza para la variable nmero de muertos de Acanthoscelides
obtectus por efecto de los entomopatgenos a las 120 horas despus de
establecido el experimento 64






v




vi

INDICE DE FIGURAS

FIGURA Pg.

1. Estadios de A. obtectus A) Adulto y B) pupa 7

2. Caractersticas morfolgicas para diferenciar los sexos
de A. obtectus 10

3. Dao de A. obtectus en granos de frijol 12

4. Modo de accin general de un entomopatgeno sobre
un insecto 15

5. Estructuras del hongo B bassiana A) Colonia de en medio slido,
B) Simpodulosporas 24

6. Estructuras y cultivo A) Micelio B) Conidioforo hialino y fialosporas
C) Metarhizium en medio slido 30

7. Proceso de lavado de arroz 44

8. Inoculacin del arroz con cepas reactivadas 45

9. Movimiento de sustrato inoculado para romper micelio 45

10. Arroz en cuartos de crecimiento y de secado 46

11. Conteo de conidios para obtener el nmero de conidios g
-1
47

12. A. obtectus mostrando la espina bfida en el fmur 49

13. Tratamientos de entomopatgenos evaluados con ejemplares
de A. obtectus 50

14. Media de ejemplares muertos en cada toma de datos
durante el bioensayo 53

15. Porcentaje de mortandad sobre A. obtectus de los tratamientos
evaluados 54

vii

RESUMEN

El frijol Phaseolus vulgaris L. en Mxico est dentro de los principales cultivos,
tanto en superficie sembrada como por su frecuencia en la dieta del pueblo (Claridades
Agropecuarias, 1997). La produccin anual de este grano no se consume de inmediato, por
lo que se requiere almacenarlo, y es en este periodo cuando los daos ocasionados por
plagas insectiles generan prdidas que van de un 10 al 35 %, provocadas por la oviposicin,
alimentacin y refugio de dichas plagas; destacando el gorgojo comn Acanthoscelides
obtectus (Camargo, 2000).
Estas prdidas se hacen visibles en el almacn; sin embargo, el dao proviene desde
el campo, donde las hembras ovipositan sus huevos en las vainas tiernas, de ah la
importancia de tener un buen manejo integrado de plagas para as poder reducir los daos
en almacn
1
(comunicacin personal).
Con la finalidad de ofrecer una alternativa de control a los productores y centros de
acopio se reactivaron cepas virulentas de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae
especficas contra A. obtectus, mediante la tcnica de reactivacin in vitro y evaluacin de
la virulencia de ambas cepas a concentraciones de 1.2x10
12
, 1.2x10
11
, 1.2x10
10
y 1.2x10
9

conidios g
-1
. El diseo experimental fue completamente al azar y se probaron 10
tratamientos, incluido el testigo, con tres repeticiones.
Los insectos utilizados en el bioensayo fueron obtenidos de una colecta de varias
muestras de frijol. Se realiz una aplicacin de cada tratamiento. Los resultados de este

1
Snchez Crdenas H. D. Ingeniero Agrnomo Parasitlogo del Estado de Tlaxcala.
viii

trabajo indicaron que el mejor tratamiento fue el de la cepa de M. anisopliae SB07 a una
dosis de 1.2x10
12
conidios g
-1
con un 67.5 % de mortalidad sobre A. obtectus, seguido por
la cepa de B. bassiana SB07 a la concentracin de 1.2x10
12
conidios g
-1
con un 62.5 % de
mortalidad, ambos 288 horas despus de la aplicacin.
Como resultado se formul el producto para la aplicacin tanto en campo como en
almacn de ambas cepas.

1

I. INTRODUCCIN

La importancia que representa el cultivo del frijol Phaseolus vulgaris L. en nuestro
pas tiene profundas races milenarias. Actualmente, es uno de los principales cultivos en
Mxico, ya que junto con el maz Zea mays L. constituye la dieta del pueblo mexicano. El
papel de esta leguminosa sigue siendo fundamental en lo econmico, porque representa
para la economa campesina una fuente importante de ocupacin e ingreso, as como una
garanta de seguridad alimentara, va autoconsumo; mientras que en la dieta representa, la
principal y nica fuente de protenas para amplias zonas de la poblacin mexicana
(Claridades Agropecuarias, 1997).
Las prdidas de granos y semillas en postcosecha son un problema que merece gran
atencin debido a que existen diversos factores que las originan durante su
almacenamiento. En nuestro pas la mayora de los agricultores no cuentan con lugares
adecuados para ello (Ibarra et al., 1998); y como es fsicamente imposible el consumo
inmediato de la produccin total del grano es necesario mantenerlos almacenados desde la
cosecha hasta su consumo o comercializacin (Prez, 1997), periodo en el que sufren
perdidas que van de un 10 a un 35 % ocasionadas por la alimentacin, oviposicin y
refugio de plagas insectiles destacando el gorgojo comn Acanthoscelides obtectus
(Camargo, 2000).
El mtodo comn de combate de A. obtectus ha sido mediante el uso de productos
qumicos, sin embargo se han ocasionado problemas secundarios como intoxicaciones en
humanos, contaminacin de los productos tratados, ambiental y problemas de resistencia de
insectos; tales efectos impulsan a buscar alternativas de manejo de plagas que involucran el
2

uso de variedades resistentes, enemigos naturales y empleo de sustancias de origen
botnico con accin insecticida (Camargo, 2000), adems, el control biolgico, a travs del
cual se emplean las mismas herramientas que existen en la naturaleza para el combate de
plagas agrcolas (Garza, 1999). Los hongos entomopatgenos, se han destacado por su
papel en el control microbial de insectos plaga, ya que virtualmente todos los rdenes de
insectos son susceptibles a enfermedades fungosas. Sin embargo uno de los problemas ms
frecuentes para este mtodo de control es la falta de informacin para el manejo y
aplicacin de bioinsecticidas (Hernndez, 1999).
El frijol es un cultivo bsico en la repblica mexicana, y es uno de los granos que
almacenados sufren daos ocasionados por plagas, se pretende ofrecer una regulacin
biolgica de A. obtectus mediante la aplicacin de las cepas reactivadas de Beauveria
bassiana SB07 y Metarhizium anisopliae SB07 como una alternativa para reducir
infestaciones en almacn y en campo, el cul es un mtodo econmico, de fcil aplicacin y
que a diferencia del control qumico, se considera seguro ya que no contamina el ambiente,
no perjudica a la salud humana ni animal y permite conservar la diversidad biolgica.
Por lo anterior, en el presente trabajo se persiguieron los siguientes objetivos:
1. Seleccionar la cepa de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill y la de Metarhizium
anisopliae (Metsch) Sor. con crecimiento ms vigoroso que tiene el cepario del
CREROB.
2. Reactivar especficamente ambos entomopatgenos contra Acanthoscelides
obtectus (Say).
3. Determinar la efectividad biolgica de distintas concentraciones de ambos
3

hongos aplicadas en las condiciones ms parecidas a las de campo.
4. Evaluar la virulencia de dichas concentraciones contra Acanthoscelides obtectus
(Say).
5. Formular la concentracin ms virulenta para ambos hongos para ofrecer una
alternativa de control a los productores de frjol, y reducir el costo y los daos
a la produccin y almacenaje de dicha leguminosa.
Hiptesis
El gorgojo del frijol Acanthoscelides obtectus (Say) es susceptible al control
biolgico con las cepas reactivadas de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill (BbSB07) y
Metarhizium anisopliae (Metsch) Sor. (MaSB07).

4

II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 El frijol Phaseolus vulgaris L.
2.1.1 Antecedentes
El frijol Phaseolus vulgaris L. es una planta originaria de Amrica tropical y
subtropical que, segn los restos ms antiguos data de hace 5000 aos aproximadamente.
La llegada de los espaoles a nuestro continente permiti que esta leguminosa se difundiera
a todo el mundo, de tal forma que hoy ubicamos a los principales pases productores en
diversas zonas del planeta: India, China, Brasil, EE. UU., etc. En Mxico el frijol ha
sustentado la alimentacin popular desde pocas precolombinas, en donde se le conoca
bajo distintos nombres: Etl (nhuatl), Tatsunitl (purpecha), X-kalil-bul (maya), Bi-zaahul
(zapoteco). Varios cronistas espaoles dieron cuenta de su importancia en la alimentacin
de los indgenas, como Fray Bernardino de Sahagn, al describir la alimentacin de los
otomes basada en el maz, frijol, chile, sal y tomates. Motolinia relata cmo, en los
tianguis, se venda el maz en granos y mazorcas al lado de semillas de frijol (Claridades
Agropecuarias, 1997).
Este cultivo es un producto vulnerable a factores climticos como las sequas,
heladas tempranas, lluvias en exceso, y ataque de plagas y enfermedades (Lpiz, 1980 a),
adems como es necesario mantener el frijol en almacenamiento desde la cosecha hasta su
comercializacin o consumo, en este periodo el grano sufre prdidas ocasionadas por varias
plagas insectiles y de acuerdo con el Centro Internacional de Agricultura Tropical, el
insecto Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera: Bruchidae), es una de las especies que
5

causan los daos ms importantes al frijol en almacn (Camargo, 2000).
En trminos generales los destinos de la produccin de frijol en nuestro pas se
caracteriza por los siguientes aspectos: El 20 % de la produccin total se destina a
autoconsumo, el 39 % a mayoristas en centrales de abasto, el 31 % a empacadoras e
industria, el 10 % a semilla y merma.
En el 2006 el cultivo del frijol en Mxico ocup una superficie aproximada de
1,497,144.1 ha, con una produccin reportada de 979,492.7 ton, y un rendimiento promedio
de 1.53 ton/ha, siendo los principales productores Zacatecas, Durango y San Lus Potos
(SAGARPA 2007).
En el Estado de Tlaxcala en el ciclo Primavera-Verano 2006 el cultivo del frijol
ocup una superficie de 7,919.3 ha, con un rendimiento promedio de 0.821 ton/ha siendo el
cuarto cultivo en importancia en cuanto a superficie sembrada despus del maz, cebada y
trigo.
En el Distrito de Huamantla, en el mismo ciclo, se sembraron 5,032 hectreas de
frijol, con un promedio de produccin de 0.810 ton/ha (SAGARPA. 2006).
2.1.2 Fenologa del cultivo
El conocimiento de la fenologa del cultivo es de gran importancia para definir sus
perodos susceptibles al ataque de las diferentes plagas.
La sucesin y duracin de las diferentes etapas, estn determinadas genticamente
en cada variedad, y se ven afectadas por las condiciones del medio, como son el clima,
temperatura, humedad, duracin e intensidad de la luz, entre otros (Lpiz, 1983).
En el frijol se diferencian claramente cinco etapas que ocurren durante su ciclo
6

