Analise Uva

Sara Sofia Marques Fernandes
Julho de 2010
Universidade do Minho
Escola de Cincias
Desenvolvimento de um mtodo de anlise
de Pesticidas na Indstria Vitivincola
U
M
in
h
o
|
2
0
1
0
S
a
r
a

S
o
f
ia

M
a
r
q
u
e
s

F
e
r
n
a
n
d
e
s
D
e
s
e
n
v
o
l
v
i
m
e
n
t
o

d
e

u
m

m
t
o
d
o

d
e

a
n
l
i
s
e

d
e

P
e
s
t
i
c
i
d
a
s

n
a

I
n
d
s
t
r
i
a

V
i
t
i
v
i
n
c
o
l
a
Dissertao de Mestrado em Qumica
rea de Especializao em Tcnicas de Caracterizao
e Anlise Qumica
Sara Sofia Marques Fernandes
Julho de 2010
Universidade do Minho
Escola de Cincias
Desenvolvimento de um mtodo de anlise
de Pesticidas na Indstria Vitivincola
Trabalho efectuado sob a orientao do
Professor Doutor Pier Parpot
e da
Dra. Isabel Arajo
AUTORIZADA A REPRODUO PARCIAL DESTA TESE APENAS PARA EFEITOS
DE INVESTIGAO, MEDIANTE DECLARAO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE
COMPROMETE;
Universidade do Minho, ___/___/______
Assinatura: ________________________________________________
Agradecimentos

II

Esta dissertao, embora seja um trabalho individual, foi realizada com contributos de natureza diversa,
e por essa razo que desejo expressar os meus sinceros agradecimentos.
Em primeiro lugar, gostaria de manisfestar o meu reconhecimento aos meus orientadores, o Professor
Doutor Pier Parpot da Universidade do Minho e a Dra. Isabel Arajo da Empresa Vinalia, pelo apoio,
ensinamentos, sugestes relevantes e disponibilidade.
Ao Departamento de Qumica da Universidade do Minho pelo acolhimento e disponibilizao do
Laboratrio e todo o material necessrio para a realizao deste projecto.
Empresa Vinalia que disponibilizou as amostras para anlise.
A todos os Professores que foram meus mentores ao longo do ano curricular do Mestrado, que atravs
das suas lies me transmitiram conhecimentos essenciais e motivao para a realizao deste trabalho.
s minhas amigas Joana e Juliana pela amizade e apoio nos momentos bons e menos bons.
Aos meus colegas de Mestrado e de Laboratrio, que sempre me acompanharam e apoiaram, em
especial a Marta pelo nimo dado.
Aos funcionrios do Departamento e Tcnicos, pelo apoio prestado.
minha famlia pelo apoio, pacincia, compreenso e incentivo sempre presentes.

Muito obrigado a todos.

Desenvolvimento de um mtodo de anlise de Pesticidas na Indstria Vitivincola

III

Resumo

Foi desenvolvido um mtodo de anlise de multi-resduos de pesticidas em vinhos brancos, por
microextrao em fase slida / cromatografia em fase gasosa / espectrometria de massa. A anlise foi
realizada utilizando cromatografia em fase gasosa com detector de espectrometria de massa com
ionizao por impacto electrnico e com aquisio de dados em Full Scan e MS/MS. Foi obtida boa
resoluo cromatogrfica para todos os compostos com um tempo total de anlise cromatogrfica de 35
minutos. Os pesticidas foram extrados das amostras por microextrao em fase slida usando uma fibra
polimrica de PDMS 100 m. A adio de um sal, temperatura e tempo de extrao foram os
parametros estudados para a otimizao de condies de extrao. Os melhores resultados foram
obtidos sem adio de sal, com 30 minutos de imerso, a 35 C. As curvas de calibrao resultaram em
respostas lineares para todos os pesticidas, para Full Scan e MS/MS. Os Limites de Quantificao
obtidos para Full Scan esto compreendidos entre 0,08-1,31 ppm, enquanto para MS/MS esto entre os
0,01-0,03 ppm, dependendo de cada composto.
A melhoria do mtodo de aquisio para MS/MS no foi efectuado para todos os pesticidas, devido a
uma avaria no instrumento GC-MS. A anlise de amostras de vinho branco, e a monitorizao dos nveis
de pesticidas durante o processo de formao do vinho, tambm no foi possvel.

