Arseniato Resistente coffeae Penicillium: Un Hongo Potencial

para la biorremediacin de suelos

Resumen La biorremediacin es un mtodo eficaz para la tratamiento de sitios de metal
contaminados principales. Los hongos fueron aislado a partir de muestras de suelo
recolectadas en diferentes arseniato reas contaminadas en toda la India. Un aislado,
Penicillium coffeae, mostr resistencia a arseniato de hasta 500 mM. Los resultados indicaron
que el pretratamiento de biomasa con lcali (NaOH) mejora el porcentaje de adsorcin a
66,8% en comparacin con la de la biomasa muerta en vivo y sin tratar cuya adsorcin fue de
22,9% y 60,2% respectivamente. Los parmetros fisiolgicos evaluados en este estudio puede
ayudar a los estudios experimentales destinados a la biorremediacin de arseniato efluentes
contaminados utilizando hongos resistentes arseniato P. coffeae.

Keywords Bioremediation Heavy metal Arsenate Biosorption Dead biomass

El aumento de la industrializacin y las actividades humanas introducen productos qumicos
txicos nuevos en el medio ambiente que perturban los ciclos biogeoqumicos naturales (Alluri
et al. 2007) en el medio ambiente. Los metales pesados son de importante de salud pblica
preocupacin (Wei et al. 2010) ya que se liberan en el desempeo de los efluentes por un
nmero de procesos industriales tales como galvanoplastia, bronceado, procesamiento de
pulpa y de acero fabricacin. Los metales pesados incluyen arseniato de plomo, mercurio,
silicio, cromo y cobre. Arseniato se produce naturalmente en una amplia variedad de
minerales.
El uso generalizado de arseniato en las industrias de fundicin de cobre, actividades
metalrgicas , los pigmentos y los insecticidas son las principales fuentes de arseniato en el
suelo y las aguas naturales ( Maheswari y Murugesan 2011 ) . Las personas afectadas con
arseniato muestran sntomas tales como eczema de la piel/membrana mucosa ,
hiperqueratosis de las palmas y plantas , verrugas, encefalopata , neuropata , trastornos
cardiovasculares, problemas respiratorios , leucemia, cnceres ( Al- Sabbaket al . 2012). La
eliminacin de arseniato de los efluentes es muy importante teniendo en cuenta el medio
ambiente , econmico y problemas de salud que pueden representar . Varios qumicos y
mtodos fsicos se han ideado y empleado para la eliminacin de metales pesados tales como
el intercambio inico , precipitacin , la evaporacin , la smosis inversa , la sorcin . reciente
desarrollo de la biotecnologa ha establecido muchos posibles mtodos de remediacin como
biosorcin utilizando microorganismos como hongos , algas y bacterias ( Bishnoi y Garima 2005
) . Un proceso de biosorcin tiene muchas ventajas sobre los procesos convencionales de
metales pesados expulsin, como el bajo costo, alta eficiencia, menos energa el consumo, la
reduccin al mnimo de los lodos txicos , sin costo adicional requerimiento de nutrientes ,
regeneracin de bioadsorbente y posibilidad de recuperacin de metal ( Ahalya et al . 2007 ) .
Debido a su inters presencia ubicua , los hongos han provocado en su uso para eliminar los
metales pesados en el medio natural ( Bishnoi y Garima 2005 ) . Tanto biolgicamente activos
e inactivos biomasa de hongos tienen la capacidad para adsorber iones metlicos ( Yan y
Viraraghavan 2000 ) . Los hongos pueden solubilizar por lo tanto , transformar y la absorcin
de las especies metlicas ( Sulaymon et al. 2013 ) . El estudio muestra la capacidad de una cepa
fngica , Coffeae Penicillium , aislado de arseniato contaminados ambientes y su uso potencial
en la biosorcin de arseniato
Adems, los parmetros crticos que influyen biosorcin de arseniato por P. coffeae tales como
, temperatura, pH , biomasa , el pretratamiento con lcali tambin han sido dilucidado.


