Generacin de gelatina de mamey con propiedades

probiticas brindadas por la inoculacin de Lactobacillus

casei en esta.
M. en C. D. Escalante-Rendiz; U. Flores-Rodrguez; J. Gutirrez-Ramrez; D. Prez-Vrguez.
Facultad de Ingeniera Qumica. Perifrico Nte. Km. 33.5,
Tablaje Catastral 13615, Col. Chuburn de Hidalgo Inn,
Mrida, Yuc., Mx. C. P. 97203. Universidad Autnoma de Yucatn.
Resumen
Existen muchos alimentos considerados
probiticos y la mayora de estos suelen ser
productos lcteos, por lo que se busca
implementar un alimento diferente, gelatina
de mamey en este caso, que pueda ser
consumido por quienes no consumen los
probiticos existentes. El microorganismo
lactobacillus casei shirota es una es una
bacteria lctica que se extrajo del alimento
probitico Yakult para la realizacin del
cultivo y las pruebas necesarias para su
anlisis y posterior implementacin en la
gelatina de mamey. Los resultados fueron
positivos para la identificacin y
aislamiento de la bacteria, as como la
cintica seguida del crecimiento de este
microorganismo. Se eligi el mamey
debido al desecho de esta fruta en la regin,
el cual puede ser aprovechado para esta
produccin, ya que los nutrimentos que
contiene son favorables para el desarrollo
de la bacteria en cuestin.
Palabras clave: Lactobacillus casei shirota,
probitico.
Abstract
There are many foods considered probiotic
and most of these are usually dairy
products, so it seeks to implement a
different food, mamey jelly in this case, it
can be consumed by those who dont
consume existing probiotics. The
microorganism lactobacillus casei shirota
is a lactic acid bacterium that was extracted
from Yakult probiotic food for the
realization of cultivation and the necessary
analysis tests and subsequent
implementation in mamey jelly. The results
were positive for the identification and
isolation of these bacteria, and the kinetics
followed by the growth of this
microorganism. The mamey fruit was
chosen because it contains nutrients that are
favorable for the development of the
bacteria in question and his wastes in this
region can be exploited for this production.
Introduccin
Hace ms de 70 aos un joven llamado
Minoru Shirota, encontr un
microorganismo que habitaba de forma
natural en los intestinos, el lactobacillus
casei, el cual tiene la capacidad de impedir
el desarrollo de bacterias nocivas. El Dr.
Shirota se encarg de aislarlo y cultivarlo.
[1]
Es una bacteria anaerobia facultativa, es
decir, crece de manera ptima en
condiciones anxicas, pero puede presentar
crecimiento si la concentracin es baja;
adems es considerado como un organismo
prebitico debido a que se le han
comprobado beneficios como inhibir
microorganismos patgenos (salmonella,
shigella y helicobacter). Para su crecimiento
ptimo, dicha bacteria requiere
carbohidratos fermentables, aminocidos,
vitaminas del complejo B, cidos nucleicos
y minerales. [2]
Materiales y metodologa
Aislamiento.
El microorganismo lactobacillus casei se
obtuvo del probitico Yakult , se
realizaron diluciones en serie en tubos
eppendorf (1/10, 1/100,, 1/1, 000,000)
iniciando con 900l de diluyente (agua
peptona 0.1%) y de Yakult, tomando
posteriormente 100l de la primera dilucin
para realizar la siguiente en 900 l del
diluyente y as sucesivamente; haciendo
una placa por cada dilucin con agar LS-
Diferencial (100l de la dilucin
correspondiente en cada placa)
incubndolas a 35 C por 3 das en
condiciones de aerobiosis.
La purificacin se realiz por estras al
tercer da de incubacin, con el asa
previamente esterilizada se tom una
colonia de aislada de un cultivo
heterogneo, la colonia con coloracin rosa
y apariencia lechosa y se coloc sobre la
superficie del medio formando estras.
Identificacin.
