Concepto de gen y

Regulacin I
Gentica I
2013

Flvio Silva Junqueira de Souza
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1866: Gregor Mendel muestra que caractersticas en la arveja (altura, color y
textura del fruto etc) se transmiten entre generaciones como entidades
discretas (no se mezclan en los "hbridos").

- 1900: "redescubrimiento" del trabajo de Mendel por los botnicos Carl Correns,
Erich von Tschermak-Seysenegg y Hugo De Vries
- 1900-1903: Hugo de Vries introduce el concepto de mutacin y la teoria
evolucionista de la mutacin


Gregor Mendel
Hugo de Vries
Oenothera lamarckiana
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1909: el botnico Wilhem Johannsen crea los trminos genotipo y fenotipo y la
palabra gen, con el significado de:

"las condiciones, fundamentos y agentes determinantes que estn presentes
[en los gametas] de manera separada, nica y independiente, [por los cuales]
muchas caractersticas de los organismos son especificadas."

W. Johannsen (1909) Elemente der exakten Erblichkeitslehre

- 1909-1915: en Drosophila, Thomas Hunt Morgan, Alfred Sturtevant y otros
muestran que los genes estn alineados en cromosomas y estudian
los fenomenos de ligamiento y recombinacin

Thomas H. Morgan
Nobel 1933
(Fisiologa y Medicina)
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1941-1945: los microbilogos George Beadle y Edward Tatum muestran que los
genes actuan a traves de enzimas especficas en vias metablicas.
Utilizaron mutantes del hongo Neurospora crassa inducidos por rayos X
fig: seleccin de mutantes auxotrficos
de Neurospora crassa
1941: mutaciones genticas
afectaban una actividad enzimtica
especfica en una via metablica
(sntesis de la vitamina B6)
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1941-1945: los microbilogos George Beadle y Edward Tatum muestran que los
genes actuan a traves de enzimas especficas en vias metablicas.
Utilizaron mutantes del hongo Neurospora crassa inducidos por rayos X
un gen = una enzima
un gen = un polipptido

George Beadle & Edward Tatum
Nobel 1958
(Fisiologa y Medicina)
Beadle
Tatum
un gen = una enzima (o polipptido)
ejemplo: catabolismo de
fenilalanina y tirosina
enfermedades
asociadas
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1928: Frederick Griffith descubre un "principio transformante" en cepas de
Streptococcus pneumoniae
experimento de Griffith
- 1944: O. Avery, C. MacLeod y M. McCarty descubren que el "principio
transformante" est compuesto por DNA
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1952: Alfred Hershey y Martha Chase descubren que DNA, pero no proteina,
es transferido del fago T2 a la clula de E. coli durante la infeccin
experimento de
Hershey & Chase
el material hereditario (los genes) es el DNA
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1953: James Watson y Francis Crick descubren la estructura del DNA
doble hlice
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1958: Francis Crick propone el "dogma central de la biologa molecular" y que
la secuencia lineal de DNA se corresponde con la secuencia de una
proteina (colinearidad)
- 1962-1965: Marshall Nirenberg, Heinrich Matthaei, Gobind Khorana y otros
descubren el cdigo gentico
esquema de flujo de informacin
propuesto por el "dogma"
(Crick, 1958)
Concepto de gen: evolucin histrica
colinearidad: la secuencia lineal de DNA en el gen se corresponde con la secuencia lineal
de una proteina
- 1977: Richard Roberts y Philip Sharp descubren los exones y intrones (genes
no son siempre colineares con las proteinas)
Concepto de gen: evolucin histrica
Concepto de gen: evolucin histrica
genes de RNA: muchos genes codifican RNAs que no se traducen a proteinas
noncoding
RNAs
- 1977: Frederick Sanger y colaboradores secuencian el genoma de DNA del
bacteriofago X174
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1980s-1990s: secuenciacin de miles de genes y primeros genomas (E. coli,
levadura etc); desarrollo de programas de computadora para la
identificacin de genes y ORFs en genomas
ORF (open reading frame): secuencia del
ATG inicial hasta el codon Stop
- 2000s: secuenciacin de los genomas del ser humano, ratn, Arabidopsis, etc.
Genes son identificados por programas de computadora en base a
identidad de secuencia con genes ya conocidos o secuencias de cDNAs
Concepto de gen: evolucin histrica
ensembl.org
(base de datos genmicos)
modelos de genes
cDNAs
conocidos
conservacin de
secuencia
Concepto de gen: evolucin histrica
- 1860s1900s: gen como unidad discreta de la herencia


