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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS I
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PRCTICA N 07

I. INTRODUCCIN
Los miembros del gnero Salmonella han sido muy estudiados como
patgenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este
microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las
plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del mtodo
analtico utilizado para su deteccin.
El gnero Salmonella se incluye en la familia Enterobacteriaceae,
integrada por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen, por lo
tanto, las caractersticas generales de las enterobacterias: son fermentadores
de la glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa y suelen ser mviles;
representa una excepcin Salmonella gallinarum, siempre inmvil
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clnicas y
los mtodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su
deteccin en alimentos. Las modificaciones a los mtodos consideraron dos
aspectos principales, el primero es el debilitamiento o dao a las clulas
bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que est sujeto (por
ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente
a la naturaleza del producto bajo estudio.
Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento
de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean
las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en
medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificacin bioqumica y
confirmacin serolgica de los microorganismos.

II. OBJETIVOS

Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de consumo humano
Conocer el mtodo de anlisis y el uso de los medios de cultivo





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III. FUNDAMENTO TEORICO:

El gnero Salmonella pertenece a la familia enterobacteriaceae. Son
bacilos Gram-negativos y su tamao oscila entre 1 y 3 m de longitud entre
.5 y 7 m de dimetro. Generalmente poseen flagelos peritricos que les dan
movilidad. Son bacterias anaerobias facultativas que fermentan la glucosa
produciendo acido y gas. (casi todas las especies de salmonella producen
sulfhidrico a partir de las protenas y son capaces de descarboxilizar algn
aminocido. Su temperatura ptima de crecimiento es de unos 37C y la aw
mnima es aproximadamente de 93. El intervalo de pH de crecimiento est
comprendido entre los valores de 4.1 y 9.0 multiplicndose, por lo tanto en
los alimentos de baja acidez.

Los principales reservorios de Salmonella son las aves de corral, el
ganado bovino y el porcino. Por lo tanto, son fuentes de infeccin las carnes
de estos animales y los huevos. El hombre tambin es reservorio de esta
bacteria lo que revela la importancia de considerar a los manipuladores de
alimentos portadores como fuente de infeccin. Tambin se han identificado
como fuentes de infeccin los vegetales frescos consumidos crudos en
ensaladas.

Alimentos asociados: carnes crudas, pollo, huevos, leche y derivados
lcteos, vegetales frescos, pescados, salsas y aderezos para ensaladas,
mezclas para pasteles, postres a base de crema, gelatina en polvo, cacao y
chocolate.

Acorde al manual de bacteriologa analtica (BAM) de los Estados
Unidos, la norma oficial mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios.
Mtodo para la determinacin de salmonella en alimentos y la metodologa
de otros pases como la Comunidad Econmica Europea, el usar mtodos
de cultivo tradicionales sigue siendo la referencia ms importante para la
deteccin de microorganismos de inters sanitario para el ser humano.

Todos los mtodos para deteccin de patgenos, involucran en mayor o
menor grado las siguientes etapas:

1) El pre-enriquecimiento tiene como objetivo el desarrollo general de
microorganismos del tipo similar a aqul que estamos buscando que se
desarrollen por lo menos 2 o 3 logaritmos. Todos aquellos microorganismos
que no son del mismo grupo (en el caso de Salmonella, aquellos diferentes
al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser inhibidos o tienen crecimiento
marginal durante este paso.
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2) El enriquecimiento selectivo (E.S.) como su nombre lo indica, es buscar
llevar a un nivel cercano al 1,000,000 de m.o./mL y neutralizar eficazmente a
otros miembros que puedan tener un desarrollo similar en la microflora del
alimento que se est analizando. En el caso especfico de Salmonella,
durante esta etapa se busca desarrollarla por encima de bacterias coliformes
como E.coli, Citrobacter y Proteus.

3) Durante el aislamiento diferencial, se toma una asada del medio de
E.S. y se re-siembra por estriado en una sola placa o mximo en la mitad de
una placa de petri regular. El estriado debe ser lo suficientemente espaciado
para que al trmino del mismo, puedan llegarse a seleccionar colonias
puntiformes que puedan ser aisladas para el siguiente paso. Para el anlisis
de Salmonella, existen ms de 5 formulaciones de agar ampliamente usadas
entre los que estn el Agar Entrico Hektoen, el Agar Verde Brillante, el Agar
de Sulfito Bismuto, el Agar McConkey, el Agar XLD y el Agar Salmonella
Shigella.

4) Las pruebas bioqumicas presuntivas se enfocan a buscar ciertas
caractersticas bioqumicas relacionadas con motilidad o desarrollo de algn
color, turbidez o precipitacin sobre un agar o un caldo selectivo en tubo.
Estas pruebas permiten descartar si bacterias con un desarrollo en agar muy
parecido a la bacteria objetivo (para Salmonella, bacterias como Proteus
vulgaris, E.coli y Citrobacter freundii y determinar en esta etapa si conviene
continuar a la bsqueda del gnero y especie del microorganismo en el
siguiente paso. Para Salmonella, los dos ensayos analticos ms comunes
incluyen el uso del Agar Triple Azcar Hierro (TSI) y el Agar Lisina Hierro
(LIA).

