Separando organelos

En la dcada de los 50 y los 60, los cientficos de la poca usaban dos tcnicas para estudiar
organelos en la clula: la microscopia y el fraccionamiento. Christian de Duve estaba a la
delantera en cuanto al fraccionamiento de clulas. En el comienzo de los 50, utilizo centrifugacin
para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, de fracciones previamente caracterizadas: el
ncleo, la fraccin rica en mitocondrias, y los microsomas. Poco tiempo despus, utilizo
centrifugacin de equilibrio-densidad para descubrir, nuevamente, otro organelo.
Antecedentes
Las clulas eucariotas son altamente organizadas y compuestas por estructuras celulares
conocidos como organelos que cumplen funciones especficas. Mientras que la microscopia ha
permitido a los bilogos a describir la localizacin y la apariencia de varios organelos, es limitada
en cuanto a descubrir la funcin de estos. Para lograrlo, bilogos celulares se han apoyado en una
tcnica conocida como fraccionamiento celular. Con esto, las clulas se abren y sus componentes
celulares son separados en base a tamao, masa y densidad, usando una variedad de tcnicas
centrifugas. De esta manera, los cientficos pudieron aislar y analizar los componentes celulares de
distintas densidades, llamados fracciones. Utilizando este mtodo, los bilogos han dividido la
clula en cuatro fracciones: el ncleo, fraccin rica en mitocondrias, microsomas, y jugo celular.
de Duve era un bioqumico interesado en las localizaciones subcelulares de enzimas metablicas.
Ya haba completado un amplio trabajo en el fraccionamiento de clulas hepticas, en las que
haba determinado la localizacin subcelular de numerosas enzimas. Al localizar estas enzimas en
fracciones celulares especficas, pudo comenzar a dilucidar la funcin del organelo. l ha hecho
saber que su trabajo estuvo guiado por dos hiptesis: el postulado de homogeneidad bioqumica
y el postulado de localizacin nica. En resumen, estas hiptesis proponen que la composicin
completa de una poblacin subcelular deberan contener las mismas enzimas, y que cada enzima
est localizada en un lugar especfico de la clula. Armado con estas hiptesis y la poderosa
herramienta de la centrifugacin, de Duve subdividi la fraccin rica en mitocondrias.
Primero, identifico la fraccin mitocondrial ligera, la cual est compuesta por enzimas hidroliticas
que, ahora se sabe, componen los lisosomas. Luego, en una serie de experimentos aqu descritos,
identifico otra fraccin subcelular discreta, a la que le llamo el peroxisoma, que se encontraba en
la fraccin mitocondrial.
El experimento
de Duve estudio la distribucin de enzimas en clulas hepticas de ratn. Altamente activas en
metabolismo de energa, el hgado contiene un nmero de enzimas para estudiar. Par buscar la
presencia de varias enzimas durante el fraccionamiento, se apoy en pruebas conocidas, llamadas
ensayos enzimticos, para la actividad enzimtica. Para retener la mxima actividad enzimtica,
tuvo que tomar numerosas precauciones, que incluan realizar todas las etapas de
fraccionamiento a 0C, debido a que el calor denatura protenas que comprometen accin
enzimtica.
de Duve utilizo centrifugacin de velocidad localizada para separar componentes celulares en
sucesivas etapas de centrifugacin. Removi el hgado del ratn y lo separo por homogenizacin.
La preparacin cruda de clulas homogenizadas fue luego expuesta a centrifugacin relativamente
lenta. Esta etapa inicial separo el ncleo de la clula, el que se colecta como sedimento en el
fondo del tubo, del extracto citoplasmtico que se mantiene en la porcin flotante. Luego, de
Duve subdividi la porcin citoplasmtica en la fraccin mitocondrial ligera, la fraccin
mitocondrial pesada, y la fraccin microsomal. Logro separar el citoplasma al realizar
centrifugaciones sucesivas aumentando la fuerza en cada ocasin. En cada etapa, colectaba y
guardaba las fracciones para un anlisis enzimtico ms adelante.
Una vez que el fraccionamiento estaba completo, de Duve realizaba ensayos enzimticos para
determinar la distribucin subcelular de cada enzima. Luego representaba grficamente la
distribucin de esta enzima dentro de la clula. Como se ha demostrado anteriormente, la
actividad de la citocromo oxidasa, una enzima importante en el sistema transportador de
electrones, fue encontrada primeramente en la fraccin mitocondrias pesada. Se haba mostrado
anteriormente que la fraccin microsomal contena otra enzima caracterizada conocida como
enzima glucosa-6-fosfatasa. La fraccin mitocondrial ligera, la cual esta compuesta por los
lisosomas, mostro la caracterstica actividad de la fosfatasa acida. Inesperadamente, de Duve
observo un cuarto patrn cuando ensayo la actividad de la uricasa. En vez de seguir el patrn de
las enzimas referidas, la actividad de la uricasa estaba altamente concentrada dentro de la
fraccin mitocondrial ligera. Esta concentracin, en contraste a la extensa distribucin, sugera
que la uricasa podra estar aislada en otra poblacin subcelular separada de las enzimas
lisosomales.
Para probar esta teora, de Duve utilizo una tcnica conocida como centrifugacin de equilibrio
densidad-gradiente, que separa macromolculas en base a su densidad. La centrifugacin de
equilibrio densidad-gradiente se puede realizar utilizando un nmero de diferentes gradientes
incluyendo sucrosa y glucgeno. En adicin, el gradiente se puede producir en agua o agua
pesada que contiene el isotopo hidrogeno deuterio en lugar de hidrogeno. En este experimento,
de Duve separo la fraccin mitocondrial rica preparada por centrifugacin de velocidad localizada.
(Ver figura 5.1). Si la uricasa fuera parte de un compartimiento subcelular separado, debera
separarse de las enzimas lisosomales en cada gradiente testeado. de Duve realizo los
fraccionamientos en esta serie de gradientes, que realizaban ensayos enzimticos como antes. En
cada caso, encontr uricasa en una poblacin separada que la enzima fosfatasa acida lisosomal y
la enzima citocromo oxidasa mitocondrial (Ver figura 5.2). Al observar repetitivamente la actividad
de la uricasa en una fraccin distinta de la actividad de las enzimas lisosomales y mitocondriales,
de Duve concluyo que la uricasa era parte de un organelo separado. El experimento tambin
mostraba que otras dos enzimas, catalasa y D-amino oxidasa acida, segregaban hacia la misma
fraccin que la uricasa. Debido a que cada una de estas enzimas producan o utilizaban perxido
de hidrogeno, de Duve propuso que esta fraccin representa a un organelo responsable del
metabolismo de los perxidos y lo nombro peroxisoma.
Discusin:
El trabajo de de Duve en el fraccionamiento celular proporciono una visin interna del
funcionamiento de estructuras celulares, al haber encontrado un mapa de la localizacin de
enzimas conocidas. Examinando el inventario de enzimas en una determinada fraccin celular,
encontr pistas que encubran sus funciones. Su cuidadoso trabajo resulto en el descubrimiento
de dos organelos, el lisosoma y el peroxisoma. Su trabajo tambin provey pistas importantes en
cuanto a la funcin de estos organelos. El lisosoma, donde de Duve encontr tantas enzimas
potencialmente destructivas, es ahora conocido por ser un importante lugar de degradacin de
biomoleculas. Se ha demostrado que en el peroxisoma de oxidan cidos grasos y aminocidos,
reacciones que producen una gran cantidad de perxidos de hidrogeno. En 1974, de Duve recibi
el premio Nobel de Fisiologa y Medicina en reconocimiento a su trabajo.