Materiales y Mtodos
Un centenar de muestras de suelo fueron colectadas de diferentes arseniato de zonas
contaminadas en toda la India . Estas muestras de suelo fueron seleccionados en agar papa
dextrosa (PDA ) medio modificado con arseniato 2 mM para el aislamiento inicial de hongos
resistentes arseniato. Los hongos fueron aisladas de diferentes muestras de suelo por serie
dilucin y la tcnica de extensin en placa estndar. Las placas se incubaron a 28 C durante 6
das . El crecimiento fngico en la placas segn lo determinado por la observacin visual de la
colonia El tamao fue evaluado para tener al menos una baja tolerancia a nivel arseniato . La
identificacin de los hongos se realiz por una combinacin de visualizar la morfologa de la
colonia y el examen microscpico. Aislados fngicos se mantuvieron en tubos inclinados PDA
como cultivos puros ( Maheswari y Murugesan 2011 ). Identificacin del aislado fngico
elegido para el estudio adicional era confirmado por la secuenciacin de genes que codifican
para ARN ribosmico como se describe a continuacin .

El cultivo de hongos se cultiv en AP durante 7 das. La micelio se recogi y se liofiliz . El
liofilizado micelio se pulveriz y se aadi tampn lL 500 TE [ Tris 100 mM (pH 8,0 ), EDTA 10
mM , SDS al 2% ] , 50-100 LG de proteinasa K y se incubaron durante 30-60 min a
55-60 C. La concentracin de sal se ajust a 1,4 M con 5 M NaCl ( 140 LL) y el volumen de
1/10th de un 10% CTAB , se incubaron durante 30 min a 0 C. La mezcla de reaccin
se centrifug durante 10 min a 10.000 rpm . El sobrenadante se precipit con acetato de
amonio seguido de 0,55 volumen de isopropanol , se centrifug durante 10 min a 10.000 rpm (
Moller et al . 1992 ) . El sedimento se lav dos veces con etanol fro al 70 % , se sec al aire y se
resuspendi en 50 lL de RNasa libre de agua . Electroforesis en gel de agarosa se realiz para
confirmar la presencia de ADN . El aislado ADN genmico se someti a Cadena de la
Polimerasa
Reaccin ( PCR ) ( Lewis et al . 2010 ) usando ITS1 como hacia adelante cebador y ITS4 cebador
como inversa ( Kendall y Pablo 2005 ) . El producto de PCR purificado se secuenci por el Ciclo
de secuenciacin kit Tinte Desoxi Terminator ( Qiagen Inc ) . La secuencia obtenida se compila
y se compara con la secuencia de datos disponible de Gen Bank en Nacional Centro de
Informacin sobre Biotecnologa ( NCBI ) , Estados Unidos de Amrica
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ) .
El anlisis filogentico se realiz utilizando el programa MEGA rbol 4 y el consenso fue
construido ( Tamura et al. 2007 ) .

