Universidade Federal do Paran

Departamento de Qumica















BIOTRANSFORMAO

DE COMPOSTOS ORGNICOS

























Brs H. de Oliveira
(bho@ufpr.br)

2012
ii
1. Introduo ...................................................................................................................... 1
1.1. Aspectos gerais ...................................................................................................... 1
1.2. Exemplos ............................................................................................................... 1
1.3. Reviso Qumica Orgnica .................................................................................... 3
1.3.1. Nomenclatura................................................................................................. 3
1.3.2. Estereoqumica .............................................................................................. 3
1.3.3. Mecanismos de reaes orgnicas ................................................................. 3
1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores .................................................... 3
1.4.1. Vantagens de uso de enzimas ........................................................................ 3
1.4.2. Desvantagens do uso de enzimas .................................................................. 4
1.5. Propriedades Enzimticas ...................................................................................... 4
1.5.1. Aspectos Mecansticos .................................................................................. 5
1.5.2. Classificao e Nomenclatura ....................................................................... 7
1.5.3. Coenzimas ..................................................................................................... 7
1.5.4. Fontes de Enzimas ......................................................................................... 7
2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatlise ............................................................ 8
2.1. Introduo .............................................................................................................. 8
2.2. Screening ............................................................................................................... 8
2.3. Metodologia Analtica ........................................................................................... 9
2.4. Exemplo ................................................................................................................. 9
3. Aplicaes Biocatalticas ............................................................................................. 11
3.1. Reaes de Hidrlise ........................................................................................... 11
3.1.1. Hidrlise de Amida ...................................................................................... 11
3.1.2. Hidrlise de steres ..................................................................................... 12
3.1.3. Hidrlise de Epxidos ................................................................................. 17
3.1.4. Hidrlise de Nitrilas .................................................................................... 20
3.2. Reaes de Reduo ............................................................................................ 21
3.2.1. Reduo de Aldedos e Cetonas (Enzimas Isoladas) ................................... 23
3.2.2. Reduo de Aldedo e Cetonas com Clulas ............................................... 25
3.2.3. Reduo de C=C por Clulas ...................................................................... 25
3.3. Reaes de Oxidao ........................................................................................... 26
3.3.1. Oxidao de lcoois .................................................................................... 26
3.3.2. Reaes de Oxigenao ............................................................................... 28
3.4. Formao de Ligaes C-C ................................................................................. 35
3.5. Adio e Eliminao ............................................................................................ 37
3.5.1. Formao de Cianidrina............................................................................... 38
3.5.2. Adio de gua e Amnia........................................................................... 38
3.5.3. Reaes tipo acilona ................................................................................... 39
3.6. Transglicosilao ................................................................................................. 39
3.6.1. Glicosiltransferases ...................................................................................... 40
3.6.2. Glicosidases ................................................................................................. 40
3.7. Halogenao e Desalogenao ............................................................................ 42
4. Tcnicas Especiais ....................................................................................................... 45
4.1. Imobilizao ........................................................................................................ 45
4.2. Enzimas Modificadas e Artificiais ...................................................................... 46
5. Outras Aplicaes ........................................................................................................ 47
5.1. Modelos microbianos de metabolismo de mamferos ......................................... 47
5.2. Derivados Ativos de Drogas ................................................................................ 47

1
BIOTRANSFORMAO DE COMPOSTOS ORGNICOS
1. Introduo

Este resumo se refere disciplina de Biotransformao de Compostos Orgnicos e
foi preparado devido ausncia de textos em Portugus nesse assunto. Seu contedo se
baseia na bibliografia recomendada, mas contm tambm informaes de vrias outras
fontes. Ele pretende apenas ser um guia para o estudante e mais informaes sero
fornecidas nas aulas.
1.1. Aspectos gerais

conceito
importncia: alternativa/auxiliar sntese orgnica; obteno de molculas
quirais;
aplicao industrial: >200 processos (ca. 2% do total de US$ 25 bilhes)
nmero de processos ao longo do tempo (grfico)
1.2. Exemplos

(Ref. Industrial Biotransformations)

Produto Biocatalisador Desde Empresa
Vinagre Bacteria 1823 Varias
L-2-metilamino-1-
fenilpropan-1-ol
Levedura 1930 Knoll AG, Alemanha
L-sorbose Acetobacter
suboxydans
1934 Varias
Prednisolona Arthrobacter simplex 1955 Schering AG,
Alemanha
c. L-asprtico Escherichia coli 1958 Tanabe Seiyaku Co.,
J apo
7-ADCA Bacillus megaterium 1970 Asahi Chemical
Industry, J apo
c. L-mlico Brevibacterium
ammoniagenes
1974 Tanabe Seiyaku Co.,
J apo
D-p-hidroxifenilglicina Pseudomonas striata 1983 Kanegafuchi
Chemical Co, J apo
Acrilamida Rhodococcus sp 1985 Nitto Chemical Ltda,
J apo
c D-asprtico e L-
alanina
Pseudomonas
dacunhae
1988 Tanabe Seiyaku Co.,
J apo
L-carnitina Agrobacterium sp 1993 Lonza, Rep Checa
c 2-ceto-L-gulonico Acetobacter sp 1999 BASF, Merck,
Cerestar, Alemanha

