describir el proceso de introduccin de genes dentro de un organismo eucaritico, principalmente un eucarionte inferior, tal como lo es la levadura. La razn por la que se escoge este tipo de organismo y no otro radica en que no siempre una bacteria es un hospedero adecuado para producir una protena, bsicamente porque la protena codificada por el gen que queremos expresar, posee modificaciones post- traduccionales las cuales en una bacteria no se pueden realizar, por ejemplo glicosilaciones, esta es una modificacin bastante extendida en protenas eucariontes y que no puede ser realizada por una bacteria. Entonces una alternativa es transferir el gen a expresar a clulas de levadura que puedan realizar dichas modificaciones. Para este propsito se usa un vector distinto que el que se usa tradicionalmente cuando se manipulan bacterias, a pesar que las caractersticas bsicas del vector van a ser prcticamente las mismas, las cuales son: Primeramente un origen de replicacin, este elemento es absolutamente imprescindible el origen de replicacin es una molcula de DNA que va a permitir que la construccin gentica que est dentro de la clula pueda propagarse en forma estable (divisin estable). Este debe replicarse cada vez que la clula se divida as las clulas hijas van a tener la construccin gentica en su interior. En este caso el origen de replicacin lo debe de un elemento de un plasmidio de 2 micrones el cual es un origen de replicacin especfico para levadura. Se debe recordar que en el caso de un plasmidio bacteriano se va usar el origen de replicacin que se llama Cole 1 que funciona en E.Coli. Como segundo requisito debemos tener un gen marcador el cual va a permitir distinguir entre clulas trasformadas, es decir adoptaron la construccin gentica desde afuera y aquellas que no lo hicieron. Ya que todos estos procesos tienen un porcentaje de eficiencia relativamente bajo, al incubar esta construccin gentica con las clulas de levadura, solo una pequea fraccin de ellas se va a trasformar, al ser solo estas las de inters debo eliminar las clulas no trasformadas y ah radica el rol de este marcador. Recordando el caso bacteriano ese gen marcador es usualmente la resistencia a algn antibitico, principalmente ampicilina y en ese caso cuando el vector ingresa a la clula bacteriana la clula se hace resistente a la ampicilina y de esa forma la puedo seleccionar, pero en este caso no tengo esa posibilidad porque la levadura es naturalmente resistente a antibiticos sin embargo lo que se va a hacer es utilizar unas cepas de levadura que son las que se llaman Auxotrofos, la cuales son clulas de levadura que tienen mutaciones en su genoma. En este caso puedo usar un mutante que se llama URA3 - , en esta cepa no funciona un gen que codifica una enzima para la sntesis de uridina, en consecuencia este mutante no puede sintetizar uridina y como no sintetiza uridina no puede sintetizar UTP y por lo tanto no puede sintetizar RNA. Si a esta levadura la coloco en un medio de cultivo que se le llama medio mnimo que contiene una fuente de fosfato (NaH 2 PO 4 /Fosfato Monosdico), glucosa como fuente de carbono y una fuente de nitrgeno (NH 4 Cl/Cloruro de Amonio), esa levadura no va a crecer, porque en este medio no hay uridina y la levadura no tiene como sintetizarla. Otro mutante que se usa habitualmente es un mutante de Leu2 - y en este caso el concepto es el mismo pero el gen que est afectado se ubica en una enzima que codifica para la ruta de biosntesis
de leucina, por ende en esta zona no se realiza este proceso, esta levadura mutante tampoco crece en un medio que carezca de leucina. Al usar el primer tipo de mutante como receptor en un experimento de transformacin entonces puedo colocar el gen URO3 normal y usarlo como marcador, lo colocar en una secuencia de DNA obtenido a travs de RNA mensajero que no contiene secuencias intrnicas, agregar adems una secuencia de terminacin y un promotor que pueden ser: 1. Un promotor que es activo en levaduras como el gen del alcohol deshidrogenasa por ejemplo que lo podra utilizar en este caso. La enzima alcohol deshidrogenasa es muy abundante en levaduras pues estas realizan mucha fermentacin alcohlica entonces este gen se expresa muy eficientemente por ende su promotor se activa de forma eficaz. 2. Un promotor PGAL-1 que viene del gen K que codifica una enzima relacionada con el metabolismo de la galactosa y el promotor de este gen se enciende solo cuando hay galactosa lo que me permite controlar la activacin de este promotor, genera que se pueda realizar un control.
