Cromatografia Lquida de Alta

Eficincia (CLAE)
Cromatografia lquida que emprega pequenas colunas,
preenchidas com materiais especialmente preparados
(FE) e uma FM que eluda sob altas presses.
Requer somente que a amostra seja solvel na FM,
independente de sua volatilidade (s no analisa gases).
Permite qualquer mecanismo de separao (adsoro,
partio, troca inica, excluso) de acordo com a FE
utilizada.
Limitaes: alto custo de instrumentao e operao; falta
de detector universal sensvel; treinamento de operao
demorado.
Onde aplicada?
Controle de qualidade e de produo na indstria.
Anlise de medicamentos.
Determinao de substncias ativas em matrizes
biolgicas.
Anlise de polmeros sintticos.
Separao e purificao de biopolmeros.
CROMATOGRAMA: mostra a variao com o tempo de uma
medida x, proporcional concentrao da substncia eluda.
t = 0 injeo
t = t
Ri
tempo de reteno (tempo entre a
injeo e a eluio da concentrao
mxima do soluto i)
t = t
M
tempo morto
t
Ri
= t
Ri
t
M
tempo de reteno relativo
h altura do pico (distncia entre a linha base e
o mximo do pico)
A rea do pico
W largura do pico na base (base do tringulo)
FATOR DE CAPACIDADE k = t
R
t
M
/ t
M
Para uma substncia em condies cromatogrficas
constantes:
t
R
= constante / k = constante
Quanto maior a reteno, maior k.
A medida de k muito freqente: para avaliar a
reteno e/ou para ajustar a separao.
k = 2 a 10 poucos componentes
k = 0,5 a 20 muitos componentes
O valor de k pode ser alterado modificando-se a
fora de eluio da FM.
FATOR DE SELETIVIDADE = k
2
/ k
1
Para haver separao k
2
k
1
ou >1.
Quanto maior , maior a separao.
NO depende da fora de eluio do solvente, mas
da afinidade do soluto pela FM e pela FE.
Diminuio da fora da fase mvel aumento de k
MAS: em geral no aumenta a seletividade!
(aumento proporcional para todos os solutos)
Para variar : mudana da FM
mudana do pH da FM
mudana da FE
PARMETROS IMPORTANTES PARA A ESCOLHA DA FM
Fora de eluio do solvente (polaridade)
Seletividade (tipo / grupo do solvente)
Representao esquemtica
de um sistema CLAE
As principais caractersticas que devem ser levadas em
conta na escolha de um equipamentos para CLAE so:
Versatilidade
Rapidez
Reprodutibilidade e Estabilidade
Sensibilidade
Fases estacionrias usadas
em CLAE
Materiais ideais:
mxima capacidade de amostra no menor tempo;
melhor resoluo;
fcil introduo na coluna;
pequena queda de presso;
baixo custo.
Partculas dos materiais empregados:
dimenses pequenas;
forma regular;
dimetros uniformes;
porosas ou peliculares (superficialmente porosas);
podem conter fases quimicamente ligadas sua
superfcie.
Colunas de separao
Materiais de preenchimento das colunas
Fases Estacionrias
Na cromatografia por adsoro/partio a FE deve
ser semelhante s substncias que devem ser
retidas nela.
Fase Normal: Fase Reversa
FE polar e FM apolar FE apolar e FM polar
INTERAES COM FE POLAR
Reteno de solutos por interaes polares facilitada por
solventes no polares (ou pouco polares).
Eluio de solutos de FE polar facilitada por solventes
polares e alta fora inica (alta concentrao de ons).
INTERAES COM FE APOLAR
Reteno de solutos por interaes apolares facilitada
por solventes polares.
Eluio de solutos de FE apolar facilitada por solventes
no polares ou pouco polares.
Exemplo: fora de eluio H
2
O > hexano em FE polar
fora de eluio hexano > H
2
O em FE apolar
Modificao Grupo ligado Aplicaes
slica
Modificao Grupo ligado Aplicaes
slica
Fases mveis usadas em CLAE
Podem ser: solventes orgnicos; solues aquosas; misturas
Composio constante (sistema isocrtico);
composio varivel (eluio por gradiente de concentrao)
Caractersticas
bom solvente para as amostras
ideal: solvente da amostra = eluente
caso contrrio: miscveis
baixa reatividade
baixa viscosidade
segurana: atxico; no corrosivo
alto grau de pureza
compatibilidade com o detector utilizado
Ex.: detector UV-VIS solvente transparente ao itilizado
Metanol e acetonitrila
mais usados
foras semelhantes, mas
atravs de interaes
diferentes:
MeOH pontes de H
Acetonitrila interaes
dipolo
Vantagens:
Acetronitrila menos
viscosa
MeOH menos txico
Fora do solvente (srie eluotrpica)
CUIDADOS COM A FM
No pode ter material particulado
obstrui o filtro de entrada da coluna (dimetro do
poro menor que o dimetro das partculas da FE)
aumenta presso do sistema
Todo solvente deve ser pr-filtrado e degaseificado
grande maioria dos problemas dirios devido
a ar na coluna (alterao na presso)
Degaseificao:
agitador mecnico (lento)
filtrao vcuo
ultrassom(15 minutos suficiente)
As tcnicas da CLAE
Cromatografia lquido-slido ou por adsoro
O mecanismo de separao da CLS baseia-se na
competio que existe entre as molculas da
amostra e as da fase mvel em ocupar os stios
ativos na superfcie de um slido (FE).
