CUADERNO DE PRCTICAS

BIOLOGA

Curso 2006-07




rea de Biologa Celular
Universidad Pablo de Olavide



Guillermo Lpez Lluch






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INTRODUCCIN

Como complemento al aprendizaje de la materia de la asignatura de Biologa de la
Licenciatura de Ciencias Ambientales de la Universidad Pablo de Olavide el presente
cuaderno contiene las indicaciones tericas y prcticas referentes a una parte
importante del trabajo de laboratorio en la investigacin biolgica: la observacin de
muestras biolgicas al microscopio y el estudio de actividades celulares.

El presente Cuaderno de Prcticas pretende repasar de una forma breve pero lo ms
completa posible las distintas tcnicas necesarias para poder manipular las muestras
biolgicas para que puedan ser observadas tanto al microscopio ptico como al
electrnico as como las normas bsicas de uso de estos instrumentos esenciales para
el desarrollo de la Biologa Celular. A lo largo de las diferentes sesiones prcticas se
tratarn los distintos aspectos sobre el manejo del microscopio ptico y electrnico,
los diferentes pasos necesarios para la manipulacin de tejidos para que puedan ser
observados, la obtencin de fracciones celulares para el estudio de actividades y el
estudio de los diferentes tejidos tanto animales como vegetales. Con todo ello,
pretendemos dar una imagen general de los procedimientos y de la citologa e
histologa bsica que complemente de la forma ms completa posible la enseanza
terica de la asignatura.

Para todo ello, el laboratorio de prcticas del rea de Biologa Celular se ha dotado de
instrumental que permite su utilizacin individualizada por parte del alumno.
Entendemos que el alumno debe aprender a respetar y cuidar el material que va a
necesitar para poder desarrollar la prctica. Afortunadamente, en la actualidad
disponemos de una gran batera de microscopios binoculares que permiten el
adecuado desarrollo de las diferentes prcticas propuestas. El alumno de Ciencias
Ambientales de la Universidad Pablo de Olavide dispone as de un instrumental que
para s hubiesen deseado grandes investigadores como D. Santiago Ramn y Cajal que
en sus Obras literarias escribe: Escogido un desvn como obrador de mis ensayos
prcticos, y reunidos algunos reactivos, slo me faltaba un buen modelo de
microscopio. Las menguadas reliquias de mis alcances de Cuba no daban para tanto.
Por fortuna, durante mi ltima gira por la corte, me enter de que en la calle del
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Len, nmero veinticinco, Primera (no lo he olvidado todava!), habitaba cierto
almacenista de instrumentos mdicos, don Francisco Chenel, quien proporcionaba, a
plazos, excelentes microscopios de Nachet y Verick, marcas francesas entonces muy
en boga. Entabl, pues, correspondencia con dicho comerciante, y ajustamos las
condiciones: consistan en abonarle en cuatro plazos ciento cincuenta duros, importe
de un buen modelo Verick, con todos sus accesorios.(...) Poco despus me
proporcion, de la misma casa, un microtomo de Ranvier, una tournette o rueda
giratoria y otros muchos tiles de micrografa. A todo subvinieron mi paga modesta
de auxiliar y las flacas ganancias proporcionadas por los repasos de Anatoma; pero
las bases financieras del laboratorio y biblioteca fueron mis economas de Cuba (...).
(Santiago Ramn y Cajal. Obras Literarias. Mi infancia y Juventud cap XXVI. Obras
literarias completas (Segunda Edicin). Aguilar de Ediciones, SA 1950). Tomando
como modelo el aprendizaje microscpico autodidacta del premio novel D. Santiago
Ramn y Cajal, podemos comprender la enorme ventaja de la que el alumno actual
disfruta al poder disponer de instrumental de microscopa del cual D. Santiago no
pudo disfrutar hasta que no se lo pudo costear por s mismo ya que las Universidades
de la poca carecan del material ms bsico en ese momento. Pese a ello, D. Santiago
lleg a desarrollar procesos de tincin que an no han sido superados.

Entendemos, por tanto, que la oportunidad de la que dispone el alumno de Biologa de
poder acercarse al excitante mundo de la clula y los tejidos hace que las presentes
prcticas no deban ser desaprovechada ya que la observacin de clulas y tejidos sigue
siendo la base fundamental de los estudios citolgicos, histolgicos, fisiolgicos,
patolgicos, e incluso moleculares y, en general, esenciales para la comprensin del
funcionamiento esencial de las bases de la vida.

Guillermo Lpez
Profesor Titular de Biologa Celular.
Universidad Pablo de Olavide

6 de Octubre de 2003
Revisado 1 de Octubre de 2004
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PRACTICA 1
MICROSCOPA PTICA (I): FUNDAMENTOS Y UTILIZACIN
DEL MICROSCOPIO PTICO.
Introduccin
La microscopa es una herramienta fundamental de la biologa y sus
especialidades. De stas, tal vez con la que ms se ha relacionado ha sido con la
histologa, pero realmente la anatoma microscpica que queda desvelada por las
tcnicas microscpicas va ms all de los tejidos (histologa) ya que abarca a la clula
y sus componentes (citologa y biologa celular), rganos (organografa) y sistemas
orgnicos (fisiologa).
Ciertamente las tcnicas microscpicas no se deben concebir como tcnicas que nos
proporcionan una visin esttica de los componentes celulares y tisulares de los
organismos vivos para obtener una mera descripcin de estos, sino que al acompaar a
otras disciplinas de la Biologa permiten desvelar la funcin de los distintos
componentes.
Es por ello que el objetivo de la primera prctica de la asignatura de Biologa consiste
en la adquisicin de destreza en el uso del microscopio ptico como herramienta
bsica y fundamental para el estudio celular e histolgico de los diferentes organismos
vivos.
Breve historia del microscopio
Una de las bases principales de la investigacin es la observacin. Pero el
estudio de los organismos pequeos y de detalles tisulares quedaba enormemente
restringido debido a la resolucin del ojo humano (0,125 mm). La necesidad de un
nivel de resolucin mayor para incrementar la informacin obtenida mediante la
observacin propici la aparicin de instrumentos fundamentales para el desarrollo de
la Biologa como fue el microscopio inventado por Antony van Leeuwenhoek. Este
personaje, sin apenas formacin universitaria, invent el primer microscopio, gracias
al cual fue el primero en observar no slo el mundo microscpico que los dems no
advertan a simple vista, sino las estructuras que subyacen a los organismos visibles.
Las caractersticas del primer microscopio diferan de las de los actuales, ya que slo
constaban de una lente casi esfrica, montada entre dos placas metlicas. La muestra
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se situaba sobre un pequeo alfiler y mediante el concurso de dos tornillos se mova
para permitir el enfoque. Era, por tanto, un microscopio simple pero que llegaba a
producir entre 50 y 300 aumentos, dependiendo de la lente empleada (Figura 1.1).



Figura 1.1. Esquema del microscopio de Van Leeuwenhoek

Los modernos microscopios pticos datan de principios del siglo XIX y se
caracterizan por ser de tipo compuesto. Disponen de una lente ocular y una lente
objetivo. Existen actualmente diversos tipos de microscopios pticos que se
diferencian fundamentalmente en las caractersticas de la fuente de luz empleada.
Tipos de microscopios pticos
a) Microscopio de campo claro (Figura 1.2)
El microscopio ms comn en el laboratorio de histolgico se denomina
microscopio de campo claro. Es descendiente directo de los microscopios que
surgieron a partir de 1820 y que inauguraron una importante era en la investigacin
histolgica.
El microscopio actual dispone de una distribucin especfica de grupos de lentes que
permiten una gran amplificacin. La fuente luminosa es un filamento de tungsteno
cuya luz es dirigida hacia un slo punto mediante la lente condensadora. El haz
luminoso incide por debajo de la preparacin que debe ser lo bastante fina como para
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que la luz pueda atravesarla. Al pasar por la muestra,
parte de la luz es absorbida por sta y la diferencia de
absorcin de la luz en diferentes partes del espcimen
produce contrastes que revelan detalles de su estructura.
Tras atravesar la muestra, la luz pasa a travs de las lentes
objetivos que se encuentran asentadas sobre una torreta
mvil localizada por encima de la preparacin. Existen
diferentes lentes objetivos con diferentes capacidades de
amplificacin de la muestra y resolucin de la imagen
que pueden ir intercambindose a lo largo del estudio.
Finalmente, la luz pasa a travs de las lentes oculares que,
amplificndola an ms, hacen incidir la imagen sobre la
retina.
Si la muestra no ha sido coloreada previamente, normalmente el sistema ptico del
microscopio comn no puede revelar demasiados contrastes. Es por ello que por lo
general, el contraste en la muestra se intensifica mediante diversos mtodos de tincin
que usualmente utilizan sistemas de contraste mediante el uso de dos colorantes
diferentes.
b) Microscopio de contraste de fase.
El microscopio de contraste de fase permite observar clulas y tejidos sin
colorear y por eso resulta especialmente til para el examen de clulas vivas. Utiliza
pequeas diferencias del ndice de refraccin entre diferentes partes de la clula o de
una muestra de tejido debido a diferencias en las densidades de distintas zonas de
clulas y tejidos. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experi-
menta una reflexin y se retarda quedando desfasada con respecto a las ondas
adyacentes. Estas diferencias de refraccin no resultan evidentes con el microscopio
ptico, pero con el microscopio de contraste de fase las longitudes de onda fuera de
fase se anulan con otras inducidas por una serie de anillos del sistema ptico, con lo
cual puede observarse la muestra con un grado de contraste apropiado obtenido en
forma de luces y sombras.





Figura 1.2. Microscopio
compuesto de prcticas.
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Figura 1.3. Fundamento del funcionamiento de un microscopio de ptico de campo claro y uno de
contraste de fase (arriba izquierda). Fundamento de la formacin de imagen en un microscopio de
contraste de fase (arriba derecha). Imagen de una clula al microscopio ptico de campo claro (A), de
contraste de fase (B), de contraste diferencial o de Normarsky (C) o de campo oscuro (D) (Alberts y
cols, 1995).



c) Microscopio de fluorescencia (Figura 1.4).
El microscopio de fluorescencia permite detectar molculas que emiten
fluorescencia (fluorocromos). Algunas sustancias emiten luz de una determinada
longitud de onda en el espectro visible cuando son expuestas a la una longitud de onda
menor, generalmente luz ultravioleta. Se usa el microscopio de fluorescencia para
detectar molculas fluorescentes naturales (autofluorescentes) como la vitamina A o la
celulosa, pero como estas molculas no son muy numerosas. La aplicacin ms comn
de este microscopio consiste en detectar la fluorescencia artificial asociada a una
determinada sustancia o componente, como es el caso de la deteccin de
antgenos/anticuerpos en procedimientos de tincin por inmunofluorescencia.
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Figura 1.4. Microscopio de
fluorescencia.
Tambin se pueden utilizar molculas fluorescentes especficas ligadas a la expresin
de una determinada protena o bien inyectarlas a un
animal o directamente a clulas y usarlas como
marcadores.
d) Microscopio confocal
El microscopio confocal (Figura 1.5) consiste
en un microscopio compuesto al que se le ha aadido
un detector fluorescente y una fuente lser que barre la
muestra con un ngulo de incidencia muy pequeo.
Ello produce la excitacin de la muestra en un plano
de espesor muy pequeo por lo que se pueden obtener
cortes pticos muy finos de la muestra (1m). La luz
emitida por los fluorocromos es recogida por un
dispositivo digital denominado fotomultiplicador y posteriormente se almacena y
procesa digitalmente utilizando un ordenador. Todas las imgenes obtenidas se
pueden visualizar individualmente o integrarse informticamente permitindose de
esta manera el obtener imgenes finales en tres dimensiones.












Figura 1.5. Imgenes al microscopio confocal. Determinacin de microfilamentos de actina (arriba) en
neutrfilos humanos sobreexpresando diversas protenas reguladoras, abajo, control de inyeccin de
estas protenas (Bird et al., 2003).



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e) Microscopio ultravioleta
En el microscopio de luz ultravioleta se analiza la absorcin de luz UV por los
componentes de la muestra. Tiene un modo de funcionamiento similar a un
espectrofotmetro, aparato que detecta la capacidad de absorcin de luz por una
determinada sustancia, pero permite registrar los resultados como una fotografa. No
permite por supuesto una visin directa debido a la incapacidad del ojo humano de
captar la luz ultravioleta. Se utiliza para detectar ciertos componentes muy especficos
en las muestras, tales como cidos nucleicos o ciertos aminocidos.

f) Microscopio de luz polarizada
Este microscopio se basa en el diferente comportamiento que presentan ciertos
tejidos y estructuras celulares cuando la luz polarizada la atraviesa. La luz se desplaza
en infinitos planos pero al pasar a travs de ciertos prismas polarizadores, se
selecciona un determinado plano de vibracin. Por otro lado, otros prismas, los
analizadores, realizan el proceso contrario convirtiendo la luz polarizada en normal. El
prisma polarizador se encuentra en la lente condensadora, mientras que el analizador
lo est en los oculares. En la clula existen componentes istropos o
monorrefringentes que no modifican el plano de polarizacin de la luz, mientras que
otros componentes son anistropos o birrefringentes que pueden ser observados al
presentar un alto brillo bajo luz polarizada. Por tanto, este microscopio permite
identificar fcilmente las estructuras birrefringentes y suelen estar formadas por
molculas alargadas y paralelas entre s.

Componentes y manipulacin del microscopio ptico

I. Componentes
El microscopio ptico compuesto es un complejo instrumento de precisin, de
uso frecuente en los laboratorios biolgicos. Este tipo de microscopio consta de dos
partes fundamentales:
Sistema ptico
Equipo mecnico

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SISTEMA PTICO:
Podemos considerar a este sistema como el componente fundamental del microscopio,
ya que el aumento y el poder resolutivo dependen exclusivamente de este sistema. El
sistema ptico est compuesto por (de arriba abajo en un microscopio ptico normal):
Ocular
Objetivo
Condensador
Diafragma
Filtro
Espejo o fuente de luz (Figura 1.6)

Espejo o fuente de luz.
Se encuentra situado en la parte inferior del microscopio y como su nombre indica es
el dispositivo que aporta luz al microscopio. En los microscopios modernos se trata de
una bombilla incandescente o halgena mientras que en modelos ms sencillos o
antiguos el microscopio posee un espejo que refleja hacia la platina la luz que recibe
procedente de una fuente luminosa externa (luz solar, lmpara).
Filtro.
Objeto de vidrio azulado que selecciona las bandas de luz ms favorables para los
estudios microgrficos, generalmente de longitud de onda de alrededor de 540 nm.
Diafragma.
Dispositivo situado bajo el condensador y que como su nombre indica acta como un
diafragma fotogrfico regulando la cantidad de luz que incide sobre la preparacin.
Condensador.
Dispositivo situado en la trayectoria del haz luminoso que procede del espejo o fuente
de luz y se dirige a la preparacin. Tiene como finalidad la de concentrar la luz sobre
el punto de la preparacin que se est observando.
Objetivo.
Es una lente especfica de longitud proporcional al aumento que recoge la luz que ha
atravesado la muestra dando lugar a una imagen aumentada. En los microscopios se
puede elegir entre varios objetivos de distintos aumentos localizados en una sola
torreta o revolver. Brindan amplificaciones baja, media, alta y de inmersin en aceite.
Existen lentes, de ampliacin baja (4-40 aumentos), que no requieren de medios
especiales entre ellas y la muestra para ejercer su funcin, son las lentes en seco,
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mientras que otras (entre 40 y 100 aumentos) requieren aceites para su correcto
funcionamiento, son las lentes de inmersin.
De las lentes objetivo depende tanto el grado de amplificacin de la imagen como el
poder de resolucin. A la vez que amplifican aumentan el detalle de los objetos
visibles en la imagen.
Ocular.
Consiste en un conjunto de lentes situadas en la parte superior del tubo ptico que
enfoca la imagen resultante tras su paso por el objetivo sobre la retina. El objetivo
enva una imagen ampliada de la preparacin que es captada por el ocular. La lente del
ocular capta y amplifica en mayor grado an la imagen de la lente objetivo. Suele
amplificar la imagen procedente por el objetivo por un factor de 10. El ocular
magnifica la imagen producida por el objetivo, pero no aumenta el poder de
resolucin.
Se puede deducir, por tanto, que el ocular se comporta como la ampliadora del
fotgrafo, es decir, que la resolucin del microscopio depende exclusivamente del
objetivo, de aqu la inutilidad de emplear oculares con alto poder de magnificacin
con objetivos dbiles.



Figura 1.6. Esquema de un microscopio moderno.
(Indique el nombre de cada uno de sus componentes)
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EQUIPO MECNICO:
El sistema ptico del microscopio va montado sobre un soporte que recibe el nombre
de equipo mecnico que consta, al menos de:
Tornillo macromtrico Pinzas de Platina
Tornillo micromtrico Platina
Tubo ptico Charnela
Revlver Columna
Brazo Pie

Platina.
Es una mnsula normalmente cuadrada sobre la cual se coloca la preparacin. La
platina est perforada en el centro para permitir el paso de la luz a su travs y que sta
incida sobre la muestra.
Pinzas de platina.
Son ballestillas que sirven para fijar la preparacin sobre la platina.
Tornillo macromtrico.
Dispositivo que modifica la distancia existente entre la platina y el objetivo
permitiendo proceder al enfoque. Se utiliza para el enfoque a pequeo aumento y para
el enfoque aproximado a grandes aumentos.
Tornillo micromtrico.
Dispositivo que, al igual que en el caso anterior, modifica la distancia existente entre
la platina y el objetivo. En este caso, sirve para afinar el enfoque obtenido con el
tornillo macromtrico, sobretodo cuando se trabaja a grandes aumentos.
Tubo ptico.
Es el soporte de oculares y objetivos. Mantiene ambas piezas pticas en su adecuada
posicin.
Revolver.
Pieza circular sobre la que se atornillan varios objetivos. Permite cambiar de objetivo
de trabajo con un simple movimiento de rotacin.
Brazo.
Parte que une las diversas partes del microscopio, tubo ptico y base, constituyendo a
modo de una asa el transporte del aparato.
Columna.
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Soporte que partiendo del pie se une al brazo mediante un eje (charnela).
Charnela.
Eje que une la columna con el brazo y sobre el cual puede girar este ltimo para hacer
observaciones, ms cmodas, aunque no es conveniente inclinarlo salvo para
preparaciones permanentes.
Pie.
Base de apoyo del microscopio. La forma ms frecuente es de "U".

Todos estos componentes transmiten la luz desde la fuente hasta el ojo del observador
tal y como se puede comprobar en la figura 1.7.


Figura 1.7 Esquema de un microscopio moderno. (Ross et al., 2004)

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II. Aspectos tericos sobre el funcionamiento del microscopio ptico.

Aumento y poder de resolucin del microscopio
Aumento proporcionado por un microscopio
Dado que el objetivo da lugar a una imagen real aumentada que es nuevamente
aumentada por el ocular, el aumento total del microscopio compuesto ser el producto
del aumento proporcionado por el objetivo y el proporcionado por el del ocular. Los
constructores de microscopios graban el aumento del objetivo y ocular sobre la propia
montura de los mismos para su mejor utilizacin.

Ejemplo Objetivo x20 con un ocular x10 dar un aumento de x200, que se suele
abreviar escribiendo 200 (200 dimetros).

Calculo del tamao de los objetos vistos al microscopio
Cuando observamos un objeto al microscopio su tamao aparece tantas veces mayor
cuantas veces sea el aumento del microscopio. Por ello para calcular el aumento real
de lo que observamos al microscopio bastar dividir el tamao aparente con que lo
vemos por el aumento.

Ejemplo Supongamos que vemos un protozoo al microscopio con un tamao
aparente de 1 mm, y que el aparato est equipado con un objetivo x20 y un ocular x10
(aumento=200),pues bien, el tamao real de aquel protozoo ser:

Tamao real =tamao aparente = 1 =0,005 mm =5 m.
Aumento 200

Poder de resolucin de un microscopio
Si bien es importante conocer el aumento del microscopio con el que se trabaja, no lo
es tanto como saber el poder resolutivo del mismo.
El poder resolutivo se refiere a la capacidad mxima para ver separados dos puntos
situados muy juntos. El poder resolutivo del ojo humano es de 0,125 mm., esto quiere
decir que a simple vista somos capaces de distinguir como independientes dos puntos
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separados 0,125 mm entre s, en tanto que si estn ms prximos los veremos como un
solo punto.
Un microscopio ptico compuesto puede resolver como mximo 0,20 m. Para un
mejor entendimiento de estos dos conceptos valga este ejemplo. Si con una lupa de 4
aumentos se observa una preparacin microscpica, no se pueden ver las clulas (cabe
pensar que hay poco aumento). Pues bien, si se hace una fotografa a travs de la lupa
y se ampla 50 veces en la ampliacin x200 tampoco se ven las clulas. No se puede
decir que no se ven porque es debido a que la imagen tiene poco aumento, ya que si se
observa la misma preparacin por el microscopio con un objetivo de 20 aumentos y un
ocular de 10, obtenemos una imagen de igualmente 200 aumentos pero se distinguen
perfectamente las clulas. En una fotografa a travs del microscopio y, sin necesidad
de ampliacin puede reconocerse esas clulas. Por qu entonces no se ven en la
primera fotografa y ahora s? Sencillamente, porque el poder de resolucin de la lupa
es pequeo y al ampliar la foto slo se consigue ver mayor lo que antes ya se vea. En
conjunto la foto muy ampliada aparecer borrosa, sin definicin. De una foto as
diremos: "exceso de ampliacin pero falta de resolucin".
Por tanto, la calidad de un juego de lentes (ocular-objetivo) depender no solo de la
capacidad de la lente para la amplificacin sino tambin de la resolucin que
presenten. La calidad de una lente depender de lo cerca que se aproxime su poder de
resolucin al lmite terico. Este lmite terico de resolucin est determinado por un
parmetro fsico, la longitud de onda de la luz visible que se utilice para la
observacin del tejido, pero tambin por el grosor del espcimen y por la apertura
numrica del objetivo.
La apertura numrica es un factor determinante en la eficiencia de un objetivo y del
condensador para dar imgenes con alta resolucin. De tal manera, a mayor apertura
numrica la imagen presenta una mejor luminosidad y resolucin. La apertura
numrica responde a la frmula:
AN =n sen
Donde n es igual al ndice de refraccin del medio que se encuentra entre el objetivo y
la preparacin. Normalmente este medio es aire (n=1) o aceite de inmersin (n=1,4).
El ngulo se corresponde a la mitad del ngulo mximo con el que el rayo de luz
entra al objetivo desde un punto enfocado en la preparacin. Es un valor fijo para cada
objetivo y se acerca a 90 cuanto ms se acerca la muestra al objetivo. Si se alcanza un
valor de de 90 su seno es igual a 1 (Figura 1.5).
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Figura 1.5. Diferente distancia focal entre objetivos de diferente aumento. El ngulo se hace ms
grande cuanto ms se acerca el objetivo a la muestra, derecha. Los objetivos con mayor capacidad de
aumento y mayor resolucin requieren de un mayor acercamiento a la muestra para poder enfocar que
los objetivos de menor aumento, izquierda. Esto permite que el ngulo alfa se acerque a los 90, valor
en el que su seno es 1.

As, la resolucin de un objetivo fue plasmada por Ernets Abbe en 1873 en lo que se
ha dado en llamar la ecuacin de Abbe:

Distancia =0,61


Por lo tanto, a una menor longitud de onda y mayor apertura numrica la distancia a la
que se observarn dos objetos cercanos como separados ser menor. Es decir, la
resolucin ser mayor.
Con una luz que tenga una longitud de onda de 540 nm, luz que pasa por un filtro
verde a la cual es muy sensible el ojo humano, y con objetivo y condensadores
adecuados, el poder de resolucin mximo que se puede alcanzar estara alrededor de
los 020-025 m. Esta es la resolucin terica que, como ya dijimos, depende de que
todas las condiciones sean optimas, inclusive las de la muestra.

III.- Manejo y enfoque del microscopio.

1.- El desplazamiento del microscopio debe realizarse tomndolo por el asa con una
mano y con la otra sustentando el pie, puesto que de otra forma puede desequilibrarse
la charnela. Debe colocarse sobre una mesa evitando las vibraciones durante la
observacin.