vegetativo: emergencia, inicio de floracin, plena floracin, fin de floracin y madurez
fisiolgica, de acuerdo con el criterio establecido por el Programa de Frijol y la Unidad de
Recursos Genticos del INIA (ahora INIFAP). La emergencia ocurre cuando ms del 50
% de las semillas sembradas han germinado y las plntulas se pueden ver sobre la
superficie del suelo; el inicio de la floracin se determina cuando al menos 10 % de las
plantas presentan una o ms flores; la plena floracin se define cuando todas las plantas
presentan sus flores y ms del 50 % de las mismas muestran una floracin abundante; el fin
de la floracin se considera cuando solamente el 10 % de las plantas muestran flores bien
desarrolladas y la madurez fisiolgica se presenta cuando la planta ha completado su ciclo
de vida y se puede cortar, sin consecuencias negativas en la fisiologa y peso de la semilla,
esto es cuando la planta an tiene algunas hojas senescentes (envejecidas y amarillentas) y
la mayora de las vainas muestran las valvas apergaminadas y secas (Escoto, 1994).
Su ciclo, de la siembra a la cosecha tarda de 100 a 150 das. La emergencia ocurre a
partir del sptimo da de efectuada la siembra. La floracin en una planta con hbito de
crecimiento tipo mata inicia a partir del da 29 de realizada la siembra y con hbito de
crecimiento trepador, a partir del da 43. La formacin del fruto ocurre desde el da 44 en
las de tipo mata y desde el da 54 en las trepadoras, y la cosecha se presenta del da 85 en
adelante las primeras y del 90 en adelante en las ltimas (Escoto, 1994).
2.2 Acanthoscelides obtectus (Say.)
El holotipo de A. obtectus (Say) fue encontrado en Louisiana, E.U.A., por esta razn
fue llamado gorgojo americano. Sin embargo, en estudios posteriores se menciona que es
originario de Amrica Central y otras regiones clidas de Amrica del Sur, de donde se
dispers por medio del intercambio comercial con Louisiana. Actualmente este gorgojo se
7

encuentra mundialmente distribuido, principalmente en reas subtropicales y en altitudes
elevadas tanto en el campo como en los depsitos de grano (Figura 1). En frica, Asia,
Europa y Amrica se considera la principal plaga del frijol almacenado (Camargo, 2000).

Figura 1. Estadios de A. obtectus A) Adulto y B) pupa.
Esta especie fue descrita con el nombre de Bruchus obtectus; actualmente su
nombre cientfico es Acanthoscelides obtectus (Say).
Algunos otros nombres cientficos dados a esta plaga son: Bruchus obtectus Say, B.
irresectus, B. obsoletus (Say), B. tetricus Gyllenhal, B. fabae Riley, Bruchidius obsoletus,
B. obtectus Say, Larra irresectus, Mylabris obtectus Say, Laria obtectus Say,
Acanthoscelides irresectus Fhraeus, Acanthoscelides tetricus Gyllenhal. En ingles se le
conoce con los nombres comunes de: bean bruchid, bean weevil, dried bean weevil, bean
beetle, american seed beetle, common bean weevil, dried bean beetle. En espaol se le
denomina como: bruquido del frijol, gorgojo de los frijoles, gorgojo de las judias, gorgojo
del frijol, brucho de los porotos, gorgojo pintado, gorgojo pardo del frijol, gorgojo comn
del frjol, gorgojo americano. Los nombres en francs son: bruchide des haricots, bruche du
haricot, en alemn: kaefer, speisebohnen; en italiano: bruco del fagiolo, tonchio del fagiolo;
8

en japons: ingen-zomusi; en suizo stambonekever; y en portugus: caruncho do feijao,
gorgucho do feijao (Forestry Compenium. 2006).
Su clasificacin Taxonmica segn Borror et al., (1992) es la siguiente:
2.2.1 Taxonoma segn Borror et al., (1992)
Phylum: Artropoda
Subphylum: Atelocerata
Clase: Insecta
Subclase: Pterygota
Divisin: Endopterygota
Orden: Coleoptera
Suborden: Polyphaga
Superfamilia: Chrysomeloidea
Familia: Bruchidae
Subfamilia: Bruchinae
Gnero: Acanthoscelides
Especie: obtectus (Say)

2.2.2 Descripcin Morfolgica
Este insecto presenta las etapas biolgicas huevo, larva (I, II, III, IV), pupa y adulto.
9

El huevo es de 0.6 mm de longitud y de color blanco, liso, de forma elipsoidal, y
son puestos en grupos sueltos de una docena o ms, en agujeros que abre la hembra
masticando en las vainas verdes, a lo largo de la juntura, o en cualquier abertura natural que
ella encuentre en la vaina, la duracin del estado es de cinco das (Metcalf y Flint, 1984).
Las larvas son de color blanquizco, estn equipadas con patas cortas y delgadas; se
distribuyen por toda la vaina, buscan las semillas en desarrollo y comiendo se abren paso al
interior. Debido a su tamao muy pequeo, los agujeros de entrada cicatrizan y queda slo
un puntito de color caf claro, de tal manera que los productores y los comerciantes rara
vez detectan las infestaciones. Despus de alimentarse por unos cuantos das, la larva muda
y aparece como larva de color blanco, con cabeza muy pequea, sin patas y sin pelos. La
alimentacin y el crecimiento continan hasta que la larva mide 0.3 cm. de largo, casi la
mitad de esta medida de ancho, arrugada y jorobada. El estado larvario puede ocupar dos
semanas a seis meses o ms, de acuerdo con la temperatura y el contenido de humedad del
frijol (Metcalf y Flint, 1984).
El estado de pupa es pasado en la celda larvaria, la cual ha sido recubierta en su
interior para excluir el excremento larvario y evitar que contaminen la pupa, que es de tipo
exarata, de color blanco, la cual tiene una extensin cilndrica al exterior, pero no penetra la
cubierta delgada de la semilla (Metcalf y Flint, 1984).
El adulto mide de 3.2 a 4.4 mm de longitud, con protrax cnico, de forma ovalada
y aplanada de arriba. Los litros no cubren todo el abdomen, adems, stos son de color
verde olivo con una hilera transversal de manchas marrones y una estrecha zona rojiza
sobre el borde posterior, sus fmures posteriores estn provistos de una espina bfida
prominente en su base, colocados sobre el borde interno inferior. Los adultos que emergen
10

de las semillas pronto buscan a los frijoles en crecimiento y depositan sus huevecillos en
ellos. Si la temperatura permanece tibia, varias generaciones pueden desarrollarse en el
campo. Cuando los granos son cosechados, todos los estados se pueden llevar al almacn y
los adultos a medida que se transforman, continan poniendo huevecillos entre los frjoles.
La cra sigue as continuamente mientras haya alimento y la temperatura sea
suficientemente clida. De seis a siete generaciones se pueden completar en un ao y hasta
28 gorgojos se pueden desarrollar en un solo frijol (Metcalf y Flint, 1984).
Los adultos de A. obtectus presentan las caractersticas morfolgicas que pueden ser
usadas para diferenciar los sexos. El margen posterior del ltimo segmento abdominal en el
macho est curvado y dirigido hacia la parte anterior, mientras que en la hembra es recto,
(Figura 2); los rganos reproductivos del macho pueden proyectarse hacia fuera con una
ligera presin dorso-ventral, entre el ltimo par de patas, las vellosidades abdominales en el
macho son ms claras que en las hembras (Maes y Kingsolver, 1993).

Figura 2.- Caractersticas morfolgicas para diferenciar los sexos de A. obtectus.

11

2.2.3 Biologa y hbitos
Despus de eclosionar, la larva de primer instar penetra en la semilla y contina
desarrollndose en su interior, a medida que se alimenta forma una cmara o celda. Las
larvas presentan cuatro mudas. Durante el ltimo instar, la larva realiza un corte circular en
la testa, y forma una "ventana" caracterstica que permitir luego al adulto abandonar la
cmara pupal o de alimentacin. El adulto recin desarrollado puede permanecer en la
cmara durante varios das antes de abandonar el grano. Inmediatamente despus de salir
del grano realiza la cpula e inicia su oviposicin. La oviposicin promedio de la hembra es
de 60 huevos.
La infestacin de este insecto plaga a menudo se inicia en el campo donde los
huevos son puestos por las hembras en agujeros que abren en las vainas verdes a lo largo de
la sutura dorsal de la leguminosa o en cualquier abertura natural que ellas encuentran en la
vaina. En los almacenes las hembras depositan los huevos solos o en grupos entre los
granos de frijol (Metcalf y Flint, 1984).
2.2.4 Daos
A. obtectus es considerado un serio problema del frijol ya que ocasiona prdidas que
van del 10 al 35 % del grano almacenado. Este gorgojo causa dos tipos de daos en el
almacn: uno consiste en la destruccin del grano ocasionado por los estados larvarios del
insecto, adems de la contaminacin al grano por sus excrementos y cadveres; otro dao
es el deterioro del grano mismo por el metabolismo de la plaga que afecta notablemente
tanto la calidad nutricional y comercial de los granos, como la capacidad germinativa de la
semilla (Figura 3); si el embrin no es afectado, sta no disminuye, pero las plntulas
resultantes de estas semillas son dbiles debido a la disminucin de reservas disponibles en
12

los cotiledones (Camargo, 2000)

Figura 3. Dao de A. obtectus en granos de frijol.
2.3 Control con hongos entomopatgenos
La palabra control ha sido objetada en muchas ocasiones, debido a que se
considera tiene varios significados; sin embargo, al igual que otras palabras de empleo
comn se usan y se entienden; no obstante desde el punto de vista ecolgico, las palabras
control y regulacin no deben considerarse como sinnimos ni equivalentes debido a que
en el sentido estricto los efectos del control y de la regulacin son diferentes sobre las
poblaciones plaga (Arredondo, 1999).
El control biolgico es la regulacin de las poblaciones de individuos indeseados a
un nivel bajo, mediante la liberacin programada y sistemtica de sus enemigos naturales.
Los agentes de control biolgico se pueden dividir en dos grandes grupos: I) insectos
benficos como son parsitos de huevos, larvas, ninfas, pupas o adultos. II) Los
entomopatgenos que incluye a los hongos, bacterias, virus y nematodos (BIOTROPIC,
1998).
13

El control microbiano de insectos se puede definir como la utilizacin dirigida y
premeditada de entomopatgenos, con el objetivo de disminuir las poblaciones de plagas
insectiles y se refiere al desarrollo de tcnicas de control que involucren a algn
microorganismo que cause alguna enfermedad infecciosa a los insectos. Los
entomopatgenos forman parte de los factores biticos que regulan las poblaciones
insectiles en la naturaleza, junto con los depredadores y parasitoides. De ah que se
considera el control microbiano como un tipo de control biolgico (Prez, 1997).
Existe un grupo de microorganismos que incluye a los hongos entomopatgenos,
estos se encuentran en la divisin Eumycota que incluye a Zygomycetos, Ascomycetos,
Basidiomycetos y Deuteromycetos o mejor conocidos como hongos imperfectos dentro de
los que se ubican la mayora de los gneros considerados como promisorios en el control de
insectos plaga (Berlanga, 1999 c), los cuales han demostrado tener potencial para infectar y
matar a cualquier insecto en alguna de las fases de su ciclo biolgico, no producen efecto
inmediato, pero una vez establecidos en un ambiente dado, pueden sobrevivir, desarrollarse
y seguir infectando a los insectos (Camargo, 2000).
Los hongos entomopatgenos usualmente causan la muerte del husped por
deficiencia nutricional de ste, por invasin o digestin de tejidos, o por liberacin de
toxinas. Slo unas pocas especies son capaces de invadir a travs de heridas en el
integumento (Fusarium, Mucor, Penicillium); las especies entomopatgenas usualmente
penetran la cutcula del husped y algunas veces lo invaden va intestino, cavidad bucal o
anal, o a travs de los espirculos. Las infecciones son generalmente iniciadas por
zygosporas, esporas o conidios (Zygomycotina, Deuteromycotina), aunque en
Mastigomycotina y Ascomycotina las zoosporas y ascosporas son las responsables.
14

