Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 1 1. Tema de la prctica: Normas de bioseguridad..\MANUAL DE BI OSEGURI DAD.OMS.pdf
2. Objetivo general:
o Conocer las normas de bioseguridad en el laboratorio que permitan reducir el riesgo de transmisin de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infeccin vinculadas a accidentes por exposicin a sangre, fluidos corporales de animales, personas, u otros materiales provenientes del campo.
3. Objetivos especficos:
Cumplir las medidas de prevencin de accidentes del personal que est expuesto a sangre, lquidos biolgicos, muestras contaminadas. Observar la conducta a seguir frente a un accidente con exposicin a dichos elementos.
4. Equipos: Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Pipetas volumetricas - automticas Probetas Vasos de precipitados Erlenmeyer Matraces Kit de diseccin Mechero de alcohol
7. Procedimiento: Lectura comprensiva de normas de bioseguridad y estndares de laboratorio. Introduccin al tema: Casi nunca es fcil prologar una obra, de cualquier naturaleza que ella sea, sinfnica, potica, cientfica pero cuando se est comprometido con la temtica que se trata y adems cuando uno sabe la seriedad con que los autores realizaron la tarea de bsqueda bibliogrfica, discusin y amplia consulta, la actividad se vuelve ms sencilla y se hace agradable. La "Bioseguridad" comienza con el pensar "qu queremos con ello?", "hacia dnde vamos?", "terminaremos alguna vez?". Seguramente esto es algo que no se terminar nunca. Es fundamental entonces privilegiar el conocimiento de lo que podemos llamar las "Buenas Prcticas", que pasan por el principio esencial de la Bioseguridad: 'No me contagio y no contagio". Estas normas nos indican cmo hacer para cometer menos errores y sufrir pocos accidentes y, si ellos ocurren, cmo debemos minimizar sus consecuencias. Es eminentemente prctica, fcil de entender y por sobre todo, fcil de aplicar. Esta norma debe ser considerada como el "Guin" de una pelcula donde figura claramente la esencia, el marco referencia, qu es lo que se quiere transmitir, cmo debemos actuar. La transformacin de un buen guin en una pelcula magistral depender siempre de Director y de los Actores. S que entre todos son capaces de obtener un "Oscar". Felicitaciones a los actores y a los autores. Tienen en sus manos una muy buena gua, no olviden que todo es mejorable, y el mejor homenaje que podemos hacer a los autores es leerla, aplicarla y, sin duda mejorarla. ..\MANUAL DE BIOSEGURIDAD.OMS.pdf CUESTIONARIO
1.- Cules son las normas de proteccin personal? 2.- Que caractersticas deber reunir la zona de trabajo del laboratorio? 3.- Seale los procedimientos de manipulacin y eliminacin de material y desechos contaminantes? 4.- Clasifique en el nivel que corresponda el laboratorio de prcticas docentes de Microbiologa
Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 2
1. Tema de la prctica: Esterilizacin
2. Objetivo general:
o Conocer las tcnicas y principios de esterilizacin de materiales, instrumentos y otros insumos de laboratorio.
3. Objetivos especficos:
Cumplir las recomendaciones de utilizacin de las tcnicas de esterilizacin especficas para cada elemento. . Operar adecuadamente los equipos destinados a la esterilizacin en laboratorio.
4. Equipos: Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
7. Procedimiento: Lectura comprensiva de tcnicas de esterilizacin. Demostracin del uso adecuado de instrumentos, equipos e insumos de laboratorio tiles para los procesos de esterilizacin. Material de estudio:
En el medio ambiente existen microorganismos que estn contaminando los objetos que se encuentran en l; as en el aire, agua y suelo existen patgenos y/o saprofitos que aprovechan los nutrientes a su alcance para desarrollarse o permanecer sobre ellos; debido a esto es difcil considerar algn lugar libre de microorganismos. Esta situacin crea dificultades en los estudios microbiolgicos, pues para estudiar los microorganismos es fundamental tenerlos en cultivos puros.
Esterilizacin:
Es la prctica que tiene por fin destruir (matar) todos los microorganismos contenidos en una preparacin. El material tratado se denomina estril. Desinfeccin: Es un proceso que elimina la mayora o todos los microorganismos sobre los objetos inanimados con la excepcin de esporos bacterianos. Se efecta por medio de agentes qumicos, clasificados en tres categoras: Alta, intermedia y baja, segn la intensidad de su accin. GERMICIDA: Agente que destruye microorganismos en especial patgenos, en tejidos vivos y objetos inanimados. Segn germen sobre el que acta, se lo denominar fungicida, virucida, bactericida, etc.. ANTISPTICO: Sustancia aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el crecimiento o la accin de microorganismos por inhibicin de su actividad o por su destruccin.
Desinfectante: se denomina as generalmente a un agente qumico capaz de destruir microorganismos patgenos o perjudiciales. Normalmente se utiliza este trmino para tratar objetos inanimados; por ello se pueden utilizar concentraciones ms elevadas y por un tiempo ms prolongado que en organismos vivos.
Se utiliza el trmino de sptico cuando un lugar u objeto posee microorganismos patgenos y stos pueden desarrollarse; el antnimo de este trmino es asptico.
