Belhaffef Amira

Driencourt Benoit
Fert Mathieu






RAPPORT DTUDE SUR LE
POTENTIEL PROBIOTIQUE DE
STREPTOCOCCUS SALIVARIUS







Devoir ralis dans le cadre de lUE 7u04
Mise en Situation Exprimentale
du Master BioMANE
Dcembre 2013
Professeur encadrant: Mme Virgine Libante


2
SOMMAIRE


I/ Introduction 3



II/ Matriel et mthodes 7

1. Activit inhibitrice de Streptococcus salivarius sur d'autres espces de bactries 7
1.1. tude du spectre de l'activit inhibitrice de S. salivarius 7
1.2. Recherche de gne de rgulation de la production de bactriocines 8
1.3. Extraction de bactriocines chez S. salivarius 10

2. Activit acidifiante de S. salivarius sur son milieu 10
2.1. tude quantitative de l'acidification du milieu pH initial 7 10
2.2. tude quantitative de l'acidification du milieu pH initial 5,5 11



III/ Rsultats 12

1/ Activit inhibitrice de S. salivarius sur d'autres espces de bactries 12
1.1. tude du spectre de l'activit inhibitrice de S. salivarius 12
1.2. Recherche de gne de rgulation de la production de bactriocine 15
1.3. Extraction de bactriocines chez S. salivarius 16

2. Activit acidifiante de S. salivarius sur son milieu 18



IV/ Discusssion 21



V/ Bibliographie 22

S
I/ Introduction
Les traitements mdicaux et notamment travers l'alimentation ont pris de plus en
plus d'importance au fil de l'histoire. La recherche en mdecine est toujours
d'actualit, luttant contre des pathognes qui s'adaptent en permanence.

1/ Les bactries probiotiques
Les bactries probiotiques sont au centre de nombreuses recherches aujourd'hui. Un
probiotique est un organisme vivant qui a un effet positif pour la sant de celui qui
l'ingurgite (en quantits suffisantes), souvent un micro-organisme. Consomm par
voie orale, ils agissent surtout dans l'intestin o est prsente une majeure partie de la
flore digestive et o se droule l'absorption des nutriments.

Beaucoup de probiotiques se trouvent la base sur les aliments que nous
consommons mais en disparaisse cause des traitements de conservation. C'est pour
cela que de nos jours, les probiotiques sont tudis pour tre ingrs comme
mdicament ou rajouts aux aliments. Les quelques probiotiques les plus courants sur
le march regroupent quelques Lactobacillus sp et Bifidobacterium lactus.

Les effets des probiotiques sont varis mais reprennent toutes le mme sens :
amliorer l'tat de sant du consommateur en aidant au transit intestinal avec des
scrtions d'enzymes ou des stimulations de la paroi intestinale, en synthtisant des
vitamines, des molcules anticancreuses et en stimulant le systme immunitaire.

Pour tre jug efficace, un probiotique doit rsister aux conditions intestinales, aux
procds alimentaires ainsi que d'tre inoffensif et apte une colonisation efficace.

2/ Streptococcus salivarius
Nous nous sommes intresss Streptococcus salivarius pour notre tude, dans le but
d'estimer son potentiel probiotique, sa capacit amliorer l'tat de sant des
individus qui l'ingurgiteraient. L'tat de sant d'une personne est quelque chose de
vaste et les manires de lamliorer sont nombreuses, ainsi nous nous sommes fixs
4
sur la capacit d'antagonisme de S.salivarius l'encontre d'ventuelles bactries
pathognes de la flore intestinale humaine.


Photographie d'une observation microscopique de S.salivarius

Caractristiques
S. salivarius est une bactrie lactique, celles-ci sont des bactries gram+, non-
sporulantes,acidophiles, non-mobiles, catalase- et chimioorganotrophes. Les bactries
lactiques sont caractrises par leur capacit faire la fermentation lactique et
S. salivarius est homofermentaire. Elles n'a pas de chane respiratoire et est d'ailleurs
incapable de respirer, ce qui lui impose une croissance lente et de nombreuses
auxotrophies. Comme tous les Streptococcus sp., S.salivarius est une coque, gram+,
catalase- et anarobie facultative.