- 1910s: gen como un locus distinto (que puede mutar, recombinar etc)


- 1940s: gen como controlador de una enzima o proteina


- 1950s: gen como ente fsico (doble hlice de DNA)


- 1960s: gen como cdigo transcripcional


- 1970s1980s: gen como ORF (con intrones y exones)


- 1990s2000s: gen como entidad anotada en bases de datos genmicos
Gerstein et at (2007) Genome Res
Qu es un gen?
- algunas definiciones posibles:
- Human Genome Nomenclature Organization : a DNA segment that contributes to phenotype/function.
In the absence of demonstrated function a gene may be characterized by sequence, transcription
or homology.

- Sequence Ontology Project : a region (or regions) that includes all of the sequence elements
necessary to encode a functional transcript. A gene may include regulatory regions, transcribed
regions and/or other functional sequence regions.

- Alberts et al (2008) Molecular Biology of the Cell, 5th ed. : ...[a] gene is any DNA sequence that is
transcribed as a single unit and encodes one set of closely related polypeptide chains" (or RNA)

- Laurence A. Moran (Sandwalk blog) : a gene is a DNA sequence that is transcribed to produce a
functional product.
no hay una definicin simple de gen
Regulacin de la expresin gnica
cmo se genera la diversidad de clulas que componen un
organismo complejo?
tienen las distintas clulas de un organismo
el mismo genoma ?
Regulacin de la expresin gnica
- experimentos de generacin de plantas completas a partir de clulas de tejidos adultos
muestran que todos los genes de la planta estn presentes en clulas diferenciadas
adultas
- la capacidad de una clula de generar todos los tipos celulares del adulto se
denomina totipotencialidad
- 1962: clonacin de ranas (Xenopus laevis) a partir de nucleos de clulas intestinales
de renacuajos: reprogramacin nuclear
Regulacin de la expresin gnica
John Gurdon
John Gurdon Nobel 2012
(Fisiologa y Medicina)
Clonacin
Dolly
Polly
- 1996: clonacin de la oveja Dolly a partir de un nucleo de una clula adulta (fibroblasto)
de la ubre: reprogramacin nuclear
tienen las distintas clulas de un organismo
el mismo genoma ? s
Regulacin de la expresin gnica
Regulacin de la expresin gnica
- nmero de genes que codifican proteinas
Escherichia coli (bacteria entrica) 4,377

Saccharomyces cerevisiae (levadura) 5,770


Caenorhabditis elegans (nemtodo) 21,733

Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) ~17,000

Danio rerio (pez cebra) 26,247

Homo sapiens (humano) 20,769

Mus musculus (ratn) 23,139


Arabidopsis thaliana (brasiccea modelo) 27,407

Picea abies (pino nrdico) 28,354
Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
- cada tejido/tipo celular tiene su perfil de expresin de mRNAs y proteinas caracterstico
Regulacin de la expresin gnica
- clulas humanas expresan 30-60% del total de genes que codifican proteinas
- las clulas no expresan todos sus genes al mismo tiempo
patrn de expresin
proteica analisada
por electroforesis 2D
Regulacin de la expresin gnica
- la expresin gnica es regulada
- las clulas no expresan todos sus genes al mismo tiempo
patrn de expresin
de mRNAs analisada
por hibridacin
de microarrays
Regulacin de la expresin gnica
niveles de control:

- alteraciones estructurales (cromatina,
amplificacin gnica etc)

- regulacin de la transcripcin (unin de
proteinas activadoras y represoras etc)

- regulacin del splicing (splicing alternativo)
y localizacin del mRNA

- regulacin de la estabilidad del mRNA y
traduccin (miRNAs)

- modificaciones posttraducionales en la
proteina (fosforilacin etc)
Regulacin pretranscripcional
regulacin a nivel de reestructuracin o acceso al DNA

- amplificacin gnica

- rearreglos cromosmicos

- regulacin de la estructura de la cromatina
(eucromatina x heterocromatina)
Amplificacin gnica
1) amplificacin extracromosmica de genes ribosomales en oognesis de anfibios y
algunos insectos

2) en la oognesis de Drosophila, amplificacin de los genes que codifican para
protenas corinicas

3) cromosomas politnicos de dipteros

en el cancer:

4) la amplificacin de oncogenes en la progresin tumoral, por ejemplo el proto-
oncogen Myc. La amplificacin de ciertos genes tambin puede llevar a la
resistencia a drogas
- aumenta la cantidad de producto (mRNA y proteina) por un aumento en el nmero
de copias del gen. No es muy comun en la naturaleza. Ejemplos:
Amplificacin gnica/genmica
- cromosomas politnicos:

- cromosomas gigantes formados por repetida replicacin sin divisin celular

- encontrados en glndulas salivares de larvas de Diptera (moscas y parientes)

- presumiblemente aumentan la produccin de enzimas salivares y permiten
crecimiento ms rpido de la larva

- ejemplo de amplificacin genmica
Drosophila larva
polytene chromosomes
Amplificacin gnica
- amplificacin de genes del corin en Drosophila:

- clulas foliculares del ovario de Drosophila amplifican las regiones genmicas
que codifican genes estructurales corinicos (forman la cscara del huevo)

- regiones amplificadas se localizan en los cromosomas 3rd y X

Rearreglos cromosmicos
- recombinacin V(D)J en linfocitos de vertebrados: seleccin clonal
cada linfocito expresa un
anticuerpo distinto
Rearreglos cromosmicos
- recombinacin V(D)J en linfocitos de vertebrados:

- ejemplo: recombinacin exones V y J ms exon constante (C) para formar una
cadena liviana
- cada linfocito expresa polipeptidos distintos devido a
recombinacin
Rearreglos cromosmicos
- mating type switch en Saccharomyces cerevisiae

- clulas haploides de levadura pueden conyugar y formar clulas diploides

- conyugacin ocurre entre clulas de distinto mating type: a y a
Rearreglos cromosmicos
- mating type switch en S. cerevisiae



- cambio de mating type puede ocurrir por
conversin gnica (sustituicin de un gen
por otro) en el locus (cassette) activo MAT



- conversin depende de la recombinasa
HO, expresada en la fase final de G1
del ciclo celular
Regulacin de acceso al DNA
- el genoma nuclear eucariota est intimamente asociado a histonas (cromatina)

- heterocromatina: cromatina densamente enpaquetada, condensada,
transcripcionalmente inactiva

- eucromatina: cromatina descondensada, formando loops,
transcripcionalmente activa
Regulacin de acceso al DNA
- el genoma nuclear eucariota est intimamente asociado a histonas (cromatina)

- heterocromatina: resistente a la expresin gnica
- barriers (barreras) son elementos de DNA que impiden que la heterocromatina
invada una regin de eucromatina

- translocaciones que eliminan barriers causan efectos de posicin en la expresin
gnica por la expansin anormal de dominios de heterocromatina
Regulacin de acceso al DNA
- el genoma nuclear eucariota est intimamente asociado a histonas (cromatina)

- heterocromatina: resistente a la expresin gnica
- barriers (barreras) son elementos de DNA que impiden que la heterocromatina
invada una regin de eucromatina

- translocaciones que eliminan barriers causan efectos de posicin en la expresin
gnica por la expansin anormal de dominios de heterocromatina
Regulacin de acceso al DNA
- estructura de la cromatina: histonas y nucleosomas

Broad Institute
solenoide (30 nm) que depende de la histona H1
formado por un octmero de histonas
H2A, H2B, H3 y H4 (x2)
Regulacin de acceso al DNA
- estructura de la cromatina:


- histonas del octmero poseen colas
N-terminales que pueden sufrir
modificaciones posttraduccionales

fig: ensamblado del octmero de histonas
Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:
- la relajacin espontnea de la estructura del nucleosoma permite la unin de proteinas que
reconocen el DNA (por ejemplo, factores de transcripcin)
Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:
- complejos de proteinas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP (con actividad
helicasa) pueden hacer deslizar nucleosomas y exponer regiones del DNA
Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:
- complejos de proteinas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP pueden
reemplazar las histonas del nucleosoma por histonas especiales
Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:
- complejos de proteinas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP pueden
reemplazar las histonas del nucleosoma por histonas especiales
Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:

- histonas del octmero poseen colas N-terminales que pueden sufrir modificaciones
posttraduccionales

metilacin (M) en residuos de arginina y lisina


fosforilacin (P) en residuos de serina y threonina


acetilacin (A) en residuos de lisina
histona H3
Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:


- cdigo de histonas (histone code): ciertas modificaciones de histonas estn asociadas y
influencian la estructura de la cromatina y la expresin gnica

Regulacin de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinmica:


- cdigo de histonas (histone code): ciertas modificaciones de histonas estn asociadas y
influencian la estructura de la cromatina y la expresin gnica

- ejemplo: las colas de histonas interaccionan fuertemente con el DNA (carga -) por residuos
de lisina (carga +); la acetilacin de las lisinas neutraliza las colas de histonas y reducen la
compactacin de la cromatina, favoreciendo la transcripcin
HATs: histone acetylases
HDACs: histone deacetylases
tcnica




- inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP)
con anticuerpos anti histonas modificadas
permite determinar la localizacin de esas
modificaciones en un locus especfico o en
todo el genoma.



