LABORATORIO No.

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ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

INTRODUCCIN
Desde los inicios de la microscopia, los
investigadores vienen desarrollando
mtodos cada vez ms sensibles,
eficaces y con mejor resolucin. Al
principio ellos debieron enfrentarse a los
problemas de aberraciones pticas,
imgenes borrosas y pobre desarrollo de
lentes, los cuales se mantuvieron hasta
mediado del siglo XIX que aparecieron
los lentes objetivos que reducan la
aberracin cromtica con una apertura
numrica entre 0.65 y 1.25. Estos
avances se iniciaron con los reportes
sobre los mtodos de iluminacin que
propuso el profesor August Klher, en
1893, y que sentaron las bases de la
microfotografa moderna. En las ltimas
dcadas se ha incrementado la
aplicacin de la microscopa ptica en los
laboratorios de investigacin de una
amplia variedad de disciplinas como la
biologa celular y molecular,
microbiologa, inmunologa y
virologa. El rpido desarrollo de
diferentes mtodos como los de
fluorescencia, contraste de fases,
confocal y de campo oscuro entre otros,
que sumados a los avances en la
digitalizacin y anlisis de imgenes, han
permitido a los microscopistas obtener
resultados rpidos, cuantificables y
confiables de una gran variedad de
especimenes biolgicos. Al margen de
estos avances, las bases del
funcionamiento de los distintos tipos de
microscopios pticos siguen siendo los
mismos que se presentan en esta
prctica y con los cuales el estudiante
deber familiarizarse.

BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO
Tres eminentes holandeses, Antn Van
Leeuwenhoek, Hans y Zaccharias
J anssen, fabricantes de lentes,
contribuyeron al desarrollo de la
microscopa. El museo de Middleburg, en
Holanda, conserva uno de los primeros
microscopios conocidos, probablemente
fabricado por uno de los hermanos
J anssen. Estos aparatos, eran
extremadamente simples, por lo que solo
permitan el examen de cuerpos opacos.
A fines del siglo XVII el italiano Camping
construy un microscopio que hizo
posible la observacin de preparaciones
transparentes. Las imgenes obtenidas
por estos microscopios eran muy
deficientes.
En Inglaterra el cientfico Robert Hooke,
trat de construir lentes ms eficaces,
pero sus resultados no fueron
satisfactorios; sin embargo, sus
observaciones contribuyeron al
establecimiento de la microscopa como
ciencia. Mientras, en el siglo XVII J onh
Marshall y otros fabricantes de
microscopios, perfeccionaron mucho el
diseo mecnico, pero no la calidad de
los lentes. Pero fue, durante el siglo XIX,
que se realizaron grandes progresos en
los sistemas pticos y en la microscopa
en general; an as, fue imposible evitar
la dispersin de la luz en sus colores
componentes en la fabricacin de
microscopios. Este fenmeno conocido
como aberracin cromtica, produca una
imagen borrosa y coloreada.
Las primeras lentes adecuadamente
corregidas para microscopios,
denominadas acromticas, hicieron su
aparicin alrededor de 1830; pero la
aberracin esfrica, tambin produca
una imagen desenfocada. En 1886, Ernot
Abbe y Caol Zeiss en Alemania
fabricaron unas lentes apocromticas
que corrigieron ambas aberraciones.
A finales del siglo XIX, los microscopios
comenzaron a adquirir la forma que
tienen actualmente, con los aportes de
Khler.
Desde el ao 1900, los microscopios se
han modificado poco en sus principios
fundamentales, pero mucho en sus
5
detalles. Estos perfeccionamientos
incluyen, la incorporacin de varios
objetivos, cada uno de aumento diferente
y roscados a un tambor giratorio o
revolver.
En 1935, Frizt Zenique invent la tcnica
del contraste de fase que hace posible la
observacin de especimenes antes
invisibles.
El microscopio electrnico, desarrollado
en vsperas de la segunda guerra
mundial, ha sido de gran utilidad para el
estudio de molculas qumicas, virus y
organelas celulares.
Existe un tipo de microscopio electrnico,
llamado de barrido, que ha adquirido una
extraordinaria utilidad, ya que ofrece
representaciones tridimensionales muy
reales de las clulas y las estructuras
celulares.