Ses cellules sont sphriques ou ovodes et mesurent de 0,7 0,9!m. Elle est
chimioorganotrophe et tire son azote d'acides amins ou de peptides. Elle est
thermophile, acidophile et ses souches ont, souvent, entre 1 et 3 plasmides.

Elle fait partie de la flore intestinale humaine et y vit en comptition permanente car
de nombreuses bactries franchissent la barrire acide du tube digestif pour y trouver
un milieu chaud, stable et riche en nutriments.

Moyen de lutte : lamensalisme
Pour pouvoir survivre et colonier le tube digestif humain, S. salivarius a pu
dvelopper des mcanismes pour survivre malgr la comptition. Les bactries
S
lactiques ont deux principales manires de lutter contre leurs comptiteurs, nous
allons vrifier au cours de cette tude si S. salivarius les possde aussi. Ces processus
impliquent une action ngative pour la survie d'autres organismes dans leur milieu par
la production de composs toxiques/nocifs directement relchs dans le milieu, c'est
le principe de relations d'amensalisme.

A cause de leur croissance lente, les bactries lactiques ont dvelopp des
mcanismes de lutte contre les micro-organismes comptiteurs notamment avec la
libration de certains composs dans le milieu. Elles rejettent de l'acide lactique qui
acidifie le milieu et tue les micro-organismes non-acidophiles.

De plus, de nombreuses bactries lactiques produisent aussi des bactriocines. Ce sont
des peptides qui empchent la croissance voir tuent les bactries proches d'elles d'un
point de vue phylogntique. Ils agissent pour la plupart sur la membrane plasmique
aprs avoir travers la paroi.

Ainsi, cette tude va porter sur l'hypothse de la production de bactriocines et ses
effets sur d'autres bactries ainsi que sur la production d'acide lactique. Car, c'est
grce ces systmes de lutte contre ses comptiteurs que S. salivarius pourrait
remplir son rle de probiotique avec ces composs qui attaqueraient directement les
bactries pathognes de l'intestin.

Pour ce faire, nous avons suivi deux axes dtude :
Le premier porte sur lactivit inhibitrice de Streptococcus salivarius sur diffrentes
espces bactriennes. Cette activit est caractrise par son spectre, sa capacit agir
sur des espces bactriennes plus ou moins proches sur larbre phylognique de
S. salivarius. Nous avons choisi dtudier ce paramtre hors situation de comptition
en isolant les mtabolites de S. salivarius sur le milieu ensuite ensemenc avec les
bactries indicatrices, ou en situation de faible comptition en la laissant crotre
24 heures avant lensemencement des bactries indicatrices. Aussi,
Streptococcus thermophilus possde un systme de rgulation de la production de
bactriocines. Cette production est active ou sur-active par lintroduction du peptide
BlpC dans son milieu de croissance. Nous avons cherch si nous pouvions activer la
production de bactriocines chez S. salivarius avec le peptide BlpC en cherchant des
6
squences ADN analogues celles de Streptococcus thermophilus. Enfin, nous avons
appliqu un protocole dextraction de bactriocines sur S. salivarius pour en
confirmer la production et comparer leur masse molculaire avec les bactriocines
dautres espces bactriennes.

Le deuxime axe dtude porte sur le potentiel de S. salivarius acidifier son milieu.
Nous avons choisi dtudier ce potentiel avec un pH initial neutre (pH 7) ou acide
(pH 5,5).
7
II/ Matriel et mthodes
Choix des souches bactriennes
Nous avons slectionn trois souches de Streptococcus salivarius dans la collection de
lUniversit Henri Poincar pour leur sensibilit aux antibiotiques classiques et leur
innocuit. Ces souches sont S. salivarius S
7-1
, S
3-12
et S
6-4
.
Nous avons choisi des bactries indicatrices pour leur proximit phylognique plus ou
moins grande avec S. salivarius, et pour leur innocuit.