En muchas ocasiones, como por ejemplo operaciones quirrgicas, se necesitan rigurosas condiciones de asepsia. as en ciruga el campo operatorio debe estar exento de grmenes patgenos y de todos aquellos que por extensin son potencialmente peligrosos.
Agentes antispticos: son sustancias qumicas capaces de destruir los microorganismos o detener su desarrollo o accin.
Bacteriosttico o Fungisttico: son productos como por ejemplo los antibiticos y fungicidas que dependiendo de su concentracin impiden la multiplicacin de una bacteria o de un hongo.
Bactericida o Fungicida: son productos que destruyen (matan) totalmente las bacterias u hongos.
Accin antimicrobiana. Est influenciada por diversos factores, entre ellos tenemos:
a) Tipo de microorganismo. Los agentes antimicrobianos poseen un espectro de accin determinado, as por ejemplo los estreptococos son sensibles a numerosos antibiticos, en particular a la penicilina, eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol, mientras que las micobacterias no son sensibles a algunos antibiticos como la rifampicina y estreptomicina.
b) Tipo de agente antimicrobiano. El agente puede ser fsico o qumico.
c) Medio ambiente. Ejemplo pH del medio, etc.
Agentes estabilizantes y desinfectantes:
I. Agentes Fsicos
1. Temperatura
La accin de la temperatura depender del medio ambiente, estado fsico-qumico de las clulas y del nmero de stas.
La mayora de las formas vegetativas son destruidas rpidamente a una temperatura de 100C cuando se encuentran en solucin acuosa, mientras que en un medio deshidratado son mucho ms resistentes. La gran mayora de las formas vegetativas bacterianas son inactivadas cuando son sometidas a temperatura de 50-60C por 30 minutos. Las formas esporuladas son extremadamente resistentes y requieren temperaturas superiores a los 100C y un mayor tiempo de exposicin. El nmero de clulas presentes en el medio a esterilizar tambin es importante.
Mtodos de aplicacin:
a) Fuego directo: consiste en exponer los objetos a la llama de un mechero (asas con hilos de platino, boca de tubos de ensayo y matraces, pipetas Pasteur, etc.). b) Ebullicin: el material a esterilizar se coloca en recipientes con agua a ebullicin (generalmente por 15 minutos). Se utiliza para esterilizar agujas, pinzas, jeringas, etc. c) Autoclave: es un aparato que esteriliza a travs de calor hmedo. Es un mtodo muy efectivo ya que el vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas coagulando su protoplasma. Se utiliza para esterilizar medios de cultivos, agua destilada, tierra, etc. La esterilizacin puede ser a travs de vapor a presin o sin presin (vapor fluente) y la fuente de energa calrica puede ser gas o electricidad. Generalmente se esteriliza a temperaturas que van entre 120 -160 C por un tiempo de 5-20 minutos con presiones que varan entre 5 y 20 p.s.i. d) Tindalizacin: este mtodo es muy poco utilizado en microbiologa para esterilizar lquidos o sustancias que no resisten el tratamiento a travs del autoclave debido al riesgo de alteracin. Consiste en calentar el medio a una temperatura de 60-70C durante 30 minutos 1 hora por tres veces consecutivas pero dejando un intervalo de 24 horas entre cada vez. A las temperaturas antes mencionadas todas las formas vegetativas son destruidas y las esporas termo resistentes pueden germinar entre cada paso y transformarse en formas vegetativas que son eliminadas con los tratamientos consecutivos. e) Pasteurizacin: se aplica a ciertos productos naturales donde se desea asegurar la conservacin momentnea de stos, sin alterar sus caractersticas organolpticas (color, olor, sabor). La leche por ejemplo se pasteuriza a una temperatura de 90C durante 30 segundos y luego se enfra a 10C. Por sus caractersticas, este mtodo no se puede considerar como esterilizacin. f) Horno Pasteur (Pupineles): la esterilizacin se efecta por calor seco a travs de circulacin de aire caliente a temperaturas que varan entre 120 y 180C por un lapso de tiempo de 20 minutos a 8 horas. La fuente de energa puede ser electricidad o gas. Este mtodo se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio, ejemplo: placas de Petri, tubos de ensayo, matraces, pipetas, etc.
Es necesario sealar que por razones de dilatacin en el proceso de esterilizacin, en el caso de pipetas volumtricas y matraces aforados, stos no deben esterilizarse a temperaturas superiores a los 140C.
2. Radiaciones
El efecto bactericida de las radiaciones es conocido desde hace muchsimo tiempo, as por ejemplo se sabe que la radiacin solar, o ms precisamente las radiaciones ultravioletas, son agentes naturales de esterilizacin. A continuacin se indican los diferentes tipos:
a) Radiaciones electromagnticas: las primeras radiaciones conocidas por su actividad son las ultravioletas; stas son las menos eficaces debido a su gran longitud de onda (se pueden utilizar para esterilizar bolsas de polietileno o papel, adems de otros usos); la regin ms activa de su espectro se encuentra entre los 2.600 y 2.700 ngstrom.