Desenvolvimento de um mtodo de anlise de Pesticidas na Indstria Vitivincola

IV

Abstract

A multi-residue solid-phase microextraction / gas chromatography / mass spectrometry detection
method for pesticide analysis in white wines was developed. Analysis was performed using capillary gas
chromatography with electron impact mass spectrometry detection in Full Scan and MS/MS acquisition
mode. Good resolution of all compounds was achieved with a run time of 35 minutes. The pesticides
were extracted from the samples using solid-phase microextraction on a polymeric fiber PDMS 100 m.
Salt addiction, extraction temperature and extraction time were the parameters studied in order to
optimize the extraction conditions. The best results were obtained with no salt addiction, 30 minutes
immersion, at 35 C. Calibration curves of extracted standards gave linear responses for all the pesticides
under Full Scan and MS/MS acquisition mode. Quantification limits between 0,08-1,31 ppm were
obtained with Full Scan acquisition mode, and from 0,01 to 0,03 ppm under MS/MS acquisition mode,
depending on each pesticide analyte.
The improvement of the analysis parameters for the MS/MS acquisition mode was not achieved for all
pesticides, due to some technical problems related to the GC-MS instrument. Wine samples analysis and
the monitoring of pesticides levels during vinification were also not possible.

ndice Geral

V
Agradecimentos
II
Resumo.
III
Abstract...
IV
ndice....
V
Abreviaturas..
IX
ndice de Figuras..
X
ndice de Tabelas..
XV
Captulo I Introduo....
18
1. O Vinho..19
1.1. Definio... 19
1.2. Introduo Histrica. 19
1.3. Produo do Vinho. 20
1.3.1. Colheita..20
1.3.2. Esmagamento... 20
1.3.3. Fermentao. 20
1.3.4. Tratamentos Ps-Fermentao.21
1.4. Bebida. 21
1.4.1. Classificao dos Vinhos 21
1.4.2. Anlise de Rotina.. 22
1.4.3. Constituintes da Matriz.. 23
2. Os Pesticidas 26
2.1. Introduo...26
2.2. Doenas e Parasitas da Videira. 28
2.3. Aplicao e Degradao.. 29
2.4. Reviso Bibliogrfica dos Pesticidas de Interesse.. 30
Captulo II Tcnicas Analticas...
32
1. Tcnicas Analticas Utilizadas neste Trabalho. 33
1.1. Microectraco em Fase Slida..33
1.2. Cromatografia de Fase Gasosa. 35
ndice Geral

VI
1.2.1. Instrumentao...35
1.2.2. Eficincia de Separao..37
1.2.3. Interpretao de um Cromatograma..38
1.3. Espectrometria de Massa..39
1.4. Cromatografia de Fase Gasosa acoplada Espectrometria de Massa. 43
1.5. Curva de Calibrao...
44
2. Reviso Bibliogrfica.. 46
2.1. Extraco. 46
2.1.1. Extraco Lquido-Lquido.. 46
2.1.2. Extraco em Fase Slida...46
2.1.3. Microextraco em Fase Slida.. 46
2.2. Anlise e Deteco 55
2.3. Estudos de Casos. 56
Captulo III Parte Experimental
57
1. Reagentes. 58
2. Instrumentao. 59
3. Preparao de Solues. 60
3.1. Estudos Prvios.. 60
3.1.1. SPME-GC-MS.. 60
3.1.2. LC-MS. 61
3.2. Optimizao das Condies de Extraco.. 62
3.2.1. Estudo do Ajuste da Fora Inica.. 62
3.2.2. Estudo da Temperatura e Tempo de Extraco. 63
3.3. Anlise Quantitativa 64
3.3.1. Mtodo Full Scan. 64
3.3.2. Mtodo MS/MS.... 67
4. Procedimentos... 70
4.1. Acondicionamento e Limpeza Trmica da Fibra de Microextraco. 70
4.2. Extraco.70
4.2.1. Estudos prvios SPME-GC-MS e Estudo do Ajuste da Fora Inica. 70
4.2.2. Estudo da Temperatura de Extraco...70
ndice Geral

VII
4.2.3. Estudo do Tempo de Extraco.. 71
4.2.4. Anlise Quantitativa. 71
5. Condies de Anlise. 72
5.1. Estudos Prvios. 72
5.1.1. GC-MS.. 72
5.1.2. LC-MS. 72
5.2. Condies de Anlise utilizadas para a construo das Rectas de Calibrao em GC-
MS.. 73
5.2.1. Mtodo Full Scan 73
5.2.2. Mtodo AMD.. 74
5.2.3. Mtodo MS/MS.. 75
Captulo IV Apresentao e Discusso dos Resultados..
76
1. Condies Experimentais... 77
2. Pesticidas de Interesse.... 79
2.1. Pesticida Ciprodinil.. 79
2.2. Pesticida Metalaxil... 82
2.2.1. GC-MS.. 82
2.2.2. LC-MS.. 83
2.3. Pesticida Folpete.. 84
2.4. Pesticida Benalaxil... 85
2.5. Pesticida Iprovalicarbe... 87
2.6. Pesticida Pirimetanil... 89
2.7. Pesticida Dieldrine... 91
3. Estudos Prvios.. 93
3.1. SPME-GC-MS(PE).. 93
3.2. SPME-GC-MS(PI) .. 94
3.3. LC-MS. 95
3.4. Concluses.. 96
4. Optimizao das Condies de Extraco 97
4.1. Estudo do efeito da Fora Inica da Soluo.. 97
4.2. Estudo do efeito da Temperatura de Extraco. 98
ndice Geral