1. Activit inhibitrice de Streptococcus salivarius sur
dautres espces de bactries.
1.1. tude du spectre de lactivit inhibitrice de S. salivarius
1.1.1. tude de l'activit inhibitrice des mtabolites de
S. salivarius: Filtres et stries
1
er
jour :
Sur milieu M17 soft coul en boite de Ptri dposer un filtre -Sartorius Stedim- au
bord de la boite.
A partir dune culture liquide de S. salivarius en phase exponentielle, prlever 150 !l,
et centrifuger 4000 tours pendant 5 min. Rcuprer le culot dans 175 !l de milieu
M17 liquide.
Ensemencer les filtres avec 150!l de cette prparation (sans dborder).
Incuber les boites 37C ( 42C pour les souches tmoin utilises) pendant 24h.
Raliser lexprience pour les 3 souches de S. salivarius, et les souches de :
S. thermophilus LMD9 (tmoin positif connu pour sa forte activit inhibitrice)
S. thermophilus CNRZ 1066 (tmoin ngatif connu pour sa faible activit inhibitrice)

2
me
jour :
Retirer les filtres ensemencs la veille. Ensemencer en stries de lextrieur vers
lintrieur les diffrentes bactries indicatrices (Figure 1).
Incuber 37C pendant 24h.
8


Figuie 1 : Schma iepisentant le plan ues stiies sui boite vu ue uessus.

1.1.2. tude de l'activit inhibitrice de S. salivarius en situation
de comptition: Multi-couches

1
er
jour :
A partir dune culture liquide (ensemencer partir de 10
-6
pour S. salivarius S
7-1
et
S. salivarius S
6-4
sauf S. salivarus S
3-12
, prendre 10
-7
) en phase stationnaire de
Streptococcus salivarius, prlever 100!l et ensemencer 2ml de milieu M17 soft en
surfusion.

Bien agiter et les verser sur la couche de M17 solide pralablement coule dans des
mini boites de Ptri (Figure 2).
Homogniser, incuber 24h 37C.

2
me
jour :
Ensemencer 2ml de Milieu M17 soft avec 150!l de culture liquide de Bactries
indicatrices (Escherichia coli, Lactobacillus lactis cremoris, Streptococcus
thermophilus)
Agiter, verser sur la couche de S. salivarius coule la veille.
Homogniser, incuber 24h temprature optimale de chaque souche (E. coli 37C,
L. lactis cremoris 30C, S. thermophilus 42C)
> raliser lexprience en triplicata pour chaque souche indicatrice.



!"#$%&'()'*+'#"$&'#(),
1 !"#$%%&' '&)*$%$'
2 +'#,-.$#,$" #/%$
S 0*.-1*/#/##&' *,-.2/1,$%&' LNu 18S11
4 3"#*/#/##&' %"#*$' Nu
S 3"#*/#/##&' %"#*$' ciemoiis

.$"/(0(*$ )1& 2'/$&( +( ,
04 '"%$5".$&' S6-4; S7-1; SS-12
04 *,-.2/1,$%&' LNB9 (tmoin positif)
04 *,-.2/1,$%&' CNRZ 1u66 (tmoin
negatif)



1
2
S
4

S
9

M17 soft+bactrie indicatrice
M17 soft+ S. salivarius
M 17 solide
Figure 2 : schma de lensemencement des botes multi-couches

Bactries cibles:
Escherichia coli
Streptococcus thermophilus LMG 18311 (tmoin positif : souche productrice de
bactriocines)
Lactococcus lactis cremoris

1.2. Recherche de gnes de rgulation de la production de
bactriocines chez S. salivarius
1/ Buts
Nous avons voulu vrifier par PCR la prsence de gnes permettant et/ou activant la
synthse de bactriocines chez S. salivarius, pour cela nous avons effectu cette
exprience avec 4 souches : 3 souches de S. salivarius (7-1, 6-4 et 3-12) et la souche
S. thermophilus LMD9 qui sert de tmoin positif comme nous savons qu'elle libre
des bactriocines. Nous comptons ainsi observer un profil ressemblant entre la
migration de l'ADN cibl par la PCR entre LMD9 et une ou plusieurs des souches de
S. salivarius.

