UNIVERSIDAD DEL ISTMO

OBTENCIN DE BIOETANOL A PARTIR DEL MANGO

CRIOLLO DEL ISTMO DE TEHUANTEPEC


TESIS

PARA OBTENER EL TITULO DE
INGENIERO QUMICO

PRESENTA

SANTIAGO ESTEVA GUTIRREZ


DIRECTOR DE TESIS

DRA. PASTORA SALINAS HERNNDEZ




SANTO DOMINGO TEHUANTEPEC OAXACA, JUNIO DE 2009


AGRADECIMIENTO

Despus de haber estado escribiendo un documento estructurado y formal;
lleg la hora de concluirlo y que mejor manera de acabarlo que agradeciendo por
supuesto y en primer lugar, a Dios, y a todas las personas que, de una forma u
otra, lo han hecho posible

A la Dra. Pastora Salinas Hernndez.

Quien con mucho gusto acepto dirigir el presente trabajo de tesis. As
mismo por su apoyo, asesoras y dedicacin durante la realizacin del mismo.
Gracias tambin por la amistad que me brind durante todo este tiempo.

Al M.Q. Fernando Morales Anzures.

Por su apoyo, asesora, capacitacin y adiestramiento en el manejo y
operacin del cromatgrafo de gases de la UNISTMO. As mismo gracias por sus
comentarios y observaciones aportados a este trabajo, los cuales fueron de gran
importancia para el mejoramiento del mismo.

ii

Al Dr. Alberto Rojas Hernndez.

Profesor investigador de la Universidad Autnoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa, por su apoyo y asesora en la realizacin del presente trabajo.

Al Dr. Jess Hernndez Ventura .

Por su apoyo, asesora y amistad brindada durante el desarrollo del
presente trabajo.

A mis compaeros y amigos:
Francisco Javier
Iris del Carmen
Arqumedes
Wilfrido
Rolando
Jos
Y Javier Alejandro
A quienes les agradezco por la amistad que me brindaron durante la
carrera.
iii

A mis revisores:

Dr. Adrin Efrn Snchez Chacn
M.C. Ricardo Henestroza Orozco
Dr. Isaas Ochoa Landn
Por supuesto y nuevamente al Dr. Jess Hernndez Ventura

Por su tiempo y dedicacin brindados para la revisin detallada del
presente trabajo. Mil Gracias.

No poda concluir mi agradecimiento si antes agradecerle a una persona
muy especial para m, quien desde el momento en que la conoc me brindo no
solamente cario y amor sino tambin su amistad, pero sobre todo su apoyo y
comprensin cuando mas lo necesitaba. A mi novia, la Ing. Guadalupe Morales
Martnez mil gracias.












iv

DEDICATORIA

A mis padres:
Santiago Esteva Martnez
Y Rosa Elena Gutirrez Martnez.

Por brindarme su apoyo y comprensin durante los cinco aos de la carrera,
as como durante la realizacin del presente trabajo. De igual manera por el amor y
cario que han brindado hasta hoy en da.

A mis hermanos:
Jorge Antonio
Dulce Mara
Manuel
Y Orlando Esteva Gutirrez.

Ya que fueron ellos los que con su apoyo y consejos, me motivaron para
seguir siempre hacia delante, a pesar de todo los obstculos que se nos presenta en
la vida.

v

A mi ta y primo:

Juana Gutirrez Martnez
Y Eric Snchez Gutirrez.

Por el apoyo y consejos que me brindaron.

A mis sobrinitos:

Narvazaret de Jess
Y Maria de Phatima Martnez Esteva

A mi abuelo:
+
Alfonso Gutirrez Corts Q.P.D.

A quien le estoy agradecido no solamente por el amor de abuelo que me
brind durante su estancia aqu en la tierra, sino por que fue l, quien con sus
consejos me motivo a luchar por esta anhelada meta, que en algn comienzo lo vi
muy difcil pero no imposible de alcanzarlo.

vi

INDICE GENERAL
Pgina
NDICE DE TABLAS x
NDICE DE FIGURAS xi
NOMENCLATURA xiii
RESUMEN xv
INTRODUCCIN 1

CAPITULO 1
ANTECEDENTES GENERALES
1.1. Biocombustibles. 3
1.2. Bioetanol como combustible. 4
1.3. Produccin de bioetanol. 6
OBJETIVOS 8
JUSTIFICACIN 9

CAPITULO 2
MARCO TERICO
2.1. Generalidades del mango. 11
2.2. Historia de la fermentacin. 12
2.3. Fermentacin alcohlica. 13
2.3.1. Limitaciones del proceso de fermentacin. 17
2.4. Mtodos analticos para compuestos qumicos voltiles. 21
2.4.1. Cromatografa. 22
vii

2.4.1.1. Clasificacin de los mtodos cromatograficos. 24
2.4.1.2. Componentes que forman parte de un
cromatgrafo de gases. 26
2.5. Espectrofotometra ultravioleta-visible (UV-Vis). 29
2.5.1. Ley de Beer Lambert. 30
2.5.2. Eleccin de Unidades para Absortividad y Concentracin. 31
2.5.3. Determinacin espectrofotomtrica directa de la concentracin. 33
2.6. Oxidacin de etanol por Cr (VI). 35

CAPITULO 3
METODOLOGA EXPERIMENTAL
3.1. Obtencin de bioetanol va fermentacin a nivel laboratorio. 38
3.1.1. Reactivos. 38
3.1.2. Equipos. 39
3.2. Procedimiento experimental. 40
3.2.1. Obtencin del jugo de mango. 40
3.2.2. Determinacin de las condiciones ptimas de fermentacin. 40
3.2.2.1. Cantidad de Levadura. 41
3.2.2.2. Relacin A-M (agua-mosto). 43
3.2.3. Fermentacin del mosto, bajo condiciones ptimas (FCO). 43
3.2.4. Determinacin de la concentracin de azcares reductores
totales (ART). 44
3.2.5. Determinacin de la concentracin de etanol producido a lo largo
de la fermentacin del mosto a las condiciones ptimas
viii

encontradas (FCO). 47
3.2.6. Mtodos analticos para compuestos qumicos voltiles. 49
3.2.6.1. Cromatografa de gases. 49
3.2.6.1.1. Anlisis cualitativo de las muestras. 49
3.2.6.1.2. Anlisis cuantitativo de las muestras. 50

CAPITULO 4
RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1. Determinacin de las condiciones ptimas de fermentacin del mosto. 55
4.1.1. Determinacin de la cantidad de Levadura
(Microorganismo fermentador). 55
4.1.2. Determinacin de la relacin A-M (agua-mosto). 56
4.2. Fermentacin del mosto a las condiciones ptimas encontradas (FCO). 58
4.3. Determinacin de la concentracin de etanol producido a lo largo de la
la fermentacin del mosto a las condiciones ptimas encontradas. 61
4.4. pH de fermentacin. 68
4.5. Anlisis por cromatografa de gases. 70
4.5.1. Anlisis cualitativo. 71
4.5.2. Anlisis cuantitativo. 75
CONCLUSIONES 80
GLOSARIO DE TRMINOS 82
BIBLIOGRAFA 85



ix

NDICE DE TABLAS
Pagina.
Tabla 3.1

Nomenclatura utilizada para los sistemas de fermentacin
del mosto.

41
Tabla 3.2 Volmenes agregados a cada uno de los matraces, para
realizar la curva de calibracin del dicromato.

48
Tabla 4.1 Concentracin de los ART presentes al inicio, as como a lo
largo de la fermentacin del mosto, en los sistemas A, B y C.

55
Tabla 4.2 Concentracin de los ART presentes al inicio, as como a
largo de la fermentacin del mosto en los sistemas D, E y F.

57
Tabla 4.3 Concentracin de los ART presentes al inicio, as como a lo
largo de la fermentacin del mosto (Condiciones ptimas 1.0
g/L de Levadura y 70 % en volumen de agua).
59
Tabla 4.4 Coeficiente de absortividad molar en funcin de la
absorbancia del in cromato a 355nm de longitud de onda y
trayecto de celda de 1.0 cm.
64
Tabla 4.5 Resultados obtenidos durante la determinacin de la
concentracin de etanol producido a lo largo de la
fermentacin el mosto (FCO).
66
Tabla 4.6 Concentracin de etanol producido a lo largo del proceso de
fermentacin a las condiciones ptimas encontradas.

67
Tabla 4.7 Tiempos de retencin obtenidos a partir de las inyecciones
de los estndares en forma pura as como en el de la mezcla.

71









x

NDICE DE FIGURAS
Pagina.
Figura 1.1 Diagrama del Proceso de produccin del Bioetanol. 7
Figura 2.1 Representacin esquemtica de un cromatgrafo de gases 26
Figura 2.2 Grafica de intensidad en funcin del tiempo de retencin. 27
Figura 2.3 Grafica de absorbancia en funcin de la concentracin a una
determinada longitud de onda A

.
35
Figura 3.1 Programa de temperatura del horno de la columna.

51
Figura 3.2. Curva de adiciones estndar.

52
Figura 4.1 Perfil de concentracin de los azucares reductores totales a
lo largo de la fermentacin del mosto (FCO), seguido por el
mtodo del reactivo de Fehling.
60
Figura 4.2 Espectros de absorcin del in cromato, obtenidos a partir
de la disolucin de dicromato de potasio a diferentes
concentraciones.
62
Figura 4.3 Grfica de absorbancia del in cromato en funcin de la
concentracin del dicromato de potasio a la longitud de onda
de 355 nm.
63
Figura 4.4 Grafico de la concentracin de etanol producido a lo largo de
la fermentacin del mosto a las condiciones ptimas
(condiciones ptimas 1.0 g/L de levadura y 70 % en volumen
de agua).

68
Figura 4.5 Grfica de pH de fermentacin del mosto a las condiciones
ptimas 1.0 g/L de Levadura y 70 % en volumen de agua.
70
Figura 4.6 Cromatgrama obtenido a partir de la inyeccin de la mezcla
de los estndares.
72
Figura 4.7 Cromatgramas obtenidos a partir de las inyecciones de las
muestras de condensados obtenidos durante la destilacin
del mosto fermentado en los sistemas D (30 % en volumen
de agua) (a), E (50 % en volumen de agua) (b) y F (70 % en
volumen de agua) (c).
73
xi


Pagina.
Figura 4.8 Cromatgrama obtenido a partir de la inyeccin de la
muestra de condensado obtenido de la destilacin del mosto
fermentado a las condiciones ptimas.

75

Figura 4.9 Cromatogramas obtenidos durante el anlisis de adiciones
estndar, en los sistemas (a) D, (b) E y (c) F.
76
Figura 4.10 Cromatograma obtenido durante la aplicacin del anlisis de
adiciones estndar.
78

































xii

NOMENCLATURA.

EtOH etanol
MTBE metil ter-butil ter
ETBE etil ter-butil ter
TAME ter-amil metil ter
DIPE di-isopropil ter
CLL Cromatografa lquido-lquido
CLS Cromatografa lquido-slido
CII Cromatografa de intercambio inico
CE Cromatografa de exclusin
CGL Cromatografa gas-lquido
CGS Cromatografa gas-slido
CG Cromatografa de gases
TCD Detector de conductividad trmica
FID Detector de Ionizacin de Flama
SCD Detector de quimioluminiscencia del azufre
ECD Detector de captura de electrones
AED Detector de emisin atmica
FPD Detector de fotomtria de llama
TIP Detector termoinico
Sistema A 1.0 g/L de Levadura y 20 % en volumen de agua
Sistema B 1.62 g/L de Levadura y 20 % en volumen de agua
Sistema C 2.16 g/L de Levadura y 20 % en volumen de agua
A-M relacin agua-mosto
Sistema D 1.0 g/L de Levadura y 30 % en volumen de agua
Sistema E 1.0 g/L de Levadura y 50 % en volumen de agua
Sistema F 1.0 g/L de Levadura y 70 % en volumen de agua
FCO Fermentacin a las condiciones ptimas
ART azucares reductores totales

xiii

V/V volumen por volumen
t
R
tiempo de retencin
nm, mm, cm, m nanmetros, milmetros, centmetros, metros
L, mL, L microlitros, mililitros, litros
g gramos
C grados centgrados
M molar
ADP adenosn difosfato
ATP adenosn trifosfato
































xiv

RESUMEN

En el presente trabajo se realiz la obtencin de etanol a nivel laboratorio,
utilizando Saccharomyces cerevisiae como microorganismo fermentador; a partir
de la fermentacin del jugo de mango (mosto) criollo o conocido comnmente
como mango corriente, del Municipio de Santo Domingo Tehuantepec, Oaxaca.

Para la fermentacin del jugo (mosto), primero se determinaron las
condiciones ptimas, como son la cantidad de levadura (microorganismo
fermentador) y la mejor proporcin de agua (% en volumen) adicionada al mosto,
que permita la filtracin y destilacin del producto final de la fermentacin. A lo
largo del proceso de fermentacin del mosto, a las condiciones ptimas
encontradas, se realizaron las determinaciones de la concentracin de los
azcares reductores totales (ART) presentes en el mosto, la determinacin de la
concentracin de etanol producido y del pH de fermentacin.

Posteriormente, se llevo a cabo el anlisis cualitativo y cuantitativo por
cromatografa de gases, de las muestras de condensado obtenidos durante las
destilaciones del mosto fermentado. En el anlisis cualitativo, se utilizaron los
siguientes estndares metanol, etanol, 2-propanol, acetato de etilo y butanol, ya
que stos, son los posibles compuestos que se pueden producir adems de
etanol, durante el proceso de fermentacin. Para el anlisis cuantitativo de las
muestras se emple el mtodo de las adiciones estndar, utilizndose butanol
como estndar interno.
xv

Los resultados obtenidos durante la determinacin de las condiciones
ptimas, demostraron que tanto la cantidad de levadura como la proporcin de
agua adicionada al mosto, no son tan determinantes en el consumo de los
azcares reductores; sin embargo, se encontr que la proporcin de agua es un
factor importante a considerar en la fermentacin, ya que esta determina la
facilidad con la que se realiza la filtracin y posteriormente la destilacin del
producto final de la fermentacin.

