EXTRACCIN Y ELECTROFORESIS DE ADN VEGETAL OBTENIDO DE ARVEJA

J. Carrillo-Moreno
a
, J.P. Jimnez-Moncada
a
, L. Arias-Lopera
a
, M.E. Higuita-Ramrez
a

a
Estudiantes Ingeniera Qumica, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia

Resumen

En el presente artculo se ilustra un proceso para la extraccin de una muestra de ADN vegetal
obtenido de arveja por mtodos fsicos como maceracin y congelacin y mtodos qumicos
mediante el uso de compuestos orgnicos como Tris, EDTA, cloroformo, CTAB, mercaptoetanol y
alcoholes (isoamlico, etanol, isopropanol). Adems se muestran y justifican los resultados obtenidos
a partir de datos experimentales como el peso y la absorbancia del ADN vegetal extrado del cual se
obtuvo un valor de 1.324 que indica que hay contaminacin por protenas y una cantidad de 81.65 g
de ADN de doble cadena en la muestra. Se presenta un anlisis cualitativo de la electroforesis de ADN
realizada al ADN vegetal extrado en un gel de agarosa para la separacin de las macromolculas en la
solucin donde se ve que hubo migracin de molculas a travs del montaje.

Palabras clave: extraccin de ADN, arveja, absorbancia, pureza, contaminacin, electroforesis de
ADN, gel de agarosa.

Abstract

This article illustrates a process for extracting a DNA plant sample obtained from pea by physical
methods such as macerating and freezing and chemical methods using organic compounds such as
Tris, EDTA, chloroform, CTAB, mercaptoethanol and alcohols (isoamyl , ethanol, isopropanol). Also
depicted and justify the results obtained from experimental data such as weight and the absorbance
of the extracted plant DNA which was obtained a value of 1.324 indicates that there is contamination
by proteins and an amount of 81.65 g of double stranded DNA in the sample. It presents a
qualitative analysis of DNA electrophoresis on DNA extracted plant in an agarose gel for separation of
macromolecules in solution where is seen migration of molecules through the assembly.

Keywords: DNA extraction, pea, absorbance, purity, contamination, DNA electrophoresis, agarose gel.