El hongo para poder infectar no slo es indispensable que entre en contacto con el
insecto, si no que adems debe ser capaz de reconocer a su hospedero antes de iniciar su
proceso de germinacin y sintetizar un complejo de exoenzimas, que le permitan degradar
la cutcula y penetrar al insecto (Lezama et al., 1999).
El desarrollo de la micosis puede ser separado en tres fases (a): adhesin y
germinacin de la espora sobre la cutcula del insecto; (b) penetracin en el homocele; y (c)
desarrollo del hongo, lo que provoca la muerte del insecto (Berlanga, 1999 c).
La adhesin de la espora sobre la cutcula del insecto puede ser por mecanismos
pasivos relacionados con el material mucilaginoso y estructuras superficiales. Las conidias
de Entomophtorales Entomophtora muscae al igual que ciertos Deuteromycetes
(Verticillium lecanii e Hirsutella thompsonii) estn recubiertos por un material
mucilaginoso que hace que se adhieran al sustrato o cutcula; en cambio, las conidias secas
de los Deuteromycetes poseen fascculos o surcos bien organizados, en estos casos, la
unin no especifica es debida a la hidrofobocidad de los surcos y la cutcula del insecto.
Estos fascculos tambin le sirven de proteccin para la deshidratacin y como medio de
dispersin en las corrientes de aire. La germinacin de la conidia depende en gran medida
de las condiciones ambientales, principalmente temperatura y humedad.
La constitucin qumica de la cutcula de los insectos y los depsitos cuticulares de
la misma son esenciales para que el hongo reconozca si esa especie de insecto es
susceptible de ser infectada. En ocasiones un hongo lleva a cabo su proceso de germinacin
sobre la cutcula del insecto y sin embargo, no penetrarlo, ya sea por causa de la
composicin qumica (fenoles, quinonas y depsitos de cera) o bien, por que son hongos
que no tienen elevado equipamiento enzimtico, como para degradar los componentes
15

cuticulares y penetrar luego al insecto (Lezama et al., 1999).
Una vez que la espora germina, el tubo germinativo puede penetrar la cutcula
directamente o producir un apresorio del cual se desarrolla una clavija de infeccin en la
cutcula del insecto (Figura 4). La penetracin de la hifa a travs del integumento involucra
factores mecnicos y enzimticos. El integumento del insecto est esencialmente formado
por protenas y quitinas asociadas con lpidos y compuestos fenlicos; la capa ms externa,
o epicutcula, contiene lpidos (cidos grasos y parafinas) que tienen actividades
antifngicas, pero se ha demostrado, que algunos hongos entomopatgenos poseen enzimas
lipolticas que los degradan (Berlanga, 1999 b).

Figura 4. Modo de accin general de un hongo entomopatgeno sobre un insecto.
La penetracin del hongo a travs del intestino ha sido observado en la hormiga de
fuego Solenopsis richteri, termitas Reticulitermes sp. y diversas especies de mosquitos. M.
16

anisopliae ocasionalmente infecta larvas de elatridos a travs de espirculos y poros de
rganos sensitivos. B. bassiana infecta diversas especies de mosquitos por el sifn; en
Heliothis zea por espirculos, y en el picudo de la alfalfa Hypera postica, va trqueas y no
por la cutcula endurecida (Berlanga, 1999 b).
Despus de cruzar la barrera que representa el integumento, el hongo se desarrolla
en el homocele o cavidad hemocelica del insecto en forma de levadura, llamados cuerpos
hifales o blastosporas (Figura 4). El homocele ofrece al hongo una fuente de nutrimentos
suficientes para el desarrollo y proliferacin de la infeccin, con su consecuente efecto
sobre el estado de salud del insecto. (Lezama, 1997). Cuando el husped muere, el hongo
crece y se dispersa virtualmente en todos los tejidos del insecto, inicindose una
competencia entre el hongo, la flora bacterial y hongos saprofitos que se desarrollan
rpidamente sobre el cadver. En la mayora de los casos el insecto se momifica,
resistiendo la descomposicin bacterial, debido aparentemente a antibiticos producidos
por el hongo (Berlanga, 1999 b).
La infeccin puede ser bloqueada por la presencia de reacciones defensivas
celulares, y los plasmatocitos, normalmente dispersos en la hemolinfa se acumulan
alrededor del micelio formando un pseudotejido o granuloma; en este caso el insecto
contina su desarrollo normal y pocos das despus el granuloma puede ser visible
externamente (Berlanga, 1999 b), por lo general esto pasa cuando el hongo no es muy
virulento (Lezama, 1997). En el caso de patgenos como B. bassiana producen toxinas, las
cuales erosionan el granuloma y permiten a las blastosporas invadir el homocele; la
fagocitosis tambin ha sido observada como reaccin defensiva del husped; los cuerpos
hifales proliferan solamente despus de la muerte del insecto (Berlanga, 1999 b). El papel
17

de las toxinas producidas por los entomopatgenos son tambin de particular importancia
en el proceso de infeccin, ya que adems de matar a las clulas hemolticas, tambin
afectan msculo, intestino, tubos de Malpighi, membranas nucleares, ribosomas,
mitocondrias, retculo endoplsmico y vacuolas entre otros organelos (Lezama et al., 1999).
Las esporas reproductivas son producidas en esclerotium o esporoforo
(esporangiforo y conidioforo). Los esporoforos e hifas estriles emergen del cadver bajo
condiciones favorables especialmente humedad y temperatura, para formar el crecimiento
micelial caracterstico sobre el integumento del insecto. Bajo condiciones desfavorables el
hongo produce propgulos de resistencia (Clamidosporas, Azygosporas, Zygosporas y
Oosporas). El proceso de dispersin de las esporas puede ser pasivo o activo, dependiendo
de las caractersticas de la espora y esporoforo. Ciertos hongos producen esporas
encerradas en una viscosidad mucilaginosa, tales conidias pueden adherirse a insectos u
otros invertebrados que las dispersan. Las esporas de algunos entomopatgenos son
fuertemente disparadas de los esporoforos y acarreadas por el viento. Los esporoforos son
generalmente positivos al fototropismo y negativos al geotropismo lo cual hace que las
esporas sean producidas al aire libre, especialmente en el caso de ascosporas de Cordyceps
el cual tiene un estroma en forma de columna que emerge de un insecto muerto en el suelo,
las ascosporas son descargadas del peritecio en la punta del estroma (Berlanga, 1999 b).
2.4 Factores que intervienen en el desarrollo de los micopatgenos
En la regulacin de los procesos de infeccin de los hongos, se incluyen tanto
factores biticos como abiticos. En el primer caso se incluye: (1) al patgeno (tipo de
inculo, la dosis, la virulencia del patgeno, su persistencia y su capacidad de dispersin),
(2) al insecto plaga (la infeccin depende de la especie de la plaga, la edad del insecto, el
18

periodo de intermudas, el hbito migratorio y niveles poblacionales). Dentro de los factores
abiticos sobresalen la temperatura, humedad, radiacin solar (principalmente la luz
ultravioleta), gases (O
2
y CO
2
), viento y la lluvia. Para el desarrollo de epizootias se incluye
la densidad y dispersin espacial del hospedante-patgeno (Camargo, 2000). Los factores
del tipo abitico determinan el xito o el fracaso de un agente de control biolgico en el
campo (Pacheco 1997).
2.4.1 Temperatura
La temperatura ptima para el crecimiento del hongo no es la misma que para el
desarrollo de la enfermedad; por lo tanto la temperatura es determinante para el crecimiento
micelial y el avance de la infeccin (Prez, 1997). La fluctuacin de la temperatura va a ser
determinante para el desarrollo de los entomopatgenos, es decir, el mximo desarrollo,
germinacin y esporulacin de B. bassiana y M. anisopliae ocurre entre los 20 y 30 C,
siendo el ptimo a los 28 C. Sin embargo entre los 15 y 35 C se observa un buen
porcentaje de germinacin, pero arriba de los 35 C se retarda ese proceso, mientras que a
49 y 50 C se inicia la mortalidad de esporas de M. anisopliae y B. bassiana
respectivamente (Pacheco, 2002).
2.4.2 Humedad relativa
El uso de hongos entomopatgenos en el control de plagas agrcolas ha sido
limitado por el estrecho rango de humedad relativa en la cual ocurre la germinacin del
hongo y la infeccin del hospedante, tanto en ambiente protegido como en condiciones de
campo. La humedad ambiental afecta en gran medida a la mayora de los procesos tanto
internos (desarrollo e invasin) como externos (germinacin y esporulacin) de los hongos
que se dan en su hospedante; en el caso de la germinacin se requieren altos porcentajes de
19

humedad que van del 90 % al 100 %; cuando el nivel de humedad se encuentra por debajo
del 90 % decrece la germinacin de los conidios (Camargo, 2000); bajo condiciones
experimentales los hongos son capaces de infectar a un insecto hospedero an en bajas
condiciones de humedad (45 a 70 %).
Walstad et al, (1970) observaron que el porcentaje de germinacin, crecimiento y
esporulacin de esporas (24 horas despus de la inoculacin) de los hongos B. bassiana y
M. anisopliae requiere de humedad relativa arriba de 92.5 %; la geminacin ptima,
crecimiento y esporulacin ocurri al 100 %, mientras que al 85 % no encontraron
germinacin de esporas de los hongos (Citado por Prez, 1997).
2.5 Propiedades de los hongos entomopatgenos
Entre las propiedades ms importantes de la poblacin del patgeno se encuentra la
virulencia, la patogenicidad, dispersin, supervivencia en el ambiente de la poblacin
hospedante, densidad y distribucin espacial del inculo; propiedades que favorecen la
presencia de epizootias. La virulencia se refiere a la intensidad de la enfermedad causada
por un patgeno, mientras que la patogenicidad se refiere a la habilidad de un organismo
para causar enfermedad. La mayora de los hongos patgenos son considerados muy
virulentos comparados con otros organismos patgenos debido a que ellos tienen un
periodo corto de incubacin, producen abundante inculo secundario, y pueden causar un
rpido incremento en la incidencia de la enfermedad (Camargo, 2000). El potencial de los
hongos se ha documentado en ms de 1500 especies de organismos entomopatgenos, de
los cuales el 10 % son reproducidos masivamente y solo el 1 % se comercializa (Cuadro 1)
(Pacheco, 2002).

