Construo 3D de Clulas da

Mesoderme de Embries de Galinha

(Gallus gallus)
Microscopia confocal
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A Microscopia Confocal uma tcnica imagiolgica desenvolvida primariamente por Marvin Minsky, em
1955. Apesar do funcionamento do Microscpio Confocal ser semelhante ao do Microscpio de fluorescncia,
o primeiro utilizado para aumentar o contraste da imagem microscpica e construir imagens tridimensionais
atravs da utilizao de um orifcio de abertura, pinhole, que permite uma grande definio de imagem em
amostras mais espessas que o plano focal.
Esta tcnica tem vindo a adquirir uma grande popularidade e possui diversas aplicabilidades na cincia,
nomeadamente na obteno de imagens de amostras vivas e de informao computadorizada tridimensional na
pesquisa biolgica, na anlise qumica e de materiais, principalmente na rea de neuroanatomia e neurofisiologia.
ndice
1 Histria
1.1 Lentes
1.2 Aparecimento do Microscpio
1.3 Cincia e o Microscpio
1.4 Gerao Seguinte
1.5 Melhorias do Sculo XVIII
1.6 Microscpios no Sculo XIX
1.7 Microscpio de Fluorescncia
1.8 Microscpio Confocal
2 Princpios Fsicos do Funcionamento do Microscpio
Confocal
2.1 Constituio do Microscpio Confocal
2.2 Luz
2.3 ptica
2.4 Visualizao de uma Imagem
3 Aplicaes
3.1 Preparao de Amostras Biolgicas
3.2 Riscos
3.3 Vantagens e Desvantagens
4 Referncias
5 Ligaes externas
Histria
Lentes
No se sabe ao certo quando as lentes foram inventadas, mas, em 721 a.C, h relatos de um cristal de rocha
recortado com propriedades de ampliao. Conhecido, posteriormente, como lente de Lanyard, pensa-se que
este objecto possa ter sido a primeira lente criada pelo homem. Contudo, as lentes passaram a ser realmente
conhecidas e utilizadas por volta do ano de 1280, em Itlia, com a inveno dos culos. Com sua rpida
popularizao, logo comearam as primeiras experincias de combinao de lentes para aplicao em
instrumentos de ampliao de imagens, resultando na criao do primeiro microscpio composto (com duas ou
mais lentes).
Aparecimento do Microscpio
A denominao de "microscpio" foi dada pelo membro da Academia de Lincei e mdico em Roma a servio
do Papa Urbano VII, Johann Giovanni Faber (1570-1640) de Bamberg em 1624. O substantivo provm da
juno de dois vocbulos gregos: micros (pequeno) e skopein (ver, examinar).
O crdito pela inveno do microscpio dado ao holands Zacharias Jansen, por volta de 1595. Como era
muito jovem na poca, pensa-se que o primeiro microscpio, com duas lentes, tenha sido desenvolvido pelo
seu pai, Hans Jansen. Porm, era Zacharias que montava os microscpios distribudos pela realeza europeia,
dado que, na altura, o instrumento era considerado um brinquedo, pois possibilitava a observao de pequenos
objectos.
No obstante, a paternidade do microscpio tem sido muito discutida e disputada, uma vez que os italianos
atribuem este singular invento ao seu compatriota, fundador do mtodo experimental e da cincia dinmica e
eminente fsico e matemtico, o famoso Galileu Galilei (1564-1642), natural de Pisa. Segundo testemunhos,
Galileu, em 1609, apenas combinou lentes ou cristais de aumento num tubo de chumbo ou papelo, aplicando-
as ao estudo da astronomia, embora se tenha apoiado no conhecimento do aparato ptico inventado pelos
Jansen. Este instrumento de Galileu permitia um aumento de trinta vezes, sendo ainda considerado o primeiro
telescpio produzido.
Mas de facto parece no ser ele o seu inventor, pois o seu contemporneo Hans Lippershey tinha um
telescpio, cujos fundamentos foram indagados por Galileu, construindo, baseado neles, o seu prprio
telescpio aperfeioado. O facto de ter construdo os seus prprios instrumentos, tal como aconteceu com
diversos cientistas, no lhe credita obter a patente de inventor, como seus bigrafos pretendem. Pelas
computaes cronolgicas, a inveno do instrumento pertence, de facto, aos Jansen.
Cincia e o Microscpio
O sculo XVII foi um perodo de grande interesse pelos microscpios. A prpria palavra microscpio foi
oficializada na poca pelos membros da Academia de Lincei, uma importante sociedade cientfica. Contudo,
ainda havia dvidas sobre a importncia do instrumento para a cincia. A ampliao dos objectos, em torno de
nove vezes, no permitia observar coisas realmente novas, de tal forma que ainda no se suspeitava que uma
estrutura presente em todos os tecidos vivos estaria ao alcance do olho humano com a ajuda dos microscpios:
a clula.
