P r o c . N a t i . A c a d . S c i .

US A
V o l . 7 6 , N o . 1 , p p . 1 0 6 - 1 1 0 , J a n u a r y 1 9 7 9
B i o c h e m i s t r y
E x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i o f c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d g e n e s
f o r h u m a n i n s u l i n
( p l a s m i d c o n s t r u c t i o n / l a c o p e r o n / f u s e d p r o t e i n s / r a d i o i m m u n o a s s a y / p e p t i d e p u r i f i c a t i o n )
DA V ID V . G O E DDE L * t , DE N N IS G . K L E ID* , F R A N C IS C O B O L IV A R * , HE R B E R T L . HE Y N E K E R * ,
DA N IE L G . Y A N S UR A * , R O B E R TO C R E A * t , TA DA A K I HIR O S E f , A DA M K R A S Z E W S K It ,
K E IIC HI ITA K UR A f , A N D A R THUR D. R IG G S t t
* Di v i s i o n o f Mo l e c u l a r B i o l o g y , G e n e n t e c h , In c . , 4 6 0 P o i n t S a n B r u n o B o u l e v a r d , S o u t h S a n F r a n c i s c o , C a l i f o r n i a 9 4 0 8 0 ; a n d * Di v i s i o n o f B i o l o g y , C i t y o f Ho p e
N a t i o n a l Me d i c a l C e n t e r , Du a r t e , C a l i f o r n i a 9 1 0 1 0
C o m m u n i c a t e d b y E r n e s t B e u t l e r , O c t o b e r 3 , 1 9 7 8
A B S TR A C T S y n t h e t i c g e n e s f o r h u m a n i n s u l i n A a n d B
c h a i n s w e r e c l o n e d s e p a r a t e l y i n p l a s m i d p B R 3 2 2 . Th e c l o n e d
s y n t h e t i c g e n e s w e r e t h e n f u s e d t o a n E s c h e r i c h i a c o l i
# - g a -
l a c t o s i d a s e g e n e t o p r o v i d e e f f i c i e n t t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a -
t i o n a n d a s t a b l e p r e c u r s o r p r o t e i n . Th e i n s u l i n p e p t i d e s w e r e
c l e a v e d f r o m
P g a l a c t o s i d a s e ,
d e t e c t e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y
a n d p u r i f i e d . C o m p l e t e p u r i f i c a t i o n o f t h e A c h a i n a n d p a r t i a f
p u r i f i c a t i o n o f t h e B c h a i n w e r e a c h i e v e d . Th e s e p r o d u c t s w e r e
m i x e d , r e d u c e d , a n d r e o x i d i z e d . Th e p r e s e n c e o f i n s u l i n w a s
d e t e c t e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y .
R e c e n t l y i m p r o v e d m e t h o d s o f DN A c h e m i c a l s y n t h e s i s ,
c o m b i n e d w i t h r e c o m b i n a n t DN A t e c h n o l o g y , p e r m i t t h e d e -
s i g n a n d r e l a t i v e l y r a p i d s y n t h e s i s o f m o d e s t - s i z e d g e n e s t h a t
c a n b e i n c o r p o r a t e d i n t o p r o k a r y o t i c c e l l s f o r g e n e e x p r e s s i o n .
Th e f e a s i b i l i t y o f t h i s g e n e r a l a p p r o a c h w a s f i r s t d e m o n s t r a t e d
b y t h e s y n t h e s i s , a n d e x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l , o f a g e n e
f o r t h e m a m m a l i a n p e p t i d e s o m a t o s t a t i n ( 1 ) .
F o l l o w i n g t h e p r e c u r s o r p r o t e i n a p p r o a c h u s e d f o r s o m a -
t o s t a t i n ( 1 ) , t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n f o r t h i s w o r k w a s s u c h t h a t
t h e i n s u l i n p e p t i d e c h a i n s w o u l d b e m a d e i n v i o a s s h o r t t a i l s
j o i n e d b y a m e t h i o n i n e t o t h e e n d o f , 3 - g a l a c t o s i d a s e . A f t e r
s y n t h e s i s , t h e i n s u l i n c h a i n s , w h i c h c o n t a i n n o m e t h i o n i n e , c a n
b e c l e a v e d o f f e f f i c i e n t l y b y t r e a t m e n t w i t h c y a n o g e n b r o m i d e .
W e d e l i b e r a t e l y c h o s e t o c o n s t r u c t t w o s e p a r a t e b a c t e r i a l
s t r a i n s , o n e f o r e a c h o f t h e t w o p e p t i d e c h a i n s o f i n s u l i n : t h e
2 1 - a m i n o - a c i d A c h a i n a n d t h e 3 0 - a m i n o - a c i d B c h a i n . In n a -
t i v e i n s u l i n , t h e t w o c h a i n s a r e h e l d t o g e t h e r b y t w o d i s u l f i d e
b o n d s , a n d m e t h o d s h a v e b e e n a v a i l a b l e f o r y e a r s f o r j o i n i n g
t h e c h a i n s c o r r e c t l y , i n v i t r o , b y a i r o x i d a t i o n ( 2 ) . Th e e f f i c i e n c y
o f c o r r e c t j o i n i n g h a s b e e n v a r i a b l e a n d o f t e n l o w . Ho w e v e r ,
b y u s i n g S - s u l f o n a t e d d e r i v a t i v e s a n d a n e x c e s s o f A c h a i n ,
5 0 - 8 0 % c o r r e c t j o i n i n g h a s b e e n o b t a i n e d ( 3 ) .
Th e s y n t h e t i c p l a n a n d c h e m i c a l s y n t h e s i s o f t h e DN A
f r a g m e n t s c o d i n g f o r t h e A a n d B c h a i n s o f h u m a n i n s u l i n w e r e
d e s c r i b e d i n a p r e v i o u s p a p e r ( 4 ) a n d w e r e s u m m a r i z e d i n F i g .
1 o f t h a t p a p e r . In t h i s c o m m u n i c a t i o n , w e d e s c r i b e t h e a s -
s e m b l y a n d c l o n i n g o f t h e g e n e s f o r t h e A a n d B c h a i n s , t h e i r
i n s e r t i o n i n t o t h e c a r b o x y t e r m i n u s o f t h e E . c o l i
f 3 - g a l a c t o s i d a s e
s t r u c t u r a l g e n e , t h e e x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f t h e s e p a r a t e
A a n d B c h a i n s , a n d t h e i r j o i n i n g t o f o r m n a t i v e h u m a n i n s u -
l i n .
MA TE R IA L S A N D ME THO DS
B a c t e r i a l S t r a i n s . E . c o l i K - 1 2 s t r a i n 2 9 4 ( e n d A , t h i - , h s r - ,
h s m k + ) ( 5 ) w a s p r o v i d e d b y K . B a c k m a n . E . c o l i K - 1 2 s t r a i n
D1 2 1 0 , a l a c + ( i Q o + z + y + ) d e r i v a t i v e o f HB 1 0 1 , w a s c o n -
s t r u c t e d b y J . B e t z a n d J . S a d l e r a n d o b t a i n e d f r o m J . S a d l e r .
E n z y m e s a n d DN A P r e p a r a t i o n s . T4 DN A l i g a s e a n d T4
p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e w e r e p u r i f i e d a s d e s c r i b e d ( 6 ) . R e s t r i c t i o n
e n d o n u c l e a s e E c o R I w a s p u r i f i e d b y t h e p r o c e d u r e o f G r e e n e
e t a l . ( 7 ) ; Hi n d III w a s p u r i f i e d b y a m e t h o d d e v e l o p e d b y D.
G o e d d e l ( u n p u b l i s h e d ) . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e B a m HI w a s
p u r c h a s e d f r o m B e t h e s d a R e s e a r c h ( R o c k v i l l e , MD) ; E . c o l i
a l k a l i n e p h o s p h a t a s e w a s p u r c h a s e d f r o m W o r t h i n g t o n .