VIII
4.3. Estudo do efeito do Tempo de Extraco. 99
4.4. Concluses.. 100
5. Rectas de Calibrao. 102
5.1. Pesticida Ciprodinil... 104
5.2. Pesticida Metalaxil... 105
5.3. Pesticida Folpete.. 106
5.4. Pesticida Benalaxil 107
5.5. Pesticida Iprovalicarbe... 108
5.6. Pesticida Pirimetanil. 109
Captulo V Concluso..
110
Bibliografia..
113
Anexos..
118
Anexo I Frases de Risco.. 119
Anexo II Frases de Segurana .. 121
Anexo III - Frmulas Matemticas .. 123
Anexo IV Instrues de Funcionamento do GC-MS.. 125
Anexo V Instrues de Funcionamento do LC-MS. 128
Abreviaturas

IX

LMR Limite Mximo Recomendado
SPE Solid Phase Extraction Extraco em Fase Slida
SPME Solid Phase Microextraction Microextraco em Fase Slida
GC Gas Chromatography Cromatografia Gasosa
MS Mass Spectrometry Espectrometria de Massa
LC Liquid Chromatography Cromatografia Lquida
HPLC High Performance Liquid Chromatography - Cromatografia Lquida de Alta Performance
PDMS - Polidimetilsiloxano
PA - Poliacrilato
CW carvo activado grafitizado
DVB resina poliestireno-divinilbenzeno
ECD ElectroChemical Detector Detector ElectroQumico
NPD Nitrogen Phosphorous Detector Detector de Azoto e Fsforo
EI Electron Impact Impacto Electrnico
CI Chemical Ionization Ionizao Qumica
RPCI Reduced Pressure Chemical Ionization Ionizao Qumica a Presso Reduzida
APCI Atmosferic Pressure Chemical Ionization Ionizao Qumica Presso Atmosfrica
ECNI Electronic Capture with Negative Ionization Captura Electrnica com Ionizao Negativa
FI Field Ionization Ionizao de Campo
rpm rotaes por minuto

ndice de Figuras

X
Captulo I - Introduo

Figura 1. cidos presentes nos vinhos: cido sulfuroso (a), carbnico (b), tartrico (c), mlico
(d), ctrico (e), lctico (f), succnico (g) e actico (h)..
24
Figura 2. Aldedos e Cetonas presentes no vinho: Acetaldedo (a), Furfural (b), -damascenona
(c) e a -ionona (d)..... 24
Figura 3. Compostos fenlicos relevantes no vinho: cido benzico (a), cido vanlico (b), glico
(c), cido ferlico (d), cido cafeico (e), siringaldedo (f), quercetina (g) e catequina
(h).. 25
Captulo II Tcnicas Analticas

Figura 4. Dispositivo de Microextraco em Fase Slida.
33
Figura 5. Esquema de um Cromatgrafo de fase gasosa
36
Figura 6. Variao da Resoluo e do Tempo de Reteno com o Factor de Capacidade
38
Figura 7. Exemplo de um cromatograma obtido por anlise de uma mistura comercial de
pesticidas por Cromatografia Gasosa 39
Figura 8. Diagrama de um Espectrmetro de Massa que mostra os vrios componentes
funcionais.. 40
Figura 9. Diagrama dos componentes de uma fonte de ionizao por impacto electrnico. 40
Figura 10. Figura ilustrativa das superfcies internas de um analisador de massas do tipo Ion
Trap.. 41
Figura 11. Diagrama de estabilidade de mathieu para analisadores de massa do tipo Ion Trap.. 41
Figura 12. Exemplo de Espectro de Massa de um Pesticida
42
Figura 13. Esquema representativo dos 4 tipos de agitao estudados: agitao nula (a),
agitao magntica (b), vibrao da fibra (c) e clula de fluxo (d) 49
Figura 14. Esquema da montagem para uma clula de fluxo utilizada para efectuar o estudo do
efeito da agitao
50
Figura 15. Efeito da velocidade de agitao na extraco de pesticidas...
50
Figura 16. Variao das reas dos picos cromatogrficos para os pesticidas estudados com o
tempo de extraco 51
Figura 17. Influncia da quantidade de etanol na eficincia de extraco.
53
Figura 18. Efeito de diferentes concentraes de sal (ajustador da fora inica) na eficincia de
extraco.. 54
ndice de Figuras