20

Cuadro 1. Clasificacin parcial de hongos con principales gneros de entomopatgenos.
SUBDIVISIN CLASE ORDEN GNERO
Mastigomicotina Chytridiomycetes Chytridiales Myiophagus.
Blastocladiales Coelonomices
Oomycetes Lagenidiales Lagenidium
Saprolegniales Leptolegnia.
Zygomicotina Zygomicetes Mucorales Spodoriniella
Entomophthorales Conidiobolus
Entomophaga
Entomophthora
Ascomycotina Hemiascomycetes Endomycetales Blastodendrion
Sacharomyces
Plectomycetes Ascosphaereales Aschosphaera
Pyrenomycetes Clavicipitales Cordyceps
Sphaeriales Torrubiella
Nectria
Laboulbeniomycetes Laboulbeniales Filariomyces
Hesperomyces
Loculoascomycetes Myrangiales Myrangium
Pleosporales Podonectria
Basidiomycotina Phragmobasidiomycetes Septobasidiales Uredinella
Septobasidium
Deuteromycotina Hyphomycetes Moniliales Aspergillus
Beauveria*
Fusarium
Hirsutella*
Metarhizium*
Nomuraea
Paecilomyces*
Verticillium*
Coelomycetes Sphaeropsidales Aschersonia*
Adaptada por McCoy et al. 1988.
* Gneros factibles a reproduccin masiva (citado por Berlanga, 1999).
21

B bassiana y M anisopliae tienen una distribucin mundial y atacan a diversas
especies de artrpodos, ya sean estados inmaduros o adultos como por ejemplo fidos,
mosquitas blancas, chapulines, termitas, catarinita de la papa, escarabajo japons, gorgojo
mexicano del frijol, chinche ligus, hormigas de fuego barrenador europeo del maz,
palomilla del abeto y plagas de granos almacenados, entre otros (Camargo, 2000).
Algunos investigadores han realizado estudios con B bassiana y M anisopliae sobre
el gorgojo pardo, tal es el caso de Ferron y Robert (1975) quienes expusieron al gorgojo
pardo del frijol a una dosis de 1x10
9
esporas/mL de B bassiana; ellos encontraron que
despus de 20 das, la mortalidad del gorgojo pardo fue del 92 %. Al respecto, Rodrguez y
Pratissoli (1990) mencionan que B bassiana y M anisoplie tienen efecto mortal sobre A.
obtectus a una dosis de 1x10
8
conidios g
-1
, con dicha concentracin de esporas queda
protegido el grano de frijol durante seis meses, por otro lado Castaeda (1993) menciona
que la cepa de B bassiana DA1 a una concentracin de 1.8x10
7
es patognica a los
bruchidos sobre todo al gorgojo pardo.
2.6 Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.
2.6.1 Antecedentes
Fue en 1835 cuando el italiano Agostino Bassi descubri al hongo
actualmente conocido como B. bassiana atacando al gusano de seda. Bassi fue uno de los
pioneros en recomendar patgenos para el control de plagas (Pacheco, 2002).
Este hongo es uno de los entomopatgenos ms evaluados por su potencial para el
control biolgico de insectos; adems de tener una amplia distribucin geogrfica, resulta
patognico a diversos rdenes de insectos (Pacheco, 2002).
22

Samsinakova (1964) obtuvo blastosporas de B. bassiana en cultivo sumergido, pero
una limitante de estos rganos propagativos han sido expuestos por Ferron (1978) al referir
que las blastosporas se producen por gemacin micelial y que no poseen las capas
protectoras de las esporas (citado por Cordova, 1993).
Ferron y Robert (1975) estudiaron la virulencia de varios hongos entomopatgenos
imperfectos contra los adultos de Acanthoscelides obtectus y obtuvieron buenos resultados
con B. bassiana y B. tenella y menos promisorios los obtienen con Metarhizium anisopliae
y Paecilomyces fumosoroseus. A una concentracin de 3.3x10
7
a 1x10
7
esporas/mL. La
micosis obtenida fue del 92 % a la ms alta concentracin.
Ferron (1977) estudi la infeccin de A obtectus con B. bassiana por contaminacin
del integumento la cual fue independiente de la humedad, pero el micelio no se desarroll
sobre los cadveres si la humedad no era cercana al punto de saturacin (= 92 %), esto
demostr que la infeccin de los insectos es independiente de las condiciones de humedad.
Sin embargo, Searle y Doberski (1984) concluyeron que la infeccin de Orizaephilus
surinamensis con B. bassiana fue dependiente de la humedad relativa.
2.6.2 Descripcin morfolgica
El gnero Beauveria es un entomopatgeno imperfecto con hifas septadas,
que contienen las estructuras reproductivas denominadas conidiforos o clulas
conidiogenas sobre las cuales se desarrollan las conidias (simpodulosporas) hialinas,
redondeadas a ovoides, unicelulares. Beauveria ramifica su micelio para formar los
conidiforos que son simples e irregulares con un raquis alargado que terminan en vrtices
en forma de racimos, la clula conidigena con base globosa o abultada presenta un
adelgazamiento en el rea donde se insertan los conidios los cuales son globosos o
23

subglobosos de 2 a 3 m. estos se insertan sobre esterigmas curveados en forma irregular o
dispuestos en zig-zag. Se caracteriza por presentar una apariencia polvosa de color blanco
algodonoso o amarillo cremoso (Barnett y Barry, 1990). El hongo en cultivo puro, a 21 das
de sembrado, alcanza su desarrollo completo y presenta un micelio de aspecto algodonoso
de color blanco y tiene una esporulacin abundante de color crema con textura de talco
(Berlanga, 1999 b) (Figura 5).
Barnet y Hunter (1972) mencionaron que en medio de cultivo, B. bassiana forma
colonias de 0.6 a 2.3 cm de dimetro a los ocho das de sembrado y a 20 C; las colonias
son lanosas y frecuentemente con apariencia polvosa, por la abundancia de conidios, al
principio sus colonias son blancas, pero conforme pasa el tiempo, generalmente toman un
color amarillento.
En un medio de cultivo superficial, el hongo produce conidios de forma redonda, de
3-4 m de dimetro; en cambio en un cultivo de inmersin, forma blastosporas, de forma
elipsoidal. Sin embargo, los conidios obtenidos por medio de cultivos en superficie, estn
dotados de mejores condiciones para sobrevivir en ambientes ms hostiles y por mayor
tiempo, en ausencia de alimento, que las blastosporas (Pacheco, 2002).
El ciclo biolgico de B bassiana comprende dos fases: una patognica y otra
saproftica. La fase de patognesis ocurre cuando el hongo entra en contacto con el tejido
vivo del husped, y la saprofitica cuando el hongo completa su ciclo aprovechando los
nutrientes del cadver del insecto.

24

Figura 5. Beauveria bassiana. A.- Colonia en medio slido, B.- Simpodulosporas.

25

2.6.3 Determinacin taxonmica
Reino: Fungi
Divisin: Eumycota
Subdivisin: Deuteromycotina
Clase: Deuteromicetes
Orden: Moniliales
Familia: Moniliaceae
Serie: Sympodulosporae
Gnero: Beauveria
Especie: bassiana (Bals.) Vuill.
2.6.4 Modo de accin
B. bassiana es parsito facultativo, el cual posee conidias que constituyen la unidad
infectiva del hongo. El proceso infectivo que lleva al insecto atacado por el hongo a morir
se cumple en 5 fases:
En la fase de adhesin o fijacin los conidios de los hongos entomopatgenos estn
adaptados para fijarse a los insectos, as, la patognesis inicia por la adhesin de un conidio
al insecto, cuando el conidio se hincha durante la pregeminacin, ste empieza a secretar
una sustancia adhesiva mucilaginosa (Pacheco 2002).
Una vez adheridas las unidades infectivas al insecto, se inicia la germinacin. Este
proceso es favorecido por factores como temperatura y requiere una humedad relativa alta
(> 90 %); sin embargo, el microambiente del follaje, particularmente cuando hay roco,
26

permite las condiciones propias, no obstante que el macroclima sea seco. Durante la
geminacin, el tubo germinal produce enzimas que destruyen la pared celular y permiten
que el hongo penetre, requiriendo temperaturas entre 15 y 35 C.
En muchos insectos, la epicutcula tiene varias capas, de las cuales, la externa es la
ms frgil al dao mecnico, aunque sta puede ser penetrada y degradada por las enzimas
del hongo. La epicutcula interna, est constituida por polmeros de lipoprotenas
estabilizadas por quinonas, que la hacen un poco ms resistente a la penetracin del hongo.
Una vez que la epicutcula es alterada, el progreso de la micosis puede ocurrir por la
penetracin de hifas a travs de la cutcula o por la penetracin de estructuras que pueden
extenderse formando placas de penetracin (Pacheco, 2002).
El hongo usualmente crece en el hemocele y se transporta a travs del sistema
circulatorio y el linftico del insecto como cuerpos hifales, esencialmente blastosporas, las
cuales se multiplican por fisin binaria (Pacheco, 2002). Al llevarse a cabo la invasin, el
tubo germinal llega a la cavidad hemoclica, donde produce una gran variedad de
metabolitos secundarios como son Beauvericin, Beauveriloides, Bassianolide, Isarolide,
Enniatinas, los cuales debilitan al sistema inmune del husped, y secreta tambin el
Oosporeina que es un metablito con actividad bactericida y el Cordicepin con actividad
antibacterial (Berlanga, 1999 a), que le ayuda a mantener un ambiente estril y permite que
el hongo invada toda la cavidad del cuerpo; en ese momento, el patgeno consume los
nutrimentos disponibles en el hemocele y digiere los rganos, tejidos del hospedante
(BIOTROPIC, 1998).
La muerte del hospedero generalmente ocurre a los cinco o seis das despus de la
penetracin del tubo germinal. Los cambios fisiolgicos, citolgicos y bioqumicos
27

ocurridos en el insecto resultan de la interaccin entre la actividad metablica del hongo y
el mecanismo de defensa del hospedero (Pacheco, 2002).
La muerte puede ser precedida por cambios en el comportamiento tales como
temblor, prdida de coordinacin o tratar de subir a una posicin ms alta de la planta. Una
vez muerto el insecto y cuando las condiciones ambientales son favorables, ocurre la
esporulacin, manifestndose por los brotes de cuerpos fructferos llamados conidiforos
en el integumento del hospedero y con esto el inicio de un nuevo ciclo.
Bajo condiciones de humedad relativa alta el micelio del hongo se observa primero
en las articulaciones y partes blandas de los insectos por donde sale ms rpidamente y
despus de algunos das le cubre el cuerpo con material fungoso caracterstico.
En condiciones de viento y de baja humedad, los conidios se dispersan ubicndose
sobre el suelo, plantas y la cutcula de nuevos hospederos.
2.7 Metarhizium anisopliae(Metsch.) Sor.
2.7.1 Antecedentes
El primer intento de control microbiano con M. anisopliae fue realizado por
Metschnikoff en 1879 para el control de larvas del curculionido Cleonus punctiventris
Germ en remolacha azucarera. En 1884 Krassilstschik continuo con estos estudios
obteniendo un control de 50 a 80 % del insecto despus de 10 a 15 das de la aplicacin
(Citado en SAGAR, 1998d).
Las infecciones con M anisopliae, llamada muscardina verde, son similares en
muchos aspectos a las causadas por B. bassiana. La muscardina verde fungosa fue
descubierta por Metschnikoff en 1879, en larvas infectadas del escarabajo gallo del trigo,
28