- para determinar las modificaciones en
todo el genoma se acopla el ChIP a
microarray hybridisation (ChIP-on-Chip) o
sequenciacin (ChIP-seq)
ChIP genmico
- el mapeo genmico de modificaciones de histonas por ChIP-on-Chip o ChIP-seq
permiten determinar las marcas de histonas asociadas a la actividad transcripcional
wormbook.org
- distribucin de RNA pol II y histonas modificadas en una regin del cromosoma IV de C. elegans
Regulacin transcripcional
regulacin a nivel de cuando y cuanto el gen se transcribe

- depende de la unin de factores de transcripcin (elementos en trans) a
elementos de DNA regulatorios (elementos en cis)

- elementos regulatorios estn organizados en promotores y enhancers

ribosomas
ensamblndose
RNA pol
transcripcin en bacterias
unidad
transcripcional
Transcripcin: procariotas
- el factor sigma (s) es necesario para el reconocimiento del promotor por la RNA
polimerasa
s reconoce el promotor
elongacin,
enzima procesiva
terminador ensamblado
holoenzima
separacin de cadenas
transcripcin abortiva
Elongacin
liberacin de s
Transcripcin: eucariotas
- varios factores de transcripcin
general son necesarios para la
iniciacin de transcripcin en los
eucariotas
Transcripcin: eucariotas
- en eucariotas hay tres RNA polimerasas
Transcripcin: eucariotas
- iniciacin de transcripcin de RNA pol II
Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
unin de TATA-binding
protein; el DNA se curva
TFIIH tiene actividad
helicasa y quinasa
iniciaciones
abortivas
iniciacin,
elongacin
Factores de transcripcin
- proteinas que controlan la tasa de transcripcin de genes


- descubiertos en las dcadas de 1950-1960 (lambda repressor, lac repressor)

- pueden activar o reprimir la transcripcin

- actuan uniendose al DNA por el DNA-binding domain

- interaccionan y forman complejos con factores de transcripcin basales (p. ej. TATA-binding
protein, complejo mediator etc) y con cofactores de transcripcin (p. ej. acetilasas de histonas)
Factores de transcripcin
- factores de transcripcin tienen una organizacin modular:
dominio de unin al DNA: helix-turn-helix; zinc-fingers, homeodominio,
helix-loop-helix, leucine zipper etc. Pueden mediar homo- o heterodimerizacin

dominio de transactivacin: contacta otras proteinas y promueve la actividad
activadora o represora del factor

dominio de unin a ligando: modula la actividad del factor por unin a otra
molcula (p. ej. dominios de unin a lactosa del represor lac y unin a
estrgeno del receptor de estrgeno)
Factores de transcripcin: tipos

- dominio helix-turn-helix:


- poseen dos a-hlices conectadas por una vuelta

- ocurre en bacterias y eucariotas

- una hlice reconoce la secuencia en el surco mayor del DNA

- se unen al DNA como dmeros
hlice de
reconocimiento
(roja)
Factores de transcripcin: tipos

- homeodominio:


- tipo especial de helix-turn-helix; poseen tres a-hlices conectadas por vueltas

- ocurre en eucariotas; particularmente importantes en el desarrollo embrionario

- una hlice reconoce la secuencia en el surco mayor del DNA (hlice 3)
Factores de transcripcin: tipos

- zinc-fingers:


- incluyen tomos de zinc en su estructura que unen residuos de histidina y cisteina

- un factor puede tener varios zinc-fingers

- hay varios tipos estructurales
a-hlice y b-sheet
unidas por el zinc
Factores de transcripcin: tipos

- leucine zippers:


- forman homo- o heterodmeros por interacciones entre a-hlices (una de cada monmero)

- hlices interaccionan por residuos hidrofbicos (Leu y otros)