5) Las pruebas bioqumicas confirmativas, acorde al manual de
Bergleys, son el conjunto de anlisis especficos para determinacin de
gnero y especie de los microorganismos. Estas incluyen pruebas como el
indol, Citrato de Simmons, Manitol, Urea, Rojo de Metilo y Voges Proskauer.
Acorde a los resultados de cada una de ellas, se determinan la identidad del
microorganismo.

6) La Serologa, usa Antisueros especficos para cada microorganismo que
indican el detalle exacto de las caractersticas bioqumicas y fisiolgicas.
Casi todas ellas son por aglutinacin en ltex y suelen demorar de 1 a 3
das.




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IV. MATERIALES:
Material Biolgico: huevos sucios

Material no biolgico:
Medio de enriquecimiento no selectivo
(caldo lactosado)
Medio de enriquecimiento selectivo (caldo
selenito y caldo tetrationato)
Medio de confirmacin: Agar S.S.
Medios para pruebas bioqumicas
Placas Petri
Tubos de dilucin
Frascos
Pipetas
Mechero Bunsen
Gradillas
Incubadora






V. PROCEDIMIENTO:

Como en este caso la muestra a estudiar han sido huevos crudos de
gallina, se toman cinco (5) de estos y los reparte equitativamente en
dos frascos grandes estriles (al
introducirlos se los rompe).





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Luego se le agrega 225 mL de caldo lactosado (enriquecimiento no
selectivo). Los frascos se los enva a estufa a 30 C por 24 h.










Pasado el tiempo, se preparan los tubos conteniendo 10 mL de los
medios de enriquecimiento selectivo (dos con caldo selenito y dos con
caldo tetrationato).Se inocula 1 mL de la muestra anterior a cada uno
de los tubos y luego se los separa, un par de tubos (C. selenito y C.
tetrationato) van a incubacin a 37 C y el otro par de tubos van a 42 C
y ambos por 24 h. nuestro grupo solo hicimos el caldo Selenito






Pasado el tiempo de incubacin, se
siembran de cada uno de los tubos en placas
con agar S-S. stas se incubarn a 37 C por 24 h.-Luego, se
realizarn a las colonias caractersticas, las pruebas bioqumicas
necesarias para su identificacin



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VI. RESULTADOS:

De los tubos con caldo selenito sembrados se los envi a incubacin,
cada uno a sus temperaturas respectivas por 24 h, obteniendo como
resultados la presencia de turbidez.











De los tubos obtenidos se sembr por agotamiento y estra en placas
con agar S-S. Se las incub a 37 C por 24 h, pasado el tiempo se
observ los resultados










Como se puede observar, se obtuvieron colonias negras, caractersticas
de Salmonella productora de H
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S. Se escogi una de estas colonias y se
le realiz las pruebas bioqumicas respectivas.


PRUEBAS RESULTADOS
Citrato Negativo
Rojo Metilo Negativo
V. P. Positivo
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VII. CONCLUSIONES:

Al aplicar la tcnica normalizada para la deteccin de Salmonella,
he concluido que, en la muestra de los huevos sucios existe la
presencia de Salmonella, por lo cual no es apto para el consumo
humano.

Logramos conocer y aplicar con xito el mtodo de anlisis para la
deteccin de Salmonella, utilizando los diferentes medios.

VIII. CUESTIONARIO
1. Qu otros medios se utilizan para un enriquecimiento no selectivo
de Salmonella?
Los caldos ms usados para el enriquecimiento no selectivos suelen ser
el Lactosado, el Agua Peptonada Bufferada y el Caldo Soya
Tripticasena.
1.1 Agua de peptona tamponada

Frmula

Peptona 10,0 g
Cloruro sdico 5,0 g
Fosfato sdico dibsico 3,5 g
Fosfato potsico monobsico 1,5g
Agua 1,0 l


1.2 Caldo lactosado

Frmula

Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Lactosa 5,0 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 6,9

1.3 Caldo de soya tripticasa

Frmula

Tripticasa o triptosa 17,0 g
Fitona 3,0 g
Glucosa 2,5 g
Cloruro de sodio 2,5 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 7,3

Indol Negativo
TSI K/A, -, 3+
LIA R/A, -, -
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2. Qu otros medios se utilizan para un enriquecimiento selectivo de
Salmonella?
En esta etapa suelen usarse caldos selectivos como el Tetrationato, el
Rappaport Vassiliadis y el Selenito Cistina.