Anisoplia austriaca. Este cientfico ruso estudio la enfermedad y vislumbr su uso prctico
en el control de insectos. Tambin encontr una evidencia de la importancia de las
epizootias naturales en la reduccin de las poblaciones de los insectos. Desde su
descubrimiento en Rusia, se han encontrado un gran nmero de insectos infectados con M.
anisopliae, hasta 75 especies en Norteamrica (Pacheco, 2002).
La utilizacin de M. anisopliae para el control de la mosca pinta Mahanarva
posticata (Stal) se inicia en 1910 cuando Rober en Trinidad y Tobago propuso la
produccin masiva del hongo. Los primeros estudios in vitro realizados por Guagliumi en
1970 registraron mortalidades de 80 % en ninfas y adultos de mosca pinta despus de 15
das de la aplicacin (citado por SAGAR, 1998d).
El primer reporte de este hongo en Mxico se debe a Urich quien lo encontr en la
regin de Santa Lucrecia, Veracruz, controlando poblaciones de mosca pinta de los pastos
Aeneolamia postica (Pacheco, 2002).
2.7.2 Descripcin morfolgica
Metarhizium anisopliae es un parsito autnomo que puede crecer como parsito de
insectos o como saprfito (Finkelman, 1984). Este hongo tiene el conidiforo o filide
hialino, ramificado, el conidio inicial o fialospora es producido por el conidiforo en una
abstriccin simple en la parte distal. En cada conidiforo se forma una cadena de
fialosporas basiptala, las cuales crecen densas y adheridas unas con otras formando masas
prismticas de columnas, la conidia ms joven es la de la base (Berlanga, 1999 b).
Las fialosporas miden de 6 a 8 m, son de color verde olivo, por lo que la
enfermedad en los insectos se denomina muscardina verde. Este hongo es considerado
29

cosmopolita, pues se reporta en distintos lugares del mundo, esto ltimo es debido a su alta
capacidad de adaptacin a diferentes condiciones ambientales (SAGAR, 1998 b).
Bajo condiciones ambientales adversas, las hifas pueden producir estructuras de
resistencia que se caracterizan por presentar pared celular gruesa, llamadas clamidosporas
las cuales los mantienen viables por tiempo prolongado.
Los estados de resistencia se encuentran en el suelo cuando los estados susceptibles
del husped no estn presentes, las esporas de Metarhizium anisopliae pueden sobrevivir
viables al menos dos aos en algunos tipos de suelos (Berlanga, 1999 a).
El hongo puede crecer en medios artificiales muy simples aun sin nitrgeno
orgnico (Finkelman, 1984), sin embargo el crecimiento y la fructificacin son mejores en
peptona agar aunque los cultivos con nitrato de amonio dan un buen crecimiento del hongo.
Ordinariamente es fcil iniciar un cultivo usando esporas del hongo, su crecimiento inicial
es con fialosporas de color blanco en su fase juvenil, conforme van madurando cambian de
color a un verde olivo (Pacheco, 2002) (Figura 6).

30

Figura 6. Estructuras y cultivo. A.- Micelio. B.- Conidioforo hialino y fialosporas. C.-
Metarhizium en medio slido.

31

2.7.3 Determinacin taxonmica
La determinacin taxonmica de este entomopatgeno es la siguiente:
Reino: Fungi
Divisin: Eumycota
Subdivisin: Deuteromycotina
Clase: Deuteromicetes
Orden: Moniliales
Familia: Moniliaceae
Serie: Phialosporae
Gnero: Metarhizium
Especie: anisopliae (Metsch.) Sor.
Metschnikoff propuso primeramente para este hongo el nombre de Entomophtora
anisopliae, ms tarde, por sugerencia del botnico Cienkowsky, le denomin Isaria
destructor. Delacroxi se refiri al hongo con el nombre de Oospora destructor. Como es un
hongo imperfecto, el nombre especifico original permanece vlido como Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sor., ya que fue identificado y descrito as por Sorokin en 1879
(Pacheco, 2002).
El ciclo biolgico de M anisopliae es tpico de los hongos imperfectos con
reproduccin asexual resultante en esporas sostenidas sobre filamentos (conidios)
(Finkelman, 1984). Su ciclo comprende dos fases: una patognica y otra saprofitica. La fase
de patognesis ocurre cuando el hongo entra en contacto con el tejido vivo del husped, y la
32

saprofitica cuando el hongo completa su ciclo aprovechando los nutrientes del cadver del
insecto.
Es importante mencionar que la velocidad de crecimiento del hongo tiene un efecto
significativo sobre su potencial epizotico a nivel de campo, ya que con un crecimiento
rpido se asegura una invasin satisfactoria sobre el insecto hospedero (Real y Edgar,
2005).
2.7.4 Modo de accin
M anisopliae es parsito facultativo, el cual posee conidias que constituyen la
unidad infectiva del hongo. El proceso infectivo que lleva al insecto atacado por el hongo a
morir se cumple en cuatro fases.
En insectos terrestres el desarrollo comienza por la penetracin de la cutcula, o bien
directamente por tubos germinativos. El desarrollo tiene lugar en el homocele, usualmente
como cuerpos hifales tipo levadura (Finkelman, 1984).
Metarhizium tiene una gran habilidad para infectar insectos mediante la penetracin
de la cutcula del hospedero, a travs de procesos mecnicos y enzimticos la cul dura de
tres a cuatro das. La importancia de estos mecanismos vara con el aislamiento del hongo y
los hospederos. Las membranas intersegmentales tienen una cubierta ms delgada que
cualquier otra parte de los segmentos, por lo que es un lugar de penetracin fcil para este
hongo (Pacheco, 2002). El hongo penetra el hemocele, donde crece una fase de cuerpos
hifales, los cuales se dispersan en el insecto. Las hifas que germinan pueden atravesar los
integumentos ms gruesos que se encuentran en la parte dorsal de los segmentos. La
habilidad de las esporas de germinar es destruida a temperaturas entre los 55 y 60 C
33

durante cinco minutos. (Pacheco, 2002).
Las hifas parecen tener preferencia por el tejido adiposo, pero tambin invaden el
sistema nervioso y tejido muscular, provocando la muerte del hospedero por el crecimiento
hifal (Pacheco, 2002) que dura de dos a tres das. Durante el proceso de invasin del hongo
se producen una gran variedad de metabolitos txicos. El M anisopliae produce gran
variedad de metabolitos secundarios. Los compuestos txicos ms estudiados han sido las
destruxinas. Estos ciclodepsipptidos son producidos durante el crecimiento micelial y
hasta el momento se han identificado ms de 14, de los cuales los ms importantes son
destruxina A, B, C, D, E y desmetildestruxina B. Los sntomas varan segn el insecto y la
manera en que el hongo infecta, se manifiesta en la prdida de sensibilidad, prdida gradual
de sus funciones y parlisis, perturba el sistema nervioso.
Finalmente sigue la fase de la esporulacin y el inicio de un nuevo ciclo. El micelio
del hongo se observa primero en las articulaciones y partes blandas de los insectos y en das
posteriores se incrementa a todo el cuerpo hasta finalmente cubrirlo. Tras la muerte del
insecto y bajo unas condiciones de humedad relativa alta las conidiosporas pueden
extenderse a travs del cuerpo cubrindolo con material fungoso caracterstico
(BIOTROPIC, 1998).
2.8 Cordyceps spp
En los Ascomycetes, las especies de Cordyceps pertenecen al orden Clavicipitales,
familia Clavicipitaceae; que es la econmicamente ms importante en el control biolgico
de artrpodos.
La familia Clavicipitaceae presenta un estado sexual (teleomrfico) que se
34

caracteriza por tener un ascoma ms o menos piriforme y de pared delgada, coloreado y
arreglado en un estroma, algunas veces bien desarrollado, y un estado asexual (anamrfico)
el cual se desarrolla fcilmente formando un esclerocio dentro o sobre el hospedero dando
lugar luego a un estroma (Umaa y Silvia. 2006).
Tambin infectan penetrando directamente la cutcula despus de la germinacin,
una vez adherida la conidia produce uno o ms tubos germinativos, los cuerpos hifales
proliferan en el homocele formando cadenas cortas; eventualmente las hifas llenan la
cavidad del cuerpo del insecto, compactndolo para desarrollarse en un pseudoesclerocio.
El estroma areo es distintivo, consiste de un centro de hifas paralelas cubierto por hifas
entrelazadas que nacen del pseudoesclerocio; tanto conidias como ascosporas pueden
desarrollarse en diferentes reas del mismo estroma (SAGAR, 1998 c).
El gnero Cordyceps es el teleomrfo o estado sexual de los gneros Beauveria y
Metarhizium los cuales representan el estado asexual o anamrfico (Wolfgang, 1995).
Su cuerpo fructfero es un estroma que sale de una masa densa de micelio, son
cilndricos, clavados, capitados, simples o algunas veces ramificados, blancuzcos, amarillos
anaranjados, rojo, caf, ocrceo, verde, gris o negro, algunas veces bicoloreados,
estpitados. Peritecios subglobosos a cnicos, superficiales o ligeramente embebidos en el
estroma. Ascas cilndricas a estrechamente clavadas. Ascosporas filiformes a puntiagudas
en los extremos, hialinos, multiseptadas (Umaa y Silvia. 2006).
2.9 Reactivacin de un entomopatgeno
Mediante la reactivacin el hongo se capacita para reconocer, identificar e infectar a
un nuevo hospedero especfico y a su vez heredar sta capacidad a las siguientes
35

generaciones. Esto ocurre durante el proceso de infeccin producido al hospedero en
cuestin, en el cual el hongo se ve en la necesidad de acudir a su banco de genes apagados
que selecciona prendiendo la combinacin de genes que promuevan la produccin de
toxinas y antibiticos necesarios y especficos para penetrar la cutcula externa del insecto y
una vez adentro combatir exitosamente la respuesta inmunolgica del mismo, y as poder
completar su ciclo de vida. La facultad de reactivarse especficamente contra diferentes
hospederos radica precisamente en esta seleccin de genes prendidos que es diferente e
inefectiva de un grupo de insectos a otro. A su vez; esta misma facultad es de amplio
espectro, ya que las posibles combinaciones son mltiples y variadas pero altamente
especificas. Una vez reactivado el entomopatgeno contra un hospedero incrementa su
virulencia hacia este
2
(comunicacin personal).
Real y Edgar (2005) indican que la patogenicidad y virulencia del hongo es afectado
por diversos factores como son la temperatura, la humedad, el estado nutricional de los
insectos; y otros factores durante el proceso de produccin masiva, como el cultivo
sucesivo del hongo sobre sustratos sintticos que podran ocasionar una reduccin del grado
de virulencia hacia el insecto. Por ello, unas de las alternativas para conservar la virulencia
es reactivar las cepas. Algunos procedimientos para reactivar hongos entomopatgenos son:
a) inoculacin del hongo en un insecto husped vivo y su posterior reaislamiento una vez
muerto y b) suplemento del medio de cultivo con el insecto husped molido, esto mantiene
la virulencia de una cepa mediante su conservacin y multiplicacin en agar-insecto
solamente, sin necesidad de recurrir a los frecuentes pases por insectos vivos.