2
a) Esterides


b) Aromas (patchouli)



c) Medicamentos (talidomida)

(R :sedativo; S : teratognico)
d) Outros

O
O
O
OH
OH
O
O
O
OH
O
progesterona
cortisona
11-hidroxiprogesterona
R. arrhizus
P. rubrum
HO
CH
2
OH
HO
HO
lcool patchouli
nor-pathcoulenol
N
O
O
NH
O
O
HO
2
C
C
NH
2
C
H
H
3
C
CH
3
SH
HO
2
C
C
H
C
H
2
N
H
3
C
CH
3
SH
HO
2
C
C
H
H
2
N
NH
2
O
HO
2
C
C
NH
2
H
NH
2
O
R-penicilamina
toxico
S-penicilamina
antiartrtico
R-asparagina
doce
S-asparagina
amarga
3
1.3. Reviso Qumica Orgnica
1.3.1. Nomenclatura

funes orgnicas
regras de nomenclatura
1.3.2. Estereoqumica

Enantimeros e molculas quirais
Importncia biolgica da quiralidade. Ex.: talidomida
Nomenclatura: sistema R-S
Atividade ptica: e.e.
Drogas quirais
1.3.3. Mecanismos de reaes orgnicas

Repr movimentao de e
-

Mecanismos de hidrlise: cat cida e bsica
Mecanismos de substituio: nucleoflica

1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores

1.4.1. Vantagens de uso de enzimas

so catalizadores eficientes
so aceitveis ecolgicamente
atuam em condies brandas
so mutualmente compatveis
no esto limitadas ao papel natural
podem catalizar um grande espectro de reaes
seletividade
quimioseletividade,
regioseletividade
enantioseletividade: feitas de L-aa
4
1.4.2. Desvantagens do uso de enzimas

ocorrem em apenas uma forma enantiomrica
requerem parmetros restritos (pH, temp.)
mostram maior atividade cataltica em gua
so propensas inibio
podem causar alergias

Enzimas Isoladas X Clulas Inteiras

Biocatalizador Forma Pros Contras
Enzima isolada Qualquer ap. Simples, elab.
Simples, melhor
produtividade
reciclagem de co-fator
dissolvida em
gua
alta atividade enzimtica reaes colaterais, subst.
lipofil. insolveis, elab.
requer extrao
suspensa em
solv. Orgnico
fcil de realizar, elab.
fcil, subst. lipoflicos
solveis, fcil rec. da
enzima
baixa atividade
Imobilizada fcil recuperao da
enzima
perda de atividade durante
a imobilizao
clulas inteiras Qualquer desnecessrio reciclar co-
fatores
equip. caro, elaborao
tediosa, baixa produt.
(menor tolerncia
concentrao), baixa
tolerncia a solv. org.,
reaes colaterais
cultura em
crescimento
maiores atividades mais biomassa, mais sub-
produtos, processo difcil
de controlar
clulas em
repouso
elaborao mais fcil,
menos sub-produtos
menores atividades
clulas
imobilizadas
clulas reutilisveis menores atividades

1.5. Propriedades Enzimticas

grupos hidroflicos externos (-COOH, -OH, -NH
2
, -SH, -CONH
2
)
grupos lipoflicos internos
pontes disulfeto

5
inativao:
rearranjo da cadeia peptdica (comea a 40-50
o
C); reversvel
hidrlise; irreversvel
troca de pontes disulfeto
reaes de eliminao e oxidao
enzimas termoestveis (microorganismos termoflicos)
1.5.1. Aspectos Mecansticos

a) Mecanismo Chave e Fechadura (Fisher, 1894)



Problemas: substratos de pequeno volume; substratos no-naturais

b) Mecanismo Encaixe Induzido (Koshland J r., 1960s)



6
c) Teoria Desolvatao e Solvatao-Substituio
Desolvatao (Dewar,1986)
substrato substitui gua no stio ativo
reao tipo fase gasosa
Solvatao-substituio
gua de solvatao do substrato substituida pelo stio ativo

d) Regra de Atracagem de Trs Pontos

e) Razes Cinticas para a Seletividade

7
1.5.2. Classificao e Nomenclatura

IUB: 3.000 enzimas (de 25.000)
atividade cataltica: 1 U.I. =1 mol de substrato transformado/min.
enzimas disponveis comercialmente
EC A.B.C.D
A: principal tipo de reao
B: subtipo indicando tipo de substrato
C: natureza do co-substrato
D: nmero da enzima especfica
Ex.: -glucosidase (EC 3.2.1.21) de amndoa; 20-40 unidades/ mg de
slido

Classe Nmero Tipo de reao Utilidade*
classific. dispon.
1.
oxidoredutases
650 90 oxidao-reduo +++
25%
2.
transferases
720 90 transferncia de grupos +
5%
3.
hidrolases
636 125 hidrlise/formao de
vrias funes
+++
65%
4.
liases
255 35 adio/eliminao de
pequenas molculas
++
5%
5.
isomerases
120 6 isomerizao

5%
6.
ligases
80 5 formao/clivagem de C-
O, C-S, C-N, C-C

1%

(*) +++: muito til; =pouco uso; %: percentagem de pesquisa no perodo 1987-96
1.5.3. Coenzimas

