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ANLISIS FUNCIONAL ORGNICO

1 cuatrimestre 2013
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Cromatografa lquida de alta resolucin
(CLAR)
Inyector
Detector
Cromatograma
Columna
Solventes
Bombas
Mezclador
Diseo instrumental de HPLC
Muestra
Descarte (fase mvil)
(fase fija)
Comparacin HPLC - CG
Tpicamente hasta
500-600
(volatilidad)
No hay lmite
terico superior
(solubilidad)
Peso molecular
Es un requisito
(inyector, columna)
Anlisis a
T amb o menor
(T
mx
60 C)
Estabilidad trmica
Polares, no polares Inicos, polares, no
polares
Polaridad de
analitos
Es un requisito No es requisito
Muestra soluble en
fase mvil
Volatilidad de la
muestra
CG HPLC Propiedad
Comparacin HPLC CG (cont.)
Ms comn FID
GC-MS
Ms comn UV-vis
Muchos no
destructivos
HPLC-MS
Detectores
Gas carrier
Fase estacionaria
(temperatura)
Fase mvil, fase
estacionaria
Separacin
Analtica Analtica, preparativa Escala
Sv inyeccin voltil,
eluye antes que los
analitos (idealmente)
Filtrar
Sv inyeccin =fase
mvil (idealmente)
Preparacin de la
muestra
CG HPLC Propiedad
Conceptos tericos bsicos
Eficiencia (N platos tericos)
N = 16 (t
R
/w
t
)
2
= 5,54 (t
R
/w
1/2
)
2
t
R,B
t
R,A
t
R,C
t
0
W
t
W
1/2
Parmetros de columna
Fase mvil (viscosidad)
Velocidad de flujo de solvente
Analitos
Conceptos tericos bsicos
Factor de retencin
(factor de capacidad)
k = (t
R
-t
0
)/ t
0
Tiempo en fase estacionaria vs
tiempo en fase mvil
t
R,B
t
R,A
t
R,C
t
0
W
t
W
1/2
Conceptos tericos bsicos
Selectividad o factor de
separacin
= k
2
/ k
1
= (t
R,B
-t
0
)/ (t
R,A
-t
0
)
1
Composicin de fase mvil
Composicin de fase estacionaria
Temperatura
t
R,B
t
R,A
t
R,C
t
0
W
t
W
1/2
Conceptos tericos bsicos
Resolucin
t
R,B
t
R,A
t
R,C
t
0
W
t
W
1/2
Selectividad tiene el
mayor impacto sobre
resolucin (fase
estacionaria, fase mvil)
Rs =0,6 valle entre picos
Rs =1permite cuantificar
Rs =1,6-1,7cuantificacin
confiable
Conceptos tericos bsicos
Conceptos tericos bsicos
Cambio de
presin
Viscosidad
Velocidad
de flujo
Longitud de
columna
Dimetro de
partcula
Radio de la
columna
Conceptos tericos bsicos
Ecuacin de van Deemter
Velocidad lineal (u)
u
opt
H
mn
A
l
t
u
r
a
d
e

p
l
a
t
o
(
H
)
A menor altura de plato, hay mayor nmero de platos y es mayor la resolucin
cromatogrfica
Conceptos tericos bsicos
Retencin con gradiente de solvente
Tiempo de
gradiente
Velocidad
de flujo
Volumen muerto de
columna
Cambio de fraccin
en volumen del
solvente B
Desarrollo de un mtodo para HPLC
-Modos de HPLC
-Eleccin de dimensiones de la columna y tamao de partcula
-Eleccin de fase estacionaria
-Aplicacin a fase reversa
-Seleccin de fase estacionaria
-Seleccin de fase mvil
-pH
-Optimizacin de condiciones
-Desarrollo de condiciones para otros modos cromatogrficos
Variables: fase estacionaria y fase mvil
-Fase reversa (RP, reverse phase)
-Fase normal
-HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),
[ANC (aqueous normal phase)]
-Intercambio inico (IEC)
-Exclusin por tamao (SEC) sistema acuoso
Permeacin por geles (GPC) sistema no acuoso
Eleccin del modo cromatogrfico
Seleccin determinada por -tipo de analito y su solubilidad
-peso molecular del analito
-matriz de la muestra
-disponibilidad de fase estacionaria y columna
Varios modos
posibles para un
mismo tipo de
analito
Fase reversa es aplicable a
analitos inicos, polares y no
polares.
Seleccin adecuada de
condiciones.