1.1 OBJETIVOS:
1.1.1 OBJETIVO GENERAL:
Valorar la importancia del
microscopio como instrumento bsico
para el estudio e investigacin en las
Ciencias Biolgicas.

1.1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Identificar las diferentes partes que
constituyen el microscopio y
reconocer las funciones de cada una
de ellas
Adquirir habilidad en el uso y manejo
correcto del microscopio, siguiendo
las indicaciones de las guas de
laboratorio.

1.2 MATERIALES
Microscopios
Porta-objetos y cubre-objetos
Papel limpia lentes
Goteros
Hilos de lana y algodn
Flores con polen





1.3 CLASES DE MICROSCOPIOS:
Existen dos tipos de microscopios:
simples y compuestos
Microscopios simples : Consta de
un solo sistema de lente
Microscopios compuestos:
Constan de dos (2) sistemas de
lentes: el objetivo y el ocular.
El microscopio compuesto es un
instrumento que aumenta
considerablemente la imagen de los
objetivos que en l se observan. Entre
las variedades de ste microscopio
encontramos el electrnico y el fotnico u
ptico. Este ltimo tipo de microscopio
est formado por una parte mecnica y
una parte ptica. (Figura No.1.1)

Parte Mecnica:
a. Pie o Base: Generalmente en forma
de herradura o rectangular, es el apoyo
de las dems piezas del microscopio. El
pie debe ser slido y pesado para
asegurar su estabilidad.
b. Columna o Brazo: Este elemento
relaciona el tubo del microscopio con el
pie; sostiene la platina y el condensador
y de ella se agarrar el microscopio
cuando se traslada durante los trabajos.
En algunos microscopios la columna es
mvil



Figura No.1.1 Microscopio ptico
Para observar imgenes de las diferentes partes
del microscopio haz clic aqu



6
c. Tubo del Ocular: Est colocado en la
parte superior del microscopio, donde
estn acoplados los oculares, que
pueden tener movimiento vertical, con
ayuda de una cremallera sobre la
columna. En algunos microscopios el
tubo del ocular es inclinado y se
mantiene fijo, en este caso se mueve la
platina.
d. Revlver o Disco Giratorio: Est
debajo del tubo ocular donde estn
acoplados los objetivos, presenta
movimiento giratorio para facilitar el
cambio de un objetivo a otro.
e. Platina: Es una placa que puede ser
cuadrada, circular o rectangular, con un
orificio central que permite el paso de la
luz a travs de ella. Su funcin es
sostener las placas con los preparados
biolgicos que se van observar
f. Carro: es un dispositivo ubicado sobre
la platina, cuya funcin es sujetar y
mover la placa que se va a estudiar.
Posee dos tornillos que permiten
movimientos horizontales (hacia
adelante, hacia atrs, hacia la derecha y
hacia la izquierda) del portaobjeto.

Cuando la platina carece del anterior
dispositivo, lleva dos soportes para fijar
las placas llamadas ganchos o uas.

g. Mecanismos de Movimiento: Est
integrado por el tornillo macromtrico y el
micromtrico
Tornillo Macromtrico: Acerca o
aleja rpidamente el objetivo del
preparado a observar; su funcin es
lograr un enfoque ms o menos claro
o aproximado del objeto.
Tornillo Micromtrico: Acerca o
aleja el objetivo del preparado, pero
lentamente, casi imperceptiblemente,
permite desplazamientos muy finos
de la platina o del tubo del ocular.
Durante la observacin y enfoque
este tornillo debe estarse moviendo
permanentemente; su funcin es
darle nitidez al enfoque.