Gerao Seguinte
No final do sculo XVII, os microscpios sofreram uma mudana no seu desenho bsico. Devido
provavelmente instabilidade do sistema lateral de sustentao, passou-se a utilizar um trip de apoio. O
primeiro esquema de microscpio com trip foi divulgado na Alemanha em 1631. Contudo, somente em 1683,
o microscopista ingls John Yarwell construiu o primeiro modelo de que se tem notcia.
Melhorias do Sculo XVIII
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O sculo XVIII foi uma poca de melhorias nas lentes e nos microscpios, nomeadamente a nvel de
estabilidade, preciso de focagem e facilidades de uso. Os instrumentos passaram a ser anunciados em diversas
publicaes pelo mundo inteiro, e vrios microscopistas lanaram os seus modelos. Por volta do ano de 1742,
os microscpios que projectavam imagens fizeram grande sucesso. Uma das diverses da poca era visitar os
espectculos de projeco microscpica.
Microscpios no Sculo XIX
No sculo XIX, os fabricantes de microscpios desenvolveram novas tcnicas para fabricao de lentes e
passaram, tambm, a utilizar espelhos curvos para melhorar a capacidade de focagem desses instrumentos. Em
1840, os Estados Unidos comearam a fabricar microscpios, uma actividade at ento restrita basicamente
Inglaterra. Finalmente, por volta de 1880, os chamados microscpios pticos atingiram a resoluo de 0,2
micrmetros, limite que permanece at aos dias de hoje.
Microscpio de Fluorescncia
A Microscopia de Fluorescncia foi inventada h quase um sculo atrs, quando alguns investigadores
experimentavam o uso de luz ultravioleta para obter uma maior resoluo. No incio, as observaes
microscpicas eram limitadas aos espcimes que tinham auto-fluorescncia, porm rapidamente se comeou a
estudar corantes com fluorescncia. No entanto, s a partir da dcada de 1940 que a Microscopia de
Fluorescncia comeou a ganhar popularidade, quando Coons e Kaplan apresentaram uma tcnica que
marcava anticorpos com um corante fluorescente para estudar interaces antignio-anticorpo, o que promoveu
uma profunda alterao no campo da Imunocitoqumica.
A descoberta que realmente trouxe a Microscopia de Fluorescncia para a vanguarda veio em 1994, quando
Chalfie M. et al conseguiram expressar naturalmente uma protena fluorescente, a protena fluorescente verde
(Green Fluorescent Protein - GFP), em organismos vivos. Este foi um marco na evoluo desta rea, pois
permitiu toda uma nova classe de mtodos de marcao.
Na histria do Microscpio de Fluorescncia, a tecnologia foi um trampolim multidisciplinar da Engenharia
ptica, Qumica e Biologia, em que todas as disciplinas contriburam para visualizar as substncias fluorescentes
unidas s protenas, aumentando a compreenso da actividade celular. A importncia da Microscopia de
Fluorescncia foi reconhecida recentemente com o prmio Nobel de Qumica do ano de 2008, que foi
concedido pelo desenvolvimento da GFP.
Microscpio Confocal
O desenvolvimento do Microscpio Confocal foi impulsionado, em grande parte, pelo desejo de se obter uma
imagem de eventos biolgicos que ocorrem in vivo.
A inveno deste objecto atribuda a Marvin Minsky que, em 1955, enquanto estudante de ps-
doutoramento na Universidade de Harvard, construiu um microscpio com o objectivo de obter uma imagem
de redes neurais, utilizando preparaes no coradas de tecido cerebral vivo. Todos os Microscpios
Confocais modernos empregam o mesmo princpio da imagiologia confocal patenteada em 1957.
A inveno de Marvin Minsky permaneceu despercebida durante algum tempo, provavelmente devido falta
de fontes de luz intensas necessrias para se obter imagens e de um computador com uma potncia suficiente
para lidar com grandes quantidades de dados. Na sequncia do trabalho de Marvin Minsky, surgem M. David
Egger e Mojmir Petran, no final dos anos 1960, que fabricam um Microscpio Confocal de feixes mltiplos,
onde utilizaram um disco giratrio (disco de Nipkow) para examinar seces de tecido cerebral no corado e
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Primeira Pgina da Patente de Marvin
Minsky Sobre o Microscpio
Confocal
clulas ganglionares. Prosseguindo nesta rea, foi em 1973 que M. David Egger desenvolveu o primeiro
Microscpio Confocal a laser mecanicamente digitalizado e publicou as primeiras imagens reconhecveis de
clulas.
Durante o final dos anos 1970 e na dcada de 1980, os avanos da informtica e da tecnologia do laser,
juntamente com os novos algoritmos para manipulao digital de imagens, levou ao aumento do interesse pela
Microscopia Confocal.
Pouco tempo depois da patente de Marvin Minsky ter expirado, os desenhos prticos do Microscpio
Confocal a laser foram traduzidos em instrumentos de trabalho por vrios investigadores. O fsico holands G.
Fred Brakenhoff desenvolveu um Microscpio de Varrimento Confocal em 1979. Quase em simultneo, Colin
Sheppard contribuiu para a tcnica com a Teoria da Formao da Imagem. Tony Wilson, Brad Amos e John
White alimentaram o conceito e, mais tarde (durante o final dos anos 1980), demonstraram a utilidade da
Imagem Confocal Latente no exame de amostras biolgicas fluorescentes.