Eleccin de dimensiones de la columna y tamao de partcula
Columna HPLC
Fase estacionaria
Dimensiones de
columna
Tipo de
superficie
Tamao de
poro
Tamao de
partcula
Largo
Dimetro
interno
Propiedades qumicas
Selectividad,
factor de retencin
Propiedades fsicas
Eficiencia,
velocidad de anlisis
Algunas especificaciones de columnas para cromatografa lquida
Tamao de partcula
-Tradicional 5 m, tendencia actual 3 m
-UHPLC (Ultra high pressure liquid chromatography)
Para mayor velocidad de anlisis y/o mayor resolucin 1,8-2 m, en combinacin con
columnas cortas (50 mm o menos).
Partculas ms pequeas: mejoran resolucin, eficiencia y tiempo de anlisis;
aumenta la presin de trabajo (600-1200 bar)
Clasificacin segn tiempo de anlisis: fast 10 min
ultra fast 1min
-Se desarrolaron recientemente partculas superficialmente porosas (SPP), tienen un core
slido (1,7 m) recubierto con una capa porosa de slica (0,5 m de espesor).
Separacin superficial disminuye difusin
Ventaja: resolucin similar a partculas de 1,8 m a menor presin de trabajo (<400 bar)
se puede aumentar la velocidad de flujo, menor tiempo de anlisis
Algunas especificaciones de columnas para cromatografa lquida (cont)
Dimensiones de columna
-Tradicional para desarrollo analtico:
4,6 x 150 mm; 5 m
4,6 x 100 mm; 5 m
4,6 x 250 mm; 5 m
Tendencia actual: 4,6 x 100 mm; 3 m (partcula comn)
4,6 x 100 mm; 2,7 m (partcula porosa)
-Columnas de menor dimetro interno para mejorar sensibilidad o
cuando la muestra es limitada
Nano muestra < 1 pg; velocidad de solvente: nl/min
Capilar muestra pg-ng; velocidad de solvente: 4 l/min
Microbore muestra ng-g; velocidad de solvente: 40 l/min
Dimensiones de columna
Dimetros de columna segn su aplicacin
-Anlisis de alta capacidad de muestras (high throughput) Longitud , partcula < 2 m
- Muestra compleja con varios componentes Longitud , partcula pequea (P )
-LC-MS dimetro ( 2,1 mm), velocidad de flujo
-Cromatografa preparativa dimetro (10-50 mm), partculas grandes (5-10 m),
velocidad de flujo
Fase estacionaria Modo fase reversa
Principio:
Particin de analitos entre fase estacionaria no polar y fase mvil polar.
Interacciones no polares y no especficas de los analitos con la fase estacionaria hidrofbica.
Fases estacionarias ligadas:
grupos hidrofbicos unidos a los grupos silanoles (SiOH) de la slica.
-C18
-C8
-C3
-fenilo
Fase mvil
-agua, con control de pH opcional (buffer, cido o base)
-solvente orgnico miscible con agua
Separacin de molculas no polares, polares, ionizables y inicas
Se mejora la retencin de compuestos ionizables por agregado de un modificador a la fase mvil.
Regla general:
los analitos de mayor tamao (protenas, PM > 2000) se analizan en columnas de fase reversa de
cadena corta (C3, CN) con poro grande (300 ); los analitos ms pequeos (PM < 2000) se separan
en columnas de cadena ms larga (C8, C18) con poro menor (80-120 ).
Fase estacionaria Modo fase reversa
Diferentes estrategias para distribuir las cadenas hidrofbicas sobre los SiOH
OH
OH
No recubierta
Protegida
estricamente
No recubierta
Recubierta
(end capped)
Recubierta,
mayor estabilidad al pH
(hasta pH 11)
Fase estacionaria Modo fase reversa
Fase mvil Modo fase reversa
H
2
O + modificador orgnico: acetonitrilo, metanol (THF, i-propanol)
Cambio en fase mvil Variacin en selectividad y retencin de muestras.
La solubilidad de la muestra puede condicionar la seleccin de la fase mvil.
Es importante controlar el pH y la fuerza inica de la fase mvil cuando los analitos son
compuestos ionizables o inicos. Se recomienda trabajar a pH 2-4.
pH de trabajo: 1 unidad de pH con respecto a pK
a
o pK
b
de los solutos analizados (90% de
predominio de especies no ionizadas). Ajustar el pH sobre el componente acuoso.
Siempre considerar a la fase mvil como una
potencial fuente de problemas para la columna.
Consultar tablas de propiedades de solventes y
miscibilidades.
Usar solventes frescos (cambio de composicin
o contaminacin).
