cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular

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CIDOS NUCLEICOS


1. Composicin de los cidos nucleicos
2. Estructura de los nuclesidos y nucletidos
3. Estructura del ADN y de los ARNs




1. Composicin de los cidos nucleicos

Los cidos nucleicos son polinucletidos, es decir, polmeros resultantes de la unin
mediante enlace fosfodister de un nmero variable de unidades monomricas
bsicas, denominadas nucletidos.

Un nucletido est formado por tres componentes. Una pentosa, un compuesto
heterocclico nitrogenado (base nitrogenada) que junto con la pentosa forma un
nuclesido, y una molcula de cido fosfrico. Los nucletidos tienen papeles muy
variados dentro del metabolismo celular. Son la moneda energtica en el
metabolismo (ej: ATP), son mensajeros qumicos secundarios en la respuesta
celular a los estmulos inducidos por hormonas o agentes externos (ej.: AMPc),
constituyen una serie de importantes cofactores enzimticos y, por supuesto, son los
constituyentes de los cidos nucleicos: ribonucleicos (ARN) y desoxiribonucleicos
(ADN).


Pentosas

La ribosa o -D-ribofuranosa es la pentosa caracterstica de los ARN (cidos
ribonucleicos) y la desoxirribosa o 2`-desoxi--D-ribofuranosa la de los cidos
desoxirribonucleicos (ADN) (Figura 1).



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Bases nitrogenadas pricas y pirimidnicas

En la Figura 2 se representan las estructuras y los nombres de los compuestos
nitrogenados aislados en la hidrlisis de los cidos nucleicos. Tres de ellos derivan
de la pirimidina y son la citosina, uracilo y timina, y los otros dos derivan de la
purina y son la adenina y la guanina. Cuando estos compuestos se disuelven en
agua originan una disolucin de carcter bsico, por lo que se conocen con el
nombre de bases nitrogenadas.













Fig.2 Estructura de las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos. Bases pricas y
pirimidnicas





O
OH CH
2
OH OH
HO HO
O
OH CH
2
OH
ribose
deoxyribose
(no O)

Figura 1.

Pentosas componentes de los
cidos nucleicos.

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Los tomos de los anillos de estas cinco bases se numeran de la misma manera
que los anillos de pirimidina y purina. Esta numeracin es importante y se har
referencia a ella ms adelante. Tanto el ADN como el ARN contienen adenina,
guanina y citosina, si bien el uracilo slo est presente en el ARN, mientras que la
timina lo est nicamente en el ADN.

Es importante destacar el carcter aromtico de las bases nitrogenadas, que hace
que los cidos nucleicos absorban en el UV a unos 260 nm. Son estructuras casi
planas y tienen la peculiaridad de que pueden presentar diferentes formas
tautmeras. Por ejemplo, la citosina puede estar en forma lactmica (normal) y
entonces se empareja con la guanina, pero puede tambin adoptar forma lactmica y
entonces es ms estable su unin a la adenina, lo que facilita las mutaciones
espontneas y por tanto la evolucin. Adems de estas cinco bases mayoritarias los
cidos nucleicos pueden contener pequeas proporciones de otras bases,
normalmente derivados metilados o hidroximetilados de las bases principales.


2. Estructura de los nuclesidos y nucletidos

Nuclesidos

Los nuclesidos son los compuestos resultantes de la unin de las pentosas y de
una base nitrogenada. Estos compuestos se unen con prdida de una molcula de
agua, a travs del tomo de carbono 1' del azcar y el tomo de nitrgeno 1 de la
base pirimidnica o el tomo de nitrgeno 9 de la base prica, como se indica en la
Figura 3. Obsrvese que el enlace N-glucosdico es siempre .











O
HOCH
2
OH OH
N
N
N
N
H
2
N
O
HOCH
2
OH
N
N
N
N
H
2
N
H

Figura 3.