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2.- La platina debe colocarse en la posicin ms baja, lo ms distante del objetivo
posible. En esta posicin se coloca la preparacin en la platina.
3.- Una vez dispuesta la preparacin sobre la platina con la muestra en el centro,
utilizando el revlver y sin tocar el objetivo se elige el objetivo de menor tamao y,
por tanto, de menor aumento.
4.- Si se va a trabajar con objetivos en seco (no el de inmersin) y con preparaciones
sin teir el condensador no es necesario, por ello, se debe colocar en la posicin ms
baja, lejos de la platina, para que no haya un exceso de luz sobre la preparacin. En
caso contrario, se procede a la inversa.
5.- A continuacin se debe regular la distancia de las lentes oculares ajustndola a los
ojos.
6.- Seguidamente procede al enfoque. El enfoque de la imagen se efecta con los
tornillos estriados (macro y micromtrico). El tornillo de enfoque grueso o
macromtrico produce movimientos de la platina en incrementos mayores que el
tornillo de enfoque fino o micromtrico. Para realizar el enfoque se procede de la
siguiente forma:
Desplazar la platina con el tornillo macromtrico, mirndola desde fuera, hasta
que est cerca del objetivo. Mirando por los oculares, se empieza a separar muy
lentamente con el macromtrico hasta que se percibe la imagen. A partir de entonces,
ser el micromtrico el que se usar para apreciar los detalles y los planos de la
preparacin.
En caso del uso del objetivo de inmersin, se coloca previamente una gota de
aceite de cedro (aceite de inmersin) sobre la preparacin, desplazando la platina
hasta que el objetivo se sumerge en el aceite, y operando posteriormente como en el
caso anterior.
7.- Una vez enfocado, graduar con el diafragma la cantidad de luz requerida, incluso
se puede variar ligeramente la altura del condensador si ello mejora la calidad de la
imagen.
8.- A continuacin se desplaza la platina con una mano o mediante los tornillos
adosados a la platina si los hubiera para recorrer la muestra mientras que con la otra
mano se rectifica continuamente la posicin del tornillo micromtrico. Antes de pasar
a objetivos de mayor aumento. Conviene seleccionar la zona de la preparacin que se
quiere observar y, para ello, se debe centrar en el campo de visin que ofrece el
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microscopio, pues de otra manera, con objetivos de mayor aumento, es muy probable
que se pierda el campo elegido.
9.- Terminado el examen de la muestra se baja la platina y se retira la preparacin. A
continuacin se desconecta de la fuente elctrica y se cubre el microscopio con la
funda protectora.

IV.- Limpieza y conservacin del microscopio.

1.- Si se ha usado el objetivo de inmersin, se debe limpiar cuidadosamente el
objetivo para retirar el aceite que lo impregna. Para ello se debe usar un pao fino
mojado en xilol o etanol y secar el objetivo a continuacin teniendo la debida
precaucin ya que el exceso de xilol disuelve los pegamentos entre las lentes y su
montura.
2.- Para la limpieza de los oculares y el condensador se debe usar un pao fino y seco
que no suelte pelusa. En caso de que estas lentes se hubieran manchado con algn
reactivo, se usar el pao mojado con agua destilada y luego se secar totalmente.
Para limpiar la platina se usar un trapo seco o poco mojado en agua destilada. En
caso de que la mancha sea de aceite, hay que utilizar un poco de xilol.
En caso de que al observar la preparacin se vean partculas extraas, pelusas,
granos de polvo, etc., se debe comprobar si stas se localizan sobre el ocular, en los
objetivos o bien en la preparacin. Para comprobarlo, proceder de la siguiente
manera :
- Estar en el ocular si, enfocada la preparacin y haciendo girar el mismo, la
partcula cambia de posicin. En este caso se debe extraer el ocular para su limpieza.
- Estar en la lente objetivo si la partcula desaparece al cambiar a otro. Se
debe limpiar por la lente objetivo por fuera. No conviene desatornillarlo para su
limpieza, ya que se puede alterar la posicin de las lentes.
- Si la partcula extraa se encuentra en la preparacin, procurar limpiarla sin
alterar la muestra biolgica.
3.- La preparacin se limpiar siempre despus de retirarla del microscopio con un
pao limpio que no suelte pelusa. Si se hubiera utilizado aceite de inmersin, ste se
retirar con un papel de filtro y posteriormente con un pao de laboratorio y una gota
de limpia-vidrios. Despus se guardar en el fichero de preparaciones.
4.- A continuacin se debe proceder a guardar el microscopio adecuadamente.
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NOTA IMPORTANTE: Nunca se debe mover el microscopio de forma brusca
durante su uso ni despus de haberlo usado pues, la bombilla caliente se funde
con facilidad.






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PRCTICA 2.
MICROSCOPA PTICA (2): PROCESADO DE LA MUESTRA
BIOLGICA PARA SU OBSERVACIN.

Introduccin.
La observacin de tejidos al microscopio ptico requiere del procesamiento de
la muestra para que se obtengan cortes lo suficientemente finos para que la luz pueda
atravesarla, para que se puedan teir convenientemente y as permitir observar las
estructuras tisulares o celulares. Para ello se requiere de una serie de pasos
encaminados a conseguir una muestra debidamente procesada. Por orden cronolgico
estos pasos son: obtencin de la muestra, fijacin, inclusin, corte, tincin y montaje.
Por todo esto, el objetivo de la presente prctica es la el conocimiento de los
fundamentos y los procedimientos que se deben seguir para la obtencin de una
muestra apta para su observacin y estudio al microscopio ptico.

Procedimientos para la preparacin de la muestra.
La muestra biolgica no puede ser procesada directamente tal y como se
obtiene del espcimen para ser observada al microscopio ptico. La muestra debe ser
procesada de forma que mantenga unas condiciones lo ms cercanas posible a las
naturales pero con las caractersticas idneas de consistencia y espesor que permitan
su observacin con el microscopio.

1. Recogida.
Una condicin bsica en el estudio de muestras biolgicas es la preservacin
de sta durante todo el proceso. Es por ello que la obtencin de la muestra debe ser lo
ms rpida posible a fin de evitar los inevitables procesos de degradacin
subsiguientes a la muerte del animal. Una vez el espcimen ha muerto, en el caso de
un animal, o ha sido arrancado, en el caso de una planta, comienzan a producirse
procesos de autolisis y putrefaccin que conducen a la destruccin de estructuras
tisulares que impediran o complicaran en demasa el estudio de la muestra. La
autolisis sobreviene por la liberacin de las enzimas lisosomales y su accin sobre los
componentes celulares, dicha autolisis comienza prcticamente en el momento de la
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muerte del animal. La putrefaccin es un proceso ms tardo y se produce por la
accin de las enzimas y toxinas producidas por las bacterias que van a utilizar los
tejidos como alimento. Para evitar estos dos procesos, la recoleccin de la muestra
debe producirse lo antes posible para que inmediatamente sea fijada.

2. Fijacin.
La fijacin consiste en el tratamiento de la muestra con agentes que retardan o
evitan la aparicin de alteraciones en sta tras la muerte del organismo. Este
procedimiento trata, por tanto, de evitar los procesos de autolisis y de putrefaccin.
Los agentes fijadores pueden presentar diferente eficacia en su accin contra la
autolisis o contra la putrefaccin con lo que, de forma ms especfica, se hace
distincin entre capacidad fijadora (prevencin de la autolisis) y capacidad
conservante (prevencin de la putrefaccin).
Los agentes fijadores pueden ser tanto fsicos como qumicos. Los agentes fsicos
tienen a la congelacin como el ncleo de este tipo de fijacin. Mientras que entre los
qumicos encontramos una gran variedad de productos que actan desnaturalizando o
precipitando las protenas del tejido con lo que se evita la autolisis y en algunos casos
la putrefaccin por su efecto antibacteriano. No obstante, no existe un mtodo
universal de fijacin y no todos los fijadores conservan el tejido indefinidamente.
Adems, ya que los defectos de fijacin no pueden ser corregidos posteriormente, la
eleccin de un determinado fijador debe ajustarse a los objetivos para los que la
muestra va a ser utilizada.

Agentes fsicos.
La congelacin es la base de la fijacin mediante agentes fsicos. Es ideal para
aquellos procedimientos que necesiten de la conservacin intacta de la estructura
antignica y del contenido enzimtico (histoqumica e inmunohistoqumica). Este
mtodo requiere inexcusablemente de rapidez en la congelacin de la muestra ya que
procesos lentos provocan la aparicin de cristales de agua que provocan roturas en la
estructura tisular. Normalmente se utiliza la congelacin en Nitrgeno lquido (-121
C) aunque su posterior manipulacin en criofractura no es aconsejable debido a la
naturaleza quebradiza de la muestra procesada de esta forma. En este caso es idneo el
procesamiento de pequeos bloques de muestra en isopentano a -50 C donde la
muestra se congela en unos 10 segundos.
23
Otros mtodos ms complejos son la criodesecacin y la criosustitucin. La
criodesecacin o liofilizacin consiste en la fijacin en nitrgeno lquido y la posterior
desecacin por sublimacin mediante la utilizacin de una bomba de vaco. Al
perderse toda el agua, este procedimiento presenta una gran capacidad de
conservacin y mantiene muy bien las caractersticas antignicas. La criosustitucin
consiste en la sustitucin del agua congelada por un lquido fijador. El procedimiento
consiste en la congelacin en nitrgeno lquido o isopentano y la posterior inmersin
en un medio de sustitucin: alcohol etlico, acetona o propilenglicol a 40 C y el
mantenimiento de la muestra a temperaturas por encima del punto de congelacin del
respectivo lquido para as evitar la formacin de cristales.

Fijadores qumicos.
Las sustancias fijadoras ideales deben presentar la mejor capacidad para los siguientes
procesos:
- Bloqueo de la autolisis. En este proceso son importantes los
parmetros de velocidad de penetracin en la muestra y velocidad
de fijacin.
- Efecto microbicida. Con el que se evita la putrefaccin.
- Evitar los efectos osmticos ya que producen retracciones y
distorsiones en la muestra.
- Induccin de cambios de textura y composicin tisular que
permitan los pasos posteriores del procesado de la muestra:
inclusin, corte y tincin.
- Efecto mordiente: mejora la tincin de la muestra.

Los fijadores qumicos los podemos clasificar en los siguientes grupos:

Fijadores simples:
a) Fijadores por deshidratacin tisular.
Producen grandes cambios en la morfologa tisular pero mantienen la estructura
antignica al revertirse la floculacin tras la rehidratacin de la muestra. Disuelven las
grasas pero conservan bien los glcidos. Entre ellos encontramos:
Alcohol etlico
Acetona
24
Metanol: especialmente para extensiones de sangre (mantiene bien el
citoesqueleto de tubulina).

b) Fijadores por cambio en el estado coloidal de las protenas.
Precipitan las protenas al bajar el pH por debajo del punto isoelctrico de stas. El
proceso se basa en que por debajo de este punto las molculas de agua alrededor de las
cargas negativas de las protenas se retiran y stas floculan, es decir, se amalgaman
unas con otras. Todos estos fijadores son cidos y se suelen utilizar en mezcla con
otros.
cido actico: bueno para nucleoprotenas y cidos nucleicos, no para
membrana y citoplasma.
cido tricloroactico: especialmente bueno para tejido nervioso, no lo es para
nucleoprotenas y cidos nucleicos.
cido crmico: muy bueno como fijador estructural y buen mordiente para
coloraciones bsicas

c) Fijadores que actan formando sales en los tejidos
Provocan la precipitacin de protenas al formar sales con ellas. Presentan por lo
general gran velocidad de fijacin aunque poco velocidad de penetracin por lo que
requieren trozos pequeos de muestra. Su mayor problema es que largas exposiciones
al fijador provocan el endurecimiento de la muestra que afecta al proceso de corte.
Cloruro mercrico o sublimado (HgCl
2
): muy bueno para caracteres
morfolgicos, muy buena capacidad mordiente. Produce un precipitado de color pardo
que afecta a la tincin por lo que hay que lavarlo previamente.
Dicromato potsico (K
2
Cr
2
O
7
): Alta capacidad mordiente. Buen fijador para
lpidos complejos. Esencial en la tcnica de Golgi del sistema nervioso. Disuelve la
cromatina si las condiciones se acercan a pH neutro por lo que requiere de grandes
lavados para evitar que en la rehidratacin queden restos.
cido pcrico (2,4,6-trinitrofenol): explosivo. Excelente para fijaciones
estructurales presentando una ptima contraccin del tejido. Una buena velocidad de
fijacin. No disuelve los lpidos ni el glucgeno y presenta una gran estabilidad. Debe
ser eliminado antes de parafinar porque puede romper las clulas.
Acetato de uranilo: fijador especfico para microscopa electrnica (ver
prctica 3).
25

d) Fijadores que actan por reticularizacin de las protenas.
La fijacin de las protenas no se produce por precipitacin sino por la formacin de
una malla tridimensional entre diferentes protenas y el compuesto fijador al unirse
ste a grupos activos de la protena y unir protenas entre s. Encontramos dentro de
este grupo a:
Formaldehdo o formol (4%) o formalina (solucin del 37-39% de formol) 1:9
en agua. Es el fijador ms utilizado en histologa. Forma enlaces entre todos los
grupos qumicos excepto los cidos. Provoca grandes cambios en la estructura
antignica de las protenas aunque no afecta a los hidratos de carbono. Es barato,
excelente para tejido adiposo y para lpidos en general. Su velocidad de fijacin puede
ser acelerada aumentando la temperatura. Compatible con todas las tinciones
generales aunque su utilizacin durante largo tiempo produce cido frmico y afectar
a la cromatina. Para evitar ciertos problemas se pueden utilizar derivados como los
siguientes:
Formol salino: para evitar su efecto osmtico se utiliza una solucin de
formol isoosmtica con el interior celular.
Formalina neutra: utiliza una solucin con carbonato clcico insoluble
que neutraliza la formacin de cido frmico.
Formol tamponado: la ms empleada hoy da que previene el choque
osmtico.
Formalina cida: fijacin de tejido nervioso para impregnacin
argntica.
Formol clcico (solucin de Baker): previenen la difusin de los
fosfolpidos y estabiliza enzimas por lo que se utiliza para algunas tcnicas de
histoenzimologa.

Glutaraldehido: Preserva excepcionalmente la morfologa celular por lo que se
utiliza preferiblemente en microscopa electrnica. Debido a su muy baja velocidad de
penetracin, requiere de trozos pequeos de tejido. Endurece el tejido por lo que la
fijacin no puede exceder de las 3 horas. Presenta una baja osmolaridad baja por lo
que requiere de soluciones tamponadas.

26
Tetrxido de smio: el mejor fijador conocido para estructuras celulares por lo
que se utiliza para la Microscopa electrnica. Se suele utilizar como segundo fijador.
No obstante es muy insoluble, lbil frente a la luz, txico, con baja capacidad de
penetracin e incompatible con fijadores reductores como el formaldehdo.

e) Mezclas fijadoras.
Cuando la utilizacin de fijadores simples no es la ideal para la fijacin de una
determinada muestra se utiliza la combinacin de varios fijadores para as obtener una
fijacin acorde a los requerimientos del estudio. A estas combinaciones se las conoce
como mezclas fijadoras. Las mezclas se clasifican en dos grupos dependiendo de que
contengan o no formaldehdo.

Contienen formol:
Fijador Bouin: Composicin: cido pcrico, formalina y cido actico. Se
utiliza como alternativa a la formalina cuando no se quiere utilizar el sublimado a
causa de su alto poder de endurecimiento que vuelve quebradizos tejidos como la piel,
testculos, rganos endocrinos, y tejidos embrionarios. No est indicado para fijar
muestras de rin ya que provoca grandes distorsiones en la estructura de este rgano.
Fijador Bouin-Hollander: Composicin: la misma que la anterior pero con
acetato neutro de cobre. Variante de la anterior pero ideal para mdula sea cuando no
se puede controlar el tiempo de fijacin de la muestra.
Bouin alcohlico: Variante del Bouin con alcohol e ideal para muestras
voluminosas.
Lquido de Gendre: variacin del Boun alcohlico con su misma composicin
cualitativa y especial para depsitos de glucgeno y pigmentos derivados de la
hemoglobina
Fijador de Mller: combinacin de un fijador simple, el dicromato potsico
con sulfato sdico y sin formaldehdo. Es esencial para la fabricacin de los fijadores
de Orth y de Zenker.
Fijador de Orth: Fijador de Mller ms formaldehdo. Esencial para la reaccin
cromafn o para impregnacin argntica del tejido nervioso.
Solucin de B-5 y Zenker-formol (Lquido de Helly): Ambas son casi idntica
siendo la B-5 una modificacin de la de Zenker. La solucin de Zenker-formol lleva,
adems, los componentes del fijador de Mller. Son unos fijadores indicados para la
27
tincin de ncleos. Tambin es el fijador de eleccin para el rin, hgado, fibras de
tejido conectivo y la fibrina.

No contienen formol.
Lquido de Zenkel. Con poca utilizacin en la actualidad siendo igual que el
Zenker-formol pero con cido actico en lugar de formol.
Lquido de Carnoy. Un sistema ideal para la fijacin de componentes
vegetales, especialmente meristemos ya que es el mejor fijador para el glucgeno y en
general para los hidratos de carbono, principales componentes de la pared celular de
los vegetales. Deshidrata rpidamente la muestra.

Existen fijadores especficos para la microscopa electrnica que se tratarn en su
prctica correspondiente.

Tabla 2.1
En la siguiente tabla se indican los fijadores ms utilizados en histologa y su
capacidad sobre determinadas substancias celulares y el mantenimiento de la actividad
o capacidad antignica.

Grasas
neutras
Glucgeno Enzimas Antgenos
Formaldehdo Preserva Preserva Preserva Preserva mal
Alcohol etlico Disuelve Precipita Preserva -----
Acetona Disuelve Mal fijador Preserva Preserva muy
bien
Sublimado Preserva Preserva ----- Preserva muy
bien
Glutaraldehido Preserva Preserva ----- Preserva
Tetrxido de osmio Fija ------- ----- -----



28
Inclusin.
Las muestras deben ser procesadas hasta obtener lminas delgadas de unas
pocas micras de espesor. Estas lminas no pueden ser cortadas sin un endurecimiento
previo de la muestra para que adquiera la consistencia adecuada. Un ejemplo visual de
este hecho es si tenemos en cuenta la capacidad que tenemos de cortar una loncha fina
de jamn curado o de otro que an est blando, sern ms finas las lonchas en aqul
que tenga la mayor consistencia sin llegar a un endurecimiento extremo.
Para facilitar la inclusin en un medio adecuado se requiere de una deshidratacin en
la que las preparaciones pierdan toda el agua ya que los medios de inclusin suelen ser
no miscibles con sta.
La deshidratacin se obtiene mediante la utilizacin de agentes qumicos
deshidratantes o mediante la criosustitucin o criodesecacin. En principio la
deshidratacin se obtiene con cualquier agente que sea capaz de absorber el agua de
los tejidos. Un deshidratante ideal no debe alterar las estructuras tisulares y debe
mezclarse con el reactivo intermediario o aclarante. La prctica totalidad de los
procesos de deshidratacin se basan en la gradacin de alcoholes consistente en la
inmersin de la muestra ya fijada en alcoholes en gradacin ascendente (50, 70, 90, 96
por ciento y absoluto). Se evita con esta tcnica la contraccin brusca del tejido que
ocurrira si se utilizase el alcohol absoluto desde un principio. Los tipos de tejido
indicarn variaciones sobre esta gradacin. El volumen del bao de alcohol es esencial
ya que se puede llegar a un equilibrio entre el grado de hidratacin de la muestra y del
alcohol con lo que hay que utilizar grandes volmenes de alcohol en referencia con la
muestra o cambios de bao de un alcohol de la misma gradacin. La duracin tambin
vara segn la muestra. A veces se emplean agentes accesorios como sulfato de cobre
anhidro, xido de calcio que producen una mejora en el proceso de deshidratacin al
eliminar el exceso de agua en el propio agente deshidratante.
Tras la deshidratacin se procede al aclarado que consiste en la sustitucin del agente
de deshidratacin por un agente miscible con el medio de inclusin. El agente de
aclarado ms utilizado es el xileno aunque tambin se pueden utilizar el tolueno,
benceno, cloroformo, tetracloruro de carbono y dioxano. Cada uno tiene sus
peculiaridades especficas.
Tras el aclarado se produce el infiltrado o impregnacin. Su fundamento radica en la
ocupacin completa con este medio de impregnacin de los espacios intra y
extracelulares inicialmente ocupados por el agua intratisular lo que se denomina
29
tambin embebido de la muestra. Para ello hay que eliminar completamente todos los
medios aclarantes de la muestra. El mtodo ms utilizado es la inclusin en parafina.
La parafina es una sustancia crea compuesta por una mezcla de hidrocarburos
saturados de cadena larga y que puede obtenerse con diferentes puntos de fusin
aunque las ms utilizadas actualmente tienen un punto de fusin de 54 a 58 C, muy
por encima de la temperatura ambiente. El grosor de los cortes, el tipo de tejido y la
temperatura del corte indicarn el tipo de parafina a utilizar siendo aquella de mayor
dureza (60-68 C) la utilizada para grosores ms finos.
El procedimiento de infiltracin consiste en la inmersin en baos seriados de parafina
para evitar que sta se cargue de medio de aclarado que produce un descenso del
punto de fusin y el reblandecimiento de la parafina. En algunos casos se inicia el
proceso de infiltrado con mezclas de benceno-parafina con concentraciones crecientes
de parafina que permiten una mayor capacidad de infiltracin.
Una vez infiltrada completamente la muestra se procede al encastramiento del tejido y
a la confeccin de los bloques. El encastramiento consiste en la colocacin de la
muestra en un casete de inclusin y el enfriado lento a 10-15 C. La muestra se coloca
en un recipiente denominado portabloques y una vez cubierto completamente con
parafina fundida se deja enfriar y endurecer hasta que se pueda cortar.

Otros mtodos de inclusin.
Raramente se pueden utilizar otros medios de inclusin como son la gelatina y la
celoidina. La primera es hidrosoluble por lo que no requiere de una deshidratacin
previa de la muestra mientras que la celoidina es soluble en alcohol-ter y benzoato de
metilo (50:50). El procedimiento en este ltimo caso es largo, incluso de das pero es
indicadas para muestras neurohistolgicas y duras o frgiles como muestras de ojo.
Los cortes, no obstante, no pueden ser inferiores a las 10 micras de espesor. Otros
medios son hidrosolubles pero distintos de las gelatinas como el polietilenglicol o sus
derivados. Otros mtodos utilizan resinas plsticas como metil-metacrilato, glicol-
metacrilato, etc. que generalmente presentan una gran dureza y que son los indicados
para las muestras de microscopa electrnica.
30
Tallado y corte de los bloques.
Una vez obtenido el bloque se procede al corte de la muestra. Antes de obtener
los cortes definitivos de la muestra ha de eliminarse la parafina sobrante que rodea a la
muestra ya que su presencia puede producir distorsiones en el proceso de corte. A este
procedimiento se le llama tallado de la muestra.
Los cortes para el MO se realizan en el microtomo (Figura 2.1). El microtomo es un
aparato que permite la obtencin de secciones tisulares de un espesor micromtrico
por lo que son lo suficientemente delgadas para su posterior observacin. Este aparato
consta de una hoja cortante y un brazo que hace avanzar al bloque de la muestra con
incrementos iguales previamente determinados por el usuario. La microscopa ptica
utiliza espesores de entre 5 y 10 micras. Existen diferentes tipos de microtomos
dependiendo del tipo de movimiento que se realice para el corte. Normalmente es el
microtomo de rotacin o tipo Minot el ms utilizado en los laboratorios donde el
portabloques, en posicin vertical, se mueve de arriba abajo delante del filo de la
cuchilla. En cada rotacin el portabloques se mueve automtica y constantemente
hacia delante segn se haya indicado.


Microtomo de rotacin. Microtomo horizontal

Criotomo
Figura 2.1. Diferentes tipos de microtomos utilizados en un laboratorio.