Asegurar la desgasificacin de los solventes:
-Desplazamiento con un gas menos soluble (He)
-Vaco
-Sonicacin
-Calentamiento
Fase mvil Modo fase reversa
En lo posible preparar la muestra un solvente de la misma composicin que la fase mvil para
evitar distorsiones por solventes con gran poder de elucin.
Fase mvil Modo fase reversa
pH de la fase mvil Modo fase reversa
Supresin inica: regulacin del pH de la fase mvil para evitar la ionizacin de los analitos y
mejorar su retencin en la fase fija.
Un buffer es efectivo para regular el pH a 1 unidad con respecto a su pK.
Ejemplo: buffer actico/acetato tiene pKa 4,8, regula a pH 3,8-5,8.
pH de la fase mvil Modo fase reversa
pH de la fase mvil Modo fase reversa
- Par inico: alternativa a supresin inica.
- Compuestos bsicos: muchas veces no es necesario trabajar a pH alto, que puede daar
la columna.
- Ionizacin potencial de los SiOH a pH ~7 SiO
-
aumenta la retencin de cationes
(aminas protonadas), interaccin secundaria, ensanchamiento del pico cromatogrfico. Se
evita a pH bajo. Otra opcin: columnas end-capped, recubiertas.
SO
3
SO
3
N
R
R
R
H
+
Na
+
Fase unida
Reactivo de par inico
Separacin de bases con
alquilsulfonatos
cido Trifluoroactico (TFA)
cido Heptafluorobutrico (HFTBA)
cido Hexanosulfnico
pH de la fase mvil Modo fase reversa
Es posible usar una fase mvil sin buffer, simplemente una fase acuosa cida
Detector UV:
La fase mvil y en particular el buffer deben ser transparentes a la de medicin solvente y
buffer con cutoff < 220 nm sales de cido fosfrico + acetonitrilo.
Desventaja: no se debe exceder 70% de solvente orgnico debido a la baja solubilidad de las
sales de fosfato.
Detector espectrmetro de masa:
Se deben excluir materiales no voltiles de la fase mvil para no daar la fuente
de ionizacin se evitan sales de fosfato y contraiones no voltiles; se evitan
TEA y TFA que presentan supresin inica en la fuente de ionizacin.
Se usan sales de amonio de buffer formiato y acetato, que no sirven para
detector UV.
Idealmente, ambas fases mviles (A = acuosa, B = orgnica) deberan tener el
mismo contenido de buffer, de modo que cuando se use un gradiente de
solvente slo vare la proporcin de fase orgnica.
pH de la fase mvil Modo fase reversa
Optimizacin de condiciones Modo fase reversa
1) Isocrtica
Para un mtodo de control de calidad, se reducen variables.
2) Gradiente
Para una muestra compleja con un rango amplio de t
R
de los analitos.
Optimizacin de condiciones Modo fase reversa
1) Isocrtica
Se vara %B de modo que 1 k 10.
Se comienza con %B alto para asegurar elucin de todos los analitos, se va reduciendo
10-20% (cuidado con el uso de buffer!)
-Buena resolucin
-Anlisis rpido
Optimizacin de condiciones Modo fase reversa
Luego de optimizar la retencin, si no se logr resolucin adecuada,
se vara la selectividad ():
Temperatura
pH
Tipo de buffer (acetato, formiato, fosfato)
Modificador orgnico (acetonitrilo, metanol, mezclas)
Velocidad de flujo de solvente
Optimizacin de condiciones Modo fase reversa
2) Gradiente
Se comienza con un amplio rango de %B en poco tiempo, luego se ajusta la retencin k*
Anlisis antidoping en orina humana SPE - LC- ESI - TOF
Columna C18 2 x 100 mm; 3 m.
Fase mvil:
A: 5 mM NH
4
Ac en HCOOH 0,1%;
B: acetonitrilo.
Gradiente: 10% a 40% B en 10 min; a 75% B en
13,5 min; a 80% en 16 min; 5 min a 80% B.
Equilibrio post-run 6 min.
Flujo de solvente: 0,3 ml/min
Anal. Clin. Acta 2007, 585, 94-102.
Muestra de orina adquirida luego de
administrar metilfenidato:
a) Cromatograma TIC;
b) Cromatograma reconstituido por
superposicin de iones especficos
correspondientes a metilfenidato (m/z
234,1489), su metabolito cido ritalnico (m/z
220,1332) y dibenzepina (m/z 296,1757) como
estndar interno
Rango m/z: 50-800
Resolucin promedio: 10000 para m/z 300
ESI, modo +, [M+H]
+
Identificacin en base a tiempo de
retencin, masa exacta y pattern
isotpico.
metilfenidato
(m/z 234,1489)
Ac. ritalnico
(m/z 220,1332)
metilfenidato
(m/z 234,1489)
Ac. ritalnico
(m/z 220,1332)
Deteccin de 124 analitos, incluyendo estimulantes, -bloqueantes,
narcticos, agonistas -adrenrgicos,
antiestrognicos, diurticos y cannabinoides.