Los Rayos X y rayos Gama liberan una energa ms importante y debido a ello penetran ms profundamente. Por su poder de penetracin ms intenso estas radiaciones son ms
eficientes, pero sus instalaciones son costosas. Adems, la irradiacin tiene la desventaja que no puede localizarse en un solo objeto. Otra desventaja es que las radiaciones ionizantes no slo destruyen los microorganismos, sino tambin las sustancias que los rodean.
b) Radiaciones electrnicas: se logran por el efecto termoelectrnico que permite obtener una emisin continua de electrones, adems de la aceleracin de stos, bajo el efecto de un campo elctrico. Estos electrones lanzados a gran velocidad tienen un poder de esterilizacin idntico a los rayos gama. Ellos se pueden dirigir a voluntad sobre el objeto a esterilizar, pero su efecto es ms dbil que el de los rayos gama y su principal defecto es la alteracin de las substancias orgnicas sometidas a su accin.
c) Sonidos: stos no poseen una utilidad prctica en esterilizacin; sin embargo, es necesario sealar que los ultrasonidos poseen el poder de matar microorganismos en una suspensin lquida liberando su contenido endocelular; de la misma manera pueden alterar las sustancias qumicas en solucin. En microbiologa se utilizan para extraer constituyentes endocelulares, enzimas, o para hacer preparados de pared celular bacteriana. El ultrasonido tambin puede emplearse para limpiar grillas que se utilizan en el microscopio electrnico.
3. Eliminacin mecnica
a) Filtracin: se utiliza para esterilizar soluciones que posean sustancias termolbiles como por ejemplo protenas que no soportan altas temperaturas. Consiste en filtrar las soluciones a travs de filtros que slo dejan pasar partculas ultradiminutas. Los filtros son de diversos tipos; los primeros que se utilizaron fueron los filtros Chamberland (de porcelana); hoy da stos han sido reemplazados por filtros Seitz (Fig. 6), de vidrio fritado (Fig. 7), Berkefeld o filtros de diatomeas y membranas de acetato de celulosa (Fig. 8) llamados tambin filtros moleculares de porosidad graduada.
b) Centrifugacin: normalmente la centrifugacin se realiza a una aceleracin de 5.000g y permite separar partculas en suspensin en un medio lquido y tiene la desventaja que no se puede aplicar a grandes cantidades de lquido; adems, no permite una eliminacin total de los microorganismos.
II. Agentes Qumicos
No todos los agentes qumicos sirven como desinfectantes o como antispticos; algunos como los cianuros son venenos celulares de alta toxicidad; otros como los antibiticos y sulfamidas poseen una accin teraputica.
Su modo de accin est relacionado con: a) Oxidacin y desnaturalizacin de las protenas: los agentes oxidantes como el H2O2 y sus derivados halogenados, oxidan los grupos SH libres de las enzimas y los alteran irreversiblemente. Los metales pesados como el mercurio y sus derivados orgnicos e inorgnicos se combinan con estos grupos SH inactivndolos. Los alcoholes poseen una accin similar al calor coagulando las protenas.
b) Alteracin de la membrana citoplasmtica: un gran nmero de agentes bactericidas actan directamente sobre la membrana citoplasmtica que juega un rol importante en la permeabilidad selectiva de los nutrientes. Debido a que esta membrana no es otra cosa que una barrera lipoproteica, los agentes liposolubles son los ms activos; tales son los compuestos fenlicos, jabones y sobre todo los detergentes. Estos ltimos gracias a sus grupos hidrosolubles y liposolubles se fijan sobre la membrana lipdica de la bacteria y sobre el medio acuoso circundante. Ellos modifican y desnaturalizan la estructura de la membrana suprimiendo as sus funciones vitales de permeabilidad.
c) Accin sobre el metabolismo: numerosas sustancias qumicas son bactericidas o bacteriostticas por inhibicin enzimtica, as tenemos que ciertos cianuros y los fluoruros son verdaderos venenos respiratorios inutilizables como antispticos.
Los colorantes no presentan la toxicidad antes indicada, as por ejemplo los colorantes bsicos (azul de metileno, violeta de genciana) reaccionan con los cidos nucleicos de la bacteria, principalmente con los ribonucleicos que estn presentes en abundancia en el citoplasma; estas combinaciones inactivan todas las funciones de la bacteria.
Otros agentes son los mutagnicos (acridinas y sus derivados) y los quelatricos.
1. Oxidantes
a) Agua oxigenada: sta y todos los compuestos que dan origen a ella (perboratos y persulfatos alcalinos) son antispticos eficaces.
b) Cloro y sus derivados: el cloro bajo su forma gaseosa o diversas combinaciones qumicas, es un antisptico muy utilizado; al respecto es necesario sealar que bajo su forma gaseosa es un producto peligroso y delicado de manejar. Sus compuestos lquidos como los hipocloritos y cloraminas son los ms difundidos. Todos los compuestos clorados siguen un mecanismo semejante de accin formando el cido hipocloroso; en esta reaccin el oxgeno es liberado dando as un intenso poder oxidante que destruye instantneamente a la mayor parte de los microorganismos que entran en contacto con l. Las formas esporuladas son ms resistentes y para su inactivacin se necesitan dosis 100 veces ms elevadas que las normales. La accin de estos compuestos clorados est relacionada con el pH del medio.
c) Yodo: es uno de los primeros compuestos que se utiliz como desinfectante; siendo principalmente de accin bactericida y fungicida. Es poco soluble en agua pero fcilmente soluble en alcohol o en soluciones acuosas de yoduro de potasio.