2
Barba lvarez, H. A. Bilogo Responsable del CREROB del Estado de Tlaxcala.
36

2.10 Produccin masiva de hongos entomopatgenos
El potencial de los hongos entomopatgenos producido masivamente para el control
de plagas se inici con los estudios de Metschnikoff en 1879 y Krassilstschick en 1888,
para el control del escarabajo Anisoplia austriaca Host. y el picudo Cleonus punctiventris
Germ. respectivamente (Berlanga, 1999 a).
Al emplear hongos entomopatgenos como insecticidas microbiales es necesario
producir masivamente el patgeno, formularlo y tenerlo disponible para su liberacin
oportuna en el campo para disminuir la poblacin del insecto plaga.
Se reconocen tres requerimientos especficos para la produccin comercial y uso
exitoso de hongos como agentes de control de insectos. Primero, el aislado del hongo
seleccionado para la produccin masiva debe tener crecimiento rpido, abundante
esporulacin y patogenicidad suficientemente alta sobre la plaga blanco. Segundo, los
costos de produccin deben ser mnimos, esto se puede lograr desarrollando un medio que
sea simple, barato, disponible en cantidades suficientes y un procedimiento de produccin
fcil y con un mnimo de labor. Tercero, el producto debe ser convenientemente formulado
para su almacenamiento por largo tiempo bajo condiciones naturales o cercanas a estas sin
prdida significativa de viabilidad e inefectividad (Hernndez y Carrillo, 1999).
La calidad de un biopreparado semi-industrial donde intervenga un
microorganismo, debe de cuidar desde el control de la cepa de trabajo hasta el producto
terminando, incluyendo el control de materia prima y el proceso de produccin o
fermentacin (Hernndez y Carrillo, 1999).
La fermentacin es la transformacin o degradacin de materia orgnica por los
37

microorganismos en productos tales como alcoholes, cidos, antibiticos y/o biomasa.
Dependiendo del contenido de humedad de la fermentacin se pueden establecer dos tipos
de fermentaciones: Fermentaciones sumergidas o en estado lquidas (FEL) y Fermentacin
en estado slido (FES) (Hernndez y Carrillo, 1999). La mayor diferencia entre estos dos
tipos de fermentaciones reside en la humedad; esto es importante, ya que en la FES el
microorganismo se encuentra en contacto con el aire, a diferencia de la FEL en donde el
contacto es con medio lquido (cultivo). En la FES la humedad depende de la capacidad de
retencin del material, el cual debe tener entre un 30 a 80 % (Crdova, 1996).
Los hongos entomopatgenos pueden ser producidos adems, empleando un sistema
mixto denominado difsico, el cual consiste en una fase inicial de obtencin de masa
micelial elevada, la cual es transferida a un sustrato inerte o nutritivo para la produccin de
conidias areas, donde se combina un mtodo de fermentador que es seguido de una
aireacin en charolas para su esporulacin.
El proceso de Fermentacin slida (FMS) puede ser definido como un mtodo de
cultivo de microorganismos sobre o dentro de partculas de una matriz slida. El contenido
de lquido de las partculas debe estar en el nivel correspondiente a la actividad de agua
necesaria para el metabolismo y adecuado crecimiento del microorganismo, pero no
exceder la mxima capacidad de retencin de agua de la matriz slida (Hernndez y
Carrillo, 1999).
El amplio rango de sustratos slidos utilizados en la FMS pueden ser clasificados en
dos grandes categoras: 1) Partculas que son al mismo tiempo soporte y sustrato, ste es el
caso de todos los materiales orgnicos. 2) La parte slida slo es soporte (minerales o
materiales sintticos) y deben ser humedecidos con diferentes soluciones nutritivas para el
38

desarrollo del microorganismo.
La FMS ha sido utilizada por el hombre por mucho tiempo, ya sea para la
preparacin de alimentos fermentados, composteo de forrajes, conservacin de alimentos
para ensilaje, cultivo de hongos comestibles y entomopatgenos.
Recientemente los procesos de FMS han sido identificados como tecnologas
limpias es decir, procesos de transformacin con poco o nulo impacto negativo sobre el
ambiente, sistemas biotecnolgicos que han despertado un renovado inters en los ltimos
20 aos. Algunas de las ventajas e inconvenientes de la FMS se enlistan en el cuadro 2.
(Hernndez y Carrillo, 1999).
Cuadro 2. Ventajas e inconvenientes de la Fermentacin en medios slidos.
VENTAJAS INCONVENIENTES
1. Simplicidad del medio de cultivo.
2. Disminucin de contaminantes debido
a la baja humedad del medio de cultivo.
3. Facilidad de aireacin.
4. Utilizacin directa de slidos
fermentados.
5. Condiciones de esterilidad menos
estrictas.
6. Bajo capital de inversin.
1. Regulacin de los parmetros de cultivo.
2. Pretratamiento de las materias primas y
soportes.
3. inoculacin importante.
4. Manejo de materiales heterogneos.
5. Poco conocimiento tecnolgico.
6. Escalamiento de reactores.
7. Riesgo de excesiva elevacin de
temperatura.
Tomado de Hernndez y Carrillo, 1999.
39

2.11 Formulacin de hongos entomopatgenos
El desarrollo de la formulacin de un insecticida microbial es semejante a un
insecticida qumico. Por lo tanto, el proceso de formulacin servir para mejorar las
propiedades de almacenamiento, manipulacin, aplicacin, efectividad, persistencia y
seguridad. Las formulaciones bsicas tanto de entomopatgenos como insecticidas
qumicos comprende: lquidas (suspensiones acuosas o emulsificables); polvos
humectables; polvos; cebos y granulados.
A diferencia de los insecticidas qumicos, el micelio, conidias, blastosporas,
zoosporas o esporangios, producidos por hongos entomopatgenos, son propgulos vivos.
Por tanto, el tipo de formulacin y seleccin de aditivos son crticos para su estabilidad.
Los acarreadores comnmente utilizados en la formulacin de entomopatgenos son
arcillas como el caoln, silica gel o tierras diatomeas (Hernndez, 1999).

40

III. MATERIALES Y METODOS.

3.1 Ubicacin del rea de trabajo.
El presente trabajo se realiz en el Laboratorio del Centro Regional de Estudios y
Reproduccin de Organismos Benficos (CREROB), ubicado en Huamantla, Tlaxcala, con
domicilio en Carretera Federal Mxico-Veracruz, Km 164.5; y con la colaboracin del
Centro de Investigacin en Biotecnologa Aplicada del Instituto Politcnico Nacional
(CIBA-IPN) Tlaxcala, con domicilio en Carretera Estatal Santa Ins Tecuexcomac
Tepetitla Km. 1.5, en la asesora estadstica.
3.2 Seleccin de las cepas de los hongos B. bassiana y M. anisopliae
Con el objeto de garantizar la efectividad biolgica de los hongos entomopatgenos
B. bassiana (Bals.) Vuill. y M. anisopliae (Metsch) sobre A. obtectus (Say), se sembraron
en medio Agar-Dextrosa-Sabouraud (ADS), ocho cepas del cepario del CREROB, las
cuales fueron BbUAT75, BbPL5, BbCOL, BbXALAPA, BbUAT2, para B. bassiana
MaPL15, MaPL31 y MaUAT25, para M. anisopliae se seleccionaron y resembraron los
cultivos de las cepas de B. bassiana y de M. anisopliae que mostraron un crecimiento ms
vigoroso para realizar los ensayos de reactivacin.
De las cepas seleccionadas se hicieron preparaciones de micelio y esporas para su
observacin en el microscopio compuesto, de las caractersticas morfolgicas de
crecimiento, tipo de micelio, esporulacin, forma de las conidias y tipo de conidiforos, por
medio de la comparacin de estas con las claves segn The Hughes-Tubaki-Barron System
of classification; Alternate Key to series and genera (Moniliaceae and Dematiaceae) (ver
41

apndice cuadro 3 y 3a). Las cepas que presentaron mayor vigorosidad en su desarrollo
fueron Beauveria bassiana XALAPA y Metarhizium anisopliae UAT25.
3.3 Reactivacin
Es un proceso que permite incrementar y/o conservar la virulencia de las cepas
sobre una plaga de inters (Real y Edgar, 2005). Para el proceso de reactivacin es
necesario que el hongo entre en contacto con la plaga, para lograr el reconocimiento del
hospedero; ocasionando el encendido de la expresin de diversos genes, no necesariamente
encendidos ante otro hospedero, para as generar mltiples toxinas y antibiticos; esta etapa
es de identificacin; en este ensayo de expresin puede encontrarse la combinacin
especifica que permita al hongo penetrar la cutcula del insecto y generar la infeccin al
combatir exitosamente la respuesta inmunolgica del hospedero en presencia de reacciones
defensivas celulares.
3.3.1 Reactivacin in vivo de las cepas.
Se sembraron dos cajas petri con la cepa de BbXALAPA y dos con MaUAT25 en
medio ADS y se dejo crecer a ambos entomopatgenos hasta su fase de esporulacin,
despus se colocaron 12 ejemplares de A. obtectus por caja para someterlos a una
exposicin masiva directa de esporas y lograr la reactivacin in vivo.
Los ejemplares de A. obtectus, se consiguieron de varias muestras de frjol
infestadas de las variedades Amarillo, Flor de mayo, Peruano, Negro, Bayo;
proporcionadas por productores de la regin de Huamantla, Tlaxcala; de las que, mediante
una zaranda se obtuvo una poblacin heterognea del insecto plaga utilizado para la
reactivacin y se mantuvieron en observacin hasta su muerte.
42

Los cadveres se deshidrataron, con el fin de evitar su descomposicin bacteriana e
incrementar la oportunidad del desarrollo del hongo; colocndolos en nuevas cajas petri
con una capa de papel filtro absorbente, en el interior de una estufa a 28 C por un plazo de
72 horas.
Una vez deshidratados los cadveres se cambiaron a una cmara hmeda que
consisti en una nueva caja petri donde se les coloc una torunda de algodn hmeda de 2
cm separada de ellos con el fin de propiciar las condiciones adecuadas de humedad para la
esporulacin del hongo, la que se manifest en un lapso de 192 a 360 horas de estar en
cmara hmeda y se apreci en la superficie, las coyunturas, las uniones y articulaciones
de los cuerpos de los insectos como una capa algodonosa, aterciopelada que termin por
cubrir por completo a los mismos. De los insectos esporulados se hicieron preparaciones
para su observacin al microscopio y corroborar que los hongos desarrollados
correspondieran a los entomopatgenos aplicados.
Las cepas reactivadas se obtuvieron mediante el aislamiento micelial a partir de los
cadveres esporulados y se sembraron en medio ADS para obtener al entomopatgeno
puro.
3.3.2 Reactivacin in vitro de las cepas
Cuando el hongo est en contacto con los restos de su hospedero se asegura la
virulencia y vigorosidad del entomopatgeno, pero al reproducirlos en medios de cultivo
artificiales dichas caractersticas se pierden gradualmente, por lo tanto, se decidi
sembrarlos en medio de cultivo agar-insecto (AI); el cual consisti en 26 g de medio ADS,
2.5 g de macerado de A. obtectus en 400 mL de agua destilada. Para obtener el macerado
los ejemplares muertos del insecto se desinfectaron con una solucin de alcohol al 5 %
43

seguida de cloro al 5 %, luego se colocaron en una caja petri con una capa de papel filtro
absorbente y se mantuvieron a 60 C en una estufa durante 24 horas para su secado.
Transcurrido este tiempo se maceraron en un mortero y junto con el medio ADS, se
vertieron en el agua destilada agitndose hasta tener una mezcla homognea, que en
seguida se esterilizo en una olla de presin de 21 litros a 115 C (75 PSI) durante 45
minutos. Ya gelificado el medio se sembraron las cepas BbXALAPA y MaUAT25 rayando
con la ayuda de un asa de siembra, para su desarrollo se mantuvieron 36 horas en un cuarto
de crecimiento a 30 C y con exposicin a luz blanca 24 horas. Posteriormente se
transfirieron a una estufa a 27 C y en oscuridad por un lapso de 144 horas, ya formados los
micelios se cambiaron a cuarto de crecimiento a 27 C con un fotoperiodo 12-12 durante
otras 144 horas para fomentar la esporulacin.
Como resultado del procedimiento anterior se obtuvieron las cepas reactivadas
contra A. obtectus de los entomopatgenos, Beauveria bassiana SB07 (BbSB07) y
Metarhizium anisopliae SB07 (MaSB07), las que se emplearon en el escalamiento en arroz
para su produccin masiva.
3.4 Propagacin masiva de los entomopatgenos en arroz
El proceso se inici con el lavado de 12 kg de arroz con agua fra (Figura 7 A),
despus se lav en agua caliente con 65 mg de antibitico tetraciclina (COL-D-TIF) por 15
minutos (Figura 7 B), en seguida se escurri el arroz en una zaranda de malla metlica para
quitarle el exceso de humedad (Figura 7 C). Una vez escurrido el arroz se pesaron 250 g
por bolsa de polipapel de 15x30 cm que se esterilizaron a 115 C durante 45 minutos y se
dejaron enfriar por 24 horas (Figura 7 D).
44