Con lo que respecta a la concentracin inicial y final de los azcares
reductores totales a lo largo de la fermentacin, stos fueron 85.526 g/L y 2.626
g/L, respectivamente; la cantidad total de azucares consumidos a lo largo de este
proceso fue de 82.90 g/L, lo cual representa el 97% de la concentracin inicial.

Los resultados obtenidos del anlisis cualitativo de las muestras de
condensados, demostraron que el tiempo de retencin del nico pico presente en
cada uno de los cromatgramas obtenidos a partir de las inyecciones de estas,
corresponde al tiempo de retencin del etanol puro as como en el de la mezcla,
por lo que se puede decir que nicamente se obtuvo etanol.

En cuanto a los resultados obtenidos durante el anlisis cuantitativo de las
muestras, stos fueron los siguientes: en el sistema D, 0.047 g/mL; en el sistema
E, 0.593 g/mL; en el sistema F, 0.466 g/mL. Mientras que en la muestra de
condensado obtenido durante la destilacin del mosto FCO (fermentado a las
condiciones ptimas) fue, 0.524 g/mL.
xvi

Introduccin
Los incrementos en el precio del petrleo crudo en los ltimos 20 aos han
estimulado considerablemente el inters en la produccin de combustibles a partir
de recursos renovables usando procesos biotecnolgicos. Un importante ejemplo
de esta tendencia es el crecimiento de la demanda de bioetanol (o simplemente
etanol, EtOH), el cual se espera se incremente dramticamente en los siguientes
aos [1, 2].

Por otro lado, uno de los objetivos fundamentales de la mayor parte de los
pases es la conservacin del medio ambiente, por la importancia que esto tiene
para garantizar a la humanidad una mejor calidad de vida en todos los sentidos,
tanto en el presente como en el futuro. Una fuente importante de contaminacin es
el transporte, debido a los gases de escape de los vehculos. Por eso, se realizan
esfuerzos para disminuir estos efectos, entre los que est el uso de etanol
directamente como combustible o en mezclas con gasolina como elemento
oxigenador.

El uso de etanol como oxigenante de la gasolina representa varias ventajas:
mayor contenido de O
2
, lo que permite una mayor combustin de la misma
disminuyendo las emisiones contaminantes de hidrocarburos no oxidados
completamente, no es txico y no contamina las fuentes de agua. [3].



1

Introduccin
Este alcohol se obtiene a partir de la fermentacin de una gran variedad de
materias primas agrcolas, dentro de las cuales se encuentran aquellas con alto
contenido de almidn, material celulsico y azucares. Por ejemplo, el etanol se
obtiene a partir de la caa de azcar en pases tropicales como Brasil e India. En
algunos pases europeos como Francia se utilizan melazas de remolacha
azucarera, mientras que la materia prima para la obtencin de etanol en los
EE.UU. es el Maz [4].

En este trabajo, se utiliz la fruta de mango de la variedad criollo para la
obtencin de etanol, a partir de la fermentacin del jugo (mosto) obtenido de la
trituracin de la misma. El mango, es una de las principales frutas de temporada
en el Municipio de Santo Domingo Tehuantepec, las variedades cultivadas son, el
mango oro, el manila y el criollo o comnmente conocido por los habitantes
como mango corriente, siendo este ltimo el de mayor volumen de produccin,
que se comercializa nicamente dentro de la poblacin, lo cual conduce a un alto
desperdicio del mismo.







2

1
CAPITULO
ANTECEDENTES GENERALES

1.1. Biocombustibles.
Los biocombustibles o biocarburantes son combustibles generados a partir
de biomasa ya sea para propsitos de transporte, generacin elctrica o
calefaccin. Ellos pueden ser producidos a partir de productos agrcolas y
forestales, as como de la porcin biodegradable de desperdicios industriales y
municipales [5]. Estos biocombustibles se dividen en tres tipos, bioetanol, biodiesel
y biogs.

Los beneficios asociados a los biocombustibles se han reflejado en un
creciente nmero de pases, los cuales estn introduciendo o planeando introducir
polticas para incrementar la proporcin de los biocombustibles dentro de su matriz
energtica. Un incremento en el comercio de biocombustibles implicara la
expansin de cultivos en diversos pases. Por un lado, los biocombustibles podran
brindar mayores ganancias econmicas, desarrollo rural y menores emisiones de
gases con efecto invernadero respecto de los combustibles fsiles. Por otro lado,
la produccin de cultivos energticos podra llevar a una expansin de la frontera
agrcola, deforestacin, contaminacin del agua, difusin de organismos
genticamente modificados, entre otros problemas.



3

Antecedentes generales
Una de las grandes barreras al desarrollo a gran escala de los
biocombustibles son sus mayores costos econmicos en comparacin al de los
combustibles convencionales. Algunas estimaciones muestran que el costo de los
biocombustibles es el doble de aquellos de los combustibles fsiles. Sin embargo,
los costos econmicos tienden a variar dependiendo del tipo de biocombustible, el
pas de origen y la tecnologa utilizada. Tambin existen diferencias dependiendo
del tipo de cultivo energtico. El maz, por ejemplo, es ms caro y produce menos
etanol por hectrea que los cultivos tropicales como la caa de azcar que se
cultivan en numerosos pases en desarrollo.

1.2. Bioetanol como combustible.
El bioetanol o simplemente etanol (EtOH), corresponde a uno de los dos
tipos de biocombustibles lquidos, este puede usarse directamente como
combustible o como oxigenante de la gasolina. La gasolina necesita de aditivos
que aumenten su octanaje y as disminuir su capacidad autodetonante,
incrementando su resistencia a la compresin. En la primera mitad del siglo
pasado, se utiliz el tetraetil plomo (C
8
H
20
Pb) como antidetonante, pero, estudios
posteriores sugirieron que por cada litro de gasolina consumida se formaba 1.0 g
de xido de plomo [6]. Fue hasta enero de 1996 que la gasolina con plomo se
prohibi en EE.UU.



4

Antecedentes generales
La adicin de oxigenantes a la gasolina empez en 1979 con el uso de metil
ter-butil ter (MTBE), el cual permite la reduccin en la emisin de compuestos
aromticos (benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos) y de monxido de carbono
(CO) al realizarse una combustin ms completa hasta CO
2
. Sin embargo, el
MTBE tiene baja biodegradabilidad, lo que causa su gran movilidad y se han
encontrado trazas de MTBE en las fuentes de agua naturales y manantiales, por lo
que se ha regulado su uso por otros oxigenantes [7]. Se han explorado otros
aditivos como el etil ter-butil ter (ETBE), el ter-amil metil ter (TAME) y el di-
isopropil ter (DIPE) [8], pero sus propiedades son similares al MTBE [6].

El uso de EtOH como oxigenante de la gasolina representa varias ventajas:
mayor contenido de O
2
(menor cantidad de aditivo requerido), no es txico, reduce
ms las emisiones de CO y no contamina las fuentes de agua [3]. Por otro lado, el
EtOH puede ser utilizado como materia prima en la produccin de ETBE [9].

A nivel mundial, Brasil es el principal productor de EtOH obtenido a partir de
la caa de azcar, seguido por EE.UU. a partir del maz. A travs del programa
Proalcohol [10] en Brasil se ha utilizado el alcohol hidratado como combustible y el
alcohol anhidro como oxigenante. En los EE.UU. hay tambin un programa de
adicin de EtOH a la gasolina que se vio impulsado especialmente por el Clean Air




5

Antecedentes generales
Act Amendments en 1990. De igual manera Francia tiene un programa de
obtencin de EtOH a partir de remolacha azucarera; la oxigenacin de la gasolina
se hace en este pas a travs de la sntesis de ETBE a partir de EtOH [11].

1.3. Produccin de bioetanol.
La variedad de materias primas usadas en la produccin de este
biocombustible va fermentacin son convenientemente clasificados bajo tres tipos
de materias primas agrcolas:
1. sustancias con alto contenido de almidn (maz, trigo, cebada, sorgo
[12], patata, cultivos de raz (legumbres)), los cuales deben primero
ser hidrolizados a azucares fermentables por la accin de enzimas
de malta o mohos.
2. sustancias con alto contenido de celulosa (madera, papel reciclado,
residuos agrcolas), los cuales deben ser convertidos a azucares,
generalmente por la accin de cidos minerales [13].
3. sustancias con alto contenido de azcar (caa de azcar,
remolachas de azcar, melazas, frutas tropicales), los cuales pueden
ser convertidos directamente a etanol.





6

Antecedentes generales
En la figura 1.1 se presenta un diagrama del proceso de produccin de
bioetanol, partiendo de los tres tipos de materias primas mencionados
anteriormente. Normalmente, el proceso de produccin involucra tres etapas. En la
primera etapa, los substratos polimricos son descompuestos a monosacridos.
La segunda etapa involucra la fermentacin microbiana (por bacterias o por
levaduras, en su mayor parte de cepa de Saccharomyces cerevisiae) para
convertir los azucares a alcoholes. Finalmente, el alcohol es recuperado por
destilacin y es purificado en pasos subsecuentes [14].


Figura 1.1. Diagrama del proceso de produccin del bioetanol.



Maz,
Trigo,
Cebada,
Sorgo
Y
Patata
Caa de Azcar,
Remolacha
(Melaza),
Frutas
Tropicales
Madera,
Desperdicios
Forestales,
Residuos
agrcolas
Dilucin
Hidrlisis
Coccin
Molienda
Azcar
Celulosa
Almidones

Bioetanol

Destilacin

Fermentacin

7

Objetivos
Objetivo general.

Obtener el bioetanol a partir de la fermentacin a nivel laboratorio del jugo
(mosto) de mango criollo del Municipio de Santo Domingo Tehuantepec.

Objetivos particulares:
Establecer las condiciones ptimas de fermentacin del mosto
(concentracin del microorganismo fermentador, proporcin agua- mosto).

Determinar la concentracin de glucosa (azcares reductores totales, ART)
presentes en el mosto a lo largo de la fermentacin.

Evaluar la concentracin de etanol producido a lo largo de la fermentacin
del mosto.

Establecer las condiciones de anlisis por cromatografa de gases de las
muestras del destilado.

Separar e Identificar por cromatografa de gases el bioetanol formado
durante la fermentacin del mosto.



8

Justificacin
Sabemos que las reservas de petrleo del planeta son recursos no
renovables y es muy probable que antes que se agoten, la tierra haya alcanzado
un colapso climtico desastroso. Por lo que es de vital importancia buscar formas
alternativas de combustibles, que no daen al medio ambiente y adems que
sean, en lo posible, renovables. Es por eso que los Biocombustibles aparecen
como una alternativa a la que estn apostando algunos sectores. Estos se dividen
en tres tipos, bioetanol o simplemente etanol (EtOH), biodiesel y biogs. El
bioetanol se obtiene a partir de la fermentacin del azcar; el biodiesel a partir de
aceites vegetales y el biogs, se obtiene de la fermentacin anaerbica de los
desechos orgnicos.

En la actualidad, el bioetanol y el biodiesel son producidos alrededor del
mundo, siendo mayor la produccin de bioetanol que de biodiesel. El bioetanol es
producido y consumido mayoritariamente en el continente americano, mientras
que la Unin Europea (UE) es el principal mercado para el biodiesel. El bioetanol
es por mucho la forma ms usada de biocombustible para el transporte en el
mundo [5]. Entre las materias primas agrcolas que comnmente se han utilizado
a nivel mundial para la obtencin de bioetanol se encuentran: la caa de azcar,
melazas de remolacha azucarera y el maz. Sin embargo, es preciso mencionar
que adems de estas materias primas, existen todava una gran variedad, dentro
de las cuales se encuentran: por su alto contenido en azucares, las frutas (ya sea
como fruta fresca o desecho), por mencionar alguno.

9

Justificacin
Por lo que, en el presente trabajo se utiliz la fruta de mango de la variedad
criollo del Istmo de Tehuantepec, Oaxaca. Esto debido no solamente por su alto
contenido de azucares, las cuales son susceptibles de someterse a un proceso de
fermentacin para la obtencin de etanol; si no tambin, como medio de
aprovechamiento de esta fruta, principalmente en estado de madurez que se
desperdicia durante la temporada de produccin en las diferentes huertas
ubicadas en el Municipio de Santo Domingo Tehuantepec, ya que el mango es
consumido nicamente como fruta fresca de temporada y su comercializacin
solamente se realiza localmente.


















10

2
CAPITULO
MARCO TERICO

2.1. Generalidades del mango.
El Mango (Mangifera indica L) [15] es uno de los frutos de mayor
importancia a nivel mundial, ya que ocupa el quinto lugar dentro de los principales
productos frutcolas. Es originario del Noroeste de la India, de la Regin Indo-
Birmnica y las montaas Chittagong en Bangladesh, donde an se le encuentra
en estado silvestre. Se ha cultivado por ms de 4,000 aos en la India, de donde
se dispers a otras reas tropicales y subtropicales del mundo.