El arseniato (2 mM) cepas tolerantes seleccionadas despus de la aislamiento preliminar se
rastrearon ms de alta arseniato la tolerancia mediante la inoculacin en las placas de PDA
incorporados con concentraciones crecientes de arseniato (10 a 700 mM, arseniato de sodio
dibsico heptahidratado, A6756, Sigma). Las placas se incubaron a 28 C durante 6 das
(Visoottiviseth y Ponviroj 2001). Aquellas cepas que muestran el crecimiento en estas placas se
considera para ser tolerante a un alta concentracin de arseniato y se utilizaron para obtener
ms estudio ( Kumar et al. 2011 ) y uno de ellos aislado de P. coffeae fue elegido para su
posterior evaluacin en un medio lquido. El efecto del pH del medio en el crecimiento de P.
coffeae, as como la adsorcin de arseniato se prob utilizando Medio PDA ajust a pH 5.0-9.0
. Discos fngicas ( 6 mm ) se colocaron en el PDA ajustado a diferentes niveles de pH . Las
placas se incubaron a 28 C durante 6 das y el crecimiento de los hongos se evalu midiendo
el dimetro de la colonia (Say et al. 2003 ) . Los aislados que mostraron tolerancia a una alta
concentracin
de arseniato fueron probados ms all de su arseniato tolerancia en medio lquido. Suspensin
de esporas de la aislado seleccionado se prepar y se transfiere a 3 Matraces Erlenmeyer que
contenan 100 ml de dextrosa de patata caldo incorporado con arseniato de 300 , 400 y 500
mM
respectivamente . Inocular medio que contiene 300 , 400 y 500 mM de arseniato sirvieron
como controles. Los matraces se incubaron a 28 ? C en un agitador rotatorio a 120 rpm
durante 6 das. Despus del perodo de incubacin , los contenidos de los matraces se filtraron
a travs de un filtro de membrana ( 0,45 lm , Millipore ) . El filtrado se analiz para la
concentracin de arseniato mediante Absorcin Atmica de generacin de hidruros
Espectrofotometra ( HG- AAS , AA -7000 , Shimadzu ) ( Visoottiviseth y Ponviroj 2001 ) . Se
realizaron experimentos por duplicado y los resultados se expresaron como residual arseniato
presente en el filtrado en comparacin con los controles. Adems el efecto de la biomasa de
hongos muertos y pretratado
en la adsorcin de arseniato fue probado . La biomasa fngica fue preparado por cultivar el
organismo en dextrosa de patata fresca caldo , se incubaron a 28 C durante 6 das . Despus
de la incubacin perodo , la estera de hongos se recogi por filtracin utilizando tela de
muselina , lavar muy bien con agua desionizada (Millipore agua) de agua y ms.

1. Secaron durante la noche a 60? C y tierra usando un mortero y maja (biomasa muerta).
2. Hervida durante 15 minutos en 500 ml de 0,5 N de sodio solucin de hidrxido, se lav con
agua desionizada y se se sec (biomasa pretratada) (Yan y Viraraghavan 2000).
Agua ionizada-De incorporado con diferentes concentraciones de arseniato (300, 400, 500
mM; Sathishkumar et al. 2008) se utiliz para el experimento. La biomasa obtenida (despus
de que el tratamiento previo) se aadi a los respectivos matraces a una tasa de biomasa de 2
g / L. Los matraces se mantuvieron a 28 C durante 24 h en un agitador rotatorio a 120 rpm.
Despus de 24 h, la solucin se filtr a travs de un filtro Millipore (0,45 lm). Cada filtrado se
analiz para la concentracin de arseniato por HGAAS (Visoottiviseth y Ponviroj 2001). El
anlisis estadstico se realiz en todos los experimentos hecho en los datos duplicados y
experimental se someti a el anlisis de la varianza, Post Hoc y la prueba de Scheffe (p = 0,05)
con el programa SPSS (versin 11.5).

Resultados y Discusin
Durante la primera ronda de seleccin con 2 mM de arseniato en el medio slido, la mayora
de los aislados (80% de la aislamientos) mostr resistencia, mientras que en el segundo nivel
de
tamizaje (10-100 mM) veintiocho aislados fngicos mostraron tolerancia de hasta 100 mM de
arseniato (fig. 1). Durante la tercera ronda de cribado de tres aislamientos fueron encontrado
a ser tolerante hasta 200 mM de arseniato (Tabla 1) y durante la ltima ronda de cribado slo
una cepa fue resistente a 700 mM de arseniato. Se identific el aislado como P. coffeae
mediante secuenciacin de nucletidos (Fig. 2). la secuencia de nucletidos se present a la
NCBI GenBank base de datos bajo el nmero de acceso y KF924258 seleccionada para el
estudio adicional. La eficiencia de P. coffeae en arseniato de resistencia se compar con la de
otros hongos se inform anteriormente. Kumar et al. (2011) identific cinco aislados de
arseniato contaminado el suelo agrcola que puede resistir arseniato de hasta 103 mg L / que
es ms alto
que la de nuestros hallazgos. Sin embargo Say et al. (2003) aislado un hongo, Penicillium
purpurogenum, que puede resistir arseniato tan alto como 35,6 mg / g de arseniato que es
mucho inferior a la de nuestros hallazgos. Biosorcin microbiana tiene potencial en el
tratamiento de metales que contiene los efluentes de residuos industriales y en el presente