Figura 7. Proceso de lavado de arroz A) Lavado de arroz con agua fra. B) Lavado con agua
caliente y antibitico C) Escurrimiento en zaranda y D) Embolsado del arroz.
Al cabo de este tiempo, se inocularon las bolsas de arroz con las cepas reactivadas y
esporuladas (Figura 8), que se mantuvieron en un cuarto de crecimiento con una
temperatura constante de 27 C y un fotoperiodo 12-12 por un espacio de 624 horas hasta
que alcanzaron el ptimo de esporulacin. Durante ste perodo se movieron las bolsas cada
72 horas, con el objetivo de romper micelio (Figura 9), incrementar la superficie de
esporulacin y por lo tanto la cantidad de esporas por bolsa. Al concluir las 624 horas se
sacaron las bolsas esporuladas del cuarto de crecimiento y se pasaron al cuarto de secado
donde a temperatura ambiente se abrieron las bolsas y se extendi el arroz en charolas de
50 x 40 cm. para perder el exceso de humedad, por 504 horas (Figura 10).
Finalmente se extrajeron los conidios del arroz esporulado agitndolo
45

vigorosamente por 10 minutos en un tamiz marca FIIC, S. A. de C. V. de 50 mallas/cm; el
producto colectado se coloc en frascos de vidrio forrados de papel aluminio y se pusieron
en refrigeracin con el fin de conservar sus caractersticas de viabilidad patognica. Este
procedimiento se utiliz tanto para MaSB07 como para
BbSB07.

Figura 8. Inoculacin del arroz con cepas reactivadas. A) Cepa reactivada y bolsas de arroz
esterilizadas B) Inoculando el sustrato C) Arroz esporulado.

Figura 9. Movimiento de sustrato inoculado para romper micelio.

46

Figura 10. Arroz en cuartos de crecimiento y de secado. A) Cuarto de Crecimiento
B) Cuarto de Secado.
3.5 Concentracin de conidios
Antes de realizar la aplicacin de los hongos entomopatgenos (BbSB07 y
MaSB07) a los insectos, fue necesario determinar la concentracin de conidios de cada
cepa, la cual se obtuvo mediante la ayuda de una cmara de Neubauer y un microscopio
compuesto (Figura 11).
47

Figura 11. Conteo de Conidios para obtener el nmero de conidios g
-1
.
Esto se llev a cabo en base al control de calidad que pide el Centro Nacional de
Referencia de Control Biolgico (C.N.R.C.B.); para ello, en un recipiente con 100 mL de
agua destilada se agregaron 1 gramo de conidios ms 1 mL de dispersante Tween 20, se
coloc el recipiente en un agitador magntico por 10 minutos para evitar la formacin de
conglomerados, posteriormente se procedi a realizar el conteo de conidios en la cmara de
Neubauer. Se realizaron seis conteos para BbSB07 y otros seis para MaSB07, se
promediaron los conteos de cada entomopatgeno; y este promedio se multiplic por el
volumen de la dilucin y se obtuvo el nmero de conidios g
-1
.
Con estos datos obtenidos se determin la cantidad necesaria de inoculo para cada
dosis aplicada; tanto para Bb SB07 como para Ma SB07.
48

3.6 Diseo experimental
Este bioensayo se estableci bajo un diseo experimental completamente al azar y
se probaron nueve tratamientos incluyendo al testigo; cada uno con cuatro repeticiones.
3.6.1 Tratamientos evaluados
Para la determinacin de los tratamientos se tom la concentracin que pide el
C.N.R.C.B. que es de 1.2 x 10
12
conidios g
-1
como dosis primaria y a partir de la cual se
realizaron tres diluciones que fueron disminuyendo en 0.1, 0.01, 0.001 %, obteniendo las
concentraciones de 1.2x10
11
, 1.2x10
10
, 1.2x10
9
,

para ambos entomopatgenos, dando un
total de cuatro tratamientos para Bb, cuatro tratamientos para Ma y un testigo.
La dosis primaria para ambos hongos se prepararon agregando 1 gramo de conidios
en 100 mL de agua en un vaso de precipitado, teniendo la concentracin de 1.2x10
12

conidios g
-1
mantenindose en constante agitacin por 10 minutos en un agitador magntico
y un imn colocado en el vaso, despus con una pipeta se tomaron 10 mL de la dosis
primaria y se deposit en otro vaso con 90 mL de agua destilada, se continu de esta
manera hasta obtener las otras concentraciones.
3.6.2 Unidad Experimental
Consisti en 10 insectos por tratamiento tomados al azar de las muestras de frijol,
siendo una poblacin heterognea, en la que, para este trabajo, no se consider el sexo, ni la
edad de los ejemplares de Acanthoscelides obtectus ya que se quisieron mantener las
condiciones de campo ms cercanas a la realidad que enfrenta el productor; por tal motivo
los gorgojos usados no fueron obtenidos de criadero en laboratorio; sino tomados
directamente de la poblacin presente en las muestras infestadas.
49

3.6.3 Identificacin de Acanthoscelides obtectus (Say).
La determinacin taxonmica de los insectos colectados se realiz con base en las
caractersticas descritas por Metcalf y Flint (1984) y que sealan como la ms evidente el
tener un diente grande y dos pequeos en el pice del fmur posterior colocados sobre el
borde interno inferior (Figura 12).

Fig. 12. Acanthoscelides obtectus que muestra los dientes en el fmur.
3.7 Aplicacin de los tratamientos evaluados
Para cada tratamiento se colocaron 10 insectos vivos y un disco de papel filtro por
caja petri esterilizada de 9 cm de dimetro y 1.5 cm de altura.
En la aplicacin de los tratamientos se calibr un atomizador comercial a un gasto
de 0.78 mL por cada una de las diluciones correspondientes, de manera que los mililitros
que cubrieron la superficie de la caja petri fueron equivalentes a un volumen de 200 litros
por hectrea que normalmente se aplica en campo, ya que las pruebas de efectividad de los
agentes biolgicos seleccionados para el control del insecto plaga en condiciones de campo
son muy importantes debido a que en condiciones de laboratorio su comportamiento es
diferente.
50

Finalmente las cajas se sellaron con parafilm y se etiquetaron con el tratamiento
aplicado y el lote (Figura 13).
La mortalidad se empez a evaluar a partir de las 48 horas de la aplicacin y se
concluy a las 528, anotando las observaciones.
El anlisis de varianza para la variable numero de Acanthoscelides obtectus muertos
se realizo con el paquete estadstico de computo Structural Analisys System (SAS)
detectando mediante la prueba de comparacin de medias de Tukey (=0.05) las diferencias
significativas entre tratamientos.

Figura 13. Tratamientos de entomopatgenos evaluados con ejemplares de A. obtectus.

51

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Reactivacin de los entomopatgenos contra Acanthoscelides obtectus
De las cinco cepas de Beauveria bassiana y tres de Metarhizium anisopliae con que
contaba el CREROB se seleccion a BbXALAPA y MaUAT21 por su vigorosidad y
viabilidad, para reactivarlas, evaluarlas y formular el bioinsecticida.
Las cepas seleccionadas se reactivaron in vivo e in vitro. A partir de stas se
obtuvieron las cepas reactivadas B. bassiana SB07 (BbSB07) y M. anisopliae SB07
(MaSB07) virulentas contra A. obtectus.
Para la reactivacin in vivo los ejemplares de A. obtectus fueron colectados de una
muestra de granos de frijol de variedades sembradas en la regin, a diferencia de otros
trabajos como los de Camargo (2000) y Prez (1997) que emplearon ejemplares de criadero
seleccionados por edad y por sexo bajo condiciones controladas de laboratorio.
La reactivacin in vitro se realiz en medio agar-insecto para incrementar la
patogenicidad y virulencia de las cepas de los entomopatgenos evaluados; como lo
mencionan Real y Edgar (2005).
Como resultado de la reactivacin in vivo e in vitro se obtuvieron las cepas
reactivadas BbSB07 y MaSB07 contra A. obtectus que se emplearon para la produccin
masiva.
La formulacin del producto fue en fermentacin de medio solido usando el arroz
como sustrato ya que es de fcil manipulacin, econmico y la viabilidad de las conidias es
mayor a la que se tiene en las fermentaciones lquidas.

52

4.2 Tratamientos y Evaluacin de las cepas.
Las cepas que presentaron mayor vigorosidad en su desarrollo fueron B. bassiana
XALAPA y Metarhizium anisopliae UAT25.
La concentracin de conidias en los tratamientos se hizo tomando como base la
dosis mxima que pide el C.N.R.C.B que es de 1.2x10
12
conidios g
-1
y a partir de la cual se
realizaron tres diluciones quedando los tratamientos tanto para BbSB07 como para
MaSB07 con las siguientes concentraciones: 1.2 x 10
12
, 1.2x10
11
, 1.2x10
10
, 1.2x10
9
.
4.3 Influencia de los entomopatgenos sobre Acanthoscelides obtectus.
Al analizar los datos en el paquete estadstico SAS se observ que los hongos
BbSB07 y MaSB07 tuvieron un efecto de control sobre el insecto a partir de las 96 horas de
la aplicacin (Figura 14); donde en los tratamientos en que se aplicaron los
microorganismos disminuyeron la poblacin del gorgojo; sin embargo, con MaSB07 a la
dosis de 1.2x10
12
se tuvo la mayor media de ejemplares muertos (2.25), con este
tratamiento se logr el mejor control de la plaga hasta 432 horas despus de la aplicacin
del entomopatgeno, superando a BbSB07 a la dosis de 1.2x10
12
que tuvo una media de
(1.00) la cual mostr su mayor significancia respecto al testigo a las 288 horas (6.25 y 1.50
respectivamente) y perdindola a las 432 horas.
En las primeras tomas de datos a las 24, 48 y 72 horas no se muestra significancia
alguna entre los tratamientos debido a que los hongos requieren de 72 horas en promedio
para lograr penetrar la cutcula de su hospedero para de esta manera lograr invadir la
hemolinfa y empezar a hacer efecto sobre l; por lo que en este trabajo se observ que a las
120 horas de establecido el experimento el entomopatgeno MaSB07 (con una media
de2.75) es diferente significativamente a BbSB07 (1.00) y al testigo (0.00).