En Mxico se introdujo a finales del siglo XVIII, cuando el mango manila
(carabao de Filipinas) fue trado por los espaoles en la Nao de China, desde
Manila al Puerto de Acapulco. Posteriormente a principios del siglo XIX se
introdujeron mangos monoembrinicos desde las Antillas a la Costa del golfo de
Mxico, los que al propagarse por semilla originaron los mangos criollos. Los
viveristas particulares introdujeron en 1950 germoplasmas de algunos cultivares
obtenidos en Florida EE.UU., los cuales se distribuyeron en los estados del
Pacfico, Centro, Norte y despus por la Regin tropical de Mxico. Estos
cultivares fueron: Haden, Tommy Atkins, Kent, Keitt, Irwin y Zill; tambin llamados
como mangos petacones. A nivel nacional los principales estados productores de
mango son Veracruz, Sinaloa, Chiapas, Nayarit, Oaxaca, Michoacn, Tabasco,
Jalisco, Colima, Guerrero, Tamaulipas y San Luis Potos.

11

Marco Terico
La composicin qumica de los frutos cambia de variedad en variedad. Los
principales constituyentes del mango son: carbohidratos, cidos orgnicos,
protenas, aminocidos, pigmentos, sustancias pcticas, polifenoles, vitaminas,
minerales, cidos grasos y componentes odorferos. Los azucares que se
encuentran en mayor proporcin en el mango son: glucosa, fructosa, sacarosa y
xilosa, siendo, segn Lakshminarayana [16], la sacarosa la responsable del sabor
dulce, y no la fructosa como generalmente sucede. Todos estos azucares son
susceptibles de someterse a un proceso de fermentacin alcohlica.

2.2. Historia de la fermentacin.
La fermentacin [13], uno de los ms viejos procesos qumicos conocido
por el hombre, es usado para producir una gran variedad de productos, incluyendo
alimentos, saborizantes, bebidas, farmacuticos y qumicos. Actualmente, sin
embargo, muchos de los productos ms simples tales como el etanol son de la
industria de la fermentacin, por lo tanto, depende de su capacidad de utilizar la
alta eficiencia y especificidad de la catlisis enzimtica para sintetizar productos
complejos y de su capacidad de superar las variaciones en la calidad y
disponibilidad de las materias primas.








12

Marco Terico
Luis Pasteur, evidentemente uno de los mayores genios de la humanidad,
con sus clsicas experiencias llenas de minuciosos detalles, sent principios sobre
las confusas causas de la fermentacin, diciendo que eran debidas a la accin
directa de seres vivientes y microscpicos. La palabra fermentacin, en su origen,
tan slo significa un simple burbujeo motivado por el desprendimiento de gases. El
trmino fermentacin deriva del verbo latino fervere que significa hervir. Gay-
Lussac ampli el significado, definindola por la escisin de un azcar en alcohol y
dixido de carbono. Desde un punto de vista bioqumico, la fermentacin se
verifica, por la accin de seres microscpicos, en los substratos orgnicos [17].

2.3. Fermentacin alcohlica.
La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del
etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en
plena ausencia de oxgeno (anaerbico), originado por la actividad de algunos
microorganismos que procesan los hidratos de carbonos (por regla general
azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el
almidn, etc.) para obtener como productos finales: el alcohol etlico (cuya frmula
qumica es: CH
3
-CH
2
-OH) y dixido de carbono (CO
2
) en forma de gas. La
conversin se representa mediante la ecuacin siguiente:




13

Marco Terico
Las principales responsables de esta transformacin son las levaduras [18].
La Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con ms
frecuencia. Por supuesto que existen estudios para producir etanol con otros
hongos y bacterias, como la Zymomonas mobilis [19, 20], pero la explotacin a
nivel industrial es mnima. Clsicamente se ha considerado que las levaduras son
los microorganismos ms vinculados al progreso y bienestar humano. Debido
principalmente a su capacidad de convertir eficientemente azcares, como los que
se encuentran en mostos de uva, frutas, cebada y otros cereales y leche en
alcohol y CO
2
. Las levaduras Saccharomyces cerevisiae [21] y algunas especies
prximas han sido tambin microorganismos muy utilizados tanto en microbiologa
industrial (bebidas fermentadas, pan y, ocasionalmente glicerina y grasa) como en
todo el desarrollo de la Bioqumica.

El proceso de fermentacin consta de tres fases bien diferenciadas: 1) fase
de induccin, es aquella durante la cual las levaduras se multiplican y la
fermentacin empieza a producirse; 2) fase tumultuosa, se caracteriza por un
aumento de gas carbnico y elevacin de la temperatura, al mismo tiempo, la
velocidad de fermentacin es bastante grande, notndose en la superficie del
lquido mucho burbujeo y gran cantidad de espuma y 3) fase lenta, esta comienza
al terminar la fermentacin tumultuosa. Durante este perodo, los mostos
fermentan a menor velocidad, se nota menos el burbujeo, y la espuma y la
temperatura comienza a descender.

14

Marco Terico
Al inicio de la fermentacin, las levaduras y las bacterias empiezan a
multiplicarse, ya que inicialmente el caldo supone un medio adecuado, que poco a
poco se va haciendo ms incmodo, debido a la formacin de alcohol, la
disminucin de azcares necesarios para su catabolismo y la reduccin de los
nutrientes necesarios para su anabolismo. Una vez superado un periodo inicial de
adaptacin, las poblaciones de levaduras y bacterias se incrementan rpidamente,
pero estas ltimas pierden la batalla de la supervivencia, permaneciendo durante
gran parte del proceso fermentativo en un estado de latencia. La velocidad del
proceso fermentativo sta ligada a la densidad de poblacin de levaduras
fermentativas. Primero sucede una etapa de adaptacin, seguida de una segunda
etapa de crecimiento exponencial, que va siendo cada vez menor hasta llegar a
una etapa de crecimiento nulo, donde el nmero de nacimientos es igual al
nmero de defunciones. Tras esta etapa la mortalidad comienza a ser mayor a la
multiplicacin, lo que corresponde a las ltimas fases de la fermentacin.

El principal camino metablico implicado en la fermentacin del etanol con
Saccharomyces cerevisiae, es la gliclisis (ruta de Embden-Meyerhof-Parnas),
por la cul una molcula de glucosa es metabolizada, y se producen dos
molculas de piruvato [22]. La ruta de Embden-Meyerhof Parnas es la ms comn
para el metabolismo de la glucosa y procede a travs de una serie de
transformaciones involucrando reacciones de fosforilacin, las cuales son
importante en la produccin de energa para el crecimiento celular.

15

Marco Terico
Esta ruta consiste de dos fases:

Fase preparatoria (fase de inversin de energa). La glucosa tras su
activacin y transformacin en otras hexosas, se descompone en dos
molculas de gliceraldehdo-3-fosfato, es decir, en dos molculas de tres
tomos de carbono. Para ello se necesita la energa aportada por dos
molculas de ATP.

O
H
H
OH
H
OH
OH
H
H
HO
Glucosa
CH
2
OH
+ 2ATP
C
C
CH
2
OPO
3
2-
OH H
O H
Gliceraldehido-3-fosfato
(GAP)
1
2
3
2
+ 2ADP


Fase productiva (fase de generacin de energa). Las dos molculas de
gliceraldehdo-3-fosfato se oxidan despus, a travs de una serie de
reacciones, hasta rendir dos molculas de piruvato. En esta oxidacin se
necesita NAD
+
, que se reduce a NADH. La energa liberada en el proceso
es utilizada para fabricar cuatro molculas de ATP.



16

Marco Terico


C
C
CH
2
OPO
3
2-
OH H
O H
Gliceraldehido-3-fosfato
(GAP)
1
2
3
+ 2 NAD
+
+ 4ADP
+ 2Pi
2 C O
C
O
-
O
CH
3
Piruvato
+ 2NADH
+ 4ATP + 2H
+
2


Bajo condiciones anaerbicas el piruvato se descarboxila para formar
acetaldehdo por accin del piruvato descarboxilasa; ste a su vez es reducido a
etanol por accin del alcohol deshidrogenasa.


C O
C
O
-
O
CH
3
Piruvato
Deshidrogenasa de
alcohol
Descarboxilasa de
piruvato
CO
2
C
O
H
CH
3
Acetaldehido
C H
OH
CH
3
H
Etanol
1
2
NADH
NAD
+


2.3.1. Limitaciones del proceso de fermentacin.
La determinacin de los factores que limitan la gliclisis fermentativa del
etanol son complejos debido a la interrelacin existente y a la naturaleza de los
parmetros intervinientes durante el proceso de fermentacin.

17

Marco Terico
En las limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar
algunos de los ms importantes como son:

Concentracin de etanol resultante.- Una de las principales limitaciones
del proceso, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de
etanol (alcohol) que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos
microorganismos como la saccharomyces cerevisiae pueden llegar a
soportar hasta el 20% de concentracin en volumen.

Una alta concentracin de etanol en el medio tiene efecto inhibitorio sobre el
crecimiento de la clula de levadura y la produccin de etanol durante el proceso
de fermentacin. En ingeniera bioqumica estos efectos se definen y se modelizan
con los modelos cinticos de velocidad especfica de crecimiento de las clulas de
levadura y la velocidad especfica de produccin de etanol, propuestos por Aiba y
colaboradores [23].

Acidez del substrato.- El pH es un factor limitante en el proceso de la
fermentacin ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por
el ambiente, bien sea alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento
de las levaduras est en un rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5
pH. Se procura mantener los niveles ptimos de acidez durante la
fermentacin usualmente mediante el empleo de disolucin.

18

Marco Terico
Concentracin de azcares.- Las levaduras fermentativas necesitan los
azcares para su catabolismo, es decir para obtener la energa necesaria
para sus procesos vitales. El principal nutriente de las levaduras es el
carbono, el cual es suministrado por los azcares contenidos en la materia
prima, siendo la concentracin de azcar un valor que se debe considerar
ya que afecta la velocidad de la fermentacin, el comportamiento y el
desarrollo de las clulas de la levadura.

Cuando se trabaja con concentraciones de azcar muy altas, se observa una
deficiencia respiratoria en la levadura y por lo tanto un descenso de la velocidad
de fermentacin. De la misma forma la baja concentracin puede frenar el
proceso. La deficiencia respiratoria se debe al efecto inhibitorio por sustrato, el
cual tiene efecto sobre la velocidad especfica de crecimiento de las clulas de
levadura. Este efecto se define en el modelo cintico propuesto por Andrews [24].

Oxgeno.- Las levaduras son organismos anaerbicos facultativos, que
significa que pueden vivir sin oxgeno. Sin embargo, una aireacin al
comienzo de la fermentacin asegura una buena cantidad de levaduras que
se multiplicarn, de igual manera las levaduras normalmente utilizan la
respiracin aerbica para oxidar la glucosa y as procesar su alimento,
obteniendo ATP.


19

Marco Terico
La fermentacin es un proceso completamente anaerbico (sin la participacin
del aire) y la inclusin del oxgeno detiene o minimiza los procesos biolgicos de
las levaduras. Presentndose el efecto Pasteur, el cul es un efecto de inhibicin
de la fermentacin alcohlica debido a la participacin de oxigeno (O
2
). Este
efecto fue descubierto en el ao 1857 por el bilogo francs Louis Pasteur, que
observ por primera vez que las levaduras dejaban de crecer al ser aireadas.

La temperatura.- Se debe tener en cuenta que para cada levadura existe
una temperatura ptima de desarrollo, en la cual se muestra activa.
Adems, se tiene una zona independiente de la temperatura ptima en la
cual la levadura an presenta actividad; a medida que se aleja de la
temperatura ptima su actividad disminuye notablemente. Por debajo de la
temperatura sealada como mnima y por encima de la mxima, las
levaduras continan viviendo en estado latente, sin embargo, al exponer
cualquier levadura a una temperatura de 55 C por un tiempo de 5 minutos
se produce su muerte. En el caso de la saccharomyces cerevisae se tiene
un desarrollo ptimo entre 2835 C, recomendable 30 C.

Ritmo de crecimiento de las cepas.- Crecimiento y fermentacin
alcohlica estn ntimamente relacionados, ya que durante la fermentacin
se da un paralelismo entre la desaparicin del azcar y la evolucin de la
poblacin de levaduras en el tiempo.

20

Marco Terico
La pauta de crecimiento de las levaduras durante la fermentacin alcohlica es
similar al ciclo de crecimiento clsico de microorganismos, pero prcticamente se
reduce a tres fases [25].

fase de crecimiento con multiplicacin activa de levaduras (las clulas
alcanzan su mxima velocidad de duplicacin y llevan a cabo un
metabolismo fermentativo del que se produce etanol),
fase estacionaria, donde se mantiene la viabilidad de las levaduras
presentes pero no hay multiplicacin (se presenta cuando los nutrientes del
medio se han agotado),
y fase de declive, donde comienza la mortandad celular y avanza
paulatinamente.

2.4. Mtodos analticos para compuestos qumicos voltiles.
En general, los mtodos para el anlisis qumico son, en el mejor de los
casos, selectivos; pocos, si es que los hay, son verdaderamente especficos. En
consecuencia, la separacin del analito de las posibles interferencias es a menudo
una etapa de vital importancia en los procedimientos analticos. Hasta mediados
del siglo XX, las separaciones analticas se llevaban a cabo en su mayor parte por
mtodos clsicos como precipitacin, destilacin y extraccin.



21

Marco Terico
Actualmente, las separaciones analticas se pueden realizar, en la mayora
de los casos, por cromatografa y electroforesis capilar, especialmente en el caso
de mezclas complejas y de multicomponentes [26].

2.4.1. Cromatografa.
La cromatografa, es un poderoso mtodo utilizado para separar e
identificar los componentes de una mezcla, ste tiene aplicacin en todas las
ramas de la ciencia.