XI

Captulo IV Apresentao e Discusso dos Resultados

Figura 19. Cromatograma obtido pela anlise do solvente utilizado durante este trabalho
(gua/Etanol 12 %) linha de base.. 77
Figura 20. Cromatograma obtido pela anlise de uma amostra de vinho com as condies
experimentais iniciais.. 78
Figura 21. Cromatograma obtido pela anlise de uma amostra de vinho com as condies
experimentais melhoradas. 78
Figura 22. Cromatograma de um vinho fortificado com Ciprodinil, onde inicialmente se
identificou o mesmo pesticida (GC-MS Full)....... 80
Figura 23. Espectro de massa obtido para o composto eludo no pico anteriormente destacado
(Figura 22.) Ciprodinil (cima); e Espectro de massa presente na Bilioteca de
espectros de massa para omesmo composto (baixo).. 80
Figura 24. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Ciprodinil...
80
Figura 25. Cromatograma de um vinho fortificado com Ciprodinil, onde inicialmente se
identificou o mesmo pesticida (GC-MS/MS).. 81
(Figura 25.) Ciprodinil. 81
Figura 27. Mecanismo de Fragmentao sugerido para os novos picos obtidos por MS/MS para
o composto Ciprodinil....
81
Figura 28. Cromatograma de um vinho fortificado com Metalaxil, onde inicialmente se identificou
o mesmo pesticida (GC-MS Full).... 82
(Figura 28.) Metalaxil (cima); e Espectro de massa presente na Biblioteca de
espectros de massa para o mesmo composto (baixo)..
82
Figura 30. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Metalaxil.
82
Figura 31. Cromatograma de um vinho fortificado com Metalaxil, onde inicialmente se identificou
o mesmo pesticida (GC-MS/MS).. 83
(Figura 32.) Metalaxil.. 83
Figura 33. Mecanismo de Fragmentao sugerido para alguns dos novos picos obtidos por
MS/MS para o composto Metalaxil....
83
ndice de Figuras

XII
Figura 34. Cromatograma de uma mistura comercial de pesticidas com um pico destacado que
foi identificado como pertencendo ao pesticida Metalaxil. 84
(Figura 34.) Metalaxil.. 84
Figura 36. Cromatograma de um vinho fortificado com Folpete, onde inicialmente se identificou o
mesmo pesticida (GC-MS Full).. 84
(Figura 36.) Folpete (cima); e Espectro de massa presente na Biblioteca de
84
Figura 38. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Folpete......
85
Figura 39. Cromatograma de um vinho fortificado com Folpete, onde inicialmente se identificou o
mesmo pesticida (GC-MS/MS).. 85
(Figura 40.) Folpete. 85
Figura 41. Cromatograma de um vinho fortificado com Benalaxil, onde inicialmente se identificou
o mesmo pesticida (GC-MS Full).. 86
(Figura 41.) Benalaxil (cima); e Espectro de massa presente na Biblioteca de
86
Figura 43. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Benalaxil....
86
Figura 44. Cromatograma de um vinho fortificado com Benalaxil, onde inicialmente se identificou
o mesmo pesticida (GC-MS/MS)... 87
(Figura 44.) Benalaxil.. 87
Figura 46. Mecanismo de Fragmentao sugerido para um dos novos picos obtidos por MS/MS
para o composto Benalaxil..... 87
Figura 47. Cromatograma de um vinho fortificado com Iprovalicarbe, onde inicialmente se
identificou o mesmo pesticida (GC-MS Full).. 88
(Figura 47.) Iprovalicarbe.. 88
Figura 49. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Iprovalicarbe.... 88
Figura 50. Cromatograma de um vinho fortificado com Iprovalicarbe, onde inicialmente se
identificou o mesmo pesticida (GC-MS/MS).. 89
ndice de Figuras