La identificacin fue por tincin de Gram,
utilizando un microscopio para determinar
que la morfologa del microorganismo y por
prueba de catalasa. Para cada prueba se
tom una colonia del inoculo con las
caractersticas anteriormente descritas ms
los reactivos correspondientes de cada
prueba. Tambin se realiz la prueba de
fermentacin de carbohidratos (lactosa,
sacarosa, xilosa, manitol) en tubos de base
rojo de fenol con campanas Durham
incubndose 24 horas a 37C.
Conservacin.
Para la conservacin del microorganismo se
emple el mtodo de congelacin, tomando
una colonia pura de cada microorganismo y
se sembr en un tubo con 5 ml de caldo
MRS, se incubaron a 37 C a 150 rpm por
24 horas. Despus se tom 1 ml y se
deposit en un tubo Eppendorf estril para
centrifugar a 10,000 rpm, por 10 minutos a
4C. Se decant (conservando el
precipitado) y aadi 1 ml de caldo MRS
con glicerol al 20%. Se Homogeneiz en un
vortex y conserv en congelacin a -20C.
Cintica de crecimiento.
La cintica de crecimiento y cuantificacin
del microorganismo se realiz por el
mtodo de Miles and Misra y mediante
lectura de absorbancias, considerando las
absorbancias como la unidad formadora de
colonias (UFC) que relaciona directamente
la concentracin de microorganismos
mediante la ley Lambert-Beer.
Preparacin de la gelatina de mamey.
La preparacin de las gelatinas con el
microorganismo se hizo utilizando 300 mL
de agua con un 30% de jugo de Mamey y
grenetina. Una vez alcanzada la temperatura
ambiente se tomaron alcuotas de 20 mL
para tres tiempos (da 0, 1 y 2) y un control
(todos por triplicado) colocando una
colonia en cada alcuota. Se mezcl para
luego mantener en refrigeracin durante 3
das a 5 C.
La activacin y viabilidad de los
microorganismos en las gelatinas se ejecut
tomando 100L de gelatina de las
diferentes formulaciones de jugo de mamey
y se adicionaron 900 l de agua peptonada
al 0.1%.Se realizaron diluciones decimales
hasta 10
-6
.
De cada dilucin se tom 0.1 ml y se
inoculan en placas de agar MRS, se
incuban a 35 C durante 48 horas. Los
resultados se informan como UFC/g de
gelatina de Mamey.
Resultados y discusiones
Se realiz la purificacin por medio de
diluciones seriadas ya que reduce la
concentracin de microorganismos de
forma gradual, est comprobado que el
crecimiento ptimo de un microorganismo
depende de la concentracin de los
microorganismos con los que se encuentra
interactuando, al variar las concentraciones
mediante las diluciones seriadas se
selecciona la que present el desarrollo
deseado.
Para la tincin de Gram se observ una
estructura alargada la cual corresponde a la
estructura caracterstica de esta especie
reportada en la literatura [3]. Como era de
esperarse la tincin Gram mostr colonias
de coloracin azul [3], por lo que se pudo
confirmar en base a dos caractersticas
macroscpicas que el microorganismo en
cuestin estaba presente en las cajas de
Petri.
Al evaluar la capacidad de reduccin de
azucares en la investigacin, se corrobor la
incapacidad de utilizar xilosa como fuente
de energa, pues los homofermentadores no
emplean la va de las pentosas para su
metabolismo como lo hacen los
heterofermentadores como lo es la
lactobacillus casei [7].
Se determin el nmero de organismos
utilizando turbidimetra, se realizaron 11
diluciones en serie con 900 L de solucin
fisiologa y 100 L de solucin madre
obtenida (y las diluidas respectivamente)
del reactor preparado con anterioridad.
Cada dilucin fue analizada mediante un
espectrmetro UV-Vis (Thermo Genesis
20) cada dos horas durante 24 horas para
evaluar la cintica de crecimiento.
Las absorbancias registradas se muestran en
la tabla 1 las cuales reflejan la turbidez de
la muestra y por ende la cantidad de
microorganismos presentes en la misma.

