13-3-2014

Extraccin de ADN plasmdico por el

mtodo de lisis alcalina (Sambrock) e
identificacin de corte con enzimas de
restriccin en E. coli

Jaral H.D.M., Landin A.M.A., Ramrez C.M., Soto A.C.A





.

Dr. Gabriela Medina Ramos
BIOINGENIERA

Universidad Politcnica de Guanajuato
Departamento de Ingeniera Agroindustrial, Av. Universidad, localidad Juan Alonso
s/n, (38483), Cortzar, Guanajuato, Mxico.
Jaral H.D.M., Landin A.M.A., Ramrez C.M., Soto A.C.A.

PRACTICA 1: Extraccin de ADN plasmdico por el mtodo de lisis
alcalina (Sambrock) e identificacin de corte con enzimas de
restriccin en E. coli.

OBJETIVO
Extraer ADN plasmdico por el mtodo Sambrock, realizar digestin de ADN con enzimas
de restriccin EcoRI y aplicar electroforesis horizontal en geles de agarosa.
RESUMEN
En la Universidad Politcnica de Guanajuato se realiz extraccin de ADN bacteriano por
l mtodo de lisis alcalina (Sambrock). Se llev acabo un corte con enzimas de restriccin
y posteriormente se realiz una electroforesis.
INTRODUCCIN
El ADN es una estructura qumica cuyos elementos fundamentales (nucletidos) se
organizan de manera lineal generando enormes secuencias de informacin gentica de
los seres vivos. El ADN puro se le puede dar diferentes usos, puede ser utilizado para
investigacin, para deteccin de rasgos de inters como resistencia a enfermedades o
virus, la secuenciacin y clonacin de ADN, la conservacin de la biodiversidad, etc.
Existen distintos mtodos para la extraccin y secuenciacin de ADN algunos de ellos son
extraccin de ADN de suspensiones bacterianas, corte con enzimas de restriccin y
electroforesis (Coll, 2014).
E. coli
Existe una variedad de E. coli, denominada 0157:H7, causa una diarrea hemorrgica, y a
veces puede provocar insuficiencia renal e incluso la muerte, especialmente en nios y en
adultos con sistemas inmunolgicos debilitados. En 1982 se identific el primer brote de
E. coli O157:H7 por comer carne de hamburguesas contaminadas con la bacteria. Desde
entonces, las epidemias de E. coli O157:H7 han sido asociadas con otros tipos de
alimentos (Sanz, 2014).
Extraccin de ADN en suspensiones bacterianas
De todas las muestras biolgicas que podemos someter a un proceso de extraccin de
ADN, las suspensiones bacterianas, son quizs las que ofrecen menos problemas por la
homogeneidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones densas de bacterias
gramnegativas pueden liberar cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves
como pueden ser una simple ebullicin, congelacin o una combinacin de ambas (frezze
& thaw) (Parque Cientifico de la Udg, 2009).
Corte con enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin son protenas cuya funcin es cortar las hebras de ADN. Se
podra decir que son tijeras moleculares que cortan ADN. Lo hacen en forma especfica.
Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que
reconoce una secuencia particular de nucletidos. Esa secuencia especfica para cada
enzima se denomina sitio de restriccin. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se
posiciona sobre la molcula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia (MEJA,
2009).
Electroforesis
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica
controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a
travs de una matriz gelatinosa.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero
de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 C y formar un gel, semislido al
enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las
molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000
nucletidos (M. Somma, 2008).
MATERIALES Y MTODOS
Se inoculo una colonia de E. coli y se tomaron 2ml y se incubo toda la noche a 37C.
Una vez realizada la incubacin se pas a tubos eppendorf y se centrifugo por 5 minutos
a 8000 rpm (figura 1) y se elimin el sobrenadante del medio LB.

Figura 1. Centrifuga

Soluciones
Solucin 1 Glucosa -50mM Tris pH 8.0 -25nM EDTA pH 8.0 -10mM
Solucin 2 NaOH 0.2N SDS 1%
Solucin 3 Acetato de potasio 3M pH 5.2
Tabla 1. Preparacin de soluciones
Se resuspendio el pellet celular con 100 l de solucin 1 y se homogenizo con vortex por
60 segundos, se mantuvo por 10 minutos a 4C (Figura 2).