La cromatografa en columna fue inventada y denominada as, a principios
del siglo XX por el botnico ruso Mikhail Tswett. l emple la tcnica para separar
varios pigmentos vegetales, tales como clorofilas y xantofilas, haciendo pasar
disoluciones de estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con
carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecan como
bandas coloreadas en la columna, lo que justifica el nombre que eligi para el
mtodo (del griego chroma que significa color, y graphein que significa
escribir) [26].

Las aplicaciones de la cromatografa han aumentado en gran manera en los
ltimos cincuenta aos, debido, no slo al desarrollo de nuevos y diversos tipos de
tcnicas cromatograficas, sino tambin a las necesidades crecientes, por parte de
los cientficos, de mejores mtodos para la caracterizacin de mezclas complejas.

22

Marco Terico
El tremendo impacto de esos mtodos en la ciencia se confirm al
otorgarse el Premio Nobel de 1952 a A.J.P. Martin y R. L. M. Synge por sus
descubrimientos en este campo. Ms impresionante es, quiz, la lista de doce
Premios Nobel concedidos entre 1937 y 1972, los cuales se basaron en trabajos
en los que la cromatografa tena un papel vital [27]; hoy por hoy, indudablemente,
esta lista ha aumentado. Cabe mencionar tambin que el trmino cromatografa
comprende una familia de mtodos de separacin muy relacionados entre s,
basados en los experimentos descritos por Day [28] y Tswett [29] en 1897-1906.

La caracterstica que distingue a la cromatografa de la mayora de los
mtodos fsicos y qumicos de separacin, consiste en que entran en contacto dos
fases mutuamente inmiscibles, siendo una de ellas estacionaria y la otra mvil. La
mezcla de la muestra, que se pone en contacto con la fase mvil, produce una
serie de interacciones (particiones) repetitivas entre la fase estacionaria y la fase
mvil, a medida que se desplaza por el sistema arrastrada por dicha fase mvil.
Las interacciones se basan en las diferencias de propiedades fsicas y qumicas
de los componentes de la muestra. Estas diferencias determinan la velocidad de
emigracin de los componentes individuales, bajo la influencia de una fase mvil
que se desplaza a travs de una columna que contiene la fase estacionaria [30].




23

Marco Terico
Los componentes separados emergen en orden creciente de interaccin
con la fase estacionaria. El componente menos retardado es el primero en salir, y
el material ms fuertemente retenido es el ltimo. Se ha obtenido una separacin
cuando un componente se retarda lo suficiente para evitar la superposicin con la
zona de un soluto adyacente, a medida que los componentes de la muestra van
emergiendo de la columna [30]. Como consecuencia de la distinta movilidad, los
componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden
analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente [26].

2.4.1.1. Clasificacin de los mtodos cromatograficos.
La fase mvil puede ser un gas o un lquido, mientras que la fase
estacionaria puede ser un lquido o un slido. El campo de la cromatografa lquida
en columna comprende diversos tipos de interacciones.

Cuando la separacin se basa primordialmente en una particin simple
entre dos fases lquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra mvil, al proceso se
le llama cromatografa lquido-lquido (o de particin) (CLL). Cuando la capacidad
de retencin de la fase estacionaria se basa en fuerzas superficiales fsicas, al
proceso se le llama cromatografa lquido-slido (o de adsorcin) (CLS).




24

Marco Terico
Los otros mtodos cromatogrficos son un poco diferentes en su accin. En
la cromatografa de intercambio inico (CII), los componentes inicos de la
muestra se separan por intercambio selectivo con iones contrarios de la fase
estacionaria. El uso de empaque de exclusin como fase estacionaria, produce
una clasificacin de las molculas basada principalmente en la geometra y
tamao de las mismas. La cromatografa de exclusin (CE) se conoce tambin
con otros nombres, pues los qumicos de polmeros la llaman cromatografa de
permeacin de geles, mientras que los bioqumicos la llaman filtracin de geles.

Si la fase mvil es un gas, los mtodos reciben el nombre de cromatografa
gas-lquido (CGL) y cromatografa gas-slido (CGS) [30]. La cromatografa gas-
lquido (CGL) tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su
denominacin se abrevia normalmente como cromatografa de gases (CG), este
tipo de mtodo cromatogrfico se basa en la distribucin del analito entre una fase
mvil gaseosa y una fase inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte. En la
cromatografa gas-slido (CGS) se produce la retencin de los analitos en una
fase estacionaria slida como consecuencia de la adsorcin fsica.






25

Marco Terico
En la cromatografa de gases (CG), la muestra se volatiliza y se inyecta en
la cabeza de una columna cromatogrfica. La elusin se produce por el flujo de
una fase mvil de un gas inerte. A diferencia de la mayora de los otros tipos de
cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica
funcin es la de transportarlo a travs de la columna [26].

2.4.1.2. Componentes que forman parte de un cromatgrafo de gases.
Los componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de
gases son: gas acarreador, puerto de inyeccin, columna, detector y registrador;
todos estos componentes se muestran esquemticamente en la figura 2.1.




Figura 2.1. Representacin esquemtica de un cromatgrafo de gases.

26

Marco Terico
El gas portador (fase mvil) proviene de cilindros provistos con vlvulas
reductoras de presin. La muestra se introduce en el inyector con una microjeringa
a travs de un septum de goma. All se produce la vaporizacin instantnea de la
misma y su introduccin en la corriente de gas. La columna se halla dentro de un
horno de temperatura variable, lugar donde se realiza la separacin de los
componentes de la muestra. El detector produce una seal elctrica proporcional a
la cantidad de materia, a medida que cada componente separado fluye a travs de
l. Esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en
funcin del tiempo (cromatograma) como el que se muestra en la figura 2.2.

0 1 2 3 4 5
Tiempo de retencin (min)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)

Figura 2.2. Grafica de intensidad en funcin del tiempo de retencin.



27

Marco Terico
Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un
componente de la muestra original. El integrador (o el software de control) calcula
adems, el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la
concentracin del analito.

Los tipos de detectores utilizados en cromatografa de gases se clasifican en:
De conductividad trmica (resistencia calentada), (TCD: por sus siglas en
ingls).
De ionizacin de flama, (FID: por sus siglas en ingls).
De quimioluminiscencia del azufre, (SCD: por sus siglas en ingls).
De captura de electrones, (ECD: por sus siglas en ingles).
De emisin atmica, (AED: por sus siglas en ingls).
Fotomtria de llama (emisin de llama), (FPD: por sus siglas en ingls).
Termoinico (llama alcalina), (TID: por sus siglas en ingls).

En este trabajo se utiliz el detector de ionizacin de Flama (FID). El FID
[26], es el detector ms extensamente utilizado, por lo general, uno de los ms
aplicables en cromatografa de gases. En l, el efluente de la columna se mezcla
con hidrgeno y con aire para luego encenderse elctricamente. La mayora de
los compuestos orgnicos, cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de
hidrgeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a
travs de la llama.

28

Marco Terico
Cuando se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de
voltios entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima
de la llama, la corriente que resulta se dirige para su medida hacia un amplificador
operacional de alta impedancia.

2.5. Espectrofotometra ultravioleta-visible (UV-Vis).
La espectrofotometra de absorcin ultravioleta-visible [30-32] fue uno de
los primeros mtodos fsicos que se aplic al anlisis cuantitativo y a la
determinacin de estructuras. Esta tcnica utiliza la radiacin visible o ultravioleta
para medir la concentracin de las sustancias qumicas.


Los dos principales tipos de aparatos usados en las medidas de la
absorbancia de la radiacin visible o ultravioleta son los fotmetros y los
espectrofotmetros. Los fotmetros: tcnicamente la palabra fotmetro se aplica a
cualquier dispositivo que pueda medir la intensidad de una radiacin, pero
normalmente se usa para designar a los instrumentos relativamente sencillos
provistos de filtros para seleccionar una zona estrecha de longitudes de onda y de
una fotocelda o fototubo para medir la intensidad de la radiacin.





29

Marco Terico
El espectrofotmetro: es un instrumento ms sofisticado que posee un
monocromador en lugar de filtros. El monocromador permite una variacin
continua al elegir la longitud de onda y hacer un barrido en una zona amplia de
longitudes de onda. Adems, el sistema de deteccin que posee el
espectrofotmetro, normalmente fototubos o fotomultiplicadores, es el ms
sensible que existe.

2.5.1. Ley de Beer Lambert.
En 1729 Bougeur y Lambert en 1760 demostraron que la transmitancia de
la luz por una solucin es una funcin exponencial de la longitud de la trayectoria;
y en 1852 Beer demostr que esta es una funcin de la concentracin de la
especie que absorbe. La combinacin de estos descubrimientos ha llegado a ser
conocida como la Ley de Beer, quizs porque la dependencia de la concentracin
es la que ms se aplica en el anlisis qumico.

La ley de Beer puede ser formulada en su forma exponencial:

abC
T
Po
P

= = 10
(2.1)




30

Marco Terico
o bien, en su versin logartmica:

abC
T T
A =

=
%
100
log
1
log
(2.2)
En donde:
P = potencia radiante de la radiacin transmitida (o no absorbida), en watios/m
2
.
Po = potencia radiante del haz emergente, en watios/m
2
.
a = es la absortividad, una constante de proporcionalidad que vara con la
longitud de onda de la radiacin empleada (es una propiedad molecular de la
especie que absorbe luz), en L/mol cm.
b = es el trayecto por la celda, o sea, el ancho de la solucin, expresado en
centmetros.
C = es la concentracin de la sustancia absorbente, en mol/L.
T = es la transmitancia (cociente de intensidades).
A = es la absorbancia, una expresin popular, porque, a diferencia de la
transmitancia, es directamente proporcional a la concentracin.

2.5.2. Eleccin de unidades para la absortividad y concentracin.
Es evidente que A es una cantidad sin dimensin, puesto que es el
logaritmo de un cociente de intensidades de haces, de modo que las unidades se
anulan.


31

Marco Terico
Ya hemos establecido que b se mide en centmetros, por lo que las
unidades para la absortividad dependen de la eleccin de las unidades para la
concentracin C. Por ejemplo, si se expresa la concentracin de la sustancia
absorbente en, gramos por litro, las unidades para a deben ser L/g cm, con lo que
el producto abC resulta adimensional, como se requiere para la absorbancia.

Debido a la importancia de la molaridad como unidad de concentracin en
la qumica analtica, usamos un smbolo especial para la absortividad, en este
caso, el smbolo es la letra griega psilon , y se denomina la absortividad molar,
con unidades de L/mol cm. Resulta as una formulacin muy usada de la Ley de
Beer:
bC A = (2.3)
Donde, , es el coeficiente de extincin molar la absortividad molar.

La constante a , es una medida relativa de la intensidad de absorcin de
un compuesto. Depende del disolvente, de la longitud de onda y de las
condiciones experimentales (pH, Temperatura, etc.), pero es independiente de C y
de b.




32

Marco Terico
2.5.3. Determinacin espectrofotomtrica directa de la concentracin.
La primera etapa en una determinacin espectrofotmetrica es la de hallar
las caractersticas de absorcin de las especies a ser determinadas, y seleccionar
la longitud de onda de mxima absorcin.

El primer paso de cualquier anlisis fotomtrico o espectrofotomtrico es el
establecimiento de las condiciones que den como resultado una relacin, a ser
posible, lineal entre la absorbancia y la concentracin del analito (muestra
problema). Para ello se debe realizar lo siguiente:

Seleccionar la longitud de onda: Para obtener una sensibilidad mxima, las
medidas espectrofotomtricas se realizan a una (longitud de onda)
correspondiente a un pico de absorcin, debido a que la variacin de la
absorbancia por unidad de concentracin es mxima en este punto.

Optimizar las variables que influyen en la absorbancia: Entre las variables
ms comunes se encuentran la naturaleza del disolvente, el pH, fuerza inica y la
presencia de sustancias interferentes. Los efectos de estas variables se deben
estudiar y se deben elegir aquellas condiciones del anlisis que permitan que la
absorbancia no se vea prcticamente afectada.



33

Marco Terico
Determinar la A y la concentracin: Los datos de A pueden manejarse de
diferentes modos en anlisis cuantitativo. La escala va desde 0 a pero la
mxima exactitud se obtiene en el intervalo de 0 a 3, por lo tanto, las condiciones
experimentales se deben elegir de manera que la absorbancia producida ocurra
dentro de dicho intervalo: las disoluciones que originen A demasiado elevadas se
diluyen y las de A bajas se concentran. Normalmente esto se prev mediante una
determinacin preliminar.

Posteriormente, se preparan una serie de disoluciones de concentraciones
perfectamente conocidas, en el intervalo en el cual se supone que se encuentra la
concentracin de la muestra problema, y se mide la absorbancia A de estas
disoluciones a una longitud de onda de absorcin mxima. Si el intervalo de las
concentraciones de los patrones utilizados es el adecuado se espera obtener una
lnea recta:

i mx y + =
(2.4)
y con
b

= m
(2.5)
Donde:
y = es la concentracin del analito.
m = es la pendiente de la recta.
x = es la concentracin del patrn.
i = es el intercepto al origen.

34

Marco Terico
Es decir, si la Ley de Beer se cumple en todo el intervalo de
concentraciones estudiadas, se obtiene una lnea recta que pasa por el origen,
como se muestra en la figura 2.3, tal como lo predice la ecuacin abC A = o la
ecuacin C b A = , a esto se le conoce como curva de calibracin.

Figura 2.3. Grafica de absorbancia en funcin de la concentracin a una determinada
longitud de onda A

.