Enquanto investigadores em Cambridge, Brad Amos e John White
tentaram observar as primeiras divises mitticas dos embries de C.
elegans, atravs de imunofluorescncia com anticorpos antitubulina,
numa tentativa de determinar os planos de clivagem das clulas. No
entanto, no conseguiram atingir o seu objectivo, visto que a maioria
da fluorescncia observada estava fora do plano de focagem. Foi
ento que estes investigadores adoptaram a tcnica de Microscopia
Confocal proposta por Minsky. Em 1987, foi construdo o primeiro
Microscpio Confocal com a capacidade de produzir imagens com
bastante utilidade, combinando tecnologias de laser, de computador e
de microelectrnica. Amos e White construram o primeiro prottipo
do Microscpio Confocal que incorporava estas tecnologias e
conseguiram, finalmente, obter imagens com melhor focagem dos
embries de C. elegans. Foi, ento, em 1987 que os primeiros
instrumentos comercializados apareceram.
Durante os anos 1990, os avanos da ptica e da electrnica
ofereceram lasers mais estveis e mais poderosos de alta eficincia.
Alm disso, iniciava-se a sintetizao de fluorocromos que eram mais
cuidadosamente combinados s linhas de excitao do laser. Aliado
ao rpido avano da velocidade de processamento dos
computadores e ao aumento da disponibilidade tecnolgica de
armazenamento de grande volume, emergente no final dos anos 1990,
a etapa foi definida como uma exploso virtual, no que diz respeito ao nmero de aplicaes que podero ser
alvo da Microscopia Confocal.
Os Microscpios Confocais modernos podem ser considerados como sistemas electrnicos totalmente
integrados, onde o microscpio desempenha um papel central numa configurao, constituda por um ou mais
detectores electrnicos, o computador (imagem para visualizao, processamento, produo e
armazenamento), vrios sistemas de lasers combinados com dispositivos de seleco e um feixe de varrimento
de montagem. Na maioria dos casos, a integrao entre as vrias componentes to profunda que toda a
Microscopia Confocal frequentemente referida como um sistema colectivo de imagem digital ou de vdeo,
capaz de produzir imagens electrnicas. Estes microscpios esto agora a ser integrados na rotina de
investigaes sobre molculas, clulas e tecidos vivos, o que no era possvel h apenas alguns anos atrs.
Princpios Fsicos do Funcionamento do Microscpio Confocal
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Espectro Electromagntico
Existem trs tipos de Microscpios Confocais comercialmente disponveis: (1) o Confocal Laser Scanning
Microscope (LSCM), o modelo mais utilizado devido elevada qualidade de imagem que permite a obteno
de imagens de alta resoluo atravs de cortes pticos, posteriormente agrupados para se fazer a reconstruo
tridimensional da topografia de objectos complexos; (2) o Spinning-Disk Confocal Microscope, com um
disco de Nipkow, cujo rcio de construo mais rpido e eficaz que o LSCM, sendo, por isso, til em
observaes dinmicas; e (3) o Programmable Array Microscope (PAM).
O sistema ptico usado neste tipo de Microscpios o mesmo que aplicado nos Microscpios de
Fluorescncia. No entanto, nestes ltimos, o campo todo iluminado, enquanto que no Microscpio Confocal
focaliza somente um ponto em determinada profundidade no espcimen.
Constituio do Microscpio Confocal
Um Microscpio Confocal, no geral, constitudo por (1) um Laser, que corresponde fonte de luz projectada
na amostra e que pode ter um comprimento de onda especfico; (2) um Scanner que um digitalizador por
unidade, ou seja, move o laser de modo a focalizar a amostra linha por linha; (3) o Z control, que permite a
focagem da amostra e a aquisio da imagem em seces nos eixos X e Z; (4) os Fotomultiplicadores
(Photomultipliers - PMT), que vo detectar os fotes emitidos e/ou reflectidos pela amostra; (5) o Pinhole,
responsvel pela discriminao profunda e pela posio nos eixos X e Y; (6) o Beam Splitter ou Via de
Fluorescncia, que definida pela combinao dos espelhos dicricos (principal e secundrio) e filtros de
emisso; e (7) as Objectivas, responsveis pela formao ptica da imagem, que determina as propriedades de
qualidade da imagem, assim como as resolues nos eixos X, Y e Z, e caracterizada pela abertura numrica,
que determina o tamanho da imagem no local (conjuntamente com os comprimentos de onda) e influencia
substancialmente a espessura mnima vivel.
Luz
A luz surge sob a forma de ftons, partculas elementares da fora electromagntica. Sendo uma forma de
energia elctrica e magntica, estes viajam atravs do espao comportando-se simultaneamente como partculas
e ondas.