Pour les amorces, nous avons utilis 4 couples : ThermA (r et f), TepA (r et f), BlpU
(r et f) et BlpuK/BlpD, chacune de ces amorces cible une squence dans le gnome de
S. thermophilus qui contient un gne de synthse ou dactivation de bactriocine et
dont on connait la taille.

2/Protocole
1
er
jour :
-Nous avons utilis une micropipette (20!L) pour placer dans des tubes PCR 1 !L
des cultures des diffrentes souches tudies. Les cultures avaient t r-ensemenc
la dernire sance en milieu M17 liquide.
-Nous avons utilis 1!L deau pure comme tmoin ngatif.
1u
-Nous avons ensuite ajout dans chaque tube : 1!L de dNTP, 10!L d'eau et 2,5!L de
tampon.
-Ensuite, nous avons rajout l'amorce ThermA dans les cinq puits qui lui taient
attribu puis nous avons fait de mme avec les trois autres couples d'amorces (5!L
des deux amorces).
-Nous avons utilis une Taq polymrase (0,5!L).

2
me
Jour :
- Aprs la PCR, nous sommes passs l'lectrophorse sur gel d'agarose. Nous avons
plac les produits de PCR des amorces BlpU, ThepA et ThermA sur le gel d'agarose
2% et les amorces BlpD/BlpuK sur le gel d'agarose 1%, le gne cibl par ces
amorces tant bien plus gros que les autres et donc plus lourd. De plus, nous avons
rajout du marqueur de taille (5!L), entre les amorces du gel 2% et cot de
l'amorce sur le gel 1%.
- Aprs la migration, nous avons rcupr les deux gels d'agarose et nous les avons
observ aux UV et photographi le rsultat de la migration.

1.3. Extraction de bactriocines chez S. salivarius

On prend des cellules en phase stationnaire pour leur production de bactriocines plus
importante quen phase exponentielle (Dortu 2008).

Purification :
- Centrifuger 50ml de culture en phase stationnaire (3 souches de S. salivariuset
tmoin ngatif : S. thermophilus CNRZ 1066 et tmoin positif : S. thermophilus
LMD9) 5000 rpm pendant 15min 4C.
- Rpartir dans 2 tubes de 50ml : 20ml de surnageant et y ajouter 10ml de
chloroforme.
- Agiter vigoureusement pendant 45min.
- Centrifuger pendant 20min.

Dnaturation :
- Mettre 40!l dchantillon (prcipit, surnageant) aprs centrifugation dans des tubes
de PCR, lui ajouter 10!l de bleu dpt.
11
- Dans un thermocycleur : chauffer 95C pendant 5 min.
- Dposer les chantillons sur gel dlectrophorse et observer le gel aux UV.

2. Activit acidifiante de Streptococcus salivarius sur son
milieu

Afin de dmontrer lacidit provoque par les souches de S. salivarius, nous suivons
la variation du pH dans le bouillon M17 sans glycrophosphate (qui a un pouvoir
tampon). Les pH initial et final sont mesurs laide dun pH mtre.

2.1. tude quantitative de lacidification du milieu pH initial = 7
par S. salivarius
- Le pH initial correspond au pH du bouillon M17 sans inoculum (sans bactrie) qui
est gale pH=7.
- Ensemencer le milieu avec 1 ml dinoculum de S. salivarius (chaque souche
ensemence dans trois tubes sparment)
- Refermer le tube ensemenc et lincuber 37C pendant 48h.
- Le pH final est le pH mesur aprs lincubation de chacune des souches de
S. salivarius teste cultive dans le bouillon M17 spcifique sa croissance pendant
24 heures 37C.