Parte ptica:
Esta integrada por los objetivos, oculares
y el aparato de iluminacin (espejo,
diafragma, condensador y filtros). Estos
elementos son los que permiten la
iluminacin, ampliacin y la visin
aumentada del objetivo.
a. Objetivo: Es la pieza ms importante
del microscopio. Ellos se acoplan
mediante roscas estndar al revlver y
pueden ser cambiados de posicin con
slo rotarlos. Reciben el nombre de
objetivos porque son los lentes que estn
ms cerca del objeto. La mayora de los
microscopios tienen tres o cuatro
objetivos. Las lentes de los objetivos son
de aumentos diversos, los ms usados
son:
Objetivos de pequeos aumentos 3.5x;
4x, 5x, 6x, 8x y 10x; objetivos de grandes
aumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de
inmersin 90x, 95x y 100x.

Las lentes de inmersin se emplean con
aceite de inmersin para conectar la
lente frontal (lente inferior del objetivo) al
porta-objeto. Entre el objetivo y el objeto
se produce una prdida de luz por
reflexin que se corrige adicionando al
preparado unas gotas de aceite de cedro
(aceite de inmersin) cuyo ndice de
refraccin 1.515, es prximo al cristal.
Este aceite tambin reduce o suprime
por completo la refraccin de los rayos
de luz provenientes de la fuente
luminosa.


Figura No. 1.2 Especificaciones de los
objetivos.
7
b. Ocular: Estn colocados en la parte
superior del tubo ocular. Est formado
por dos sistemas de lentes dispuestos de
un cilindro. Su finalidad es aumentar la
imagen dada por el objetivo y
eventualmente corregir algunos defectos
de la misma. Reciben dicho nombre
porque son las lentes que se encuentran
ms cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x;
5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x.
El aumento de la imagen de un objeto
observado a travs de un microscopio,
se calcula multiplicando el nmero de
aumento del objetivo con el cual se est
trabajando por el nmero de aumento del
ocular que se est utilizando.
c. Aparato de iluminacin: Est
conformado por la fuente de luz, el
diafragma, el condensador y los filtros.
d. Fuente de luz: Puede ser natural o
artificial, cuando es natural (solar) o
procede de un foco luminoso situado
fuera del microscopio, un espejo recoge
la luz del medio y la refleja a travs del
objeto y del sistema de lentes. La luz
artificial la constituye generalmente un
bombillo ubicado en el microscopio y
conectado a un circuito elctrico de bajo
voltaje.
e. Diafragma: Est ubicado entre la
fuente de luz y el condensador,
inmediatamente debajo de la platina, su
funcin es regular la intensidad de luz
que atraviesa el objeto. El diafragma
tiene una palanquita que al moverla
hacia delante o hacia atrs agranda o
achica el orificio central, dejando pasar
mayor o menor cantidad de luz
respectivamente.
f. Condensador: Es un elemento cnico
que posee un sistema de dos lentes
convergentes que recogen o concretan
los rayos luminosos para enviarlos al
objetivo por el agujero de la platina.
Existe un tornillo manual que permite
guardar la altura del condensador. Esta
graduacin es importante cuando se
trabaja con objetivos de gran aumento
(40x, 100x), ya que en la medida que se
trabaja con stos objetivos el
condensador debe subirse. Lo contrario
sucede cuando se trabaja con objetivos
de menor aumento (4x, 10x).
g. Filtros: Entre la fuente de luz y el
condensador de algunos microscopios
existe un portafiltros en el cual se puede
colocar filtros a voluntad del observador.
Los filtros son elementos de cuarzo o de
vidrio, pueden ser de color azul, amarillo
o verde. Ellos interceptan el haz de rayos
luminosos antes de entrar al
condensador, esto se hace con el objeto
de seleccionar un tipo de luz
determinada para una experiencia dada.
Para observar imgenes de filtros haz clic aqu.