NAD/NADH; NADP/NADPH; ATP; acetil-CoA
1.5.4. Fontes de Enzimas

indstria de detergentes e alimentos: proteases e lipases
fontes animais: rins, fgado, pncreas
fontes microbianas: colees de cultura; natureza
8
2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatlise





2.1. Introduo

necessidade de novas enzimas
novas molculas quirais
substituio de processos qumicos
processos ecolgicamente corretos
2.2. Screening

fontes de enzimas
solo: 10
9
clulas/g
gua
vegetais (endofticos): ex. GA
3

isolamento no seletivo: solo seco, abs esponja, agar, incubao (temp
variadas).
isolamento seletivo: pr-tratamento do solo; ad antibitico; meio seletivo.
9
2.3. Metodologia Analtica

Importncia
Mtodos fsico-qumicos: ccd, clae, cg
Bioensaios (clulas animais, microbianas, enzimticos)
HTS (high-throuput screening)
2.4. Exemplo

Biotransformao de Esteris. Brs H. de Oliveira e Deise D. Bueno,
Qumica Nova 19 (3), 233-6 (1996).

Importncia de substncias esteroidais: hormnios, antiinflamatrios,
anticoncepcionais, etc.
Matrias-primas; intermedirios


O
O
Androstenodiona
HO
-Sitosterol
O
O
HO
Diosgenina
O
O
Progesterona


amostras de solo e de sementes de soja em meio lquido contendo colesterol
como nica fonte de C; 7 dias
alquota para novo frasco contendo o mesmo meio; processo executado por
um total de 15 vezes.
Crescimento microbiano em todos os frascos
Seleo: meio c/ colesterol dosagem

10
TABELA 1- Degradao de Colesterol por Microorganismos Provenientes da
Amostragem 1. (S =amostra de semente; So=amostra de solo). Concentrao
inicial de colesterol =200 mg%

Amostra Colesterol
Degradado
(%)
10 (S)(*) 53,02
25 (S) 50,92
8 (So) 48,82
14 (S) 47,98
7 (S) 38,76
. .

(*) amostra utilizada nos experimentos de degradao do -sitosterol

Transferncia p/ meio slido
Isolamento: bactria Gram +
Experimento preparativo com sitosterol
Extrao com solvente
Isolamento cromatogrfico de androst-4-eno-3,17-diona

O
O
androst-4-eno-3,17-diona


11
3. Aplicaes Biocatalticas

3.1. Reaes de Hidrlise

Hidrlise qumica: mecanismo
2/3 do total da pesquisa
aspectos mecansticos: serina hidrolases
trade cataltica: importncia

C OR
2
R
1
O
N
N
H
His
R
2
OH
O O
-
Asp
O
H
Ser
O O
H
Asp
N
N
H
His
O
C
O
R
1
Ser
C OH
R
1
O
O H
H
enzima
acilada


3.1.1. Hidrlise de Amida

Ligao amida
Importncia: qumica de aa e peptdeos
Mercado de aa: >0,5 milho toneladas/ano (US$ 2 bilhes)
Adoantes no-calricos: aspartame (Asp, Phe)
Rotas enzimticas p/ aa enantiomricamente puros:

12
R CO
2
R
1
NHR
2
R CO
2
H
NH
2
R CO
2
H
O
CO
2
H
R
hidrolase (res)
liase (ad NH
3
)
desidrogenase
(aminao redut)



Resol por hidrolases: proteases, esterases ou lipases

3.1.2. Hidrlise de steres

Ligao ster: hidrlise
Esterases, proteases e lipases
3.1.2.1. PLE ( Pig Liver Esterase )

verstil, substrato-tolerante, barata
Ex.: prostaglandinas


CO
2
Me
CO
2
Me
OH
PLE
CO
2
Me
CO
2
H
OH
e.e. 98%

O
COOMe
OH
HO
O
COOH
OH
HO
PLE
13
3.1.2.2. Esterases microbianas

S
S
CO
2
OAc
t-Bu
S
S
CO
2
OH
t-Bu
S
S
CO
2
OAc
t-Bu
Bacillus sp
e.e. 94%
+




CO
2
Me R
carboxilesterase
NP
Bacillus subtilis
R=Aril-
R=Aril-O-
CO
2
H Ar
CO
2
H ArO
CO
2
Me Ar
CO
2
Me ArO
+
+
e.e. >95%
e.e.>87%



Ex.: analgsicos, antiinflamatrios

CO
2
H CO
2
H
MeO
Ibuprofeno Naproxeno




Otimizao da seletividade
Modificao do substrato
Variao do sistema de solvente
Variao do pH

OAc
OAc
OH
OAc
PLE
Meio e.e. (%)
H
2
O 55
H
2
O/DMSO 6:4 72
H
2
O/DMF 8:2 84
H
2
O/t-BuOH 9:1 96

14
3.1.2.3. Lipases

Hidrlise de triglicerdeos
Importante em: processamento de alimentos e prep de intermedirios quirais
Pode hidrolisar e formar lig ster
Diferena lipase X esterase: interao c/ substrato

Mecanismo: -hlice (tampa) aberta quando em contato c/ bifase leo-
gua
Seletividade