Fig 1. Aislamiento de hongos tolerantes a arseniato de muestras de suelo.





Fig 2. Consenso de rbol filogentico generado para la secuencia de nucletidos de la
Penicllium coffeae.

Fig 3. Efecto del pH sobre la adsorcin de arseniato por Penicillium coffeae. Las letras A, B y C
en la figura representan subconjuntos homogneos que proporcionan agrupacin de las
medias de los valores obtenidos. Los grupos que caen bajo diferentes subconjuntos (A, B y C)
son significativamente diferentes unos de otros en p = 0.05




estudio demostr esta capacidad de un aislado fngico que mostr resistencia a arseniato tan
alta como 500 mM en una medio lquido. El aislado fue capaz de crecer en agar medio con 700
mM de arseniato , sin embargo , la adsorcin en Se observ el medio lquido a disminuir por
encima de 500 mM. El aislado se identific como P. coffeae ( fig. 2 ) que mostraron un
crecimiento y una ptima resistencia a arsenato en pH 9,0 . El crecimiento de las colonias de P.
coffeae en placas de PDA fija en diferente pH se determin mediante la medicin de la colonia
de dimetro Despus de crecimiento durante 6 das . No parece haber un correlacin directa
entre el incremento en el pH con el crecimiento de P. coffeae . Este aislado mostr un
crecimiento mximo a pH 9.0 ( fig. 3 ) con 500 mM de arseniato . La adsorcin de arseniato a
pH alto podra ser debido a un aumento negativo cargar en la superficie celular que favoreci
la electroqumica la atraccin y el aumento de la adsorcin del metal ( Kang et al . 2007 ) .


El aislado de P. coffeae result ser tolerantes a arseniato hasta 700 mM en medio slido . Por
lo tanto , este aislamiento se evalu adicionalmente por su capacidad para adsorber el
arseniato en medio lquido como la biomasa viva , muerta y tratada. Si no se trata biomasa (
vivos y muertos ) y se trata se cultiv en lquido medio que contiene 300 , 400 y 500 mM de
arseniato de 6 das a 28 C. Despus de la incubacin , los micelios se separaron del caldo de
cultivo y el arseniato residual en el se analiz el filtrado de cultivo . Los resultados se
compararon con los
la de los controles no inoculados . Los controles mostraron Los valores de absorcin de 6,8 %,
10,4 % y 16,2 % en 300 , 400 mM y 500 mM , respectivamente (Fig. 4 ) . El porcentaje de
adsorcin con la biomasa viva vari de 12 % a 23 % . Biomasa Dead mostr significativamente
mejores niveles de de adsorcin en comparacin con micelios vivos . La adsorcin porcentaje
en la biomasa muerta vari de 28,3 % , 16,18 % y 60,2 % a los 300 , 400 y 500 mM
respectivamente (Fig. 4 ) . Micelio tratado con lcali mostr la mejor adsorcin ( 66,8 % ) en
500 mM de arseniato . Sin embargo el porcentaje de adsorcin por biomasa pretratada se
determin que era 58,4 % , 54,5 % y 66,8 % a los 300 , 400 y 500 mM de arseniato ,
respectivamente . Micelios pretratados mostraron el mayor porcentaje de adsorcin y puede
representar la condicin ptima para mxima de adsorcin de arseniato por P. coffeae ( fig. 4 )
.