Los cortes tambin se pueden realizar en ejemplares congelados en nitrgeno lquido.
Las muestras congeladas se cortan a temperaturas por debajo de cero grados mediante
31
una hoja de acero enfriada y en este caso el aparato en cuestin recibe el nombre de
criotomo o criostato (Figura 2.1).
Los cortes obtenidos con el microtomo son depositados en un bao con agua caliente
y generalmente gelatinada con una temperatura entre 45 y 50C (Figura 2.2). La
temperatura, cercana al punto de fusin de la parafina, permitir el estirado del corte y
la obtencin de una seccin de la muestra perfectamente estirada. Posteriormente los
cortes son capturados por los portaobjetos introduciendo stos dentro del bao y, en
contacto con los cortes, sacndolos poco a poco mientras los cortes quedan adheridos
al portaobjetos.
Las preparaciones ya colocadas sobre los portaobjetos han de ser secadas
meticulosamente para evitar el desprendimiento accidental durante el proceso de
tincin (Figura 2.2). La desecacin se realiza por altas temperaturas (60 C)
rpidamente o a 37 C durante toda la noche. Tambin se pueden utilizar soluciones
adherentes para evitar desprendimientos de la muestra. El desengrasado del
portaobjetos previene desprendimientos pero ciertas substancias como la albmina, la
gelatina o resinas acrlicas permiten una mayor adhesin de las muestras sobretodo si
provienen de muestras obtenidas con el criostato.

32



A) Batera de diseccin. Las muestras son
recogidas y procesadas utilizando estas bateras.

B) Bloques de parafina. Bloque tallado (izquierda)
y sin tallar.

C) Microtomo. Los bloques de parafina son
cortados en finas lonchas de unas 5 micras de
espesor
D) Bao de flotacin. Las lonchas de muestra se
depositan sobre la superficie para que se estiren
completamente

E) Obtencin de la muestra en el bao de
flotacin. El portaobjetos se sumerge en ngulo de
45 y se deja que la muestra se adhiera retirndolo
posteriormente.
F) Secador. Para que las muestras queden
completamente adheridas se dejan secar al aire o
mediante una plancha secadora.
Figura 2.2. Proceso de corte de muestras biolgicas con el microtomo y posterior captura con el
portaobjetos y completa adhesin para su posterior procesado en el proceso de tincin.

33

Tincin.
Para la observacin de una muestra histolgica, y dado que los componentes
tisulares tienen todos la misma densidad ptica, los cortes obtenidos deben teirse
para as poder diferenciar diferentes estructuras. La primera utilizacin de colorantes
en histologa conocida se debe a Van Leeuwenhoek que en 1714 utiliz una solucin
de azafrn disuelto en vino para teir las fibras musculares estriadas. A partir de ah se
utilizan el carmn y la hematoxilina, pero cuando ms se diversifican los colorantes es
cuando se desarrolla la industria textil que permiti una gran diversificacin de
colorantes sobretodo los basados en la anilina.
Existe una gran variedad de colorantes clasificados en varios grupos dependiendo de
que sean naturales o artificiales, de sus grupos cromforos o de su apetencia tisular.
Para un estudio general de los tejidos es esencial diferenciar entre colorantes bsicos,
cidos, neutros, indiferentes o metacromticos. Los colorantes bsicos son aquellos
que de grupos fuertemente bsicos responsables de su carga global y que se utilizan
para colorear estructuras cidas: hematoxilinas, fucsina bsica, galocianina:...
Los colorantes cidos presentan grupos altamente cidos y tien estructuras bsicas
contenidas generalmente en los citoplasmas: eosinas, fucsina cida, pironina...
Los colorantes neutros son resultado de mezclar colorantes cidos y bsicos
obteniendo un compuesto con carcter salino pero que mantiene la capacidad de
colorear conjunta o separadamente estructuras diversas que adquieren una tonalidad
polcroma: Giemsa.
Los colorantes indiferentes no tienen ni carcter cido, bsico o salino sino que
colorean mediante impregnacin fsica.
Los colorantes metacromticos por contraposicin a los ortocromticos que producen
una coloracin similar al color del colorante, tien de un color completamente
diferente las estructuras a las que afectan. Generalmente se derivan de la anilina. Por
ejemplo tenemos los grnulos de los mastocitos que presentan una coloracin
caracterstica roja cuando se tien con azul de metileno o de toluidina.
En cuanto a los criterios de especificidad, las tinciones pueden ser clasificadas en
tinciones generales y especficas segn tian de una forma general la muestra o se
concentren en estructuras concretas. En todo caso, las tinciones generales constan de
dos colorantes de forma que se produzca una tincin ms concreta de una estructura
dada: fibras o ncleos, y como fondo se utiliza otro colorante que rellene el resto de
34
estructuras celulares: hematoxilina-eosina (Ver protocolo al final del tema). En las
tinciones especficas se persigue la observacin de unas estructuras con una
determinada caracterstica qumica: as tenemos la tincin del PAS para teir glcidos,
o la tincin de Feulgen para teir ADN.


A) Modelos de recipientes y cunas de tincin.
Existen mltiples modelos adecuados a diferentes
volmenes y cantidad de muestras que deben ser
teidas.
B) Sistema de tincin en parihuelas. Se utiliza este
sistema para procesamiento de pocas muestras y
de una manera rutinaria y rpida.

C) Racks de almacenamiento de muestras. Las
muestras teidas son catalogadas, y colocadas en
racks que se guardan en grupos de 5 en sus
correspondientes cajas etiquetadas.
D) Microscopio ptico. Las muestras, una vez
teidas pueden ser estudiadas mediante el
microscopio ptico.
Figura 2.3. Modelos de tincin de muestras para el microscopio ptico. Se muestran los dos
procedimientos bsicos de tincin basados en la inmersin en distintos modelos de recipientes (A) o en
el recubrimiento de las muestras suspendidas sobre parihuelas (B).

Para la tincin, en general los colorantes suelen ser hidrosolubles por lo que primero
se debe rehidratar la muestra eliminando previamente la parafina y rehidratando
mediante inmersin en soluciones alcohlicas de gradacin decreciente hasta llegar a
agua o a una solucin tamponada. Tras la incubacin con los colorantes que se hayan
35
elegido, la muestra, por lo general, debe ser deshidratada nuevamente ya que los
medios de montaje utilizados suelen ser soluciones altamente hidrfobas (Figura 2.3).

Montaje.
Una vez deshidratadas, las muestran son montadas definitivamente. El medio
de montaje debe evitar el contacto de la preparacin con el aire ambiental y debe
elegirse un medio de montaje cuyo ndice de refraccin est ms prximo al del
lquido que impregne el corte que generalmente es xileno (muestras deshidratadas) o
el agua (no deshidratadas). Para el montaje de muestras deshidratadas se utilizaban
resinas vegetales como el blsamo de Canad pero actualmente se han sustituido por
pegamentos sintticos comerciales que por evaporacin del solvente se solidifican
rpidamente: Eukitt o Entelln. En preparaciones hidratadas, se utilizan clsicamente
la glicerina y la goma arbica, aunque estos han sido sustituidos por soluciones
comerciales ms estables.
En cualquier caso, durante el proceso de montaje, se debe evitar la formacin de
burbujas areas entre el portaobjetos y el cubreobjetos.


Ejemplos de tinciones.

Tincin hematoxilina-eosina. (Tincin general)
Para poder observar una muestra en la que se pueda apreciar la textura general
del tejido se utiliza de forma generalizada la tincin Hematoxilina-eosina que tie los
ncleos de un color azulado mientras que los citoplasmas se tien de color rojizo. De
esta forma se permite poder contrastar las clulas y dar una visin ms o menos
completa del tejido.
36
Protocolo para la tincin Hematoxilina-eosina.
El protocolo a seguir para esta tincin es el que sigue, aunque pequeas variaciones
pueden ser realizadas de acuerdo con el tipo de tejido a teir:
Desparafinar:
o Xilol I 15 min.
o Xilol II 5 min.
Hidratar:
o Alcohol absoluto (100 ) 5 min.
o Alcohol absoluto (100 ) 2-3 min.
o Alcohol 80 2-3 min.
o Alcohol 50 2-3 min.
Lavar
o Agua destilada 2 min.
Teir
o Hematoxilina 2-5 min.
Lavar
o Agua corriente 40 s.
Azulear:
o Carbonato de Litio 30 s.
Lavar:
o Agua corriente 15 s.
Teir:
o Eosina 2-4 min.
Deshidratar:
o Alcohol 70 2-3 min.
o Alcohol 80 2-3 min.
o Alcohol absoluto (100 ) 2-3 min.
o Alcohol absoluto (100 ) 2-3 min.
o Alcohol absoluto (100 ) 2-3 min.
Aclarar:
o Xilol 3 min.
o Xilol 5 min.
Montar con medio de montaje (Eukitt o similar).
Tincin cido perydico-Schiff. (Tincin especfica)
37
En otros casos es preferible realizar una tincin que muestre de forma ms
contrastada una determinada estructura o sustancia que, o bien se encuentra muy
representada en la muestra que pretendemos observar, o bien, queremos detectar
especficamente para detectar un determinado fenmeno o anomala. A este tipo de
tincin se le denomina tincin especfica ya que su objetivo es teir especficamente
una determinada sustancia o estructura. Como ejemplo vamos a indicar el
procedimiento para la tincin del cido perydico-schiff, especfica para sustancias
azucaradas, especialmente para glndulas de secrecin mucosa como el epitelio
glandular del intestino.

Procedimiento para la tincin cido perydico-Schiff

Desparafinar e hidratar como en el caso anterior.
Cubrir la muestra con HIO
4
(cido perydico) al 0.5% durante 10 min. Se
produce la oxidacin de los grupos hidroxilo de los azcares
fundamentalmente en grupos aldehido.
Lavar con agua destilada.
Cubrir la muestra con reactivo de Schiff durante 15 min a temperatura
ambiente.
Lavar con agua sulfurosa para paralizar la reaccin con el reactivo de Schiff.
Seguir con abundante lavado con agua de grifo (3 veces).
Teir con hematoxilina de Harris durante 1 min.
Lavar con agua destilada y posteriormente con agua alcalina para permitir el
viraje del colorante.
Deshidratar con alcoholes de graduacin ascendente.
Aclarar el xilol y montar.


38




39


PRCTICA 3
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO.
ANLISIS DE MICROGRAFAS ELECTRNICAS.

Breve resea terica.
Si bien el Microscopio ptico (MO) constituye una herramienta esencial en el
desarrollo y el estudio de la histologa, no fue hasta la invencin del Microscopio
Electrnico (ME) cuando se pudo estudiar el interior celular con detalle. El ME
permite un examen directo a un nivel ultraestructural de los tejidos y las clulas
revelando detalles de orgnulos y componentes macromoleculares tales como
ribosomas, complejos del poro, partculas vricas, o hebras de cidos nucleicos.
El principal problema para la observacin de tejidos a un nivel ultraestructural reside
en el poder de resolucin. Ernest Abbe en 1873 plasm este trmino en lo que se ha
dado en llamar la ecuacin de Abbe:

Resolucin =distancia =K / AN (n. sen )

donde Resolucin : es la capacidad para distinguir como separados dos puntos u
objetos que se encuentran juntos; una resolucin con valor ms bajo permite observar
objetos que se encuentran ms juntos, K: es la constante del medio de la lente, AN: la
apertura numrica, n: ndice de refraccin, : ngulo de apertura y : longitud de
onda.

Por ello, el poder de resolucin depende de la apertura numrica del objetivo (una
medida de la calidad de la lente), del ndice de refraccin del medio (un parmetro
especfico del medio que se encuentre entre el objetivo y la muestra) y de la longitud
de onda.
En el caso del MO se trabaj con los dos primeros parmetros consiguiendo muy
pronto lentes de una alta calidad y utilizando medios interpuestos entre la muestra y el
objetivo que permitan un alto grado de poder de resolucin. No obstante, la mxima
resolucin slo se poda obtener a longitudes de onda pequeas pero en el espectro
visible.
40
No fue hasta 1924 cuando De Broglie formul la hiptesis de que la radiacin
electromagntica iba asociada a un rayo electrnico y, por tanto, se comportaba como
las ondas de fotones de la luz. Dos aos despus Buhch utiliz el campo electrosttico
para enfocar un haz de rayos electrnicos permitiendo establecer claramente un
paralelismo entre los rayos luminosos y los electrnicos.
Poco despus se pudieron utilizar lentes electromagnticas que actuaban de forma
similar a las lentes presentes en el MO (Knoll, Ruska y Von Borries (1932)). Gracias a
estos hallazgos, se pudo construir el primer microscopio electrnico denominado
hipermicroscopio, y ya en 1939 la casa Siemens fabric los primeros aparatos a escala
industrial.
En el ME la menor longitud de onda de los electrones, tericamente, permite una
resolucin de 0,005 nm aunque en la prctica la resolucin del microscopio
electrnico de transmisin (MET) es de 0,2 nm (unas 1000 veces la resolucin del
MO) mientras que en el microscopio electrnico de barrido (MEB) es de 10 nm.
Para calcular la resolucin en el ME no se puede utilizar directamente el parmetro de
la longitud de onda de los electrones pero se puede utilizar la frmula de De Broglie
que relaciona el voltaje del microscopio con la longitud de onda del haz de electrones,
por lo tanto, la resolucin va a poder ser modificada en un microscopio variando el
voltaje de ste:

=A 12,2/ v
Donde 12,2: es una constante; v: es el voltaje que se aplica al microscopio y A: es una
constante despreciable en microscopa electrnica.
As mismo, la amplificacin de los MET actuales es de hasta unos 10.000.000 de
veces en comparacin con las 1000 veces que permita el MO. Esta amplificacin es
el producto de las distintas ampliaciones que permiten las lentes objetivo (x100 y
x200), lentes oculares (x200) y lente proyectora (x1.000.000) a las que hay que sumar
la ampliacin del negativo por mtodos fotogrficos con lo que se puede llegar hasta
10.000.000 de veces.

Distintos tipos de microscopios electrnicos.
Existen dos tipos esenciales de microscopio electrnico. El microscopio
electrnico de transmisin (MET) (el que ms se utiliza en Biologa Celular y del que
se obtiene una imagen en dos dimensiones de la muestra similar a la que se obtiene en
41
un MO) y el microscopio electrnico de barrido, scanning o exploracin (MEB) (que,
a modo de como trabajan las lupas, da un amplio detalle de las superficies de
organismos, clulas y otras estructuras en tres dimensiones).
Mientras que el MET ya era fabricado en 1939 a nivel comercial, no fue hasta 1962
que el primer MEB comercial fabricado en Cambridge estuvo disponible.
Las diferencias entre ambos microscopios quedan reflejadas en la Tabla 3.1.

Tabla 3.1
Comparacin entre las caractersticas del MET y MEB
MET MEB
Resolucin 3 a 10 Amstrongs 75 a 100 Amstrongs
Imagen 2 dimensiones 3 dimensiones
Muestras Secciones Muestras ntegras
Haz De gran dimetro y esttico Puntual y movil
Procesamiento
muestra
Contraste qumico No contraste
Tcnica Lente proyectora necesaria No requerimiento lente
proyectora


El microscopio electrnico de transmisin.
En su diseo, el MET es parecido a un MO convencional. El MET consta de
varias partes esenciales.
La fuente de iluminacin es un can electrnico formado por la fuente de
electrones o ctodo constituido por un filamento de tungsteno por el que pasa una
corriente de 6 W para conseguir su incandescencia. Los electrones despedidos por el
filamento son atrados por el nodo, que en realidad es toda la columna del
microscopio aunque tambin se le llama nodo a una pequea pieza en forma de
hongo (cilindro de Wenhelt con un dimetro de 30 amstrongs) y muy cercana al
ctodo que impone la diferencia de potencial (60 a 200 kv) y que presenta un orificio
por el que van a pasar los electrones impulsados por la diferencia de potencial entre
nodo y ctodo (ambos forman el can de electrones).
42
Para que el haz de electrones pueda transmitirse se requiere necesariamente un
vaco de 5 atmsferas en la columna que se obtienen mediante el concurso de una
bomba de vaco conectada al microscopio.
Ya en la columna del microscopio encontramos las bobinas o lentes
electromagnticas (electroimanes) que hacen las veces de lentes condensadoras,
objetivo y lente de proyeccin enfocando el haz electrnico (su funcin es la de crear
campos electromagnticos que desvan (enfocan) el haz de electrones). En los
electroimanes encontramos diversas piezas esenciales para el proceso de enfoque y el
control del haz de electrones. En su parte central constan de unas arandelas con un
orificio de unas 30 micras que limitan y eliminan los electrones dispersos del rayo de
electrones.
Tambin encontramos la platina (donde se deposita la rejilla que lleva la
muestra), la pantalla visora (una pantalla de un material que emite fluorescencia
cuando es alcanzado por los electrones) y un dispositivo para que los electrones
incidan en una placa fotogrfica para obtener la microfotografa.

El microscopio electrnico de transmisin de alto voltaje.
A diferencia del anterior, el Microscopio electrnico de alto voltaje utiliza una
diferencia de potencial de 500 a 30.000 kv que da lugar a una mayor aceleracin de
los electrones y por tanto una mayor capacidad para atravesar las muestras. Por ello
pueden utilizarse en este microscopio muestras gruesas (5 micras) o incluso clulas
enteras.

El microscopio electrnico de barrido.
El funcionamiento del MEB es bastante complejo y no es el objetivo de esta
prctica el entrar en cuestiones tcnicas. No obstante debemos hacer hincapi en las
particularidades de este tipo de microscopio. La muestra debe ser desecada y cubierta
con una superficie en la que la electrodensidad permita que los electrones reboten
sobre ella. Para ello la muestra debe ser recubierta por metales pesados (oro, platino,
paladio).
Los electrones no atraviesan la muestra sino que el haz de electrones la barre
constantemente desde el lateral para que los electrones choquen contra ella y se
dispersen. La dispersin provoca la formacin de electrones secundarios. Estos
electrones secundarios son atrados por una serie de componentes del microscopio que
43
los convierten en fotones. Los fotones son registrados por un fotomultiplicador que
mostrar la imagen en una pantalla de televisin. Por tanto, este microscopio
electrnico permite la obtencin de imgenes de superficie en tres dimensiones lo que
sera similar a la imagen que proporciona una lupa.

La criofractura.
EL MEB se puede utilizar para estudiar estructuras subcelulares mediante una
tcnica que permite obtener un molde de las membranas y comprobar la presencia de
protenas en stas. Esta tcnica, la criofractura, se basa en la congelacin rpida de
una muestra (-196 C) con nitrgeno lquido y el corte con una cuchilla que a modo de
fractura aprovecha los planos de fractura de las membranas celulares dado que es
donde se encuentran los enlaces ms dbiles. A continuacin del corte se revisten las
dos caras de la muestra con un sombreado de platino que, tras la digestin de la
muestra biolgica, deja una rplica de la superficie en este metal. As, este es el nico
mtodo que permite observar el interior de las membranas celulares. Permite as
obtener las dos caras de la bicapa lipdica y analizar las protenas que se presentan en
ambas caras y cmo estn distribuidas.

Preparacin de las muestras para el MET.
Los cortes se preparan en la misma forma que en la preparacin de muestras
para el microscopio ptico pero con ciertas particularidades. La base de la formacin
de la imagen est en que algunos electrones son incapaces de atravesar la muestra al
chocar con sustancias de alta densidad que, o bien se encuentran en la muestra o han
sido adicionadas durante la preparacin (tetrxido de smio, permanganato de potasio,
citrato de plomo).
Los fijadores son especiales y permiten una mayor preservacin de la
ultraestructura celular que los fijadores utilizados en el microscopio ptico. Estos son
esencialmente el glutaraldehido (para protenas) y el tetrxido de osmio (para lpidos).
El tetrxido de osmio tambin sirve para hacer resaltar las membranas ya las impregna
cubrindolas de un metal pesado que desviar los electrones cuando estos incidan
sobre ellas.
Para las muestras para el MET, la parafina no es un buen medio para la
inclusin, para estas muestras es necesario un medio de inclusin mucho ms duro
como materiales plsticos que permiten obtener cortes muy finos: araldita o epn.
44
Para obtener estos cortes se necesitan cuchillas muy afiladas y resistentes formadas
esencialmente por diamante o platino. Los cortes son de unos 25 a 100 nm de espesor,
mientras que los realizados en microscopa ptica son de unas 5-10 micras.
Los cortes se colocan en una rejilla de cobre y se tien con colorantes que
llevan metales pesados como el acetato de uranilo o el citrato de plomo. En este paso
no se precisa eliminar el material plstico que incluye la muestra como haba que
hacer en el caso de la parafina para el microscopio ptico. La muestra puede ser
utilizada directamente para su observacin.
Al utilizar cortes muy finos para el MET el estudio de la muestra presenta el
problema esencial de que la imagen observada no es ms que una pequea parte de la
realidad y por ello, las muestras al MET deben ser estudiadas con gran precaucin
antes de utilizarse en cualquier articulo, informe o estudio. Es posible que se obtenga
una imagen de una clula sin ncleo aparente pero eso no quiere decir que dicha
clula carezca de ncleo por lo que no podramos decir que la clula es anucleada.

Anlisis y estudio de estructuras subcelulares.
Una vez obtenida una imagen al microscopio electrnico se debe realizar un
anlisis exhaustivo de ella. Generalmente las imgenes obtenidas se utilizan para
ilustrar la presencia o la morfologa de un determinado orgnulo celular. Esto conlleva
a un proceso de anlisis y descripcin de la imagen obtenida.
Por ello se acompaan imgenes de los orgnulos usualmente observados en
una muestra celular (Figuras 3.1 a 3.12).


45

MICROGRAFAS.
A continuacin se presentan una serie de micrografas obtenidas con el microscopio
electrnico de transferencia donde se pueden estudiar los distintos orgnulos celulares.


Figura 3.1. Micrografa general de dos clulas completas donde se pueden observar dos ncleos, gran
cantidad de citoplasma, mitocondrias, retculo endoplsmico rugoso, lisosomas, membrana plasmtica
que se para las dos clulas, gran cantidad de poliribosomas, y algunas vesculas de secrecin.


46


Figura 3.2. Ncleo celular donde se puede observar la Heterocromatina (H), la eucromatina (E) y la
doble membrana de la envoltura nuclear. Se puede observar tambin un gran poro nuclear (flecha roja).




Figura 3.3. Retculo endoplsmico rugoso ( R ),
ntimamente ligado al ncleo (N) y a mitocondrias
(junto a lnea roja).
Figura 3.4. Dos aparatos de Golgi o dictiosomas
completamente desarrollados. Obsrvese su cara
cncava dirigida a un hipottico centro entre ellos.
Se pueden observar tambin una gran cantidad de
vesculas y gran ncleo en la zona inferior
izquierda.


47


Figura 3.5. Lisosoma. Obsrvese un lisosoma
rodeado de mitocondrias y de un ncleo (N). Los
lisosomas se caracterizan por ser vesculas con un
contenido muy heterogneo correspondiente al
material incorporado por las clulas y que se
encuentra en proceso de digestin.




Figura 3.6. Peroxisoma. Los peroxisomas
aparecen como vesculas ms o menos
homogneas en las que se pueden observar un
material interior cristalizado ms denso a los
electrones que corresponde a la enzima urato
oxidasa.






Figura 3.7. Vesculas de secrecin. Observese el
contenido oscuro de las vesculas correspondiente
a la gran cantidad de protena que incorporan y
que aparece densa a los electrones por las tcnicas
utilizadas para observar clulas con el microscpio
electrnico. En algunos casos el contenido
completo de las vesculas se expulsa al exterior sin
que ocurra una clara difusin del material
contenido por la vescula.
Figura 3.8. Gotas lipdicas. En las clulas
podemos observar tambin acmulos de lpidos
que aparecen de color claro o incluso
completamente blanco en la micrografa debido a
la disolucin de los lpidos en los solventes
utilizados en el proceso de tratamiento de la
muestra. Las gotas lipdicas son abundantes en los
adipocitos y clulas que metabolizan lpidos y no
presentan membrana a su alrededor.