1.4 LA LUZ:
La luz es una forma de energa
transportada continuamente por el
espacio a velocidades muy elevadas
(330.000 Km/s en el vaco). La luz est
formada por pequeos corpsculos que
salen de un foco luminoso en forma de
ondas. El brillo de la luz es proporcional
a la altura o amplitud de la onda y su
color depende de la longitud de sta. La
luz blanca est constituida por una gama
de colores del espectro visible, stos
colores son: rojo, anaranjado, amarillo,
verde, azul y violeta.
Cada color corresponde a una longitud
de onda determinada, por consiguiente,
la luz blanca se compone de muchos
rayos de luz, todos vibrando con
diferentes longitudes de onda. (Figuras
1.3 y 1.4).




Figura No.1.3. Naturaleza Ondulatoria de
la Luz
8
La luz de una sola longitud de onda se
llama monocromtica. Si bien se utilizan
casi solo microscopios de luz blanca, la
mayora de las lentes modernas estn
diseadas para el uso de luz
monocromtica verde.



Figura No.1.4. Espectro de Luz Visible

1.5 LENTES:
Las lentes son el componente ms
importante del microscopio; se fabrican
de vidrio u otros materiales
transparentes.
Pueden ser convexas o cncavas en
ambas superficies, planas en una cara o
tener cualquier combinacin de stas dos
formas en su superficie.
Las lentes son de dos tipos: positivas y
negativas.
Lentes Positivas: Hacen converger
los rayos de luz, es decir, los
concentra para formar una imagen
real.
Lentes Negativas: Hacen divergir los
rayos de luz, sin formar ninguna
imagen real.

1.6 PREPARACIONES
MICROSCPICAS:
Debemos tener en cuenta que a travs
del microscopio solamente se pueden
observar objetos que dejan pasar rayos
de luz, por esta razn el preparado debe
ser lo ms delgado y transparente
posible, pues un preparado grueso solo
nos permite observar una mancha negra.
Los detalles solo se observan si la
preparacin es lo suficientemente
delgada para que sea
transparente con la luz que recibe. Para
realizar preparaciones microscpicas los
porta y cubre-objetos deben limpiarse
antes de usarse. Un buen mtodo es
guardarlos en alcohol y antes de
utilizarlos secarlos con un pao limpio y
libre de grasa. Los cubre-objetos deben
limpiarse con mucho cuidado porque son
frgiles.

Las preparaciones microscpicas pueden
ser acuosas o en seco.
Las preparaciones acuosas son las ms
simples y fciles usadas para examinar
cualquier objeto fluido, como agua de
estanque o sangre. Se deposita una
gotita del lquido que se desea observar
en el centro del porta-objeto, se coloca el
cubreobjeto sobre el porta, forme con las
dos lminas un ngulo de 45 grados y
luego deje caer suavemente la laminilla
cubre-objeto sobre el preparado,
evitando la formacin de burbujas. Figura
No.1.5.

El lquido no debe rebosar los bordes del
cubre-objeto, en caso de que suceda
seque cuidadosamente el lquido
sobrante usando papel absorbente o
papel toalla. La preparacin queda as
lista para la observacin. Estas
preparaciones son de corta duracin
porque se secan rpidamente; para
hacerlas ms duraderas debe cerrarse
hermticamente los bordes del cubre
objeto; la duracin de sta preparacin
no es indefinida. Los bordes se pueden
cerrar con vaselina o esmalte. Un cierre
ms hermtico se consigue cerrando con
blsamo de Canad (Euparal).

Las preparaciones en seco como lo
ndica su nombre, se hacen para
observar objetos secos, tales como alas
de insectos. Aqu se utiliza goma
arbiga, la cual se extiende sobre el
porta, luego se deposita el objeto sobre
la superficie y se deja endurecer la
9
goma. Una vez endurecida la goma se
pone un poco de blsamo de Canad
sobre el objeto y se coloca el cubre-
objeto.