Estructura de dos
nuclesidos.
Desoxiadenosina Adenosina
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Los nombres de los nuclesidos indican su estructura. As, si el nuclesido est
formado por una ribosa y una base prica, se nombra cambiando la terminacin -ina
de la base por -osina (por ejemplo, de la guanina y la ribosa obtenemos la
guanosina), mientras que si se trata de una base pirimidnica la terminacin cambia
a -idina (de timina y ribosa obtenemos el nuclesido timidina). Por su parte, si el
nuclesido se forma con desoxirribosa, delante del nombre obtenido habr que
colocar el prefijo desoxi- (de adenina y desoxirribosa se obtiene el nuclesido
desoxiadenosina). La Tabla 1 recoge el nombre de todas las combinaciones
posibles (si bien la timidina y la desoxiuridina no existen en los cidos nucleicos
naturales).






Bases pricas

Nuclesido

Desoxinuclesido
A
Adenina Adenosina Desoxiadenosina
G Guanina Guanosina Desoxiguanosina
Bases pirimidinicas
C Citosina Citidina Desoxicitidina
U Uracilo Uridina (Desoxiuridina)
T Timina (Timidina) Desoxitimidina



Nucletidos

Los nucletidos son steres fosfricos de los nuclesidos. Todos los nucletidos
naturales poseen el grupo fosfato unido al tomo de carbono 5' de la pentosa. En la
Figura 4 se indica cmo se une el cido fosfrico con dos nuclesidos diferentes
para formar los correspondientes nucletidos, en una reaccin que tambin implica
prdida de una molcula de agua.



Tabla 1.

Nomenclatura de los nuclesidos.
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96















Los nucletidos se denominan combinando el nombre del nuclesido del que
proceden con la palabra monofosfato. As, el ster fosfrico de adenosina se
denomina 5'-monofosfato de adenosina (Tabla 2).






Bases pricas

Nucletido

Desoxinuclesido
A
Adenina Monofosfato
de adenosina
Monofosfato de
desoxiadenosina
G Guanina Monofosfato
de guanosina
Monofosfato de
desoxiguanosina
Bases pirimidinicas
C Citosina Monofosfato
de citidina
Monofosfato de
desoxicitidina
U Uracilo Monofosfato
de uridina

T Timina Monofosfato de
desoxitimidina

O
OH
N
N
NH
2
O
CH
2
O P
O
O
-
O
-
deoxyctyidine monophosphate (dCMP)

Figura 4.

Estructura de un
nucletido.
Tabla 2.

Nomenclatura de los nucletidos monofosfato.
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Por otro lado, los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos corrientes aparecen en
las clulas no solamente en forma monofosfato, sino que tambin pueden aparecer
en forma de 5'-difosfatos (con dos molculas de fosfrico) o bien 5'-trifosfatos (con
tres molculas). As los derivados de la adenosina, seran:

AMP : 5'-monofosfato de adenosina
ADP : 5'-difosfato de adenosina
ATP : 5'-trifosfato de adenosina.

Los nucletidos trifosfato (NTPs) desempean diversas funciones en las clulas.
As, el ATP, es un transportador de fosfato y de pirofosfato en numerosas
reacciones enzimticas en las que se requiere aporte energtico (aunque tambin
pueden realizar esta funcin el GTP, el UTP y el CTP). Por otro lado, algunos NTPs,
pueden actuar como transportadores de restos de azcares (energetizados) en la
biosntesis de polisacridos. Por supuesto, la funcin principal de los NTPs, es la de
actuar como precursores en la biosntesis enzimtica de los cidos nucleicos.


3. Estructura del ADN y de los ARNs

El cido desoxirribonucleico (ADN) est constituido por cadenas de
desoxirribonucletidos y el cido ribonucleico (ARN) por cadenas de ribonucletidos
(ambas monofosfato). Kas uniones entre nucletidos se realizan mediante enlaces
fosfodister (Figura 5).