Al colocar el promotor en la levadura estas levaduras transformadas crecern solo en el medio que les brinde los sustratos especficos dependiendo del gen a utilizar por lo siguiente estas levaduras podrn sintetizar las diferentes enzimas y podrn fabricar UTP y estas se denominarn clulas de levadura positivas para la transformacin cuyo nombre ahora ser URA3 + (las clulas de levadura no transformadas seguirn siendo URA3 - ).
Con las clulas positivas puedo generar un cultivo y una vez este tenga un tamao considerable puedo agregar al medio de cultivo galactosa que activar el promotor PGAL-1 y este una vez activado se sintetizar el RNA mensajero. Este RNA mensajero no tiene seal de unin al ribosoma esto porque la levadura es un eucarionte y estas no necesitan seal de unin, para que esta unin se realice puedo agregar un trozo de RNA que codifique para un pptido seal. Usualmente se usa un pptido seal para estos fines denominado Factor Alfa que logra este cometido. La protena codificada tendr este pptido seal en su extremo amino eso significa que va a entrar en la ruta de secrecin de protenas de la levadura y por lo tanto la protena producida a partir de este gen forneo, va a ser puesta en el exterior de la clula. No siempre es posible obtener los resultados que uno espera cuando involucra una levadura, porque la levadura es un organismo eucarionte inferior y no existen necesariamente los procesos de codificacin post-traduccional que son realizados por una clula de un mamfero (eucariota superior), supongamos, el tipo de glicosilacin no siempre es el mismo. Por consiguiente se presentan algunas situaciones en que la levadura no es funcional para esta transformacin por lo tanto se debe cambiar el hospedero directamente a una clula eucarionte superior (clula animal). No abordaremos las clulas vegetales, ya que todos los procesos son ms complicados, pero s hablaremos sobre clulas animales en cultivo donde la teora es la siguiente: Sabemos que las clulas de un organismo pueden estar desde el punto de vista de divisin, en tres categoras: en divisin activa (Mitosis), en reposo proliferativo (G 0 ) o pueden haber
salido absolutamente del ciclo de replicacin (Fase D/Diferenciacin). Por ejemplo las clulas precursoras de la medula sea que estn generando clulas hematopoyticas, es decir, estn en constante divisin. Hay otras clulas que se dividen bajo estmulos por ejemplo las clulas epidermales, que se dividen cuando se produce una herida por medio de Factores de Crecimiento Epidermal que actan sobre clulas en reposo y estimulan su divisin. Por ltimo encontramos clulas que ya salieron del ciclo de divisin porque tienen un estado de diferenciacin avanzado, por ejemplo las neuronas, las cuales una vez que se diferencian ya no pueden volver a dividirse. Las clulas que uno puede encontrar en cultivo estn dentro de la categora de clulas que estn divisin en permanente o en la categora de clulas que estn en reposo proliferativo y pueden ser inducidas a la divisin; por tanto tenemos medios de cultivo mnimos contiene o a los que es necesario adicionar los factores de crecimiento adecuados. Como caso especial tambin se pueden cultivar clulas transformadas, principalmente clulas que provienen de un tumor, porque una de las caractersticas de estas es que han perdido su capacidad de regular el ciclo y estn permanentemente en divisin. De hecho, hay un grupo de clulas humanas que se usan corrientemente en experimentos, que se llaman Clulas Hela stas clulas son una lnea de cultivo que viene del ao 53 y corresponden a clulas que fueron obtenidas de una seora con cncer, quien ms tarde falleci. Estas clulas son tumorales y como su ciclo no est regulado continuaron dividindose indefinidamente. Existen diferencias entre lo que pasa en las bacterias o en las levaduras y las clulas animales en cultivo. La primera es que se dividen menos, un ciclo completo de divisin en una clula animal toma unas 24hrs aproximadamente, por contraparte a lo que