1. INTRODUCCIN
El ADN es la abreviatura del cido
desoxirribonucleico (en ingls, DNA). Es una
molcula presente en todas las clulas de los
seres vivos y es la encargada de codificar todo
lo que nosotros somos, desde el color del pelo
hasta las protenas que tenemos en nuestra
sangre. El ADN es una molcula cargada que
est asociada a protenas y en el caso de los
organismos eucariontes est encerrado dentro
de un ncleo [1]. Existen diferentes mtodos
fsicos y qumicos de extraccin de ADN,
algunos ejemplos son: salting-Out, chelex y el
mtodo de fenol-cloroformo; esta ltima es
una tcnica que usa solventes orgnicos y
permite obtener ADN de muy buena calidad y
cantidad [2]. La extraccin de ADN requiere
una serie de etapas bsicas: En primer lugar
tiene que romperse la pared celular y la
membrana plasmtica para poder acceder al
ncleo de la clula. A continuacin debe
romperse tambin la membrana nuclear para
dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como
lavavajillas emulsionan los lpidos de las
membranas celulares y las rompen. Un
detergente es una solucin capaz de disolver
las membranas y as permitir que stas se
separen del resto de los componentes. Adems
este detergente es capaz de unir las protenas
que estn junto al ADN. La sal de mesa tiene
un catin que se une a la molcula de ADN y
hace que cambie sus propiedades qumicas, lo
que evita la unin de las protenas al ADN. Para
aislar el ADN hay que hacer que precipite en
alcohol. El ADN es soluble en agua, pero
cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y
precipita en la interfase entre el alcohol y el
agua. Adems de permitirnos ver el ADN, el
alcohol separa el ADN de otros componentes
celulares, los cuales son dejados en la solucin
acuosa [3]. El alcohol adems disuelve los
azcares y protenas [1]. La electroforesis en
gel es un grupo de tcnicas empleadas por los
cientficos para separar molculas basndose
en propiedades como el tamao, la forma o el
punto isoelctrico. La electroforesis en gel se
utiliza generalmente con propsitos analticos,
pero puede ser una tcnica preparativa para
purificar molculas parcialmente antes de
aplicar espectrometra de masas, PCR,
clonacin o secuenciacin de ADN. [4] La
electroforesis de cidos nucleicos es el mtodo
habitual para separar, identificar y purificar
molculas o fragmentos de DNA y RNA. Es un
mtodo de separacin de mezclas de
molculas biolgicas. Cuando una mezcla de
molculas ionizadas y con carga neta son
colocadas en un campo elctrico, estas
experimentan una fuerza de atraccin hacia el
polo que posee carga opuesta. En los
tampones habitualmente utilizados, los cidos
nucleicos estn cargados negativamente y
migran hacia el nodo. Cada molcula aporta
una carga negativa (procedente del grupo
fosfato), por lo que la relacin carga/tamao es
prcticamente constante e idntica para todas
las molculas, independientemente de su
tamao (un nucletido tendr la misma
movilidad que un fragmento de doble cadena
de 800pb o uno de 5kb). La electroforesis de
DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o
poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos
para los cidos nucleicos, de modo que los
diferentes fragmentos (al tener la misma
relacin carga/tamao), migran en funcin de
su tamao y/o conformacin. Los geles de
poliacrilamida (en cubetas verticales) se
emplean para fragmentos pequeos de DNA
(5-500pb), as como para la mayora de los
RNA. Los geles de agarosa (en cubetas
horizontales) se utilizan para fragmentos
grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando
agarosas de distintas concentraciones (distinto
grado de reticulacin) pueden separarse
fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo
elctrico constante; para separar fragmentos
de tamao superiores a 50kb se utiliza la
electroforesis de campo pulsante en la que la
direccin del campo elctrico cambia
peridicamente. Cuando se ha completado la
electroforesis, las molculas ms pequeas han
llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar'
mediante la adicin de un colorante especfico
para hacerlas visibles. Se emplean compuestos
como el bromuro de etidio, para los cidos
nucleicos, o la plata, para las protenas.
Asimismo se emplean otros mtodos para
visualizar la separacin de la mezcla en el gel.
Si el reactivo es fluorescente bajo la luz
ultravioleta (radiacin UV), se puede
simplemente hacer una fotografa de la placa
bajo dicha luz. Tambin, si las molculas
contienen tomos radiactivos se puede
efectuar una autorradiografa. Si se han
inyectado varias mezclas una junto a otra en la
placa, se producirn separaciones paralelas.
Cada separacin mostrar distintas bandas
correspondientes a cada componente de la
mezcla. Si las separaciones son incompletas, se
dar un solapamiento entre bandas haciendo
indistinguibles dos o ms componentes. Las
bandas en diferentes separaciones paralelas
que estn a la misma distancia del principio
significa que contienen molculas que han
atravesado el gel a la misma velocidad. Existen
marcadores especiales que contienen una
mezcla de molculas de tamao conocido. Si se
hace una electroforesis de un marcador con
una mezcla desconocida, las bandas
observadas en el marcador pueden ser
comparadas con las obtenidas en la mezcla
desconocida para determinar su tamao. La
distancia a la que se encuentra la banda del
principio es (aproximadamente) inversamente
proporcional al logaritmo del tamao de la
molcula [5]. En la prctica de laboratorio y el
informe tenemos como objetivos utilizar una
tcnica sencilla para poder extraer el ADN de
un producto natural comprendiendo las etapas
para el aislamiento de la molcula, determinar
su pureza y familiarizarse con mtodos de
separacin de cidos nucleicos mediante
electroforesis en un gel de agarosa e
interpretar los datos cualitativamente.