2.2. tude quantitative de lacidification du milieu pH initial = 5,5
par S. salivarius
Les pH initial et final ont t mesurs laide dun pH mtre.
- Ensemencer le milieu avec 1 ml dinoculum de S. salivarius (chaque souche
ensemence dans trois tubes)
- Refermer le tube ensemenc et incuber 37C pendant 48h.
- Le pH final est le pH mesur aprs lincubation de chacune des souches de
S. salivarius teste cultive dans le bouillon M17 spcifique sa croissance pendant
24 heures 37C.
12
III/ Rsultats
1. Activit inhibitrice de Streptococcus salivarius sur
dautres espces de bactries.
1.1. tude du spectre de lactivit inhibitrice de S. salivarius
1.1.1. tude de l'activit inhibitrice des mtabolites de
S. salivarius: Filtres et stries


Figure 3 : isolement de bactriocines produites par S. salivarius sur filtres Sartorius (emplacement
indiqu par un cercle en pointills gris) et milieu M17 solide incubes 24h :(A) Tmoin positif S.
thermophilus LMD9, (B) S. salivarius S
7-1
, (C) S. salivarius S
3-12
, (D)S. salivarius S
6-4
.Inhibition de la
croissance de bactries indicatrices ensemences en stries et incubes 24h : (1) L. lactis cremoris, (2) L.
lactis MG, (3) S. thermophilus LMG 18311, (4) E. coli, (5) B. subtilis.

Le tmoin positif S. thermophilus LMD9 montre une faible inhibition de L. lactis
cremoris (Figure 3, A) ; une inhibition moyenne de E. coli et de B. subtilis ; une
bonne inhibition de L. lactis MG et de S. thermophilus LMG 18311.

1S
Le tmoin ngatif S. thermophilus CNRZ 1066 a t contamin durant
lensemencement des stries et nest donc pas exploitable.

S. salivarius S
3-12
montre une activit inhibitrice sur toutes les souches indicatrices
alors que S
7-1
montre une faible activit inhibitrice hormis sur L. lactis MG et S.
thermophilus LMG 18311. S. salivarius S
6-4
montre quant elle des niveaux
dinhibition intermdiaires avec toutefois une bonne inhibition de la croissance de L.
lactis MG et S. thermophilus LMG 18311.

Nous en dduisons suite cette exprience que S. salivarius S
3-12
prsente lactivit
inhibitrice la plus forte et le spectre le plus large.

1.1.2. tude de l'activit inhibitrice de S. salivarius en situation
de comptition: Multi-couches
Nous avons observ une forte activit inhibitrice des souches de Streptococcus
salivarius S
3-12
sur la souche de Lactococcus lactis cremoris teste (Figure 4 et
Table 1), et une activit moindre sur la souche dE. coli ; par contre elle navait aucun
effet sur la souche de S. thermophilus LMG 18311 (tmoin ngatif).

La souche de S. salivarius S
7-1
prsente une activit inhibitrice sur la souche de
L. lactis cremoris et E. coli, mais elle est sans effet sur S. thermophilus LMG 18311.

Lexprience mene avec S. salivarius S
6-4
na montr aucune activit inhibitrice sur
les diffrentes souches testes.

Remarque :
Lors de lobservation des rsultats de cette exprience ; nous avons observ sur la
boite de S. salivarius S
7-1
/L. lactis cremoris une seule zone dinhibition.

Les rsultats de cette exprience montrent que la souche de S. salivarius S
3-12
produit
des composs inhibiteurs qui agissent sur L. lactis cremoris ; par contre elle na eu
aucun effet sur S. thermophilusLMG 18311 qui est une souche productrice de
14
bactriocines, ceci peut tre du antagonisme entre les composs produits pas les
deux souches.


Figure 4 : exemple de rsultats.
(A) absence dinhibition entre S. salivarius S
7-1
et S. thermophilus. (B) forte inhibition entre
S. salivarius S
3-12
et L. lactis cremoris.


Table 1 : interprtation des rsultats de lexprience Multi-couches avec les souches de Streptococcus
salivarius.
E. coli L. lactis cremoris S. thermophilus
S. salivarius S
3-12
+ +++ -
S. salivarius S
7-1
+ + -
S. salivarius S
6-4
- - -
(+++) inhibition forte, (+) inhibition faible mais significative, (-) pas dinhibition.