P l a s m i d s , i n c l u d i n g p B R 3 2 2 ( 8 ) , w e r e i s o l a t e d b y a p u b l i s h e d
p r o c e d u r e ( 9 ) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . Th e c h e m i c a l s y n t h e s i s
o f t h e d e o x y o l i g o n u c l e o t i d e s ( f i g u r e 1 o f r e f . 4 ) h a s b e e n d e -
s c r i b e d ( 4 ) . X p l a c 5 DN A w a s i s o l a t e d a s d e s c r i b e d ( 1 0 ) .
Th e f o l l o w i n g r e a c t i o n b u f f e r s w e r e u s e d : k i n a s e b u f f e r , 6 0
m M Tr i s - HC l , p H 8 / 1 5 m M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l / 1 0 m M Mg C l 2 ;
l i g a s e b u f f e r , 2 0 m M Tr i s - HC l , p H 7 . 5 / 1 0 m M d i t h i o t h r e i t o l / 1 0
m M Mg C l 2 ; B a m HI b u f f e r , 2 0 m M Tr i s - HC l , p H 7 . 5 / 7 m M
Mg C l 2 / 2 m M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ; E c o R I- Hi n d Il l b u f f e r ,
B a m HI b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M N a C l ; a n d p h o s p h a t a s e
b u f f e r , 5 0 m M Tr i s - HC l , p H 8 / 1 0 m M Mg C l 2 .
A s s e m b l y o f In s u l i n G e n e s . Th e a s s e m b l y o f t h e r i g h t ( B B )
h a l f o f t h e B - c h a i n g e n e ( s e e f i g u r e 1 o f r e f . 4 ) w i l l b e d e s c r i b e d
i n d e t a i l . O l i g o n u c l e o t i d e s B 2 - B 9 w e r e p h o s p h o r y l a t e d i n d i -
v i d u a l l y . F i f t y m i c r o c u r i e s o f [ ' y - 3 2 P ] A TP ( n - 2 0 0 0 C i / m m o l ,
N e w E n g l a n d N u c l e a r ) w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s i n a 1 . 5 - m l
p o l y p r o p y l e n e t u b e , t h e n i n c u b a t e d w i t h t h e o l i g o n u c l e o t i d e
( 1 0 , u g ) a n d 8 u n i t s o f T4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e i n 6 0
A l
o f k i n a s e
b u f f e r . A f t e r 2 0 m i n a t 3 7 0 C , 1 0 n m o l o f A TP a n d 1 0 u n i t s o f
T4 k i n a s e w e r e a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s c o n t i n u e d f o r a n
a d d i t i o n a l h o u r . Th e k i n a s e w a s i n a c t i v a t e d b y h e a t i n g a t 9 0 C
f o r 5 m i n .
P h o s p h o r y l a t e d f r a g m e n t s B 2 , B 3 , B 6 , a n d B 7 ( 2 . 5 , g e a c h )
w e r e c o m b i n e d w i t h 2 . 5
j A g
o f 5 ' - O H f r a g m e n t B i a n d d i a l y z e d
f o r 2 h r a g a i n s t 1 l i t e r o f l i g a s e b u f f e r . A TP w a s a d d e d t o a
c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 m M, t h e r e a c t i o n m i x t u r e ( 6 0 A l )
w a s
c o o l e d t o 1 2 0 C , a n d T4 l i g a s e ( 5 0 u n i t s ) w a s a d d e d . A s e p a r a t e
l i g a t i o n r e a c t i o n i n v o l v i n g p h o s p h o r y l a t e d f r a g m e n t s B 4 , B 5 ,
B 8 , a n d B 9 a n d u n p h o s p h o r y l a t e d B 1 0 w a s p e r f o r m e d i d e n t i -
c a l l y . A f t e r 1 2 h r a t 1 2 0 C , t h e t w o l i g a t i o n r e a c t i o n m i x t u r e s
w e r e c o m b i n e d , a d d i t i o n a l T4 l i g a s e ( 4 0 u n i t s ) w a s a d d e d , a n d
t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 1 2 0 C f o r 4 h r . Th e m i x t u r e w a s
e x t r a c t e d w i t h p h e n o l / c h l o r o f o r m a n d p r e c i p i t a t e d w i t h e t h -
a n o l , a n d t h e DN A f r a g m e n t s w e r e p u r i f i e d b y e l e c t r o p h o r e s i s
o n a 1 0 % a c r y l a m i d e g e l ( 1 1 ) . Th e m o s t s l o w l y m i g r a t i n g b a n d
w a s s l i c e d f r o m t h e g e l a n d t h e DN A w a s e x t r a c t e d ( 1 1 ) .
A s i m i l a r p r o c e d u r e , w i t h t h e f o l l o w i n g e x c e p t i o n s , w a s u s e d
t o a s s e m b l e t h e l e f t ( B H) h a l f o f t h e B - c h a i n g e n e . A l l e i g h t
A b b r e v i a t i o n s : B B , l e f t h a l f o f i n s u l i n B g e n e ; B H, r i g h t h a l f o f i n s u l i n
B g e n e ; A ( S S 0 3 - ) , S - s u l f o n a t e d d e r i v a t i v e s o f t h e i n s u l i n A - c h a i n
p e p t i d e ; B ( S S 0 3 - ) , S - s u l f o n a t e d d e r i v a t i v e s o f t h e i n s u l i n B - c h a i n
p e p t i d e .
t To w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .
1 0 6
Th e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e
c h a r g e p a y m e n t . Th i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d -
v e r t i s e m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e
t h i s f a c t .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 6 ( 1 9 7 9 ) 1 0 7
o l i g o n u c l e o t i d e s ( H1 - H8 i n f i g u r e 1 o f r e f . 4 , 3 0
A g e a c h ) w e r e
p h o s p h o r y l a t e d . Th e r e f o r e , a f t e r c o m p l e t e l i g a t i o n a n d b e f o r e
p u r i f i c a t i o n b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s
t r e a t e d w i t h 4 0 0 u n i t s o f E c o R I a n d 4 0 0 u n i t s o f Hi n d III f o r
2 h r a t 3 7 0 C . Th e B H b a n d m i g r a t i n g a t 4 6 b a s e p a i r s w a s
e l u t e d f r o m a 1 0 % a c r y l a m i d e g e l .
Th e p r o c e d u r e u s e d t o c o n s t r u c t t h e A - c h a i n g e n e w a s a l s o
s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d f o r t h e B B f r a g m e n t . Th e o n l y m a j o r
d i f f e r e n c e w a s t h a t , a f t e r a s s e m b l y , t h e 5 ' e n d s o f t h e c o m p l e t e
A g e n e w e r e p h o s p h o r y l a t e d .
C o n s t r u c t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f l a c - In s u l i n Hy b r i d
P l a s m i d s . Th e B B f r a g m e n t w a s c l o n e d a s f o l l o w s : 1 , . g o f
p B R 3 2 2 w a s t r e a t e d w i t h 5 u n i t s o f B a m HI i n B a m HI b u f f e r
f o r 1 h r a t 3 7 0 C . A f t e r a d d i t i o n o f N a C l t o 5 0 m M, Hi n d III ( 5
u n i t s ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s c o n t i n u e d f o r 1 h r . Th e
e n z y m e s w e r e i n a c t i v a t e d b y h e a t i n g a t 7 0 ' C f o r 1 0 m i n . Th e
p r e p a r e d p B R 3 2 2 w a s l i g a t e d t o t h e B B f r a g m e n t f o r 3 h r a t
1 2 ' C i n 2 5 p A o f l i g a s e b u f f e r ( c o n t a i n i n g 0 . 1 6 m M A TP ) b y
u s i n g 2 0 u n i t s o f T4 l i g a s e . Ha l f o f t h e r e s u l t i n g DN A w a s u s e d
t o t r a n s f o r m E . c o l i 2 9 4 b y a p u b l i s h e d p r o c e d u r e ( 1 2 ) . Th e B H
f r a g m e n t a n d t h e A - c h a i n g e n e w e r e c l o n e d s i m i l a r l y , w i t h t h e
a p p r o p r i a t e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s t o c u t p B R 3 2 2 .