VOLUMOSA pequena
Molcula do Substrato
Lipase de Candida sp
Lipase de Aspergillus sp
Lipase de Pseudomonas sp
Lipase de Mucor sp


Lipase pancretica de porco (PPL)
A mais barata
Preparao bruta (pacreatina, esteapsina)
Outras hidrolases presentes (-quimotripsina, colesterol esterase,
fosfolipases, etc.)
Alta seletividade pode ser devida s impurezas

15
AcO HO OAc
+
hidrolase
rac


Enzima V Reao Seletividade
(razo enantiomrica)
PPL bruta Boa >300
PPL pura No reage -
-quimotripsina No reage -
Colesterol esterase Rpida 17
Hidrolase nova Boa 210

Lpases de Candida sp
C. lipolytica, C. antartica (CAL), C. rugosa (CRL)
C. rugosa: aceita steres volumosos (p.ex. de lcoois sec. cclicos)
OAc
CO
2
Et
OH
CO
2
Et
OAc
CO
2
Et
O
CO
2
Et
O
CO
2
Et
CRL
principal
e.e.=77%
e.e. >99% traos


Lpases de Pseudomonas sp (PSL)
P. fluorescens, P. aeruginosa, P. cepaceae , P. glumae
No aceitam steres volumosos

16
Ar
S S
(CH
2
)n (CH
2
)n
CO
2
Me MeO
2
C
Ar
S S
(CH
2
)n (CH
2
)n
CO
2
H MeO
2
C
PSL
n e.e. (%)
1 48
2 >98
3 79


Lpases de Mucor sp (MSL)
M. miehei, M. javanicus
M. miehei : operador qumico Asp-His-Ser (similar outras lpases)

O
R
O
O
R
O
O
O
R
OH
R
O
O
lipase


Lipase R Solvente e.e. (%)
CRL H tampo 12
PSL H tampo 81
MSL H tampo >99
MSL Me tampo >99
PPL Me tampo 20
PPL Me tampo/hexano 85

Outras Lipases: microbianas


AcO
OMe
O
Me
OH
OMe
O
Me
AcO
OMe
O
Me
+
lipase
Aspergillus sp.
17
3.1.3. Hidrlise de Epxidos

Epxidos: estrutura, preparao, importncia (intermedirios p/ sntese de
compostos bioativos)
Sntese assimtrica/resoluo: no disponvel (exceto mtodo Sharpless
lcoois allicos)
Epoxidao microbiolgica: possvel mas tcnicamente difcil (eng. Processo)
Hidrlise qumica: mecanismo cat cida e bsica
Epxido Hidrolases (EH): mais teis que epoxidases; metabolismo de
alquenos e aromticos
O
procariotas
eucariotas
di-oxigenase
mono-oxigenase
dioxetano
epxido
redutase
EH
R
R
O
O
R
OH
OH
R
OH
OH
R


Epxidos como agentes alquilantes: txicos, cancergenos, teratognicos
Epxido Hidrolases Hepticas: CEH (citoslica); MEH (microsomal)
MEH
mais ativa e seletiva com epxidos no-naturais
fgado de porco, coelho, rato, camundongo, etc.
Sobrenadante 9000 g de homogenato de fgado
Mecanismo de ao

18
O O
-
Asp
O
O O
-
Asp
OH
HO
N
N
H
His
O O
OH
Asp
H O
H
Tir
O
H
N
N
H
H
His


Influncia pH?
Subst Asp por Ser (mutao): que acontece?
resoluo cintica de epxidos assimtricos

O
R
OH
-
OH
-
reteno
inverso
O
R
O
R
EH
HO
HO
R
HO
HO
R
+
+


substratos para MEH
cadeias lipoflicas prximas ao oxirano maior atividade
grupos polares prximas ao oxirano efeito inibidor
fatores estricos
fatores eletrnicos (eletronegatividade)

O
R
O
R
1
R
2
O
R
1
R
2
O
R
1
R
2
R
3
O
R
1
R
2
R
3
R
4
> >
>

19



R
X
MEH
tampo
R
HO
HX




X V reao
O Rpida
NH, N-CH3 Lenta
S No ocorre

EN O>N>S
Epxido Hidrolases Microbianas: convenincia p/ uso industrial;
escalonamento
Ex.: prep de hormnio juvenil (insetos)

OH
O
O
OH
OH
OH
OH
Helmintosporium
sativum
+



20
Ex.: derracemizao de xido de estireno

O
O
O
O
CH
2
OH
OH
CH
2
OH
OH
CH
2
OH
OH
B.s
A.n.
A. niger
B
. s
u
lfu
re
s
c
e
n
s
+
+
(ret.)
(in
v
.)
A. niger +
B. sulfurescens
98 % e.e.
83 % e.e.
89 % e.e., 92 % rend.
96 % e.e. 51 % e.e.