XIII
(Figura 50.) Iprovalicarbe.. 89
Figura 52. Mecanismo de Fragmentao sugerido para um dos novos picos obtidos por MS/MS
para o composto Iprovalicarbe.... 89
Figura 53. Cromatograma de um vinho fortificado com Pirimetanil, onde inicialmente se
identificou o mesmo pesticida (GC-MS Full).. 90
(Figura 53.) Pirimetanil.. 90
Figura 55. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Pirimetanil. 90
Figura 56. Cromatograma de um vinho fortificado com Pirimetanil, onde inicialmente se
identificou o mesmo pesticida (GC-MS/MS). 90
(Figura 56.) Pirimetanil.. 90
Figura 58. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o pico base obtido por MS/MS para o
composto Pirimetanil.. 91
Figura 59. Cromatograma de uma soluo padro de pesticida Dieldrine (GC-MS Full).. 91
(Figura 59.) Dieldrine (cima); e Espectro de massa presente na Biblioteca de
esprectros de massa para o mesmo composto (baixo).... 91
Figura 61. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o pico base obtido para o composto
Dieldrine 92
Figura 62. Recta de Calibrao para o pesticida Metalaxil construda pelo mtodo SPME-GC-
MS(PE).... 93
Figura 63. Recta de Calibrao para o pesticida Metalaxil construda pelo mtodo SPME-GC-
MS(PI)... 94
Figura 64. Recta de Calibrao para o pesticida Metalaxil construda pelo mtodo LC-MS(PE).... 95
Figura 65. Resultados obtidos no estudo do efeito da Fora Inica da soluo para o conjunto de
pesticidas. 98
Figura 66. Resultados obtidos no estudo do efeito da temperatura de extraco para o conjunto
de pesticidas.... 99
Figura 67. Resultados obtidos no estudo do efeito de tempo de extraco para o conjunto de
pesticidas. 100
Figura 68. Rectas de calibrao obtida para o pesticida Ciprodinil pelo mtodo SPME-GC-
MS(PE).. 104
ndice de Figuras

XIV
Figura 69. Recta de calibrao obtida para o pesticida Metalaxil pelo mtodo SPME-GC-MS(PE)
(Full Scan)
105
Figura 70. Recta de calibrao obtida para o pesticida Folpete pelo mtodo SPME-GC-
MS(PE)..
106
Figura 71. Recta de calibrao obtida para o pesticida Benalaxil pelo mtodo SPME-GC-
MS(PE)..
107
Figura 72. Recta de calibrao obtida para o pesticida Iprovalicarbe pelo mtodo SPME-GC-
MS(PE) (Full Scan)...
108
Figura 73. Recta de calibrao obtida para o pesticida Pirimetanil pelo mtodo SPME-GC-
MS(PE).....
109
ndice de Tabelas

XV
Captulo I - Introduo

Tabela 1. Caractersticas dos compostos de aco pesticidas utilizados neste trabalho.. 31
Captulo II Tcnicas Analticas

Tabela 2. Guia para a quantificao de analitos em SPME... 35
Tabela 3. Para cada pesticida, os valores representam a razo das reas dos picos obtidos
com fibras de revestimentos polimricos diferentes (extraco efectuada por imerso
directa da fibra em 3 mL de uma soluo padro 100 g/L em gua, em agitao
magntica, durante 20 minutos) e as reas do pico correspondente obtido por
injeco directa de 1 L de uma soluo padro 100 g/L em acetona 47
Tabela 4. Variao das reas dos picos obtidas com revestimentos de diferentes espessuras,
nas condies acima indicadas.. 48
Tabela 5. Tempos de equilbrio obtidos (min) para os pesticidas estudados sob diferentes
condies de agitao.... 49
Tabela 6. Variao das reas dos picos cromatogrficos para os pesticidas estudados com a
temperatura de extraco.. 52
Tabela 7. Resumo de alguns mtodos reportados para a anlise de multi-resduos de
pesticidas em vinhos. 56
Tabela 8. Caractersticas dos Pesticidas estudados, dos compostos e solventes utilizados 58
Tabela 9. Caractersticas da Soluo-Me Metalaxil para estudos prvios por GC-MS.. 60
Tabela 10. Preparao das Solues Padro para estudos prvios por GC-MS.. 61
Tabela 11. Caractersticas da Soluo-Me de Metalaxil para estudos prvios por LC-MS. 61
Tabela 12. Caractersticas das Solues Padro de Metalaxil para estudos prvios por LC-MS.. 62
Tabela 13. Caractersticas das solues padro preparadas a partir de padres e preparados
comerciais de pesticidas na forma de slido para o estudo do Ajuste da Fora
Inica.. 62
Tabela 14. Caractersticas das solues padro preparadas a partir de preparados comerciais
de pesticidas na forma de lquido para o estudo do Ajuste da Fora Inica.. 63
ndice de Tabelas

