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Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Carolina Villafae y Duina Posso Duque
Protocolos de extraccin de ADN total de animales mtodo de
Salting Out
Nota: este protocolo ha sido ensayado utilizando sangre, hgado, y corazn frescos de tortugas,
aves y primates.

1. Materiales
-Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul
-Recipiente para hielo
- Bao de Mara
-Campana de extraccin
- Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm
- Juego de diseccin, que incluya: una tijera pequea, una pinza entomolgica y un bistur
- Congelador (-80C)
- Cmara de electroforesis horizontal
-Tubos de 1,5ml
-Guantes de ltex sin polvo


2. Reactivos
-Tris-HCL
-EDTA
-SDS
-NaCl
-Proteinasa K
-Hielo
-Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol (25:24:1)
-Acetato de amonio 7.5M
-Etanol
-TE (10:1)
-RNasa






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Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Carolina Villafae y Duina Posso Duque


3. Preparacin de soluciones
A) Buffer de extraccin
Reactivo Concentracin en solucin
Tris-HCl (pH=8.0) 10mM
EDTA (pH=8.0) 1mM
SDS 0.1%
NaCl 10mM

Nota: Mezcle los ingredientes, complete al volumen deseado y autoclave. Este Buffer se puede
almacenar por meses en la nevera, a 4C.

B) T10E1
Reactivo Concentracin en solucin
Tris-HCl (pH=8.0) 10mM
EDTA (pH=8.0) 1mM

Nota: Completar el volumen con agua destilada, autoclavar y guardar al 4C.

4. Protocolo
1. Tomar 5l de sangre pura o su equivalente si est diluida.
2. Adicionar300l de buffer de lisis.
3. Incubar en hielo por 30 min invirtiendo los tubos ocasionalmente.
4. Adicionar 10 l de Proteinasa K (10mg/ml) y digerir a 55-60 C por 3 horas mezclando
ocasionalmente por inversin (puede ser que se necesite ms tiempo para la lisis).
5. Adicionar 150 l de acetato de amonio 7.5 M y mezclar por inversin.
6. Incubar a -80C por 20 min.
7. Centrifugar a 13000rpm por 20 10 min.
8. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo y descartar el precipitado.
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9. Adicionar 2 volmenes de etanol al 100% fro.
10. Invertir los tubos varias veces para que el ADN se precipite.
11. Incubar a -80C por 20 min.
12. Centrifugar a 13000rpm por 20 min.
13. Con cuidado, retirar el etanol evitando que el pellet se valla con l.
14. Adicionar aproximadamente 600l de etanol al 70% y lavar por inversin.
15. Centrifugar a 13000rpm por 10 min.
16. Retirar el etanol dejando el pellet en el tubo.
17. Realizar un spin final a 13000rpm por 5 min. y utilizar una punta nueva para pipetear con
cuidado el etanol restante
18. Secar al aire completamente.
19. Adicionar 50-70l de 1xTE (T10 E1) para resuspender el ADN, o en su defecto resuspender en
agua milliQ autoclavada.

6. Bibliografa
Fitzsimmons C J, Schmutz S M, Bergen R D and McKinnon J J 1998 A potential association
between the BM1500 microsatellite and fat deposition in beef cattle. Mammalian Genome 9: 432-
434

Como citar este protocolo:
Carolina Villafae y Duina Posso Duque. Protocolos de extraccin de ADN total de animales
mtodo de Salting Out . Protocolos de laboratorio UEG (http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/).
2009. Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Altos de Pipe- Venezuela.