Figura No.1.5. Preparaciones Acuosas

1.7 COLORANTES :
Los colorantes son sales compuestas por
un cido y una base. Se clasifican en
cidos, bsicos y neutros, segn la parte
de los mismos que imparta el color. En
los colorantes cidos el grupo cromforo,
el que imparte el color, es el componente
cido, el componente bsico es incoloro.
Lo contrario sucede con los colorantes
bsicos. Los colorantes neutros tienen
coloreado el componente cido y el
bsico.
La mayora de los colorantes son
sintticos, aunque se emplean todava
algunos naturales. La hematoxilina y el
carmn son los colorantes naturales ms
importantes para la tincin de tejidos. El
carmn es producido por la conchinilla
(Coccus cacti).
La hematoxilina se extrae de la madera
de un rbol de Mxico, el palo
Campeche.
Otro colorante es la orcena que se
extrae de lquenes. Existen tres tcnicas
de tincin de uso general: la coloracin
seca o de tejidos muertos, la coloracin
vital o de tejidos vivos y la histoqumica,
en la cual se utilizan las reacciones de
los colores para hacer visible los
elementos estructurales de las clulas y
de los tejidos. Una reaccin histoqumica
muy conocida es la de Feulgen, en la
que se emplea el reactivo incoloro de
Schiff par teir el DNA en tonos rojizos
purpreos. (Figura 1.6)



Figura No.1.6. Colorantes.
Haz clic aqu.

1.8 MANEJO DEL MICROSCOPIO:
Antes de iniciar una observacin
microscpica se debe iluminar
completamente el campo visual, para lo
cual se procede de la siguiente manera:

1. Gire el revlver hasta que el objetivo
de menor aumento quede en posicin de
trabajo, o sea que quede alineado con
los oculares. Usted sentir un golpecito
(como un clic) cuando el objetivo llegue a
su posicin de uso.
2. Lleve el condensador a su posicin
ms alta.
3. Accione el tornillo macromtrico hasta
que el objetivo de menor aumento
descienda lo mximo posible o hasta que
la mesa ascienda lo mximo posible,
segn sea el modelo del microscopio.
Esta operacin se hace llegar hasta un
punto de parada (tope).
4. Mire a travs del ocular o gire el
espejo hacia la fuente de luz hasta
obtener un mximo de iluminacin. Si el
campo visual no queda uniformemente
iluminado, baje lentamente el
condensador hasta obtener una
iluminacin uniforme. Si su microscopio
es elctrico siga los pasos 1, 2 y 3.
Enchufe el cable del transformador a la
fuente de energa.
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Conecte el cable del microscopio al
transformador y luego accione el botn
de ste para que encienda la bombilla.
Mire por el ocular.
5. Una vez lograda una correcta
iluminacin coloque el preparado sobre
la platina. Mirando de lado, asegrese
que el objeto a observar est centrado
justo debajo del objetivo de menor
aumento.
6. Mirando a travs del ocular mueva
suavemente el tornillo macromtrico, si el
objeto est bien centrado aparecer su
imagen en el campo visual. Dle nitidez
al enfoque accionando el tornillo
micromtrico. Mueva el carro en
diferentes direcciones para seleccionar el
mejor campo posible. Puede controlar la
intensidad de la luz, mediante el
diafragma o el regulador de la intensidad
de la luz de la bombilla.
Para hacer un enfoque con mayor
aumento debe seguir las indicaciones
anteriores. Una vez obtenido el enfoque
correcto con menor aumento, mueva el
revolver y coloque en posicin de trabajo
el objetivo de mayor aumento. Si su
microscopio est bien calibrado debe
aparecer enfocada la imagen del objeto.
Este enfoque se refina accionando el
tornillo micromtrico.

Cuando el microscopio es monocular
debe acostumbrarse a mantener tambin
abierto el ojo que no utilice en la
observacin microscpica, esto le evita
cansancio.