O
N
N
N
N
NH
2
OH
CH
2
O P
O
-
O
N
N
N
N
NH
2
OH
CH
2
O P
O
-
O
N
N
N
N
NH
2
OH
CH
2
O P
O
-
O
O
O
O
O
O

Figura 5.

Enlace fosfodister entre
nucletidos.
cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
98


Entre el ADN y el ARN, existen tres diferencias claras:

el azcar integrante del ARN es la ribosa
el ARN contiene uracilo en lugar de timina
el ARN est formado por una nica cadena

Adems, existen tres tipos diferentes de ARN, cada uno de los cuales desempea una
funcin diferente, el mensajero (ARNm), el transferente (ARNr) y el ribosmico (ARNr).

Podemos distinguir varios niveles estructurales en los cidos nucleicos. La estructura
primaria o secuencia indica el orden en que se encuentran los nucletidos. La
ordenacin regular y estable que adopten los nucletidos puede denominarse
estructura secundaria, la ms conocida es la estructura de la doble hlice del ADN,
descubierta por Watson and Crick en 1953.

Estructura primaria. Secuenciacin de cidos nucleicos
Una vez definido si el cido nucleico es un ADN o un ARN, la secuencia de
nucletidos o estructura primaria solo vara segn las bases. Por eso un cido
nucleico puede representarse por la secuencia de bases, cada base representa al
nucletido que la porta.

En 1977 se desarrollaron dos mtodos para la secuenciacin de DNA, que nos
permiten secuenciar fragmentos de entre 200 y 400 pb:

Mtodo de Maxan y Gilbert...............................Hidrlisis qumica parcial
Mtodo de Sanger, Niklen y Coulson................Sntesis parcial

Para el desarrollo de ambos casos es necesario proceder segn una serie de pasos
comunes.

Secuenciacin de cidos nucleicos etapas comunes a ambos mtodos
-Desnaturalizacin para separar las hebras del DNA
-Marcaje del extremo del DNA de forma que pueda visualizarse. Normalmente
se marca el extremo 5 usando
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P, un radioistopo que emite partculas beta.
- Reducir el DNA a cuatro sets de fragmentos marcados.
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-Despus se hace una electroforesis de acrilamida de alta concentracin que
permite separar fragmentos de cidos nucleicos que se diferencian tan slo en un
nucletido. El gel de secuenciacin es un gel de poliacrilamida muy largo y muy fino
que se corre a unos 70C para evitar hibridaciones.

En el Mtodo de Maxan y Gilbert esto se consigue dividiendo la muestra de DNA
monocatenario y marcado en cuatro partes. Cada una de estas porciones de
muestra se trata con procedimientos qumicos que permiten la rotura de la cadena
por un tipo de base, eliminando dicha base. Esto genera una serie de fragmentos
que pueden separarse por electroforesis, solo se visualizarn aquellos que
contienen el extremo 5`marcado. Las cuatro porciones de fragmentos que han sido
hidrolizadas para la identificacin de cada una de las cuatro bases que componen el
DNA se someten a electroforesis en 4 calles de un gel de secuenciacin.

El mtodo de Sanger (Figura 6) consiste en hacer la sntesis de la cadena
complementaria en presencia de la DNA polimerasa e introduciendo un nucletido
malo de forma que la polinucleasa termina y no contina la sntesis de la cadena
complementaria. Como nucletido defectuoso suele usarse el dideoxinucletido. El
dideoxinucletido no posee el grupo 3`hidroxilo por lo que no puede enlazarse con el
siguiente nucletido y la sntesis se detiene. La polimerasa necesita un primer, que
se marca con radioactividad o fluorescencia; en la sntesis se utilizan pequeas
cantidades del nucletido defectuoso con lo que la sntesis se ir parando en
diferentes puntos. El resultado, si utilizamos la citosina defectuosa dideoxycitosina,
ser la obtencin de fragmentos de diferente longitud y marcados, terminados en
citosina. Despus de separar los fragmentos en un gel de acrilamida capaz de
diferenciar fragmentos cuyo peso molecular se diferencie en una sola base,
podemos obtener la secuencia complementaria a la cadena que se desea
secuenciar. Al igual que en el mtodo de Maxam-Gilbert tendremos cuatro porciones
en cada una de las cuales utilizaremos un nucletido malo, y cada porcin de
fragmentos de oligonucletidos se correr en una calle diferente. El gel se lee desde
abajo, donde estarn los fragmentos ms pequeos y por lo tanto ms prximos al
extremo 5`, hacia arriba; la secuencia leda directamente del gel ser la
complementaria de la cadena que queremos secuenciar.