C o n s t r u c t i o n o f t h e p l a s m i d s f o r e x p r e s s i o n o f t h e s y n t h e t i c
i n s u l i n g e n e s i s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g . 1 . Th e s e p a r a t e
c h a i n s i n i n s u l i n a r e b i o l o g i c a l l y i n a c t i v e ( 2 ) a n d w e r e s y n t h e -
s i z e d a t t a c h e d t o l a r g e p r e c u r s o r p r o t e i n s . Th e r e f o r e , t h e c o n -
t a i n m e n t l e v e l o f P 2 - E K 1 , r e c o m m e n d e d b y t h e N a t i o n a l In -
s t i t u t e s o f He a l t h g u i d e l i n e , w a s u s e d .
DN A S e q u e n c e s . Th e m e t h o d o f Ma x a m a n d G i l b e r t ( 1 1 )
w a s u s e d t o d e t e r m i n e DN A s e q u e n c e s . S e q u e n c e d a t a a r e n o t
i n c l u d e d , b u t w i l l b e p r o v i d e d u p o n r e q u e s t .
P r e p a r a t i o n o f In s u l i n R e a g e n t s . P o r c i n e a n d b o v i n e i n s u l i n
w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a . Th e S - s u l f o n a t e d d e r i v a t i v e s
( S S 0 3 - ) o f t h e i r A a n d B c h a i n s w e r e p r e p a r e d a n d p u r i f i e d a s
d e s c r i b e d ( 1 3 ) . % 5 S - L a b e l e d A ( S S O 3 - ) a n d B ( S S O 3 - ) w e r e
p r e p a r e d s i m i l a r l y e x c e p t t h a t 5 m C i o f s o d i u m [ s 5 S ] s u l f i t e ( 6 9
m C i / m o l , N e w E n g l a n d N u c l e a r ) w a s s u b s t i t u t e d f o r u n l a b e l e d
E c o R I P O O - g a l
X p l a c 5 - -
E c o R I B B - - p B R 3 2 2 _
p B B 1 0 1
- I
Hi n d l i l l
s o d i u m s u l f i t e . A f t e r s e p a r a t i o n o f t h e c h a i n s , t h e s p e c i f i c a c -
t i v i t y w a s 9 2 , 0 0 0 c p m / , u g a n d 3 2 , 0 0 0 c p m / , u g , r e s p e c t i v e l y ,
f o r A a n d B c h a i n s . Th e r a d i o i m m u n o a s s a y f o r t h e i n s u l i n
c h a i n s i s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g . 3 .
P u r i f i c a t i o n o f B C h a i n o f Hu m a n In s u l i n . E . c o l i
D1 2 1 0 / p IB l w a s g r o w n t o l a t e l o g a r i t h m i c p h a s e i n 7 l i t e r s o f
L B m e d i u m ( 1 0 ) c o n t a i n i n g 2 0 m g o f a m p i c i l l i n p e r l i t e r . Is o -
p r o p y l - f l - D- t h i o g a l a c t o s i d e w a s a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n
o f 2 m M, a n d t h e c e l l s w e r e g r o w n f o r o n e m o r e d o u b l i n g . W e t
c e l l p a s t e ( 2 4 g ) w a s s u s p e n d e d i n 3 0 m l o f B B b u f f e r ( 1 0 ) a n d
c e l l s w e r e l y s e d b y o n e p a s s a g e t h r o u g h a F r e n c h p r e s s a t 4 0 0 0
l b / i n c h 2 ( 2 7 . 6 MP a ) . Th e c e l l d e b r i s w a s p e l l e t e d b y c e n t r i f u -
g a t i o n a t 1 5 , 0 0 0 r p m f o r 3 0 m i n . Th e p e l l e t w a s d i s s o l v e d i n 4 0
m l o f 6 M g u a n i d i n i u m c h l o r i d e / 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l a n d
c e n t r i f u g e d a t 3 0 , 0 0 0 r p m f o r 1 h r . Th e s u p e r n a t a n t w a s d i -
a l y z e d o v e r n i g h t a g a i n s t 2 0 l i t e r s o f H2 0 . Th e p r e c i p i t a t e ,
c o n t a i n i n g a b o u t 1 g o f p r o t e i n , w a s d i s s o l v e d i n 2 5 m l o f 7 0 %
f o r m i c a c i d . C y a n o g e n b r o m i d e ( 1 . 3 g ) w a s a d d e d a n d t h e
m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e a c t o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e .
F o r m i c a c i d a n d c y a n o g e n b r o m i d e w a s r e m o v e d b y r o t a r y
e v a p o r a t i o n a n d t h e r e s i d u e w a s d i s s o l v e d i n 5 0 m l o f 8 M
g u a n i d i n i u m c h l o r i d e . S - S u l f o n a t e d d e r i v a t e s o f t h e p e p t i d e
m i x t u r e w e r e p r e p a r e d b y a d d i n g 1 g o f s o d i u m t e t r a t h i o n a t e
a n d 2 g o f s o d i u m s u l f i t e , a d j u s t i n g t h e p H t o 9 w i t h N H4 0 H,
a n d s t i r r i n g t h e m i x t u r e s a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 4 h r . Th e
p H w a s t h e n a d j u s t e d t o 5 w i t h a c e t i c a c i d a n d t h e m i x t u r e w a s
d i a l y z e d t w i c e a g a i n s t 3 l i t e r s o f H2 0 . Th e r e s u l t i n g w h i t e
p r e c i p i t a t e ( - 0 . 6 g o f p r o t e i n ) w a s p e l l e t e d b y c e n t r i f u g i n g a t
1 0 , 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n .
P u r i f i c a t i o n o f A C h a i n o f Hu m a n In s u l i n . E . c o l i 2 9 4 /
p IA l w a s g r o w n t o A 5 5 0 o f 2 i n 5 l i t e r s o f L B m e d i u m c o n -
t a i n i n g 2 0 m g o f a m p i c i l l i n p e r l i t e r . Th i s s t r a i n i s c o n s t i t u t i v e
f o r f l - g a l a c t o s i d a s e a n d s o w a s n o t i n d u c e d . Th e 1 5 g ( w e t
w e i g h t ) o f c e l l s o b t a i n e d w e r e p r o c e s s e d b y t h e s a m e p r o c e d u r e
u s e d f o r t h e B c h a i n u p t h r o u g h t h e p r e p a r a t i o n o f t h e S - s u l -
f o n a t e d d e r i v a t i v e s . A f t e r t h e p H w a s a d j u s t e d t o 5 a n d t h e
m i x t u r e w a s d i a l y z e d a g a i n s t H2 0 t o a n i o n i c s t r e n g t h o f a b o u t
G e n e f o r
P - g a l
,
A
A
T4
l i g a s e
p B H1 E c o R I
B H
V
Hi n d l i l
F IG . 1 . C o n s t r u c t i o n o f l a c - i n s u l i n p l a s m i d s . p B B 1 0 1 ( 2 Mg ) ( p B R 3 2 2 c o n t a i n i n g t h e B B s e q u e n c e ) w a s t r e a t e d w i t h E c o R I a n d Hi n d III ( 2 0
u n i t s e a c h ) , a n d t h e l a r g e f r a g m e n t w a s p u r i f i e d o n a 1 0 % a c r y l a m i d e g e l . p B H1 ( 8 g g ) ( p B R 3 2 2 c o n t a i n i n g B H s e q u e n c e ) a l s o w a s t r e a t e d w i t h
E c o R I a n d Hi n d III, a n d t h e s m a l l f r a g m e n t w a s p u r i f i e d o n a 1 0 % a c r y l a m i d e g e l . Th e s e t w o f r a g m e n t s w e r e l i g a t e d t o 2 , u g o f E c o R I- d i g e s t e d
X p l a c 5 i n 3 0 Ml o f l i g a s e b u f f e r w i t h 2 0 u n i t s o f l i g a s e . Th i s m i x t u r e w a s u s e d t o t r a n s f o r m E . c o l i 2 9 4 . Th e c o n f i g u r a t i o n o f r e s t r i c t i o n s i t e e n d s
( V r e p r e s e n t s Hi n d III; * r e p r e s e n t s E c o R I) w a s s u c h t h a t o n l y c o r r e c t j o i n i n g o f t h e t w o h a l v e s o f t h e B g e n e w o u l d l e a d t o v i a b l e p l a s m i d s .