48



Figura 3.9. Mitocondria. Las mitocondrias se
observan como orgnulos ms o menos ovalados,
aunque en realidad forman estructuras
tridimensionales muy ramificadas, en los que se
pueden distinguir prolongaciones de membrana
hacia el interior del orgnulo. El interior
corresponde a la matriz mitocondrial, las
prolongaciones de membrana corresponden a las
crestas mitocondriales que pueden presentar muy
diversas formas. Entre la membrana de las crestas
mitocondriales (membrana interna) y la membrana
externa se encuentra el espacio intermembrana.
Figura 3.10. Cloroplasto. Mucho ms grandes
que las mitocondrias, los cloroplastos presentan
tres espacios en su interior. Al igual que la
mitocondria presentan la matriz, en este caso
llamada estroma, y el espacio intermembrana. Pero
a diferencia de las mitocondrias, no presentan
crestas sino una acumulacin de membranas
aplanadas y apiladas que se corresponden con los
tilacoides. Los tilacoides se estructuran en grupos
o apilamientos denominados grana. En el interior
de cada tilacoide encontramos el espacio
tilacoidal. En algunos cloroplastos podemos
observar acmulos de material de reserva
correspondiente al almidn.



Figura 3.11. Corte transversal de cilios en los que
se puede observar la membrana plasmtica
rodeando los nueve pares de microtbulos
perifricos y el par central.
Figura 3.12. Detalle de un corte de cilios donde se
puede observar mucho ms claramente los nueve
pares de microtbulos perifricos y el par central.
Las vesculas aparentemente vacas que aparecen
acompaando corresponden a prolongaciones de la
membrana plasmtica.



49



PRCTICA 4
UTILIZACIN DE CURVAS PATRN.
OBTENCIN DE CURVA PATRN PARA DETERMINACIN
DE PROTENAS (MTODO BRADFORD).

Introduccin.
La cuantificacin de los diferentes componentes moleculares de los
organismos: cidos nucleicos, protenas, azcares o lpidos o la determinacin de
actividades enzimticas bien a partir de clulas o tejidos o bien a partir de orgnulos
aislados (ver prctica siguiente) requiere de la utilizacin de diferentes mtodos e
instrumentos. Los instrumentos utilizan parmetros fsicos para las realizar las
diferentes mediciones. Unos utilizan propiedades de los compuestos para absorber luz,
otros utilizan las propiedades conductoras de la electricidad de algunos compuestos,
otros recogen la luz que algunos compuestos orgnicos emiten, etc. As, los
instrumentos utilizados nos dan como resultados la cuantificacin de un parmetro
fsico que, si el instrumento est bien calibrado, est directamente relacionadas con la
cantidad del compuesto que se pretende determinar.
En el desarrollo de la presente prctica estudiaremos la utilizacin de
parmetros de referencia para la cuantificacin de componentes moleculares y la
determinacin de actividades celulares. Para ello procederemos a la realizacin y
estudio de curvas patrn, necesarias para establecer una relacin directa entre el
parmetro fsico y la cantidad de un determinado compuesto. Para ello procederemos
a seguir los pasos necesarios para la obtencin de una curva patrn para la
determinacin de protenas mediante el mtodo Bradford (mtodo colorimtrico).

50
Parmetros de referencia.
Cuando determinamos una actividad enzimtica o la cantidad de algn
componente celular entre diferentes muestras se debe tener en cuenta un determinado
parmetro que asegure que en la comparacin entre muestras de diferentes organismos
o de diferentes tratamientos se ha utilizado una cantidad de muestra idntica o se han
procesado de una manera similar. A estos parmetros que nos permiten la
comparacin entre muestras diferentes se los conoce como parmetros de
referencia. Estos parmetros no deben verse afectados por la manipulacin o por los
tratamientos a los que sometamos a los organismos en estudio dado que de otra
manera no seran tiles como parmetros de referencia.
Como parmetros de referencia ms tiles tenemos el peso fresco, el peso seco,
la cantidad de ADN, la cantidad de protenas, los fosfolpidos de membrana, etc...

El peso fresco es muy utilizado cuando la cantidad de material disponible es
fcilmente mesurable,
El peso seco (la materia orgnica prescindiendo del agua) tambin es muy til
y permite obtener informacin sobre la cantidad orgnica total utilizada en el
experimento.
Otros parmetros deben ser utilizados cuando la masa total de la muestra
utilizada es difcil de medir. La cantidad de ADN nos permite homogenizar
los resultados respecto al nmero de clulas ya que ante muestras de la misma
naturaleza la cantidad de ADN debe ser la misma a no ser que el tratamiento al
que las sometamos afecte a este parmetro.
Cuando se utilizan clulas en cultivo u homogenados tisulares o celulares es
til el parmetro de la cantidad de protena total, pero al igual que en el caso
anterior, siempre y cuando el tratamiento a estudiar no afecte a este parmetro.
En el caso del estudio de componentes lipdicos de las clulas el parmetro de
los fosfolpidos totales de membrana nos puede permitir relacionar los
resultados de diferentes tratamientos con un parmetro que no debe cambiar a
no ser que la cantidad de membranas totales celulares se vea modificada.

En conclusin, los parmetros de referencia nos van a permitir poder relacionar
dos o ms resultados sin perjuicio de la cantidad de materia de partida ya que al
relacionar estos resultados con el parmetro, las pequeas variaciones en la cantidad
51
de materia de partida no producen graves errores de medicin. No obstante, deben
evitarse grandes diferencias en la cantidad de materia utilizada cuando se realiza una
medicin o se estudia una actividad enzimtica a fin de evitar problemas derivados de
una diferente sensibilidad del aparato en la medicin.

Controles internos.
Los controles internos son tambin parmetros de referencia que nos permiten
evitar los posibles errores que se hayan podido producir en el transcurso de la
manipulacin de la muestra. Consisten, como su nombre indica, en parmetros que se
van a medir en el mismo procedimiento en el que se obtienen los resultados de la
medicin y que, por lo general, tienen la misma naturaleza que el parmetro a medir.
Existen mltiples ejemplos de controles internos como:

Actividad enzimtica de referencia. A partir de una determinada
muestra procedemos a realizar una actividad enzimtica que no debe
verse afectada por el tratamiento ya que es constitutiva por lo que
aquellas variaciones que detectemos en esta actividad se deber al uso
de diferentes cantidades de muestra.
Protenas constitutivas. Cuando se determina la expresin de una
determinada protena mediante tcnicas de inmunotincin (western
blotting), se utilizan anticuerpos desarrollados anti- esa protena que
finalmente, y por diferentes tcnicas, nos permitirn observar bandas de
color o impresiones fotogrficas sobre placas de radiografa tanto
mayores cuanto mayor sea la expresin de esa protena. Como control
interno se utilizan anticuerpos anti-protenas constitutivas que no
cambian con los tratamientos: actina, gliceraldehido-fosfato
deshidrogenasa, tubulina, etc...
ARN constitutivo. Por el mismo caso anterior, la determinacin de la
expresin de un determinado gen mediante la medicin de la cantidad
de su ARNm (ARN mensajero), utiliza como control interno la
determinacin de ARNm de genes constitutivos, ej., los anteriormente
mencionados, o ARN ribosmicos (ARN 18S y 28S en el caso de
eucariotas).
52
Otras sustancias. En la determinacin de compuestos orgnicos se
adicionan sustancias de naturaleza similar y en cantidad conocida que,
tras el procesado de la muestra, se determinarn comprobndose la
prdida de material a lo largo del procesamiento de la muestra.
Normalmente la prdida es similar entre diferentes muestras procesadas
en paralelo, pero pequeos errores entre muestras suelen ser habituales.

Determinacin de protenas.
Para la realizacin de la presente prctica procederemos a realizar la curva patrn para
la determinacin de protenas utilizando uno de los diferentes mtodos para la
determinacin de protenas habitualmente utilizados en el laboratorio (mtodo de
Bradford). En las diversas tcnicas de determinacin de protenas se utilizan
soluciones que, por diferentes mecanismos se unen a las protenas dando lugar a
soluciones coloreadas cuya densidad ptica o capacidad para absorber la luz de una
determinada longitud de onda se tanto mayor cuanto mayor es la cantidad de protena.
Mediante este mecanismo podemos utilizar la tcnica de Lowry, la tcnica del cido
bicinconnico o la tcnica de Bradford. Tambin podemos utilizar una capacidad
intrnseca de las protenas que consiste en la absorcin de luz a 280 nm (ultravioleta)
de manera que una unidad de absorbancia se corresponde con una solucin de
protenas a una concentracin de 1 mg/ml.

Mtodo de determinacin de protenas de Lowry.

Material:
Reactivo A:
NaOH 4 g/litro, Na
2
CO
3
20 g/litro, Tartrato sdico potsico 0,2 g/litro.
Reactivo B:
CuSO
4
.5H
2
O 5 g/litro
Estos dos reactivos se mantienen a 4 8 C (frigorfico) hasta su uso.
Reactivo C (preparar justo antes de proceder a la determinacin):
Mezcla de reactivo A (98 partes) y de reactivo B (2 partes).
Reactivo D (preparar justo antes de proceder a la determinacin):
Mezcla de Folin y agua a partes iguales.

53
Preparacin de la curva patrn:
Se suele utilizar como protena estandar para realizar la curva patrn la protena
srica, albmina bovina (BSA, de bovine serum albumine en ingls) en una
concentracin conocida y disponible comercialmente. Solemos partir de una solucin
concentrada de BSA a 1 mg/ml 1000 g/ml.
Mezclamos diferentes volmenes de BSA, de 0 a 200 microlitros (l) con agua para
obtener un volumen final de 300 l. As obtendremos diferentes cantidades de
protena segn el volumen que hayamos introducido de sta.

Procedimiento
Se aaden a las diferentes soluciones de BSA los reactivos de la siguiente manera:
- Aadir 3 ml de reactivo C.
- Agitar los tubos para mezclar correctamente.
- Incubar a temperatura ambiente entre 10 y 30 min.
- Aadir 0,3 ml de reactivo D.
- Incubar a temperatura ambiente entre 30 min y 2 horas (antes o
despus no es estable).
- Medir la densidad ptica a 700 nm.
- Se procede normalmente por duplicado (dos muestras por
concentracin) y posteriormente realizamos la media.
- Utilizar como blanco de la determinacin el estandar con
concentracin nula de BSA.
La determinacin de muestras de concentracin desconocida se realiza de la misma
manera pero aadiendo 0,1 ml de muestra y 0,2 ml de agua. La densidad ptica (OD)
obtenida se relacionar con la curva patrn obtenida con las cantidades conocidas de
BSA.

Mtodo de determinacin de protenas mediante reaccin con cido
Bicinconnico.

Material:
Reactivo (preparar justo antes de empezar) :
1 parte de CuSO
4
. al 4% en agua
50 partes de cido bicinconnico (solucin comercial).
54

Preparacin de la curva patrn:
Al igual que en el caso anterior, se suele utilizar como protena estandar para realizar
la curva patrn BSA a una concentracin conocida.
Se mezclan diferentes volmenes de BSA con agua hasta un volumen final de 100 l.
As obtendremos igualmente que en el caso anterior diferentes cantidades de protena
segn el volumen que hayamos introducido de sta.

Procedimiento
Se aaden a las diferentes soluciones de BSA los reactivos de la siguiente manera:
- Aadir 2 ml de reactivo a cada tubo
- Agitar los tubos para mezclar correctamente.
- Incubar a 37 C durante 30 min.
- Medir la OD a 562 nm.
- Se procede igualmente por duplicado (dos muestras por
concentracin) y posteriormente realizamos la media.
- Utilizar como blanco de la reaccin el estandar con concentracin
nula de BSA.
La determinacin de muestras de concentracin desconocida se realiza de la misma
manera en un volumen final de 100 l. La densidad ptica (OD) obtenida se
relacionar con la curva patrn obtenida con las cantidades conocidas de BSA.

Mtodo de determinacin de protenas de Bradford.
Este mtodo permite determinar protenas a pequeas concentraciones (de 0,2 a 20
g) con lo que se disminuye la cantidad de muestra que se ha de utilizar para la
determinacin de protenas.
Material:
Reactivo constituido por el corlorante Serva Blue G, en cido fosfrico y etanol
preparado de la siguiente manera. Disolver 100 mg de Serva Blue G en una mezcla de
100 ml de cido fosfrico al 85% (solucin comercial) y 50 ml de etanol al 95%. Tras
la disolucin del colorante, completar el volumen final hasta 1 litro con agua fra.
Dejar reposar durante, al menos, 24 h y filtrar con papel de filtro de buena calidad. La
absorbancia del colorante una vez filtrado a 590 nm frente a un blanco realizado con
55
agua debe ser de aproximadamente 0,4. Se debe guardar en botes oscuros, protegido
de la luz, y a temperatura ambiente.
En algunos casos se disponen de soluciones concentradas comerciales a una
concentracin 5 veces mayor que la normal, con lo que se debe proceder a realizar
previamente la disolucin correspondiente para proceder a la determinacin.
Ser necesaria tambin una solucin 1M de NaOH.

Preparacin de la curva patrn:
Se suele utilizar como protena estandar para realizar la curva patrn la protena
srica, albmina bovina (BSA, de bovine serum albumine en ingls) o
inmunoglobulina bovina (IgG). a concentraciones conocidas y disponibles
comercialmente. Solemos partir de una solucin concentrada de BSA o IgG a 1 mg/ml
1000 g/ml. Segn las indicaciones iniciales, la absorbancia obtenida con cantidades
idntivas de BSA y de IgG son diferentes debido a la diferente naturaleza de las
protenas y a las caractersticas de afinidad del colorante. Se considera que una curva
patrn obtenida con IgG est ms acorde con las caractersticas generales de
soluciones complejas de protenas.
Tomamos diferentes volmenes de protena, de 0,2 a 20 l y los colocamos
directamente en la cubeta de medicin completando en todo caso hasta 20 l con
agua.
Procedimiento
Se mezclan diferentes soluciones de protena y reactivos de la siguiente manera:
- Aadir a la protena 50 l de NaOH 1 M.
- Aadir a cada cubeta de medicin 1 ml de solucin de Bradford.
- Mezclar por inversin e incubar a temperatura ambiente unos 5
min.
- Medir la densidad ptica a 590 nm.
- Se procede normalmente por duplicado (dos muestras por
concentracin) y posteriormente realizamos la media.
- Utilizar como blanco de la reaccin el estandar con concentracin
nula de BSA o de IgG.
La determinacin de muestras de concentracin desconocida se realiza de la misma
manera pero aadiendo hasta 20 l de muestra. La densidad ptica (OD) obtenida se
56
relacionar con la curva patrn obtenida con las cantidades conocidas de BSA o de
IgG.

Desarrollo de la prctica.

Cada grupo de alumnos dispondr del material necesario para realizar dos curvas
patrn utilizando el mtodo de Bradford anteriormente descrito y BSA e IgG como
protenas de referencia. Teniendo en cuenta la plantilla que sigue, los alumnos debern
realizar la determinacin de la absorbancia correspondiente a cada cantidad de
protena y confeccionar la correspondiente curva patrn segn se indica en el
cuestionario al final del cuaderno.

Plantilla:

Tubo b Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7
Protena (l) 0 2 4 6 8 10 15 20
H
2
0 (l)
NaOH 1M (l)
Reactivo 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
OD (590 nm)

Media OD





57



PRCTICA 5
FRACCIONAMIENTO CELULAR.
DETERMINACIN DE ACTIVIDADES CELULARES:
MITOCONDRIA.

Introduccin.
El estudio de una actividad particular dentro de la enorme cantidad de
diferentes actividades que se producen al unsono en una clula necesita de la
obtencin previa de material suficientemente puro como para eliminar todo aquello
que pueda interferir en el ensayo para la actividad en cuestin. As, para estudiar una
actividad concreta en muchas ocasiones es necesario realizar un paso preliminar que
permita obtener una fraccin celular que contenga los componentes que realizan dicha
actividad. Adems es necesario que la actividad que se pretende determinar se
desarrolle a una velocidad suficiente como para que pueda ser medida por los distintos
mecanismos disponibles en un laboratorio de investigacin. Para la caracterizacin de
una determinada actividad es necesario, en primer lugar, localizar el orgnulo u
orgnulos en los que sta actividad se desarrolla y a continuacin abordar un proceso
de purificacin que permita obtener un extracto celular enriquecido con este orgnulo.
La fraccin celular purificada debe encontrarse de la forma ms pura posible para
evitar interferencias de actividades similares. Al proceso de purificacin de fracciones
celulares se le denomina fraccionamiento celular.

En el desarrollo de la presente prctica pretendemos abordar un mecanismo
bsico de fraccionamiento celular consistente en la lisis de clulas en cultivo y una
primera separacin consistente en la eliminacin de los ncleos y restos celulares.
Posteriormente realizaremos una siguiente separacin que nos permita obtener una
fraccin enriquecida en mitocondrias que sern utilizadas para el estudio de
actividades mitocondriales.

58

El procedimiento del fraccionamiento celular.

La lisis celular.
El primer paso a tener en cuenta a la hora de realizar un fraccionamiento
celular consiste en estudiar el material de partida ya que ello nos permitir elegir el
mejor procedimiento para romper las clulas y poder posteriormente fraccionarlas.
Aunque los mecanismos de lisis celular suelen ser similares, la diferente textura,
resistencia y composicin celular y extracelular de los tejidos dificulta el proceso a la
hora de la lisis celular. El fin de la lisis celular es obtener un extracto que contenga
todos los orgnulos celulares en suspensin y que sea fcilmente separable de restos
celulares grandes e incluso de matriz extracelular. Es por ello que tejidos ricos en
material extracelular y con gran cohesin entre clulas son ms difciles de lisar que
otros tejidos con una mayor predisposicin a la rotura celular. Adems, para obtener
un buen homogenado celular es necesario elegir un tampn de homogenizacin o lisis
que sea compatible con la actividad que vamos a realizar de lo contrario, tras el
proceso de lisis se debern abordar otros procesos que permitan cambiar un tampn
por otro con lo que se perder eficacia a la hora de obtener la fraccin pura.
Los tampones de homogenizacin ms usuales son aquellos que se basan en
una solucin de fosfatos sdicos y potsicos o bien de Tris o HEPES, compuestos que
permite mantener el pH del tampn durante el proceso de medicin, a los que se suele
aadir sales inorgnicas tales como cloruro sdico o potsico, en una cantidad
suficiente para mantener la osmolaridad baja y que las clulas se rompan o una
osmolaridad similar a la de la clula si el proceso es por lisis mecnica, y quelantes de
metales tales como el EDTA o el EGTA, todos estos compuestos permiten que las
clulas exploten y que los diferentes compartimentos celulares se separen entre s. En
ciertos casos se adicionan detergentes que van a afectar a las membranas celulares y
mejorar el proceso de lisis. No obstante, el uso de detergentes est restringido a ciertos
procesos ya que pueden afectar a la actividad enzimtica a estudiar. A estos tampones
se les suele aadir antes de su uso compuestos inhibidores de la accin de las
proteasas o incluso cocktails que contienen varios de ellos y en algunos casos otro tipo
de inhibidores que afecten especficamente a los procesos de degradacin de las
protenas que van a ser estudiadas, por ejemplo, inhibidores de fosfatasas.
59
Una vez elegido el tampn adecuado se procede a homogenizar el tejido. Para
ello se procede a utilizar los homogenizadores, una familia de aparatos diseados
para permitir una buena rotura de tejidos y clulas y cuyo diseo y naturaleza vara
segn la muestra de que se trate. Entre los homogenizadores encontramos aquellos
basados en la trituracin del tejido, tales como los Ultraturrax, una especie de batidora
en pequeo; otros estn basados en el paso del material entre las paredes de un cristal
y las de un vstago. Entre estos ltimos existen muy diversas variedades que difieren
esencialmente en la forma del vstago y en el material del que est formado ste que
puede ser tefln, vidrio, vidrio esmerilado, etc. Existen tambin otros tipos de
homogenizadores especialmente diseados para clulas que se basan en favorecer el
estallido celular ante condiciones externas de presin negativa o incluso positiva;
estos son los homogenizadores por cavitacin en nitrgeno o el uso de jeringas y
agujas con un dimetro de luz extremadamente pequeo por lo que al verse obligada a
pasar a su travs, la clula explota.

El fraccionamiento celular.
Una vez obtenido el lisado celular, ste puede ser utilizado para la
determinacin de algunas actividades que en clulas ntegras no podran realizarse. No
obstante, en mltiples ocasiones es conveniente realizar un primer aclarado de la
muestra para retirar los ncleos y restos celulares o tisulares no completamente rotos
que pueden interferir en la medida. Al igual que casi todos los procesos de
purificacin, el aclarado y la obtencin de las diferentes fracciones celulares se realiza
mediante centrifugacin secuencial consistente en someter a las muestras a
centrifugaciones a diferentes velocidades dependiendo del orgnulo que se pretenda
aislar. As pues, para el primer aclarado consistente en la eliminacin de los ncleos y
restos celulares grandes se debe realizar una primera centrifugacin a unas 1000 x g
(se prefiere representar la velocidad de centrifugacin en gravedades (g) ya que as,
podemos adecuar la velocidad en cualquier tipo de centrfuga y actualmente todos los
modelos nuevos permiten seleccionar la velocidad en gravedades). Normalmente, tras
esta primera centrifugacin, el sobrenadante es considerado como el extracto
completo celular mientras que la pella se descarta como un conjunto de restos
celulares no definidos incluyendo ncleos por lo que el sobrenadante obtenido en esta
centrifugacin se denomina extracto post-nuclear.
60
El extracto completo puede ser tratado de diferente forma dependiendo del
orgnulo que se vaya a purificar. En la mayora de los casos se comienza
centrifugando a velocidades inicialmente bajas para ir eliminando o recogiendo
aquellos orgnulos que tienen una mayor densidad. En una clula eucariota animal la
mitocondria es recogida a unas 10.000 x g quedando un sobrenadante libre de
mitocondrias y una pella enriquecida en mitocondrias pero que tambin ha arrastrado
parte de otras membranas celulares, especialmente lisosomas y parte del retculo
endoplsmico. Con el sobrenadante obtenido se pueden purificar el resto de orgnulos
membranosos centrifugando a mayores velocidades, pero, no obstante, una mayor
separacin requerir del estudio de las velocidades adecuadas para cada orgnulo. A
100.000 x g se precipita la mayor parte del resto de membranas mientras que a
500.000 x g se obtiene finalmente una pella formada por pequeas vesculas de
secrecin muy ligeras y un sobrenadante que puede ser considerado como el citosol
libre de orgnulos membranosos y de complejos macromoleculares.
Como se ha comentado antes, la pella obtenida con 10.000 x g s contiene una
fraccin cruda de mitocondria pero tambin una gran cantidad de contaminantes de
otras membranas celulares. Si tomamos como ejemplo este sistema, aunque se puede
realizar con cualquier extracto celular y para otros muchas membranas celulares, una
mayor purificacin de orgnulos membranosos celulares se puede obtener mediante
centrifugacin en gradientes de densidad conocida, por ejemplo de sacarosa, o de
polmeros comerciales de densidades determinadas como el Nicodenz. Cuando se
somete una mezcla de membranas en un tubo relleno de una solucin de estos
compuestos dispuesta formando un gradiente de densidad, bien continua o bien
discontinua, (es decir, menos densa en la parte superior del tubo y ms densa en la
parte inferior), se consigue que las membranas celulares se separen dependiendo de su
densidad. As, las membranas quedan confinadas a una fina banda debido a que no
pueden bajar a densidades superiores de la que ellas mismas presentan. El aislamiento
de estas bandas permite obtener fracciones altamente purificadas de orgnulos
membranosos celulares. El tipo de gradiente depende del tipo de orgnulo que se
pretende purificar.
En otros casos, como en el de la membrana plasmtica, se puede obtener una
fraccin pura de sta usando compuestos no miscibles entre s que separan la
membrana dependiendo de sus caractersticas fsico-qumicas tales como el dextrano y
el polietilenglicol. La membrana plasmtica queda retenida en la fraccin superior de
61
polietilenglicol debido a la acumulacin de cargas positivas en el polietilenglicol y la
carga negativa neta de la membrana plasmtica mientras que el resto de membranas
quedan retenidas en la fase inferior de dextrano.
Un esquema del proceso de lisis celular descrito puede ser observado en la
figura 4.1.


