sucede en las bacterias donde cada generacin se produce en 30 min. y en una levadura en 90 min. Lo segundo es que, si son clulas normales (no tumorales) estas presentan una caracterstica denominada inhibicin por contacto por lo que clulas que se encuentran en divisin y confluyen en un punto tocndose dejan de dividirse, esto limita en buena parte la cantidad de clulas que se pueden obtener a partir de un cultivo celular, siendo uno de los problemas a los cuales se enfrenta. Aparece un problema en relacin a los vectores, pues si se desea transferir genes hacia clulas animales, necesitamos disponer de un vector que nos permita transferir el gen al interior de la clula y en este caso se distinguen dos situaciones; un tipo de vector para transposicin transitoria y otro tipo denominado transposicin estable. 1. Transposicin Transitoria: Se podr expresar un gen dentro de una clula animal, pero funcionar durante pocos das, unas cuantas generaciones. Al vector se le aplica un ORI (origen de replicacin), el origen que usualmente se utiliza es el SV-40 que infecta clulas humanas. (Si se desea producir una protena dentro de clulas humanas el ORI del virus SV-40 nos sirve, pues este infecta humanos y por lo tanto es capaz de replicarse en clulas humanas o de mono).
La transposicin transitoria no sirve para que una lnea celular se produzca permanentemente, en laboratorios se utiliza este experimento porque es muy rpido de hacer. Debemos recalcar que para fines de produccin de la protena o biotecnolgicos esta no es la estrategia adecuada, debido a que estas clulas se multiplican por divisin celular, cuando hay mitosis existe una etapa en que las fibras del huso mittico se conectan por el centrmero del cromosoma por lo que se segrega al momento de la divisin, son las cromtidas del cromosoma doble y NO la regin de DNA del vector, ya que no presenta centrmero y no se une al huso mittico, por lo que al momento de la divisin celular, no existe un mecanismo de segregacin que asegure que las ambas clulas hijas se lleven lo que les corresponde desde el punto de vista de esa molcula de DNA. A medida que se dividen estas clulas, aparecen clulas hijas que no contienen la misma construccin gentica, debido a que el proceso de transposicin funciona slo un tiempo determinado. 2. Transposicin Estable: Si se tiene un cromosoma o DNA cromosomal de la clula que se est infectando y un cDNA que est dentro de un vector, para que ste se integre al cromosoma de la clula infectada. Una vez estando dentro de la clula infectada, una vez que est dentro del cromosoma de la clula manipulada, pasa a ser un gen ms de ese cromosoma, va a ser replicado cada vez que el cromosoma de la clula infectada se replique y ser segregado entre dos clulas hijas al momento de la mitosis, ya que va dentro de los cromosomas que sern segregados. Se necesita ahora poner un vector que asegure que el cDNA se va a integrar al cromosoma de la clula que se est manipulando. El vector debe saber cules de las clulas efectivamente integraron el cDNA y cules no, es decir, necesito un gen marcador. Entonces hay que disear un vector que tenga gen marcador, que no va a tener origen de replicacin, porque no necesita origen de replicacin. Se tiene que tener un mecanismo que permite que este gen que est afuera se meta dentro del cromosoma de la clula manipulada y ese gen se va a propagar establemente porque se va a replicar junto con el cromosoma. Entonces este es un vector distinto del que hemos estado hablando. Si recordamos un poco a los retrovirus, tenemos que el genoma retroviral que es RNA asociado con molculas de la transcriptasa reversa. Estos son un grupo de virus envueltos, por fuera de esto tienen envoltura y esta envoltura tiene una bicapa lipdica. Y dentro inserta dentro de la bicapa, hay un grupo de protenas que son denominadas las protenas de la envoltura o tambin llamadas partculas de la envoltura. Estas protenas (partculas virales) son lo ms externo que tiene el virus.
