INTRODUO

Microbiologia a cincia que estuda os microrganismos, seres vivos de tamanho

microscpico que pertencem a classes e reinos diversos e entre os quais esto os protozorios,
as algas microscpicas, os vrus, as bactrias e os fungos. Pela dificuldade em classific-los
como plantas ou animais, os microrganismos so s vezes agrupados separadamente como
protistas, seres de vida primitiva.
O homem no seu meio ambiente convive com inmeras formas de vida. Os
microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos benefcios como pelos malefcios que
proporcionam ao homem, sendo encontrados na natureza em abundncia e variedade de
formas. Para que os mesmos sejam cultivados artificialmente necessrio conhecer suas
exigncias nutricionais e suas condies fsicas de crescimento.
Tanto nas prticas de Microbiologia quanto em outras prticas em que h o manuseio
de amostras passiveis de contaminao, so extremamente necessrios procedimentos
chamados de manobras asspticas que evitem a contaminao tanto de quem est
manipulando as culturas, quanto da prpria.
Manobras asspticas uma srie de procedimentos executados de modo a evitar que os
meios de cultura estreis sejam contaminados por microrganismos indesejveis. Partindo-se
do princpio de que todos os materiais a serem utilizados devem estar estreis. Uma forma de
esterilizao com a utilizao do bico de bunsen, por exemplo, uma ala bacteriolgica, cuja
finalidade de transportar amostras de um meio a outro deve ser flambada at que esta
apresente. Mas aps a tcnica devem-se esperar uns segundos para que no haja a
desnaturao da amostra por conta do calor excessivo da ala. importante tambm a
passagem dos materiais antes e depois no bico de bunsen para no causar contaminao do
ambiente. Em qualquer ambiente estamos expostos a microrganismos. No laboratrio
microbiolgico, esses microrganismos se no forem reduzidos, podem afetar negativamente
os experimentos realizados alterando o resultado esperado no decorrer da prtica. E para isso
a tcnica de manipulao assptica de grande importncia para manter os meios de cultura
ou matrias estreis isentos de contaminao. O ambiente de trabalho deve estar o mais livre
possvel de microrganismos para se obter bons resultados.


OBJETIVO
Desenvolver habilidades para executar as tcnicas de preparao de esfregaos e para o
mtodo de colorao de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactrias de acordo com a
colorao obtida. Desenvolver a habilidade, tambm, para utilizar o microscpio ptico,
observando as bactrias aps a colorao de Gram.

REVISO BIBLIOGRAFICA

Colorao de Gram
Como a maioria dos microrganismos parecem quase incolores quando observados
atravs de um microscpio tico padro, frequentemente deve-se prepar-los para a
observao e uma das formas pelas quais isto pode ser feito atravs da colorao. A
colorao significa simplesmente corar os microrganismo com um corante que enfatiza certas
estruturas, sendo corante um sal composto de um on positivo e um on negativo, onde um dos
quais colorido e conhecido como cromforo. A cor dos corantes bsicos est no on
positivo e dos corantes cidos est no on negativo, assim, para aplicar corantes cidos ou
bsicos, os microbiologistas usam trs tipos de tcnicas de colorao, a simples, a diferencial
e a especial.
As bactrias Gram+ (70% da parede celular espessa) apresentam uma parede espessa,
homognea, predominantemente constituda por peptidoglicano. Deste modo, o corante
violeta, atravs do mordente, fixado no interior da clula pela camada espessa de
peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao violeta
do corante usado.
As bactrias Gram- (entre 10 a 20%, parede celular mais fina) apresentam uma parede
constituda por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contm
peptidoglicano e que mais fina que a das Gram+. Deste modo, a corante vileta no fixado
nesse tipo de bactria e removido. A camada de peptidoglicano mais fina que a das Gram+
e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizadas pelo agente descolorante quando
as clulas ficam descoloradas, so pigmentadas pelo corante vermelho.
Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura
da camada de peptidoglicano, a responsvel pelo diferente comportamento das bactrias
face colorao de Gram.
O peptidoglicano um heteropolmero rgido e insolvel na gua, constitudo por
cadeias lineares de dois acares aminados - NAG (cido n-acetilglucosamina) e NAM
(cido n-acetilmurmico) - ligados entre si por ligaes glicosdicas. As cadeias lineares
ligam-se entre si atravs de cadeias de quatro aminocidos.
O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em
microbiologia mdica, pois a reao de Gram de uma bactria pode fornecer informao
valiosa para o tratamento de doena, uma vez que as bactrias gram-positivas tendem a ser
mortas facilmente por penicilinas e cefalosporinas, e as bactrias gram-negativas geralmente
so mais resistentes, pois os antibiticos no podem penetrar na camada de lipopolissacardeo.