XVI
comerciais de pesticidas na forma de slido para o estudo da Temperatura e do
Tempo de Extraco... 64
Tabela 16. Caractersticas das solues padro preparadas a partir de preparados comerciais
de pesticidas na forma de lquido para o estudo da Temperatura e do Tempo de
Extraco.... 64
Tabela 17. Preparao das Solues-Me dos Pesticidas em estudo para a construo das
Rectas de Calibrao pelo mtodo Full Scan. 65
Tabela 18. Preparao das Solues Padro do Pesticida Ciprodinil para construo da recta de
calibrao pelo mtodo Full Scan. 65
Tabela 19. Preparao das Solues Padro do Pesticida Metalaxil para construo da recta de
calibrao pelo mtodo Full Scan.. 65
Tabela 20. Preparao das Solues Padro do Pesticida Folpete para construo da recta de
Tabela 21. Preparao das Solues Padro do Pesticida Benalaxil para construo da recta de
Tabela 22. Preparao das Solues Padro do Pesticida Iprovalicarbe para construo da recta
de calibrao pelo mtodo Full Scan..... 66
Tabela 23. Preparao das Solues Padro do Pesticida Pirimetanil para construo da recta
de calibrao pelo mtodo Full Scan.... 67
Tabela 24. Preparao das Solues-Me dos Pesticidas em estudo para a construo das
Rectas de Calibrao pelo mtodo MS/MS.... 67
calibrao pelo mtodo MS/MS 68
Tabela 28. Preparao das Solues Padro do Pesticida Pirimetanil para construo da recta
de calibrao pelo mtodo MS/MS.... 69
ndice de Tabelas

XVII
Tabela 29. Parmetros de identificao utilizados nas anlises efectuadas pelo mtodo Full
Scan... 74
Tabela 30. Parmetros escolhidos para a optimizao das condies de ionizao para as
anlises a efectuar pelo mtodo MS/MS.. 74
Tabela 31. Parmetros escolhidos para as anlises efectuadas pelo mtodo MS/MS. 75
Tabela 32. Parmetros de identificao utilizados nas anlises efectuadas pelo mtodo MS/MS. 75
Captulo IV Apresentao e Discusso dos Resultados

Tabela 33. Condies de Anlise iniciais pelo mtodo SPME-GC-MS... 77
Tabela 34. Condies de Anlise melhoradas pelo mtodo SPME-GC-MS..... 78
Tabela 35. Resultados obtidos no estudo prvio do pesticida Metalaxil por SPME-GC-MS(PE)... 93
Tabela 36. Resultados obtidos no estudo prvio do pesticida Metalaxil por SPME-GC-MS(PI)....... 94
Tabela 37. Resultados obtidos no estudo prvio do pesticida Metalaxil por LC-MS(PE). 95
Tabela 38. Resultados obtidos no estudo do efeito da Fora Inica da soluo para cada
pesticida... 97
Tabela 39. Resultados obtidos no estudo do efeito da temperatura de extraco para cada
pesticida. 98
Tabela 40. Resultados obtidos no estudo do efeito do tempo de extraco para cada pesticida... 99
Tabela 41. Concentrao dos pesticidas de interesse presente nas solues padro analisadas
por GC-MS Full e respectiva mdia das reas dos picos cromatogrficos obtidos (2
rplicas para o pesticida Benalaxil e 3 rplicas para os restantes).. 102
Tabela 42. Concentrao dos pesticidas de interesse presente nas solues padro analisadas
por GC-MS/MS e respectiva mdia das reas dos picos cromatogrficos obtidos (3
rplicas). 103

Captulo I
Introduo

Introduo

19
1. O Vinho

1.1. Definio

O vinho o produto obtido pela vinificao/fermentao alcolica, total ou parcial de uvas frescas,
provenientes de vrios tipos de castas (Vitis Vinfera), cujos bagos so esmagados, prensados ou
transformados por outros processos tecnolgicos permitidos por lei. composto de: gua, lcool
etlico, cidos orgnicos fixos (cido tartrico), cidos orgnicos volteis (cido actico), sais, glicerina
(que confere a macieza e o aveludado), taninos, matria corante, matrias minerais e azotadas, e
vitaminas. Bebida adequada ao consumo, apresenta aromas frutados e perfumados
[1]
.
Na Unio Europeia, o vinho , legalmente, definido como o produto obtido, exclusivamente, por
fermentao parcial ou total de uvas frescas, inteiras ou esmagadas ou de mostos
[2]
.
A palavra vinho tem origem etimolgica no latim, vinum, que tanto pode significar "vinho" como
"videira", e , genericamente, uma bebida alcolica produzida por fermentao do sumo de uva
[3]
.