1 molcula da FM deslocada molcula do
soluto ser adsorvida
importante que as partculas da FE tenham
grande rea superficial (grande n de stios ativos).
Cromatografia lquido-lquido ou por partio
O mecanismo de separao da CLL baseia-se
nas diferentes solubilidades que apresentam os
componentes da amostra na FM e na FE.
Os componentes + solveis na FE so
seletivamente retidos por ela, enquanto os solveis
so transportados mais rapidamente pela FM.
Inconveniente: solubilidade da FE na FM.
Soluo: materiais que contenham a FE
quimicamente ligada a um suporte slido.
Cromatografia lquida com fase ligada (CLFL)
O mecanismo de separao principal da CLFL
baseia-se na partio.
FE com grupos de superfcie ativos: adsoro
Variando a natureza dos grupos funcionais da FE
possvel obter diferentes tipos de seletividade.
Limitao: a quantidade de FE que possvel
ligar a um suporte (geralmente partculas de slica)
limitada quantidades pequenas de amostras.
Aplicao: molculas de baixa ou mdia
polaridade, no inicas, de MM < 2000 e solveis em
solvente orgnico.
Cromatografia por excluso (CE)
A CE efetua a separao de acordo com o
tamanho efetivo das molculas.
FE = material inerte cujos poros tm tamanho
controlado.
As molculas pequenas podem penetrar na
maioria dos poros e apresentam um maior t
R
.
MM = 1000 at vrios milhes
Aplicao: molculas de alta MM (polmeros)
Cromatografia por troca inica (CTI)
Na CTI a FE , normalmente, uma resina de
poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, a qual
so ligados grupos inicos.
Exemplo: resina trocadora de ctions: -SO
3
-
resina trocadora de nions: -NR
3
+
Os grupos tm um contra-on (com carga oposta)
que pode ser deslocado por ons da FM de carga
similar a ele.
Exemplo: resina trocadora de ctions
M
+
+ R-SO
3
-
Na
+
Na
+
+ R-SO
3
-
M
+
FE para CLAE com fase ligada
A superfcie da slica que o suporte mais popular, pode
ser modificada por um destes caminhos, entre outros:
a) Formao de ligao siloxano (Si-O-SiR
3
) por reao
do grupo silanol com um organoclorosilano:
Si-OH + R
3
SiCl Si-O-SiR
3
+ HCl
b) Formao da ligao em duas etapas:
silanol + cloreto de tionila cloreto
cloreto + organometlico grupo orgnico
diretamente ligado superfcie da slica
Si-OH + SOCl Si-Cl + SO
2
+ HCl
Si-Cl + Ri Si-R + LiCl
Detectores usados em CLAE
Detector ideal:
Alta sensibilidade e baixo limite de deteco.
Resposta rpida a todos os solutos.
Insensibilidade a mudanas na temperatura e na
vazo da FM.
Resposta independente da FM.
Resposta linear com a quantidade de soluto.
No destruio do soluto.
Informao qualitativa do pico desejado.
Detector por absorvncia nas regies do
ultravioleta e do visvel
Seu funcionamento baseia-se na absoro de luz pela
da amostra ao passar atravs dela qualquer radiao
eletromagntica; normalmente isso ocorre na regio do
ultravioleta at o infravermelho em um dado .
varivel: detector espectrofotomtrico
1 ou 2 s fixos: detector fotomtrico (254 e 280nm)
Sensibilidade: at 0.001 unidades de absorvncia
Limite de deteco: at 10
-9
g
Quando muda a fase mvel (gradiente) que absorve no
UV cela de referncia para compensar variao
Detector por ndice de refrao
o segundo mais usado em CLAE.
Acompanha continuamente a diferena de ndice de
refrao entre a FM pura e o efluente que sai da coluna
contendo os componentes da amostra.
Para solutos que no absorvem no UV ou visvel.
Resposta universal, mas sensibilidade moderada
(10
-6
g 10
-7
unidades de ndice de refrao)
Para observar essa diferena necessrio um controle
de temperatura de 0,001C.
Outro problema: sensibilidade s variaes de vazo e
mudanas na composio da FM, o que impede o uso de
gradientes (no h par de solventes com ir idnticos)
Exemplo 1:
Fase reversa efeito
da coluna
Reteno de
hidrocarbonetos
aromticos
a) Coluna C8
b) coluna C18
Hidrocarbonetos
aromticos:
benzeno
naftaleno
fluoreno
antraceno
1,2-benzantraceno