O espectro electromagntico corresponde distribuio da
intensidade da radiao electromagntica segundo a sua frequncia
ou comprimento de onda. Varia desde os raios gama (de maior
energia) s ondas rdio (de menor energia), sendo que a luz visvel
corresponde apenas a uma pequena parte deste espectro que pode
ser subdividido de acordo com a cor - vermelho nos comprimentos
de onda longos e violeta para os comprimentos de onda mais curtos.
A luz branca resulta, ento, da mistura de todas as cores do espectro
visvel.
A luz possui, portanto, uma natureza ondulatria (conceito
introduzido na Fsica pela primeira vez por James Clerck Maxwell).
No entanto, quando interage com material, esta s capaz de dar ou receber energia em pequenas quantidades
o que remete para a sua natureza corpuscular, ou seja, a luz tambm constituda por pequenas partculas
denominadas fotes.
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Energia do Foto
A energia de um fton (Ef) dada pela relao Ef = hf, sendo f a
frequncia da onda electromagntica a que o fton est associado e h
uma constante universal de proporcionalidade, conhecida por
constante de Planck (devido ao fsico Max Karl Planck). A
interaco entre a luz e a matria faz-se, portanto, atravs da troca de
um nmero determinado de ftons.
De acordo com o estado atual do conhecimento cientfico, a luz
gerada pelo movimento de partculas carregadas, nomeadamente de
eltrons, um dos constituintes fundamentais do tomo e, portanto, da
matria. A maioria das fontes luminosas emite luz proveniente do
movimento destas partculas. Como se sabe, os eltrons encontram-
se volta do ncleo do tomo, ocupando apenas certos padres
energticos designados por orbitais. A cada uma destas orbitais corresponde um valor especfico de energia.
Quando o eltron se encontra na orbital qual corresponde o nvel de energia mais baixo no irradia energia,
no entanto, quando o tomo excitado, o eltron pode posteriormente perder a energia adquirida, libertando-a
sob a forma de um fton, ou seja, de luz.
As fontes de luz usuais diferem entre si pelo modo como fornecem energia aos eltrons em movimento. Se a
energia vem do calor, a fonte designada por incandescente. o caso da luz proveniente das lmpadas
incandescentes. Se provm de outra fonte, tal como a qumica ou elctrica, a fonte designa-se por luminescente.
o caso dos materiais fosforescentes.
A luz do laser diferente da luz normal, possuindo as seguintes caractersticas:
Monocromtica: possui um comprimento de onda especfico de luz, o que vai resultar numa cor
especfica;
Coerente ou "organizada" : cada fton move-se juntamente com restantes. Todos os ftons possuem
frentes iniciadas simultaneamente;
Direcionada: Possui um feixe estreito e concentrado, contrariamente a outras fontes de luz que produzem
disperso;
Intensa.
Como j referido, o fton emitido por qualquer tomo tem um determinado comprimento de onda que depende
da diferena de energia entre o estado excitado e o estado fundamental. Se esse fton encontrar outro tomo
com um eltron em estado excitado idntico, a emisso estimulada pode ocorrer. O primeiro fton pode
estimular ou induzir emisso atmica de tal maneira que o fton emitido como consequncia vibrar na mesma
frequncia e direco que o fton recebido. Assim, importante que o meio apresente tomos com eltrons em
nveis cujo espaamento tenha justamente a energia do feixe de luz que se deseja obter. Se todos os tomos
desse meio apresentarem eltrons no estado de mais baixa energia, a ao do laser no poder iniciar-se
devido ao facto de que no teremos eltrons excitados para que ocorra o processo de emisso estimulada, ou
mesmo espontnea. Assim, antes de iniciar-se a ao do laser, preciso que a maioria dos tomos possua
eltrons nos seus estados excitados.
Outro ponto fundamental do laser um par de espelhos, estando estes posicionados em cada ponta do meio
gerador. Os ftons refletem-se nos espelhos para viajar de um lado a outro do material gerador de laser.
Durante este processo, estimulam outros eltrons a fazer com que a energia decrescente aumente e podem
causar a emisso de mais ftons de igual comprimento de onda. Um efeito domin ocorre e logo se tero
propagado vrios ftons de mesmo comprimento de onda. Aps a inverso de populao ter ocorrido,
produzindo a excitao dos eltrons com ajuda de uma fonte externa, o decaimento espontneo de um dos
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Focagem do Microscpio Confocal
Variao na qualidade da imagem
obtida consoante o tamanho do
pinhole
tomos para o estado fundamental comea a provocar a emisso estimulada dos demais tomos e,
consequentemente, produz luz. Apenas a luz que se propaga ao longo do eixo principal do laser vai sofrer as
vrias reflexes no interior da cavidade ressonante, fazendo com que haja um feixe de luz.