1.9 RECOMENDACIONES QUE DEBEN
OBSERVARSE PARA EL BUEN USO
Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO:
1. El microscopio es un instrumento
costoso y de precisin, con muchas
partes delicadas, por lo tanto, debemos
darle el mejor cuido posible.
2. Si su Microscopio presenta algn
defecto, consulte con su profesor. No
trate de arreglarlo Usted.
3. Las lentes del microscopio cuestan
casi tanto como todas las dems partes
juntas. Mantenga las lentes limpias. No
toque las lentes con los dedos, ya que el
sudor las daa. Nunca limpie las lentes
con otra cosa que no sea papel especial
para lentes.
4. No permita que lquidos,
especialmente cidos o alcoholes, se
pongan en contacto con su microscopio.
5. Use siempre cubre-objetos cuando
observe en agua u otros lquidos
6. Localice siempre el objeto con el
objetivo de menor aumento
7. Los sedimentos de grasa, el aceite de
inmersin y los residuos de stos
productos deben eliminarse
inmediatamente con un poco de
disolvente como ter o xilol. Nunca se
debe emplear alcohol, ya que disuelve el
cemento utilizado en la fabricacin de los
lentes. La limpieza final es ms efectiva
usando un poco de agua destilada.
8. Cuando no se est usando el
microscopio, debe mantenerse siempre
cubierto con una funda.
9. Al finalizar sus actividades de
laboratorio, tenga en cuenta lo siguiente:
9.1 Antes de apagar la fuente de luz,
llevar el dispositivo que regula la
intensidad luminosa hasta O (cero).
9.2 Dejar el microscopio con el objetivo
de menor aumento en la posicin de
enfoque y la platina en su mxima
posicin superior.
9.3 Desenchufar el microscopio y
colocarle la funda protectora.


2.0 EJERCICIO DE APLICACIN:
Con las siguientes prcticas se ejercitar
inicialmente al estudiante en el uso y
manejo del microscopio.

1. Fibra de lana o algodn:
Coloca varias fibras de lana o algodn de
diferentes colores sobre un portaobjetos,
coloque el cubre-objetos, enfoque con
menor y mayor aumento.
Esquematice sus observaciones.



11
2. Granos de polen:
Coloque granos de polen del estigma de
una flor en un porta-objetos, con ayuda
de un gotero ponga una gota de agua,
ubique el cubre-objetos y observe con
menor y mayor aumento. Haga un
esquema de lo observado.


3.0 CUESTIONARIO:
1. Coloque los nombres a las diferentes
partes del microscopio numeradas en
la Fig. No. 1.6 e investigue las
funciones de cada una de ellas.
2. Qu otros tipos de microscopios se
utilizan en la investigacin biolgica?
3. Qu son objetivos secos?
4. Qu son objetivos de inmersin?
5. Para qu se utiliza el aceite de cedro,
cuando usamos el objetivo de
inmersin?

Cuando se utiliza un microscopio de
espejo:
6. Qu importancia tiene utilizar la
parte cncava del espejo?
7. Qu importancia tiene utilizar la
parte plana del espejo?
8. Investigue sobre el funcionamiento
de los diferentes microscopios
electrnicos y establezca diferencias
entre ellos.
9. Describa las principales tcnicas de
preparacin de muestras empleadas
en microscopa ptica.
10. Qu son los colores
complementarios y que utilidad
tendran en microscopa ptica.


3.1 ENLACES
http://tq.educ.ar/tq03027/tipos.htm :
Como usar el microscopio, tipos,
generalidades
http://www.itg.uiuc.edu/technology/at
las/: Pgina con atlas de imgenes
obtenidas en diferentes tipos de
microscopios.
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12









FIGURA 1.6 EL MICROSCOPIO PTICO
















13
GALERIA DE IMGENES

1. LAS PARTES DEL MICROSCOPIO

1.1 OCULARES


1.2 OBJETIVOS Y REVOLVER


1.3 PLATINA Y CARRO


1.4 DIAFRAGMA




1.5 CONDENSADOR


1.6 TORNILLOS


1.7 BRAZO


1.8 LA IMAGEN

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14
2. FILTROS
2.1 FILTROS POLARIZADORES


2.2 FILTROS MONOCROMATICOS


2.3 UBICACIN DE LOS FILTROS


2.4 COLORES COMPLEMENTARIOS

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3. TINCIN DE MUESTRAS






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15