2.6. Oxidacin de etanol por Cr (VI).
La oxidacin de alcoholes por accin del Cr (VI) [33] se utiliza, por ejemplo,
en los dispositivos empleados para el control de la alcoholemia en el aire exhalado
de los conductores de vehculos. La reaccin qumica es la siguiente:


3CH
3
CH
2
OH + 4HCrO
4
-
+ 16H
+
3CH
3
COOH + 4Cr
3+
+ 13H
2
O
(2.6)


A

(
u
.
a
)

C (mol/L)
m =b
35

Marco Terico
Donde:
CH
3
CH
2
OH y CH
3
COOH son las frmulas qumicas del etanol y del cido actico,
respectivamente, y HCrO
4
-
es la del in cromato cido.

El in HCrO
4
-
est en equilibrio en medio cido con el in dicromato (Cr
2
O
7
2-
)
segn la siguiente reaccin (K = 3.0X10
-2
a 298 K, K es la constante de equilibrio):


Cr
2
O
7
2-
+ H
2
O

2HCrO
4
-
(2.7)

La reaccin qumica (2.7) se equilibra en una escala de tiempo del orden de
los nanosegundos o picosegundos. Por lo tanto, es indistinto emplear cromato
cido o dicromato como reactivo, ya que en este ltimo caso el cromato cido
necesario para oxidar el etanol se obtendr de inmediato a partir de la hidrlisis
del dicromato. En otras palabras, el equilibrio qumico se alcanza muy
rpidamente y no constituye el paso limitante de la reaccin global.

La concentracin de cromato es en todo momento la concentracin en
equilibrio con dicromato. En las condiciones de trabajo, despreciando las especies
que podran formarse al protonarse ambos iones, puede considerarse que todo el
cromo (VI) est como HCrO
4
-
.


36

Marco Terico
Por lo tanto, la absorbancia de la solucin es una medida de la
concentracin de este ltimo, y se puede seguir el avance de la reaccin 2.6
espectrofotomtricamente.




















37

3
CAPITULO
METODOLOGA EXPERIMENTAL

3.1. Obtencin de bioetanol va fermentacin a nivel laboratorio.
3.1.1. Reactivos.
Todos los reactivos utilizados son de grado analtico, para la preparacin de las
respectivas soluciones se utiliz agua destilada o desionizada.

1. Tartrato de sodio y potasio (CALEDON).
2. Hidrxido de sodio (J.T. BAKER).
3. Sulfato de cobre pentahidratado (BAKER).
4. Ferrocianuro de potasio (BAKER).
5. cido clorhdrico (J.T.BAKER).
6. Acetato de plomo (MEYER).
7. Glucosa Monohidratada (MEYER).
8. Metanol (MEYER).
9. Etanol (BAKER).
10. Butanol (J.T. BAKER).
11. Alcohol terbutlico (REASOL).
12. Acetato de etilo (J.T.BAKER).
13. cido actico (J.T. BAKER).
14. Dicromato de potasio (J.T. BAKER).
15. Levadura de pan (Sacchoromyces cerevisiae).

38

Metodologa Experimental
16. Indicador (fenolftaleina al 1%).
17. Buffer (J.T.BAKER), pH = 4 y 7.

Todos los gases fueron PRAXAIR grado cromatogrfico (alta pureza).
1. Hidrgeno comprimido.
2. Helio comprimido.
3. Aire comprimido.
4. Nitrgeno comprimido.

3.1.2. Equipos.
1.- Espectrofotmetro UV/vis Marca VARIAN. Modelo Cary 100 ( 0.001 unidades
de absorbancia), con una celda de cuarzo de un centmetro de longitud de paso
ptico.

2.- Cromatgrafo de gases Varian CP-3380 controlado por un software Star
Chromatography Workstation versin 6, operado por una computadora personal,
equipado con un detector de ionizacin de flama (FID), una columna capilar de
silica fundida (de 15 m de longitud y 0.25 mm de dimetro interno) y un inyector
para columna capilar. Como gas de arrastre se utiliz helio.




39

Metodologa Experimental
3.- Cromatgrafo de gases Marca PERKIN ELMER, con un detector de ionizacin
de flama (FID), inyector capilar y una columna PE-WAX de 30 m de longitud con
un dimetro interno de 0.53 mm y un espesor de pelcula de 1 m.

4.- Jeringa Hamilton de 1.0 L.

5. pH-metro OAKTON pH 2100 series.

3.2. Procedimiento experimental.
3.2.1. Obtencin del jugo de mango.
El primer paso fue recolectar la materia prima, mangos maduros de la
variedad criollo, en una de las huertas ubicadas en la Colonia el Jordn,
perteneciente al municipio de Santo Domingo Tehuantepec. Posteriormente se
procedi al lavado, pelado y trituracin de los mismos hasta obtener un lquido
(mosto) espeso, el cual fue filtrado, para eliminar las fibras que contena y as
obtener un mosto homogneo; estas operaciones se realizaron manualmente.

3.2.2. Determinacin de las condiciones ptimas de fermentacin.
Para encontrar las condiciones ptimas tanto para la fermentacin del
mosto as como para las operaciones posteriores a esta, principalmente filtracin y
destilacin del mismo, primero se determin la cantidad de levadura y
posteriormente se vario la cantidad de agua adicionada al mosto.

40

Metodologa Experimental
En la tabla 3.1, se presenta la nomenclatura utilizada para designar a cada
uno de los sistemas con los cuales se trabaj durante la determinacin de las
condiciones ptimas para la fermentacin del jugo (mosto) de mango para la
obtencin del etanol.

Tabla 3.1. Nomenclatura utilizada para los sistemas de fermentacin del mosto.

Sistemas
Cantidad de Levadura
(g/L)
Volumen de agua
(% volumen)
A 1.0 20
B 1.60 20
C 2.10 20
D 1.0 30
E 1.0 50
F 1.0 70


3.2.2.1. Cantidad de Levadura.
Para obtener la cantidad de levadura se realiz la fermentacin de la
siguiente forma: al mosto filtrado se le agreg agua al 20% (v/v), esto para
disminuirle su viscosidad. Para eliminar los microorganismos indeseables en la
mezcla mosto-agua, sta se calent a una temperatura aproximada de 70-73 C, y
enseguida se dej enfriar hasta los 40 C. Luego la mezcla mosto-agua se dividi
en tres porciones.


41

Metodologa Experimental
Enseguida cada mezcla se transfiri al recipiente de fermentacin
(recipiente de plstico), donde se le agreg como microorganismo fermentador,
cierta cantidad de levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae). Al sistema A 1.00
g/L, al sistema B 1.62 g/L y al sistema C 2.16 g/L con la finalidad de obtener la
cantidad ptima de levadura para la fermentacin. Posteriormente la mezcla
mosto-agua-microorganismo de cada uno de los sistemas fue aireada (la aireacin
se llev a cabo mediante agitacin) durante dos horas, esto con la finalidad de
aumentar la concentracin de oxgeno disuelto en el medio, la cual es esencial
para el desenvolvimiento de las levaduras.

A lo largo de la fermentacin del mosto, se tomaron muestras a ciertos
intervalos de tiempo, a las que se les determin la cantidad de azucares
reductores totales. La determinacin de azcares reductores totales se realiz con
el objetivo de saber en que momento detener la fermentacin y por lo tanto
proceder a la destilacin del mosto, es decir cuando el contenido de azucares en
el mosto se ha agotado; ya que los azcares son la fuente de alimentacin de los
microorganismos y por lo tanto, determinan el rendimiento de etanol. A partir de
stos resultados se decidi trabajar con 1.0 g/L de Levadura.

Al trmino de este proceso, se trat de filtrar el mosto fermentado, sin
embargo la filtracin no se logr debido a que este tena una consistencia espesa.


42

Metodologa Experimental
Por tal motivo se procedi a realizar nuevas pruebas variando la cantidad
de agua agregada al mosto.

3.2.2.2. Relacin A-M (agua-mosto).
Para encontrar la relacin ptima A-M (agua-mosto) que permitiera el
filtrado del producto final, la cantidad de levadura se mantuvo constante (1.0 g/L) y
se vari la proporcin de agua adicionada al mosto, se trabaj de forma similar al
proceso anterior con tres sistemas: el D, E y F con un 30, 50 y 70 % en volumen
de agua, respectivamente. Con base a estos experimentos se encontr que la
mejor relacin de agua-mosto es de 70:30.

3.2.3. Fermentacin del mosto, bajo condiciones ptimas (FCO).
Por ltimo, se realiz la fermentacin del mosto utilizando la cantidad de
levadura ptima (1.0 g/L) y la mejor proporcin de agua con respecto al mosto
(70:30). La temperatura se mantuvo en el intervalo de 29 a 31 C, ya que en el
caso de la Saccharomyces cerevisiae se tiene un desarrollo ptimo entre 28 a 35
C, recomendable 30 C [34]. A lo largo de la fermentacin, se tomaron muestras a
ciertos intervalos de tiempo, a las que se les realizaron adems de la
determinacin de los azcares reductores totales y de la concentracin de etanol
producido, el pH. Una vez detenida la fermentacin del mosto se llevo a cabo la
filtracin y posteriormente la destilacin del mismo.


43

Metodologa Experimental
Las muestras obtenidas de las destilaciones del mosto se guardaron en
refrigeracin hasta su posterior anlisis por cromatografa de gases.

3.2.4. Determinacin de la concentracin de azcares reductores totales
(ART).
Para llevar a cabo la determinacin de la glucosa (ART) a lo largo de la
fermentacin del jugo (mosto) de mango, se prepar el reactivo de Fehling as
como una solucin de glucosa al 0.5%.

Reactivo de Fehling.
El reactivo de Fehling se prepar en un matraz aforado de 1.0 L a partir de
Tartrato de Sodio y Potasio (130 g), Hidrxido de Sodio (110 g ), Sulfato de Cobre
Pentahidratado (24 g), Ferrocianuro de Potasio (16.8 g) y agua destilada para
aforar el matraz.

Solucin de glucosa al 0.5 %.
Para esta solucin se pesaron 0.25 g de glucosa monohidratada y se
disolvieron en 50 mL de agua destilada.





44

Metodologa Experimental
Valoracin del Reactivo de Fehling.
Se colocaron en un matraz erlenmeyer de 125 mL, 15.0 mL del reactivo de
Fehling exactamente medidos, posteriormente se le agreg 20 mL de agua
destilada y se agit con cuidado para homogenizar. Luego se procedi a calentar
el matraz sobre una parilla elctrica, cuando el reactivo comenz a hervir se le
agreg de una bureta, la solucin de glucosa (0.5 %) a razn de 2 a 3 gotas por
segundo, cuidando que la ebullicin no se interrumpiera durante la titulacin. La
titulacin del reactivo fue hasta la desaparicin completa del color azul-verde, para
dar un color amarillo claro.

El factor del reactivo de Fehling se obtuvo a partir del siguiente clculo:


( )
T
g
V
m V
= F
(3.1)
Donde:
F = Factor de Fehling, en g de azcar.
V
g
= Volumen de la solucin de glucosa al 0.5 % consumido en la
valoracin del reactivo de Fehling, en mL.
m = Masa de glucosa, en g.
V
T
= Volumen total de la solucin de glucosa, en mL.


45

Metodologa Experimental
Valoracin de la muestra.
La muestra se prepar de la siguiente forma: se midi con una probeta 20
mL de mosto y se transfiri a un matraz aforado de 100 mL, luego se le agreg
con una pipeta volumtrica 5.0 mL de HCl concentrado. Posteriormente el matraz
se coloc en un bao mara a 63 C durante 3 minutos. Luego se enfri a chorro
de agua y se neutraliz, para la neutralizacin se uso la misma cantidad de sosa
concentrada (20 g de NaOH en 50 mL de agua). Ya neutralizada la solucin se le
agreg 5.0 mL de acetato de plomo al 10.0 %, por ltimo se afor con agua
destilada y se procedi a filtrar. El filtrado se coloc en una bureta y se titul el
reactivo de Fehling de forma similar que con la solucin de glucosa al 0.5 %.
Para determinar el contenido de azucares reductores totales, se utiliz la
siguiente ecuacin:

( )( )( )
( )( )
m
T
V V
V 1000 F
L
g
ART =

(3.2)
Donde:
ART = azucares reductores totales.
F = Factor de Fehling expresado en g de azcar.
V
T
= Volumen total de la solucin, en mL.
V = Volumen de la solucin consumido en la valoracin del reactivo de Fehling, en
mL.
V
m
= Alcuota de mosto utilizado, en mL.



46

Metodologa Experimental
3.2.5. Determinacin de la concentracin de etanol producido a lo largo de la
fermentacin del mosto a las condiciones ptimas encontradas (FCO).

La determinacin de la concentracin de etanol producido a lo largo de la
fermentacin del mosto se llevo a cabo mediante la oxidacin del mismo por
accin del Cr (VI). El progreso de la reaccin de oxidacin del etanol se midi
espectrofotomtricamente.

El procedimiento fue el siguiente: Primero se realiz la curva de calibracin
del in cromato para determinar el coeficiente de extincin molar, mediante la ley
de Beer. Para tal fin se prepararon una serie de patrones a partir de la disolucin
estndar de dicromato de potasio 1X10
-3
M en matraces aforados de 25 mL, el
aforo de cada uno de los matraces se realiz con la solucin de HCl 3.6 M. Esto
se hizo por triplicado. Los volmenes aadidos a cada uno de estos matraces se
presentan en la tabla 3.2. Finalmente se midi la absorbancia de cada una de las
diluciones patrn en el intervalo de longitud de onda, , de 300 a 500nm.












47

Metodologa Experimental
Tabla 3.2. Volmenes agregados a cada uno de los matraces, para realizar la
curva de calibracin del dicromato.