2. Alcoholes: el alcohol etlico en concentraciones de 50-70% es uno de los ms utilizados; posee un efecto bactericida pero no ejerce una accin sobre las formas esporuladas. El alcohol metlico es menos activo pero ms nocivo. Los alcoholes superiores como los proplicos, butlicos y amlicos tienen un poder mayor pero su baja solubilidad al agua limita su uso.
3. Metales pesados y sus sales: ciertos metales tienen un efecto bactericida, este poder ejercido a dosis nfimas se llama oligodinmico y se puede explicar por una pobre ionizacin del metal y por la afinidad de estos iones con las protenas celulares. La plata bajo su forma metlica ha sido uno de los elementos ms utilizados. Las sales de metales pesados son ms eficaces y muy utilizadas; las ms comunes son las sales de Ag, Hg, Cu y Zn. Todas inactivan la clula precipitando las enzimas o combinndose con sus grupos - SH; esto explica a su vez la actividad y toxicidad que ejercen tanto sobre las clulas del hospedante como sobre las clulas bacterianas.
4. Fenoles: gracias a su grupo fenlico poseen propiedades bacteriostticas o bactericidas. El fenol como desinfectante ha sido reemplazado por antispticos menos custicos; a pesar de ser bactericida y fungicida es poco activo sobre las formas esporuladas y su accin puede ser favorecida por Na o K; atenuada por la materia orgnica e inhibida en presencia de soda. En general los fenoles se utilizan en medicina como desinfectantes y como antispticos pulmonares e intestinales. Algunos de ellos son: fenol, hexaclorofeno, cresol-brut, timol, resorcina, hexilresorcina. 5. Jabones y detergentes sintticos: los jabones son sales sdicas o potsicas de cidos grasos de pesos moleculares elevados (ac. oleico, linoleico, ricinoleico) cuyo poder antisptico vara segn las especies microbianas. Su accin mecnica reduce la fuerza de tensin superficial y aumenta el poder humectante del agua. Los microorganismos son aprisionados por la espuma y luego eliminados con el enjuagado. Junto con los jabones alcalinos se han sintetizado otros compuestos de elevado poder mojante con una accin bactericida paralela, stos son los detergentes, que se dividen en:
a) Detergentes aninicos (el grupo activo es el aninico). b) Detergentes catinicos (poseen un grupo activo catinico; los ms importantes son los amonios cuaternarios) entre los cuales tenemos: cloruro de alquil-dimetil-benzil-amonio, bromuro de cetil-trimetil-amonio, bromuro de dimetil-cetil-cicloexil-amonio). c) Detergentes no inicos (no son de inters debido a su ausencia de actividad antimicrobiana).
6. Colorantes: la mayor parte se utilizan como antispticos de uso local y normalmente poseen una accin selectiva ya sea sobre bacterias Gram(+) o Gram(-), as por ejemplo el cristal violeta inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias Gram(+). Algunos colorantes son: azul de metileno, verde de malaquita, verde brillante, violeta de genciana.
7. Gases: A travs de este mtodo se pueden esterilizar productos inestables al calor, objetos de plstico, locales, etc.
Tipos de gases utilizados: a) Formaldehido: los vapores de formaldehido se pueden obtener por calentamiento de soluciones diluidas de formaldehido o por los productos de polimerizacin de este aldehdo. Estos vapores poseen un poder bactericida que aumenta con la temperatura y humedad; as por ejemplo a 22C en presencia de un 60-80% de humedad, el tiempo de esterilizacin ser de algunas horas, siendo rpidamente destruidas las formas vegetativas y ms lentamente las
formas esporuladas. Debido a la toxicidad de los vapores, stos deben evacuarse una vez terminada la desinfeccin. b) Oxido de etileno: posee un amplio espectro de accin con un gran poder esporicida. Su uso est ligado a una mezcla con anhdrido carbnico o fren, ya que en su estado puro es prcticamente inutilizable debido a su alto poder inflamable. El xido de etileno es gaseoso a temperatura ambiente y lquido a una temperatura inferior a 10C. Su accin en base a la temperatura le permite entrar en contacto con los productos y objetos ms diversos y su poder penetrante asegura la esterilizacin de telas y an de ciertos plsticos. La utilizacin de aparatos especialmente diseados para su aplicacin, han ampliado su campo de accin. c) B-propiolactona: es un compuesto lquido que a temperatura ambiente emite vapores que son bactericidas, esporicidas y fungicidas. Es 25 veces ms activo que el formol y 400 veces ms activo que el xido de etileno. Tiene la ventaja que no es inflamable ni explosivo, posee una accin penetrante y es de rpida eliminacin. Se puede utilizar para esterilizar materiales quirrgicos, hilo para suturas, desinfeccin de locales e incluso medios de cultivos. d) Esencias voltiles (aceites esenciales): las esencias naturales tienen un poder bacteriosttico limitado que se debe a sus compuestos fenlicos y terpnicos y tambin en menor medida a sus alcoholes y aldehdos.