To s c r e e n f o r t h e p r e s e n c e o f t h e l a c f r a g m e n t , w e p l a t e d t h e t r a n s f o r m e d c u l t u r e o n g l u c o s e m i n i m a l p l a t e s ( 1 0 ) c o n t a i n i n g 4 0 Mg o f 5 - b r o m o -
4 - c h l o r o - 3 - i n d o y l - , - g a l a c t o s i d e ( X - g a l ) a n d 2 0 Mg o f a m p i c i l l i n p e r m l . P l a s m i d s w e r e p r e p a r e d f r o m , B - g a l a c t o s i d a s e c o n s t i t u t i v e ( b l u e ) c o l o n i e s .
B e c a u s e t h e X p l a c 5 l a c o p e r o n f r a g m e n t c o n t a i n s a n a s y m m e t r i c a l Hi n d III s i t e ( 1 4 ) , t h e o r i e n t a t i o n o f t h a t f r a g m e n t i n t h e r e s u l t i n g p l a s m i d s
c a n b e d e t e r m i n e d . P l a s m i d s a m p l e s o f 1 , g w e r e d i g e s t e d w i t h Hi n d III a n d s i z e d o n 0 . 7 % a g a r o s e g e l s . P l a s m i d s ( 1 5 - , u g s a m p l e s ) h a v i n g t h e
d e s i r e d o r i e n t a t i o n o f t h e l a c f r a g m e n t w e r e t h e n t r e a t e d w i t h E c o R I, Hi n d III, a n d B a m HI, a n d s i z e d o n a 1 0 % a c r y l a m i d e g e l t o v e r i f y t h e
p r e s e n c e o f b o t h t h e B H a n d B B f r a g m e n t s . Th e d i a g r a m o f p IB 1 ( 7 . 1 m e g a d a l t o n s ) i s n o t d r a w n t o s c a l e . To c o n s t r u c t t h e l a c - i n s u l i n A p l a s m i d
( p IA 1 , n o t s h o w n ) , w e l i g a t e d 1
g g
o f E c o R I- t r e a t e d p A 1 1 ( p B R 3 2 2 c o n t a i n i n g t h e A g e n e ) a n d 3 Mg o f E c o R I- t r e a t e d X p l a c 5 f o r 4 h r a t 4 C .
Tr a n s f o r m a n t s o f E . c o l i 2 9 4 w e r e s e l e c t e d f o r r e s i s t a n c e t o a m p i c i l l i n o n X - g a l p l a t e s . O r i e n t a t i o n o f t h e l a c f r a g m e n t w a s d e t e r m i n e d b y d i g e s t i n g
p l a s m i d s p u r i f i e d f r o m t h e b l u e c o l o n i e s w i t h Hi n d III a n d B a m HI.
B i o c h e m i s t r y :
G o e d d e l e t a l .
1 0 8 B i o c h e m i s t r y : G o e d d e l e t a l .
A B C D E F
* . . . .
F IG . 2 . S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e / p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o -
r e s i s o f e x t r a c t s o f s t r a i n 2 9 4 / p IA l . S a m p l e s w e r e h e a t e d i n O ' F a r r e l l
s a m p l e b u f f e r a n d e l e c t r o p h o r e s e d i n a s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e / 1 0 %
g e l a s d e s c r i b e d ( 1 5 ) . L a n e s A , B , a n d C : t o t a l c e l l s ; 2 0 , 1 0 , a n d 5 l ,
r e s p e c t i v e l y . L a n e s D, E , a n d F : i n s o l u b l e c e l l d e b r i s ; 2 0 , 1 0 , a n d 5
IA ,
r e s p e c t i v e l y .
0 . 0 1 M, t h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s
u s e d f o r f u r t h e r p u r i f i c a t i o n ( s e e R e s u l t s a n d Di s c u s s i o n ) .
R E S UL TS A N D DIS C US S IO N
A s s e m b l y a n d C l o n i n g o f B - C h a i n G e n e a n d A - C h a i n
G e n e . Th e g e n e f o r t h e B c h a i n o f i n s u l i n w a s d e s i g n e d t o h a v e
a n E c o R I r e s t r i c t i o n s i t e o n t h e l e f t e n d , a Hi n d III s i t e i n t h e
m i d d l e , a n d a B a m HI s i t e a t t h e r i g h t e n d . Th i s w a s d o n e s o t h a t
b o t h h a l v e s , t h e l e f t E c o R I- Hi n d l I h a l f ( B H) a n d t h e r i g h t
Hi n d III- B a m HI h a l f ( B B ) , c o u l d b e s e p a r a t e l y c l o n e d i n t h e
c o n v e n i e n t c l o n i n g v e h i c l e p B R 3 2 2 ( 8 ) a n d , a f t e r t h e i r s e -
q u e n c e s h a d b e e n v e r i f i e d , j o i n e d t o g i v e t h e c o m p l e t e B g e n e
( F i g . 1 ) . Th e B B h a l f w a s a s s e m b l e d b y l i g a t i o n f r o m 1 0 o l i g o -
d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s , l a b e l e d B l - B 1 0 i n f i g u r e 1 o f r e f . 4 ,
m a d e b y p h o s p h o t r i e s t e r c h e m i c a l s y n t h e s i s . B i a n d B 1 0 w e r e
n o t p h o s p h o r y l a t e d , t h e r e b y e l i m i n a t i n g u n w a n t e d p o l y m e r -
i z a t i o n o f t h e s e f r a g m e n t s t h r o u g h t h e i r c o h e s i v e e n d s ( Hi n d III
a n d B a m HI) . A f t e r p u r i f i c a t i o n b y p r e p a r a t i v e a c r y l a m i d e g e l
e l e c t r o p h o r e s i s a n d e l u t i o n o f t h e l a r g e s t DN A b a n d , t h e B B
f r a g m e n t w a s i n s e r t e d i n t o p l a s m i d p B R 3 2 2 t h a t h a d b e e n
c l e a v e d w i t h Hi n d Il I a n d B a m HI. A b o u t 5 0 % o f t h e a m p i c i l -
l i n - r e s i s t a n t c o l o n i e s d e r i v e d f r o m t h e DN A w e r e s e n s i t i v e t o
t e t r a c y l i n e , i n d i c a t i n g t h a t a n o n p l a s m i d Hi n d III- B a m HI
f r a g m e n t h a d b e e n i n s e r t e d . Th e s e q u e n c e s o f t h e s m a l l Hi n -
d III- B a m HI f r a g m e n t s f r o m f o u r o f t h e s e c o l o n i e s ( p B B 1 0 1
t o p B B 1 0 4 ) w e r e d e t e r m i n e d ( 1 1 ) a n d w e r e c o r r e c t a s d e -
s i g n e d .