Figura 4.1. Esquema del proceso de fraccionamiento celular. TH: tampn de homogenado, MAM:
membranas asociadas a mitocondria. De D.J .M. Fernndez-Ayala (Tesis doctoral)

62

Ensayos.
El fraccionamiento celular permite realizar una gran variedad de ensayos tanto
enzimticos como de determinacin de protenas, aislamiento de stas o de complejos
de protenas, estudios de composicin de membranas: protena, extraccin de lpidos,
glucoprotenas, etc.
Por tanto, podemos considerar al fraccionamiento celular como una de las
principales herramientas utilizadas en Biologa Celular.


Desarrollo de la prctica.

A partir de clulas en cultivo se realizar el lisado celular mediante
homogenizacin vidrio-vidrio y el posterior fraccionamiento por centrifugacin hasta
obtener una pella de mitocondrias crudas. Dicha fraccin mitocondrial se utilizar
para realizar la determinacin de la actividad mitocondrial citocromo c reductasa
dependiente de piruvato/malato inhibible por rotenona (un inhibidor especfico del
complejo I mitocondrial) o de succinato y en este caso inhibible por malonato (un
inhibidor especfico del complejo II mitocondrial). Mediante esta reaccin se
determina la actividad de parte de la cadena de transporte mitocondrial y
concretamente la que afecta a los complejos I +III (citocromo c reductasa dependiente
de piruvato/malato) y la que afecta a los complejos II +III (citocromo c reductasa
dependiente de succinato). En este ltimo caso se utilizar la rotenona para evitar el
flujo reverso de electrones.

Obtencin de la fraccin de mitocondrias crudas:

Recoger las clulas por centrifugacin durante 5 min a 4 C a 500 x g.
Lavar las clulas dos veces mediante centrifugacin con PBS fro durante 5
min a 4 C a 500 x g.
Resuspender las clulas en 2,5 ml de tampn de lisis en fro. Tampn de
lisis: 2 mM Hepes pH 7.4, 0,15 mM MgCl
2
, 10 mM KCl, 0,5 mM
EGTA. Conseguimos as producir hinchamiento de las clulas.
63
Homogenizar las clulas mediante la utilizacin de un homogenizador
vidrio-vidrio subiendo y bajando el mbolo varias veces (dos tandas de
15 veces cada vez). Tras comprobar la lisis celular al microscopio,
aadir una solucin de sacarosa en tampn de lisis hasta una
concentracin final de 0,32 M (2,5 ml de tampn de lisis ms sacarosa
0,64 M). As se restaura la osmolaridad y se consigue que las
mitocondrias mantengan su estructura normal.
Recoger el homogenado y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 C. As
se eliminan los ncleos y restos celulares grandes que quedan retenidos
en la pella mantenindose en el sobrenadante el resto de orgnulos en
suspensin.
Recoger el sobrenadante y centrifugar nuevamente a 10.000 x g durante 10
min a 4 C. Descartar el sobrenadante ya que en la pella se encuentran
las mitocondrias aisladas.
Resuspender la pella en 1 ml de tampn de lisis ms 0,32 M de sacarosa.
Mantener en fro hasta que se realice el ensayo de la actividad.
Determinar la cantidad de protena en la muestra. La determinacin se
realizar midiendo la densidad ptica de la muestra a 280 nm.


Para el ensayo de actividad mitocondrial:
Para realizar la determinacin de una actividad enzimtica mediante el uso de tcnicas
espectrofotomtricas vamos a utilizar la muestra de mitocondria aislada previamente y
estudiar el efecto de inhibidores especficos de dos miembros de la cadena de
transporte de electrones mitocondrial, la rotenona (para el complejo I) y el malonato
(para el complejo II) (Figura 4.2). El proceso se realiza en presencia de un potente
inhibidor del complejo IV mitocondria, el KCN, para evitar que el citocromo c
reducido, molcula que se va a medir, pueda ser reoxidado por el complejo IV y as
evitar que podamos realizar la medicin.





64






























Figura 4.2. Esquema del proceso de transporte de electrones mitocondrial. Se indican los puntos de
inhibicin afectados durante la prctica. Igualmente se indica la actividad de la ATPasa mitocondrial
como proceso acoplado para la obtencin de energa. De D.J .M. Fernndez-Ayala (Tesis doctoral)

Desarrollo de la medicin.
Espacio intermembrana
Matriz
mitocondrial
Complejo IV
Complejo V
Complejo III
Complejo II
Complejo I
4 H
+
NAD
+
H
+
NADH
Q
QH
2
2 Cit-c
ox
2 Cit-c
red
? O
2
2 H
+
H
2
O
2 e
-
4 H
+
fumarato
succinato
2 e
-
Q
QH
2
pool
Q/QH
2
2 H
+
Q
QH
2
2 H
+
2 H
+
2 e
-
2 H
+
2 H
+
2 H
+
2 e
-
2 H
+
H
+
H
+
ADP
Pi
ATP
(B)
pool
Q/QH
2
Los complejos
I y II
reducen el
pool de CoQ
El complejo
III
oxida el
pool de CoQ
Rotenona
Malonato
KCN
65
El estudio de la actividad citocromo c reductasa mitocondrial se realiza
mediante espectrofotometra determinando la variacin de densidad
ptica a 550 nm que sufre el citocromo c reducido en una solucin
tamponada con fosfato sdico (NaH
2
PO
4
/Na
2
HPO
4
a pH 7,5).
Marcaremos los tubos del 1 al 6. Tomar 50 microlitros de fraccin cruda
mitocondrial previamente aislada a una concentracin proteica de 2
mg/ml y resuspender en tampn fosfato suficiente (ver tabla adjunta)
para que el volumen final sea de 1 ml. Aadimos 10 microlitros de
cianuro potsico (KCN) 25 mM para inhibir la actividad del complejo
IV y as evitar que el citocromo c se reoxide.
A los tubos nmero 4 al 6 se aade rotenona a 5 g/ml a partir de una
concentracin de 500 g/ml.
Al tubo nmero 6 se aaden 10 l de malonato 1M (Concentracin final 10
mM).
Dejar incubar durante 5 min a 37 C.
Aadir 50 l de una concentracin de 0.5 mM de citocromo c oxidado a
cada tubo.
Aadir a los tubos 2 y 3 se aaden 10 l de NADH 4 mM o 40 ml de una
solucin 250 mM piruvato/ 250 mM malato.
Aadir a los tubos 5 y 6 10 l de una solucin 1 M de succinato.
Incubar a 37 C durante 5 min e introducir inmediatamente despus el tubo
en hielo.
Medir la absorbancia a 550 nm. Realizar blanco con el tampn de reaccin.
Anotar los valores obtenidos para calcular la actividad.
Calcular la actividad obtenida teniendo en cuenta un coeficiente de
extincin mM del citocromo c reducido a 550 nm de 27,8 mM
-1
cm
-1

tanto en presencia y ausencia del inhibidor. Para el clculo de la
actividad, restar siempre el valor obtenido en ausencia de substrato,
tubos 1 y 4.


66

Tabla de aditivos.

Antes de comenzar el ensayo, incluir en cada casilla el valor correspondiente del
volumen aadido de cada uno de los componentes para as obtener el volumen de
tampn fosfato que se debe aadir al principio.
La ltima casilla se utilizar para anotar la densidad ptica (OD) obtenida en el
ensayo.


Complejo I+III Complejo II+III
Tubos 1 2 3 4 5 6
Actividad

Nada +NADH +Inhibidor Nada +Succinato +Inhibidor
Mitocondrias

50 50 50 50 50 50
KCN


Rotenona


Malonato


Citocromo c


NADH


Succinato


Tampn
fosfato



Densidad
optica





67


PRCTICA NMERO 6

ESTUDIO DE LA MITOSIS

Introduccin.
La divisin celular es un proceso por el cual a partir de una clula madre se
producen dos clulas hijas que gentica, estructural y funcionalmente son iguales entre
s e iguales a la propia clula madre. Ello se debe a que han recibido, excepto en el
caso de procesos anormales, la misma informacin gentica de la clula madre y, por
lo general en la mayora de los organismos la misma cantidad de citoplasma y
orgnulos.
Este fenmeno se produce tanto en procariotas como en eucariotas. En los
procariotas y eucariotas unicelulares o de vida libre la divisin celular es el proceso
por el cual se propaga la informacin gentica y aumenta el nmero de individuos de
la poblacin, mientras que en los organismos pluricelulares la divisin celular es
esencial para el desarrollo del organismo a partir del zigoto y para la reparacin de las
clulas que han muerto por desgaste o por lesiones ocurridas en los tejidos.
Existen diferencias entre la divisin celular de procariotas y eucariotas
derivadas de la distinta estructura y de la diferente cantidad de ADN que poseen estos
tipos de clulas. En las clulas eucariotas el proceso de divisin es ms complejo
debido a la existencia de un ncleo en el que se almacena la cromatina condensada en
forma de cromosomas que, en algunos casos, pueden ser muy numerosos.
El mecanismo utilizado para la divisin celular se denomina mitosis, aunque es
el mecanismo que afecta al material gentico. Normalmente este mecanismo se
contina con la divisin del citoplasma denominada citocinesis.

El objeto de la presente prctica es identificar las clulas que se encuentran en
mitosis y las distintas fases de sta mediante la tincin y observacin de meristemos
de raz de cebolla. Una vez identificadas las fases de la mitosis, se puede calcular el
ndice mittico y la distribucin porcentual de cada una de las fases mitticas de
meristemos de raiz de cebolla crecidos en diferentes condiciones. Con estos datos
realizaremos un informe a modo de trabajo de investigacin explicando la
metodologa utilizada, los objetivos, resultados y comentarios al respecto.
68

Ciclo celular.
El ciclo celular es una secuencia regular y repetitiva de crecimiento y divisin
celulares que sufren todas las clulas. La duracin de este ciclo es variable y depende
del tipo celular, del organismo y de factores externos como la temperatura, factores de
crecimiento, nutrientes y toxinas.
El ciclo celular consta de cinco fases: G1, S, G2, mitosis y citocinesis (Figura
5.1). Las tres primeras fases se agrupan en lo que se denomina interfase durante la
cual la clula se prepara para realizar la divisin celular formada por las dos ltimas
fases.
La funcin de las fases de la interfase quedan resumidas de la siguiente forma:
Fase G
1
.- Durante esta fase se desarrolla una alta actividad bioqumica
cumpliendo con las distintas funciones que la clula presente en el organismo.
Normalmente, en un organismo pluricelular, las clulas, que no se dividen
normalmente salvo en presencia de ciertos factores de crecimiento, se enquistan en
una subfase denominada G
0
. La fase G
0
indica nicamente que las clulas no se
encuentran en un ciclo contnuo de crecimiento y duplicacin. En un organismo
diploide, la cantidad de ADN en el ncleo es de 2n.
Fase S.- Cuando las clulas se encuentran en un ciclo contnuo de crecimiento
y divisin celular o reciben una seal extracelular adecuada, pasan a duplicar la
cantidad de ADN y sintetizar una serie de protenas encargadas de la compactacin
del ADN. Por lo tanto, al final de la fase S, una clula de un organismo diploide ha
pasado a tener una dotacin doble de ADN. No se puede decir que sea tetraploide (4n)
sino que sigue siendo diploide pero con cada uno de los cromosomas duplicados, las
indicaremos como 4c.
Fase G
2
.- Las clulas han terminado la sntesis de ADN (4c) y se preparan
para sufrir el complejo proceso de la divisin celular. En esta fase se sintetizan las
protenas necesarias para llevar a cabo la mitosis y se concluye la duplicacin y
separacin del centriolo en clulas animales.

69
G1: crecimiento
S: duplicacion
del ADN
G2: crecimiento
M: Mitosis
G0: quiescencia
G1: crecimiento
S: duplicacion
del ADN
G2: crecimiento
M: Mitosis
G0: quiescencia











Figura 5.1. Esquema del ciclo celular.

La regulacin del ciclo celular es muy importante en organismos pluricelulares
ya que un descontrol de la velocidad del ciclo podra descompensar y alterar el
equilibrio funcional del organismo dando lugar a consecuencias tan negativas como el
cncer.

Fases de la mitosis.
Durante la mitosis se distribuyen los cromosomas de forma que cada clula
hija reciba una dotacin completa de ADN. Ello depende de la existencia de
cromosomas duplicados y condensados compuestos por dos cromtidas unidas por un
centrmero y de la existencia de un huso mittico compuesto por microtbulos
polares, astrales y cinetocricos. Estos ltimos se unirn a los cromosomas por los
cinetocoros.
En las clulas animales aparecen las fibras del ster o astrales, que surgen a
partir del centriolo y que participan como anclaje del huso mittico a la membrana
plasmtica. En clulas vegetales, el huso mittico no requiere de microtbulos de ster
ni de centriolos, probablemente debido a la propia rigidez de la pared celular. De todas
formas, presentan un centro organizador desde donde parten los microtbulos y desde
donde se organiza el huso acromtico.



70


De una forma breve, durante las fases del ciclo se producen los siguientes
procesos:

Profase.
Los cromosomas se condensan, el citoesqueleto celular se va despolimerizando
y se van organizando las fibras del huso. En animales, los centriolos, ya divididos, se
separan y se localizan en polos opuestos de la clula. Se forman los microtbulos
polares del huso.

Prometafase.
Desaparece el nucleolo y la envoltura nuclear. Se acaba de formar el huso y los
cromosomas se unen a los microtbulos cinetocricas.

Metafase.
Las cromtidas se colocan en el plano ecuatorial del huso mittico tras unos
movimientos de balanceo dirigidos por los microtbulos cinetocricos.

Anafase.
Las cromtidas hermanas se separan de forma simultnea y se dirigen hacia los
polos del huso mediante un movimiento de traccin ocasionado por la
despolimerizacin de las fibras cinetocricas de actina. En animales, los centriolos se
separan mediante el concurso de los microtbulos astrales.

Telofase.
Los cromosomas alcanzan los polos del huso. Se despolimeriza el huso
mittico. Se reconstruye la envoltura nuclear alrededor de los cromosomas que se
descondensan para dar lugar a dos clulas idnticas.

Citocinesis.
La citocinesis es la separacin fsica de las dos nuevas clulas. En las clulas
animales se produce mediante la aparicin de un surco en el plano ecuatorial de la
clula que finalmente la estrangula. El estrangulamiento se produce mediante el
71
concurso del citoesqueleto de actina y de miosina formando un anillo contrctil en esa
localizacin. En el caso de las plantas, la citocinesis se produce en el plano ecuatorial
de la clula debido a la formacin de una nueva pared celular entre las clulas hijas
mediante la fusin de vesculas del aparato de Golgi cargadas de polisacridos
transportadas y organizadas por microtbulos. La membrana de vesculas darn lugar
a la membrana plasmtica y los polisacridos a la pared celular tpica de los vegetales.


Figura 5.2. Clulas en distintas fases de la mitosis. Profase (izquierda arriba), metafase
(izquierda abajo), anafase (derecha arriba) y telofase (derecha abajo). Los cromosomas aparecen
teidos de color azul mientras que los microtbulos aparecen coloreados de rojo.

72

Tincin.
Existen varios protocolos para la tincin de cromosomas en plantas con el fin
de estudiar los procesos mitticos: orcena y tincin de Feulgen. En la presente
prctica utilizaremos la tincin de Feulgen para ADN.
El fundamento de la tincin de Feulgen consiste en la tincin especfica del
ADN por eliminacin de parte de sus nucletidos. El ADN es una doble hlice
formada por un esqueleto de desoxirribosa-fosfato al que se le unen las bases
nitrogenadas, pricas o pirimidnicas que se disponen al 50 % en el ADN. El
tratamiento con HCl elimina por hidrlisis las bases pricas del ADN sin alterar su
estructura molecular. Al eliminarse las bases pricas, en las molculas de
desoxirribosa quedan libres grupos aldehdos. El reactivo de Schiff es una solucin
incolora que se une a los grupos aldehdo cambiando a un color rojo-rosado
fcilmente visible al microscopio.
La tcnica no tie el ARN ya que el tratamiento con HCl lo hidroliza
completamente al igual que lo hara con el ADN si prolongsemos la incubacin con
HCl. Una caracterstica importante de esta tcnica es que adems de detectar la
presencia de ADN en la clula, se puede usar para determinar el contenido ya que es
una tcnica estequiomtrica.

Procedimiento de tincin.
Obtencin de la muestra.
Las cebollas se han mantenido en cultivo hidropnico durante tres das hasta
que las races han alcanzado una longitud determinada. Posteriormente se cortan los
meristemos, se lavan con agua corriente y se fijan con fijador Carnoy (cido actico
glacial y alcohol etlico al 50%).

Tincin.
Lavar las raices con agua dos veces durante tres minutos.
Incubar con HCl 5 N durante treinta minutos
Lavar las raices con agua dos veces durante tres minutos
Tratar con reactivo de Schiff durante 20 min.
Lavar las raices con agua cuatro veces durante tres minutos.
73
Aplastar la raz. Para ello se toma la raz y se coloca en un portaobjetos.
Tras cortar la zona del meristemo, zona ms teida, se aade una gota
de cido actico al 50% sobre el meristemo y se coloca encima el
portaobjetos. Se realiza el aplastado de la raz con una punta de lpiz,
punteando sobre el meristemo en espiral desde el centro al exterior.
Finalmente, se procede a la observacin de la muestra al microscopio y
al recuento del nmero de clulas en mitosis respecto al total (ndice
mittico) y al recuento de clulas que se encuentran en las diferentes
fases del ciclo celular (ndice de fases).


74


75


PRCTICA 7

TEJIDOS VEGETALES. TINCIN Y ESTUDIO HISTOLGICO
DE TEJIDOS VEGETALES.

Introduccin.
La clula vegetal presenta una serie de caractersticas distintivas, entre las que
podemos sealar:
- Presencia de pared celular. La pared celular se trata de una estructura
formada por azcares (celulosa y ligninas fundamentalmente) que se encuentra
recubriendo las clulas vegetales. Esta pared es delgada (pared celular primaria) en
clulas jvenes y poco diferenciadas (meristemo, parnquima), mientras que en otras
clulas se engrosa formando pared secundaria. La pared secundaria puede ser de
celulosa (colnquima) y puede llegar a lignificarse (esclernquima y xilema). Cuando
se deposita este material en la pared, la clula deja de crecer y el protoplasto muere.
Es entonces cuando estas clulas cumplen su misin (esclernquima para soporte, o
vasos del xilema huecos para el paso de agua y sales).
- La morfologa celular es muy variable dependiendo del tipo celular.
- La presencia de cloroplastos es muy patente slo en las partes verdes de la
planta, fundamentalmente en las hojas.
Por ello, los cortes histolgicos obtenidos de tejidos vegetales son teidos con
tcnicas que discriminan entre las caractersticas de las paredes celulares siendo esta
estructura la, casi exclusiva, estructura visible al microscopio ptico.

El objetivo de la presente prctica consiste en la observacin y estudio de
distintos tipos de clulas y tejidos vegetales. Para ello, se proceder a la tincin de
cortes de material vegetal mediante una tcnica compleja que utiliza sales de cinc y
hierro, cido tnico y los colorantes safranina y naranja G.

Tejidos vegetales.
Meristemos.
Formado por clulas indiferenciadas y proliferantes, el meristemo es el tejido
responsable del crecimiento y desarrollo de la planta (Figura 6.1). La clula
76
Figura 6.1. Meristemo radicular
de cebolla (Allium cepa).
meristemtica es una clulas pequea e isodiamtrica. Presentan una baja proporcin
citoplasma/ncleo llegando el ncleo a constituir hasta el 50% del volumen celular. Su
pared celular es delgada formada por lmina media
y pared primaria formada principalmente por
celulosa y pectinas. Su contenido intracelular est
formado por gran cantidad de citoplasma con pocos
orgnulos pero con abundancia de ribosomas y
aparato de Golgi. Los plastidios (proplastidios) son
pequeos y no funcionales. Presentan mltiples
vacuolas de pequeo tamao. Las clulas
meristemticas, entre las que podemos observar gran
cantidad de clulas en mitosis, se disponen en cordones dejando poco espacio
extracelular entre ellas.
Los meristemos se clasifican en primarios o secundarios segn den lugar a
crecimiento primario (crecimiento en longitud y grosor)o meristemos secundarios
(dan lugar a crecimiento en grosor). Los meristemos primarios son apicales (caulinar y
radical) e intercalares. Los meristemos secundarios son el meristemo vascular,
interfascicular y suberoso.)

Epidermis.
La epidermis es la capa celular ms externa de los rganos con crecimiento
primario de la planta: hojas, verticilos florales, frutos, semillas, tallos y races
mientras que en los rganos con crecimiento secundario la epidermis es reemplazada
por la peridermis. En la mayora de las plantas consiste en una sola capa de clulas
aunque puede aparecer multiestratificada en ciertos rganos de algunas plantas como
begoniaceas, quenopodiceas, morceas.... No se debe confundir esta
multiestratificacin con la hipodermis, otro tejido de proteccin sobre el que en
algunos casos descansa la epidermis. La forma de las clulas epidrmicas vara segn
el medio en el que la especie vegetal habite. En general las clulas son aplanadas y se
disponen ntimamente unidas sin presentar apenas espacios intercelulares. Presentan
una considerable cantidad de mitocondrias, retculo endoplsmico y complejo de
Golgi. Los cloroplastos estn poco desarrollados y suelen ser amiloplastos. Poseen
una gran vacuola. Tienen una pared celular primaria de espesor primario que en la
cara externa presenta una capa de pectina muy pura que separa la pared de la capa
77
cuticular formada por cutcula, una sustancia lipdica de proteccin que recubre la
epidermis. Sobre la cutcula puede depositarse una nueva capa de ceras.
La epidermis no es un tejido homogneo sino que puede presentar multitud de
tipos celulares entre los que podemos distinguir entre otras: clulas epidrmicas,
clulas oclusivas de los estomas (Figuras 6.2 y 6.3), y tricomas. Las clulas oclusivas
del estoma presentan forma arrionada. Los tricomas adquieren diferentes formas
dependiendo de su funcin como: pelos radiculares, o pelos de hojas para captar la
humedad.
Figura 6.2. Epidermis (inferior) en la que se
pueden observar las clulas guarda del estoma. El
estoma abre a la cmara subestomtica.
Figura 6.3. Epidermis (inferior) recubierta de
cutcula que se ha teido de color rosado. Dentro
de las clulas parenquimticas se pueden observar
los cloroplastos (verde).
Figura 6.4. Epidermis superior de una hoja.
Obsrvese la compacta unin entre las clulas
epidrmicas formando un autntico mosaico.
Figura 6.5. Epidermis inferior de una hoja. Al
contrario que en el caso de la parte superior, en la
zona inferior de la hoja se pueden observar gran
cantidad de estomas.

Endodermis.
Es un tejido protector presente en las races aunque tambin en algunos tallos y
hojas. Se encuentra rodeando los haces vasculares delimitando claramente la mdula
de la corteza (Figura 6.6). Est formada por una nica capa de clulas similares a las
de la epidermis pero presentando una gran vacuola. Su pared celular presenta un
depsito de lignina y suberina dispuesta en banda que constituye la estra o banda de
78
Caspary (Figura 6.7). La banda de Caspary tiene como funcin el impedir el paso de
agua e iones al cilindro central o mdula a travs de los espacios extracelulares o
apoplsticos obligando al agua e iones a pasar a travs de la clula, por el espacio
simplstico. De esta manera la endodermis controla el paso de nutrientes e iones a los
conductos vasculares.
Figura 6.6. Endodermis. La endodermis hace de
autntica barrera entre las clulas de la corteza
(superior izquierda) de las clulas de la mdula
donde se cuentran los haces vasculares (xilema
con paredes engrosadas de color rojizo)
Figura 6.7. Endodermis. Obsrvese la banda de
Caspari (rojo) que, a modo de cinturn, hace
imposible el transporte de agua por la pared
celular que separa dos clulas sino que el agua
debe atravesar las clulas para pasar desde la
corteza a la mdula.