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1. Extraccin de ADN
Para la degradacin de la pared celular se
usaron mtodos fsicos, primero se debi
congelar por 10 minutos, macerar el material
de trabajo y posteriormente se pes una
cantidad de ste. En la inhibicin de nucleasas
se utiliz 1 mL de solucin buffer 1 que
contiene: 50 mM Tris-HCl de pH 8.0; 5 mM
EDTA; 350 mM Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol;
10% polyetilenglicol. Luego de una agitacin
moderada se procedi a centrifugar a 5000
rpm por un tiempo aproximado de 10 minutos
y a una temperatura de 4C; se descart el
sobrenadante y para resuspender el slido y
solubilizar la membrana celular se agreg 500
L una solucin buffer 2 que contiene: 50 mM
Tris HCl de pH 8.0; 5 mM EDTA; 350 mM
Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol; 1% Sodio
Sarkosyl; 710 mM NaCl; 0.1%
Centiltrimetilamonio (CTAB). En la
desnaturalizacin y separacin de protenas se
us una solucin de cloroformo-alcohol
isoamlico en una proporcin 24:1. Se hizo uso
nuevamente de la centrifugacin en el mismo
intervalo de tiempo y temperatura y la fase
acuosa fue transferida a otro tubo
conservando y utilizando slo la solucin
orgnica restante. En la etapa de precipitacin
se utiliz 2 volmenes de isopropanol a una
temperatura de -20C; para eliminarlo tambin
se us el equipo de centrfuga. Hecho esto se
lav con etanol al 70% y nuevamente se
centrifug la solucin para eliminar el alcohol.
Finalmente, se resuspendi el precipitado en
300 L de Tris-Edta y se ley la absorbancia en
un espectrofotmetro a 260 nm. Para este
procedimiento fueron indispensables otros
materiales como bistur, mortero con el cual se
macer la arveja objeto de estudio de la cual
se extrajo el ADN, tubos de ensayo con tapa,
balanza analtica para pesar el tejido luego de
macerar la arveja, pipetas de 5ml y
micropipetas, equipos y sistemas de
refrigeracin como una centrfuga refrigerada y
un bao de agua a 60C para la incubacin de
la muestra, puntas para micropipetas y tubos
eppendorf.

2.2. Electroforesis
Los reactivos utilizados fueron: solucin buffer
de Tris-Borato (TBE) con pH 8.0 la cual se
prepar con 54 g de Tris base, 27.5 g de cido
brico y 20 mL de una solucin de EDTA 0.5 M,
ajustando pH y volumen a 1L; gel de agarosa al
0.8% en buffer TBE, el cual se agrega para
cubrir el gel 1 mm por encima de su parte
superior. Lo anterior fue realizado en el
laboratorio por los monitores antes de
comenzar la prctica. Adicionalmente se utiliz
buffer de carga que est compuesto por una
solucin de sacarosa al 40% con azul de
bromofenol al 0.25% preparado en agua en
una proporcin 1:1, para mezclar con las
muestras de ADN y colocar la mezcla en los
pozuelos del gel de agarosa ayudados por
micropipetas. Posteriormente se aplic una
corriente elctrica con el fin de impulsar la
migracin de la molcula aproximadamente
unos 10 cm en el gel; esto se observ por la
migracin de color. En una solucin con
bromuro de etidio de concentracin 0.5 g/mL
el gel fue sumergido. Se utiliz un
transiluminador UV para observar las bandas
de ADN. Los materiales utilizados fueron placa
de vidrio sobre la cual se prepar el gel
horizontal, cinta de enmascarar, micropipetas
con las cuales se midieron los volmenes y se
adicionaron las muestras mezcladas dentro del
gel de agarosa y mechero utilizado en la
preparacin del gel.

Todos los implementos (reactivos e
instrumentos) utilizados y anteriormente
mencionados fueron facilitados por los
laboratorios de la Universidad de Antioquia,
lugar en el cual se realizaron los
procedimientos.

3. RESULTADOS


1
La pureza de ADN obtenido se calcula por la
relacin

2
La cantidad de ADN de doble cadena se
obtiene por la siguiente ecuacin [6]:

; para nuestro caso el

factor de dilucin fue de 1 mL de H
2
O.