Fig 4. Porcentaje de arseniato adsorbida por la biomasa viva, muerta y pretratada de
Peniciilium coffeae. Letras a, b, c y d en la figura representan subconjuntos homogneos que
proporcionan agrupacin de medias de los valores obtenidos. Los grupos que caen bajo
diferentes subconjuntos (A, B, C y D) son significativamente diferentes unos de otros en p =
0.05


El estudio comparativo de la tolerancia por arseniato en vivo, biomasa muerta y pretratado
mostr que el pretratamiento de la biomasa con hidrxido de sodio aumentado
significativamente el porcentaje de adsorcin de arseniato ; Este aumento en de adsorcin
podra ser debido a la modificacin qumica de la componentes de la pared celular o la
exposicin de sitios de unin a metales presentar en la pared celular . De NaOH elimina
polisacridos amorfos , lpidos y protenas de la pared celular que enmascarar los sitios
reactivos , generando de este modo espacio dentro de la b esqueleto glucano - quitina
permitiendo que los iones metlicos que absorben en la superficie de la clula (El- Sayed y El-
Morsy 2004 ) . Sin embargo, la mecanismo por el cual trataron previamente exposiciones P.
coffeae mejor la resistencia del metal y la adsorcin en la actualidad no se conoce y requiere
ms estudio.
Adems, la biomasa muerta (calor se seca a 60 C) mostr un ligero aumento en la adsorcin
de arseniato cuando en comparacin con la biomasa viva . Sin embargo, en caso de en directo
la biomasa puede haber transporte de arseniato travs de la clula membrana causando la
acumulacin intracelular y arseniato por lo tanto, alterar el metabolismo de la clula ( Ahalya
et al . 2007 ) . La capacidad de adsorcin por el aislado reducido ms all cierta concentracin
de arseniato ( 500 mM) , lo que podra ser debido a los grupos involucrados , tales como
carboxilo , hidroxilo y amida en la pared celular en la adsorcin de arseniato lo que resulta en
el logro de un punto de saturacin ( O'Connell et al.2008 ) . Tambin se observ una reduccin
considerable en el la eficiencia de adsorcin del organismo cuando se cultiva en arseniato
medio libre por ms tiempo . Este hallazgo fue en conformidad con Visoottiviseth y Ponviroj (
2001 ) . Este es el primer informe para demostrar que P. coffeae , tanto en directo y muertos ,
tiene la capacidad de adsorber arseniato en 500 mM , temperatura de 28 C, a un pH de 9,0 y
en perodo de crecimiento de 6,0 das . Este informe tambin da cuenta de la eficacia de lcali (
NaOH 0,5 N ) biomasa de P. coffeae tratada en arseniato de adsorcin y por lo tanto se aade
a la lista de
adsorbentes arseniato . Porcentaje de adsorcin por pretratado biomasa a 500 mM fue de
66,8 % en comparacin con la de en vivo y la biomasa muerta sin tratamiento cuyo porcentaje
de adsorcin fue 22,9 % y 60,2 % respectivamente. Como seguimiento de la presente estudio ,
la eficiencia de las clulas muertas de P. coffeae se evaluarse en forma inmovilizada como la
inmovilizacin de las clulas no slo mejora la resistencia mecnica de la biomasa nativa , sino
que tambin ayuda en la reutilizacin de la biomasa para varios rondas de adsorcin y
desorcin ( Narsi et al. 2007 ) . La investigacin adicional tambin se llevar a cabo para
evaluar la eficiencia de adsorcin de P. coffeae en un estudio de campo (Ahalya et al. 2007).