Figura: Retrovirus con su RNA y la transcriptasa reversa. Usualmente los mecanismos defensivos de una clula contra una infeccin por virus es generar anticuerpos contra las partculas virales, pero el rol tiene que ver con el mecanismo de infeccin. Entonces supongan ustedes lo siguiente: en la membrana de la clula hay una protena R y esa protena es la que interacta
con la estructura donde est el virus y es una interaccin reversible entre partcula viral y el receptor que est en la clula.
Figura: protena R de la clula interactuando con retrovirus. Se debe aclarar que la clula no tiene receptor para virus, son solo protenas que estn en la superficie y que tienen otra funcin. Pero, el virus se aprovecha de esta protena para interactuar as con este receptor. En esta interaccin especifica entre virus y protena- Rc, el virus reconoce la clula de esa protena y esa protena que est en la superficie reconoce solo a los virus que tienen una determinada partcula. Por lo tanto, la interaccin es especfica, es como una interaccin entre una hormona y un receptor o un neurotransmisor con un receptor. Una vez que esto sucede, se produce un ingreso de este virus, el cual es endocitado por la clula. Dentro de la clula toda la estructura externa del virus es degradada y finalmente este RNA es transportado al ncleo celular y ese RNA tiene una estructura: secuencia U5 y U3 (Secuencia nica en el extremo 5 y 3). Dentro de este RNA hay s o si algunos ORFs, entre ellos GAG, POL, ENV.
Figura: Esquema de Estructura de RNA. U5: Secuencia nica del extremo 5. U3: Secuencia nica del extremo 3. ORFs: GAG: Contiene los genes para las protenas de la cpside viral. POL: Codifica para la Transcriptasa Reversa. ENV: Codifica para las protenas de la envoltura.
Figura: Estructura de RNA (igual al esquema anterior) Continuando con el proceso la transcriptasa reversa utiliza el RNA como molde para codificar cDNA viral de doble hebra. Los virus pueden promover el desarrollo de tumores, si se posicionan cerca de un gen llamado B-Onc. Dentro de un Retrovirus, existen LTRs, las cuales son secuencias terminales repetidas, y se ubican a ambos lados del gen. Son secuencias altamente similares entre s. La funcin de estas secuencias es permitirle al retrovirus insertarse al cromosoma de la clula infectada, obtenindose: Figura: Insercin de DNA Viral. Esto es parte del mecanismo de transferencia replicativa de un gen. En la regin LTR izquierda existe un Promotor de Transcripcin Viral. En el RNA, est localizado en la parte U3. La finalidad del virus es replicarse, es decir, producir ms copias de l, que sean eliminadas de la clula que infect, para llegar a otras clulas y propagarse. Para esto, se utilizar un mRNA que es una copia del retrovirus, el cual se sintetiza a partir del
promotor, siendo una copia idntica al retrovirus. El promotor, al ser muy eficiente, lleva a una reproduccin del genoma viral, es decir, se amplifica el genoma del virus (se hacen ms virus). Los mRNAs generados pueden ser traducidos, sintetizando las protenas GAG, POL y ENV. Esto va a ser importante para construir la estructura de sobrevivencia del virus. Cmo usaremos esto para el propsito?