La souche de S. salivarius S
3-12
semble produire de composs activit inhibitrice
agissants sur nos souches indicatrices.

La souche S
6-4
na montr aucune activit inhibitrice vis--vis des diffrentes souches
testes, nous en dduisons quelle ne produit pas de composs inhibiteurs, du moins
ils nont pas deffet sur les bactries indicatrices.





A B
1S
1.2. Recherche de gnes de rgulation de la production de
bactriocines chez S. salivarius
Avec l'amorce ThermA, on n'obtient pas de rsultat significatif (figure 5 A). A part
d'normes bandes de moins de 75pb, il n'y a rien d'autre et donc pas de fragment
d'environ 178pb, comme attendu. On n'a rien obtenu non plus avec LMD9.

Figure 5 A : rsultats de migration de la PCR par les amorces ThermA, TepA et BlpU.

Figure 5 B : rsultats de migration de la PCR par les amorces BlpuK/BlpD.
L'amorce TepA a donn de grandes bandes de moins de 75pb mais galement une
bande pour la souche S
6-4
de 350pb environ, elle ne correspond pas la taille attendue
mais s'en rapproche.

L'amorce BlpU n'as pas montr de bandes de 188pb mais une bande de 1000pb pour
LMD9 et une de 1200pb pour la souche S
6-4
. Il y a galement une bande de 800pb
environ qui se retrouve pour toutes les souches et mme pour l'eau.

16
Enfin, les amorces BlpuK et BlpD ont donn de grandes bandes moins de 200pb et
une bande 1200pb pour la souche S
6-4
, plutt que le fragment de 705pb attendu
(Figure 5 B).

L'exprience avec les amorces ThermA n'a rien donn, aucun fragment qui se dtache
des autres : l'amas d'ADN de moins de 75pb n'est pas interprtable.

Celle avec Tep A est plus intressante, elle montre que la souche S
6-4
a un fragment
de 350pb environ. Cela ne correspond pas, apparemment, au fragment recherch
avec cette amorce, mais une diffrence de migration d au gel ou au fragment lui-
mme est envisageable, l'cart de taille observ n'tant pas trs grand. Ainsi, on peut
dire que la souche S
6-4
a peut-tre le gne de production de bactriocine cibl par
l'amorce TepA.

Cela se remarque aussi avec le couple d'amorces BlpuK/BlpD o la souche S
6-4
ne
prsente pas de fragment de 705pb comme cela est attendu, mai une bande de 1200pb.
La diffrence tant faible, cela montre peut-tre la prsence du gne cibl par
BlpuK/BlpD.

L'exprience avec BlpU, elle, montre une bande qui se retrouve pour toutes les
souches et pour l'eau. Si l'on retrouve une bande avec l'eau, alors qu'elle ne doit pas
contenir d'ADN, cela montre que les puits des amorces BlpU ont t contamins et
que l'on voit l un fragment d'ADN d'un contaminant. A part cela, on retrouve ces
deux fragments pour LMD9 et la souche S
6-4
, bien qu'ils ne correspondent
apparemment pas au fragment attendu (188pb), le fait de retrouver chez LMD9 un
fragment de taille presque identique que celui vu pour la souche S
6-4
confirme que
cela doit tre le fragment recherch que l'on a retrouv sur LMD9 (tmoin positif) et
sur la souche S
6-4
.

1.3. Extraction de bactriocines chez S. salivarius

Le profil du tmoin positif S. thermophilus LMD9 montre deux bandes bien marques
et de taille diffrente et une bande moins intense assez proche de lune des deux
17
bandes intenses (Figure 6). Il y a aurait donc au moins deux squences peptidiques
isoles.


Figure 6 : gel SDS-PAGEde bactriocines-like prpares avec la procdure dextraction au
chloroforme. (1066) tmoin ngatif S. thermophilus CNRZ 1066, (LMD9) tmoin positif
S. thermophilus LMD9, (S6-4) S. salivarius S
6-4
, (S3-12) S. salivarius S
3-12
, (S7-1) S. salivarius S
7-1
.

