ANLISIS DE DNA PLSMDICO DE Escherichia coli TRANSFORMADA

MEDIANTE DIGESTIN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN Y

UNA CARACTERIZACION EN ELECTROFORESIS.
Castellanos Portillo, Laura Carolina-93101708894
Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Bsicas, Departamento de Microbiologa, Biologa
Molecular.
Abril 21 del 2014

OBJETIVO
Analizar mediante la tcnica de electroforesis un ADN plasmdico intacto y cortado con
enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII, BamHI y PstI)

METODO
En esta prctica se analiz el DNA plasmdico de E.coli transformada, es decir, que se le ha
introducido de forma estable con un plsmido artificial.
El mtodo utilizado para su obtencin se denomin Lisis alcalina por SDS. Para esto se hizo la
previa, preparacin del cultivo bacteriano portador del plsmido. Despus se tomaron 1,5 ml del
cultivo de bacterias y se ponen en un eppendorf de 2ml, centrifugndose a continuacin durante
30seg a 13000 rpm. Se retira el sobrenadante, dejando el sedimento lo ms seco posible. Luego se
resuspendio el sedimento de bacterias en 100 l de solucin de lisis alcalina I + Glucosa, seguido de
un vortex, despus se adiciona en el mismo tubo 200 l de solucin de lisis alcalina II y se mezcla
suave el contenido del tubo manualmente. A continuacin, se aadi 150 l de solucin de Lisis
alcalina III, se mezcl el contenido del tubo por inversin suavemente y se sumergi por unos
segundos en hielo. Se adiciona fenol-cloroformo en una relacin 1:1, se llev a vortex y centrifugo
por 2 minutos, despus se transfiri el sobrenante a otro tubo de eppendorf donde se le aadi 2:1
de Etanol absoluto y se llev a vortex. Esto se mantuvo en temperatura ambiente por unos segundos
y posterior a ello se llev a centrifugar por 5 minutos. Donde despus se retir el sobrenante y se
procedi a lavar el pellet registrado con etanol al 70% y 2 minutos de centrifuga. Para terminar se
retira el sobrenante este se resuspende en 50 l en una solucin de Buffer TE + 1 l RNAsas,
seguidamente se almacena a 4C para su posterior visualizacin electrofortica.

Pasado el tiempo de almacenamiento se procedi al agregado de endonucleasas de restriccin,
por lo que fue necesaria la elaboracin de tres reacciones en tubos de eppendorf. La primera fue
con el uso de las enzimas de EcoRI y Hind III, donde primero se aadi 20 l del ADN plasmdico ya
extrado, 2.5 l de Buffer de la enzima EcoRI, 1.5 de EcoRI, 1.0 de H
2
0 desionizada, se llev a
incubar a 37C en bao mara por 30 minutos, despus de este tiempo se pasa a 4C por 2
segundos y se procedi adicionar la segunda enzima en este caso Hind III, se llev a incubar a 37C
por otros 30 minutos para asi completar una hora de incubacin total de la reaccin.
En la segunda reaccin se agreg 10 l de ADN plasmdico, 2.5 l de Buffer de la enzima BamIII,
1.5 de BamIII, 1.0 de H
2
0 desionizada, se llev a incubar a 37C en bao mara por 1 hora. Para la
tercera reaccin se agreg 10 l de ADN plasmdico, 2.5 l de Buffer de la enzima Pst I, 1.5 de Pst I,
1.0 de H
2
0 desionizada, se llev a incubar a 37C en bao mara por 1 hora

Para la electroforesis se quit la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte del gel y se
coloca en la cubeta de electroforesis. Los pocillos deben de estar cerca del ctodo (polo negativo,
color negro). Se aadi tampn de electroforesis TBE al 1x, de forma que cubra bien el gel de
agarosa que estaba al 1%. Se aplic 8 l de cada muestra preparada las cuales fueron (6), con 4 l
de Buffer de carga y 4 l de la muestra ADN plasmdico. Luego se aplican 8 l de marcador de peso
molecular en uno de los pocillos, as que fueron 7 pocillos utilizados. Se tap la cubeta de
electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de alimentacin. Se comprob que este bien
conectada. Se program la fuente a unos 107 voltios y se comienza a correr la electroforesis que
duro unos 45 minutos hasta que el buffer de carga haya recorrido la distancia adecuada a travs del
gel. Una vez acabada la electroforesis se desconect la corriente y se retir los cables y la tapa de
la cubeta. Se visualizaron los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiz una fotografa de la
imagen. Despus se descartara el gel en el recipiente para residuos slidos destinados al bromuro
de etidio previsto a tan fin.