PROCEDIMENTO I
MATERIAL:
Lmina;
Bico de Bunsen;
Microscpico;
Cristal Violeta;
Lugol;
Safranina e lcool;
Placa de petri contendo o meio de cultura;
Ala de platina;
O procedimento I corresponde a analise tanto de bactria quanto de fungos de um
ambiente.
1. Foi coletada uma amostra do ar expondo uma placa de Petri contendo o meio de
cultura (gar nutriente) em um tanque de decantao do esgoto do bloco C do CCT da
Universidade Estadual da Paraba;
2. Foi colocada uma placa sem exposio ao ambiente, como prova em branco.
3. Identificou as placas, anotando todas as especificaes necessrias (Data, nome do
aluno) e as encubou na posio invertida temperatura de 30C.
4. Esperou-se quatro dias at o desenvolvimento da colnia de bactrias; e 24 para a
colnia de fungos.
5. Lavou-se uma lmina com lcool e a secou verificando se toda a gordura foi removida.
6. Preparou-se o esfregao e o secou a temperatura ambiente.
7. Passou-se o esfregao 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen para fixao do
mesmo.
8. Deixou-se o esfregao secar na estufa.
9. Adicionou-se o Cristal violeta, aguardar 1 minuto.
10. Aplicou a soluo de Lugol(substncia mordente com o objetivo de fixar o corante)
esperar 60 segundos e lavou com gua.
11. Descorou com lcool absoluto removendo o corante.
12. Corou-se com safranina e foi esperado 30 segundos.
13. Lavou-se e secou-se.
14. Examinou-se no microscpico.


PROCEDIMENTO II
MATERIAL:
Lmina para microscopia;
Suporte para lminas;
Corante verde malaquita;
Corante safarina;
Microscpio, leo d imerso, papel absorvente.
Foi preparado o esfregao, e o corou pelo mtodo de Wirtz-Conklin, da seguinte forma;
1. Corou por cinco minutos com soluo de verde malaquita a quente at secar;
2. Deixou esfriar e lavou com gua;
3. Corou por um minuto com safrarina a frio;
4. Lavou-se com gua e deixou secar.

RESULTADOS E DISCURSES

Na anlise do ambiente encontramos para bactrias com aspecto amarelado. J para os fungos, o
resultado obtido foi de com formato esfrico e de cor branca, algumas com aparncia aveludada, um
indicador de fungos filamentosos, e outras de aspecto leitoso, onde provavelmente possam ser
leveduras.
Tanto do procedimento I quanto do II a analise microscpica observou-se a presena de
bactrias Gram (-) e na forma de bacilo, sabendo que a grande maioria das bactrias Gram (-) so
patognicas.
CONCLUSO
Depois de aplicarmos o teste de colorao de Gram, observamos que as colnias
bacterianas em primeiro lugar apresentavam uma colorao avermelhada, o que de acordo
com o que aprendemos em aula consiste em classific-la como sendo Gram ( - ), j que as
bactrias Gram (+) apresentam uma colorao azulada/rosa, o que no era o caso.
Ainda observando essa lmina em microscpio, depois de determinar se era gram (+) ou
(-), partimos para observao da forma apresentada pela colnia, e podemos observar que ela
se dispunha espalhada pelo campo visual em forma de bastes alongados. Conclumos pela
estrutura apresentada que se tratava de um Bacilo.

REFERNCIA BIBLIOGRFICA
Apostila de Microbiologia Experimental. 2011
Colorao de Gram: disponvel em: http://pt.scribd.com/doc/23341096/Aula-
Pratica-de-coloracao-de-Gram