De acuerdo a los resultados obtenidos
mediante la relacin para determinar la pureza
del ADN obtenido podemos afirmar que hubo
una posible contaminacin por protenas ya
que el valor hallado se encuentra por debajo
del rango de 1.7 [7], aunque podemos decir
que el valor de pureza obtenido es aceptable
ya que el resultado no est por debajo de 1.0
valor en el cual se considera que se presenta
alta contaminacin por protenas. La cantidad
de ADN calculada es coherente segn la
cantidad de muestra que se pes en el
laboratorio, ya que el orden de unidades de la
cantidad de ADN calculada (g) es menor que
el orden de la cantidad pesada de la muestra
(mg).



Grfica 1. Imagen tomada en el laboratorio de
la electroforesis de ADN en gel de agarosa.

De la imagen puede verse que no es posible
hacer un anlisis cuantitativo de los pares de
bases contenidos en el ADN vegetal, aunque el
nmero de pares de bases de la arveja es de
Tabla 1. Datos de laboratorio y resultados
Peso muestra (mg) 75.5
Absorbancia
= 260 nm
1.633
Absorbancia
= 280 nm
1.233
Pureza
1
1.324
Cantidad de ADN
2
(g) 81.65
aproximadamente 3000. Sin embargo,
cualitativamente puede verse que hubo una
migracin de molculas en el carril donde se
ubicaba el patrn y en uno de los carriles
iniciales de izquierda a derecha. El factor luz
tampoco permite que la imagen sea
suficientemente ntida para hacer una
caracterizacin, adems de otros eventos que
antecedieron a la prctica de lo cual se hablar
en la seccin de causas de error.

4. CAUSAS DE ERROR.

Muchas son las razones para justificar el
resultado de pureza de ADN obtenido (1.324).
Empezamos por las condiciones del material de
inicio, suponiendo que los mtodos fsicos no
fueron suficientes o correctamente realizados
para romper las primeras barreras de
extraccin y en esta etapa pudo haber
contaminacin e interferencias por material
biolgico humano [2]. En la etapa de
extraccin mediante solventes orgnicos una
cantidad significativa de clorofila qued
disuelta en la fase acuosa cuando lo debido fue
que hubiese quedado disuelta en la fase
orgnica, por lo tanto, existe un factor de
contaminacin por clorofila; esto lo pudimos
deducir porque el pellet tena un color
bastante verdoso, caracterstica del
componente. Es posible tambin que la
cantidad de solucin a la que lemos la
absorbancia no haya estado bastante
concentrada y se haya descartado una
cantidad significativa con el sobrenadante.
Aunque de la imagen es posible ver una
migracin de molculas no nos es posible
percibir un nmero de bandas. Un hecho que
antecedi a la prctica fue que la nevera donde
se almacenaba el patrn en el laboratorio no
estuvo en funcionamiento durante un tiempo
por causas propias del quehacer universitario
por lo que el patrn pudo haberse daado o
deteriorado y esto no permiti ver bandas
definidas, adems del factor luminosidad UV
mencionado en la seccin anterior, ya que para
el uso de este tipo de luz se necesita un cuarto
totalmente oscuro y haba gran filtracin de luz
visible a la habitacin; lo anterior no permite
que hagamos un anlisis cuantitativo del ADN
vegetal extrado para hacerlo, sugeriramos en
situaciones futuras usar mtodos electrnicos
como el mtodo PCR que permite hacer una
cuantificacin bastante ajustada sobre las
bandas que se obtienen.

5. REFERENCIAS.
[1] http://www.chilecientifico.cl/ciencia-
divertida-informacion-general-103/187-
extraccion-de-adn.html
[2]
http://www.slideshare.net/marcia_karina/extr
accion-adn
[3]
http://www.educa.madrid.org/web/ies.antoni
ogala.mostoles/dep_bio_archivos/EXTRACCIO
N_DE_ADN.pdf
[4]
http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en
_gel
[5]
http://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/
timag/trabajos/2006/electroforesis/
[6]
http://sebbm.es/BioROM/contenido/av_biom
o/Guiones_Biomol.pdf
[7]
http://www.bancoadn.org/documentacion/ext
raccionADN.pdf