O espelho que se encontra numa das pontas do laser semiprateado, o que significa que reflecte uma parte da
luz e permite a passagem de outra parte. Essa parte da luz que consegue passar a luz laser.
ptica
O mecanismo de funcionamento ptico deste microscpio melhor entendido como um par de lentes, com o
espcimen situado no ponto focal de uma das lentes e com a formao de imagem no ponto focal da outra. O
princpio bsico do Microscpio Confocal captar apenas a poro do espcimen situada no ponto focal de
lente mais prxima deste. Esta meta conseguida atravs da associao de um orifcio de abertura ou pinhole,
que no mais do que uma superfcie com um orifcio. Desta forma, o orifcio estrategicamente colocado no
ponto focal da lente oposta (isto , no extremo contrrio do sistema de lentes relativamente ao espcimen)
sendo, portanto, atravessado apenas pela luz referente ao ponto focal captado pelo sistema.
De acordo com o mecanismo de funcionamento do pinhole, podemos ser levados a pensar que quando mais
pequeno for o orifcio, melhor. Quando maior a capacidade de eliminar a luz de fundo mais definida ser a
imagem obtida. De facto, em termos tericos, esse o raciocnio correcto. Na prtica, no entanto, um pinhole
muito pequeno poder eliminar tambm a luz necessria para a formao da imagem, isto , a capacidade de
seccionamento ptico ou optical seccioning seria to elevada que as seces de luz emitida seriam demasiado
finas para serem captadas pelo fotomultiplicador.
Uma forma de evitar este evento poderia residir no aumento da
intensidade da luz emitida pelo laser ou no aumento da concentrao
de fluorforos. No primeiro caso, sabe-se que demasiada intensidade
luminosa leva saturao ou mesmo degradao dos fluorforos. No
segundo, a excessiva concentrao destas molculas pode levar
interaco entre elas levando a fenmenos de quenching (fenmeno
que designa a perda de luminosidade de uma determinada
substncia). Como os fluorforos so excitados por um comprimento
de onda diferente daquele que emitem, a presena de muitos fluorforos juntos no permite que eles captem
eficazmente a luz excitatria, isto , captam um determinado comprimento de onda e comeam a emitir noutro,
emisso esta que interfere com a captao de fluorforos demasiado prximos. De certa forma, para uma
concentrao muito grande de fluorforos, o aumento da intensidade de luz emitida inibe-se a si prpria, uma
vez que diminui a taxa de excitao molecular.
Experimentalmente, observou-se que pinholes com dimenses
inferiores s do disco de Airy no oferecem benefcios. O pinhole
desejvel ter um tamanho igual ao disco de Airy (ponto de focagem
mximo que se consegue obter com uma lente perfeita. O tamanho
deste disco varivel consoante o comprimento de onda a que est
subjacente), uma vez que poder ser ultrapassado pela totalidade
da luz no ponto focal e ter capacidade para eliminar luz indesejvel.
A focagem de um ponto nico permite obter aquilo a que se designa
por optical seccioning, isto , permite formar uma imagem plana de
uma fina seco focada do espcimen. Como a luz emitida pelo
espcimen fora do ponto focal eliminada pelo pinhole, a imagem
obtida com Microscpio Confocal bastante mais definida em relao a outros tipos de microscopia.
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Uma das grandes vantagens do Microscpio Confocal advm precisamente da capacidade para optical
seccionning. Com a obteno destas imagens bidimensionais muito definidas, possvel obter seces a toda a
espessura do tecido e criar imagens tridimensionais atravs da juno das primeiras.
Pelo tamanho e caractersticas do pinhole, verifica-se que, a cada momento, a quantidade de fotes que
chegam ao sensor bastante pequena. Assim, necessria a utilizao de uma fonte luminosa muito intensa,
que, nos tempos da criao do aparelho, era uma lmpada de zircnio. Actualmente, opta-se pelos lasers, que
ainda tm a vantagem de emitir num comprimento de onda especfico, existindo vrios disponveis no mercado
com comprimentos de onda diferentes.
Tendo em conta que no caso do Microscpio Confocal, a objectiva uma estrutura que a luz atravessa nos
dois sentidos, ainda que comprimentos de onda diferentes, necessrio um filtro capaz de separar esses
comprimentos de onda sem que nenhum dos dois se perda. Assim, colocado um espelho dicrico (di dois;
crico cor) ou dicromtico para reflectir o laser e ser atravessado pela luz emitida ou vice-versa.
Alm do espelho dicrico, o Microscpio Confocal tambm equipado com espelhos mveis. Aquando da
sua criao, Minsky constituiu as suas imagens atravs da mobilidade do espcimen. Contudo, ainda que este
mtodo permita evitar defeitos nas lentes, levava muitas vezes a perdas de resoluo da imagem. Alm disso, a
nvel biolgico torna-se impossvel efectuar algumas manipulaes (tal como microinjeco de sondas
fluorescentes) quando o espcimen mvel. Desta forma, opta-se actualmente por manter o espcimen
esttico enquanto o laser "varre" toda a sua superfcie. Este mtodo conseguido com espelhos, associados a
pequenos motores, que rodam de forma a conseguir abranger uma rea limitada do espcimen. De referir que
os espelhos so responsveis pela varrimento do laser apenas a duas dimenses.