Figura 2. Homogenizador Vortex
Se adiciono 200 l de solucin 2, se resuspendio y se homogenizo en el vortex por 60
segundos mantenerlos por 10 minutos a 4C.
Posteriormente se adiciono 150 l de solucin 3 y se homogenizo con vortex mantenerlos
por 10 minutos a 4C. Enseguida se centrifugo a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4C, se
recato el sobrenadante y se adiciono 1 l de ARNasa, se incubo por 30 min a 37C
(Figura 3).

Figura 3. Incubadora
Lavados
El primer lavado se realiz con fenol relacin v/v vertiendo 240 l de fenol en 240 l de la
muestra, se mezcl con vortex y se centrifugo a 10 000 rpm por 5 minutos, recuperando la
fase superior en un tubo eppendorf limpio obteniendo un volumen 480 l
El segundo lavado fue con solucin fenol-cloroformo relacin v/v se mezcl y centrifugo a
10 000 rpm por 5 minutos (figura 4) recuperando la fase superior en un tubo eppendorf
limpio.

Figura 4. Segundo lavado
En el ltimo lavado fue cloroformo en una relacin v/v se mezcl y centrifugo a 10 000
rpm por 5 minutos recuperando la fase superior en un tubo eppendorf limpio
Al sobrenadante rescatado se le adiciono 2.5 v de etanol absoluto (-20C) adicionando
300 l de sobrenadante y 500 l de etanol y se almacenndolo 1 hra a (-20C) en el
freezer (Figura 5).

Figura 5. Freezer a -20C
Despus de haber pasado el almacenamiento se centrifuga a 13 000 rpm por 15 minutos
descartando el sobrenadante.
El precipitado fue resuspendido en etanol al 70% en concentracin del precipitado de 1 v
y se almaceno por 24 gras en freezer. Al da siguiente se centrifugo a 13 000 rpm por 15
minutos y se descart el sobrenadante.
La pastilla que qued en el tubo se dej secar y se
resuspendio en agua destilada estril (Figura 6).






Enzimas de restriccin
En un tubo eppendorf nuevo se aadi:
5 l de ADN
1.5 l de buffer 3 10
x

8 l de agua estril
0.5 l de enzima EcoRI

La muestra obtenida se incubo 2 horas a 37C.
Una vez obtenidas las muestras de ADN completo y ADN digerido con la enzima de
restriccin se procedi a la elaboracin del gel de agarosa en concentracin al 1% para la
tcnica de electroforesis.
Electroforesis
Se prepar 200ml de agarosa al 1% disuelta en solucin TAE 1X se dej fundir en un
microondas, despus se enfri hasta que la piel soporte la temperatura (aproximadamente
a 40C), obteniendo una apariencia cristalina. En una base de acrlico se coloc un peine
de dientes que sirven para formar los carriles, se verti una pequea cantidad de agarosa
liquida para formar una pelcula (tipo gel) de no ms de 1 cm de altura.
Se program el equipo de electroforesis a 80v, introduciendo el gel en la cmara donde
fue inundada por TAE 1X que tiene la funcin de conducir corriente para que puedan
migrar los fragmentos de ADN.
En el primer carril se puso 10 l de marcador peso molecular (1kb), en el siguientes
carriles se colocaron mezclas de 4l de buffer de carga Orange G 6x con 10 l de
muestra, siendo la primer muestra para el segundo pozo el ADN bacteriano y la segunda
mezcla para el tercer pozo fue la muestra de ADN cortada por la EcoRI y la tercer muestra
en el cuarto pozo una segunda muestra de ADN cortada por la EcoRI.
Carriles Indicadores
Carril 1 Marcador 1kb
Figura 6. Pastilla puesta a secar





Una vez colocadas las muestras en los carriles, se puso en funcionamiento el equipo de
electroforesis por un tiempo de 1 hora 20 minutos.

