Item to check Importance

Definition of experimental and control groups E

Number within each group E
Assay carried out by the core or investigators laboratory? D
Acknowledgment of authors contributions D
Description E
Volume/mass of sample processed D
Microdissection or macrodissection E
Processing procedure E
If frozen, how and how quickly? E
If fixed, with what and how quickly? E
Sample storage conditions and duration E
Procedure and/or instrumentation E
EXPERIMENTAL DESIGN
SAMPLES
NUCLEI ACID EXTRACTION
Name of kit and details of any modifications E
Source of additional reagents used D
Details of DNase or RNase treatment E
Contamination assessment (DNA or RNA) E
Nucleic acid quantification E
Instrument and method E
Purity (A260/A280) D
Yield D
RNA integrity: method/instrument E
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts E
Electrophoresis traces D
Inhibition testing (Cq dilutions, spike, or other) E
Complete reaction conditions E
Amount of RNA and reaction volume E
Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration E
Reverse transcriptase and concentration E
REVERSE TRANSCRIPTION
Temperature and time E
Manufacturer of reagents and catalogue numbers D
Cqs with and without reverse transcription D
Storage conditions of cDNA D
Gene symbol E
Sequence accession number E
Location of amplicon D
Amplicon length E
In silico specificity screen (BLAST, etc) E
Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs? D
Sequence alignment D
Secondary structure analysis of amplicon D
Location of each primer by exon or intron (if applicable) E
What splice variants are targeted? E
Primer sequences E
RTPrimerDB Identification Number D
Probe sequences D
Location and identity of any modifications E
Manufacturer of oligonucleotides D
Purification method D
Complete reaction conditions E
qPCR TARGET INFORMATION
qPCR OLIGONUCLEOTIDES
qPCR PROTOCOL
Reaction volume and amount of cDNA/DNA E
Primer, (probe), Mg2, and dNTP concentrations E
Polymerase identity and concentration E
Buffer/kit identity and manufacturer E
Exact chemical composition of the buffer D
Additives (SYBR Green I, DMSO, and so forth) E
Manufacturer of plates/tubes and catalog number D
Complete thermocycling parameters E
Reaction setup (manual/robotic) D
Manufacturer of qPCR instrument E
Evidence of optimization (from gradients) D
Specificity (gel, sequence, melt, or digest) E
For SYBR Green I, Cq of the NTC E
Calibration curves with slope and y intercept E
PCR efficiency calculated from slope E
CIs for PCR efficiency or SE D
r2 of calibration curve E
qPCR VALIDATION
Linear dynamic range E
Cq variation at LOD E
CIs throughout range D
Evidence for LOD E
If multiplex, efficiency and LOD of each assay E
qPCR analysis program (source, version) E
Method of Cq determination E
Outlier identification and disposition E
Results for NTCs E
Justification of number and choice of reference genes E
Description of normalization method E
Number and concordance of biological replicates D
Number and stage (RT or qPCR) of technical replicates E
Repeatability (intraassay variation) E
Reproducibility (interassay variation, CV) D
Power analysis D
Statistical methods for results significance E
Software (source, version) E
Cq or raw data submission with RDML D
DATA ANALYSIS
Grupo Experimental: Mandarinas Murcott heridas y curadas, almacenadas a distintos tiempos. Grupo
Control: Mandarinas Murcott heridas y no curadas, almacenadas a distintos tiempos.
n = 5
El ensayo va a ser realizado completamente en nuestro laboratorio
Muestras Experimentales: Luego de que los frutos son cosechados, se esteriliza la zona del
flavedo que va a ser herida con un bistur. Luego los frutos son expuestos a 37 C y 90% de
humedad relativa durante 24 hs, seguida de una incubacin a 20 C durante 24 hs (Tratamiento de
curado). Finalmente se almacena a distintos tiempos ( 0 das, 7 das, 30 das). Muestras control:
Heridas, sin curado y almacendas a distintos tiempos ( 0 das, 7 das, 30 das).
100 mg
macrodiseccin
El flavedo y albedo son separados de los sacos de jugo. stos ltimo se seccionan en cuartos.
El flavedo junto al albedo y los sacos de jugo son almacenado a -80C imediatamente despus
salir de los disitntos tiempos de almacenamiento.
no son fijadas
Las muestras fueron guardadas a -80C un ao antes de hacer la extraccin de RNA
Se homogenizaran 100 mg de flavedo con N2. Agrega una punta de esptula de PEG 15000 para
capturar compuestos fenlico y otros productos oxidados. Agregar 1 ml de TRIzol. Incubar 5 min a
T.A . Transferir a eppendorf estril y agregar 250 l de Cloroformo ( MERCK), mezclar
vigorosamente 15 seg. Incubar 3 min a T.A, centrigugar a 12000 g durante 15 min a 4C. Tomar
la fase acuosa y repetir. el paso anterior. Tranferir fase acuosa a un eppenorf estril y agregar 500
l isopropanol agitar por inversion. Inubar a T.A durante 10 minutos. Centrifugar a 9200 g durante
10 min a 4 C. Descartar sobrenadante y lavar el precipitado con 1 ml de etanol al 75 %. vortexear
y centrigugar a 4000 g durante 5 min a 4 C. Descatar sobrenadante y secar el pellet a T.A durante
10 min. Resuspender con 40 l de agua tratada con DEPC. Incubar 10 min en bao a 55C-60C.