Figura: Replicacin, Transcripcin y Traduccin de Protenas Virales. Las protenas de la envoltura tienen una propiedad especial, la protenas de la membrana se sintetizan con un mecanismo que involucra la participacin de un pptido seal, es decir, tienen una secuencia aminoacdica que es equivalente al pptido seal que se encuentra en protenas de exportacin, por consiguiente cuando estas protenas se empiezan a traducir aparece el pptido seal, el ribosoma que lo est traduciendo esas protenas, lo ribosomas libres en el citoplasma, es conducido sobre el retculo endoplsmico por la chaperona SRP que lee la seal y lo pega al RE y desde ese momento la protena empieza a ser sintetizada hacia el interior del retculo y entra en la ruta secretora de protenas. Adems de esa seal que la protena tiene en extremo amino, en extremo carboxilo tiene otro pptido que hace que esta protena quede atrapada en la membrana del retculo endoplsmico, sigue sintetizndose hasta que esta seal del extremo carboxilo la detiene, y la deja puesta ah, porque del RE se forman vesculas que llevaran esta protena integrada en sus membranas, llegando al Golgi que las enva a las membrana de las clulas que terminan fusionndose con la membrana celular, no logran salir de la clula, sino que quedan atrapadas nuevamente, pero ahora en la Membrana citoplasmtica de la clula
Las otras protenas GAG, POL (Transcriptasa reversa, las de la cpside y el RNA viral) ms otras se pueden ensamblar las partes del virus y hacer muchas copias, que se desplazarn a la membrana de la clula para salir al exterior por exocitosis llevndose consigo las protenas de la envoltura que estaban en la membrana plasmtica previamente.
Entonces nos damos cuenta que la doble envoltura viral viene de la membrana plasmtica o de una membrana de la clula infectada. Todo nos sirve para saber qu debo hacer para colocar un gen desde afuera dentro de una clula viral, y que quede dentro del cromosoma de forma estable. Para que el cDNA del virus se integre al cromosoma lo que yo necesito son los LTRs, sern las que permitan que el cDNA viral se integre dentro del cromosoma. Los genes virales GAG, POL y ENV son importantes para el retrovirus, no para lo que queremos hacer por los que los debo reemplazar por el gen que me interesa integrar, lo nico que voy a guardar son las LTRs. Ahora bien genticamente hablando (sobre manipulacin gnica) como ya se seal de esta estructura son de inters solamente los LTR, no los genes virales. Entonces tericamente yo puedo sacar y cortar el DNA y retirar lo que est entre los LTR. Entonces ah puedo reemplazarlo con el cDNA que proviene de un mRNA y que se obtuvo a partir del gen que se quiere que funcione dentro de la clula.
Se introduce lo que tenga que colocar entre la LTR izquierda y LTR derecha. Entonces, voy a hacer una especie de ampliacin y voy a colocar un promotor entre las dos LTR. Pero, este promotor es opcional. Ahora bien en la LTR, hay un promotor viral, por lo tanto en estricto rigor no necesito colocar otro porque aqu hay un promotor.
Figura: Promotor despus de LTR. Entonces si yo quiero poner un gen dentro de una clula animal y quiero que ese gen funcione en forma descontrolada, uso el promotor viral. Pero si yo quiero que ese gen funcione un poco ms controlado se puede colocar un promotor adicional y ese promotor lo selecciono yo. Solamente en clulas animales, este promotor PGK (fosfoglicerato kinasa, enzima de la glicolisis). Se puede o no agregar una secuencia, que se denomina con una letra griega Y (Smbolo ). Esto es un enhancer pero traduccional, no transcripcional, es decir, si un mRNA contiene una secuencia de ese tipo, ese mRNA se traduce con una muy alta eficiencia, esto ocurre porque esa secuencia est presente en los mRNA virales. Figura: Promotor + Secuencia Y + cDNA Propsito del virus: quiere que toda la clula infectada funcione para su beneficio, entonces, cuando se produce un RNA viral dentro de una clula infectada, esta secuencia de RNA es una especie de trampa para factores iniciadores de la transcripcin, entonces los atrae con harta afinidad, eso significa que el puesto a elegir el sistema traduccional, elige mRNA viral antes que traducir en mRNA celular Y esto puede o no estar presente, pero lo importante es que a continuacin de esto, yo voy a colocar el cDNA y lo que quiero decir es
que este cDNA, puede provenir y puede ser transcrito a partir de este promotor o si lo coloco. Siguiendo con esto, voy a poner un segundo gen y este gen adquiere un nuevo promotor y este promotor usualmente es la fosfoglicerato quinasa y voy a poner un gen llamado NeoR (neomisina fosfotransferasa) y posterior a este voy a poner la otra LTR.