1.2. Introduo Histrica
[4, 5]

O vinho possui uma longnqua importncia histrica e remonta a diversos perodos da humanidade. Do
ponto de vista histrico, impossvel precisar a sua origem, pois o vinho nasceu antes da escrita. Os
enlogos dizem que a bebida surgiu por acaso, talvez por um punhado de uvas amassadas esquecidas
num recipiente, que sofreram posteriormente os efeitos da fermentao. Mas o cultivo das videiras
para a produo do vinho s foi possvel aquando da Sedentarizao.
A introduo da produo vincola em Portugal continua encoberta por questes ainda no resolvidas
em termos de investigao. A primeira referncia produo vincola em Portugal de 989, segundo o
Livro de Datas do Convento de Fies, sendo a regio Douro a mais antiga regio demarcada no mundo.
Os vinhos portugueses sempre se caracterizaram por uma grande variedade de uvas autctones,
devido s diferenas de solo e clima, o que lhes confere caractersticas nicas para cada regio.
Um dos vinhos portugueses mais clebres e de grande exportao o Vinho do Porto.

Introduo

20
1.3. Produo de Vinho

1.3.1. Colheita
[6]

A qualidade da uva tem enorme influncia sobre o produto final, o vinho. Por isso a colheita deve ser
realizada no tempo certo. Uma colheita antes do tempo resulta em um vinho desequilibrado, com baixa
concentrao de acar e, consequentemente, de lcool. Se a colheita for tardia, a uva produzir um
vinho rico em lcool, mas com pouca acidez. Os factores fundamentais que influem na colheita so o
clima (temperatura, humidade, etc), e o solo.

1.3.2. Esmagamento
[6]

O esmagamento das uvas era feito com os ps, tradio mantida at hoje em algumas regies. O
esmagamento da uva produzir uma mistura de sumo, granhas, pelcula e polpa que ser chamado de
mosto.

1.3.3. Fermentao
[7]

a parte mais complexa e importante do processo da produo do vinho. Existem vrias etapas na
fermentao: a fermentao alcolica/tumultuosa, que dura poucos dias, e onde ocorre grande
libertao de dixido de carbono e o aumento da temperatura que por sua vez acelera a transformao
do acar em lcool; e a fermentao malolctica/lenta, onde esta comea a diminuir de intensidade
devido diminuio da presena do acar, e onde se verifica a diminuio da acidez.

Introduo

21
1.3.4. Tratamentos Ps-Fermentao
[7, 8]

Todos os vinhos so sujeitos a um perodo de maturao antes de serem engarrafados. Este processo
envolve a remoo de partculas e matria coloidal, e o vinho sofre uma srie de mudanas para
manter ou melhorar os seus atributos sensoriais. Os ajustamentos do vinho tentam corrigir algumas
deficincias encontradas nas uvas e problemas que se desenvolveram na fermentao:
o Acidez e pH: A correco da acidez e do pH pode ser feita em qualquer altura durante a
vinificao; no entanto, obtm-se melhores resultados aps a fermentao. O uso do cido
tartrico tem um efeito significativo no pH, enquanto o cido mlico afecta mais a acidez total.
o Acar: Os vinhos podem ser adoados pela adio de mosto concentrado, mas s em certas
circunstncias.
o Aroma: Muitos aromas da uva (terpenos, norisoprenides, fenis volteis) encontram-se em
complexos glicosdicos no volteis. Estes podem ser libertados por hidrlise cida ou enzimtica.
o Cor: Algumas variedades possuem baixo teor em taninos, o que torna necessrio a adio de
taninos enolgicos para formarem ligaes com as antocianas e estabilizarem a cor.

1.4. Bebida

1.4.1. Classificao de Vinhos
[8]

Existem cinco tipos distintos de vinhos:
o os vinhos tintos, que podem ser obtidos atravs das uvas tintas ou das tintureiras (aquelas em que
a polpa tambm possui pigmentos);
o os brancos, que podem ser obtidos atravs de uvas brancas ou de uvas tintas desde que as
cascas dessas uvas no entrem em contacto com o mosto e que essas no sejam tintureiras;
o os ross, que podem ser feitos de duas maneiras: misturando-se o vinho tinto com o branco ou
diminuindo o tempo de macerao (contacto do mosto com as cascas) durante a vinificao do
vinho tinto.
Introduo

22
o os espumantes, so vinhos que passam por uma segunda fermentao alcolica, que pode ser na
garrafa, chamado de mtodo tradicional, ou em auto-claves (tanques isobaromtricos). Ambas as
formas de vinificao fazem a fermentao em recipiente fechado incorporando assim dixido de
carbono ao lquido e dando origem s borbulhas.
o e os vinhos fortificados, que so aqueles que a fermentao alcolica interrompida pela adio
de aguardente. De acordo com o momento da interrupo, e da uva que est sendo utilizada,
ficar mais ou menos doce. O grau alcolico final dos vinhos fortificados fica entre 19-22 % vol. Os
mais famosos so o Vinho do Porto (Portugal), o Vinho da Madeira (Portugal), o Xerez (Espanha) e
o Marsala (Siclia).
Em Portugal existe um tipo de vinho especfico, o Vinho Verde, que pode ser tinto ou branco, mas
devido sua maior acidez, entre outras caractersticas, pode ser considerado como uma categoria
parte.