EXPERIMENTAL DESIGN
SAMPLES
NUCLEI ACID EXTRACTION
TRIzol (Invitrogen)
Cloroformo (Merk), Isopropanol (Merk), Etanol (Merk), y agua miliQ.
Se incubar 2 g RNA con 1l de Buffer de reaccion 10X (Promega) , 2 U de la DNAsa (
Promega) y agua DEPC hasta completar 10 l de volmen final. Incubar 30 min a 37C. Luego
gregar 1 l de RQ1 STOP Solution ( Promega) e inubar a 65 c durante 10 min.
Control de la transcripcin reversa (sin enzima) para asegurar la ausencia de DNA en la muestras
de RNA. Para esto, RNA fue procesado como una muestra normal para RT excepto que no se le
agrego la MMVL ( Promega)
La concetracion de RNA ser determinada midiendo absorbancia a 260 nm. Si la concentracin
obtenida es superior a 400 ng/ l diluir hasta aprox. 200 ng/ l y medir nuevamente.
UNICAM
Se determinara la pureza de RNA midiendo a relacin de absorvancia A260/280 ( se espera que no
sea menor a 1,8) y medir A260/230( se espera que obtener valores entre 1,8 y 2)
La integridad de las muestras de ARN sern chequearon mediante la corrida en geles de agarosa
al 1,5% preparada en 500 l TAE 1 X y 8 l de EtBr. Se mezcla 2 g ( el vol no debe ser inferior a
5 l) de finales RNA con 3 l de loading buffer. Las corridas electroforeticas sern realizadas en
el amortiguador TAE mencionado previamente, a una intensidad de corriente constante de 100 V
durante 15 min. cuantificar por densitometra ndice 28S/18S ( se esprera valores cercanos a 2)
No corresponde
Se considerar curvas estandar tanto para los genes de referencia como para los de inters.
Cada muestra de RNA sern tratadas con DNAsa, incubas con 1 g de oligo (dt)15 ( Biodynamics)
en un volumen final de 20 l, 5 min a 70C. Enfriar rpidamente en hielo y dar un spin. Anadir
Buffer 5X ( Promega); dNTPS a una concentracion final de 50 mM, 25 U RNAsin (inhibidor de la
ARNasa(Promega), 200 Ude M-MLV (Promega), agua hasta completar volune final de 25 l.
Incubar a 42 C durante 1 hora, Incuabar luego a 70C durante 5 min para inhibir la M-MLV.
Almacenar las muestras a -20C.
2 g de ARN. Volumen final de reaccin: 20 l.
Olig dT de 2 g/ul
5 U/ul de M-MLV (Promega)
REVERSE TRANSCRIPTION
1 hora a 42C y 5 min a 70C
M1701
(- 20 C)
Ver tabla
Ver tabla
Ver Tabla
Se har por Blast
Ver Tabla
no corresponde
La reaccin de PCR se llavar a cabo en un termociclador Mini opticon Real- Time PCR detetion
system con CFX manager sofware (Bio-Rad). Usando como SYBER-GREEN ( Invitrogen) en un
volumen final de 20 l. El mix de la reaccin est formado por buffer de amplificacion 1X (
Invitrogen) , 3 mM de MgCl2,0,2 mM de dNTPs, 0,5 X SYBER GREEN , 1 M de cada cebador, y
0,5 U de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen), 5 l de una dilucin 1/5 ADNc. los parmetro
de ciclado son : desnaturalizacin inicial a 94C durante 3 min; 40 ciclos de 95 C durnate 15 seg.,
58C durante 15 seg, y 72 C durante 20 seg. y un ciclo de 72 C durante 7 min.
qPCR TARGET INFORMATION
qPCR OLIGONUCLEOTIDES
qPCR PROTOCOL
Volumen de reaccin: 20 L. Cantidad de cDNA: 5 L de dilucin 1/5
3 mM de MgCl2,0,2 mM dNTPs, 1 M de cada cebador.
0,5 U de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen)
Platinum Taq ADN polimerasa 10 X buffer.
Ver las condiciones de los fabricantes
SYBER Green ( Invitrogen)
Especificado previamente.
Manual
Mini opticon Real- Time PCR detetion system con CFX manager sofware (Bio-Rad)
Para chequear la especificidad de la reaccin se realizar curva de melting y geles de agarosa y
se observar si hay amplificacin de un solo producto por par primer o si tambin si ve
amplificacin de dmeros de primers
Se puede observar contaminacion o por dmeros de cebadores. stos de diferencian entre s
observando la curva de melting. La contaminacin es aceptable cuando existe una diferencia de la
menso 8 ciclos respecto al Cq del Goi en las muestras y cuando el blanco amplifica entre los
ciclos 35 a40.
