Instituto Superior Tcnico

Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica 2 Ano

Bioqumica e Biologia Molecular


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Turma D - Grupo 1:

ngelo Dias, n 65087
Mrcia Santos, n 65111
Mariana Branco, n 65112
30 Outubro de 2009
Prof.: Jorge Leito
2


Fig. 2 - Projeces de Fisher das
formas D e L do glicerdeo.
Resumo
A invertase catalisa a hidrlise da sacarose nos seus monmeros constituintes. Deste modo, na
actividade laboratorial, procedeu-se caracterizao cintica da invertase (beta-fructofuranosidase) a
partir do estudo do efeito da concentrao de sacarose (substrato) na actividade da enzima, em seis
ensaios. Analisados os resultados obtidos e recorrendo equao de Lineweaver-Burk obteve-se

.

Introduo terica
Hidratos de Carbono
Os hidratos de carbono so compostos ternrios de carbono, hidrognio e oxignio, com frmula
emprica

(podendo ).
As suas unidades estruturais so os
monossacardeos ou oses, classificados de
acordo com o nmero de carbonos da
molcula (por exemplo, um monossacardeo
de cinco carbonos denomina-se pentose) e
que possuem vrias funes lcool e uma
funo redutora, aldedo ou cetona. Se a
funo carbonlica for um aldedo, como na
glucose, o monossacardeo denomina-se
aldose, se for uma cetona, como na frutose,
designa-se cetose (Fig.1).
No que diz respeito isomeria, temos de ter em conta que o
gliceraldedo possui um tomo de carbono assimtrico ou quiral,
apresentando duas configuraes: D e L, de acordo com as Projeces de
Fisher. Assim, as letras D e L referem-se configurao do penltimo
tomo de carbono do extremo da cadeia oposto ao grupo carbonilo, ou
seja, se o grupo OH estiver do lado direito temos uma forma D, caso
esteja do lado esquerdo L (Fig.2).
Contudo, em soluo aquosa, e portanto no metabolismo, os
monossacardeos esto, maioritariamente, ciclizados. A ciclizao
ocorre, aps hidratao, atravs da eliminao de uma molcula de
gua entre o OH que ficou ligado ao carbono 1 das aldoses (ou o
carbono 2 das cetoses) e o OH ligado ao penltimo ou ao antepenltimo carbono da estrutura, formando-
se um hemiacetal. De acordo com a posio do segundo OH envolvido, tratar-se- de uma forma piranose
ou furanose (Fig.3).
Fig. 1 - Funo aldedo e funo cetona.
3



Na representao cclica encontramos mais um carbono assimtrico (1 para as aldoses e 2 para as
cetoses). Conforme a posio, na projeco de Fisher, do oxidrilo ligado a esse carbono do mesmo lado
ou do lado contrrio ao do oxidrilo que determina a classificao em D ou L teremos,
respectivamente, o ismero ou o ismero . Na representao cclica de Tollens, e para as formas D, os
ismeros so aqueles em que o oxidrilo ligado ao carbono antissimtrico est direita, enquanto que
os ismeros so representados com este oxidrilo esquerda. Para a representao cclica de Haworth
os grupos oxidrilo que esto direita na representao de Tollens, so representados para baixo e os que
figuram esquerda so representados para cima (Fig.4).






Os monossacardeos podem ainda estabelecer ligaes
entre si denominadas glicosdicas (Fig.5), de origem
covalente, originando polissacardeos, classificados de
acordo com o nmero de monossacardeos que os
constituem (por exemplo, a ligao de trs
monossacardeos origina um trissacardeo). No que diz
respeito aos polissacardeos destacam-se trs
particularmente importantes: o amido, o glicognio e a
celulose. O amido a forma de reserva glucdica nos
vegetais e o glicognio a forma equivalente nos animais. A
celulose a substancia responsvel pela estrutura das
paredes celulares dos vegetas e no hidrolisvel pelas
enzimas presentes no nosso sistema digestivo.