-Fase reversa (RP, reverse phase)
-Fase normal
-HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),
[ANC (aqueous normal phase)]
-Intercambio inico (IEC)
-Exclusin por tamao (SEC) sistema acuoso
Permeacin por geles (GPC) sistema no acuoso
Eleccin del modo cromatogrfico
Fase estacionaria: slica, otras fases polares como amino (RNH
2
), diol (RCHOHCH
2
OH) o
ciano (RCN), en orden decreciente de polaridad.
Fase mvil no polar inmiscible con agua: hidrocarburos, CH
2
Cl
2
, EtOAc.
Los compuestos ms polares son ms retenidos.
Razones para usar fase normal: -mayor retencin de compuestos polares
-elucin de compuestos hidrofbicos muy retenidos en RP
-separacin de ismeros
-solvente de inyeccin inmiscible con agua
-separaciones preparativas
-recuperacin de muestra en solvente no polar
HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
Fase estacionaria: polar.
Fase mvil no polar miscible con agua, con un pequeo porcentaje de agua ( 2,5% en volumen).
Los compuestos hidroflicos, polares o cargados son ms retenidos que los compuestos
hidrofbicos. El agregado de agua a la fase mvil reduce la retencin picos agudos para
analitos polares ( fase normal).
til para compuestos muy polares poco retenidos en RP modo complementario a RP
Fcilmente adaptable a equipos acoplados a espectrmetro de masa.
Cuando se usa fase mvil con alta proporcin de solvente orgnico aumenta la sensibilidad de MS
debido a que se reduce la supresin inica de la fuente (con respecto a buffer acuosos).
Optimizacin de los siguientes parmetros:
Fase estacionaria: slica,
amino (RNH
2
),
modo mixto (alquil-diol, alquil-carboxilo, C18-amida, aromtico-
ciano, alquil-hidroxilo, etc)
zwitterinico (tetraalquilamonio-sulfnico)
Concentracin de solvente orgnico
Tipo de buffer y concentracin (si se usa)
pH
Temperatura
HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
HILIC
Ranitidina
m/z 315 176
Paroxetina
m/z 330 192
Ranitidina
m/z 315 176
Paroxetina
m/z 330 192
A: HCOOHNH
4
8mM en H
2
O
B: HCOOHNH
4
8mM en 95% acetonitrilo
Gradiente: 5% B a 90% B en 10 min
Gradiente: 100% B a 50% B en 10 min
RP C18
LC-MS/MS
Seleccin de los iones
Paroxetina
m/z = 330
[M+1]
+
330,2
[M+1]
+
315,1
175,9
192,0
Ranitidina
m/z = 315
Varias consideraciones importantes
Preparacin de muestras
Muestras libre de interferencias, compatible con el mtodo de separacin y deteccin
seleccionados.
Filtrar la muestra: a medida que disminuye el tamao de partcula, disminuye tambin el
fritado de la columna. Bloqueo de capilares, fritados, ingreso a la columna, detector.
Filtrar la fase mvil. Daos en vlvulas, sellos, pistones, agujas y jeringas, tubera
capilar.
HPLC estndar: filtro 0,45 m
UHPLC: filtro 0,22 m
Lavar la columna, lavar el buffer, dejar con fase mvil: agua/solvente orgnico.
Usar fases mviles miscibles con el solvente de inyeccin de la muestra.
Usar la columna hasta un 10% por debajo del lmite mximo de presin (ver manual!),
regular las velocidades de flujo de solvente.
Seguir la direccin de flujo marcada en la columna.
Evitar ajustar excesivamente las roscas (fittings) de las columnas al colocarlas o
sacarlas del equipo.
Bibliografa
-The LC Handbook. Guide to LC columns and method development. Agilent. 2011.
Publication number 5990-7595EN.
www.chem.agilent.com\Library\primers\public\LC-Handbook-Complete-2.pdf
-Agilent ZORBAX column guide selection.
-The basics of HILIC. www.sepscience.com
-Trends in universal detection in high performance liquid chromatography. Joshi, P. B.;
Bhoir, S. I.; Bhagwat, A. M. www.sepscience.com