Figura: Vector para ser introducido en clula blanco de mamfero. Cuando se produce un RNA viral dentro de la clula infectada. La secuencia de RNA es una especie de trampa para factores de transcripcin. Lo que quiere decir que el sistema traduccional de la clula va a preferir mRNA viral, antes que uno propio. Esta secuencia Y, puede o no estar presente, es un enhancer traduccional que permite la eficacia en la traduccin de mRNA viral. Luego de este se ubica el cDNA, el cual puede ser transcrito a partir del promotor o a partir del LTR. (Por ello es opcional poner el un promotor). Se coloca un segundo gen, que corresponde al de NeoR. Antes de eso se pone un promotor de fosfogliceratoquinasa. El gen NeoR, es de origen bacteriano. Y para finalizar se poner la otra LTR. NeoR, codifica una enzima, llamada neomicina fosfotransferasa, que otorga resistencia a la neomicina. Pero las clulas animales son insensibles a neomicina, pues los antibiticos matan bacterias. Sin embargo existe un compuesto txico para clulas animales (G418), que las mata, pero puede ser fosforilado convirtindose en algo inocuo. Esta fosforilacin la puede hacer la neomicina fosfotransferasa. Por tanto, el gen NeoR, confiere resistencia a neomicina, pero en clulas animales otorga resistencia a G-418, por ende se convierte en un gen marcador. Todo lo que est entre dos LTR se integra al cromosoma. El vector se construye a partir del RNA del retrovirus, se cortan los genes GAG, POL y ENV con una enzima de restriccin, para insertar entre las LTR, todos los elementos mencionados. Todos los vectores, ya sea levadura, plantas o animales, tienen un segmento con el gen de resistencia a ampicilina Amp + y el origen de replicacin de COLE1 (ORI cole1). Y esto porque antes de querer transformar una clula de levadura, humana o planta, se debe hacer la construccin gentica del vector, incluyendo, pegar el cDNA al vector, el promotor, los genes marcadores, etc. Y esto se comprueba en bacterias. Primero se pega el cDNA de inters en un vector, pero no todos los cDNA quedarn ligados al vector, es por ello que para seleccionar las molculas que s se ligaron, con la mezcla se transforman bacterias, y se seleccionan aquellas que tengan el vector, es decir, aquellas bacterias (E. Coli) que tengan el gen Amp + . Siguiente paso, es sacar el DNA de la bacteria y comprobar que la secuencia que la bacteria adquiri sea la que se necesita, mandando la construccin gentica para que la secuencien. As se corrobora que se tiene el gen de inters, en el vector especfico. Despus de esto, se puede hacer la transformacin de una clula animal. Todos los vectores sern funcionales tanto en E. Coli como en Plantas (animales o levadura), pues es de suma importancia corroborar el vector, antes de iniciar el proceso de transformacin. Siempre se trabaja con cDNA.