Th e B H f r a g m e n t w a s p r e p a r e d i n a s i m i l a r m a n n e r a n d
i n s e r t e d i n t o p B R 3 2 2 t h a t h a d b e e n c l e a v e d w i t h E c o R I a n d
Hi n d III r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s . P l a s m i d s f r o m t h r e e a m -
p i c i l l i n - r e s i s t a n t , t e t r a c y c l i n e - s e n s i t i v e t r a n s f o r m a n t s ( p B H1
t o p B H3 ) w e r e a n a l y z e d . Th e s m a l l E c o R I- Hi n d III f r a g m e n t s
h a d t h e e x p e c t e d n u c l e o t i d e s e q u e n c e .
Th e A - c h a i n g e n e w a s a s s e m b l e d i n t h r e e p a r t s . Th e l e f t f o u r ,
m i d d l e f o u r , a n d r i g h t f o u r o l i g o n u c l e o t i d e s ( s e e f i g u r e 1 o f r e f .
4 ) w e r e l i g a t e d s e p a r a t e l y , t h e n m i x e d a n d l i g a t e d ( o l i g o n u -
c l e o t i d e s A l a n d A 1 2 w e r e u n p h o s p h o r y l a t e d ) . Th e a s s e m b l e d
A - c h a i n g e n e w a s p h o s p h o r y l a t e d , p u r i f i e d b y g e l e l e c t r o -
p h o r e s i s , a n d c l o n e d i n p B R 3 2 2 a t t h e E c o R I- B a m HI s i t e s . Th e
6 8
1 / d i l u t i o n X 1 0 4
4 0
F IG . 3 . R e c o n s t i t u t i o n r a d i o i m m u n o a s s a y f o r i n s u l i n c h a i n s . Th e
S - s u l f o n a t e d A s a m p l e w a s m i x e d w i t h t h e S - s u l f o n a t e d B s a m p l e
i n a 1 . 5 - m l c o n i c a l p o l y p r o p y l e n e t u b e a n d d r i e d u n d e r r e d u c e d
p r e s s u r e . Th e d r i e d p r o t e i n s w e r e s u s p e n d e d i n 2 5
1 d
o f 1 0 m M s o d i u m
a c e t a t e ( p H 4 . 5 ) . Tw o m i c r o l i t e r s o f 1 0 % ( v o l / v o l ) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l
w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s h e a t e d ( t 9 5 0 C ) f o r 1 0 m i n . Th e
m e r c a p t o e t h a n o l w a s r e m o v e d b y e t h y l a c e t a t e e x t r a c t i o n . Tw o m i -
c r o l i t e r s o f 0 . 1 M g l y c i n e b u f f e r ( p H 1 0 . 6 ) w a s a d d e d , a n d t h e p H w a s
a d j u s t e d , i f n e c e s s a r y , t o 9 . 6 - 1 0 . 6 . Th e o p e n t u b e w a s p l a c e d i n a
d e s s i c a t o r o v e r m o i s t h y a m i n e h y d r o x i d e a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 6
h r . A d i l u t e d a l i q u o t o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a s s a y e d f o r i n s u l i n
r a d i o i m m u n e a c t i v i t y b y u s e o f a c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e r a d i o i m -
m u n o a s s a y k i t ( P h a d e b u s In s u l i n Te s t , P h a r m a c i a ) . Di l u t i o n a n d
a s s a y w e r e d o n e a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n s s u p p l i e d . Th e o r d i n a t e
B / B o i s t h e c p m i n t h e p e l l e t o f t h e e x p e r i m e n t a l s a m p l e d i v i d e d b y
t h e c p m i n t h e p e l l e t o b t a i n e d w i t h b u f f e r o n l y . * , 4 0 Mu g o f p o r c i n e
A ( S S O 3 - ) i n 1 0 m M N H4 HC O 3 ( p H 9 ) w a s m i x e d w i t h 1 0 Mg o f b o v i n e
B ( S S 0 3 - ) i n t h e s a m e b u f f e r ; 0 , p o r c i n e A ( S S O 3 - ) o n l y ; 0 , b o v i n e
B ( S S 0 3 - ) o n l y ; A , 1 0 0 s g o f p o r c i n e A ( S S O 3 - ) a n d 9 3 Mg o f E . c o l i
B - c h a i n f r a c t i o n F - 1 0 ( c l e a v e d b y C N B r a n d S - s u l f o n a t e d , i n s o l u b l e
a t p H 5 ) ; X , f r a c t i o n F - 1 0 o n l y ; a , 1 0 0 Mg o f p o r c i n e A ( S S O 3 - ) , 9 3 Mu g
o f f r a c t i o n F - 1 0 , a n d 3 , u g o f b o v i n e B ( S S O 3 - ) .
E c o R I- B a m HI f r a g m e n t s f r o m t w o a m p i c i l l i n - r e s i s t a n t , t e t -
r a c y c l i n e - s e n s i t i v e c l o n e s ( p A 1 0 a n d p A l l ) c o n t a i n e d t h e d e -
s i r e d A - g e n e s e q u e n c e .
C o n s t r u c t i o n o f P l a s m i d s f o r E x p r e s s i o n o f A a n d B In s u l i n
G e n e s . F i g . 1 i l l u s t r a t e s t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e l a c - i n s u l i n B
p l a s m i d ( p IB l ) . P l a s m i d s p B H1 a n d p B B 1 0 1 w e r e d i g e s t e d w i t h
E c o R I a n d Hi n d III e n d o n u c l e a s e s . Th e s m a l l B H f r a g m e n t o f
p B H1 a n d t h e l a r g e f r a g m e n t o f p B B 1 0 1 ( c o n t a i n i n g t h e B B
f r a g m e n t a n d m o s t o f p B R S 2 2 ) w e r e p u r i f i e d b y g e l e l e c t r o -
p h o r e s i s , m i x e d , a n d l i g a t e d i n t h e p r e s e n c e o f E c o R I- c l e a v e d
X p l a c 5 . Th e 4 . 4 - m e g a d a l t o n E c o R I f r a g m e n t o f X p l a c 5 c o n -
t a i n s t h e l a c c o n t r o l r e g i o n a n d t h e m a j o r i t y o f t h e j 3 - g a l a c t o -
s i d a s e s t r u c t u r a l g e n e ( 1 , 1 4 ) . Th e c o n f i g u r a t i o n o f t h e r e s t r i c -
t i o n s i t e s e n s u r e s c o r r e c t j o i n i n g o f B H t o B B . Th e l a c E c o R I
f r a g m e n t c a n b e i n s e r t e d i n t w o o r i e n t a t i o n s ; t h u s , o n l y h a l f o f
t h e c l o n e s o b t a i n e d a f t e r t r a n s f o r m a t i o n s h o u l d h a v e t h e d e s i r e d
o r i e n t a t i o n . Th e o r i e n t a t i o n o f 1 0 a m p i c i l l i n - r e s i s t a n t , f , - g a -
l a c t o s i d a s e - c o n s t i t u t i v e c l o n e s w e r e c h e c k e d b y r e s t r i c t i o n
a n a l y s i s ( s e e l e g e n d o f F i g . 1 ) . F i v e o f t h e s e c o l o n i e s c o n t a i n e d
t h e e n t i r e B - g e n e s e q u e n c e a n d t h e c o r r e c t r e a d i n g f r a m e f r o m
t h e , B - g a l a c t o s i d a s e g e n e i n t o t h e B - c h a i n g e n e . O n e , p IB l , w a s
c h o s e n f o r s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s .