Neste tipo de microscopia nunca h uma imagem completa do espcimen, uma vez que a cada instante apenas
observado um ponto. Assim, o microscpio acoplado a um sistema informtico que constri uma imagem,
pixel a pixel, medida que os pontos do espcimen so focados. Geralmente, uma imagem demora cerca de
0,1 a 1 segundos a ser gerada. Contudo, este perodo poder ser maior para obteno de uma imagem
bidimensional de alta definio ou tridimensional. fundamental que os fluorforos no se encontrem
demasiado expostos ao comprimento de onda que os excita, sob pena de sofrerem danos ou photobleaching
(destruio fotoqumica de um fluorforo). Assim, so actualmente usados mtodos de captura a alta
velocidade, como, por exemplo a Microscopia Confocal com disco de Nipkow. Este disco detm milhares de
pinholes em toda a sua superfcie, o que permite a actuao de algumas centenas deles a cada momento.
Visualizao de uma Imagem
O laser emite um feixe de luz que ir incidir, em primeiro lugar, na objectiva e, de seguida, no espelho dicrico,
que reflecte a luz para uma segunda objectiva. Esta converge a luz para um nico ponto na amostra. A luz
fluorescente emitida pela amostra , ento, captada pela segunda objectiva e passa atravs do espelho dicrico,
enquanto que a luz do feixe reflectida. Posteriormente, a luz fluorescente da amostra convergida por uma
terceira objectiva de modo a ser captada pelo fotomultiplicador. Antes desta ser detectada pelo mesmo,
parcialmente obstruda de forma que apenas a luz proveniente do ponto focal seja captada. O fotomultiplicador
transforma, ento, o sinal luminoso em sinal elctrico, que ser gravado por um computador. O microscpio
digitaliza a amostra sequencialmente, ponto por ponto e linha por linha, e converge os pixis numa imagem.
Deste modo, seces pticas da amostra so imagens com grande contraste e resoluo nos eixos X, Y, Z, ou
seja, so tridimensionais.
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Astrcitos - Imagem construda por
Microscopia Confocal
Aplicaes
Apesar da sua longa histria, s recentemente o Microscpio Confocal se tornou num instrumento prtico com
aplicaes definidas. Entre estas aplicaes destaca-se a obteno de imagens valiosas de amostras vivas e de
informao computorizada tridimensional na pesquisa biolgica, na anlise qumica e de materiais, permitindo a
localizao tridimensional de estruturas e molculas marcadas com fluorocromos. O espectro de
aplicaes especficas deste tipo de microscopia vasto e restringido apenas pelos limites do avano cientfico.
Este tipo de microscpio apresenta especial relevncia em estudos de neuroanatomia e neurofisiologia, bem
como estudos de morfologia de uma grande variedade de clulas e tecidos. Da mesma forma, a crescente
utilizao de protenas fluorescentes proporciona uma expanso do nmero de estudos cientficos
experimentais, associados ao uso de tcnicas de Microscopia Confocal, possibilitando o aumento do nmero
de aplicaes.
Actualmente realizam-se vrias tcnicas com recurso a este equipamento, nomeadamente marcao de
eptopos, Transferncia de Energia de Ressonncia por Fluorescncia (Fluorescence Resonance Energy
Transfer - FRET), pesquisa das clulas estaminais, estudos de ''Photobleaching'', informaes obtidas por
tempo de vida fluorescente, microscopia multifoto (multifoton), reflexo interna total, hibridizao de DNA,
sondas membranares e de ies e protenas bioluminescentes.
Marcao de Eptopos
A tcnica de Marcao de Eptopos para a Microscopia Confocal muito semelhante de Imunocitoqumica,
utilizando fluorocromos como molculas propiciadoras de visualizao.
Transferncia de Energia de Ressonncia por Fluorescncia ou Fluorescence Resonance Energy
Transfer (FRET)
A localizao precisa e a natureza de interaces entre molculas, em clulas vivas, apresentam grande
relevncia em muitas reas de investigao biolgica. Para compreender estas interaces fsicas nos processos
biomoleculares tpicos, a proximidade relativa das partculas necessita de ser determinada com alguma preciso.
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Esquema ilustrativo de FRET
Processo de FRET
Clulas Estaminais: Construo de
uma Imagem em Microscopia
Confocal
A tcnica de Transferncia de Energia de Ressonncia por Fluorescncia ou FRET (Theodore Frster, 1949),
quando conjugada com a microscopia, permite a determinao da
distncia entre molculas num raio de nanmetros (proximidade
suficiente para que ocorra interaco molecular).
Atravs da marcao de
vrias estruturas celulares
com fluorforos individuais
que possuam diferentes
espectros de excitao e emisso e com o recurso a diferentes
combinaes de filtros fluorescentes, ser possvel examinar a
proximidade das molculas marcadas dentro de uma nica clula ou
num corte de tecido.