3.1.4. Hidrlise de Nitrilas

R-CN; H-CN
Nitrilas naturais: reserva de N; defesa
N
N
N
NH
2
CN
ribose
CN
O
R
1
R
2 glucose
N
OMe
CN
O
toiocamicina
(antibiot.)
glicosdeos cianognicos
(mandioca)
ricinina
(mamona)


Hidrlise qumica: mecanismo
Caminhos possveis p/ hidrlise enzimtica

R C N
R C
O
OH
+ NH
3
R C
O
NH
2
nitrila hidratase
amidase
nitrilase


RCO
2
H e NH
3
: alvos para screening
Nitrilase: mecanismo
21

R C N
R C
NH
S Enz
+ Enz-SH
H
2
O
R C
NH
2
S Enz
O
H
R C
O
S Enz
H
2
O
R C
O
S Enz
O
H
R C
O
OH
NH
3
+ Enz-SH

AA contendo SH:
Exemplo:

O
NH
2
N N
C
N
Rhodococcus rhodochrous
o-: picolinamida (977 g/l)
m-: nicotinamida (1465 g/l)
p-: isonicotinamida (1099 g/
(nitrila hidratase)


Importncia da nicotinamida: NAD, NADP, etc.


3.2. Reaes de Reduo

22

conceito
desidrogenases
co-fatores: NAD(H); NADP(H)
reciclagem de co-fatores
enzimas isoladas X clulas inteiras

desidrogenase
cofator-H2 cofator
Substrato Substrato reduzido
sistema de
reciclagem
23
3.2.1. Reduo de Aldedos e Cetonas (Enzimas Isoladas)

Reduo qumica: NaBH
4
; LiAlH
4
; produtos racmicos
desidrogenase lcool de levedura (YADH)
desidrogenase lcool de fgado de cavalo (HLADH)
Regra de Prelog

O
P
G
OH
P
G
[H
-
]
NAD(P)H NAD(P)
desidrogenase


YADH: muito especfica; aldedos ou metilcetonas; prep lcoois quirais
secundrios
HLADH (fgado de cavalo):
baixa especificidade
estrutura conhecida; R-X; dmero
red. De cetonas cclicas (4-9C)
Ex.:


TBADH (Thermoanaerobium brockii)
Termoestvel ( 85 oC)
Tolera solventes orgnicos
Ex.:
R
1
R
2
O
R
1
R
2
OH
R
1
R
2
OH
TBADH
rec. NADPH
ou


O
O
H
H
1 3
6
O
O
H
H
1 3
6
+ O
HO
H
H
1 3
6
HLADH
recicl.
NHADH
24

HSDH (Hidroxiesteroid)
Substrato natural: esterides
Ex.:
O
R
1
R
2
HO
R
1
R
2
O OH
O
R
1
R
2
+
rec. NAD(P)H
R
1
=R
2
=H
TBADH ou
HSDH
HSDH
R
1
,R
2
=Me, Cl
+



R
1
R
2
Enzima e.e. lcool
(%)
H H HSDH <10
H H TBADH >95
H Cl HSDH >90
Cl Cl HSDH >95
Me Cl HSDH >98
Me Me HSDH >95

Substratos preferidos pelas desidrogenases:

O
R
H
O
R
1 R
2
R
O
O
YADH
HLADH
TBADH
HSDH
O
O
O


25

3.2.2. Reduo de Aldedo e Cetonas com Clulas

Vantagens: co-fator
Desvantagens: baixa produtividade (transporte, rec produto, instabilidade
gentica do microorganismo)
Saccharomyces cerevisae
O mais usado; facilidade de manuseio
Primeira reviso: 1949!
Cetonas alifticas e aromticas simples: Prelog
Cadeias longas ou volumosas: no aceita
Comportamento divergente: diferentes DHs com preferncias
estereoqumicas opostas
Ex.:



Outros microorganismos redutores de cetonas
Geotrichum candidum
Sporotrichum exile
Mucor ambiguus

3.2.3. Reduo de C=C por Clulas

Hidrogenao qumica
Enoato redutases: Clostridia, Proteus, S. cerevisae, Beauveria sulfurescens
Adio trans de H
Ativao: facilitar ataque de H
-

Ativadores: cidos, steres, lactonas, cetonas, aldedos ,- insaturados

R
1
OR
2
O O
R
1
OR
2
OH O
S. cerevisae
R
1
OR
2
OH O
ou
26
Ex.:
R
CO
2
H
Cl
R
Cl
CO
2
H
enoato redutase
S. cerevisae
Cl
CO
2
H
R
enoato redutase
S. cerevisae
R
CO
2
H
Cl



R
Cl
O
R
Cl
O
S. cerevisae
rpida
S. cerevisae
lenta
R
Cl
OH
R
Cl
OH
+
major.

3.3. Reaes de Oxidao

Importncia
Problemas de mtodos qumicos: metais, inespecificidade (rgio, estreo)

3.3.1. Oxidao de lcoois

Mtodos qumicos: exemplos
Mtodos enzimticos: pouco usados
Termodinmicamente desfavorvel, recicl cofator dificultada
Inibio pelo produto (- polar)
pH timo 8-9: co-fator e produtos instveis
oxid lcool secundrio: destruio de quiralidade
Oxidao regiosseletiva de poliis
Carboidratos

27
Ex.:



O
O
OH OH
HO
OH


Assimetrizao de diis proquirais ou meso

OH
OH
R
R
OH
R
R
H
O
HLADH
recicl NAD+
O
R
R
OH
O
R
R
O
HLADH
recicl NAD+
exp.
meso