2.1 Caldo selenito-cistina
Triptona o polipeptona 5,00 g
Lactosa 4,00 g
Fosfato disdico 10,00 g
Selenito cido de sodio 4,00 g
L-cistina 0,01 g
Agua destilada 1,00 l
pH final: 7,0
2.2 Caldo tetrationato
Proteosa peptona o triptona 5,0 g
Sales biliares 1,0 g
Carbonato de calcio 10,0 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 7,0

2.3 Vassiliadis-Rappaport


Solucin A
Triptona 5,0 g
Cloruro de sodio 8,0 g
Fosfato de potasio
dihidrogenado 1,6 g
Agua destilada 1,0 l

Solucin B
Cloruro de magnesio
hexahidratado 400,0 g
Agua destilada 1,0 l

Solucin C
Oxalato de verde de malaquita 0,4 g
Agua destilada 100,0 ml

Medio completo
solucin A 1000 ml
solucin B 100 ml
solucin C 10 ml


3. Qu otros medios de confirmacin o aislamiento se puede utilizar
para el aislamiento de Salmonella?

3.1 Agar verde brillante (VB)

Frmula
Extracto de levadura 3 g
Polipeptona (Proteosa peptona No. 3) 10g
Cloruro de sodio 5 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Rojo de fenol 0,08 g
Agar 20,0000 g
Verde brillante 0,0125 g
Agua destilada 1 l
pH final: 6,9


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3.2 Agar con sulfito de bismuto

Frmula
Extracto de carne de res 5 g
Mezcla de peptonas 10g
Glucosa 5,000 g
Fosfato disdico (anhidro) 5 g
Sulfato ferroso (anhidro) 0,3g
Sulfito de bismuto 8 g
Verde brillante 0,025 g
Agar 20 g
Agua destilada 1 l
pH final: 7,6

6.1.3.3 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Frmula
Xilosa 3,75 g
L-lisina 5,00 g
Lactosa 7,50 g
Sacarosa 7,50 g
Cloruro de sodio 5,00 g
Extracto de levadura 3,00 g
Rojo de fenol 0,08 g
Agar 15,00 g
Desoxicolato de sodio 2,50 g
Citrato frrico-amnico 0,80 g
Tiosulfato de sodio 6,80 g
Agua destilada 1,00 l
pH final: 6,9

6.1.3.4 Agar para Salmonella y Shigella (SS)

Frmula
Extracto de carne 5,000 g
Polipeptona * 5,000 g
Lactosa 10,000 g
Sales biliares 8,500 g
Citrato de sodio dihidratado 8,500 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,500 g
Citrato frrico 1,000 g
Agar 13,500 g
Rojo neutro 0,025 g
Verde brillante 0,330 mg
Agua destilada 1,000 l
pH final: 7,0




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3.5 Agar entrico Hektoen

Frmula
Proteosa peptona 12 g
Extracto de levadura 3 g
Lactosa 12 g
Sacarosa 12 g
Salicina 2 g
Sales biliares 9g
Cloruro de sodio 5g
Tiosulfato de sodio 5 g
Citrato amnico frrico 1,5g
Azul de bromotimol 0,064 g
Fuscina cida 0,1 g
Agar 13,5g
Agua 1 l
pH final: 7,5
4. Fundamentar los diferentes medios utilizados.
CALDO DE ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO(Caldo lactosado sin
indicador).- Es un medio de pre-enriquecimiento, ya que la lactosa
contenida en el caldo va a favorecer el crecimiento de las
enterobacterias que pudieran estar presentes en el medio.

CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO:
a) CALDO SELENITO.- Este caldo inhibe el crecimiento de
coliformes, enterococos y estafilococos (no as de Salmonella,
Shigella, Proteus y Pseudomonas)

b) CALDO TETRATIONATO.- Inhibe el crecimiento de coliformes y
bacterias Gram positivas (estas por los acidos biliares).
Originalmente el caldo no contiene tetrationato en su formulacin,
este se forma por oxidacin del tiosulfato sdico merced al yodo
contenido en la solucin (por eso le agregamos lugol).

MEDIO DE AISLAMIENTO (Agar Salmonella Shigella).-Es un medio
de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales
biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del
Proteus spp. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no
fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y
producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se
evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de
sulfuro de hierro.



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IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

SALMONELLA (2003) Generalidades del gnero. Obtenido el 15 de
febrero de2008 enhttp://www.bvsops.org.uy/pdf/salmonella.pdf
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en
Microbiologa: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic. Lima.
L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de
Alimentos:Aislamiento e identificacin de Salmonella. Obtenido en:
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico
_de_microlimentos.htm
Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, bienes y
servi cios. Mtodo para la determinacin de salmonell a en
alimentos. Disponible en:
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/114ssa14.html

Metodologa para anlisi s de Sal monella. Mtodos para
deteccin de Salmonella en al imentos y bebidas. Disponibl e en:
http://iso22000yhaccp.blogspot.com/2008/11/metodologa-para-
anlisi s-de-salmonell a.html