Matraz aforado
Vol. de solucin de
dicromato de potasio
(mL)
[K
2
Cr
2
O
7
]
M
1 2 8.0X10
-5

2 4 1.6X10
-4

3 6 2.4X10
-4

4 8 3.2X10
-4

5 10 4.0X10
-4

6 12 4.8X10
-4

7 14 5.6X10
-4

8 16 6.4X10
-4

9 18 7.2X10
-4

10 20 8.0X10
-4



Para determinar la concentracin del etanol a lo largo del proceso de
fermentacin del mosto, se fueron tomando 15 mL del mismo a cierto intervalo de
tiempo, los cuales se destilaron. El destilado se recolect en un matraz aforado, el
cual contena la disolucin de dicromato de potasio 1X10
-3
M. Despus de 30
minutos se tom una alcuota de la mezcla etanol-dicromato de potasio y se
coloc en la celda para medir su absorbancia en el espectrofotmetro UV/Vis. La
disminucin en la absorbancia del in cromato es una medida directa de la
variacin de la cantidad de alcohol presente en la mezcla.


48

Metodologa Experimental
3.2.6. Mtodos analticos para compuestos qumicos voltiles.
3.2.6.1. Cromatografa de gases.
El anlisis cualitativo de las muestras de condensado se realiz en el
Laboratorio de Qumica de la Universidad del Istmo, mientras que el anlisis
cuantitativo se realiz en el Laboratorio de Qumica Analtica de la Universidad
Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa.

3.2.6.1.1. Anlisis cualitativo de las muestras.
Las condiciones de operacin con las cuales se trabaj durante el anlisis
cualitativo de las muestras fueron: helio (gas acarreador); temperatura del inyector
y del detector fueron, 130 y 150 C, respectivamente. La temperatura de la
columna fue de 40 C. El tiempo de corrida fue de 6 minutos, mientras que el
volumen de inyeccin de la muestra a analizar fue de 0.2 L.

Para la identificacin del o de los componentes, registrados como un pico
en cada uno de los cromatogramas de las muestras, previamente se realizaron
inyecciones por duplicado de cada uno de los siguientes estndares puros
(metanol, etanol, 2-propanol, acetato de etilo y butanol), as como de la mezcla
equimolar de los mismos. Estas inyecciones se realizaron a las mismas
condiciones que las de las muestras. Finalmente se compararon los tiempos de
retencin (que es nico para cada compuesto a las mismas condiciones) de los
estndares con los picos presentes en las muestras.

49

Metodologa Experimental
3.2.6.1.2. Anlisis cuantitativo de las muestras.
En la cromatografa, la mayor parte de los anlisis se realizan con el fin de
determinar la concentracin o el peso absoluto del, o los componentes presentes
en la muestra. Debido a que el cromatgrafo no presenta los resultados en forma
numrica, sino como variaciones del voltaje de salida en funcin del tiempo, es
necesario transformar dichas variaciones en un nmero y convertirlo luego a la
informacin deseada. Por lo que la concentracin del etanol en las muestras se
determin, empleando el mtodo de las adiciones estndar [35], el cual consiste
en aadir sobre una serie de alcuotas, cantidades conocidas del componente a
determinar, y medir la magnitud de la propiedad analtica de inters tras las
diferentes adiciones. Se utiliz butanol como estndar interno, esto para obtener
las relaciones de reas, entre el analito y el estndar interno en cada adicin.

Las condiciones de operacin con las cuales se trabaj durante el anlisis
de las muestras de condensado fueron: flujo de nitrgeno (gas acarreador), 3.0
mL/min; temperatura del inyector y del detector, fue de 220 C; la temperatura de
la columna fue de acuerdo al siguiente programa: Temperatura inicial, 40 C
durante 3 min, posteriormente, la temperatura se incrementa a una velocidad de
25 C/min hasta llegar a la temperatura final de 215 C. En la figura 3.1 se muestra
esquematizado dicho programa de temperatura. El volumen de inyeccin de la
muestra a analizar fue de 1.0 L.


50

Metodologa Experimental


Figura 3.1. Programa de temperatura del horno de la columna.

Preparacin de la muestra.
Se midi con una pipeta volumtrica, 2.0 mL de muestra de destilado y se
coloc en un matraz aforado de 10 mL, en donde se le agreg con una
micropipeta 25 L de butanol (estndar interno), posteriormente se llev al aforo
con agua destilada. Despus de agitar la disolucin, se tom con una Jeringa
Hamilton, 1.0 L y se inyect en el cromatgrafo de gases.

Enseguida se llev a cabo las adiciones del estndar etanol puro. Se
realizaron 5 adiciones, el volumen agregado en cada adicin fue de 25 L. Al
trmino de cada adicin, se fueron inyectando 1.0 L de la disolucin. Este mismo
procedimiento se repiti para las otras muestras.


t1(3min)
25C/min
40 C
215 C
51

Metodologa Experimental
Los resultados de las seales instrumentales del anlisis se representan
como en la figura 3.2. La seal medida R (en este caso la seal R, representa el
cociente de reas (A
est
/A
ei
), donde A
est
es el rea del estndar etanol puro en cada
adicin y A
ei
es el rea del estndar interno (butanol) utilizado), se representa en el
eje y, mientras que en el eje x, la escala se expresa en trminos de las cantidades
de analito aadidas, ya sea como masa o como concentracin. Por lo tanto, la
concentracin desconocida est dada por el punto en el cual la lnea extrapolada
corta al eje de concentracin. La recta de regresin se establece mediante
mnimos cuadrados.


Figura 3.2. Curva de adiciones estndar.

La concentracin del analito aadido en el volumen de muestra original (V
X
)
en cada adicin se calcula utilizando la siguiente ecuacin:

Regresin lineal
y = aX + b
Concentracin de analito aadido (C

)
Concentracin de analito
en la muestra problema (CX)
S
e

a
l
,

R

y = 0
b = -aX

o bien -CX = b/a = CX
Extrapolacin
52

Metodologa Experimental


(3.3)

Donde:
C

= Incremento en la concentracin del analito en el volumen de muestra original,

en g/mL.
C
est
= Concentracin del estndar (etanol puro) aadido en cada sistema, g/mL.
V
est
= Volumen de estndar (etanol puro) acumulado en cada sistema, mL.
V
x
= Volumen total de muestra, mL.

Una vez construida la curva de adicin estndar, se procede a determinar la
concentracin del analito en la muestra original mediante la extrapolacin de la
ecuacin de regresin lineal del tipo y = aX + b. Con intercepto en y = 0, la
concentracin se determina mediante la siguiente ecuacin:

a
b
=
x
C (3.4)
Donde:
C
X
= es la concentracin del analito determinado experimentalmente, g/mL.
b = es la ordenada de la ecuacin de regresin lineal.
a = es la pendiente de la ecuacin de regresin lineal.

=
x
est est
V
C V
C
.
'
53

Metodologa Experimental
Por otra parte, se requiere estimar la precisin de C
X
, para ello es
necesario construir el intervalo de confianza, utilizando para ello la siguiente
ecuacin:

( )
mL / g tS C
c x
(3.5)
Donde:
S
C
= es la estimacin del error estndar en C
x
.
t = distribucin t de Student.

Ahora considerando la correlacin de las variables, Sc esta definida de la
siguiente manera:
(3.6)

Donde sus variables se obtienen de las siguientes sumatorias:









2
2

=
N
S m S
S
xx yy
y
( )

= =
2 2
2
) (y N y y y S
i i yy
( )

= =
2 2
2
) (x N x x x S
i i xx
xx
xy
S
S
m =
( )( ) ( )

= = y x N y x y y x x S
i i i i xy

+ =
xx
y
c
S m
y
N
m
S
S
2
2
2
2
1
54

4
CAPTULO
RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1. Determinacin de las condiciones ptimas de fermentacin del mosto.
4.1.1. Determinacin de la cantidad de Levadura (microorganismo
fermentador).
Para ste estudio, se vari la cantidad de levadura y la proporcin de agua
se mantuvo constante, al 20 % (v/v). Se trabaj con tres sistemas de fermentacin,
estos fueron A (1.0 g/L), B (1.60 g/L de levadura) y C (2.10 g/L de levadura).

En la Tabla 4.1, se presentan los resultados obtenidos durante la
determinacin de la concentracin de los ART presentes en el mosto,
determinadas al inicio y a lo largo de la fermentacin del mismo en los sistemas A,
B y C.

Tabla 4.1. Concentracin de los ART presentes al inicio, as como a lo largo de la
fermentacin del mosto, en los sistemas A, B y C.

Tiempo (horas)
Sistema A
ART (g/L)
Sistema B
ART (g/L)
Sistema C
ART (g/L)
0 116.0 116.0 116.0
15 54.166 52.419 52.0
40 7.135 4.031 3.728



55

Resultados y Discusin
De dicha Tabla, se puede observar que la concentracin inicial de los
azcares reductores en los tres sistemas fue, 116.0 g/L. Despus de 15 horas de
fermentacin, la concentracin de los azcares en los sistemas A, B y C fueron,
54.166 g/L, 52.419 g/L y 52.0 g/L, respectivamente. Mientras que la concentracin
final de stos (40 horas de fermentacin) fue, 7.135 g/L en el sistema A; 4.031 g/L
en el sistema B y 3.728 g/L en el sistema C.

Con base a las concentraciones finales de los ART, el consumo total de
stos, expresados en trminos de porcentajes en los sistemas A, B y C fueron,
93.8, 96.5 y 96.8 %, respectivamente. De acuerdo a lo anterior se puede decir que
el consumo de azcares en los sistemas de fermentacin B y C son prcticamente
iguales y ligeramente superiores a A. Por lo tanto se puede decir que la cantidad
de levadura no es tan determinante en el consumo de azcares. El producto final
de la fermentacin en stos tres sistemas, no se pudieron filtrar por lo tanto
tampoco se pudieron destilar.

4.1.2. Determinacin de la relacin A-M (agua-mosto).
Durante la determinacin de la relacin A-M (agua-mosto) que permitiera un
buen filtrado del producto final, la cantidad de levadura se mantuvo constante (1.0
g/L) y se vari la proporcin de agua adicionada al mosto, se trabaj nuevamente
con tres sistemas de fermentacin, estos fueron D (30 % en volumen de agua), E
(50 % en volumen de agua) y F (70 % en volumen de agua).

56

Resultados y Discusin
En la Tabla 4.2, se presentan los resultados obtenidos durante la
determinacin de la concentracin de los ART presentes en el mosto,
determinadas al inicio y a lo largo de la fermentacin del mismo en los sistemas D,
E y F.

Tabla 4.2. Concentracin de los ART presentes al inicio, as como a largo de la
fermentacin del mosto en los sistemas D, E y F.

Tiempo (horas)
Sistema D
ART (g/L)
Sistema E
ART (g/L)
Sistema F
ART (g/L)
0 150.0 150.0 150.0
28 42.134 31.779 27.985
47 5.108 3.750 2.875

De dicha Tabla, se puede observar que la concentracin inicial de los
azcares reductores en los tres sistemas fue, 150.0 g/L. Despus de 28 horas de
fermentacin, la concentracin de los azcares en los sistemas D, E y F fueron,
42.134 g/L, 31.779 g/L y 27.985 g/L, respectivamente. Mientras que a las 47
horas, la concentracin final de stos fueron, 5.108 g/L en el sistema D; 3.750 g/L
en el sistema E y 2.875 g/L en el sistema F.

Con base a las concentraciones finales de los ART, el consumo total de
stos, expresados en trminos de porcentajes en los sistemas D, E y F fueron,
96.5, 97.5 y 98.0 %, respectivamente. De acuerdo a lo anterior se puede decir que
el consumo de azcares en los sistemas de fermentacin E y F son prcticamente

57

Resultados y Discusin
iguales y ligeramente superiores a D. Por lo tanto el contenido de agua tampoco
es determinante en el consumo de azcares; sin embargo, es muy importante para
el proceso de filtracin y destilacin del producto final de la fermentacin. Esto
debido a que la filtracin del producto final de la fermentacin fue un poco
complicado al trabajar con el 30 y 50 % en volumen de agua, mientras que con el
70 % en volumen de agua, el proceso de filtracin y destilacin fue ms simple,
por lo que se decidi que la mejor proporcin de A-M para la fermentacin es la de
70 % (v/v), con la cual se trabaj.

4.2. Fermentacin del mosto a las condiciones ptimas encontradas (FCO).
Los resultados obtenidos durante las pruebas previas para la determinacin
de la cantidad de levadura y el volumen de agua adicionada al mosto, muestran
que tanto la cantidad de Levadura y el volumen de agua adicionada no son
determinantes en el consumo de los azcares, por lo que se decidi trabajar con
1.0 g/L de Levadura y 70 % en volumen de agua.

En la Tabla 4.3 as como en la figura 4.1, se presentan los resultados
obtenidos durante la determinacin de la concentracin de los ART presentes en
el mosto FCO, determinada al inicio y a lo largo de la fermentacin del mismo a las
condiciones ptimas encontradas.



58

Resultados y Discusin
Tabla 4.3. Concentracin de los ART presentes al inicio, as como a lo largo de la
fermentacin del mosto (Condiciones ptimas 1.0 g/L de levadura y 70 % en volumen de
agua.
Tiempo (horas) ART (g/L) Consumo (g/L) Consumo (%)
0 85.526 0 0
3 69.148 16.378 19
4 65.00 20.526 24
6 58.035 27.491 32
8 53.278 32.248 37
10 50.781 34.745 40
12 47.794 37.732 44
16 44.345 41.181 48
18 32.964 52.562 61
20 30.532 54.994 64
22 22.713 62.813 73
24 15.585 69.944 81
26 11.640 73.886 86
28 7.420 78.106 91
30 4.548 80.978 95
46 2.626 82.9 97


De la Tabla 4.3, se puede observar que la concentracin inicial de los ART
en el mosto fue, 85.526 g/L. Despus de 16 horas de fermentacin, la
concentracin fue de 44.345 g/L, la cantidad total de azucares reductores
consumidos a este tiempo de fermentacin fue de 41.181 g/L, lo cual representa el
48% respecto a la concentracin inicial.