Parnquima.
Es un tejido poco diferenciado que presenta diferentes funciones dependiendo
de las caractersticas de sus clulas: fotosntesis (parnquima asimilador),
almacenamiento (parnquima de reserva), o acumulacin de aire (parnquima
aerfero). Debido a la disparidad de funciones, la clula parenquimtica presenta
formas variadas pero preferentemente prismtica aunque algunas veces aparecen
redondeadas debido a la turgencia. La pared celular suele ser delgada presentando
lmina media, pared primaria y en algunos casos pared secundaria poco desarrollada.
Presentan una gran vacuola central que almacena una gran variedad de sustancias
dependiendo de la planta que se trate. La vacuola se mantiene muy turgente. El
espacio extracelular en el tejido es de dimensiones variables dependiendo igualmente
de la funcin.
El parnquima se clasifica dependiendo del tipo de funcin que desarrolle de la
que van a depender las caractersticas celulares. As tenemos:
Parnquima asimilador o cloroflico (Figura 6.8) que presenta abundantes
cloroplastos muy desarrollados en las hojas. En l encontramos el parnquima en
empalizada (clulas de aspecto prismtico y con pocos espacios extracelulares) o el
79
parnquima lagunar (clulas ms redondeadas presentando grandes espacios
extracelulares).


Figura 6.8. Corte de hoja en el que se puede observar el parnquima cloroflico en empalizada
(superior) y el parnquima cloroflico lagunar (inferior). El centro del corte corresponde a un nervio
formado por haces vasculares. En la parte superior (haz) se distingue claramente la epidermis formada
por una nica capa de clulas.

Parnquima de reserva. Clulas con paredes muy delgadas con algunos
espacios extracelulares. Presentan una gran vacuola central que almacena la sustancia
de reserva y plastidios de almacenamiento (amiloplastos, elaioplastos,etc). El ncleo
es poco visible y perifrico.
Parnquima aerfero. Especialmente importante en plantas acuticas. Es un
tejido formado por clulas grandes con aspecto estrellado y con grandes espacios
intracelulares donde se almacenan gases.
Parnquima acufero. Similar al parnquima de reserva pero donde la sustancia
de reserva es agua que se acumula en la vacuola.

Tejidos de sostn.
Son tejidos formados por clulas especializadas que presentan paredes
celulares muy engrosadas para cumplir su funcin de sostn de la planta. Existen dos
tipos de tejidos de sostn: colnquima y esclernquima.
Colnquima. Se presenta preferentemente en rganos en vas de crecimiento
como son los peciolos, tallos, hojas y frutos y rganos maduros de plantas herbceas.
Est formado por clulas vivas que presentan cloroplastos. La pared celular de la
clula del colnquima estn muy engrosadas en todo el permetro o slo en algunas
zonas pero no presenta lignina sino que est formada por celulosa, pectatos y agua.
Esclernquima. Formado por clulas con una pared secundaria muy engrosada
y endurecida debido a la lignificacin. Est formado por clulas (esclereidas) y fibras.
80
Las fibras se forman a partir del meristemo por elongacin y prdida posterior del
citoplasma dejando una fibra alargada con poca luz en su interior. El esclernquima se
encuentra tanto en corteza como en mdula de tallos y races al igual que en el
mesfilo de la hoja, los frutos y las semillas.



Figura 6.9. Colnquima. Obsrvese las paredes
celulares engrosadas en las uniones entre clulas y
clulas.
Figura 6.10. Esclernquima. Obsrvese el gran
acmulo de lignina que presenta este tejido.

Tejidos vasculares.
Los tejidos vasculares son caractersticos de plantas superiores y comprende
dos tipos de tejidos; el xilema y el floema. El xilema transporta agua y sustancias
disueltas en ella desde la raz al resto de la planta mientras que el floema transporta los
nutrientes orgnicos por toda la planta.
Xilema. Tambin llamado leo (Figura 6.11). Fcilmente apreciable al
microscopio, el xilema est formado por dos tipos de elementos: las tqueas o vasos y
las traqueidas.
Las trqueas se encuentran en angiospermas, en algunas gimnospermas y
pteridofitas. Pueden alcanzar hasta los 5 m de longitud y 0,7 mm de dimetro.
Consisten en la superposicin de numerosas clulas de forma cilndrica que se han
unido entre s a travs de sus paredes basales y apicales. Estas paredes han quedado
perforadas formando verdaderos canales. La pared celular primaria de las trqueas
prcticamente desaparece durante el proceso de diferenciacin mientras que el
citoplasma y orgnulos desaparecen por completo. Presentan numerosos
engrosamientos de lignina en su pared celular que presentan diferentes disposiciones
segn el tipo celular y que permiten la clasificacin de las trqueas en anuladas (en
81
forma de anillos), helicadas (en forma de hlices), doble-helicadas (en doble hlice) y
anulo-helicadas (con anillos y hlices). En xilemas ms diferenciados o procedentes
de crecimiento secundario encontramos trqueas con disposiciones ms complejas del
engrosamiento de lignina: escaleriformes (los huecos quedan como peldaos de
escalera), reticuladas (pared lignificada irregular con perforaciones), punteadas (muy
lignificadas y con punteaduras).
Las traqueidas se encuentran en el xilema de todas las plantas. Su estructura es
similar a la de las trqueas a excepcin de que la traqueida como clula individual es
ms estrecha y larga que un elemento de la trquea y se unen unas a otras dando lugar
a un recorrido irregular. Las paredes entre traqueidas son oblicuas en sus extremos y
llenas de punteaduras.

Floema. Tambin denominado liber (Figura 6.12). Est formado por dos
elementos: los tubos cribosos y las clulas cribosas.
En el caso de los tubos cribosos, al igual que ocurra con las trqueas, resultan
de la superposicin de clulas cilndricas unidas entre s por sus paredes basales y
apicales pero, en lugar de presentar perforaciones, se comunican entre s por cribas
formando lo que se denomina placa cribosa. En las paredes celulares laterales tambin
podemos encontrar reas que presentan un gran nmero de cribas, que se denominan
reas cribosas. Las cribas estn atravesadas por plasmodesmos. Durante el proceso de
diferenciacin se forman las placas y reas cribosas y el citoplasma de las clulas va
degenerando hasta que el contenido de la vacuola o tonoplasto se rompe mezclndose
con el citoplasma formando el mictoplasma. El ncleo y las mitocondrias desaparecen
y slo podemos encontrar algunos plastdios, ribosomas libres y algunos fragmentos
de citoplasma. La pared celular no presenta lignificacin y si nos acmulos de una
sustancia polisacardica de tipo glucano que obtura las placas cribosas durante las
pocas de reposo de la planta (invierno).
Las clulas cribosas son clulas alargadas y delgadas con extremos
puntiagudos que se disponen superpuestas unas a otras y slo presentan reas cribosas.

Asociadas a los elementos del tejido conductor de las plantas encontramos
clulas parenquimticas y otro tipo de clulas anejas con diferentes funciones. El
xilema, floema, y clulas anejas se disponen en forma de haces de diferente
conformacin denominados haces vasculares.
82


Figura 6.11. Traqueas y traqueidas. En el xilema se pueden observar largas fibras formadas por
clulas unidas entre s en las que se ha producido un proceso de lignificacin que ha engrosado las
paredes celulares por lignificacin (de ah el color rojizo). Los engrosamientos puede adquirir diversas
formas siendo llamativas las escaleriformes y las espirales.



Figura 6.12. Floema, corte longitudina. Se puede observar las placas perforadas (izquierda y derecha
en color rojizo). En comparacin con el xilema. Las paredes del floema estn menos engrosadas ya que
no sufren lignificacin.



83



Haces vasculares de lila

Haz vascular de hoja de maiz
.


Haces vasculares de Heliantus

Haces vasculares de maiz.

Figura 6.13. Diferentes tipos de haces vasculares. Como se puede observar, la disposicin de floema y
xilema en las plantas vara entre distintos tipos y familias de plantas.

84
Tinciones.
A continuacin se describen dos mtodos de tincin general para especmenes
vegetales.

Tincin con verde-yodo y rojo-congo para tejidos vegetales.
Este mtodo permite teir la pared primaria de las clulas que aparecer en
rojo mientras que lignina y suberina de la pared secundaria y la cutina de las clulas
epidrmicas aparecern teidas de verde.

Protocolo de tincin:

1) Tratar la muestra con hipoclorito sdico al 10% durante 10 min. Se realiza
esta incubacin para vaciar las clulas y dejar nicamente las paredes celulares.
2) Lavar con agua de grifo durante 5 min.
3) Incubar con una solucin acuosa de cido actico al 20% durante 5 min para
permitir la unin del colorante al tejido, es decir, acta como mordiente.
4) Lavar con agua destilada, 2 lavados de 5 min cada uno.
5) Incubar con Verde yodo al 1% en agua durante 5 min.
6) Incubar con alcohol de 70 durante 5 min.
7) Lavar con agua destilada, 2 lavados de 5 min cada uno.
8) Sumergir en rojo congo al 1% en agua durante 10 min.
9) Lavar con agua destilada, 2 lavados de 5 min cada uno.
10) Baar en alcohol de 96 durante 5 min.
11) Baar en alcohol de 100 , 2 lavados de 5 min cada uno.
12) Aclarar con xilol, 2 lavados de 5 min.
13) Montar.

85
Tincin con Safranina-NaranjaG-Acido tnico para tejidos vegetales.
Partiendo de cortes de parafina de diferentes partes (tallo, raices, hojas) de
diferentes plantas del entorno procederemos al protocolo de tincin.
Preparacin de soluciones:
ZnCl
2
: al 2% en H
2
O. Filtrar antes de usar.
Safranina: Preparar una solucin concentrada al 2% en H
2
O. Diluir 1:25.000.
Naranja G-cido tnico: 2 g de naranja G, 5 g de cido tnico, 0.3 ml de HCl
diluido 1:5, 1 cristal de timol y aadir H
2
O hasta 100 ml.
cido tnico: 5 g de cido tnico y 1 cristal de timol en 100 ml de H
2
O.
NH
4
Fe(SO
4
)
2
: al 1% en H
2
O.
Protocolo de tincin:
1.- Desparafinacin e hidratacin de los cortes. Incubar la muestra como sigue:
I. Xilol 15 min
II. Alcohol 100 5 min
III. Alcohol 90 5 min
IV. Alcohol 70 5 min
V. Agua corriente 5 min
2.- Tratar con ZnCl
2
1 min
3.- Lavar con agua corriente 5 seg
4.- Teir con safranina 5 min
5.- Lavar con agua corriente 5 seg
6.- Teir con naranja G-cido tnico 1 min
7.- Lavar con agua corriente 5 seg
8.- Incubar con acido tnico 5 min
9.- Lavar con agua corriente 5 seg
10.- Tratar con NH
4
Fe(SO
4
)
2
2 min
11.- Lavar con agua corriente 15 seg
12.- Deshidratar y montar (como se ha indicado anteriormente).
86

Tras la realizacin de esta tcnica, observaremos las estructuras tisulares vegetales con
las siguientes coloraciones: negro o violeta oscuro para las paredes celulares no
lignificadas (ej. parnquima, colnquima, floema), rojo para las paredes celulares
lignificadas (esclernquima, xilema), amarillo-anaranjado para los ncleos y color
ocre para los cloroplastos.



87



PRCTICA 8.
OBSERVACIN DE TEJIDOS ANIMALES (1).
ESTUDIO HISTOLGICO DE EPITELIOS Y TEJIDO
CONJUNTIVO Y ELEMENTOS CELULARES DE LA SANGRE.
Introduccin.
Las tcnicas histolgicas tienen como fin la observacin de los diferentes
tejidos que conforman las diferentes estructuras de los organismos. La observacin y
estudio de cortes histolgicos de diferentes rganos y la comprensin e identificacin
de los tejidos que en esas muestras se observan constituye el principal objetivo de la
histologa. Por ello en las dos ltimas prcticas del presente cuaderno procederemos al
estudio exhaustivo de diferentes rganos y la identificacin de los tejidos que los
componen. Para ello dispondremos de diferentes muestras as como de atlas
histolgicos que permitirn una mayor comprensin de lo observado a travs del
microscopio.

Los epitelios.
Los epitelios (Figura 8.1) estn formados por clulas fuertemente unidas entre
s por complejos de unin presentes en las membranas plasmticas de clulas
adyacentes. Entre las clulas apenas existe sustancia intercelular. Los epitelios en s,
no presenta vasos sanguneos ni linfticos con lo que se alimentan por difusin a partir
de los capilares que subyacen en el tejido conjuntivo sobre el que descansa el epitelio
y que se denomina lmina basal.
Recubren todas las superficies libres del organismo tanto internas como
externas. Consideramos superficies externas la epidermis, y los epitelios que revisten
la superficie del aparato digestivo, respiratorio y urogenital. Igualmente reviste las
cavidades internas del organismo: cavidad pulmonar, cardiaca y abdominal,
recibiendo el nombre de mesotelio. Finalmente reviste los vasos sanguneos y
linfticos (endotelio).
88
Los epitelios no slo tienen una funcin de proteccin y recubrimiento sino
que tambin pueden ejercer una funcin secretora. Por ello distinguimos entre
epitelios de revestimiento y glandulares.


Epitelios de revestimiento.
Los epitelios de revestimiento cumplen diferentes funciones: proteccin
(epidermis, epitelio gstrico), recepcin sensorial (epidermis, epitelio olfativo, epitelio
lingual), absorcin (epitelio intestinal), secrecin (clulas secretoras de los epitelios,
glndulas), excrecin (epitelio renal), intercambio gaseoso (alveolos pulmonares), etc.
En cuanto a su clasificacin, los epitelios pueden clasificarse atendiendo a dos
criterios que se aplican conjuntamente:
a) En cuanto a la forma de las clulas: epitelios planos o
escamosos (clulas aplanadas), epitelios cbicos (clulas isodiamtricas,
en forma de cubo) y epitelios prismticos o cilndricos (clulas ms altas
que anchas con forma prismtica).
b) En cuanto al nmero de capas celulares: epitelios simples o
monoestratificados (una sla capa), epitelios pseudoestratificados
(cuando an observando dos o tres hileras de ncleos todas las clulas
estn en contacto con la lmina basal) y epitelios estratificados (formados
por diferentes capas celulares y donde slo las clulas de la capa inferior
estn en contacto con la lmina basal).

Epitelios glandulares.
Las clulas de estos epitelios expulsan productos que normalmente ellas
mismas sintetizan. La liberacin puede producirse al exterior del organismo (secrecin
exocrina) o al interior, generalmente al torrente sanguneo (secrecin endocrina). Los
epitelios glandulares suelen ser muy diversos en cuanto a composicin y organizacin
por ello lo podemos clasificar segn diferentes criterios:
a) En cuanto al nmero de clulas: unicelulares (donde clulas
aisladas presentes dentro de un epitelio de revestimiento cumple una
funcin secretora), y multicelulares (formados por un nmero grande de
clulas secretoras).
89
b) En cuanto al lugar de liberacin de los productos: glndulas
endocrinas (liberan a los capilares sanguneos), glndulas exocrinas
(liberan su contenido al medio externo o a un cavidad del organismo en
contacto con el medio externo). Algunas glndulas son a la vez endocrinas
y exocrinas al unsono como el pncreas o el hgado.
c) Segn el tipo de secrecin: glndulas mucosas (secretan
mucopolisacridos con funcin lubrificante o protectora), serosas (secretan
una composicin rica en enzimas), mixtas (la secrecin es a la vez mucosa
y serosa).
d) Segn el mecanismo de secrecin: glndula merocrina
(secrecin mediante vesculas de secrecin sin prdida de material
citoslico), glndula apocrina (junto con la secrecin liberan parte de la
zona apical del citosol), glndula holocrina (la secrecin est formada por
la propia clula que se libera completa o rota tras acumular gran cantidad
del producto de secrecin).





90


Figura 8.1. Diferentes tipos de epitelio. Posemos observar los siguientes epitelios: simple plano,
endotelio (arriba izquierda); simple cbico, nefrona (arriba derecha); simple cilndrico, intestino (medio
izquierda); simple cilndrico ciliado, revestimiento trquea (medio derecha); simple pseudoestratificad,
resvestimiento trquea (abajo izquierda); o y estratificado plano queratinizado, piel (abajo izquierda).

91
Tejido conjuntivo.
El tejido conjuntivo (Figura 8.2), como su nombre indica, ejerce la funcin de
unir rganos y tejidos por lo que se encuentra en todos aquellos lugares que sirven de
nexo entre otros tejidos como son la lmina basal (entre tejido epitelial y tejido
muscular o el propio tejido conjuntivo), el peristio y pericndrio (tejido conjuntivo
que recubre otros tejidos conjuntivos ms especializados como son el cartlago y el
hueso), tendones (nexo de unin entre msculo y hueso), etc El tejido conjuntivo
est formado por dos componentes bien distintos: el componente celular formado por
diversos tipos de clulas de distinto origen y la matriz extracelular. Ambos
componentes cooperan en la formacin de un tejido con propiedades elsticas que
tolera la deformacin y amortigua la interaccin mecnica entre distintos tipos
celulares y rganos.










Figura 8.2. Imagen del tejido conjuntivo (flechas ) correspondiente a lmina basal de un epitelio plano
estratificado, piel. Se pueden observar los ncleos celulares ovoidales de los fibroblastos y diversas
estructuras fibrosas indicativas de la gran cantidad de fibras de este tejido. Igualmente se observan
paquetes musculares de msculo liso que se encuentra en este tejido.

Tipos celulares.
Dentro de las clulas que integran el tejido conjuntivo se distinguen las clulas
fijas o residentes del tejido y las clulas mviles que entran al tejido conjuntivo
procedentes del torrente sanguneo.
Las clulas fijas agrupan a fibroblastos y a las clulas adiposas, mientras que
el grupo de clulas mviles incluye a clulas con capacidad de movimiento que
proceden de la sangre y que incluyen a eosinfilos, macrfagos, clulas cebadas,
linfocitos y clulas plasmticas.
92

Fibroblastos
Los fibroblastos son las clulas ms comunes en el tejido conjuntivo cuya
funcin es la de sintetizar y secretar las molculas proteicas que formarn la matriz
extracelular (colgeno y los mucopolisacridos de la sustancia fundamental). Tienen
forma de huso alargado, el ncleo se observa al microscopio como una elipse como
consecuencia de la forma celular. Los fibroblastos en reposo poseen un repertorio de
orgnulos bastante equilibrado. Sin embargo cuando el tejido conjuntivo es daado,
los fibroblastos presentan un mayor contenido en retculo endoplsmico, aparato de
Golgi y grnulos de secrecin, lo que se interpreta como la consecuencia de una
mayor capacidad de sntesis de protenas de la matriz extracelular que sustituyan a los
elementos daados.

Clulas adiposas
En el tejido conjuntivo existen clulas especializadas y completamente
diferenciadas que almacenan lpidos. Estas clulas o adipocitos presentan un ncleo
aplanado y un citoplasma muy reducido que posee nicamente algunos orgnulos.
Casi la totalidad del citoplasma est ocupado por una gran gota de lpido que carece
de membrana que la envuelva y que desplaza al citoplasma hacia la superficie celular.
Dependiendo de la disposicin y cantidad de las gotas de grasa se habla de grasa
blanca (formada por adipocitos que presentan una nica gota de grasa que ocupa la
mayora del citoplasma) o grasa parda (clulas con gran cantidad de mitocondrias que
presentan mltiples gotas de grasa y que se encargan no de almacenar grasa sino de
producir calor con ella). Cuando la proporcin de clulas adiposas en un tejido
conjuntivo es mayoritaria se habla de tejido adiposo o de reserva. Los tejidos
conjuntivos en general nunca se convierten en tejidos adiposos, si bien los tejidos
adiposos proceden de tejidos conjuntivos.
Figura 8.3. Tejido adiposo blanco (izquierda) y tejido adiposo pardo (derecha).
93

Clulas cebadas o mastocitos.
Clulas pertenecientes al sistema defensivo del organismo con caractersticas
similares a los basfilos.

Clulas mviles del tejido conjuntivo
Para proteger el tejido conjuntivo frente a las infecciones existe un grupo de
clulas que cooperan entre s para garantizar la asepsia de los tejidos conjuntivos y por
extensin de los espacios corporales.
Los macrfagos son clulas con gran capacidad fagoctica que destruyen
elementos invasores de los tejidos conjuntivos. Tienen capacidad de desplazarse por el
tejido conjuntivo infiltrndose entre las clulas.
El sistema defensivo del tejido conjuntivo se completa con clulas blancas
infiltradas desde la sangre y que incluyen a linfocitos, clulas plasmticas, eosinfilos
y basfilos.

Componentes fibrosos del tejido conjuntivo.
Las propiedades mecnicas del tejido conjuntivo se deben a las protenas
fibrosas que los componen. Tradicionalmente se han descrito tres tipos de fibras:
fibras colgenas, fibras reticulares y fibras elsticas (Figura 8.4). Las dos primeras son
manifestaciones estructurales distintas de la misma molcula: el colgeno.
Estas fibras se encuentran inmersas en una solucin viscosa que se compone
de protenas ramificadas formando la denominada "sustancia fundamental", que posee
las propiedades de un gel poco denso.

Fibras de colgeno.
Las principales fibras que componen el tejido conjuntivo son las fibras de
colgeno sintetizadas por los fibroblastos. Estas fibras miden entre 0,5 a 20 m de
dimetro y son de longitud indefinida. Las fibras colgenas son ligeramente
onduladas, y cuando se las mira con la luz polarizada presentan una acentuada
birrefrigencia. Al microscopio electrnico poseen un patrn de bandas caracterstico
que se repite cada 64 a 67 nm, y otro con periodicidad de 240 nm.
Estas fibras son muy flexibles pero poseen una extraordinaria resistencia a la
traccin, ya que la estructura de las fibras colgenas se basa en la interaccin de
94
diversas molculas de tropocolgeno entre s. Las molculas de tropocolgeno se
componen de 3 cadenas polipeptdicas unidas entre ellas por disposicin helicoidal.
Las cadenas polipeptdicas se presentan en diversas isoformas. La combinacin de
estas diversas isoformas da lugar a los distintos tipos de colgeno que se presentan en
los distintos rganos y tejidos.

Fibras reticulares.
Las fibras reticulares son fibrillas de colgeno muy finas que interaccionan
entre s formando red o malla. Las fibras reticulares son propias de los tejidos
conjuntivos laxos y poco o nada frecuentes en los densos. Los laxos son ms
abundantes en el animal en desarrollo y son sustituidos por fibras de colgeno en el
individuo adulto.

Fibras elsticas.
Ciertos rganos del cuerpo como las grandes arterias o los pulmones necesitan
una gran capacidad elstica para poder llevar a cabo su misin. La elasticidad de estos
rganos se basa en parte en el tejido conjuntivo que posee una gran proporcin de
fibras elsticas. Las fibras elsticas se componen de una protena denominada
elastina, que tiene capacidad de polimerizar constituyendo fibras delgadas de unos 200
nm que forman una malla o red tridimensional. La malla formada por fibras de
elastina se ve apoyada por otras molculas de elastina que no forman parte de fibras
sino que se encuentran en forma soluble y que contribuyen a las propiedades elsticas
del tejido del que forman parte.

Sustancia fundamental
Todas las fibras que forman parte de la matriz extracelular del tejido
conjuntivo estn embebidas en una solucin acuosa ms o menos viscosa que se
compone de una gama de molculas aminoglucdicas de estructura ramificada que
aportan al lquido extracelular unas caractersticas de fluidez ptimas para la funcin
que cumple en el tejido denominada sustancia fundamental.
Estas molculas presentan una estructura lineal de molculas de azcares
cargados negativamente y formando dmeros concatenados llamados glicanos que se
unen a una molcula proteica pasando a constituir los proteoglicanos. Dependiendo de
la composicin en azcares de estas molculas adquieren propiedades electroqumicas
95
particulares. Los proteoglicanos a su vez se pueden unir a una molcula lineal
glucdica, cido hialurnico, constituyendo una compleja macromolcula cargada
negativamente con capacidad de retener agua.


Figura 8.4. Fibras del tejido conjuntivo. Fibras de colgeno (izquierda), fibras de elastina (centro),
fibras de reticulina (derecha).