References
Ahalya N, Kanamadi RD, Ramachandra TV (2007) Cr(VI) and Fe(III)
removal using Cajanus cajan husk. J Environ Biol
28(4):765769
Alluri HK, Roanda SR, Settalluri VS, Bondii JS, Suryanarayana V,
Venkateswar P (2007) Biosorption: an eco-friendly alternative
for heavy metal removal. Afr J Biotechnol 6(25):29242931
Al-Sabbak M, Sadik Ali S, Savabi O, Savabi G, Dastgiri S,
Savabieasfahani M (2012) Metal contamination and the epidemic
of congenital birth defects in Iraqi cities. Bull Environ
Contam Toxicol 89:937944
Bishnoi NR, Garima (2005) Fungusan alternative for bioremediation
of heavy metal containing wastewater: a review. J Sci Ind
Res 64:93100
El-Sayed, El-Morsy M (2004) Cunninghamella echinulata a new
biosorbent of metal ions from polluted water in Egypt. Mycologia
96:11831189
Kang SY, Kim DW, Kim KW (2007) Enhancement of As(V) adsorption
onto activated sludge by methylation treatment. Environ
Geochem Health 29(4):313318
Kendall MJ, Paul RT (2005) Fungal-specific PCR primers developed
for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts.
BMC Microbiol 5:28
Kumar P, Srivastava AV, Dwivedi S, Chakrabarty D, Nandita S,
Tripathi RD (2011) Biological removal of arsenic pollution by
soil fungi. Sci Total Environ 409:24302442
Lewis WP, Bretagne S, Klingspor L, Willem Melchers JG, McCulloch
E, Schulz B, Finnstrom N, Mengoli C, Rosemary Barnes A,
Peter Donnelly J, Loeffler J, On behalf of the European
Aspergillus PCR Initiative (2010) Aspergillus PCR: one step
closer to standardization. J Clin Microbiol 48:12311240
Maheswari S, Murugesan AG (2011) Removal of arsenic (III) ions
from aqueous solution using Aspergillus flavus isolated from
arsenic contaminated site. Indian J Chem Technol 18:4552
Moller EM, Bahnweg G, Sandermann H, Geiger HH (1992) A simple
and efficient protocol for isolation of high molecular weight
DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant
tissues. Nucleic Acids Res 20:61156116
Narsi R, Bishnoi RK, Bishnoi K (2007) Biosorption of Cr(VI) with
Trichoderma viride immobilized fungal biomass and cell free
Ca-alginate beads. Indian J Exp Biol 45:654657
OConnell DW, Birkinshaw C, ODwyer TF (2008) Heavy metal
adsorbents prepared from the modification of cellulose: a review.
Bioresour Technol 99:67096724
Sathishkumar M, Binupriya AR, Swaminathan K, Choi JG, Yun SE
(2008) Bio-separation of toxic arsenate ions from dilute solutions
by native and pretreated biomass of Aspergillus fumigatus in
batch and column mode: effect of biomass pretreatment. Bull
Environ Contam Toxicol 81(3):316322
Say R, Ylmaz N, Denizli A (2003) Biosorption of cadmium, lead,
mercury, and arsenic ions by the fungus Penicillium purpurogenum.
Sep Sci Technol 38:20392053
Sulaymon AH, Ebrahim SE, Mohammed-Ridha MJ (2013) Equilibrium,
kinetic, and thermodynamic biosorption of Pb(II), Cr(III),
and Cd(II) ions by dead anaerobic biomass from synthetic
wastewater. Environ Sci Pollut Res Int 20(1):175187
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007) MEGA4: molecular
evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0.
Mol Biol Evol 24(8):15961599
Visoottiviseth P, Ponviroj N (2001) Selection of fungi capable of
removing toxic arsenic compounds from liquid medium. Sci
Asia 27:8392
Wei YT, Zheng YM, Paul Chen J (2010) Enhanced adsorption of
arsenate onto a natural polymer-based sorbent by surface atom
transfer radical polymerization. J Colloid Interface Sci
356(1):234239
Yan G, Viraraghavan T (2000) Effect of pretreatment on the
biosorption of heavy metals on Mucor rouxii. Water SA
26:119123