Le profil du tmoin ngatif S. thermophilus CNRZ 1066 montre deux bandes de faible
intensit.
Le profil de S. salivarius S6-4 ne prsente pas de bandes dintensit significative.
Le profil de S. salivarius S
3-12
prsente trois bandes intenses dont deux sont groupes
et correspondent une bande du tmoin positif.
Le profil de S. salivarius S
7-1
prsente trois groupes de bandes dintensit moyenne.

Les diffrentes souches de S. salivarius ne produisent pas les mmes squences
polypeptidiques et nen produisent pas les mmes quantits. S. salivarius S
6-4
ne
produit pas les polypeptides recherchs. Nous pouvons nanmoins conclure que
S. salivarius S
3-12
et S
7-1
produisent des squences qui laissent prsager la production
de bactriocines similaires celles du tmoin positif.
18
2. Activit acidifiante de Streptococcus salivarius sur son
milieu

Nous observons une acidification du milieu dans tous les cas et on atteint un pH final
autour de 4 pour chaque souche, aussi que le pH final est plus faible lorsque le pH
initial est 7 que lorsquil est de 5,5 (Figure 7).


Figuie 7 : mesuie uu pB apies 48h sui N17 liquiue avec un pB initial ue 7 et ue S,S. (S6-4)
04 '"%$5".$&' S6-4, (S7-1) 04 '"%$5".$&' S7-1, (SS-12) 04 '"%$5".$&' SS-12, avec baiies u'eiieui stanuaiu.

La modification du pH initial chaque exprience pour les diffrentes souches testes
montre quelles ont un potentiel dacidification du milieu pouvant tre exploit.

La souche S
3-12
semble tre la souche avec le potentiel dacidification le plus lev,
surtout quand elle est ensemence au dpart un pH=7, ce potentiel peut tre due
son activit mtabolique (fermentation du lactose en acide lactique).

Par ailleurs, la souche S
7-1
semble avoir un potentiel dacidification moindre,
notamment dans un milieu pH initial de 5,5.

Pour dterminer si les souches avaient un effet diffrent sur le pH, nous avons
effectu des tests statistiques.

3,8
3,85
3,9
3,95
4
4,05
4,1
4,15
4,2
4,25
4,3
pH 7 pH 5,5 pH 7 pH 5,5 pH 7 pH 5,5
S6-4 S7-1 S3-12
pH nal
19
Comme nous avions trois chantillons, nous avons men un test de Kruskal-Wallis
pour dterminer sil y a une diffrence significative entre un et les autres :
Aprs avoir plac les valeurs des trois chantillons, on obtient les moyennes des rangs
pour chacun. On a un indice statistique (H) de 14. A cot, d'aprs la table du Khi
2
, on
obtient une valeur du c de 5,991, avec un ddl gal 2 et un p de 0 ,05.
H tant suprieur au c, on refuse l'hypothse nulle donc il y a une diffrence
significative entre un des chantillons et les deux autres.
Pour dterminer quel est l'chantillon diffrent, on fait un test de comparaisons
multiples avec les trois chantillons.
Test sur les trois couples d'chantillons possibles, avec un p de 0,05 :
-6-4/7-1 : Rm(diffrence des rangs)=5, indice statistique=6,7171 donc pas de
diffrence significative.
-6-4/3-12 : Rm=6,5, indice=6,7171 donc pas de diffrence significative (mais trs
proche du contraire).
-7-1/3-12 : Rm=11,5, indice=6,7171 donc une diffrence significative.

L'chantillon S7-1 ou S3-12 semble prsenter une diffrence avec les deux autres,
peut-tre plus le 3-12.
Pour les dpartager, on fait les mme tests mais avec un p de 0,1:
-6-4/7-1 : Rm=5, indice 5,964 donc pas de diffrence significative.
-6-4/3-12 : Rm=6,5, indice 5,964 donc une diffrence significative.
-7-1/3-12 : Rm=11,5, indice 5,964 donc une diffrence significative.