Fig. 5 - Ligao glicosdica
Fig. 3 - Ciclizao e formao hemiacetal
Fig. 4 - Representao de Haworth
4


Enzimas
As enzimas so protenas de grandes dimenses especializadas na catlise de reaces biolgicas, isto
, aceleram a velocidade de reaco diminuindo a energia de activao. Podem ser totalmente proteicas
ou constitudas por uma parte proteica (apoenzima) e outra parte no proteica, os cofactores. Estes
ltimos podem ser ies metlicos, grupos prostticos ou coenzimas e so responsveis pela
transformao estrutural do substrato.
Apesar de participarem nas reaces, as enzimas no alteram o equilbrio das mesmas e encontram-se
inalteradas no final da reaco.
Estes biocatalisadores so compostos por um centro activo ou sitio activo que constitudo pelos
aminocidos que esto em contacto com as molculas (substrato) que sero catalisadas. Este local divide-
se em local de fixao onde a enzima se liga ao substrato por ligaes fracas e em centro cataltico no qual
o substrato sofre a reaco qumica.
As enzimas no reconhecem todas as molculas, pelo contrrio, eles reconhecem especfica e
selectivamente os seus substratos entre todas as outras molculas. Esta especificidade controlada por
um encaixe nico entre enzima e substrato.
Existem dois modelos para a interaco enzima-substrato: o modelo chave-fechadura, e o modelo de
encaixe induzido. O primeiro assume que somente um substrato com uma conformao apropriada
consegue encaixar-se no centro activo da enzima. Ao contrrio, no modelo do encaixe induzido a enzima
molda o seu centro activo a fim de conseguir um encaixe com a molcula.
O trabalho enzimtico pode ser regulado atravs de inibidores e/ou activadores- regulao alostrica-
o que pode ser benfico do ponto de vista da poupana energtica dos organismos.

A classificao das enzimas baseia-se no tipo de reaco que catalisam, dividindo-se assim em seis
categorias:
Oxiredutases;
Transferases;
Hidrolases;
Liases;
Isomerases;
Ligases.

Das hidrolases faz parte a enzima invertase ou beta-fructofuranosidase
(EC 3.2.1.2.6), responsvel pela hidrlise da sacarose nos seus monmeros
constituintes, a glucose (acar redutor) e a frutose. Por definio, uma
unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mmol de sacarose a glucose e frutose
por minuto a pH=4.6 e a 25C.
Uma grande quantidade de microorganismos produz invertase (Fig.6),
contudo comercialmente biosintetisada atravs da Sacharomices cerevisae
ou da Sacharomices carlsbergensis. Contrariamente maioria das enzimas, a
invertase tem uma elevada actividade no intervalo de pH 3.5-5.5 com um pH
ptimo em 4.5 e um mximo de actividade a aproximadamente 60C. Esta
enzima utilizada principalmente na indstria alimentar onde a frutose
preferida em relao sacarose, porque mais doce e no cristaliza to
facilmente. Uma outra utilizao da invertase na produo de mel artificial.
Fig. 6 Enzima invertase.
5


Aps uma hidrlise de sacarose para se poder determinar a quantidade de glucose presente numa
soluo utiliza-se reagente DNS e a tcnica de espectofotometria. O cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) na
presena de um acar redutor, a glucose, reduzido por este a 3-amino-5-nitrosalicilico que apresenta
uma cor laranja/vermelho. Finalmente, com o espectofotometro possvel determinar a absorvncia que
permite calcular a concentrao do acar redutor por intermdio de um grfico de ajuste linear que
relacione estas duas grandezas.

Cintica Enzimtica
A actividade enzimtica pode ser avaliada atravs de vrios modos, por exemplo com base na
actividade molar, ou seja o nmero de moles de substrato transformado por mole de enzima por unidade
de tempo, ou at por unidade enzimtica, que a quantidade de enzima que catalisa a transformao de
um micromole de subtrato num minuto, a 25C, nas condies ptimas de pH e concentrao de
substrato. Assim podem-se obter grficos substrato transformado em funo do tempo, nos quais se
conclui que existe uma dependncia linear entre a velocidade inicial de uma reaco enzimtica e a
concentrao de enzima na reaco.
Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relaes, apresentando em
1913 um estudo quantitativo das variaes da velocidade de uma reaco de acordo com o aumento da
concentrao de substrato na mesma (Fig.7). Assim, atravs da equao