RESULTADOS




FIGURA 1. Corrida electrofortica en gel de agarosa teido con Bromuro de Etidio de ADNs
obtenidos.
DESCRIPCION:
El gel de resolucin es la matriz de agarosa que se emple al 1 %, sobre el cual se formaron 7
pocillos en los cuales iban dispuestas las muestras de ADNs plasmidicos extrados anteriormente
por dos manipuladores-operadores del laboratorio. Las molculas de ADN, van a migrar generando
un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al peso molecular de cada
una de las molculas y a la concentracin del gel mismo.


CARRIL 1: ADN plasmdico, extrado por Lisis alcalina y degradado por la enzima Pst I del operador
Laura Castellanos
CARRIL 2: ADN plasmdico, extrado por Lisis alcalina y degradado por la enzima BamHI del
operador Laura Castellanos
CARRIL 3: ADN plasmdico, extrado por Lisis alcalina y degradado por la enzima EcoRI + Hind III
del operador Laura Castellanos
CARRIL 4: ADN plasmdico, extrado por Lisis alcalina y degradado por la enzima BamH del
operador Erika Torres
CARRIL 5: ADN plasmdico, extrado por Lisis alcalina y degradado por la enzima EcoRI + Hind III
del operador Erika Torres

1 2 3 4 5 6 7
CARRIL 6: ADN plasmdico, extrado por Lisis alcalina y degradado por la enzima Pst I I del
operador Erika Torres
CARRIL 7: Marcador de Peso Molecular 1kb DNA Step Ladder .

ANALISIS DE RESULTADOS
Un plsmido es una molcula de ADN de doble cadena circular de unos pocos cientos o miles de
pares de bases de circunferencia. Plsmidos de origen natural son los virus de las bacterias. El
plsmido artificial pUC18 el cual es de un tamao de 2,686 bp, ha sido diseado genticamente
para incluir un gen de resistencia antibitica a ampicilina (amp R), y un gen (y su promotor) para
la beta-galactosidasa de la enzima (lacZ); junto con un origen de replicacin (ori). El
gen lacZ contiene una regin de poliengarce, con una serie de sitios de restriccin nicos en ningn
otro lugar en el plsmido. La digestin con cualquiera de estas endonucleasas har que un solo corte
que linealiza el ADN plsmido circular, y permitir que se recombinan con ADN extrao que se ha
cortado con la misma endonucleasa.

Tal fue el caso de este ensayo donde se observ los fragmentos generados por las enzimas EcoRI,
HindIII, Pst I y BamHI a travs de la digestin los cuales fueron analizados gracias a una corrida
electrofortica. La calidad de esta fue relativamente buena ya que se logr observar particin del
ADN por lo que se cree que las enzimas adicionadas hicieron efecto y cumplieron con su funcion. Sin
embargo la digestin ms evidente fue la del carril 6 donde se hizo la reaccin del plsmido pUC18
con Pstl I ya que las bandas se perciben de mejor calidad.

Durante la carrera electrofortica los fragmentos de menor tamao corren ms que los fragmentos
de mayor tamao y de este modo la posicin relativa de los fragmentos en el gel depende de los
tamaos de los mismos.
Segn el mapa de restriccin del plasmido pUC 18, (ANEXOS) el cual muestra las localizaciones de
los sitios de las enzimas EcoRI la cual tiene un sitio de corte de 450pb, esta reconoce la secuencia
destino G/AATTC, mientras que la enzima HindIII corta en la secuencia A/ AGCTT y su tamao de
secuencia es de 399 pb y ambas producen extremos cohesivos como resultado de su corte. Es por
ello que la primera reaccin es factible debido a sus caractersticas similares y su alto rendimiento,
esto se puede ver en los carriles 3 y 5.
Para el caso de la enzima Pst I la cual tiene 411 pb, y corta en la secuencia CTGCA/G y fue donde
mejor se percibe los fragmentos en la corrida electrofortica. En la reaccin con la enzima BamHI la
cual tiene un tamao de secuencia de 430 pb y su secuencia de corte es G/GATCC. Estas enzimas
son de la misma concentracin de sal, todas producen extremos cohesivos como corte y todas se
encuentran en la zona del Lac Z en lo que se llama sitio de clonacin mltiple.