53

Fig. 14. Media de ejemplares muertos en cada toma de datos durante el bioensayo.

En el bioensayo se tuvo un efecto similar con la aplicacin de BbSB07 a la dosis de
1.2x10
9
(0.50 y 0.75 respectivamente) y el tratamiento testigo sin entomopatgeno (0.50 y
0.50) durante las 144 y 168 horas despus de establecido.
El tratamiento de MaSB07 a la concentracin de 1.2x10
12
fue el mas significativo
(6.25), seguido de la cepa de BbSB07 a la dosis de 1.2x10
12
(5.25), despus aparecen los
tratamientos de BbSB07 a la dosis de 1.2x10
10
y 1.2x10
9
(3.75 para ambos) esto fue a las
264 horas.
El pico mximo de control del entomopatgeno MaSB07 a la concentracin de
1.2x10
12
se logr a las 312 horas despus de su aplicacin (6.75) notndose el mismo caso
para BbSB07 a la dosis de 1.2x10
12
(6.25) y aunque el efecto de esta cepa supera por poco
al de MaSB07 a las 456 horas (8.50 para Beauveria y 8.25 en Metarhizium) se consider
54

como el segundo tratamiento para el control biolgico de la plaga; ya que tiene un tiempo
de control poco mas amplio que MaSB07 (Figura 14).
En trminos generales se observ que la concentracin de ambos entomopatgenos
de 1.2x10
12
logr un control biolgico significativo del insecto plaga, dndonos un 92.5 %
de insectos muertos la cepa de BbSB07, un 87.5 % la cepa de MaSB07 contra el 70 % del
testigo sin tratamiento, estos datos fueron a las 528 horas de establecido el bioensayo
puesto que despus de este tiempo la muerte ocasionada por los tratamientos fue similar a
la muerte natural de los testigos (fig. 15).

Fig.15. Porcentaje de mortandad sobre A. obtectus de los tratamientos evaluados.
Los resultados de este trabajo contrastan con los obtenidos en otros similares, tal es
el caso de Camargo (2000) que tuvo una mortalidad mayor del 90 % a los cinco das de la
aplicacin con una dosis de 1x10
9
conidios g
-1
de la cepa Bb4A; Prez (1997) obtuvo una
55

mortalidad del 100 % al quinto da de la aplicacin de el bioinsecticida Naturalis-L con una
concentracin de 2.3x10
7
conidios/mL.
Bautista y Gonzlez (2005) al aplicar cuatro veces M. anisopliae a una dosis de
1x10
12
conidias ha
-1
sobre Aeneolamia spp. con intervalos de 15 das, obtuvieron un control
del 96.4 %, siendo un porcentaje mayor al obtenido con la cepa de MaSB07 en este
bioensayo, mas sin embargo solo se realiz una aplicacin de MaSB07, por lo tanto la
aplicacin de la cepa es una alternativa potencial.
En el trabajo realizado por Ibarra et al (2005) mencionan en que M. anisopliae
control a los adultos de Dalbulus maidis mas rpido que la cepa B. bassiana, lo cual
confirma que el entomopatgeno M. anisopliae acta mas rpido que B. bassiana sobre sus
hospederos.
En los resultados de Lpez et al (1994) cuando evaluaron las cepas de B. bassiana a
una concentracin de 1.5x10
8
conidios g
-1
contra descortezadores del genero IPS en pino
observaron que ninguna cepa control; caso contrario a Morales et al que obtuvieron un
control de adultos de Amphidees spp. con la cepa nativa de BbSAA a los siete y 13 das
despus de su aplicacin con un 77 y 99 % de mortalidad respectivamente; por lo tanto se
requiere de la reactivacin de los entomopatgenos sobre alguna plaga de inters para
lograr su control.
Tambin se concluy que el control biolgico es ms eficiente si se realiza el
incremento y conservacin de los entomopatgenos como lo constato Delgado et al. (2005)
que reportaron un control del 51 % de Sphenarium purpurescens Charp y Melanoplus
differentialis Thomas con la cepa de M anisopliae var. acridum a dosis de 1x10
13

conidias/mL a los 21 das despus de su aplicacin y a partir de este da se manifest de
manera ms importante, coincidiendo tambin con lo sealado por Arredondo (1999)
56

mencionando el efecto prolongado del control biolgico a diferencia del qumico, el cual es
inmediato.
La meta de este experimento fue el de ofrecer un producto de calidad para el
control de la plaga en condiciones de campo y almacn, ya que el comportamiento en
condiciones controladas de laboratorio son diferentes. Por lo cual al comparar los
resultados obtenidos en este trabajo con los de otros autores se observo que al aumentar la
dosis de los entomopatgenos se incrementa el ndice de mortalidad de Acanthoscelides
obtectus.

57

V.- CONCLUSIONES.

Se logr la reactivacin in vitro de las cepas de Beauveria bassiana XALAPA
(BbSB07) y Metarhizium anisopliae UAT25 (MaSB07) contra Acanthoscelides obtectus.

La cepa MaSB07 ocasiono una mortandad de Acanthoscelides obtectus mas rpida,
que la generada por la cepa BbSB07.

Ambos entomopatgenos mostraron su mximo control a las 288 y 312 horas de su
aplicacin con la dosis de 1.2x10
12
conidios g
-1
sobre el insecto plaga.

La Formulacin de los entomopatgenos MaSB07 y BbSB07 a la dosis de 1.2x10
12

conidios g
-1
ofrece una alternativa de control de Acanthoscelides obtectus, en campo, y que
tambin puede aplicarse en almacn para tratar 800 kilogramos de grano.

58

VI. LITERATURA CITADA

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62

VII. APENDICE.

Cuadro 3. Claves para la determinacin taxonmica de Beauveria bassiana segn The
(Moniliaceae and Dematiaceae).

1 h Conidia (sympodulospores) developing at tips of conidiophores or
conidiogenous us cell (not from pores in outer wall) and forming
successively on new growing tips by sympodial proliferation; increase may be
slight but conidia are of different ages:(this key includes some genera placed by
some authors in the Porosporae).(Examples: Fusicladium, Tritirachium,
Cercospora) Series SYMPODULOSPORAE 102
102a Conidia coiled, helicosporous 103
102b Conidia not coliled 106
106a On living plants in nature, principally on leaves, mostly parasitic 107
106b Closely associated with other fungi, often parasitic on them 122
106c Saprophytic on various substrata 123
123a Conidia hyaline to subhyaline (Slightly pigmented) 124
123b Conidia with distinct dark pigment 139
124a Conidia typically 1-celled 125
124b Conidia typically 2-celled 139
124c Conidia 3- to several-celled 137
125a Conidiophores variously branched, rarely simple 126
125b Conidiophores typically simple, rarely branched 131
131a Conidia catenulate Sympodiela 104
131b Conidia not catenulate 132
132a Fertile area of conidiogenous cell slender, rachislike 133
132b Fertile area of conidiogenous cell not slender or reachislike 134
133a Base of conidiophore enlarged; mostly on insects Beauveria 100
133b Base of conidiophore not enlarged; saprophytic Tritirachium 100

63

Cuadro 3a. Claves para la determinacin taxonmica de Metarhizium anisopliae segn The
(Moniliaceae and Dematiaceae).

1 i Conidia (phialospores) formed successively from open apex of
conidiophore or conidiogenous cell (phialide), which ordinarily does not
increase in length; conidia often collect in droplet of mucilage or slime at
apex or remain attached in basipetal chains; in a few genera the simple
conidiophore proliferates percurrently and forms new phialides. (Examples:
Chalara, Phialophora, Verticillium, Aspergillus)Series
PHIALOSPORAE 151
151a Normally aquatic, growing on decaying vegetation 152
151b Not normally aquatic 154
154a Conidia typically 2- to several-celled 155
154b Conidia typically 1-celled 159
159a Apex of conidiophore much enlarged, covered with flask-shaped phialides;
conidia in dry chains Aspergillus 94
159b Conidiophores phialides or conidia otherwise 160
160a Conidia hyaline or subhyaline 161
160b Conidia distinctly pigmented, at least in mass 178
161a Conidia crescent-shaped, typically with hyaline apical appendages 162
161b Conidia globose, ovoid, oblong, or hooked, without appendages 163
163a Conidia produced well within phialide (endogenous), mostly rod shaped 164
163b Conidia produced at apex of phialide, not rod-shaped 167
167a Conidiophores short or mostly reduced to a single phialide 168
167b Conidiophores well developed, simple or branched 169
169a Conidia dry, not in moist heads 170
169b Conidia held together in moist slimy heads 172
170a Conidiophores mostly, simple, dark; conidia single or catenulate.
Monilochaetes 86
170b Conidiophores branched, dark; conidia catenulate Thysanophora 96
170c Conidiophores branched, hyaline; conidia catenulate 171
171a Conidia cylindrical, aggregated into dry columns Metarhizium 94
171b Conidia globose, ovoid or rod-shaped; conidiophore brush compact Penicillium 94
171c Conidia fusiform to lemon-shaped; conidiophores brush loose.... Paecilomyces 94
64

Cuadro 4. Anlisis de varianza para la variable nmero de muertos de Acanthoscelides
obtectus por efecto de los entomopatgenos a las 120 horas despus de establecido el
experimento.

Fuente G.L. S.C. C.M. F-V Pr > F
Tratamiento 8 20.50 2.5625 3.79 0.0042
Error 27 18.25 0.67659
Total 35 38.75
R
2
0.5290
Cv 89.68

experimento.

Tratamiento 8 28.000 3.5000 3.05 0.0141
Error 27 31.000 1.1481
Total 35 59.000
R
2
0.4745
Cv 91.84

experimento.

Tratamiento 8 96.3888 12.0486 3.28 0.0096
Error 27 99.2500 3.6759
Total 35 195.6388
R
2
0.4926
Cv 50.38

experimento.

Tratamiento 8 99.5555 12.4444 3.23 0.0104
Error 27 104.0000 3.8518
Total 35 203.5555
R
2
0.4890
Cv 47.73

65

experimento.

Tratamiento 8 81.0000 10.125 3.26 0.0099
Error 27 83.7500 3.1018
Total 35 164.7500
R
2
0.4916
Cv 37.07

experimento.

Tratamiento 8 84.5000 10.5625 3.73 0.0047
Error 27 76.5000 2.8333
Total 35 161.0000
R
2
0.5248
Cv 32.57

experimento.

Tratamiento 8 91.2222 11.4027 3.59 0.0058
Error 27 85.7500 3.1759
Total 35 176.9722
R
2
0.5154
Cv 32.23

experimento.

Tratamiento 8 94.7222 11.8402 4.67 0.0011
Error 27 68.5000 2.5370
Total 35 163.2222
R
2
0.5803
Cv 27.83

66

experimento.

Tratamiento 8 75.0000 9.3750 3.47 0.0071
Error 27 73.0000 2.7037
Total 35 148.0000
R
2
0.5067
Cv 27.40

experimento.

Tratamiento 8 70.5555 8.8194 3.72 0.0047
Error 27 64.0000 2.3703
Total 35 134.5555
R
2
0.5243
Cv 24.09

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