Ejercicios
- Conozca los diferentes mtodos y equipos de esterilizacin. (Dibuje)
- Prepare material de vidrio y esterilcelo en la estufa de esterilizacin.
- Prepare un medio de cultivo y utilice el autoclave para su esterilizacin.
Cuestionario
1. Describa que materiales requieren esterilizarse con calor hmedo y cuales con calor seco. 2. A que temperatura se somete .
Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No.3
1. Tema de la prctica: Preparacin y dispensacin de medios de cultivo para hongos y bacterias
2. Objetivo general:
o Conocer las tcnicas de preparacin, conservacin y uso de los medios de cultivo para el crecimiento y desarrollo de microorganismos existentes en el ambiente suelo, aire, agua, materiales de origen vegetal, para su estudio y clasificacin.
3. Objetivos especficos:
Adiestrar al estudiante en las tcnicas de dispensacin de medios de cultivo en platos petri, tubos de ensayo. Preparar medios de cultivo en estado slido y lquido. Demostrar las bondades de los medios de cultivo con caractersticas especficas de constitucin qumica. 4. Equipos: Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Pipetas volumetricas - automticas Probetas Vasos de precipitados
Erlenmeyer Matraces Kit de diseccin Mechero de alcohol Platos petri Tubos de ensayo
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Medios de cultivo
7. Procedimiento:
Preparacin de un medio de cultivo En la preparacin de un medio de cultivo, se pueden distinguir los siguientes pasos:
Extraccin de los medios nutritivos (en caso de medios naturales o mixtos). Adicin de sustancias nutritivas (ej. glucosa) y/o de sostn (ej. agar). Ajuste del pH. Reparticin. Esterilizacin.
Medios de cultivos ms comnmente utilizados Agar agua. Se utiliza preferentemente para aislar hongos del suelo. Agar 10 - 18 g Agua 1000 ml (destilada, desionizada o potable).
Se agrega al agua el agar y se calienta hasta licuarlo. Se distribuye en tubos o matraces y se esteriliza a 15 p.s.i. durante 20 minutos.
Agar-papa-dextrosa (APD). Se usa para aislar la mayora de los hongos. Papas peladas 200,0 g Dextrosa 12,5 g Agar 20,0 g Agua destilada 1.000,0 ml
Las papas peladas se hierven en 1.000 ml de agua destilada hasta que estn cocidas. Posteriormente el jugo se filtra mediante gasa y algodn hidrfilo, se agrega el agar y la dextrosa y se enrasa a 1.000 ml con agua destilada. Se reparte en matraces o tubos y se esteriliza en autoclave a 15 p.s.i. por 20 minutos.
Agar-papa-dextrosa acidificado. este medio permite inhibir el desarrollo de bacterias, pudiendo utilizarse para aislar hongos a partir de tejidos enfermos (ej. races).
La preparacin se realiza en forma idntica al APD; salvo, que despus de esterilizado se agregar 50 gotas de cido lctico 50% por litro de medio de cultivo.
Agar nutritivo o agar peptona. Se utiliza para aislar la mayora de las bacterias, pudiendo tambin servir como medio para conservar microorganismos. Extracto de carne 3 g Peptona 10 g Agar 18 g Agua destilada 1.000 ml
Los ingredientes se disuelven en 500 ml de agua destilada, se lica el agar a bao Mara, se reparte en tubos o matraces y se esteriliza a 15 p.s.i. durante 20 minutos.
Caldo nutritivo. Se emplea para el cultivo lquido de bacterias y difiere del agar nutritivo en que se omite el agar, pudindose tambin incluir un carbohidrato (10 g de sacarosa o dextrosa).
Suplementos antibacterianos
Cloranfenicol. Antes de esterilizar agregue 0,05 g/L de cloranfenicol suspendido en 10 ml de alcohol etlico 95%; mezcle bien y esterilice a 118C durante 10 minutos.
Penicilina. Preparar una solucin stock de agua destilada estril con 60 mg (100.000 unidades) y guardar en refrigerador. Agregar 1 ml de la solucin a 10 ml de medio de cultivo previo a depositarlo en las placas de Petri.
Estreptomicina. Preparar una solucin stock de agua destilada estril de 750 ml con 1 g de estreptomicina y guardar en refrigerador. Agregar 1 ml de la solucin a cada 10 ml de medio de cultivo previo a depositarlo en la placa de Petri; la concentracin es de 100 unidades/ml.
Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 4
1. Tema de la prctica: Aislamiento de microorganismos.
2. Objetivo general:
Ejercitarse en las tcnicas de aislamiento y purificacin de microorganismos comunes del ambiente suelo, agua, aire.
3. Objetivos especficos:
Conocer la estructura de hongos comunes. Ejercitarse en el manejo del microscopio compuesto y de diseccin. (Estereoscopio).