, em
que E a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato. Do estudo desta reaco surge a
constante de Michaelis

, que uma constante de equilbrio para a dissociao do

complexo E-S, onde [E] a concentrao de enzima livre, [S] a concentrao de substrato e [E-S] a
concentrao de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expresso de

[E]=[E
0
]-[E-S], fica

.
Como se tinha observado que velocidade da reaco era
directamente proporcional concentrao de enzima
ligada, significava que

(E
0
a
concentrao total de enzima ligada ao substrato, e
velocidade mxima corresponde a do momento em que
todas as enzimas esto ligadas ao substrato) e, portanto,

, que substituindo na expresso de

fica

. Esta equao, denominada Equao de

Michaelis Menten permite no s obter o valor de
como tambm de

(valores estes compreendidos entre

10
-8
M e 10
-2
M). Note-se que esta constante permite medir a
afinidade da enzima para o substrato, que igual a 1/

, ou
seja, se a afinidade for elevada

baixo, sendo necessria

uma baixa concentrao de substrato para se atingir a
velocidade mxima.
Mais uma vez, obtendo um grfico que relacione a velocidade da reaco com a concentrao de
substrato, deduz-se que se

, ento

=[S], por outras palavras

igual concentrao de
substrato para qual a velocidade igual a metade da velocidade mxima.
Fig. 7 Grfico Que relaciona Velocidade da
reaco com a concentrao de substrato.
6


Fig. 8 Grfico que traduz a equao de
Lineweaver e Burk
Fig. 9 Efeito da temperatura na actividade enzimtica.
Fig. 10 Efeito do pH na actividade enzimtica.
Por serem equaes e grficos que no eram lineares,
Lineweaver e Burk foram os primeiros a descobrir que bastava
inverter os valores de da concentrao de substrato e da
velocidade, para que os clculos se tornassem mais fceis e
simples, exigindo menos leituras experimentais. Por isso,
isolando

no primeiro membro da equao de Michaelis-

Menten vem

, designada por
equao de Lineweaver-Burk. Note-se por fim, que se 1/v = 0
ento temos o valor de -1/

e se 1/[S] = 0 corresponde a
1/vmax, que so os valores necessrios para estudar a
actividade cintica das reaces enzimticas (Fig.8).

Influncia da temperatura e do pH na actividade enzimtica
A velocidade da reaco enzimtica condicionada
por diversos factores, entre os quais o pH e a
temperatura do meio em que se d a reaco. Por um
lado, a velocidade de todas as reaces aumenta com o
aumento da temperatura, sendo as reaces
endergnicas as mais favorecidas. Ao aumentarmos a
temperatura aumentamos a constante de equilbrio, e
por conseguinte a velocidade da reaco. No entanto, a
partir de um determinado valor de temperatura a
protena enzimtica comea a desnaturar, diminuindo a
sua actividade. Verifica-se ento que existe uma
temperatura ptima para qual a reaco tem velocidade
mxima, e corresponde a um compromisso entre a temperatura que favorece a reaco e a temperatura
de desnaturao da enzima.
Por outro lado temos o pH do meio, o qual
influencia directamente a reaco enzimtica. Assim,
pH extremos (bsicos ou cidos) modificam
irreversivelmente a estrutura da enzima,
desnaturando-a ou modificando a ligao entre
apoenzima (parte no proteica do enzima equivalente
aos cofactores orgnicos) e coenzima (parte proteica
da enzima). O pH influencia tambm o estado de
ionizao do substrato e dos aminocidos do centro
activo em geral.