CH
2
OH
C
C
C
C
CH
2
OH
O
H HO
OH H
H HO
Acetobacter
suboxidans
CH
2
OH
C
C
C
C
CH
2
OH
OH H
H HO
OH H
OH H
CHO
C
C
C
C
CH
2
OH
OH H
H HO
OH H
OH H
Sorbitol
Sorbose
cido L-ascrbico Glicose
HO
O
C
O
C
C
C
C
CH
2
OH
HO
H
H HO
28
HLADH
recicl NAD+
HLADH
recicl NAD+
exp.
R
OH
OH
R
OH
O
H
O R
OH
O R
O


3.3.2. Reaes de Oxigenao

Oxidao qumica de HC: ativados (ex. oxid allica por SeO
2
) e no-ativados
(difcil, no-especfica)
Importncia
Oxigenases

Mono-oxigenases
Sub + DoadorH
2
+ O
2
SubO + Doador + H
2
O
rec. co-fator




Dioxigenases
Sub + O
2
SubO
2



Oxidases
O
2
+ 2e
-
O
2
2-
H
2
O
2
+2H
+
2H
2
O
2O
2
2-
O
2
+ 4e
-
+4H
+



29
Mono-oxigenases
Maioria ligada a membrana
Ativao do O2: comum a todas
Tipos de substratos/produtos
Sub + O
2
+ H
+
+ NAD(P)H SubO + H
2
O + NAD(P)
+
mono-oxigenase



C H C OH
R
R
O
Rn-X
Rn-X=O X=N, S, Se, P
H OH
R
1
R
2
O
R
1
O
O
R
2




Citocromo P-450: grupo +comum de MO; hemeproteina; detoxificao;
mesma seq 26 aa prox heme
Ciclo cataltico: ~oxid qumica com metais


30
Fe
3+
S
O
N
N
N
N
H H
e
-
O
2
Fe
3+
S
N
N
N
N
O
O
Sub
e
-
Sub
Fe
3+
S
N
N
N
N
O
O
H
2
O 2H
+
Fe
4+
S
N
N
N
N
O
Sub
Sub
Fe
5+
S
N
N
N
N
O
H
2
O
SubO
Sub H
2
O Sub
Fe
2+
S
N
N
N
N
Fe
3+
S
N
N
N
N
Sub


1. Acoplamento do substrato ao stio ativo
2. Red Fe
3+
>Fe
2+
(e
-
de NADP[H] ou outro co-fator (Fe
2+
mais reativo)
3. Ligao de O
2

4. Recep e
-
>enfraquecimento de ligao O-O
5. Sada de O na forma de gua: formao de nuclefilo forte
6. Ataque do O ao Sub; subst Sub oxidado pela H
2
O

MO dependente de flavina:
Co-fator: flavina
Substratos: aldedos, cetonas; produtos: steres
Ciclo cataltico de MO: ~oxid qumica com perxidos/percidos


H
O O
R
R
1
OR
2
O
R
1 R
2
O
HO
O
R
R
1
R
2
O
Bayer-Williger


31


O
2
Sub
N
N
NH
N O
O
NADPH NADP
+
(Enz-FAD)
N
N
NH
N O
O
H
H
(Enz-FADH
2
-Sub)
N
N
NH
N O
O
H O
HO
(Enz-FAD-4a-OOH-Sub)
N
N
NH
N O
O
H
OH
(Enz-FAD-4a-OH-SubO)
SubO + H
2
O
N
N
NH
N O
O
H O
O
O
N
N
NH
N O
O
H O
O
O
O
O



Hidroxilao de Alcanos
Funcionaliz em pos no-ativadas: poucas alternativas em Q.O.
Reativ relativa: 2
o
>3
o
>1
o
.
Hidroxil esterides



F. verticilloides
CH
2
OH
Limoneno lcool Perlico
32






Hidroxilao de Comp Aromticos
Hidrox regioespecfica difcil por via qumica
Monooxigenases: hidrox em o- e p-; via epxido
Polifenoloxidases (tirosinase): fenol ->catecol ->o-quinona ->
polimerizao
R
OH
R
OH
OH
O
2 H
2
O
polifenol
oxidase
O
2 H
2
O
polifenol
oxidase
R
O
O




R.arrhizus
CO
2
H
O
CO
2
H
O
OH



O
CO
2
H
OH
O
CO
2
H
OH
O
CO
2
H
F. verticilloides
+
P. chrysogenum
CO
2
H
O
CH
2
OH
CO
2
H
O
33
Mecanismo





Ex.: L-dopa (3,4-diidroxifenilalanina); L-epinefrina (adrenalina)

HO
HO
OH
NHCH
3
adrenalina
HO
HO
COOH
NH
2
H
L-3,4-diidroxifenilalanina
(L-DOPA)



Uso de microorganismos; Ex.
N
CO
2
H
O N
OH
Cunninghamella
echinulata
Pseudomonas sp
N
CO
2
H
HO
O N
OH
HO
cido 6-hidroxinicotnico
prenalterol (>85%)
(100 %)



34
Epoxidao de alquenos
Epxidos quirais: intermedirios sintticos de alto valor
Mtodos qumicos
Epxidos pequenos e no-funcionalizados: obteno difcil por via qumica
Monooxigenases: no usadas em escala preparativa; co-fator; natureza
complexa
Clulas: uso de meio bifsicos; minimizao efeito txico do produto
Ex.:
R
1
H
R
2
R
1
R
2
O
microorganismo
O
2
Pseudomonas oleovorans
Corynebacterium equi
Mycobacterium sp
Xanthobacter sp
Nocardia sp