4. Equipos: Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Pan hmedo Fruta en descomposicin Pipetas volumetricas - automticas Probetas Vasos de precipitados Erlenmeyer Matraces
Kit de diseccin Mechero de alcohol Platos petri conteniendo medio de cultivo
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Agua destilada
7. Procedimiento: Aislamiento de microorganismos de material vegetal enfermo.
Con la ayuda de una aguja de diseccin raspe el sitio en donde usted visualice la presencia de hongos, o zona afectada (podrida), y pngalo en la placa petri conteniendo medio de cultivo, con ligeros movimientos circulatorios. Selle el plato petri con papel parafilm. Etiquete el aislamiento con la informacin de procedencia del material, fecha y medio de cultivo utilizado. Incube de forma invertida en una estufa a 28C por 48 horas
Aislamiento de microorganismos del suelo
Tome la muestra de suelo seca y tamizada y coloque en forma de grumos en el interior de un plato petri conteniendo medio de cultivo Incube la muestra en el interior de una estufa a 28C por 48 horas Observe el crecimiento y desarrollo de los microorganismos
Aislamiento de microorganismos del aire
Deposito un plato petri conteniendo medio de cultivo en el rea en la que usted quiere obtener informacin de la presencia de microorganismos. Abra la tapa y exponga el medio de cultivo por cinco minutos al ambiente, en el reposaran los microorganismos existentes en el rea.
Proceda a la observacin.
.
Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 5
1. Tema de la prctica: Observacin e identificacin de microorganismos Aislados el ambiente suelo, agua, aire.
2. Objetivo general:
Ejercitarse en las tcnicas de observacin macroscpica y microscpica de microorganismos comunes del ambiente suelo, agua, aire.
3. Objetivos especficos:
Conocer la estructura de hongos comunes. Ejercitarse en el manejo del microscopio compuesto y de diseccin. (Estereoscopio).
4. Equipos: Microscopio estereoscopio Microscopio compuesto Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Placas porta objeto Placas cubreobjeto Vasos de precipitados Erlenmeyer Matraces Kit de diseccin Mechero de alcohol Platos petri conteniendo medio de cultivo
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Agua destilada Lactofenol
7. Procedimiento: Observacin macroscpica
Coloque debajo del lente objetivo del microscopio estereoscopio (diseccin), una parte del material a observar, examine cuidadosamente acercndolo, hasta tener una buena visualizacin (60 x). Describa y dibuje lo que observe.
Observacin microscpica
limpie la placa portaobjetos. La placa debe estar exenta de pelusas, esto lo consigue flamendola sobre la columna de fuego del mechero bunsen. Con el cuenta gotas coloque una gota de agua destilada, lactofenol o colorante sobre la placa portaobjeto. Con la ayuda de una aguja de diseccin raspe el sitio en donde usted visualice la presencia de hongos, o zona afectada (podrida) y pngalo en la placa con ligeros movimientos. Coloque el cubre objeto, haciendo coincidir una arista de la placa con el borde del agua. Ponga la placa sobre la platina del microscopio, asegurndola mediante las pinzas. Proceda a la observacin.
Resultados.
Describa y dibuje lo que observe. Realice una descripcin detallada de la clasificacin del organismo observado y su etiologa
Cuestionario.
Seale con que lente (aumentos) hace la observacin de hongos? Cual es la estructura de la pared celular de los hongos
Bibliografa
.
Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 6
1. Tema de la prctica: Control biolgico
2. Objetivo general:
Evaluar la accin antagnica de microorganismos tiles en la produccin agropecuaria
3. Objetivos especficos:
Estudiar las caractersticas, hbitos y comportamiento de los microorganismos antagnicos en contra de microorganismos patgenos
4. Equipos: Microscopio estereoscopio Microscopio compuesto Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Vasos de precipitados Kit de diseccin Mechero de alcohol Platos petri conteniendo medio de cultivo Sacabocado
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Agua destilada
7. Procedimiento: Con la ayuda de un sacabocado #3 coloque un disco de la cepa del microorganismo antagnico en un extremo de la caja petri, y en el otro un disco del patgeno.
Selle el plato petri con papel parafilm Etiquete el plato indicando el nombre del medio de cultivo utilizado, material de precedencia, fecha. Incube a 28C Registre datos de crecimiento radial a partir del segundo da de realizada la siembra Tabule los datos Anlisis de datos Exposicin de resultados
Cuestionario. Defina que es Control biolgico Cules son los objetivos de CB. Qu tipo de antagonismos existen en la naturaleza?
Bibliografa
.
Firma
Pa An P
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 7
1. Tema de la prctica: Aislamiento de bacterias del ambiente suelo, agua, aire.
2. Objetivo general: o Conocer y practicar las tcnicas de aislamiento de bacterias provenientes de ambientes diferentes. 3. Objetivos especficos: Estudiar las caractersticas morfolgicas de los diferentes gneros de bacterias Conocer hbitos y comportamiento de las bacterias en distintos medios de cultivo
4. Equipos: Microscopio estereoscopio Microscopio compuesto Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Vasos de precipitados Kit de diseccin Mechero de alcohol Platos petri conteniendo medio de cultivo Sacabocado Material vegetal enfermo