Absorvncia
A absorvncia uma propriedade que mede a capacidade de um material de absorver radiao com
uma frequncia especfica, avaliada atravs de aparelhos designados por espectrofotometros, que se
baseiam na propriedade que muitas espcies tm de absorver radiao ultravioleta e visvel.
7


Fig. 11 Absorvncia de um substncia de
concentrao c e coeficiente de absoro .
A absorvncia, para um determinado comprimento de onda,
dada por

, em que I a intensidade de luz que

atravessa a soluo no espectrofotometro e I
0
a intensidade
de luz inicial incidente na amostra. uma grandeza
adimensional por ser o quociente de duas intensidades. Uma
das relaes mais importantes da absorvncia para a qumica
atravs da Lei de Beer, que diz que a absorvncia
directamente proporcional concentrao da amostra. Por
outra palavras, , onde l (em cm) distncia que a luz
percorre dentro da amostra, c (em mol L
-1
) a concentrao da
amostra e o coeficiente de absoro molar (em L mol
-1
cm
-1
)
da substncia.
Finalmente, assinala-se que a linearidade entre a absorvncia e concentrao limitada por diversos
factores qumicos e instrumentais, tais como: disperso da radiao devido presena de partculas na
soluo ou desvios nos coeficientes de absoro molar devido a interaces intermoleculares entre
molculas muito prximas, a utilizao radiao no totalmente monocromtica e possibilidade de
fluorescncia da amostra, assim como alteraes do ndice de refraco das cuvetes e alteraes no
equilbrio das solues analisadas.





8


Procedimento


Material:

Foi utilizado material comum de laboratrio, tais como pipetas de preciso, copos de vidro, tubos de
ensaio, suportes e espectrofotometro.

Procedimento experimental:

A experincia consiste na caracterizao cintica da
enzima invertase, e como tal estudou-se o
comportamento da enzima em solues com
diferentes concentraes de sacarose: 15, 30, 45, 60,
75 e 100 g/l. Uma vez que para cada concentrao o
procedimento igual, apenas se vai descrever para
uma.
Comeou-se por numerar 9 tubos de ensaio de 0 a 7
e um branco e colocar num suporte para tubos de
ensaio. Colocou-se 500 l de DNS (Fig.12, lado
esquerdo) em todos os tubos de ensaio com uma
pipeta de preciso, adicionando-se no final 500 l de
Tampo de acetato (Fig.12, lado direito),
exclusivamente no tubo de ensaio branco, tapando
com uma tampa solta e agitando no vrtice (Fig.13,
Azul).
Iniciou-se a experincia pela concentrao mais
baixa de sacarose, 15 g/l, em que se colocou 25 ml de
soluo de sacarose no vaso reaccional, com agitador,
em contacto com o thermomix, aparelho encarregue
de termostatizar a soluo temperatura ptima de
45C para a enzima actuar (Fig.13, Amarelo e Verde).
No tubo 0 depositaram-se 500 l de sacarose,
correspondente ao instante 0 exactamente antes da
enzima actuar (retirou-se sacarose do vaso reaccional
antes de se colocar a enzima), tapou-se o tubo e
agitou-se no vrtice.
Seguidamente preparou-se os cronmetros para
iniciar a contagem no momento em que se adiciona ao
vaso reaccional 500 l de soluo de enzima invertase.
Ao fim de cada minuto retirou-se 500 l de soluo
sacarose+invertase e colocou-se no tubo de ensaio
respectivo (1 minuto corresponde ao tubo n 1),
tapando e agitando tambm no vrtice (Fig.14).
Fig. 12 Frasco de DNS e Tampo de acetato.
Fig. 13 Vaso reaccional (Amarelo), thermomix
(Verde), vrtice (Azul).
Fig. 14 Tubo de ensaio numerados de 0 a 7, e
um branco, quase no final da contagem dos 7
minutos.
9




Electroforese:














