Estas enzimas no cortan el DNA de manera inespecfico sino que cortan en solo determinados sitios
dependiendo de la secuencia, ya que estas poseen una especificidad de rotura restrictiva. Las
enzimas de restriccin destruyen el DNA en secuencias especficas para cada una de ellas. Una de
las caractersticas de las enzimas de restriccin es que las secuencias reconocidas y a travs de las
cuales ellas actan son secuencias palindrmicas de cuatro, seis, ocho nucleotios de longitud.
Segn la posicin del corte, las endonucleasas de restriccin producen extremos suaves o
sobresalientes de la doble hebra. El tamao de la secuencia de reconocimiento de una
endonucleasa de restriccin define la frecuencia de corte media.

Estas enzimas fueron descubiertas en los aos 60 y 70, y su funcin es la destruir bacterifagos o
virus que invadan la bacteria, ya que una vez cortado el ADN el virus se vuelve inofensivo. Es por
eso que se habla de un sistema de restriccin/modificacin donde en necesario que las bacterias se
protejan de sus propias enzimas a travs de un cambio qumico de su DNA despus de la sntesis.
Esto consiste en la adicin de un radical metilo en nucletidos especficos a lo largo de la cadena del
DNA. Una vez metilados, estn protegidos de ser digeridos por la enzima de restriccin. Este
sistema se considera un sistema inmune primitivo de la bacteria. Como la enzima evoluciona hasta
obtener este grado de especificidad en destruir el DNA viral en cuanto preserva el DNA bacteriano es
desconocido. Organismos ms evolucionados no presentan tal sistema.

ANEXOS
Grafico1. Vector pUC18



Grafica 2. Mapa de tipos de Vectores (pUC18 pUC19) (TYPE)







Tabla 1. Secuenciacin y corte de cada enzima
Enzima Origen Bacteriano Sitio de
Reconocimiento
Resultado del Corte
EcoRI Escherichia coli
5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G AATTC---3'
3'---CTTAA G---5'
BamHI Bacillus
amyloliquefaciens
5'GGATCC
3'CCTAGG
5'---G GATCC---3'
3'---CCTAG G---5'
HindIII Haemophilus influenzae
5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'---A AGCTT---3'
3'---TTCGA A---5'
Pst I Providencia stuartii
5'CTGCAG
3'GACGTC
5'---CTGCA G---3'
3'---G ACGTC---5'

Grafico 3. Tamaos de secuencia de algunas enzimas de restriccin (VECTORES)



CONCLUSION
La calidad de esta caracterizacin electrofortica de la digestin del plsmido pUC 18 fue
relativamente buena ya que se logr observar la particin del ADN por lo que se cree que las
enzimas adicionadas hicieron efecto y cumplieron con su funcin. Sin embargo la digestin ms
evidente fue la del carril 6 donde se hizo la reaccin del plsmido pUC18 con Pstl I ya que sus
bandas se perciben de mejor calidad.
BIBLIOGRAFIA
SAMBROOK, J.; FRISTCH, E.F. y MANIATIS, T. (1989). "Molecular Cloning. A laboratory manual".
2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (3 volmenes
GLICK, B.R. y PASTEARNK, J.J. (1994). "Molecular Biotechnology. Principles and applications of
recombinant ADN". ASM Press.
VECTORES pUC 18 y pUC 19. Visitado en la pgina:
http://www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/pUC18-pUC19-map.pdf el 20/04/2014.
TYPE VECTOR MAP pUC18/19 Visitado en la pgina
http://www.clontech.com/takara/US/Products/Molecular_Biology/Nucleic_Acids/Vectors/xxclt_displayI
mage.jsp?imgCntId=11256& el 20/04/2014.