6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico Agua destilada
7. Procedimiento: Aislamiento de bacterias de material vegetal enfermo.
Proceda a desinfectar con etanol 90% el material vegetal en estudio Con la ayuda de un bistur extraiga parte de material vegetal enfermo y deposite en una vaso de precipitacin conteniendo agua destilada estril, djelo en reposo por 5 minutos. Deposite 1 ml en el interior de una caja petri conteniendo medio de cultivo selectivo para el crecimiento de bacterias y distribyalo en la superficie de agar con suaves movimientos giratorios. Selle la caja petri con papel parafilm Etiquete la caja petri consignando la informacin referente a procedencia del material, fecha. Incube por 48 horas a 32C Realice observaciones peridicas de control de contaminacin
Aislamiento de bacterias del suelo
Tome la muestra de suelo seca y tamizada y coloque en un vaso de precipitacin, formando una solucin homognea Djela reposar por cinco minutos, tome 1 ml de la solucin y depostela en el interior de una caja petri conteniendo el medio de cultivo apropiado para el crecimiento de bacterias del suelo Incube la muestra en el interior de una estufa a 32C por 48 horas Observe el crecimiento y desarrollo de los microorganismos
Aislamiento de bacterias del aire
Deposito un plato petri conteniendo medio de cultivo apropiado para el crecimiento y desarrollo de bacterias en el rea en la que usted quiere obtener informacin de la presencia de microorganismos. Abra la tapa y exponga el medio de cultivo por cinco minutos al ambiente. Incube a 32C por 48 horas Proceda a la observacin.
Cuestionario.
1. Que agrupaciones son fcilmente encontradas? 2. Defina que es colonia bacteriana. Bibliografa
. Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 8
1. Tema de la prctica: Tincin de Gram. (Hans Christian Gram)
2. Objetivo general: o Conocer y practicar las tcnicas de preparacin y observacin microscpica de bacterias 3. Objetivos especficos: Estudiar las caractersticas morfolgicas de diferentes gneros de bacterias Determinar la reaccin Gram negativa y positiva de bacterias.
4. Equipos: Microscopio estereoscopio Microscopio compuesto Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin Cmara de flujo laminar Autoclave Cocineta elctrica
5. Materiales: Cultivos bacterianos Placas porta objeto Laminas cubre objeto Vasos de precipitados Kit de diseccin Mechero de alcohol Platos petri conteniendo medio de cultivo Sacabocado Asas de inoculacin Goteros
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Agua destilada Cristal violeta Alcohol cetona Yoduro de potasio Safranina Aceite de inmersin
7. Procedimiento:
Tincin simple - Limpie bien las placas portaobjeto, eliminando la grasa y pelusas. Las grasas sern eliminadas con xilol y las pelusas haciendo una o dos pasadas de la placa por sobre la columna de calor del mechero. - Frotis. Consiste en extender o repartir la suspensin de bacterias sobre la placa portaobjeto, una vez que ha sido depositada la gota de agua-bacteria, ste extensin se har con la ayuda de un asa o placa portaobjeto limpia, lo que permitir realizar una mejor observacin - Fijacin. Fije las bacterias a la placa haciendo pasar tres veces el portaobjeto en la llama del mechero de alcohol a una altura prudencial, para no deformar las agrupaciones bacterianas que pudieran existir. - Tincin. emplee un solo colorante como el azul de metileno, fuscina, rojo congo, tie la placa completamente y deje actuar el colorante por un minuto. - Retire el colorante, enjuague y luego squela a la columna del mechero de alcohol o por simple exposicin al aire con movimientos horizontales - Agregue una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observe las bacterias al microscopio, utilizando el lente hmedo o de inmersin.
Procedimiento:
Tincin Compuesta (Gram)
- Coloque el colorante A (violeta de genciana) por espacio de medio minuto., elimine el exceso. - Agregue el colorante B (solucin de yodo) por un minuto. Elimine el exceso con leves sacudimientos de la placa o con la pisceta. - Aada la solucin C (safranina) por 30 segundos. - Lave la placa con agua corriente y luego squela a la columna del mechero de alcohol, o por simple exposicin al aires con movimientos horizontales. - Agregue una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observe las bacterias al microscopio, utilizando el lente hmedo o de inmersin.
Resultados y comentario.
Observe y dibuje la forma y agrupacin bacteriana.
Cuestionario
Qu es una tincin diferencial? Defina cual es el rol de los colorantes utilizados en la Tincin compuesta
Bibliografa
. Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 9
1. Tema de la prctica: Anlisis microbiolgico de una muestra de orina, y residuos fecales de animales
2. Objetivo general: o Conocer y practicar las tcnicas de preparacin y anlisis de muestras de orina y residuos fecales en animales de granja. Lquido excretado por los riones a travs de las vas urinarias, con el cual se eliminan sustancias innecesarias para el organismo. Desempea un papel importante en la regulacin del balance de lquidos y electrolitos y del equilibrio entre cidos y bases. En las personas sanas es clara y de color amarillo. En el animal ste color no cambia. La cantidad de orina producida diariamente es de 1 a1,5 litros, en la especie humana (consultar en animales) valor que aumenta si se ingieren muchos lquidos y disminuye en caso de sudoracin intensa. 3. Objetivos especficos: - Visualizar sustancias innecesarias para el organismos y que son expulsadas en la orina Observar los tipos de cristales ms comunes secretados en la orina. 4. Equipos: Microscopio compuesto Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin
5. Materiales: Muestra de orina Placas porta objeto Laminas cubre objeto Mechero de alcohol
Goteros
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Agua destilada Aceite de inmersin Solucin salina
7. Procedimiento: Tome 40 ml de la muestra en estudio Sumerja la tira colorimtrica de parmetros biofsicos Registre los datos Centrifugue la muestra colocada en un tubo de ensayo por cinco minutos a 1500 rpm Elimine el sobrenadante y coloque el sedimento en un porta objeto Observe el sedimento urinario al microscopio compuesto (lente 40 x -100 x) Dibuje lo que observa
Realice el frotis de la muestra Cubra la preparacin con solucin de cristal violeta djela reposar por un minuto Lave con agua destilada estril Cubra la preparacin con yodo de gram lave con agua destilada. Aada alcohol cetona Elimine el exceso Lave con agua destilada estril Cubre con rojo congo o safranina y djelo actuar por dos minutos Elimine el exceso, enguaje con agua destilada esteril Seque la muestra al calor del mechero de alcohol Observe al microscopio
Resultados y comentario.