Figura 7. Equipo de electroforesis
Procedente a ello se recuper el gel y se analiz en un foto-documentador en el cual es
expuesto a radiaciones UV para facilitar la visualizacin de los fragmentos de ADN y
apoyado de un software analizar dichos fragmentos.

RESULTADOS

Al termino de la electroforesis el gel se coloc en una solucin para que se generara una
tincin y por medio de una cmara fue expuesto a radiaciones UV para facilitar la
visualizacin de los fragmentos de ADN y con la ayuda de un software se analiz dichos
fragmentos como se observa en la figura 8.

Figura 8. Electroforesis de bacteria. En el carril 1 (izquierdo) se muestra el marcador
molecular, en el carril 2, 3 y 4 siguente no se observa la presencia de ADN, indicando que
la prueba es negativa.
Carril 2 DNA plasmdico bacteria
Carril 3 Corte con EcoRI
Carril 4 Corte con EcoRI
Tabla 2. Orden de los carriles con su respectivo indicador

Carga (-)
Carga (+)

DISCUSIN
Deacuerdo a los resultados obtenidos se puede apreciar que la tecnica tiene su grado de
dificultad, por lo tanto si no es ejecutada adecudamente no se obtendran los resultados
esperados, ya que como se pudo observar en la electroforesis teniamos la presencia de
cristales de agarosa que no se fundieron bien al preparar el gel, al igual que al
resuspender el pellet, no fue en la cantidad adecuada de agua que eran 50 l que
afectaron el resultado final. En comparacin con el reporte de investigacin del Perfil
plasmdico en aislados intrahospitalarios de Klebsiella spp el procedimiento se sigui de
manera puntual y el pellet a diferencia del nuestro, fue resuspendido en 15 l agua que
confirman que la ausencia de ADN en la electroforesis pudo verse debido al exceso de
agua recomendada y la poca cantidad de material gentico obtenido o a errores de
manipulacin (MOREY, 2010) .

CONCLUSIN
La tcnica empleada para la extraccin de ADN no se manipulo de manera
adecuadamente como consecuencia no hubo presencia de ADN bacteriano en el anlisis
electrofortico.
Un punto crtico dentro de la metodologa es la pureza del DNA ya que la reaccin de
enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como protenas, fenol,
cloroformo, etanol en altas concentraciones inhiben la digestin con enzimas de
restriccin, otro aspecto es que no se obtuvo una cantidad significativa de ADN para ser
leda por el mtodo de electroforesis, se sugiere la adicin de cloranfenicol para amplificar
el nmero de copias de plsmidos y por tanto el rendimiento final.

BIBLIOGRAFA
Coll, V. B. (11 de marzo de 2014). Estructuras y Propiedades de los cidos nucleicos.
Obtenido de Estructuras y Propiedades de los cidos nucleicos:
www.uv.es/tunon/pdf_doc/AcidosNucleicos_veronica.pdf
M. Somma, M. Q. (2008). Electroforesis en Gel de Agarosa. Electroforesis en Gel de
Agarosa.
MEJA, L. Y. (Septiembre de 2009). INGENIERA GENTICA AGROPECUARIA. Enzimas
de restriccin y secuencias de corte. Bogota, Colombia. Obtenido de Enzimas de
restriccin y secuencias de corte .
MOREY, J. R. (2010). PERFIL PLASMDICO EN AISLADOS INTRAHOSPITALARIOS DE
Klebsiella spp. CUMANA.
Parque Cientifico de la Udg. (Enero-Febrero de 2009). La extraccin y purificacin del
ADN para el anlisis por PCR.Mitos y realidades. Informaciones sobre Analisis
Microbiologicos por PCR, pgs. 1-5.
Sanz, E. (11 de Marzo de 2014). Muy interesante Qu es la bacteria E.Coli? . Obtenido
de Muy interesante Qu es la bacteria E.Coli? :
http://www.muyinteresante.es/salud/preguntas-respuestas/ique-es-la-bacteria-ecoli