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Secuenciacin automtica. La secuenciacin de DNA est realmente automatizada
usando una variante del mtodo de Sanger, en la que los dideoxinucletidos estn
marcados con una cola fluorescente de distinto color. Los cuatro ddNTP se aaden
en el mismo tubo y los fragmentos resultantes se separan por tamao en una
electroforesis capilar (un refinamiento de la electroforesis en gel que es ms rpida).
Todos los fragmentos de un determinado tamao migran por el capilar como un solo
pico y el color asociado a cada fragmento se detecta usando un lser. La
informacin se pasa directamente a un ordenador que determina la secuencia. Esta
tecnologa permite secuenciar miles de nucletidos en pocas horas. El proyecto
genoma humano que acaba de ser completado (Febrero 2001) por la empresa
Celera es el ms ambicioso de los proyectos de secuenciacin que ha secuenciado
35000 genes y unos 3000 millones de pares de bases con esta tecnologa.




Figura 6.

Secuenciacin de cidos
nucleicos. Mtodo de
Sanger.
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Estructura secundaria de los cidos nucleicos
Los diagramas de rayos X realizados a principios de los 50 por Rosalind
Franklin y Wilkins, indican que las molculas de ADN son largas cadenas
helicoidales con dos periodicidades a lo largo de su eje. Su anlisis qumico pone de
manifiesto diversos aspectos. La composicin en bases nitrogenadas es la misma
para todas las clulas de una especie. En los ADN, la proporcin molar de adenina
es siempre igual a la de timina, y anlogamente la proporcin molar de citosina es
equimolar con la de guanina. Por lo tanto el nmero total de bases pricas es igual
al de bases pirimidnicas (Regla de Chargaff). Basndose en estos datos, J. Watson
y F. Crick propusieron un modelo estructural para el ADN. La principal caracterstica
de este modelo es que una molcula de ADN consta de dos cadenas helicoidales de
polinucletidos, que a su vez se hallan enrolladas alrededor de un mismo eje,
formando una doble hlice destrgira de cadenas antiparalelas, como muestra la
Figura 7. Las unidades de desoxirribosa y los grupos fosfato, que forman el
esqueleto de las cadenas polinucleotdicas, constituyen la parte externa de su
estructura, mientras que las bases (parte hidrfoba) se sitan de forma
perpendicular al esqueleto carbonado y se encuentran situadas en su interior.



















Figura 7.

Estructura del DNA. Doble
hlice y disposicin espacial
de los componentes
moleculares del DNA.
cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
102



Las dos cadenas, que forman la doble hlice, estn unidas entre s por puentes de
hidrgeno, entre bases especficas de cada cadena. As, la guanina de una cadena
est siempre unida a la citosina de la otra (a travs de tres puentes de hidrgeno), y
la adenina a la de timina (por dos puentes de hidrgeno), como se muestra en la
Figura 8. Esto explicara el que molculas de ADN con mayor % G+C son ms
difciles de separar en hebras. Debido a la gran longitud de la molcula de ADN,
existen numerosos enlaces por puente de hidrgeno entre las dos cadenas, y
aunque este enlace es dbil, hacen que en conjunto el ADN sea una molcula muy
estable. La disposicin de parte hidrfoba hacia el interior y los fosfatos y ribosas
hidrfilos hacia el exterior tambin contribuye a estabilizar la estructura. Las dos
cadenas son antiparalelas. Una en el sentido 5` 3`y la otra en el sentido 3` 5`.






