Dibuje lo que observa.
Cuestionario.
Que sustancias son anormales en una muestra de orina Cual es el pH normal
Bibliografa
. Firma
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA Santo Domingo Gua de prcticas de Laboratorio
Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa Prctica No. 10
1. Tema de la prctica: Anlisis microbiolgico de la leche
2. Objetivo general: o Aplicar las tcnicas de anlisis microbiolgico de muestras de leche para su categorizacin.
3. Objetivos especficos: - Aplicar el recuento total en una muestra de leche para reconocer su pureza. - Aplicar las pruebas de anden para conocer la calidad de una muestra de leche - 4. Equipos: Microscopio compuesto Estufa de incubacin Estufa de esterilizacin
5. Materiales: Muestra de leche Mechero de alcohol Asas de inoculacin Goteros Vasos de precipitacin Probetas de 500 ml Lactodensmetro Tubos de ensayo Termometro Bureta de 500 ml
6. Reactivos e insumos: Alcohol antisptico Agua destilada Fenolftalena KOH Azul de metileno
7. Procedimiento:
Determinacin de la densidad de la leche Verter la leche por las paredes de la bureta sin hacer espuma Colocar suavemente el lacto densmetro dentro de la bureta y dejarlo flotar Cuando est en reposo hacer la lectura
RESULTADOS Por cada grado centgrado sobre 15 C aumentar 0.2 Por cada grado centgrado bajo 15C disminuir 0.2 Ejemplo: el lactodensimetro indica 28 a la temperatura 25C Correccin: 28 + (10 x 0.2) -28 + 2 = 30
Leche pura = 1.028 1.033 Leche aguada = menos de 1.028 Leche descremada = 1.0033 1.037
PRUEBA DE REDUCTASA REDUCCIN DEL AZUL DE METILENO
INTRODUCCIN Se basa en la observacin del cambio de color que sufre el azul de metileno. El tiempo que requiere este cambio depende del nmero de bacterias, del consumo de oxgeno por ellas, de la multiplicacin de dichas bacterias. Un tiempo de reduccin corto es indice de falta de cuidado en la produccin de esa leche, uso de utensillos mal lavados, falta de enfriamiento de la leche a temperaturas favorables para el crecimiento de microorganismos
OBJETIVO Determinar la presencia de microorganismos que adulteran la calidad de la leche MATERIALES Tubos de ensayo de 40 ml Recipiente para muestra de leche Incubadora a 37 C Pipeta de 1 ml
PROCEDIMIENTO Poner en tubos de prueba 40 ml de leche Agregar 1 ml de solucin de azul de metileno Mover el tubo para mezclar la leche y el colorante Colocar en una estufa incubadora a 37C Realizar lecturas cada hora
RESULTADOS Realizar los controles y tomar nota de las coloraciones. Cuando se han decolorado las dos terceras partes del tubo se considera totalmente decolorado, comparar los resultados con la siguiente tabla:
Ms de 5 horas = muy buena 3 a 5 horas = buena 2 a 3 horas = regular 1 hora = mala Menos de 1 hora = psima
DETERMIANCIN DE LA ACIDEZ INTRODUCCIN
La acidez de la leche es un dato que nos indica la carga microbiana de la leche, el cuidado en cuanto a higiene y conservacin. La leche debe estar entre 16 y 18 Dornic. En la sierra por el transporte largo tenemos que aceptar la leche de 20 Dornic. El fermento lctico debe estar entre 70 y 90 Dornic, de lo contrario debemos preparar un nuevo cultivo
OBJETIVO Determinar la cantidad de microorganismos que intervienen en los procesos de conservacin de la leche hasta su procesamiento y consumo. MATERIALES - Vaso de precipitacin de 50 ml - Gotero - Acidmetro Pipeta de 10 ml Solucin 1/10 normal de NaOH(Hidrxido de sodio) Solucin indicadora de fenoltaleina 2% bureta
PROCEDIMIENTO Colocar 9 ml de leche en el vaso de precipitacin Agregar 3-4 gotas de fenoltaleina Llenar la bureta con la solucin de NaOH 1/10 normal. Empezar a titular la leche en el vaso. Cuando la leche toma el color rosado, la titulacinest terminada. Debe mantenerse el color durante 10 segundos como mnimo.
RESULTADOS Dcimas de ml de NaOH N/ 10 utilizada = acidez en grados Dornic