Reaes de Baeyer-Villiger
Mtodo qumico: ster ou lactona


MO dependente de flavina
Uso de clulas
Acinetobacter sp, Pseudomonas sp (algumas patognicas)
Risco de hidrlise do produto: inibidores (p-nitrofenilfosfato de etila =
paraoxon); mutantes no-hidrolticas
Ex.:
O
R
O
R
O
O
R
Acinetobacter sp
+




Diidroxilao de aromticos
Importncia ecolgica
Obteno de glicis quirais
35
Pseudomonas sp


R
O
O
R
di-oxigenase
O
2
R
OH
OH
redutase
H
2
R
OH
OH
diidrodiol
desidrogenase
NAD(P)H NAD(P)
+


3.4. Formao de Ligaes C-C

reaes do tipo aldlicas: mecanismo

sntese de imina: mecanismo
R
1
R
2
NH
R
1
R
2
O
NH
3
C
OH
NH
2
R
2
R
1

aldolases
substratos: carboidratos, aa, hidroxicidos
adio 1, 2 ou 3C
2 grupos
Aldolase tipo I
Plantas superiores e animais
Co-fator: no requer
Mecanismo
CH
3
CHO CH
3
CHCH
2
CHO
OH
OH
-
, H
2
O
5
o
, 4-5 h
aldol
36
H
2
O
-Enz-NH
2
H
O R
1
R
N
R
1
X
OH
Enz
R
O
R
1
X
OH
R
X
N
Enz
H
Enz-B
Enz-NH
2
-H
2
O
R
X
N
Enz
H H
X=H, OH, NH
2
R
X
O
base
Schiff
enamina


Aldolase tipo II
Bactrias e fungos
Dependente de Zn2+
Mecanismo
Receptor:
Doador:
R
O
X
H R
1
O
R
O
-
X
H R
1
O
N N
Enz
H
Zn
+2
R
1
OH
R
X
O



Obs.: remoo inicial de H
+
do doador por uma histidina


37
Exemplo: anlogos nitrogenados de acar (anti-HIV)



3.5. Adio e Eliminao

Liases:
adio de H
2
O ou NH
3
a alquenos;
adio de HCN a C=O

PO OH
O
+
H
O
N
3
OH
aldolase
FDP
PO
O
N
3
OH
OH
OH
PO
O
N
3
OH
OH
OH
+
1) fosfatase
2) H
2
/Pd
1) fosfatase
2) H
2
/Pd
NH
OH
OH
OH
HO
NH
OH
OH
OH
HO
deoxinojirimicina
deoximanojirimicina
38
3.5.1. Formao de Cianidrina

Cianidrinas: estrutura; sntese qumica: aldedo/cetona +HCN
Importantes intermedirios em qumica orgnica

R CN
OH
vrios produtos


sntese enzimtica: oxinitrilases
Ex.: (prioridade R >R)

R' R"
O
R' R"
CN HO
R' R"
OH NC
HCN
R-oxinitrilase
S-oxinitrilase


fontes:
(R)-oxinitrilases: famlia Rosaceae (amndoa, ameixa, pssego)
(S)-oxinitrilases: Sorghum bicolor (sorgo), Hevea brasiliensis (seringueira),
Ximenia americana (sndalo), Manihot esculenta (mandioca).
Problemas: uso de HCN transcianao (acetona cianidrina)

3.5.2. Adio de gua e Amnia

Fumarase: ad gua a C=C

C C
X
HOOC
COOH
H
C C
X
HOOC
COOH
OH
H H
X=H (ac. fumrico), Cl
X=H (ac. mlico)
fumarase
H
2
O


Influncia da e.n. de X.
3-metilaspartase: ad amnia a C=C
39

C C
X
HOOC
COOH
H
C C
X
HOOC
COOH
NH
2
H H
X=H, Cl, Me, etc.
NH
3
3-metilaspartase


3.5.3. Reaes tipo acilona

Qumica: mecanismo
Biocataltica: sntese da efedrina

Ph H
O
H
3
C CO
2
H
O
Ph
OH
O
+
S. cerevisae
(descarboxilase
de piruvato)
CO
2
aciloina
Ph
OH
NH
CH
3
(-)-efedrina
MeNH
2
H
2
/Pt

3.6. Transglicosilao

oligossacardeos e polissacardeos: migrao intracelular e excreo de
glicoproteinas; interaes clula-clula; oncognese; interao da superfcie
celular com patgenos
sntese qumica de carboidratos difcil
biocatlise atraente: glicosil transferases; glicosidases


40
3.6.1. Glicosiltransferases


requer acar ativado (UDP-acar)
3.6.2. Glicosidases

independem de co-fatores
endo e exo-glicosidases
hidrlise reversa
transglicosilao
usos: celulose >glicose >etanol


41

Exemplo glicosilao de diis:


Exemplo hidrlise do esteviosdeo:
OGG
CO
2
G
OH
CO
2
H
esteviosdeo
esteviol
pectinase