Repetiu-se o procedimento at ao minuto 7,
momento a partir do qual se colocaram os tubos de
ensaio num suporte, dentro de uma panela com gua a
ferver durante 5 minutos, a fim de promover a reaco
entre o DNS e os acares redutores (Fig.15).
Findos os 5 minutos colocaram-se os 9 tubos em gelo
(Fig.16) durante mais 3 minutos, e finalmente adicionou-
se 5 ml de gua destilada em cada tubo para diluir a
soluo.
Neste momento o grupo de alunos dividiu-se em dois,
uns iniciaram novamente o procedimento anterior para
outra concentrao de sacarose, e os restantes foram ler
os valores de absorvncia no espectrofotometro a
540nm (valor mximo de absorvncia para os compostos
alaranjados Fig.17 formados por DNS e acares
redutores). Para isso, utilizou-se uma clula fotomtrica
ou cuvete para colocar a soluo de cada tubo, uma de
cada vez. Primeiro utilizou-se a clula com soluo do
tubo de ensaio branco, para calibrar a mquina,
colocando-a no espectrofotometro nunca esquecendo
de por as faces lisas viradas para os locais onde a luz iria
incidir. Entre cada medio lavou-se a cuvete com a nova
soluo do tubo seguinte, para certificar que os valores
obtidos seriam os mais correctos (Fig.18).
Depois de repetido o protocolo 6 vezes, para cada
concentrao de sacarose, reuniram-se os dados sobre
absorvncia e trocaram-se valores entre os grupos.

Fig. 16 Tubos de ensaio em gelo durante 3
minutos.
Fig. 15 Tubos de ensaio na panela durante 5
minutos.
Fig. 17 Aspecto das solues depois de
promovida a reaco com DNS.
Fig. 18 Medio das absorvncias no
espectrofotometro.
10


43,167
188,167
331,5
446,5
659,833
801,5
941,5
1078,167
y = 150,42x + 34,833
R = 0,9973
0
200
400
600
800
1000
1200
0 2 4 6 8
[
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e
s
]

(
m
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/
l
)
Tempo decorrido (min)
15g/l
103,167
358,167
674,833
668,167
843,167
1026,5
1216,500
1333,167
y = 168,23x + 189,14
R = 0,9737
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 2 4 6 8
[
A

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s

r
e
d
u
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r
e
s
]

(
m
g
/
l
)
Tempo decorrido (min)
30g/l
Resultados Experimentais

Apresentam-se as tabelas e os grficos construdos a partir dos valores registados e dos clculos
efectuados. Primeiramente os grficos de acares redutores em funo do tempo decorrido, para cada
uma das seis concentraes estudadas. De seguida construiu-se o grfico do inverso da velocidade em
funo do inverso da concentrao.

Concentrao: 15g/l











Concentrao: 30g/l



Tempo
decorrido
(min)
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0 0,016 43,167
1 0,103 188,167
2 0,189 331,500
3 0,258 446,500
4 0,386 659,833
5 0,471 801,500
6 0,555 941,500
7 0,637 1078,167
Tabela 1 - Valores de absorvncia, tempo e
concentrao de acares redutores para a
concentrao inicial de 15g/l.
Tempo
decorrido
(min)
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0 0,052 103,167
1 0,205 358,167
2 0,395 674,833
3 0,391 668,167
4 0,496 843,167
5 0,606 1026,500
6 0,720 1216,500
7 0,790 1333,167
Grfico 1 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de
uma concentrao inicial de 15g/l de sacarose.
Grfico 2 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de
uma concentrao inicial de 30g/l de sacarose.
Tabela 2 - Valores de absorvncia, tempo e
concentrao de acares redutores para a
concentrao inicial de 30g/l.

11


134,833
324,833
523,167
754,833
973,167
1201,5
1433,167
1786,5
y = 230,44x + 84,972
R = 0,9933
0
500
1000
1500
2000
0 2 4 6 8
[
A

c
a
r
e
s

r
e
d
u
t
o
r
e
s
]

(
m
g
/
l
)
Tempo decorrido (min)
45g/l
181,5
389,833
573,167
764,833
948,167
1124,833
1319,833
1518,167
y = 188,63x + 192,33
R = 0,9997
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 2 4 6 8
[
A

c
a
r
e
s

r
e
d
u
t
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r
e
s
]