Con el vector se transformar una clula, pero que no es la definitiva, sino una intermediaria, previamente infectada con un retrovirus y por ende en ella estarn presente los productos de RNA de este. Ya sea protena GAG, Pol y en la membrana protenas ENV, puesto que en uno de los cromosomas est insertado un provirus o un retrovirus con el RNA para la protena GAG, Pol y ENV que se transcribe y se traduce generando dichas protenas. Cuando se inserta el plsmido fabricado, en el DNA cromosomal queda con esta construccin: Figura: Plsmido fabricado y mRNA de inters. A partir de esto se fabrican los mRNA, entonces se tiene un RNA con 5-3 y proteinas de la cpside viral. En conclusin, con este RNA y las proteinas de la cpside se ensamblan partculas virales, que son virus falsos, pues no tienen el genoma viral, tienen el RNA que proviene de la transcripcin de estas construcciones. A partir de esta clula se obtendrn muchos virus que no contienen el genoma viral, son pseudovirus. Con estos virus se puede hacer una infeccin de la clula blanco, para as transferir la construccin gentica al interior de ella, a travs de un proceso de infeccin viral. Estas clulas transformadas son vendidas, donde es posible escoger un sistema de empaque, existen 6 sistemas diferentes que se distinguen en la protena de envoltura que se producir, porque la infeccin entre un virus y la clula blanco, depende de la interaccin entre la envoltura y una protena receptora presente en la superficie de esta ltima. Por consiguiente, si se desea infectar una clula humana, la envoltura del pseudovirus a construir debe ser compatible con una proteina presente en la superficie de dicha clula. Si esto no sucede, es decir la envoltura no es compatible con el receptor de la clula blanco, la infeccin no se producir. Debido a lo anterior, hay distintos tipos de sistemas de empaque de clulas intermediarias, de acuerdo al propsito del experimento, es decir depende de que se quiera infectar. Existen distintos tipos de clulas, dependiendo del propsito del experimento a realizar; por ejemplo si quiere infectar mamferos, se necesita que en la superficie de la clulas se coloque una protena de envoltura que reconozca al receptor que est presente en clula de mamfero; con lo que se quiere decir que entre las seis posibilidades de empaque, hay que escoger una clula intermediaria. Existe un sistema que sirve para trasformar lo que sea, porque utiliza una protena de empaque que proviene del virus del afta. Este virus es de una familia de virus que producen el afta en humanos y la fiebre aftosa en ganado. Este virus es muy promiscuo, puesto que puede inyectar lo que sea, ya que como molcula receptora utiliza fosfatidil inositol, y todas las membranas eucariticas tienen fosfatidil inositol; por lo que si fabrico virus falsos (pseudovirus) y a estos les coloco protenas de envoltura, esta protena de envoltura del virus se podr unir a cualquier clula, pudiendo transferirlo a cualquier organismo ya que poseen fosfatidil inositol, y como la protena de envoltura se pega a este fosfatidil inositol, se pegar por ende a esa membrana, pudiendo esta ser infectada.
Respecto a clulas de cultivo; estas no son organismos, sino que solo clulas de cultivo, por lo que a estas clulas se les debe mantener constantemente. Es por esto que, suponiendo que, se quiere aumentar la produccin de leche de una vaca, siendo la prolactina la protena clave del proceso, se debe aumentar los niveles de prolactina en esta vaca para que aumente su produccin de leche. Entonces el mRNA toma la prolactina, la toma y genera DNA prolactina, con lo que luego se obtiene una clula de vaca que tiene el gen de la prolactina. La clula de vaca no sirve por s sola, por lo que, se necesita una planta, puesto que desde una clula de planta se puede generar un organismo completo, cosa que no sucede en los animales. Es por esta razn que se debe escoger la clula blanco, y si esta es una clula embrionaria; esto se puede lograr; ya que esta clula embrionaria es totipotencial, siendo esta la clula que va a ser transcrita y trasformada. Luego de esto viene todo el proceso embriolgico. Resumiendo esta clula transgnica transformada se implanta en un ovocito que ser transformado, el cual luego ser implantado en el tero de una vaca, con lo que se obtendr, luego del desarrollo, un animal con tejido transgnico y otro no transgnico, es decir algunos tejidos con prolactina y otros no. Luego de varios cruces y selecciones repetidas, se puede obtener un organismo homocigoto para el gen de la prolactina en su corazn, produciendo una gran cantidad de hormona y gran cantidad de leche. Eso sucede en los salmones que sintetizan la hormona del crecimiento, los cuales alcanzan su tamao ideal a edades muy tempranas. Tambin pasa esto en el sper conejo que tiene mucha hormona del crecimiento, es decir que si manipulo bien las cosas, se puede llegar a obtener un organismo transgnico que, es decir genticamente modificado, si se escogen bien los componentes, tanto los genes, el vector la clula intermediaria y la clula blanco.