Exemplo glicosilao do esteviosdeo (veja artigo J .Biotechnology, 2006):

+
esteviosdeo
OGG
CO
2
G
OGG
CO
2
G
G
rebaudiosdeo
glicosidases de
Fusarium sp maior proporo
de rebaudiosdeo


42
Mecanismo lizozima (Nature Structural Biology 8, 737 - 739 (2001)
doi:10.1038/nsb0901-737): NAG=N-acetilglicosamina.




3.7. Halogenao e Desalogenao

Introduo
Cerca de 1000 PN halogenados
Importncia: diazepam, mitotano
CH
CHCl
2
Cl
Cl
mitotano
N
N
O
CH
3
Cl
diazepam

Derivados de Cl (terrestres) e Br (marinhos) mais comuns
Algas marinhas: lib 10
7
ton bromoalcanos
Toxicidade de haloalcanos

Halogenao
Qumica
Haloperoxidases: nico tipo isolado
43
Cloroperoxidase de Caldariomyces fumago; bromoperoxidase de
Pseudomonas aureofaciens; iodoperoxidase de raiz forte (Armoracia
lapathifolia)
Substrato +H
2
O
2
+X
-
+H
+
Produtos halogenados +2H
2
O

1. Halogenao de Alquenos

X +
haloperoxidase
HOX ou X
2
OH
X
Y
X
OH
-
Y
-
O
-
O
O
O
X
n



I
OH
OH
I
cloroperoxidase
I
-
, H
2
O
2
+
9 : 1



Halogenao de alquinos

CHCl
2
O
Cl
O
Cl
+
1 : 2 : 0,3
CH
3
C CH
cloroperoxidase
Cl
-
, H
2
O
2
Cl
O
+


Halogenao de Compostos Aromticos
NH
2
Cl
NH
2
Cl
Br
cloroperoxidase
Br
-
, H
2
O
2



44
Halogenao de Grupos C-H
cloroperoxidase
Cl
-
, H
2
O
2
O O
O O
Cl


Desalogenao

Importncia ambiental: biodegradao (pesticidas, solventes, etc.)
Mtodo qumico
Halohidrina Epoxidases
Fontes: bactrias (Flavobacteria, Corynebacteria, Pseudomonas),
fungos (Caldariomyces fumago), algas (Laurencia pacifica)

X HO
haloidrina epoxidase
O
+ HX


2. Desalogenases: Sn X OH (indep de co-fator); influncia da
natureza de RX (1
o
., 2
o
. 3
o
.)

O O
-
Asp
C X
R
H
H
O O
-
O O
CH
2
R
O H
H
N
N
H
His
N
N
H
N
N
H
H
RCH
2
OH
Asp Asp


3. Ex.: (S)-2-cloropropinico (sntese de anti-inflamatrios e herbicidas)

CO
2
H
Cl
CO
2
H
OH
CO
2
H
Cl
desalogenase
(P. putida)
+
e.e. >98%

45
4. Tcnicas Especiais
4.1. Imobilizao

aderncia da enzima a um suporte slido ou confinamento
reutilizao da enzima
tcnicas
adsoro (van der Waals, inica, lig. H)
ligao covalente
ligao cruzada
confinamento em gis
confinamento em membranas

46

4.2. Enzimas Modificadas e Artificiais

enzimas solveis em solventes orgnicos (mod. PEG)
bio-imprinting
enzimas semi-sintticas
anticorpos catalticos


O
O
Ph
OH
R
OH
+
-
O
OPh
R
O
O
R
O
P
O
OPh
R
+ PhOH
47
5. Outras Aplicaes

5.1. Modelos microbianos de metabolismo de mamferos

Importncia
Exs.:


5.2. Derivados Ativos de Drogas

Importncia
Exs.:


N
N
O
CH
3
Cl
diazepam

N
O
O
F
O
S16924 (Servier)
Antipsictico
Cunninghamella echinulata
Mucor plumbeus
Metablitos
O
O O
OCH
3
OH
OH
21
O
O O
OH
OH
21
Galbanoldeo A Galbanoldeo B
Potentes antifngicos (Merck)
Streptomyces halstedii
21-OH
48
Bibliografia

K. FABER. Biotransformations in Organic Chemistry - A Textbook, 5
th
ed.
Springer, New York, 2004. (Terceira edio disponvel na Biblioteca de
Tecnologia e na de Biolgicas, 660.634 B617).
A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey. Industrial Biotransformation, Wiley,
Weihheim, 2000. (660.63 L721i). (Disponvel na Biblioteca de Tecnologia).
A.L. DEMAIN and J .E. DAVIES. Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 2
nd
Edition, American Society for Microbiology,
Washington,1999. (660.62 M294i)
P. PRAVE, U. FAUST, W. SITTING, D.A. SUKATSCH. Fundamentals of
Biotechnology, Editora VCH, Federal Republic of Germany, 1987.
Q. H.G. Davies, R.H. Green, D.R. Kelly, S.M. Roberts. Biotransformations in
Preparative Organic Chemistry, Academic Press, New York, 1989. (547.2
B615).
R. H.-J . Rehm, G. Reed and A. Puhler (Ed.). Biotechnology, 2
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ed. Weinheim :
VCH, 1993- Biotransformations, Vol 8a, 8b (660.6 B616).