59

Resultados y Discusin
Finalmente a las 46 horas, la concentracin de los azucares reductores fue
2.626 g/L, la cantidad total de azcares reductores consumidos durante la
fermentacin fue de 82.9 g/L, lo cual representa el 97 % de la concentracin
inicial.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)
A
R
T
,

g
/
L
consumo lento
consumo acelerado
consumo lento

Figura 4.1. Perfil de concentracin de los azucares reductores totales a lo largo de la
fermentacin del mosto (FCO), seguido por el mtodo del reactivo de Fehling.

De la figura 4.1, se puede observar que la concentracin de los azcares
reductores fue disminuyendo gradualmente a lo largo del proceso de fermentacin.
Durante las primeras 12 horas, el consumo de los azcares reductores fue lento,
esto se debe a que los microorganismos, ms que a consumir los azcares del
medio de fermentacin se reproducen.


60

Resultados y Discusin
Mientras que de las 16 a 30 horas, el consumo de los azcares fue ms
rpido, puesto que una vez reproducidos los microorganismos, llevan a cabo el
metabolismo fermentativo del que se produce etanol. Finalmente se puede
observar que despus de las 30 horas, la fermentacin fue muy lenta, ya que la
concentracin de los azcares en el medio es muy baja [36].

La tendencia del comportamiento del perfil de concentracin de los ART a
lo largo de la fermentacin del mosto en funcin del tiempo de fermentacin
presentado en la figura 4.1, es muy similar al reportado por Phisalaphong y
colaboradores [37].

4.3. Determinacin de la concentracin de etanol producido a lo largo de la
fermentacin del mosto a las condiciones ptimas encontradas.
Para determinar la concentracin de etanol producido a lo largo de la
fermentacin del mosto, primero se realiz una curva de calibracin del in
cromato, para obtener el coeficiente de absortividad molar de este in. Se utiliz
como estndar una solucin de dicromato de potasio 1x10
-3
M, la absorbancia se
midi en el intervalo de longitud de onda de 300 a 500 nm, debido a que el in
cromato presenta su mximo de absorcin a 355 nm.




61

Resultados y Discusin
En la figura 4.2, se muestran los espectros de absorcin del in cromato a
diferentes concentraciones, obtenidos a partir de la disolucin de dicromato de
potasio. De sta figura, se puede observar una banda ancha de absorcin entre
325 y 400 nm, presentando el mximo a 355 nm. De igual manera se aprecia que
la absorbancia se incrementa con el aumento de la concentracin de la disolucin
de dicromato de potasio.

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
300 350 400 450 500
Longitud de onda (nm)
A

(
u
.
a
.
)
355 nm
8.0x10-5 M
8.0x10-4 M

Figura 4.2. Espectros de absorcin del in cromato, obtenidos a partir de la disolucin de
dicromato de potasio a diferentes concentraciones.


En la figura 4.3, se presenta la grfica de absorbancia del in cromato en
funcin de la concentracin de la solucin de dicromato de potasio a la longitud de
onda de 355 nm.

62

Resultados y Discusin
De la figura 4.3, se puede observar que se cumple con la ley de Beer en el
intervalo de concentraciones de la solucin de dicromato de potasio de 8.0x10
-5
a
8.0X10
-4
M, ya que los resultados de absorbancia obtenidos en funcin de la
concentracin se ajustan a una lnea recta (R
2
=0.994).

0
0.5
1
1.5
2
0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001
[in cromato,M]
A

(
u
.
a
.
)

Figura 4.3. Grfica de absorbancia del in cromato en funcin de la concentracin del
dicromato de potasio a la longitud de onda de 355 nm.

El coeficiente de extincin molar absortividad molar del in cromato, se
determin a partir del anlisis estadstico de los datos presentados en la Tabla 4.4.







63

Resultados y Discusin
Tabla 4.4. Coeficiente de absortividad molar en funcin de la absorbancia del in
cromato a 355nm de longitud de onda y trayecto de celda de 1 cm.

= (A/Cb)
*
A (u.a.)
= 355 nm
[K
2
Cr
2
O
7
]
M
2788.384500 0.22307076 8.0x10
-5

2258.893125 0.36142290 1.6X10
-4

2382.983750 0.57191610 2.4X10
-4

2469.698719 0.79030359 3.2X10
-4

2406.664950 0.96266598 4.0X10
-4

2294.625333 1.10142016 4.8X10
-4

2150.979214 1.20454836 5.6X10
-4

2349.146453 1.50345373 6.4X10
-4

2229.374153 1.60514939 7.2X10
-4

2289.009388 1.83120751 8.0X10
-4


*: A, es la absorbancia de la solucin del in cromato a 355 nm de longitud de onda
(columna 2); C, es la concentracin de la solucin de dicromato (columna 3) y b, es el trayecto de
celda (1 cm)

Para determinar la desviacin estndar s as como el intervalo de confianza
utilizando el estadstico t de Students de un 95 % de nivel de confianza (t =
2.228) se emplearon las ecuaciones 4.1 y 4.2.


( )
1
2

=

n
X Xi
S (4.1)



64

Resultados y Discusin
Donde:
X
i
= es el coeficiente de extincin molar, , del in cromato (Columna 1, tabla 4.4),
desde i = 1 hasta n = 10.
X = al promedio de los coeficientes de extincin molar, , del in cromato.

n
ts
X = (4.2)

El valor obtenido para la desviacin estndar s y el intervalo de confianza
, fueron los siguientes: s =176 y = 2362 124, respectivamente, por lo tanto el
coeficiente de extincin molar, es el promedio, = 2362.

( )
cm mol
L
cm
L
mol
Cb
A
.
1
= = =

Una vez determinado el valor de , se procedi a realizar los clculos para
determinar la concentracin de etanol producido a lo largo de la fermentacin del
mosto, mediante la reaccin de oxidacin de ste por accin del cromo (VI).

Los resultados se muestran en la Tabla 4.5, donde la primera columna
corresponde al volumen utilizado de la solucin de dicromato de potasio 1x10
-3
M,
en la cul se recolect el destilado; la segunda columna es la absorbancia
correspondiente a la reaccin entre el etanol y el Cr (VI); la tercera columna

65

Resultados y Discusin
corresponde a la concentracin del in cromato que no reacciona con el etanol, el
cul se determin utilizando la absorbancia (=355 nm) y el coeficiente de
absortividad molar calculado ( = 2362), mediante la ecuacin A = bC; en la
cuarta columna se presenta la concentracin del in cromato que reacciona con el
etanol, el cul se determin a partir de la diferencia entre la concentracin inicial
de la solucin de dicromato de potasio (1X10
-3
M) y la concentracin del in
cromato que no reacciona (Tercera columna, Tabla 4.5).

Tabla 4.5. Resultados obtenidos durante la determinacin de la concentracin de
etanol producido a lo largo de la fermentacin del mosto (FCO).

V(K
2
Cr
2
O
7
)
(mL)
A (u.a.)
= 355 nm
[HCrO
-4
]
Sin reaccionar
M
[HCrO
-4
]
Reacciona
M
25 1.52818942 5.7766X10
-4
4.2234X10
-4

25 0.88084185 2.9134X10
-4
7.0866X10
-4

25 0.84362376 2.7903X10
-4
7.2097X10
-4

25 0.48520106 1.5561X10
-4
8.4439X10
-4

25 0.34913960 1.0557X10
-4
8.94439X10
-4

25 0.27293569 8.2535X10
-5
9.1746X10
-4

25 0.24117178 7.2928X10
-5
9.2707X10
-4

25 0.19782861 5.9824X10
-5
9.4017X10
-4

25 0.16806671 5.0824X10
-5
9.4917X10
-4

25 0.08923515 4.4915X10
-5
9.5508X10
-4

25 0.04526991 1.4518X10
-5
9.8548X10
-4

25 0.03157989 9.8301X10
-6
9.9016X10
-4

35 0.03336561 1.0986X10
-5
9.8901X10
-4

35 0.02778527 9.5749X10
-6
9.9042X10
-4

35 0.03565255 1.2006X10
-5
9.8799X10
-4

40 0.05133419 1.8111X10
-5
9.8188X10
-4

50 0.08596646 3.3086X10
-5
9.6691X10
-4


66

Resultados y Discusin
Finalmente, para determinar la concentracin del etanol producido a lo largo
de la fermentacin del mosto, se emple la relacin estequiomtrica de la
siguiente reaccin:

3CH
3
CH
2
OH + 4HCrO
4
-
+ 16H
+
3CH
3
COOH + 4Cr
3+
+ 13H
2
O


Tabla 4.6. Concentracin de etanol producido a lo largo del proceso de
fermentacin a las condiciones ptimas encontradas (FCO).

Tiempo
(horas)
[Etanol]
M
[Etanol]
g/L
0 2.8280X10
-4
0.013009113
3 4.1522X10
-4
0.019100378
4 4.2243X10
-4
0.019432179
6 4.7976X10
-4
0.022068958
8 4.7915X10
-4
0.022040981
10 4.9149X10
-4
0.022608872
12 4.9664X10
-4
0.022845584
16 5.0848X10
-4
0.023390382
18 5.3615X10
-4
0.024662951
20 5.5993X10-
4
0.025756869
22 5.4604X10
-4
0.025118259
24 5.7692X10-
4
0.026538515
26 6.0462X10
-4
0.027812516
28 5.8942X10
-4
0.027113678
30 6.1368X10
-4
0.028229300
46 6.5925X10
-4
0.030325899






67

Resultados y Discusin
En la Figura 4.4, se presenta el grafico de concentracin de etanol
producido a lo largo de la fermentacin del mosto en funcin del tiempo. De esta
figura, se puede observar que la concentracin de etanol fue incrementando
gradualmente a lo largo del proceso de fermentacin.

0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0 10 20 30 40 50
Tiempo (horas)
[
E
t
a
n
o
l
]
,

g
/
L

Figura 4.4. Grafico de la concentracin de etanol producido a lo largo de la fermentacin
del mosto (condiciones ptimas 1.0 g/L de levadura y 70 % en volumen de agua).

4.4. pH de fermentacin.
El pH, es un factor que se debe cuidar en la fermentacin, debido a su
importancia en el control de la contaminacin bacterial como tambin al efecto en
el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentacin y en la formacin
de etanol.

68

Resultados y Discusin
Cuanto ms bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infeccin, pero
si se trabaja con pH muy bajos la fermentacin es muy lenta, ya que la levadura
no se desarrolla de la forma conveniente. Segn estudios se hall que el pH ms
favorable para el crecimiento de la Saccharomyces Cerevisiae se encuentra entre
4.4 5.0, con un pH de 4.5 para su crecimiento ptimo, aunque puede sobrevivir
de 3.0 a 7.5 [38].

La medicin del pH, se realiz en el mosto FCO (1 g/L de Levadura y 70 %
de agua adicionada al mosto), durante el proceso de fermentacin. Para esto, a
cada intervalo de tiempo, primero se homogeniz el mosto mediante agitacin y
enseguida se sumergi el electrodo del pH-mtro para la medicin del pH.

En la Figura 4.5, se presenta la grafica de pH con respecto al tiempo de
fermentacin del mosto, registrado al inicio as como a lo largo de la fermentacin.
De esta figura, se puede observar que el pH inicial fue de 4.7, el cul fue
disminuyendo lentamente a lo largo del proceso de fermentacin hasta llegar a un
pH de 3.9, a las 30 horas de fermentacin. Despus de 30 horas de fermentacin
ste presento un cambio de 0.003; debido a que la concentracin de azucares es
muy baja, por lo que su conversin a etanol es mnima, por lo tanto, al no haber
cambios en la concentracin de azucares y etanol el pH se mantiene
prcticamente constante.


69

Resultados y Discusin
3
3,5
4
4,5
5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)
p
H

Figura 4.5. Grfica de pH de fermentacin del mosto a las condiciones ptimas 1.0 g/L de
Levadura y 70 % en volumen de agua.

4.5. Anlisis por cromatografa de gases.
El anlisis por cromatografa de gases se realiz a las muestras de
condensados obtenidos durante la destilacin del mosto fermentado en los
sistemas D, E y F, correspondiente al 30, 50 y 70 % en volumen de agua,
respectivamente, as como el del FCO (1.0 g/L de levadura y 70 % en volumen de
agua). Con lo que respecta a los sistemas de fermentacin A, B y C, estos
presentaron una consistencia muy espesa al final del proceso de fermentacin, por
lo que fue imposible destilarlos.




70

Resultados y Discusin
4.5.1. Anlisis cualitativo.
La identificacin del, o de los compuestos, principalmente etanol, presentes
en las muestras de condensados obtenidos durante las destilaciones del mosto,
fermentado en los sistemas D, E y F, as como en el del FCO, se realiz mediante
la comparacin de los tiempos de retencin (que es nico para cada compuesto a
las mismas condiciones) obtenidos durante las inyecciones de los siguientes
estndares puros as como de la mezcla equimolar de los mismos: metanol,
etanol, 2-propanol, acetato de etilo y butanol.

En la Tabla 4.7, se presentan los tiempos de retencin de cada uno de los
estndares mencionados anteriormente, los cuales fueron obtenidos a partir de las
inyecciones en forma pura as como en el de la mezcla de los mismos.

Tabla 4.7. Tiempos de retencin obtenidos a partir de las inyecciones de los
estndares en forma pura as como en el de la mezcla.