Assim, o FRET assume-se como um processo atravs do qual a
transferncia de energia ocorre entre um fluorforo num estado de
excitao e um segundo cromforo que se encontre nas
proximidades. O mecanismo de FRET envolve assim um fluorforo
dador num estado electrnico de excitao que tem a capacidade de transferir essa energia de excitao para
um cromforo (receptor) nas proximidades numa reaco non-radiative ao longo de interaces dipolo-
dipolo de longo alcance. Atravs desta tcnica, possvel verificar as molculas que se encontram mais
prximas (permitindo concluir acerca da associao molecular) contrariamente ao que possvel observar com
o Microscpio ptico (limite de resoluo mais baixo).
Pesquisa de Clulas Estaminais
As clulas estaminais so clulas indiferenciadas que se podem auto-
renovar, expandir e diferenciar em diversos tipos celulares e durante
o desenvolvimento embrionrio que estas clulas se especializam.
Mais tarde, no indivduo adulto, as clulas estaminais reparam tecidos
danificados e substituem as clulas que, devido ao fenmeno de
senescncia ou leso, morrem. Estas clulas so estudadas
essencialmente pelo seu potencial na utilizao em transplantes e para
curar doenas em que os tecidos foram danificados.
Como as propriedades deste tipo celular precisam de ser
compreendidas utiliza-se, entre outras, tcnicas de Microscopia
Confocal. Esta tcnica permite estudar as caractersticas morfolgicas
das clulas estaminais como tamanho e forma, obter imagens
tridimensionais que possibilitam a anlise das estruturas internas que
as constituem, bem como recolher informao sobre a actividade
celular.
Estudos de Photobleaching
O processo de Photobleaching envolve a diminuio da absoro e da intensidade de fluorescncia de
determinado fluorforo. Tcnicas como Perda de Fluorescncia na Photobleaching (Fluorescence Loss in
Photobleaching - FLIP) e Recuperao de Fluorescncia aps Photobleaching (Fluorescence Recovery
after Photobleaching - FRAP) so utilizadas para observar o movimento de substncias intracelulares.
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Princpio do Photobleaching Exemplo de Photobleaching
Diferencial em Tecidos com
Marcao Mltipla
Exemplo de uma Recuperao aps
Photobleaching
O Photobleaching o fenmeno caracterizado pela perda de fluorescncia que, em determinadas
circunstncias, permite aceder a informaes que de outra forma no seriam possveis de obter, como a
verificao da integridade/continuidade da membrana e a examinao da fluidez na direco lateral.
Na tcnica de FLIP, uma regio da clula em estudo bleached continuamente, ou seja, sujeita a um qumico
que remove toda a cor inata do tecido ou o torna branco, por processos de oxidao. Este processo tem como
objectivo permitir visualizar a direco do movimento do transporte
intracelular, atravs da observao da perda progressiva de
fluorescncia nessa direco.
Assim esta tcnica requer a
preparao de "clulas"
marcadas com fluorforos,
sendo mais utilizado
actualmente o GFP ou
protenas relacionadas,
especficas para os alvos de
interesse. O bleaching
contnuo da rea de
interesse na clula requer
uma iluminao por laser
precisa e suficiente para
inactivar todos os fluorforos dentro da rea em estudo.
As imagens obtidas ao
longo do tempo (time-lapse) so utilizadas para capturar a perda de
fluorescncia na direco do transporte. Permite, tambm, descrever
o movimento para dentro (FLIP) ou para fora (FLOP) de uma regio
de interesse.
Por outro lado na FRAP, aps a marcao com sonda com
fluorforos, retirada primeiramente uma imagem/fotografia antes de
realizar photobleaching. De seguida direccionada uma fonte de luz para uma pequena rea de interesse, com
um comprimento de onda apropriado. Os fluorforos desta regio so, assim, excitados com uma iluminao
de grande intensidade, perdendo rapidamente o seu tempo de vida. Neste ponto , ento, possvel visualizar a
rea de interesse como um ponto escuro. As sondas marcadas que ainda tm a capacidade de emitir
fluorescncia vo-se difundir na amostra e preencher o espao das sondas que j no tm esta capacidade na
rea seleccionada.
Informaes obtidas por Tempo de Vida Fluorescente
As imagens obtidas por tempo de vida (de Fluorescncia) atravs de Microscopia ou FLIM (Fluorescence
Lifetime Imaging Microscopy) tm como base a aplicao de mltiplas cores com marcadores fluorescentes
para a observao da distribuio celular de molculas biolgicas como as protenas, lpidos, cidos nucleicos e
ies, entre outros. Cada marcador fluorescente apresenta um tempo especfico de durao para a emisso de
fluorescncia no seu estado excitado. Detectando as diferenas nesse tempo possvel distinguir fluorocromos
que emitem fluorescncia no mesmo comprimento de onda, assim como casos nos quais exista
autofluorescncia. Este tipo de anlise permite ainda obter informao sobre molculas numa clula viva tendo
em considerao todos os factores conhecidos que afectam a sobrevida da fluorescncia, como por exemplo,
intensidade inica, propriedades hidrofbicas, concentrao de oxignio, Photobleaching e intensidade da luz.
Estabelecendo a relao entre estes factores e a durao da emisso de fluorescncia possvel calcular a
concentrao inica e analisar a FRET.