Clasificacin del tejido conjuntivo.
El tejido conjuntivo se puede clasificar segn la abundancia de los
componentes fibrosos. As, nos encontramos con el tejido conjuntivo laxo y el denso
segn si la proporcin de protenas fibrosas es baja o alta, respectivamente. Esta
diferencia en el contenido fibroso hace que estos dos tipos de tejidos presenten
propiedades muy distintas. El tejido conjuntivo laxo es ms esponjoso y elstico que
el denso, ya que las fibras del primero son ms finas que las del segundo, adems de
poseer espacios de mayor tamao que son ocupados por clulas.
El tejido conjuntivo laxo es el que envuelve a los rganos como el corazn, los
pulmones, los huesos o los riones.
El tejido conjuntivo denso rico en fibras puede ser regular o irregular segn la
orientacin de las protenas fibrosas. Ejemplos de tejido conjuntivo irregular son
las vainas de los tendones y los nervios. El tejido conjuntivo regular forma la
crnea, los tendones y los ligamentos.
Cuando el tejido conjuntivo presenta una gran proporcin de fibras elsticas se
trata de un tejido conjuntivo elstico que en realidad es un tejido conjuntivo denso
rico en elastina. Se presenta en el ligamento nucal de rumiantes, aponeurosis, paredes
de arterias y venas, trquea y bronquios, etc.
Existe otro tipo de tejido conjuntivo denominado tejido conjuntivo reticular
constituido por una compleja retcula tridimensional de fibras de colgeno y que se
encuentra normalmente alrededor de clulas adiposas y de las clulas del hgado.
96

Tejidos esquelticos. Cartlago y hueso.

Tejido cartilaginoso.
El tejido cartilaginoso (Figura 8.5) es una forma especializada de tejido
conjuntivo que consta de unas clulas especializadas denominadas condrocitos,
embebidas en una matriz endurecida tipo gel rica en sustancia fundamental. La
principal caracterstica de este medio intercelular es que carece de vasos sanguneos y
de nervios.
Los cartlagos se clasifican en hialino, elstico y fibrocartlago en funcin de
los componentes de la matriz extracelular.
Las clulas constituyentes del cartlago son los condrocitos. No obstante en el
desarrollo del cartlago podemos encontrar otras clulas. El cartlago se forma a partir
de clulas mesenquimales embrionarias que se agrupan formando poblaciones densas.
Conforme las clulas aumentan de tamao se diferencian a condroblastos que
comienzan a secretar colgeno y protenas fibrosas solubles que forman una matriz
extracelular que aumenta en proporcin en el tejido hasta separar unas clulas de
otras, quedando por tanto aisladas en zonas exentas de matriz o lagunas.
Las clulas quedan atrapadas en las lagunas donde retienen la capacidad de
divisin para uno o dos ciclos ms, de modo que pueden verse lagunas ocupadas por
1, 2 4 condrocitos, o bien lagunas que se agrupan de dos en dos, o de cuatro en
cuatro. A estos grupos se los denomina grupos isgenos. Los condrocitos se observan
como clulas de aspecto elipsoide, que se adaptan en todo momento a la morfologa
de la laguna en la que habitan.
La matriz cartilaginosa se compone principalmente (90%) de colgeno tipo II
distinto al colgeno tipo I del resto de tejidos conjuntivos. Adems de este tipo de
colgeno mayoritario, existen cantidades pequeas de colgeno tipos IX, X y XI, que
se asocian al colgeno tipo II. Esta mezcla de colgenos de diferentes tipos
proporciona la flexibilidad que posee el tejido. La compactacin de este tejido se debe
al alto contenido en glucosaminoglucanos que existe en la matriz extracelular.
La proporcin de las distintas protenas que integran la matriz extracelular da
lugar a distintos tipos de cartlago. El cartlago puede ser de tres tipos distintos:
hialino, cartlago elstico y fibrocartlago.
97
El cartlago hialino est presente en la unin del esternn a las costillas, en la
nariz y en las anillas de la trquea. Adems es el cartlago que existe en los esqueletos
sin osificar.
El cartlago elstico est presente en las orejas, paredes del conducto auditivo
externo, la trompa de Eustaquio y la epiglotis, adems de los anillos de la faringe. Los
condrocitos del tejido cartilaginoso elstico son similares a los del hialino, sin
embargo la matriz extracelular es rica en protenas elsticas con propiedades similares
a la elastina.
El fibrocartlago tiene grandes parecidos con el tejido conjuntivo
convencional ya que los condrocitos se encuentran aislados en lagunas tenues
rodeados de fibras de colgeno conjuntivo, carece de fibroblastos pero las transiciones
entre conjuntivo y fibrocartlago no muestran diferencias claras. De hecho la
localizacin del fibrocartlago se haya en las conexiones de los tendones con los
huesos. El mayor acmulo de fibrocartlago ocurre en los discos intervertebrales.


Figura 8.5. Cartlago hialino. Izquierda, visin general del cartlago de un bronquio. Derecha, detalle
que presenta las lagunas y los grupos isgenos en los que se encuentran los condrocitos


Tejido seo.
El tejido seo constituye el componente principal del esqueleto de la mayora
de los vertebrados aportando al organismo un soporte estructural de gran resistencia.
El hueso posee una gran resistencia mecnica a la traccin y a la compresin, a la vez
que posee cierta flexibilidad y sobre todo poco peso. El hueso est formado por un
tejido vivo en permanente renovacin, lo que hace posible la introduccin de prtesis
y la cicatrizacin de los huesos daados.
Existen dos variantes de tejido seo, compacto y esponjoso, que se
diferencian en la organizacin de la matriz extracelular, pero no en su composicin.
98
Las clulas propias del hueso son de 4 tipos diferentes: osteocitos,
osteoblastos, osteoclastos y clulas osteoprogenitorias. Los osteocitos se encuentran
en las lagunas existentes entre la matriz mineralizada y emiten prolongaciones a travs
de los canalculos que conectan unas osteonas con otras. Los osteoblastos son clulas
que crean matriz sea y se localizan en las superficies de los huesos, de modo que los
huesos crecen desde las superficies expuestas hacia el exterior. Estos osteoblastos
secretan los componentes orgnicos de la matriz y promueven la fijacin de minerales
para formar la fraccin inorgnica del hueso. Los osteoblastos sumergidos en la matriz
neoformada se diferencian para producir osteocitos. Los osteclastos son enormes
clulas mutinucleadas responsables de la destruccin de hueso de forma continuada.
La labor de los osteoclastos es la que permite la modificacin permanente del hueso y
la adaptacin a las nuevas condiciones y necesidades que existan. Los osteoclastos
pueden medir hasta 150 micras y poseer hasta 50 ncleos. Para que se pueda producir
la continua formacin y destruccin del hueso, y en especial la cicatrizacin de las
fracturas seas, las clulas del hueso deben ser reemplazadas por otras nuevas en
funcin de las necesidades. Esta labor la realizan las clulas osteoprogenitoras que se
dividen en respuesta a factores hormonales y se diferencian a osteoblastos y osteocitos
en base a las necesidades de generacin del hueso, los osteoclastos, por su parte,
proceden de una lnea especfica de clulas de tipo macrofgico.
La matriz sea se compone de un 35% componentes orgnicos y un 65% de
sales inorgnicas. Los componentes orgnicos del hueso son mayoritariamente
colgeno tipo I (90%) y aminoglucanos (5%), seguido de osteocalcina (2%) y
sialoprotenas (3%) que poseen fuerte unin a tomos de calcio y otros minerales. Los
componentes inorgnicos del hueso son bsicamente cristales de fosfato clcico
parecidos a la hidroxiapatita (Ca
10
[PO
4
]
6
[OH]
2
).

Estructura microscpica del tejido seo.
Cuando se examina una seccin de tejido seo al microscopio (Figura 8.6),
podemos apreciar que existen clulas distribuidas a intervalos regulares en el seno de
la matriz extracelular mineralizada. Estas clulas estn localizadas en cavidades
lenticulares o lagunas. Desde estas lagunas irradian un alto nmero de canalculos
extremadamente delgados que entran en contacto con otros conductillos similares
procedentes de otras lagunas. De esta forma, las clulas del hueso u osteocitos se
comunican unas con otras y reciben sustancias nutritivas que de otro modo no
99
conseguiran atravesar la sustancia intercelular, que a diferencia del tejido
cartilaginoso, est mineralizada. En conjunto estos canalculos hacen que se cree un
espacio contnuo que llega hasta el interior del hueso.
Los osteocitos del tejido seo compacto se organizan de tres formas posibles
diferentes: 1) formando estructuras cilndricas u osteonas que rodean un orificio
central que se conoce como canal vascular, que es el espacio por el que discurren los
capilares sanguneos oxigenando y nutriendo al hueso. 2) fragmentos angulosos de
hueso de forma y tamao irregular que se denominan sistemas instersticiales que
suponen piezas para el correcto ensamblaje entre las diferentes osteonas. 3) Alrededor
de los lmites internos y externos del hueso compacto los osteocitos forman un
cinturn de laminillas continuas que envuelven y limitan al hueso y que se denominan
laminillas circunferenciales. Envolviendo los huesos por dentro y por fuera se
encuentran vainas de tejido conjuntivo que se denominan periostio y endostio
respectivamente.
El tejido seo compacto posee una matriz extracelular que a simple vista
aparece como una estructura continua, mientras que el tejido seo esponjoso presenta
una matriz extracelular reticulada que deja gran cantidad de espacios entre la malla.
Estos tipos de tejido seo pueden coexistir en un mismo hueso. As, el tejido seo
compacto se distribuye en la periferia de los huesos mientras que el esponjoso ocupa
el interior del mismo. La retcula que existe en el tejido seo esponjoso es ocupada por
la mdula sea, que es un conjunto de tipos celulares diversos entre los que destacan
las clulas hematopoyticas de las que derivan las clulas sanguneas.




Figura 8.6. Aspecto de un corte de hueso compacto en el que se pueden observar los conductos de
Havers (izquierda). Detalle de una osteona o conducto de Havers (centro y derecha).


100

Elementos celulares de la sangre.
Tipos celulares maduros en la sangre (Figura 8.7).
Dentro de los clulas maduras que podemos encontrar en la sangre
distinguimos varios tipos. En primer lugar encontramos el tipo celular mayoritario, los
hemates, eritrocitos o glbulos rojos. Los eritrocitos humanos son clulas que
aparecen de un color naranja plido, de forma bicncava, lo que le da un aspecto de
disco con una zona plida en el centro, y anucleados. En otros organismos como las
aves, estas mismas clulas aprecen nucleadas pero su ncleo carece de actividad. En
algunos casos se pueden observar como unas clulas redondeadas rodeadas
completamente de espculas. A esta forma se la denomina clula crenada y se el
resultado de la prdida de agua por parte de la clula debido a procesos osmticos. En
procesos como la anemia falciforme los eritrocitos aparecen con estructuras extraas,
como de media luna.
El resto de clulas que se pueden observar son clulas nucleadas. Constituyen
lo que se denomina en general los leucocitos o glbulos blancos. Los leucocitos estn
formados por clulas tanto de la lnea mieloide como de la linfoide. Forman parte de
los leucocitos los linfocitos (tanto T como B y clulas NK), los granulocitos o
polimorfonucleares y los monocitos. Dentro de los granulocitos podemos distinguir
claramente los neutrfilos (forma mayoritaria), los basfilos y los eosinfilos.
Los linfocitos aparecen como la clula nucleada ms pequea, de un tamao
similar al del glbulo rojo. Son bastante abundantes en las muestras de sangre
perifrica. Aparecen prcticamente teidas por completo de azul-violeta debido a que
su ncleo (que se tie de este color) ocupa cerca de un 90% del volumen celular.
Mediante la tcnica histolgica utilizada no se puede distinguir entre los tres tipos de
linfocitos anteriormente mencionados. Para poder distinguirlos deberamos utilizar
otras tcnicas como la inmunohistoqumica que, mediante el uso de anticuerpos,
detecten especficamente protenas presentes nica y exclusivamente en cada uno de
los tipos de linfocitos indicados.
Los neutrfilos son el tipo celular de leucocito mayoritario en la sangre
perifrica constituyendo aproximadamente un 55-65% de los leucocitos. Aparecen
como unas clulas ms grandes que los eritrocitos. Su caracterstica distintiva es la
101
presencia de un ncleo lobulado donde el nmero de lobulaciones depende del tiempo
de vida del neutrfilo llegando a presentar hasta 5 lobulaciones. El citoplasma es
claramente visible y aparece de un color rosa plido con algunas granulaciones pero
difcilmente apreciables. En el caso de algunos neutrfilos procedentes de muestras
del sexo femenino aparece una prolongacin fina del ncleo denominada palillo de
tambor o corpsculo de Barr que no se presenta en el caso del sexo masculino.
Los eosinfilos como su nombre indica tienen una alta afinidad por el
colorante eosina por lo que su caracterstica esencial es la de presentar un citoplasma
lleno de grnulos de color rojizo. Son clulas de un tamao mayor que los neutrfilos.
Presentan un ncleo por lo general bilobulado.
Los basfilos son las clulas ms pequeas de los granulocitos y las menos
abundantes en el torrente sanguneo. Como su nombre indica son afines a colorantes
bsicos por lo que van a teirse fuertemente con el colorante azulado del sistema de
tincin. As, presentan una gran cantidad de grnulos azules en el citoplasma.
Presentan una gran ncleo bilobulado difcilmente observable por la gran cantidad de
grnulos teidos del mismo color que el ncleo.
Los monocitos son las clulas ms grandes dentro de los leucocitos. Su
presencia en la sangre es puramente transicional ya que su funcin es la de pasar a los
tejidos y convertirse en macrfagos. Presentan un ncleo en forma de herradura y
levemente perifrico y un citoplasma abundante de un color grisceo con punteaduras
correspondientes al alto nmero de grnulos y lisosomas.
Finalmente, otro componente de la sangre lo constituyen las plaquetas. Las
plaquetas no se pueden considerar como clulas ya que son restos de clulas llamadas
megacariocitos y que quedan residentes en la mdula sea mientras que sus
prolongaciones se rompen y pasan al torrente sanguneo constituyendo las plaquetas.
Aparecen como pequeos corpsculos de color rosceo.
102

A

B




c

D


E

f



Figura 8.7. Clulas maduras de la sangre. a) Visin general de sangre humana donde se
pueden observar los eritrocitos, un neutrfilo y dos linfocitos, b) Neutrfilos, c)
Eosinfilo, d) basfilo, e) Monocito, f) Plaquetas rodeadas por eritrocitos.

Composicin celular de la sangre perifrica.
En el ser humano, la proporcin de clulas en la sangre es de:
Glbulos rojos: 4-5 millones/mm
3
(85-95% de clulas)
Glbulos blancos: 6-9 mil clulas/mm
3
(5-15% de clulas)
Neutrfilos: 55-60% de los glbulos blancos.
Eosinfilos: 2-5% de los glbulos blancos.
Basfilos: 0-1% de glbulos blancos.
Linfocitos: 30-35% de glbulos blancos.
Monocitos: 3-7% de glbulos blancos.
Plaquetas: 0,2-0,4 millones/mm
3
.
103
45 45

Procedimiento prctico para la tincin rpida de sangre.
Procederemos, y tomando todas las precauciones necesarias, a tomar muestras
de sangre perifrica de voluntarios mediante incisin con lanceta en la yema de un
dedo. Posteriormente se realizarn frotis de esa sangre tal y como se indica en la
figura 8.8.
Tras un periodo de unos 5 min en el que la sangre se ha secado sobre el
portaobjetos procedemos a la tincin.
La tincin utilizada consiste en inmersiones rpidas en fijador, y dos
colorantes tras lo que se coloca el cubreobjetos sobre la muestra y se procede a la
observar.












Figura 8.8. Realizacin de un frotis de sangre. La gota de sangre debe depositarse en un extremo del
cubreobjetos (arriba). Por delante de la gota se coloca un cubreobjetos y se deja que la gota se extienda
por la arista que formen el cubreobjetos y el portaobjetos. Ambos deben mantenerse en un ngulo de 45
entre ellos (medio). Posteriormente se desplaza el cubreobjetos hacia delante extendiendo la gota de
sangre (abajo). La sangre quedar ms concentrada en la zona inicial del frotis mientras que aparecer
en monocapa al final del frotis.


104
Tincin, pasos:
1. Sumergir el porta en la solucin-fijadora durante 5 segundos (5 inmersiones
de 1 segundo). Dejar escurrir el exceso de fijador colocando el cubreobjetos sobre su
lado menor en vertical sobre un papel de filtro.
2. Sumergir el porta en el colorante 1 durante 5 segundos (5 inmersiones de 1
segundo). Dejar escurrir el exceso de colorante con el mismo procedimiento
anteriormente indicado.
3.- Sumergir el porta en el colorante 2 durante 5 segundos (5 inmersiones de 1
segundo). Proceder de la misma forma indicada anteriormente para eliminar el exceso
de colorante.
4.- Enjuagar el porta con agua destilada o desionizada mediante inmersin.
5. Dejar secar la muestra y proceder a su examen con microscopio Se puede
colocar un porta sobre la muestra previa introduccin de una gota de agua o de
solucin de montaje si est completamente seco.
6.- La muestra debe ser observada en aquellas zonas del frotis donde se
observa una disposicin de las clulas en monocapa y presentan una densidad celular
adecuada.
Si es necesaria una mayor tincin, se pueden aumentar el nmero de
inmersiones en los colorantes. Si se pretende una mayor tincin de los eosinfilos se
debe aumentar el nmero de inmersiones en colorante 1 (rojo) y si es de los basfilos
el colorante 2.
105

Desarrollo de la prctica.
A partir de muestras teidas de diferentes formas, el alumno deber estudiar e
identificar los tejidos epiteliales y conjuntivos. Para ello disponemos de muestras de
traquea (epitelio respiratorio), esfago (epitelio digestivo y lmina basal), estmago
(epitelio digestivo y lmina basal), intestino delgado y grueso (epitelio digestivo y
lmina basal), rin (epitelio cbico), pulmn (epitelio plano) y piel (plano
estratificado y tejido conjuntivo denso, dermis), glndulas (hgado), y tejido
conjuntivo esqueltico como cartlago y hueso. Y de muestras de sangre perifrica
humana y de reptil para realizar un estudio comparativo de ellas.
Con la ayuda de la explicacin terica precedente a la prctica y con la ayuda
de Atlas de Histologa disponibles en el laboratorio el alumno deber tomar tantas
notas como le sean necesarias para poder identificar los tejidos epiteliares y
conjuntivos y clulas de la sangre presentes en las muestras.

106



107


PRCTICA 9
OBSERVACIN DE TEJIDOS ANIMALES (2).
TEJIDOS MUSCULARES Y TEJIDO NERVIOSO.

Introduccin.
Como continuacin a la prctica 8 procedemos a culminar la observacin de
los diferentes tejidos que conforman las diferentes estructuras de los organismos. En
esta prctica procedemos a estudiar los tejidos conjuntivos y el tejido nervioso.

Tejido muscular.
El tejido muscular es el responsable de los movimientos corporales o de los
movimientos de ciertos orgnulos como los del tubo digestivo durante el proceso de
digestin. Estos movimiento se deben a la presencia de un aparato contrctil en el que
intervienen de forma principal las protenas actina y miosina.

Dentro de los msculos encontramos tres tipos:

Tejido muscular liso.
El tejido muscular liso (Figuras 9.1 y 9.2) est formado por clulas alargadas
en forma de huso y un ncleo en posicin central. Se encuentra en las paredes de
rganos y tubos sanguneos. Sus movimientos son involuntarios y, por lo tanto,
controlados por el sistema nervioso autnomo. Las clulas estn muy unidas entre s y
difcilmente se observan las uniones entre ellas. En tinciones de hematoxilina-eosina,
suele observarse al microscopio como un tejido bastante homogneo donde el
sarcoplasma (citoplasma en clulas musculares) aparece de un color rojo ms o menos
intenso y de aspecto homogneo mientras que el ncleo aparece centrado dentro de la
clula.

108


Figura 9.1. Tejido muscular liso. Los puntos
oscuros de color azulado corresponden a los
ncleos que se disponen en el interior de unas
clulas ahusadas e ntimamente unidas unas a las
otras dando aspecto de un tejido compacto.
Figura 9.2. Tejido muscular liso (detalle). Se
pueden observar claramente los ncleos (azul) e
incluso la individualidad de las clulas.

Tejido muscular esqueltico.
El tejido muscular esqueltico (Figuras 9.3 y 9.4) est formado por clulas
muy alargadas en las que encontramos una gran cantidad de ncleos tambin de forma
alargada y perifricos procedentes de la fusin de mioblastos o clulas precursoras de
la fibra muscular. Por lo tanto, las clulas musculares esquelticas constituyen un
sincitio. Se denomina igualmente msculo estriado debido a la presencia de estras
transversales resultado de la presencia de sarcmeras. Las sarcmeras estn formadas
por citoesqueleto de actina organizado en compactos haces de actina entre los que se
disponen varillas bipolares de miosina y que constituyen el mecanismo de la
contraccin muscular. Este msculo es voluntario por lo que est inervado por el
sistema nervioso voluntario.



Figura 9.3 Tejido muscular esqueltico. Los
puntos oscuros de color azulado corresponden a
los ncleos. Ntese la disposicin alineada a lo
largo de las fibras.
Figura 9.4. Tejido muscular esqueltico
(detalle). Se puede observar la estriacin
caracterstica de las sarcmeras. Ntese la
disposicin perifrica de los ncleos.

109
Tejido muscular cardiaco.
El tejido muscular cardiaco est formado por clulas individualizadas que
presentan un ncleo central al igual que lo tenan las del msculo liso pero con
estriacin y organizacin interna en forma de sarcmeras semejante a la que presenta
el msculo esqueltico. Las clulas se unen entre s por medio de discos intercalares.
Est inervado por el sistema nervioso involuntario.


Figura 9.5. Msculo cardiaco. Ntese la disposicin ms central de los ncleos y la ausencia de fibras
tan patentes como las que se observaban en el tejido muscular esqueltico. El detalle (derecha) permite
observar las separaciones entre las clulas formadoras de la fibra muscular cardiaca.

Tejido nervioso.
La funcin del tejido nervioso es la de la comunicacin entre clulas. Se
encarga de recibir informacin tanto del exterior como del interior del organismo,
procesar y enviar la respuesta a los rganos correspondientes. Por lo tanto presenta
dos capacidades importantes, la excitabilidad y la conductividad.
Podemos distinguir entre el sistema nervioso central (formado por el encfalo
y la mdula espinal) y el sistema nervioso perifrico (formado por todo el tejido
nervioso situado fuera de los dos rganos anteriormente indicados).
Para el estudio histolgico del sistema nervioso se utiliza mayormente el
sistema nervioso central ya que verdaderamente es el que muestra una estructura
tisular definida mientras que el sistema nervioso perifrico est formado por finas
fibras nerviosas (nervios) y por algunos acmulos de clulas nerviosas (neuronas).
En estos rganos se distinguen claramente dos regiones: la sustancia gris y la
sustancia blanca. Esta separacin se debe a la proporcin de cuerpos celulares frente
a prolongaciones axonales revestidas de mielina. As, la sustancia gris est formada
110
por una alta proporcin de cuerpos celulares de neuronas y gla mientras que la
sustancia blanca lo est por prolongaciones axonales.

Tipos celulares del tejido nervioso.
La clula principal del tejido nervioso es la neurona. Normalmente es una
clula grande de forma muy compleja en la que se puede ver un ncleo centrado en el
cuerpo celular del que se emiten prolongaciones muy ramificadas (dendritas) hacia
un polo celular mientras que hacia el opuesto se emite una larga prolongacin (axn).
La forma de estas clulas es enormemente variada dependiendo de la funcin y de la
localizacin de la neurona.
Segn el nmero de prolongaciones de las neuronas (Figura 9.6) tenemos
neuronas unipolares (con una nica prolongacin), neuronas bipolares (con dos
prolongaciones), neuronas multipolares (con un nmero alto de prolongaciones), y
neuronas pseudounipolares (donde el del cuerpo celular redondeado parte una sola
prolongacin que se bifurca en dos en forma de T).


Figura 9.6.Tipos neuronales dependiendo del nmero de prolongaciones.