Figura 1. Cintica de crecimiento con respecto a las horas: I fase de adaptacin, II fase
aceleracin positiva, III fase exponencial, IV fase aceleracin negativa y V fase estacionaria.
La cintica de crecimiento realizada por
absorbancias (Figura1.) nos indica un
aumento en el nmero de clulas conforme
pasa el tiempo, en este caso se realiz un
cultivo discontinuo o sistema cerrado al
cual no se le aade ninguna sustancia al
8
8.2
8.4
8.6
8.8
9
9.2
9.4
9.6
9.8
10
0 5 10 15 20
l
o
g

d
e

U
F
C
/
m
L

Tiempo en horas
Cintica de crecimiento
I II III IV V
medio por lo que las concentraciones de
nutrientes disminuirn y los residuos
producidos por el microorganismo
aumentarn [5].
Analizando la cintica de crecimiento
obtenida se aprecia una fase de latencia o de
adaptacin (I) menor al intervalo de 2 horas
del primer muestreo, atribuible a que en la
obtencin, purificacin, conservacin y
cintica del microorganismo se utilizaron
agares y caldos MRS es decir el medio de
cultivo desde el aislamiento hasta la
cintica nunca cambi, posteriormente se
aprecia una fase de aceleracin del
crecimiento (II) en la que el nmero de
clulas comienza a aumentar con cierta
aceleracin, posteriormente en el intervalo
de la hora cuatro a la ocho la velocidad con
la que aumentan el nmero de clulas se
mantiene constante formndose una lnea
inclinada durante esta fase a la que se
conoce como fase exponencial (III) en la
hora siete aproximadamente se produce una
desaceleracin y decremento gradual de la
velocidad de crecimiento debido a que los
nutrientes comienzan a ser escasos (IV)
para as alcanzar una fase estacionaria
alrededor de las once horas, durante esta
fase los nutrientes se agotan y los productos
metablicos se acumulan, la poblacin se
estabiliza y la actividad metablica de las
clulas se torna ms lenta esta fase
estacionaria se prolong hasta las 20 horas
lo que indica cierta estabilidad y resistencia
del microorganismo a sobrevivir aun con
escases de alimento. A partir de la dcima
hora se aprecia un decremento de la
velocidad de la formacin de colonias por
lo que la pendiente en esa fase de la grfica
se vuelve cero es decir entra a una fase
estacionaria (V) [6]

Conclusiones
El mtodo de obtencin de la especie
lactobacillus casei shirota a partir de
Yakult y la implementacin como
probitico en gelatina de mamey, es fiable
ya que el los microorganismos crecen
adecuadamente y sin contaminaciones (si se
tratan de la manera correcta). Por lo que la
produccin de gelatina como probitico es
factible.
Referencias
1. http://www.grupotolukasa.com.mx/
historia.html
Fecha consulta: 26/mayo/2014
2. http://www.repositoriodigital.ipn.m
x/bitstream/handle/123456789/889
1/VFINAL%20TESIS%20MLOZA
NO.pdf?sequence=1
Fecha consulta: 26/mayo/2014
3. http://www.tdx.cat/bitstream/handle
/10803/3931/mrg1de1.pdf?sequenc
e=1
4. Hernndez, A., Alfaro, I. y Arrieta,
R. (2003) Microbiologa Industrial.
Editorial UNED. Pg. 47, 49.
5. Tortora Gerard J, Funke Berdell R.,
Case Cristhine L. Introduccin a la
microbiologa. 2007. Editorial
medica Panamericana. Argentina.
Pg. 174, 177
6. Microbiologa. Prescott, Harley,
Klein: Quinta edicin, editorial
McGraw Hill Pg. 119- 13
7. Microorganismos tiles.
Universidad Nacional de Mar de la
Plata. Argentina. Fecha de consulta:
20/Mayo/2014. URL:
http://www.mdp.edu.ar/agrarias/gra
do/772_Microbiologia_Alimentos/a
rchivos/UT_5_MICROOG_UTILE
S.pdf