(
m
g
/
l
)
Tempo decorrido (min)
60g/l
Concentrao: 45g/l









Concentrao: 60g/l













Tempo
decorrido
(min)
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0 0,071 134,833
1 0,185 324,833
2 0,304 523,167
3 0,443 754,833
4 0,574 973,167
5 0,711 1201,500
6 0,850 1433,167
7 1,062 1786,500
Tabela 3 - Valores de absorvncia, tempo e
concentrao de acares redutores para a
concentrao inicial de 45g/l.
Tempo
decorrido
(min)
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0 0,099 181,5
1 0,224 389,833
2 0,334 573,167
3 0,449 764,833
4 0,559 948,167
5 0,665 1124,833
6 0,782 1319,833
7 0,901 1518,167
Tabela 4 - Valores de absorvncia, tempo e
concentrao de acares redutores para a
concentrao inicial de 60g/l.
Grfico 3 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de
uma concentrao inicial de 45g/l de sacarose.
Grfico 4 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma
concentrao inicial de 60g/l de sacarose.
12


174,833
421,5
613,167
784,833
983,167
1246,5
1479,833
1598,167
y = 206,59x + 189,69
R = 0,996
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 2 4 6 8
[
A

c
a
r
e
s

r
e
d
u
t
o
r
e
s
]

(
m
g
/
l
)
Tempo decorrido (min)
75g/l
476,5
686,5
901,5
1068,167
1206,5
1486,5
1651,5
1713,167
y = 183,04x + 508,17
R = 0,9895
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 2 4 6 8
[
A

c
a
r
e
s

r
e
d
u
t
o
r
e
s
]


(
m
g
/
l
)
Tempo decorrido (min)
100g/l
Concentrao: 75g/l










Concentrao: 100g/l



Tempo
decorrido
(min)
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0 0,095 174,833
1 0,243 421,5
2 0,358 613,167
3 0,461 784,833
4 0,580 983,167
5 0,738 1246,5
6 0,878 1479,833
7 0,949 1598,167
Tabela 5 - Valores de absorvncia, tempo e
concentrao acares redutores para a
concentrao inicial de 75g/l.
Tempo
decorrido
(min)
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0 0,276 476,500
1 0,402 686,500
2 0,531 901,500
3 0,631 1068,167
4 0,714 1206,5
5 0,882 1486,500
6 0,981 1651,500
7 1,018 1713,167
Tabela 6 - Valores de absorvncia, tempo e
concentrao de acares redutores para a
concentrao inicial de 100g/l.
Grfico 5 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de
uma concentrao inicial de 75g/l de sacarose.
Grfico 6 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de
uma concentrao inicial de 100g/l de sacarose.
13


0,00648
0,00594
0,00434
0,00530
0,00484
0,00546
y = 26,563x + 0,0047
R = 0,5377
0,0E+0
1,0E-3
2,0E-3
3,0E-3
4,0E-3
5,0E-3
6,0E-3
7,0E-3
0,0E+0 1,0E-5 2,0E-5 3,0E-5 4,0E-5 5,0E-5 6,0E-5 7,0E-5 8,0E-5
1
/
V
e
l
o
c
i
d
a
d
e

(
(
l
.
m
i
n
)
/
m
g

g
l
u
c
o
s
e
)
1/[Sacarose] (l/mg sacarose)
Lineweaver-Burk
Lineweaver-Burk













[Sacarose]
(g/l)
[Sacarose]
(mg/l)

(l/mg)
Velocidade
(mg/(l.min))

((l.min)/mg)
15

150,42

30

168,23

45

230,44

60

188,63

75

206,59

100

183,04

Tabela 7 - Concentraes de sacarose e velocidades.
Grfico 7 - Grfico de Lineweaver-Burk para a experincia realizada.
14


Clculos

A partir dos valores de absorvncia medidos no espectofotmetro e da equao de ajuste do grfico
de absorvncia em funo da concentrao de acares redutores: dado,
retiraram-se as concentraes de acares redutores, substituindo em os valores de absorvncia e
resolvendo em ordem a .
Recorrendo Equao de Lineweaver-Burk,

deduzida no Fundamento Terico e notando que

corresponde ordenada na origem do grfico 7,

construdo com os valores experimentais e que

corresponde ao declive. Substituindo vem:

, tendo em conta
que a massa molar da glucose 180,16 g/mol.

, tendo
em conta que a massa molar sacarose 342,296 g/mol.