Compuesto
Pura
t
R
(minutos)
Mezcla
t
R
(minutos)
Metanol 2.224 2.282
Etanol 2.372 2.436
2-propanol 2.540 2.604
Acetato de etilo 3.389 3.445
Butanol 4.221 4.354


71

Resultados y Discusin
En la Figura 4.6, se muestra el cromatograma obtenido a partir de la
inyeccin de la mezcla de los estndares mencionados anteriormente. De esta
Figura, se puede observar una buena separacin de los picos correspondientes a
cada uno de los estndares.

Figura 4.6. Cromatograma obtenido a partir de la inyeccin de la mezcla de los
estndares.

En las Figuras 4.7 (a), (b) y (c), se muestran los cromatogramas obtenidos a
partir de las inyecciones de las muestras de condensados obtenidos durante la
destilacin del mosto fermentado en los sistemas D, E y F, respectivamente.





2
-
p
r
o
p
a
n
o
l

M
e
t
a
n
o
l

E
t
a
n
o
l

A
c
e
t
a
t
o

d
e

e
t
i
l
o

B
u
t
a
n
o
l

Tiempo de retencin (min)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)

6 5 4 0 1 2 3
72

Resultados y Discusin


Figura 4.7. Cromatgramas obtenidos a partir de las inyecciones de las muestras
de condensados obtenidos durante la destilacin del mosto fermentado en los sistemas D
(30 % en volumen de agua) (a), E (50 % en volumen de agua) (b) y F (70 % en volumen
de agua) (c).



0
6
1 2 3 4 5
(b)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)

Tiempo de retencin (min)
E
t
a
n
o
l

1 2 3 4 5
E
t
a
n
o
l

Tiempo de retencin (min)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)

6 0
(c)
1 2 3 4 5 6 0
E
t
a
n
o
l

Tiempo de retencin (min)
(a)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)

73

Resultados y Discusin
De la Figura 4.7, se puede observar que en cada uno de los cromatogramas
presentados, aparece un solo pico, cuyo tiempo de retencin fueron: 2.368
minutos, 2.380 minutos y 2.398 minutos, respectivamente. Al comparar stos
tiempos con los tiempos de retencin de los estndares presentados en la Tabla
4.7, se pudo observar que dichos tiempos corresponde al tiempo de retencin del
etanol, por lo tanto se puede decir que en el mosto fermentado en los sistemas, D,
E y F, se tiene nicamente etanol.

En la Figura 4.8, se muestra el cromatograma obtenido a partir de la
inyeccin de la muestra de condensado obtenido durante la destilacin del mosto
FCO. De ste cromatograma, se puede observar un solo pico, cuyo tiempo de
retencin fue, 2.376 minutos, lo cual al compararlo con los tiempos de retencin de
los estndares presentados en la Tabla 4.7, se pudo observar que dicho tiempo
corresponde al tiempo de retencin del etanol, por lo tanto se puede decir que en
el mosto fermentado a las condiciones ptimas, se tiene nicamente etanol.








74

Resultados y Discusin


Figura 4.8. Cromatgrama obtenido a partir de la inyeccin de la muestra de
condensado obtenido de la destilacin del mosto fermentado a las condiciones ptimas.

4.5.2. Anlisis cuantitativo.
La concentracin de etanol presente en cada una de las muestras de
condesados obtenidos durante la destilacin del mosto, se determin mediante el
mtodo de las adiciones estndar, utilizndose como estndar interno, butanol. El
mtodo de las adiciones estndar, consiste en aadir sobre una serie de alcuotas,
cantidades conocidas del componente a determinar (en este caso etanol), y medir
la magnitud de la propiedad analtica de inters tras las diferentes adiciones.




1 2 3 4 5
6
0
Tiempo de retencin (min)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)

E
t
a
n
o
l

75

Resultados y Discusin
En la Figura 4.9, se muestran los cromatogramas obtenidos a partir del
anlisis de adiciones estndar de las muestras de condensados obtenidos durante
la destilacin del mosto fermentado en los sistemas D, E y F, correspondientes al
30, 50 y 70 % en volumen de agua, respectivamente.

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de retencin (min.)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
.
)
B
u
t
a
n
o
l
E
t
a
n
o
l
a)

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de retencin (min.)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
.
)
E
t
a
n
o
l
B
u
t
a
n
o
l
b)

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de retencin (min.)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
.
)
c)
E
t
a
n
o
l
B
u
t
a
n
o
l

Figura 4.9. Cromatogramas obtenidos durante el anlisis de adiciones estndar, en los
sistemas (a) D, (b) E y (c) F.

76

Resultados y Discusin

De las tres figuras mostradas anteriormente, se puede observar en cada
caso que la intensidad del pico del etanol va aumentando conforme se realizan
adiciones del estndar (etanol puro).

Para el anlisis estadstico de los datos experimentales obtenidos a partir
de las adiciones estndar realizadas a las muestras de condensados, se
determino el intervalo de confianza con un 95 % de nivel de significancia,
considerando la t de Students = 2.015 [39] , los resultados son los siguientes:

La desviacin estndar Sc obtenido para la muestra de condensado del
mosto fermentado en el sistema D fue de 0.002, por lo tanto el intervalo de
confianza es, C
x
=

(0.047 0.004) g/mL; la desviacin estndar Sc para la del
sistema E fue de 0.051, por lo tanto el intervalo de confianza es, C
x
= (0.593
0.102) g/mL y finalmente la desviacin estndar Sc para la del sistema F fue de
0.003, por lo tanto el intervalo de confianza es, C
x
=

(0.466 0.006) g/mL.

De acuerdo a estos resultados, se puede decir que la concentracin de
etanol en la muestra de condensado del sistema E es mayor que a la del sistema
F y a la del sistema D.



77

Resultados y Discusin
En la Figura 4.10, se muestra el cromatograma obtenido a partir del anlisis
de adiciones estndar, realizado a la muestra de condensado obtenido durante la
destilacin del mosto FCO encontradas (1.0 g/L y 70 % en volumen de agua).

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de retencin (min)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

(
u
.
a
)
E
t
a
n
o
l
B
u
t
a
n
o
l

Figura 4.10. Cromatograma obtenido durante la aplicacin del anlisis de
adiciones estndar.


De la Figura 4.10, se puede observar que la intensidad del pico del etanol
va aumentando conforme se realizan adiciones del estndar (etanol puro).




78

Resultados y Discusin
Para el anlisis estadstico de los datos experimentales obtenidos a partir
de las adiciones estndar realizada a la muestra de condensado obtenido a partir
de la destilacin del mosto FCO, se determino el intervalo de confianza con un 95
% de nivel de significancia, considerando la t de Students = 2.015, el resultado del
intervalo de confianza para esta muestra de condensado es, C
x
= (0.524 0.076)
g/mL, con una desviacin estndar Sc obtenido de 0.038.

















79

Conclusiones
Las frutas, principalmente mango, por su alto contenido en azcares puede
ser utilizado para la obtencin de etanol va fermentacin.

Durante la determinacin de la cantidad de Levadura (microorganismo
fermentador) ptima para realizar la fermentacin del mosto, se pudo observar que
con base a la concentracin final de los azcares reductores en los sistemas de
fermentacin A, B y C (20 % en volumen de agua c/u) fueron similares, por lo que
la cantidad de Levadura no fue tan determinante en el consumo de los azcares.
Por otro lado, tambin se puede concluir que al trabajar con un 20 % en volumen
de agua adicionada al mosto, el proceso de filtracin del producto final de la
fermentacin no es posible.

De igual forma, durante la determinacin de la relacin A-M (agua-mosto),
se pudo observar que la concentracin final de los azcares reductores en los
sistemas D, E y F (30, 50 y 70 % en volumen de agua, respectivamente), fueron
similares, por lo que el volumen de agua adicionada al mosto tampoco fue
determinante en el consumo de los azcares. Sin embargo, es muy importante
para las operaciones posteriores a la fermentacin, la filtracin y destilacin del
producto final de la fermentacin.




80

Conclusiones
De acuerdo a lo anterior, se decidi trabajar con 1.0 g/L de Levadura y con
un 70 % en volumen de agua adicionada al mosto, por ste ltimo, debido a que a
este porcentaje de volumen de agua, la filtracin y destilacin del producto final de
la fermentacin fue ms simple.

Con lo que respecta al anlisis cualitativo de las muestras de condensado
obtenidos durante la destilacin del producto final de la fermentacin de los
sistemas D, E, F y FCO, stos demostraron que nicamente se obtuvo etanol.

Por otro lado, con lo que respecta al anlisis cuantitativo de las muestras
de condensado obtenidos durante la destilacin del producto final de la
fermentacin de los sistemas D, E, F y FCO, stos fueron los siguientes: 0.047
g/L, 0.593 g/L, 0.466 g/L y 0.524 g/mL, en los sistemas D, E, F y en el del FCO,
respectivamente. Por lo anterior se puede concluir que ambas concentraciones
son similares.








81

Glosario de trminos.
ADP.- (C
10
H
15
N
5
O
10
P
2
) es un nucletido di fosfato, es decir, un compuesto
qumico formado por un nucletido y dos radicales fosfatos. En este caso el
nuclesido lo componen una base prica, la adenina, y un azcar del tipo pentosa
que es la ribosa.
Alcoholemia.- La alcoholemia es la cantidad de alcohol que existe en la sangre o
en el aire exhalado. La tasa de alcoholemia es el nmero de gramos (g) de alcohol
en cada litro de sangre, o el nmero de miligramos (mg) en cada litro de aire
espirado, segn la forma de medir adoptada.
Anaerobio.- Adj. y m. [Organismo] que puede vivir y desarrollarse en ausencia
completa o casi completa de oxgeno molecular libre.
Analito.- En qumica analtica un analito es el componente (elemento, compuesto
o in) de inters analtico de una muestra.
ATP.- (C
10
H
16
N
5
O
13
P
3
) es un nucletido bsico en la obtencin de energa celular.
Est formado por una base nitrogenada (adenina) unida al carbono 1 de un azcar
de tipo pentosa, la ribosa, que en su carbono 5 tiene enlazados tres grupos
fosfato. Se encuentra incorporada en los cidos nucleicos. Se produce durante la
fotosntesis y la respiracin celular, y es consumida por muchos enzimas en la
catlisis de numerosos procesos qumicos.
Biomasa.- Materia total de los seres que viven en un lugar determinado,
expresada en peso por unidad de rea o de volumen.
Materia orgnica originada en un proceso biolgico, espontneo o provocado,
utilizable como fuente de energa.
82

Cultivares.- "Cultivar" es el trmino que se reserva para aquellas poblaciones de
plantas cultivadas que son genticamente homogneas y (1) comparten
caractersticas de relevancia agrcola que permiten distinguir claramente a la
poblacin de las dems poblaciones de la especie y (2) traspasan estas
caractersticas de generacin en generacin, de forma sexual o asexual.
Eluir.- Separar una sustancia que est retenida en una fase estacionaria mediante
un fluido.
Escisin.- Rompimiento.
Gliclisis.- La gluclisis o gliclisis (del griego glycos: azcar y lysis: ruptura), es
la va metablica encargada de oxidar o fermentar la glucosa y as obtener energa
para la clula.
Grado analtico.- de alta pureza.
Latencia.- Tiempo que transcurre entre un estmulo y la respuesta que produce, y,
en particular, lapso entre el momento en que se contrae una enfermedad y la
aparicin de los primeros sntomas.
Mosto.- El mosto es el jugo de la uva u otros cereales resultante de su pisado,
prensado, o cualquier otra operacin que deje libre el lquido en ellas contenido. El
mosto de las uvas se utiliza normalmente para la elaboracin posterior de vinos, el
de cebada para cerveza o whisky, el arroz para el sake, etc.
Nanosegundos.- Es la unidad de tiempo que equivale a la milmillonsima parte
de un segundo, 10
-9
segundos.
NAD
+
.- nicotinamida adenina dinucletido (tambin llamada difosfopiridina
nucletido y Coenzima I), es una coenzima que se encuentra en todas las clulas
vivas. El compuesto es un dinucletido, ya que consta de dos nucletidos unidos a
83

travs de sus grupos fosfato con un nucletido que contiene un anillo adenosina y
el otro que contiene nicotinamida. En el metabolismo, el NAD
+
participa en las
reacciones redox (oxidorreduccin), llevando los electrones de una reaccin a
otra. La coenzima, por tanto, se encuentra en dos formas en las clulas: NAD
+
y
NADH. El NAD
+
, que es un agente oxidante, acepta electrones de otras molculas
y pasa a ser reducido, formndose NADH, que puede ser utilizado entonces como
agente reductor para donar electrones. Estas reacciones de transferencia de
electrones son la principal funcin del NAD
+
.
Oxidar:- Dicho del oxgeno o de otro agente oxidante: Producir xido al
reaccionar con una sustancia.
Pirolizan.- Descomposicin qumica que se obtiene por accin del calor.
Picosegundos.- Es la unidad de tiempo que equivale a la billonsima parte de un
segundo, 10
-12
segundos.
t.- En probabilidad y estadstica, la distribucin t (de Student) es una distribucin
de probabilidad que surge del problema de estimar la media de una poblacin
normalmente distribuida cuando el tamao de la muestra es pequeo. sta es la
base de la popular prueba t de Student para la determinacin de las diferencias
entre dos medias mustrales y para la construccin del intervalo de confianza para
la diferencia entre las medias de dos poblaciones. La distribucin t surge, en la
mayora de los estudios estadsticos prcticos, cuando la desviacin tpica de una
poblacin se desconoce y debe ser estimada a partir de los datos de una muestra.


84

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