- la posibilidad de formar heterodmeros aumenta el
espectro de secuencias-blanco
homodmeros heterodmero
Factores de transcripcin: tipos

- helix-loop-helix:


- dos a-hlices conectadas por un loop flexible

- forman homo- o heterodmeros por interacciones entre a-hlices (una de cada monmero)

- la posibilidad de formar heterodmeros aumenta el espectro de secuencias-blanco; factores con
una hlice truncada pueden actuar como inhibidores
heterodmero
loop flexible
heterodmero
Factores de transcripcin: tcnicas

- electrophoretic mobility shift assay (EMSA): permite testear si hay proteinas que unen
una determinada secuencia de DNA


- DNA footprinting: permite determinar precisamente el sitio de DNA en donde se une una
proteina


- cromatografia de afinidad por DNA: permite purificar proteinas de extractos celulares con
capacidad de unirse a un elemento de DNA


- phylogenetic footprinting: permite encontrar elementos de DNA funcionales en
secuencias largas de DNA


- precipitacin de cromatina (ChIP): permite determinar los sitios de DNA en que un factor
de transcripcin se une in vivo

Factores de transcripcin: gel shift (EMSA)
Factores de transcripcin: cromatografia de afinidad
Factores de transcripcin: DNA footprinting
extracto
- +
Factores de transcripcin: phylogenetic footprinting
Factores de transcripcin: ChIP
Elementos regulatorios de DNA

- conjuntos de sitios de unin de factores de transcripcin con funciones en la regulacin
de la tasa de transcripcin de uno o ms genes



procariotas: promotor; genes frecuentemente organizados en operones (un
promotor para muchos genes en fila); no hay enhancers


levaduras: promotor proximal + UAS (upstream activating sequence) localizada
cerca del promotor; no hay enhancers


animales, plantas: promotor proximal + enhancers (sequencias regulatorias
distales; pueden estar hasta 1 Mb del gen que controlan)
gen reportero
- transgenes (genes artificiales) pueden ser usados para evaluar la actividad
regulatoria de elementos de DNA
promotor
enhancer
a testear
GFP (green fluorescent protein)
b-galactosidasa (lacZ)
luciferasa
chloranfenicol acetiltransferasa (CAT)
b-glucoronidasa
pA
intron
(opcional p/
eucariotas)
3' UTR
Elementos regulatorios de DNA: tcnicas de estudio
promotor
basal
- expresin de transgenes (reporteros) puede ser testeada en clulas en cultivo o
organismos transgnicos (E. coli, levadura, Drosophila, ratn, Arabidopsis etc)
- expresin de luciferasa en clulas en cultivo bajo control de regiones regulatorias
Elementos regulatorios de DNA: tcnicas de estudio
- expresin de GFP en el cerebro de ratones transgnicos bajo control de regiones
regulatorias del gen de proopiomelanocortina (Pomc)
Elementos regulatorios de DNA: tcnicas de estudio
Pomc
neuronal
enhancers
promoter
10 kb
pituitary
arcuate nucleus
GFP
Patapoutian et al. 1993
expresin de lacZ (b-galactosidasa)
en msculos esquelticos
- embrin de E13.5 con expresin
de lacZ bajo el control del promotor
de myf5 (factor de transcripcin que
controla desarrollo de los msculos)
Elementos regulatorios de DNA: tcnicas de estudio
- animales y plantas transgnicas
permiten evaluar la actividad de una
regin regulatoria en el organismo
entero (en contraste con clulas en
cultivo)
Estrategias de control transcripcional: procariotas
- bacterias tienen muchos genes de funcin relacionada organizados en operones
(p. ej. operon de biosntesis de triptofano, operon de catabolismo de lactosa)
- operones son frecuentemente controlados de manera negativa por represores
(triptofano, lactosa) que se unen a operadores, pero tambin puede haber regulacin
positiva
Estrategias de control transcripcional: procariotas
Estrategias de control transcripcional: procariotas
- operon lac es controlado tanto por un represor (que deja de reprimir al unirse a lactosa)
como por un activador (proteina CAP, activada por cAMP/glucosa)
Estrategias de control transcripcional: procariotas
- en bacterias el factor sigma usado por la mayora de los genes es el s70, pero
hay varios factores sigma que controlan grupos de genes especializados
- p. ej. en caso de shock trmico, se transcribe el factor s32 que se une al promotor de
genes de proteinas de heat shock, desencadenando una respuesta protectiva para la
clula