In a s i m i l a r e x p e r i m e n t , t h e 4 . 4 - m e g a d a l t o n l a c f r a g m e n t
f r o m X p k z c 5 w a s i n t r o d u c e d i n t o t h e p A l l p l a s m i d a t t h e E c o R I
s i t e t o g i v e p IA L . p IA 1 i s i d e n t i c a l t o p IB l e x c e p t t h a t t h e A -
g e n e f r a g m e n t i s s u b s t i t u t e d f o r t h e B - g e n e f r a g m e n t . DN A
s e q u e n c e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e c o r r e c t A - a n d B - c h a i n g e n e
s e q u e n c e s w e r e r e t a i n e d i n p IA l a n d p IB l , r e s p e c t i v e l y .
P r o c . N a t i . A c a d . S c i . US A 7 6
( 1 9 7 9 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 6 ( 1 9 7 9 ) 1 0 9
0 1 - C l i
2 1 :
0 )
2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 1 2 4
V
2
C O
f J
0 0
0
2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
F r a c t i o n
F IG . 4 . DE A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y o f a n e x t r a c t o f s t r a i n
D1 2 1 0 / p IB 1 . Th e f r a c t i o n t h a t w a s i n s o l u b l e a t p H 5 ( 5 8 0 m g o f
p r o t e i n ) w a s d i s s o l v e d i n 2 0 m l o f 1 0 m M N H4 HC O 3 a n d a d j u s t e d t o
p H 9 . 3 5 S - L a b e l e d b o v i n e B ( S S O 3 1 ( 1 3 5 , 0 0 0 c p m ; 4 . 4 , g ) w a s a d d e d
a n d t h e s a m p l e w a s a p p l i e d t o a 2 X 6 0 c m c o l u m n o f W h a t m a n DE 5 2 .
E l u t i o n w a s w i t h a 1 - l i t e r g r a d i e n t o f 0 . 0 1 - 2 . 0 M N H4 HC O 3 ( p H 9 ) .
F r a c t i o n s o f 4 m l w e r e c o l l e c t e d . 0 , A 2 8 0 ; 0 , 1 0 0 - , u l a l i q u o t s w e r e u s e d
t o m e a s u r e r a d i o a c t i v i t y o f 3 5 S - l a b e l e d b o v i n e B ( S S O 3 ) ; A , 1 0 0 - Ml
a l i q u o t s w e r e a s s a y e d f o r B - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y b y b e i n g
m i x e d w i t h
1 0 0 , u g
o f p o r c i n e A ( S S O 3 - ) a n d u s i n g t h e r e c o n s t i t u t i o n
a s s a y ( F i g . 3 ) .
E x p r e s s i o n . Th e s t r a i n s t h a t c o n t a i n t h e i n s u l i n g e n e s c o r -
r e c t l y a t t a c h e d t o
f 3 - g a l a c t o s i d a s e
( D1 2 1 0 / p IB l a n d 2 9 4 / p IA l )
b o t h p r o d u c e l a r g e q u a n t i t i e s o f a p r o t e i n t h e s i z e o f , B - g a l a c -
t o s i d a s e ( F i g . 2 ) . A p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f t h e t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n
w a s t h i s , B - g a l a c t o s i d a s e - i n s u l i n A o r B c h a i n h y b r i d . Th e h y b r i d
p r o t e i n s a r e i n s o l u b l e a n d w e r e f o u n d i n t h e f i r s t l o w - s p e e d
p e l l e t i n w h i c h t h e y c o n s t i t u t e z 5 0 % o f t h e p r o t e i n ( F i g . 2 ) .
To d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n s u l i n A a n d B c h a i n s , w e
Ta b l e 1 . A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f E . c o l i i n s u l i n A c h a i n
A m i n o R e s i d u e s p e r p e p t i d e
a c i d E . c o l i A ( S S O 3 1 P o r c i n e A ( S S O 3 - ) P r e d i c t e d
Hi s 0 . 0 8 0 . 0 8 0
L y s 0 . 0 0 0 . 0 0 0
Tr p 0 . 0 0 0 . 0 0 0
A r g 0 . 0 0 0 . 0 0 0
P h e 0 . 0 0 0 . 0 0 0
A s x 2 . 3 8 2 . 5 0 2
Th r 0 . 2 4 0 . 2 8 1
S e r 0 . 1 4 0 . 2 3 2
H- S e r 0 . 0 2 0 . 0 0 0
G l x 3 . 9 7 4 . 5 8 4
P r o 0 . 0 0 0 . 0 9 0
G l y 1 . 4 0 1 . 4 8 1
A l a 0 . 2 0 0 . 1 1 0
C y s 0 . 5 5 0 . 0 0 0
V a l 1 . 1 5 1 . 0 6 1
Me t 0 . 6 2 0 . 4 3 0
Il e 1 . 9 9 1 . 4 8 2
L e u 2 . 3 3 2 . 3 5 2
Ty r 1 . 8 9 2 . 3 0 2
A p p r o x i m a t e l y 2 5 , A g o f p o r c i n e A ( S S 0 3 - ) ( w h i c h i s i d e n t i c a l i n
s e q u e n c e t o h u m a n A ) a n d 2 5
A g o f E . c o l i A ( S S 0 3 - ) p u r i f i e d t w i c e
b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w e r e h y d r o l y z e d a n d
a n a l y z e d i n p a r a l l e l . Th e S S 0 3 - d e r i v a t i v e s o f c y s t e i n e w e r e d e s t r o y e d
d u r i n g h y d r o l y s i s a n d d o n o t r e g i s t e r a s a m i n o a c i d s w i t h t h e p r o g r a m
u s e d . S e r i n e a n d t h r e o n i n e w e r e a l s o p a r t i a l l y d e s t r o y e d .
0
x
e ~ o
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C O
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7 0
C A
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0
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- 1
6 G .
0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8
Ti m e , m i n
F IG . 5 . R e v e r s e d - p h a s e h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a -
p h y . ( A ) A s a m p l e ( 5 0 0 Mg ) , p u r i f i e d b y DE A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g -
r a p h y ( B c h a i n , F i g . 4 ) , w a s s u b j e c t e d t o h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d
c h r o m a t o g r a p h y a t r o o m t e m p e r a t u r e o n a n S P 3 5 0 0 l i q u i d c h r o -
m a t o g r a p h ( S p e c t r a - P h y s i c s ) e q u i p p e d w i t h a L i C h r o q o r b R P - 8 0 . 3
X 2 5 c m c o l u m n ( Me r c k E M) . Th e e l u t i n g b u f f e r w a s 5 0 m M N H4 O A c
w i t h a n a c e t o n i t r i l e g r a d i e n t o f 2 4 - 6 0 % . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d
d r i e d , a n d s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r B - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y
b y o u r r e c o n s t i t u t i o n a s s a y . ( B ) A n A - c h a i n s a m p l e ( 5 0 0 g g t o t a l
p r o t e i n ) , p a r t i a l l y p u r i f i e d b y a m i n o e t h y l - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y ,
w a s s u b j e c t e d t o h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w i t h a n
a c e t o n i t r i l e g r a d i e n t o f 1 5 - 6 0 % . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d s a m p l e s
w e r e a s s a y e d f o r A - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y . S o l i d l i n e , A 2 8 0 ; A ,
r a d i o i m m u n e a c t i v i t y .
u s e d a r a d i o i m m u n o a s s a y b a s e d o n t h e r e c o n s t i t u t i o n o f c o m -
p l e t e i n s u l i n f r o m t h e s e p a r a t e c h a i n s . Th e i n s u l i n r e c o n s t i t u t i o n
p r o c e d u r e o f K a t s o y a n n i s e t a l . ( 3 ) , a d a p t e d t o a 2 7 - , u l a s s a y
v o l u m e , p r o v i d e d a v e r y s u i t a b l e a s s a y . E a s i l y d e t e c t a b l e i n s u l i n
r a d i o i m m u n e a c t i v i t y w a s o b t a i n e d a f t e r S - s u l f o n a t e d d e r i v -
a t i v e s o f t h e i n s u l i n c h a i n s w e r e m i x e d a n d r e c o n s t i t u t e d b y t h e
p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g . 3 . Th e s e p a r a t e S -
s u l f o n a t e d c h a i n s o f i n s u l i n d o n o t r e a c t s i g n i f i c a n t l y , a f t e r
r e d u c t i o n a n d o x i d a t i o n , w i t h t h e a n t i - i n s u l i n a n t i b o d y u s e d .