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Microscopia Multifoto (Multifoton)
Esta tcnica uma poderosa ferramenta de investigao, que combina Microscopia Confocal com fluorescncia
multifotnica de longo comprimento de onda, permitindo a obteno de imagens tridimensionais de alta
resoluo, de alvos marcados com fluorocromos muito especficos.
Deste modo, a tcnica consiste na marcao da amostra biolgica em estudo, com uma ou mais sondas
fluorescentes antes de ser examinada no microscpio. No entanto, apesar deste passo de marcao com
sondas afectar inevitavelmente o espcimen biolgico de alguma forma, extremamente importante e necessrio
pois os tecidos/estruturas tecidulares no possuem contraste suficiente para serem visualizadas. Uma nica fonte
de luz (laser) possui energia suficiente para excitar um electro nas sondas fluorescentes, caso tenha um
comprimento de onda adequado. Assim sendo, possvel conjugar vrios lasers que emitem em comprimentos
de onda inferiores, mas cujo somatrio permite a excitao de um electro. Deste modo, apenas so excitados
os electres que se encontram no ponto de interseco dos lasers e que so especficos para esse comprimento
de onda (somatrio dos comprimentos de onda de cada laser).
Protenas Fluorescentes e Bioluminiscentes
No estudo da biologia celular e da medicina, a GFP, as suas variantes genticas e de espectro de cor (YFP -
Yellow; CFP - Cyan; BFP - Blue; dsRFP - Red), a luciferase e a aequarina, tm-se mostrado bastante
relevantes no estudo da posio ou movimento de componentes celulares (protenas, genes e estruturas
celulares), variaes das concentraes inicas intracelulares, bem como na deteco da adenosina trifostato
(ATP). A importncia da GFP encontra-se relacionada com o facto de o gene no qual tem origem, quando
isolado, poder expressar a protena noutros organismos vivos.
Preparao de Amostras Biolgicas
Como em qualquer tcnica laboratorial que envolva a anlise de amostras biolgicas imprescindvel ter em
considerao quais os mtodos de preparao ideais. No caso da Microscopia Confocal as amostras podem
ser organismos vivos, culturas celulares, amostras fixadas, cortes histolgicos de rotina, sendo as tcnicas
adequadas ao tipo de amostra e procedimento.
A fixao, tambm nesta tcnica, deve estabelecer um equilbrio com a manuteno da antigenicidade, sendo
que o fixador mais comum o Paraformaldedo a 4% tamponado, utilizado a uma temperatura de 4C. O
Formol comercial possui, na sua constituio, Metanol (6-15%) e outras impurezas que podem afectar a
fixao e, consequentemente a tcnica.
A amostra deve ser submersa em fixador com ligeira agitao, sendo que os tecidos que se encontram
osmoticamente activos podem apresentar algumas alteraes morfolgicas (retraco ou expanso tecidual).
A espessura dos cortes histolgicos depende da distncia de trabalho de cada alvo, da penetrabilidade do
anticorpo ou do fluorocromo utilizado para colorao e das propriedades de transparncia do tecido que forma
a amostra. O tempo de observao deve ser limitado, uma vez que os radicais livres que so produzidos
durante o tempo de excitao dos fluorocromos danificam as clulas e tecidos no fixados.
As amostras devem ser protegidas da luz, analisadas rapidamente e armazenadas no frio.
Riscos
Tendo em conta os reagentes utilizados nas tcnicas de Microscopia Confocal (fluorocromos, DAPI, meios de
cultura, fixadores, entre outros) consideram-se mltiplos riscos, tais como, inflamveis, nocivos, irritantes,
txicos e cancergenos.
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Vantagens e Desvantagens
Como todas as tecnologias, a Microscopia Confocal apresenta diversas vantagens e desvantagens.
Vantagens Desvantagens
Imagens multidimensionais Elevado custo
Seccionamento ptico
Nmero limitado de ondas de excitao disponveis
com lasers comuns
Melhor contraste que a microscopia de luz convencional
Carcter nocivo da radiao laser de alta
intensidade
Melhor resoluo que a microscopia de luz convencional Carcter nocivo das clulas e tecidos vivos
Observao da clula viva sem destruio
Estudo de variaes inicas em clulas vivas
Observao de tecidos em tempo real
Observao de clulas vivas sem fixao ou artefactos
de seccionamento fsico
Alta resoluo
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Ligaes externas
The Neural Circuit for Touch Sensitivity in Caenorhabditis elegans
(http://www.jneurosci.org/cgi/reprint/5/4/956) Possivelmente o primeiro artigo sobre C. elegans aps
se observar os seus embries atravs do Microscpio Confocal (em ingls)
Centrosome Movement in the Early Divisions of Caenorhabditis elegans: A Cortical Site
Determining Centrosome Position (http://www.jcb.org/cgi/reprint/109/3/1185.pdf) Artigo Cientfico
sobre embries de C. elegans (em ingls)
Photobleaching (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/photobleaching/) - Ficheiro em
JAVA que explica o fenmeno de Photobleaching (em ingls)
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Categoria: Microscopia
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