Segn la longitud del axn distinguimos neuronas de Golgi tipo I (de axn
largo) y neuronas de Golgi tipo II (de axn corto). Las primeras emiten axones desde
el sistema nervioso central a los rganos perifricos, las segundas suelen encontrarse
dentro del sistema nervioso central.
111
El ncleo de la neurona es grande, ligeramente ovoide y normalmente
localizado en el centro del cuerpo celular o pericarion. Suelen aparecer plidos en los
cortes teidos con colorantes bsicos debido a la homognea dispersin de la
cromatina. Tienen orgnulos dispersos por todo el pericarion y son muy ricas en
citoesqueleto, especialmente de tubulina. En las neuronas teidas con colorantes
bsicos suelen aparecer orgnulos fuertemente teidos en el citoplasma que se
denominan Cuerpos de Nissl. Los cuerpos de Nissl estn formados por cisternas de
retculo endoplsmico rugoso dispuestas en paralelo y muy ricas en ribosomas.

Figura 9.7. Diferentes muestras de tejido nervioso. Arriba a la izquierda, tincin de hematoxilina-
eosina de cerebro donde se pueden observar las distintas densidades y capas delimitadas por la cantidad
de cuerpos neuronales. Arriba a la derecha, delimitacin de la sustancia blanca (hacia la izquierda) y la
sustancia gris (hacia la derecha). Abajo izquierda, detalle de diferentes neuronas en una tincin de plata
donde se pueden observar claramente los axones y los cuerpos celulares. Abajo derecha, detalle de un
soma neuronal.

En los tejidos nerviosos encontramos tambin otros tipos celulares
encuadrados dentro del nombre gentico de neurogla. La neurogla o clulas gliales
incluye los astrocitos, oligodendrocitos, microgla y las clulas ependimrias.
Los astrocitos son clulas en forma de estrella que establecen contacto con
vasos sanguneos a travs de los pies perivasculares. Intervienen en la cohesin del
112
sistema nervioso central. Se distinguen astrocitos protoplsmicos, ms grandes y
localizados preferentemente en la sustancia gris, y los astrocitos fibrosos, delgados y
con grandes expansiones localizados con preferencia en la sustancia blanca.
Los oligodrendrocitos son clulas emparentadas con los astrocitos pero de
tamao menor, con ncleos de menor tamao y con prolongaciones escasas, delgadas
y poco ramificadas. Su funcin es la de formar las vainas de mielina que envuelven a
las fibras nerviosas (clulas de Schwann).
La microgla est formada por un conjunto de clulas de tamao pequeo que
presentan un ncleo oscuro y prolongaciones finas en forma de espinas cortas y
retorcidas. Estn distribuidas por todo el sistema nervioso central. Su funcin es la de
eliminar mediante fagocitosis clulas muertas del sistema nervioso por lo que se las
denomina macrfagos cerebrales.
Las clulas ependimrias o ependimocitos son las clulas del epitelio que
rodea la superficie interna de los ventrculos cerebrales y el conducto central de la
mdula espinal. Estas clulas son tpicas clulas epiteliales de forma cbica aunque en
algunas regiones presentan caractersticas especiales como prolongaciones largas
hacia el interior del tejido nervioso subyacente similares a los de los astrocitos. Las
clulas con estas prolongaciones reciben el nombre de tanicitos.



La observacin de las diferentes clulas del tejido nervioso es compleja debido
a la ntima interaccin que se produce entre ellas. Por ello, cuando se estudia el tejido
nervioso de los rganos del sistema nervioso central conviene partir de observaciones
a bajos aumentos para ir delimitando las diferentes capas y posteriormente ir haciendo
un estudio exhaustivo de las diferentes capas. Como muestra podemos observar las
figuras 9.7 y 9.8







113


Corte de cerebelo. Obsrvese la diferenciacin del
tejido en la capa granular (G) y la capa molecular
(exterior) o la corteza (zona clara exterior a G). P
indica las clulas de Purkinje
Corte de cerebelo a ms detalle donde se pueden
distinguir claramente la zona granular (G)
formada por gran cantidad de cuerpos celulares y
la corteza formada por las dendritas de las clulas
de Purkinje (P) y cuerpos neuronales.



Clulas de Purkinje. Tincin de plata. Obsrvese
la gran cantidad de prolongaciones dendrticas que
se internan en la zona de la corteza.
Clulas de Purkinje. Tincin de plata. Obsrvese
el enorme arbol dendrtico y el gran cuerpo celular
ovalado.

Figura 9.8. Estudio histolgico del cerebelo a diferentes aumentos: x100 (arriba a la izquierda), x200
(arriba a la derecha), x400 (abajo a la izquierda) x 600 (abajo a la izquierda)

Desarrollo de la prctica.
A partir de muestras teidas de diferentes formas, el alumno deber estudiar e
identificar los diferentes tejidos musculares y el estudio del tejido nervioso. Para ello
disponemos de muestras de esfago (msculo liso), estmago (msculo liso), intestino
delgado y grueso (msculo liso), msculo esqueltico y corazn (msculo cardiaco)
adems de diferentes partes del sistema nervioso central (tejido nervioso): cerebro,
cerebelo y mdula espinal.
Con la ayuda de la explicacin terica precedente a la prctica y con la ayuda
de Atlas de Histologa disponibles en el laboratorio el alumno deber tomar tantas
notas como le sean necesarias para poder identificar los tejidos musculares y las
caractersticas del sistema nervioso.

114
115

BIBLIOGRAFA

LIBROS:
Boya Vegue, J. Atlas de Histologa y Organografa Microscpica. Editorial
Panamericana. 1999
Bradbury, S. and Bracegirdle, B. Introduction to light microscopy. Bios scientific
publishers limited. 1998
Bancroft JD and Gamble M. Theory and practice of histological techniques. Fifth
edition. Churchill Livingstone 2002.
Fawcett, D.W. Tratado de histologa. McGraw-Hill/Interamericana, 1995.
Fawcett, D.W. Tratado de histologa. McGraw-Hill/Interamericana, 2000.
Fawcett, D.W. Compendio de histologa. McGraw-Hill/Interamericana, 1994.
Garca del Moral, R. Laboratorio de anatoma patolgica. McGraw-
Hill/Interamericana, 1993.
Geneser, F. Histologa. Editorial Panamericana, 1994.
Geneser, F. Histologa: sobre bases biomoleculares. Editorial Panamericana, 2000.
Geneser, F. Histologa: sobre bases biomoleculares (CD-ROM). Editorial
Panamericana, 2000.
Paniagua, R. Citologa e histologa vegetal y animal. McGraw-Hill/Interamericana.
1997.

PGINAS WEB.
En las siguientes pginas se pueden obtener importantes informaciones sobre el
procesamiento de muestras histolgicas as como informacin sobre tcnicas, tejidos,
etc.
http://web.usal.es/
~
eliseo/histotec/histotel.htm
Interesante pgina web sobre tcnicas y tinciones histolgicas.
http://casweb.cas.on.edu/pbell/Histology/histo.home.html
Completa direccin sobre tcnicas histolgicas y estudios de tejidos.
http://www3.usal.es/~histologia
Pgina web de la Universidad de Salamanca donde se pueden apreciar
interesantes pginas sobre histologa y tinciones y diversas tcnicas.

116




117

NORMATIVA DE LAS PRCTICAS.
1.- La asistencia a las prcticas es obligatoria. Si bien la existencia de un examen
prctico puede permitir la ausencia a una prctica siempre que est justificada. Se
controlar la asistencia mediante la firma del alumno en un cuadrante en cada sesin
prctica.
2.- El cambio de grupo de prcticas no se permitir a no ser que se realice por
intercambio con otro alumno/a o bajo casos excepcionales.
3.- El uso de la bata es obligatorio en todas las sesiones prcticas. No se permitir el
acceso al laboratorio si no se dispone de dicha bata.
4.- El alumno debe hacer un uso adecuado del material de prcticas puesto a su
disposicin y, as mismo, es responsable de dejar su lugar de trabajo correctamente
ordenado una vez terminada la prctica.
5.- El alumno deber entregar a final del curso una memoria de las prcticas realizadas
que ser tenida en cuenta a la hora de la evaluacin en casos de duda y siempre de
forma positiva. La memoria consistir en la resolucin de las cuestiones propuestas al
final de este cuaderno y presentadas de forma adecuada y ordenada.
6.- Al final del periodo lectivo se proceder a una sesin adicional prctica en la que
se expondrn los seminarios voluntarios en la que rige la misma norma de asistencia
obligatoria para todos los alumnos de la sesin prctica.
7.- La parte prctica de la asignatura ser superada mediante la celebracin de un
examen prctico que se valorar sobre un total de 20 puntos y se considerar aprobado
cuando se alcance un mnimo de 10 puntos. El examen prctico se celebrar
coincidiendo con el segundo parcial de teora (primera oportunidad) y con el final de
la asignatura para aquellos que no lo hubiesen superado.
8.- La nota de prcticas corresponder a un 25% de la nota final de la asignatura.
9.- La nota de los seminarios se adicionar a la nota final de la asignatura.


118


119




CUADERNO DE
PRACTICAS

BIOLOGA

cuestionario


Curso 2004-05






rea de Biologa Celular
120


121



PRACTICA 1
MICROSCOPA PTICA (I): FUNDAMENTOS Y UTILIZACIN
DEL MICROSCOPIO PTICO.

Cuestiones.
1.- De qu manera se calcula el aumento total de un microscopio?
2.- Calcule el tamao real de una clula cuyo tamao aparente al microscopio ptico
con un objetivo de x40 y un ocular x10 es de 0,75 mm.
3.- Teniendo en cuenta la figura 1.6 indicar las diferentes partes de que consta un
microscopio ptico.
4.- Qu papel tienen el filtro el diafragma y el condensador en la iluminacin?
5.- Describa brevemente utilizando un ejemplo las diferencias existentes entre
aumento y resolucin. Segn su descripcin, tiene la imagen de un tejido
obtenida con un objetivo x40 y aumentada 100 veces la misma resolucin que una
imagen obtenida con un objetivo x100 y aumentada 4 veces?
6.- Se han obtenidos imgenes de una determinada muestra con microscopios que
utilizan filtros de luz monocromtica de longitudes de onda diferentes: 425 y 550
nm. Indique razonadamente y aplicando la frmula adecuada qu objetivo ofrecer
una mayor resolucin.
7.- La observacin de estructuras subcelulares al microscopio ptico es prcticamente
imposible a no ser que la estructura sea muy grande. Indique qu tcnicas y
microscopio utilizara para observar estructuras como la mitocondria, el aparato de
Golgi o el citoesqueleto celular utilizando microscopa ptica.
8.- Utilizando lentes objetivo de diferentes aumentos realice un esquema de lo que
observa centrndose en un campo centrado a bajos aumentos e incrementndolos
paso a paso.
9.- En el caso de que disponga de muestra de agua estancada, realice un estudio de los
organismos que observa en la muestra de agua estancada ilustrndolos con
pequeos esquemas.
122


PRCTICA 2.
MICROSCOPA PTICA (2): PROCESADO DE LA MUESTRA
BIOLGICA PARA SU OBSERVACIN.

Cuestiones.
1.- Se pretende realizar un anlisis histolgico de un determinado tejido en el que se
desea preservar lo mejor posible los siguientes componentes celulares: a)
estructura y antigenicidad; b) antigenicidad; c) cromatina. Qu tipo o tipos de
fijadores utilizara? Cules no utilizara? Razone la respuesta.
2.- En un determinado tejido se necesita realizar una tincin en la que se diferencien
claramente las clulas de los componentes de la matriz extracelular. De los
colorantes mencionados durante esta prctica, cules utilizara? Porqu? Se
trata de una tincin general o especfica? Razone la respuesta.
3.- Se han obtenido muestras de peces aparecidos muertos en diferentes
circunstancias: a) el 24 de agosto en el ro Guadalquivir; b) el 13 de enero en un
afluente del tramo superior del Ebro, con qu espcimen podra usted obtener
mejores muestras para su estudio histolgico?. Razone la respuesta.
4.- Una vez obtenido el corte de un tejido, cul es el fundamento de la hidratacin
inicial y la deshidratacin final en el proceso de tincin? Se debera proceder de
la misma forma para cualquier tipo de montaje?
5.- Realice un esquema donde comente brevemente los diferentes pasos que seguira
para obtener una tincin de hgado procedente de un animal tomado como muestra
para el estudio de la hepatotoxicidad de un nuevo compuesto.



123


PRCTICA 3
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO.
ANLISIS DE MICROGRAFAS ELECTRNICAS.

Cuestiones.
1.- Porqu se obtiene una mayor resolucin al microscopio electrnico que al
ptico?.
2.- Indique porqu las resinas utilizadas en el procesamiento de la muestra para el
microscopio electrnico deben ser ms duras que la parafina utilizada en el
microscopio ptico.
3.- Realice un estudio comparativo entre los elementos de un microscopio ptico y de
un microscopio electrnico indicando el paralelismo de sus funciones.
4.- Realice un estudio comparativo entre un MET y un MEB indicando sus similitudes
y sus diferencias.
5.- Realice un estudio comparativo de las clulas nmero 1 y 12 del cuaderno de
imgenes MET (Ver anexo I). Ambas clulas proceden de los rganos endocrinos
de dos animales en estudio en los que se han encontrado diferencias en el proceso
de secrecin. Indique las peculiaridades de cada una de ellas.
6.- Analice conjuntamente las imgenes 3 y 17 del mismo cuaderno (Ver anexo I) y
establezca las diferencias y similitudes entre estos dos tipos celulares. Indique, si
le es posible, su posible funcionalidad.


124



PRCTICA 4
UTILIZACIN DE CURVAS PATRN.
OBTENCIN DE CURVA PATRN PARA DETERMINACIN
DE PROTENAS (MTODO BRADFORD).

Cuestiones.
1.- Realice una curva patrn de cada una de las protenas utilizadas como referencia:
BSA e IgG. Calcule en cada uno de los casos la recta de regresin que relacione la
absorbancia con la cantidad de protena presente en la muestra.
2.- Cul cree usted que es la mejor protena de referencia teniendo en cuenta los
resultados obtenidos de la recta de regresin?
3.- Utilizando los resultados obtenidos en el punto 1, calcule la cantidad de protena de
una muestra problema que presente una densidad ptica utilizando el mtodo de
Bradford de 0,45 habiendo utilizado para ello 10 l de muestra.
4.- Qu concentracin tendra esta misma muestra si hubiese sido diluida
previamente 10 veces y se hubiesen adicionado 5 l para realizar el ensayo?.



125


PRCTICA 5
FRACCIONAMIENTO CELULAR.
DETERMINACIN DE ACTIVIDADES CELULARES:
MITOCONDRIA.
Cuestiones.
1.- Esquematice un posible proceso de fraccionado celular para la obtencin de
mitocondria, retculo endoplsmico rugoso, retculo liso y citosol partiendo de un
mismo homogenado celular.
2.- Teniendo en cuenta los conocimientos que posee sobre protenas celulares,
relacione las siguientes protenas con el orgnulo que aislara en el caso de querer
estudiar su actividad: bomba de sodio-potasio, oligosacaridil-transferasa, N-acetil-
glucosamina fosfotransferasa, hidroxilasa cida, ADN polimerasa, hexoquinasa.
3.- Calcule con los resultados obtenidos durante la medicin de actividad por el
espectrofotmetro, la actividad mitocondrial representndola como actividad total
y actividad especfica referida a cantidad de protena (mg). Para ello tenga en
cuenta la actividad inespecfica de la muestra.
4.- En el caso del punto anterior, indique el porcentaje de inhibicin obtenido con los
correspondientes inhibidores para el complejo I y el complejo II mitocondrial.
5.- Conteste a las siguientes preguntas: Qu esperara observar si se hubiese utilizado
en los ensayos estigmatelina o antimicina A, inhibidores especficos del complejo
III mitocondrial? Qu esperara observar si no hubiesemos utilizado KCN en la
mezcla de reaccin?



126


PRCTICA 6

ESTUDIO DE LA MITOSIS

Cuestiones.
1.- Esquematice el procedimiento seguido para realizar la tincin de Feulgen.
2.- Calcule la dilucin que se ha de realizar para obtener una solucin de 500 ml de
HCl 5N partiendo de una solucin comercial al 33% de HCl en agua con una
densidad de 1,19 g/l.
3.- Observando las muestras, esquematice cul es el aspecto que presentan las clulas
meristemticas en cada una de las fases del ciclo celular incluyendo las distintas
fases de la mitosis.
4.- A partir de los datos obtenidos, realice un breve informe cientfico sobre el efecto
de los distintos tratamientos a los que se han sometido los bulbos de cebolla sobre
la divisin celular. Represente los resultados obtenidos de la forma ms clara
posible.



127


PRCTICA 7

TEJIDOS VEGETALES. TINCIN Y ESTUDIO HISTOLGICO
DE TEJIDOS VEGETALES.



Cuestiones.
1.- Realice un esquema del procedimiento seguido para obtener la tincin de muestra
vegetal.
2.- Dentro de los rganos vegetales existen variadas organizaciones en las que los
tejidos vasculares se organizan y que son visibles especialmente en races y tallos.
Estudie detenidamente varias de las muestras disponibles de tallo y raiz y realice
un esquema de estas organizaciones de haces vasculares. Comntelos lo ms
completamente posible.
3.- A partir de varios cortes de raz, esquematice y describa las diferentes capas y los
diferentes tejidos que observe.
4.- Realice un estudio comparativo entre la raz y el tallo de una misma planta
comentndolo de la forma ms completa posible.
5.- Esquematice un corte de hoja y describa los diferentes tejidos que en ella observe.
6.- Realice un estudio comparativo de tres de las muestras de hoja disponibles.


128


PRCTICA 8.
OBSERVACIN DE TEJIDOS ANIMALES (1).
ESTUDIO HISTOLGICO DE EPITELIOS Y TEJIDO
CONJUNTIVO Y ELEMENTOS CELULARES DE LA SANGRE.


Cuestiones.
1.- Con la informacin de que dispone, realice un esquema general de los diferentes
tipos de epitelios segn el tipo y el nmero de clulas.
2.- En la muestra en la que aparece el esfago tambin aparece la trquea. Estudie las
dos muestras y realice un esquema de ambos rganos. Indique las particularidades
del epitelio respiratorio de la trquea y del epitelio del esfago.
3.- Dispone usted de mltiples ejemplos tejido conjuntivo sobre el que se asientan los
epitelios. Observe el tejido del intestino y realice un esquema indicando las
estructuras que observa en el tejido conjuntivo asociado al tubo digestivo a nivel
del intestino.
4.- Dispone usted de muestra de piel. Estudie la interaccin entre la epidermis y el
tejido conjuntivo subyacente. Estudie las estructuras presentes en la dermis (tejido
conjuntivo).
5.- Diferencie el tejido adiposo blanco del pardo mediante observacin de las muestras
histolgicas. Haga un pequeo esquema y comntelo.
6.- Dispone usted de tejido seo y cartilaginoso (trquea y oreja). Realice un esquema
de ellos y comente sus similitudes y diferencias. Estudie y realice un esquema ms
preciso de un grupo isgeno en el cartlago y de una osteona en el hueso.
7.- Realice un esquema de cada uno de los tipos celulares observables en la muestra.




129


PRCTICA 9
OBSERVACIN DE TEJIDOS ANIMALES (2).
TEJIDO MUSCULAR Y TEJIDO NERVIOSO.


Cuestiones.
1.- Dispone usted de muestras en las que se observa msculo esqueltico, cardiaco y
msculo liso. Haga un dibujo de cada uno y comente sus diferencias esenciales.
Intente establecer una relacin entre su morfologa y la funcin que cumplen estos
tipos de msculo.
2.- Finalmente estudiamos el tejido nervioso. Estudie muestras de tejido de cerebro,
cerebelo y mdula espinal. Esquematice e indique la presencia de la sustancia gris
y la blanca en cerebelo y la mdula espinal.
3.- Estudie la estructura del cerebelo e indique las particularidades que en ella
encuentra mediante esquemas a diferentes aumentos.
4.- Realice el mismo estudio con la muestra de mdula espinal.

130





131










ANEXO I

IMGENES PRCTICA NMERO 3

132


Imagen 1

133

Imagen 12
134


Imagen 3


135




Imagen 17

136



137









ANEXO II

MODELO DE EXAMEN DE PRCTICAS

138




139






1.- (10 puntos) Test:

Responda mediante una cruz en la plantilla que se encuentra al final la opcin vlida
en cada una de las siguientes cuestiones. Recuerde, en cada uno de los casos slo hay
una respuesta posible.

1.- Los fijadores deben esencialmente:
a) Permitir una buena tincin.
b) Preservar la estructura del tejido.
c) Mantener el tejido hidratado.
d) Evitar la descomposicin del tejido.

2.- La hidratacin de una muestra ya cortada se realiza para:
a) Fijarla.
b) Teirla.
c) Montarla.
d) Incluirla.

3.- En microscopa qu relacin existe entre el aumento y la resolucin?:
a) No existe relacin.
b) A mayor aumento, mayor resolucin.
c) A menor resolucin, mayor aumento.
d) A mayor resolucin, menor aumento.

4.- La apertura numrica de los microscopios pticos:
a) Es un nmero que indica los aumentos.
b) Indica la distancia a la que debe colocarse el condensador.
c) Es un parmetro relacionado con la resolucin.
d) Depende del tipo de ocular.

5.- El microscopio electrnico de barrido:
a) Requiere de finos cortes para que la muestra pueda observarse.
b) Presenta una pantalla fluorescente para la observacin de la imagen.
c) Requiere de muestras procesadas de forma similar a la del microscopio
ptico.
d) Presenta el objeto en tres dimensiones en una pantalla de televisin.

6.- La tincin de Feulgen:
a) Es una tincin especfica de tejido nervioso.
b) Se utiliza para observar ncleos y cromosomas.
LICENCIATURA DE CIENCIAS AMBIENTALES

ASIGNATURA: BIOLOGA

EXAMEN PRCTICO.
Mircoles, 3 de septiembre de 2003.

CURSO 2002/03 GRUPO:

APELLIDOS: NOMBRE:
140
c) Se trata de una tincin general.
d) Tie especficamente la mitocondria.

7.- Para la observacin de las clulas de tejido nervioso:
a) Utilizara una tincin general de tipo de hematoxilina-eosina.
b) Requiere de una tincin especial de matriz extracelular.
c) La tincin de plata permite distinguir claramente a las clulas nerviosas.
d) Se utiliza un sistema de contrasta ncleo-citoplasma.

8.- Las tinciones vitales:
a) Requieren de un procesamiento similar a la de la tincin de cualquier tejido
para el microscopio ptico.
b) Necesitan de compuestos que se unan a protenas fijadas.
c) La tincin depende de actividades celulares para que se produzcan.
d) Slo sirven para organismos microscpicos como las bacterias.

9.- En la tincin de sangre humana:
a) Se observan los ncleos de los eritrocitos.
b) El ncleo de los leucocitos aparece de color rojo y el citoplasma azulado.
c) Se utiliza una tincin de tipo general que contrasta ncleos y citoplasmas.
d) Los basfilos son los leucocitos ms comunes.

10.- Los microscopios electrnicos:
a) Se basan en la utilizacin de luz lser.
b) Requieren de muestras vivas.
c) Necesitan de un tubo completamente al vaco.
d) Utilizan un gas inerte para evitar que el haz de electrones se disperse.

RESPUESTAS


a b c d
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
141

2.- (5 puntos) Pregunta larga:

Esquematice de la forma ms completa el paralelismo entre el microscopio ptico y el
microscopio electrnico de transmisin. Comente brevemente algunas de las partes
esenciales de ambos.




142

3.- (5 puntos) Anlisis de micrografas:

Las siguientes imgenes corresponden a clulas observadas al microscopio electrnico
(A) y al microscopio ptico (B). En el caso de la muestra A comente brevemente pero
lo ms detalladamente posible las estructuras subcelulares que se observan en estas
clulas y determine la funcin que tienen estas clulas a partir de la informacin de
stas estructuras al igual que otras posibles estructuras que cabra esperar encontrar y
en el caso B comente los tejidos que observa en la figura e indique qu tipo de
estructura orgnica cree que es.
Puede anotar indicaciones en cada una de las micrografas que ayuden a su
descripcin.

A
143


B












144





145