O u r r e c o n s t i t u t i o n a s s a y , t h o u g h n o t e x t r e m e l y s e n s i t i v e ( l i m i t s
o f d e t e c t i o n a b o u t 1 Mg ) , w a s s p e c i f i c a n d s u i t a b l e f o r f o l l o w i n g
i n s u l i n c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y d u r i n g p u r i f i c a t i o n .
To u s e t h e r e c o n s t i t u t i o n a s s a y , w e p a r t i a l l y p u r i f i e d t h e
, 3 - g a l a c t o s i d a s e - A o r B c h a i n h y b r i d p r o t e i n , c l e a v e d i t w i t h
c y a n o g e n b r o m i d e , f o r m e d S - s u l f o n a t e d d e r i v a t i v e s , a n d
p a r t i a l l y p u r i f i e d t h e p e p t i d e s a s d e s c r i b e d i n Ma t e r i a l s a n d
Me t h o d s . Th i s p r o c e d u r e w a s b a s e d o n o u r e a r l i e r e x p e r i e n c e
w i t h t h e p u r i f i c a t i o n o f s o m a t o s t a t i n f r o m E . c o l i ( u n p u b l i s h e d
d a t a ) a n d t h e k n o w n p r o p e r t i e s o f t h e i n s u l i n c h a i n s .
B i o c h e m i s t r y :
G o e d d e l e t a l .
1 1 0 B i o c h e m i s t r y : G o e d d e l e t a l .
Ta b l e 2 . R e c o n s t i t u t i o n o f r a d i o i m m u n e h u m a n i n s u l i n
R a d i o i m m u n e a c t i v e
" A "
s a m p l e
" B "
s a m p l e i n s u l i n , n g
E . c o l i 5 8 - HP L C * - < 0 . 5
E . c o l i DE 1 1 7 t < 0 . 5
P o r c i n e A t E . c o l i DE 1 1 7 7 4
E . c o l i 5 8 - HP L C B o v i n e B 4 5
E . c o l i 5 8 - HP L C E . c o l i DE 1 1 7 2 0
O u r s t a n d a r d r e c o n s t i t u t i o n a s s a y p r o c e d u r e w a s u s e d ( F i g . 3 ) . Th e
r e s u l t s a r e g i v e n a s n g o f r a d i o i m m u n e a c t i v e i n s u l i n p r o d u c e d p e r
2 0
A l
o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e . HP L C , h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o -
m a t o g r a p h y .
* F i v e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f f r a c t i o n 5 8 f r o m a n a m i n o e t h y l - c e l l u l o s e
c o l u m n w a s c h r o m a t o g r a p h e d o n a n R P - 8 c o l u m n a n d t h e " A " p e a k
w a s c o l l e c t e d . A s e s t i m a t e d f r o m t h e p e a k h e i g h t , t h e s a m p l e c o n -
t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 2 5
, g
o f p r o t e i n .
t Te n m i c r o l i t e r s o f DE A E - c e l l u l o s e f r a c t i o n 1 1 7 ( F i g . 4 ) , c o n c e n t r a t e d
t o 1 . 6 m g o f t o t a l p r o t e i n p e r m l , w a s u s e d a s t h e " B " s a m p l e .
S - S u l f o n a t e d p o r c i n e A ( 7 0
A g ) .
S - S u l f o n a t e d b o v i n e B ( 1 0 , Mg ) .
In s u l i n B - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d f i r s t
a m o n g t h e S - s u l f o n a t e d c y a n o g e n b r o m i d e p e p t i d e s i n s o l u b l e
a t p H 5 ( f r a c t i o n F - 1 0 , F i g . 3 ) . Th e a c t i v i t y w a s e n r i c h e d f u r -
t h e r b y c h r o m a t o g r a p h y o n DE A E - c e l l u l o s e ( F i g . 4 ) . Th e B -
c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y c o e l u t e d w i t h S - [ 3 5 S ] s u l f o n a t e d
b o v i n e B c h a i n .
A p o r t i o n o f t h e m a t e r i a l p u r i f i e d b y DE A E - c e l l u l o s e c h r o -
m a t o g r a p h y w a s a n a l y z e d b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o -
m a t o g r a p h y o n a r e v e r s e d - p h a s e R P - 8 c o l u m n ( F i g . 5 A ) . Th i s
c o l u m n s e p a r a t e s p r i m a r i l y o n t h e b a s i s o f h y d r o p h o b i c i n t e r -
a c t i o n s . Th e i n s u l i n B - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y e l u t e d a t a
p o s i t i o n v e r y c l o s e t o t h a t o f b o v i n e B c h a i n . G o o d p u r i f i c a t i o n
w a s o b t a i n e d b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , b u t
t h e b r e a d t h o f t h e p e a k i n d i c a t e d t h a t t h e c h r o m a t o g r a p h i c
f r a c t i o n w a s n o t p u r e .
A n o t h e r s a m p l e ( 1 m g t o t a l p r o t e i n ) o f t h e m a t e r i a l p u r i f i e d
b y DE A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y w a s s u b j e c t e d t o g e l f i l -
t r a t i o n o n S e p h a d e x G - 7 5 i n 5 0 % a c e t i c a c i d , a s y s t e m t h a t
c o m p l e t e l y r e s o l v e s A c h a i n f r o m B c h a i n . Th e B - c h a i n r a -
d i o i m m u n e a c t i v i t y e l u t e d a t t h e s a m e p o s i t i o n a s S - s u l f o n a t e d
b o v i n e B c h a i n , i n d i c a t i n g s i m i l a r s i z e s ( d a t a n o t s h o w n ) .
In s u l i n A - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d f i r s t i n
t h e t o t a l m i x t u r e o f c y a n o g e n b r o m i d e p e p t i d e f r a g m e n t s o b -
t a i n e d f r o m t h e p a r t i a l l y p u r i f i e d f l - g a l a c t o s i d a s e - A
c h a i n
h y b r i d . Th e a c t i v i t y w a s e n r i c h e d b y p H 5 p r e c i p i t a t i o n a n d
a m i n o e t h y l - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y a n d p u r i f i e d o n a m i -
c r o g r a m s c a l e b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y
( F i g . S B ) . Th e i n s u l i n A - c h a i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y e l u t e d
f r o m t h e c o l u m n a t a p o s i t i o n i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h a t o f
p o r c i n e S - s u l f o n a t e d A c h a i n . P o r c i n e A c h a i n i s i d e n t i c a l t o
h u m a n A c h a i n ( 2 ) .