Se espera obtener una eficiencia de 1,8-2
aprox 1
qPCR VALIDATION
Se construir una curva de calibracin realizando diluciones seriadasdesde una dilucin 1/2 desde
una 1/40 hasta 1/360 del cDNA.
En caso de que nos interese determinar el LOD Se construir una curva de calibracin realizando
diluciones seriadasdesde una dilucin 1/2 desde una 1/40 hasta 1/360 del cDNA.
No corresponde
Se espera que todas las medidas estn comprendidas en el rango de linealidad ensayado. De lo
contrario de determinar el LOD.
No corresponde
El analisis se har en una hoja de calculo de Excel. Los valores de RQ sern calculados usando el
promedio de los Cq de todas las muestras del estudio. La normalizacion se llevar a cabo usando
ambos genes de referencia, para ello se determino el CV (menor al 25%), y el parametro M
(menor a 0,5)
Los Cq fueron determinados por el software del equipo CFX manager (Bio-Rad)
Los datos sern analizados con Sigma Stat
Se espera no observar amplificacin.
Valores del CV, y M confirmarn si se puede utilizar los genes de referencia elegidos
Se usar el mtodo de la eficiencia corregida, y para normalizar y se utilizar un factor de
normalizacion que tiene en cuenta ambos genes de referencia
5 repeticiones biologicas, para cada grupo
Se realizaron duplicados de replicas tcnicas
La desviacin standard esperda entre replicas debe ser menor a 0.3
Logaritmo de los NRQ entre los grupos usando una t-Student(p=0,05)
SigmaStat
DATA ANALYSIS
No curado Curado
0 das (PAR I) 10 frutos 10 frutos
7das (PAR II) 10 frutos 10 frutos
30 das (PARIII) 10 frutos 10 frutos
Tratamiento
Tiempo de Almacenamiento
Foward PK.2 5-ATTCAGTCgTggCTCTTCAC-3 20nt; Tm=54.6C; %GC=50
Reverse PK.2 5-TCTCCgggggAAAATATAAg-3 20nt; Tm=51.1C; %GC=45
pdto: 194pb
Tabla de oligos de gen target
Foward PK.3 5-gCAgCTgAgACTACCAATgC-3 20nt; Tm=56.0C; %GC=55
Reverse PK.3 5-CAgCggTTCTAATCTTCgAg-3 20nt; Tm=52.8C; %GC=50
pdto: 164pb
Foward PEPCK.2 5-CTTTTggAggCAAgCTACAC-3 20nt; Tm=54.1C;%GC=50
Reverse PEPCK.2 5-TCACAAAgCCCTCAAAATTC-3 20nt; Tm=51.3C;%GC=40
pdto: 178pb
Foward EM.2 5-TACAgCCCTgCTTATCgAAC-3 20nt; Tm=54.2C; %GC=50
Reverse EM.2 5-ATgCTgATTCTTACCCACCA-3 20nt; Tm=53.4C; %GC=45
pdto: 195pb
Foward PDC.2 5-TgATggACCgTACAATgTg-3 19nt; Tm=52.0C; %GC=47.4
Reverse PDC.2 5-TTCAAAAggTTCTTgCTTgg-3 20nt; Tm=51.5C; %GC=40
pdto: 208pb
Foward ADH.2 5-ATgCCATgATTTCAgCTTTC-3 20nt; Tm=51.4C; %GC=40
Reverse ADH.2 5-TACAACCgAAggAAggTCAg-3 20nt; Tm=53.9C; %GC=50
pdto: 179pb
Foward ADH.3 5-gCCCTCTgTCgTTgATATg-3 19nt; Tm=52.8C; %GC=52.6
Reverse ADH.3 5-CCCTTTTTCgCTCCTAgTC-3 19nt; Tm=52.7C; %GC=52.6
pdto: 179pb
Seq # Seq Name Seq 5' to 3' OD pmol Len MW
16841 AtPK-Up
TGAGCTACAA
AAAGCTCCCA
GTG
17.95 76955.66 23 7041.65
16842 AtPK-LB-down
GACCATCATA
CTCATTGCTGA
TC
15.21 70768.51 23 6958.62
16843 AtPK-WT-down
CACTTCCAATG
AGCACTCTTG
AG
15.61 71764.84 23 6983.62
16844 forwardUBQ7
AAGGTGAAGA
CTCTCACAGG
12.65 60526.69 20 6175.08
16845 forwardPP2a
TTCCATTCGTG
ATGCTGCTG
17.34 98768.86 20 6090.05
16846 reversePP2a
GGTACCCTAT
CTTTTGATGC
13.78 77038.24 20 6074.05
16847 forwardactin2
AGTTCTGTTCC
AGCCATCTC
12.62 72698.16 20 6018.99
16848 reverseactin2
GTGATTTCCTT
GCTCATACG
14.49 81007.56 20 6074.05
Tabla de oligos de los genes Referencias
Reverse PEPCK.2 5-TCACAAAgCCCTCAAAATTC-3 20nt; Tm=51.3C;%GC=40