15


Discusso

Atravs da anlise e comparao dos valores de absorvncia determinados pelo espectofotmetro,
verificou-se, tal como espectvel, que a concentrao glucose resultante da hidrlise da sacarose,
aumentou com o decorrer do tempo. Todavia, a correspondncia do tempo com a concentrao de
glucose no est totalmente correcta, visto que a partir do momento que retirada a soluo do vaso
reaccional at esta ser colocada no tubo em contacto com a soluo tampo de acetato decorrem alguns
segundos, durante os quais a enzima invertase continua a actuar. Assim, as concentraes
correspondentes aos tempos das tabelas sero um pouco mais baixas que aquelas que esto
apresentadas.
A variao da concentrao de produtos em funo do tempo apresenta uma correlao
aproximadamente linear, no entanto teoricamente os valores de concentrao deveriam tender, aps um
intervalo de tempo suficientemente grande, para o valor de concentrao inicial de sacarose. Como os
valores de concentrao de glucose ao final de sete minutos so muito inferiores ao seu valor final, os
grficos acima construdos no permitem chegar a essa concluso.
A partir do grfico de Lineawer-Burk construdo para esta experincia verifica-se que, apesar de alguns
valores estarem relativamente em desacordo com o expectvel (longe da recta de ajuste ou decrescerem
ao invs de crescerem) o seu declive positivo, donde se conclui que, na generalidade, um aumento da
concentrao de substrato corresponde a um aumento na velocidade. Idealmente, medida que a
concentrao de substrato aumenta, a velocidade deveria aumentar. Porm, os resultados obtidos
distanciam-se ligeiramente da cintica enzimtica descrita por Lineweaver-Burk, evidenciando os erros
sistemticos e acidentais presentes na realizao do trabalho laboratorial.
O valor de K
M
calculado (

M) est dentro do limite terico previsto (10

-8
a 10
-2
M, como
explicitado no Fundamento Terico). Contudo, no existem valores de referncia que permitam comparar
os valores de velocidade mxima da reaco e de K
M
, pelo que no se pode inferir quanto aos erros
analticos cometidos, nem exactido dos resultados experimentais. Note-se ainda que este valor,
16,5mM, corresponde concentrao para a qual, a velocidade da reaco metade da velocidade
mxima.
Os erros dos resultados obtidos advm de diversos factores. No s das condies ambientais do
laboratrio, como a temperatura e presso, mas tambm as condies do meio de cultura influenciam,
tanto positiva como negativamente, a reaco. Alm disso, a determinao da concentrao das solues
por espectofotometria indirecta (relembre-se que foi feita atravs da equao do grfico dado),
podendo apresentar erros que influenciam directamente a aplicao da equao de Lineweaver-Burk.


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Bibliografia

FIALHO, Arsnio; MOREIRA, Leonilde; TAVARES, lvaro; LEITO, Jorge; MATEUS, Marlia; S-
CORREIA, Isabel; Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioqumica e Biologia Molecular, Instituto
Superior Tcnico, 1 Semestre, 2008/2009, pg. 10 - 12;

CAMPOS, Lus S.; Entender a Bioqumica (5.Ed.) , 2009, Escolar Editora, Lisboa, pg. 153 161,
241 249, 258 - 260;

G. M. Copper, R. E. Hausman, The Cell, a molecular approach (4 Ed.) , 2007, ASM Press-Sinauer-
Associates Inc., Washington, D.C., pg. 44 46, 73 - 80;

Diapositivos das aulas tericas de Bioqumica e Biologia Molecular, FIALHO, Arsnio, aulas 6,7 e 8;

http://plato.if.usp.br/1-2004/fap0181d/Lei%20de%20Beer.htm, visitado em 31 de Outubro 2009;

http://virtualabs.ist.utl.pt/ERI/cine.html, visitado em 31 de Outubro 2009;

http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?Itemid=201&id=96&option=com_content&task=
view, visitado em 31 de Outubro 2009;

http://www2.dq.ua.pt/qne/doc/AL1.5_Colorimetria.pdf, visitado em 31 de Outubro 2009;