W h e n a n e x c e s s o f p o r c i n e A ( S S O 3 - ) ( 4 0 , u g ) w a s m i x e d , r e -
d u c e d , a n d o x i d i z e d w i t h b o v i n e B ( S S O 3 - ) ( 1 0 , u g ) , w e u s u a l l y
o b t a i n e d 1 0 - 1 5 % c o r r e c t j o i n i n g t o y i e l d r a d i o i m m u n e a c t i v e
i n s u l i n . R e c o n s t i t u t i o n i n i m p u r e m i x t u r e s w a s l o w e r , a s e x -
p e c t e d . B e c a u s e o f t h i s s t r o n g a n d v a r i a b l e c o m p e t i t i v e i n h i -
b i t i o n b y o t h e r p e p t i d e s , t h e a m o u n t o f i n s u l i n c h a i n s i n t h e
e x t r a c t s c a n b e s t b e e s t i m a t e d b y a d d i n g t o t h e e x t r a c t a k n o w n
a m o u n t o f t h e c h a i n t o b e a s s a y e d . Th i s t y p e o f e x p e r i m e n t
( i l l u s t r a t e d i n F i g . 3 ) i n d i c a t e s t h a t t h e y i e l d o f i n s u l i n c h a i n s
i s h i g h ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 m g f r o m 2 4 g w e t w e i g h t o f c e l l s ) a n d
c o n s i s t e n t w i t h t h e a m o u n t o f i n s o l u b l e 3 - g a l a c t o s i d a s e p r o t e i n
o b t a i n e d ( a t l e a s t 1 0 5 m o l e c u l e s p e r c e l l ) . Th i s e s t i m a t e d y i e l d
i s 1 0 t i m e s h i g h e r t h a n t h a t r e p o r t e d f o r s o m a t o s t a t i n ( 1 ) .
Th e e v i d e n c e t h a t w e h a v e o b t a i n e d c o r r e c t e x p r e s s i o n f r o m
c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d g e n e s f o r h u m a n i n s u l i n c a n b e s u m -
m a r i z e d a s f o l l o w s . ( i ) R a d i o i m m u n e a c t i v i t y h a s b e e n d e t e c t e d
f o r b o t h c h a i n s . ( i i ) Th e DN A s e q u e n c e s o b t a i n e d a f t e r c l o n i n g
a n d p l a s m i d c o n s t r u c t i o n h a v e b e e n d i r e c t l y v e r i f i e d t o b e
c o r r e c t a s d e s i g n e d . B e c a u s e r a d i o i m m u n e a c t i v i t y i s o b t a i n e d ,
t r a n s l a t i o n m u s t b e i n p h a s e . Th e r e f o r e , t h e g e n e t i c c o d e d i c -
t a t e s t h a t p e p t i d e s w i t h t h e s e q u e n c e s o f h u m a n i n s u l i n a r e
b e i n g p r o d u c e d . ( i i i ) Th e E . c o l i p r o d u c t s , a f t e r c y a n o g e n
b r o m i d e c l e a v a g e , b e h a v e a s i n s u l i n c h a i n s i n t h r e e d i f f e r e n t
c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m s t h a t s e p a r a t e o n d i f f e r e n t p r i n c i p l e s
( g e l f i l t r a t i o n , i o n e x c h a n g e , a n d r e v e r s e d - p h a s e h i g h - p e r f o r -
m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) . ( i v ) Th e A c h a i n p r o d u c e d b y
E . c o l i h a s b e e n p u r i f i e d o n a s m a l l s c a l e b y h i g h - p e r f o r m a n c e
l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a n d h a s t h e c o r r e c t a m i n o a c i d c o m -
p o s i t i o n ( Ta b l e 1 ) .
Ta b l e 2 i l l u s t r a t e s t h a t i n s u l i n r a d i o i m m u n e a c t i v i t y c a n b e
o b t a i n e d e n t i r e l y f r o m E . c o l i p r o d u c t s . E a s i l y d e t e c t a b l e r a -
d i o i m m u n e i n s u l i n a c t i v i t y i s p r o d u c e d w h e n p u r i f i e d E . c o l i
A c h a i n i s m i x e d a n d r e c o n s t i t u t e d w i t h p a r t i a l l y p u r i f i e d
( t 1 0 % p u r e ) E . c o l i B c h a i n .
W e g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f
L o u i s e S h i v e l y , R o c h e l l e S a i l o r , F r a n c e s F i e l d s , a n d Ma r k B a c k e r . W e
g i v e s p e c i a l t h a n k s t o He r b e r t W . B o y e r f o r h i s e n c o u r a g e m e n t a n d
s c i e n t i f i c c o n s u l t a t i o n a n d t o R o b e r t A . S w a n s o n f o r m a k i n g t h i s w o r k
p o s s i b l e . W o r k a t t h e C i t y o f Ho p e w a s s u p p o r t e d b y c o n t r a c t s f r o m
G e n e n t e c h , In c .
1 . It a k u r a , K . , Hi r o s e , T. , C r e a , R . , R i g g s , A . D. , He y n e k e r , H. L . ,
B o l i v a r , F . & B o y e r , H. W . ( 1 9 7 7 ) S c i e n c e 1 9 8 , 1 0 5 6 - 1 0 6 3 .
2 . Hu m b e l , R . E . , B o s s h a r d , H. R . & Z a h n , H. ( 1 9 7 2 ) i n Ha n d b o o k
o f P h y s i o l o g y , e d s . S t e i n e r , D. F . & F r e i n k e l , N . ( W i l l i a m s &
W i l k i n s , B a l t i m o r e , MD) , V o l . 1 , p p . 1 1 1 - 1 3 2 .
3 . K a t s o y a n n i s , P . G . , Tr a k a t e l l i s , A . C . , J o h n s o n , S . , Z a l u t , C . &
S c h w a r t z , G . ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m i s t r y 6 , 2 6 4 2 - 2 6 5 5 .
4 . C r e a , R . , Hi r o s e , T. , K r a s z e w s k i , A . & It a k u r a , K . ( 1 9 7 8 ) P r o c .
N a t l . A c a d . S c i . US A 7 5 , 5 7 6 5 - 5 7 6 9 .
5 . B a c k m a n , K . , P t a s h n e , M. & G i l b e r t , W . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t i . A c a d .
S c i . US A 7 3 , 4 1 7 4 - 4 1 7 8 .
6 . P a n e t , A . , v a n d e S a n d e , J . H. , L o e w e n , P . C . , K h o r a n a , H. G . ,
R a a e , A . J . , L i l l e n h a u g , J . R . & K l e p p e , K . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m i s t r y
1 2 , 5 0 4 5 - 5 0 4 9 .
7 . G r e e n e , P . J . , B e t l a c h , M. , B o l i v a r , F . , He y n e k e r , H. L . , Ta i t , R .
& B o y e r , H. W . ( 1 9 7 8 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 , 2 3 7 3 - 2 3 8 0 .
8 . B o l i v a r , F . , R o d r i g u e z , R . L . , G r e e n e , P . J . , B e t l a c h , M. C . ,
He y n e k e r , H. L . , B o y e r , H. W . , C r o s a , J . H. & F a l k o w , S . ( 1 9 7 7 )
G e n e 2 , 9 5 - 1 1 9 .
9 . C l e w e l l , D. B . ( 1 9 7 2 ) J . B a c t e r i o l . 1 1 0 , 6 6 7 - 6 7 6 .
1 0 . Mi l l e r , J . H. ( 1 9 7 2 ) E x p e r i m e n t s i n Mo l e c u l a r G e n e t i c s ( C o l d
S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g Ha r b o r , N Y ) .
1 1 . Ma x a m , A . M. & G i l b e r t , W . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A
7 4 , 5 6 0 - 5 6 4 .
1 2 . He r s h f i e l d , V . , B o y e r , H. W . , Y a n o f s k y , C . , L o v e t t , M. A . &
He l i n s k i , D. R . ( 1 9 7 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 1 , 3 4 5 5 -
3 4 5 9 .
1 3 . K a t s o y a n n i s , P . G . , To m e t s k o , A . , Z a l u t , C . , J o h n s o n , S . & Tr a k -
a t e l l i s , A . C . ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m i s t r y 6 , 2 6 3 5 - 2 6 4 2 .
1 4 . P o l i s k y , B . , B i s h o p , R . J . & G e l f a n d , D. H. ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d .
S c i . US A 7 3 , 3 9 0 0 - 3 9 0 4 .
1 5 . O ' F a r r e l l , P . H. ( 1 9 7 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 0 , 4 0 0 7 - 4 0 2 1 .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 6
( 1 9 7 9 )