L'chantillon 3-12 prsente une diffrence entre ses valeurs et celles des deux autres
chantillons.
La souche 3-12 acidifierait plus son milieu, avec un risque d'erreur de 10%.

pH de dpart :
Pour vrifier si le ph de dpart influe sur le ph final aprs cultures, on a fait un test de
Mann-Whitney avec l'chantillon A, pH 5,5 et lchantillon B, pH 7 (9 valeurs
chacun)
On a donc obtenu Ua=24 et Ub=57, on a choisi Ua pour valeur du U donc 24.
Sur la table de Mann-Whitney, avec deux chantillons 9 et un p de 0,05 par dfaut,
on a obtenu un C de 17.
2u

Comme U est suprieur c, Ho est accept donc, 5% de risque d'erreur, il n'y a pas
d'impact du pH de dpart sur les pH finaux.

La modification du pH initial chaque exprience pour les diffrentes souches testes
montre quelles ont un potentiel dacidification du milieu pouvant tre exploit.

La souche S
3-12
semble tre la souche avec le potentiel dacidification le plus lev,
surtout quand elle est ensemence au dpart un pH=7, ce potentiel peut tre du son
activit mtabolique (fermentation du lactose en acide lactique).

Par ailleurs, la souche S
7-1
semble avoir un potentiel dacidification moindre,
notamment dans un milieu pH initial de 5,5.
21
IV/ Conclusion
travers nos expriences, nous avons mis en vidence lactivit inhibitrice de
Streptococcus salivarius et son activit acidifiante. Ces activits sont potentiellement
exploitables dans le dveloppement dun probiotique intestinal. Parmi les souches
testes, S. salivarius S
3-12
montre la plus forte activit inhibitrice sur le plus grand
nombre de bactries indicatrices, et la plus forte acidification du milieu. Nous avons
galement pu mettre en vidence une production de bactriocines, molcules
antibiotiques en vogue dans le domaine des biotechnologies modernes. Le fait que
nous nayons pas mis en vidence de locus li aux bactriocines dans le gnome de
S
3-12
montre que des recherches sont encore mener sur cette souche.

la suite de ces expriences prliminaires, le travail de dveloppement du
probiotique ncessiteront beaucoup de temps puisquil faudra dmontrer la capacit
de S
3-12
coloniser lintestin afin quelle prodigue ses effets bnfiques sur la dure. Il
faudra enfin trouver un moyen de labsorber qui maximisera ses effets.

Concernant le nom du produit, la troisime et la douzime lettre de lalphabet sont C
et L. La souche S
3-12
donne ainsi SCL : Solution Control Light.

22
V/ Bibliographie
http://brccbio205sp11.blogspot.fr/2011/07/natural-occurring-cavity-fighters.html
consult le 30/09/2013



Cohen-Hadria A. 2010. Les probiotiques: quelles perspectives en odontologie?. Thse
d'exercice : Chirurgie dentaire : Paris 7.

Corrieu G. Luquet F.-M. 2008. Bactries lactiques : De la gntique aux ferments.
Collection sciences et techniques agroalimentires. Ed. TECH & DOC. Paris-France.

Dartu C ; Thonart P. Les bactriocines des bactries lactiques : Caractristiques et
intrts pour la bioconservation des sols. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2009
13(1), 143-154.

De Vos P ; Boone D. R. ; Garrity G. M. 2011. Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes. 2
e
ed. Springer. New-York- USA.

Leyral G ; Vierling E. 2007. Microbiologie et toxicologie des aliments: Hygine et
scurit alimentaires. 4
e
ed. Reuil-Malmaison. Bordeaux-France.

Prescott L.M; Harley J.-P; Klein D. A. 2003. Microbiologie. 2
e
ed. de boek.
Bruxelles- Belgique. Pp. 702.

Wilson M; et al. Clinical and Laboratory Features of Streptococcus
salivariusMeningitis: A Case Report and Literature Review. Clin Med Res. Fvrier
2012. 10(1) : 15-25.