Las medidas de la doble hlice son muy concretas y pueden estudiarse por
difraccin de rayos X. La distancia entre las cadenas es constante e igual a 1.9 nm.

Figura 8.

Enlaces entre las bases
del ADN. Puentes de
hidrgeno T-A y G-C.
cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
103
Hay 10.5 nucletidos por vuelta y el paso de rosca son 3.4 nm. Se aprecia un surco
mayor y uno menor.

Este modelo explica bien los procesos de replicacin y transcripcin, y se ha
comprobado experimentalmente su validez, la estructura de Watson and Crick del
DNA se conoce tambin con el nombre de B-DNA y es la estructura ms estable,
pero tambin se han caracterizado otras variantes. Algunas secuencias del ADN
adoptan ciertas estructuras inusuales como los palndromes o regiones o simetra
rotacional.
























Por su parte, las molculas de ARN son monocatenarias y con un nivel de
estructura inferior al ADN. Qumicamente se caracterizan por una menor estabilidad
que el ADN debido al hidroxilo reactivo del C-2 , capaz de esterificar un hidroxilo de
la molcula prxima de fosfato y producir la ruptura de la cadena. La menor
estabilidad se justifica en base a la funcin del ARN, que es una copia de la
informacin contenida en las molculas de ADN, de menor tamao y mayor
movilidad y tiene vida limitada dependiendo del requerimiento de su presencia. Las

Figura 9.

Modelos del ADN.
Diferentes conformaciones
espaciales.
cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
104
estructuras ms definidas corresponden a los ARN transferentes y los ARN
ribosmicos.

Los ARNt pueden representarse esquemticamente en forma de hoja de trbol
(Figura 10). Comenzando por el extremo 5, los ARNt comparten las siguientes
caractersticas:

Un grupo fosfato 5 terminal.
Un brazo de 7 pares de bases que incluye el nucletido 5 terminal y que
contiene emparejamientos de bases que no son del tipo Watson-Crick, como
G-U. Esta estructura se conoce como brazo aceptor o brazo del aminocido.
Una horquilla de 3 4 bases apareadas que acaba en un lazo de cadena
sencilla que contiene frecuentemente la base modificada dihidrouridina (D).
La estructura completa recibe el nombre de brazo D.
Una horquilla de 5 bases apareadas con un lazo que contiene el anticodn,
el triplete de bases que es complementario al codn del ARNm. Esta
estructura recibe el nombre de brazo anticodn.
Una horquilla de 5 bases apareadas en un lazo monocatenario que contiene
por lo general una secuencia T-pseuouridina-C. La estructura se denomina
brazo T.
Todos los ARNt acaban en la secuencia CCA con un grupo 3-OH libre.


















cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Los ARNr son las molculas de nucleicos que constituyen la estructura de los
ribosomas. Todos los ribosomas contienen dos subunidades (Figura 11). Por
razones histricas, los ribosomas intactos y las subunidades se designan por unos
nmeros que describen la velocidad a la que sedimentan cuando se centrifugan. El
ribosoma intacto de E. coli (y de todos los procariotas) se llama ribosoma 70S,
siendo S una medida de la velocidad de sedimentacin, y las dos subunidades que
lo componen, que son distintas en tamao y composicin, se denominan 30S y 50S.
En procariotas, una subunidad 30S est formada por una molcula de ARNr 16S y
por 21 protenas diferentes. Por su parte, una subunidad 50S contiene dos
molculas de ARNr, de diferentes velocidades de sedimentacin (5S y 23S) y 32
protenas diferentes.























Figura 10.

Estructura secundaria de
los ARNt.

Figura 11.

Estructura secundaria de los ARNr.