1.4.2. Anlises de Rotina
[9, 10]

A anlise de uvas e vinhos, assim como de mostos, um processo de rotina nas empresas de hoje. A
partir destas anlises tenta-se prever qual a melhor altura para fazer a vindima, controla-se a produo
de um vinho, procede-se correco de algum desequilbrio num constituinte do mosto ou vinho, faz-
se o controlo de qualidade de um vinho ou avalia-se a salubridade do produto. Todos estes passos so
importantes e por isso uma empresa deve ter um laboratrio de anlise, assim como qualquer
vitivinicultor deve ter o seu pequeno laboratrio para que possa avaliar como decorre a vinificao.
Assim, as anlises fsicas, qumicas, microbiolgicas e sensoriais tornaram-se fundamentais para a
indstria vnicola. Com estes processos tenta-se aumentar a qualidade do produto, reduzir os
desperdcios e conservar o vinho por um perodo de tempo mais extenso. As anlises so realizadas
desde o esmagamento e prensagem da uva, durante toda a fermentao e todos os processos
subsequentes at ao engarrafamento, e mesmo depois, durante o envelhecimento do vinho. Os
propsitos da realizao das anlises so diversos, podendo ter o intuito de detectar falsificaes ou
fraudes, detectar a presena de produtos proibidos, determinar quantidades de alguns componentes de
forma a verificar se esto dentro do regime legal imposto ou ento para que se possa efectuar uma
correco e, finalmente, para avaliar a qualidade geral do vinho.
Diversos constituintes, tais como o etanol, o dixido de enxofre ou cidos, esto sujeitos a um controlo
legal e portanto, as respectivas determinaes so bastante frequentes. J a componente cida de um
Introduo

23
vinho pode ser alvo de correces durante a vinificao (tanto para acidificar como para desacidificar),
pelo que as determinaes dos constituintes cidos tm de ser realizadas para detectar qualquer
desequilbrio. Outro componente que pode ser tambm alvo de correces o acar do vinho
(sacarose).
Finalmente, a qualidade geral de um vinho avaliada por anlises dos quatro tipos acima referidos:
fsicas, qumicas, microbiolgicas e sensoriais. Isto porque o conceito "qualidade" envolve diferentes
aspectos, tais como o aspecto visual do vinho, o paladar, o aroma ou at relativamente capacidade
de conservao e envelhecimento durante um longo perodo de tempo.
A determinao de pesticidas em vinhos, assim como em outros produtos alimentares, enquadra-se na
avaliao da presena de produtos proibidos. A sua proibio deve-se suposio ou comprovao da
toxicidade deste tipo de produtos para a sade dos seres vivos. Para isso existem limites mximos de
resduos legalmente estabelecidos para os pesticidas. Eles vo variando consoante os produtos
alimentares em questo. Por outro lado, a aplicao dos pesticidas nas culturas est sujeita a medidas
preventivas para que no permaneam nos produtos alimentares at ao momento de estes serem
consumidos.

1.4.3. Constituintes da Matriz
[7, 8]

A matriz do vinho complexa, uma vez que este constitudo por uma variedade muito grande de
compostos.
O constituinte predominante das uvas e do vinho a gua, e assim sendo, esta estabelece as
caractersticas bsicas do vinho, assim como, o facto de serem as substncias hidrossolveis
constituintes do vinho aquelas que tm um papel mais significativo.
No vinho, tambm, esto presentes lcoois. O etanol o lcool mais importante, e embora esteja
presente em pequenas quantidades na uva, a fonte primria deste composto encontra-se na
fermentao. Sob condies normais de fermentao, a percentagem de etanol no vinho pode ser
acumulada at 14-15 %, no entanto, nveis superiores podem ser atingidos atravs da adio de acar
durante a fermentao. Outro lcool presente no vinho o metanol, no entanto, este encontra-se
presente em quantidades muito pequenas. Mesmo assim, este composto alvo de preocupao devido
sua transformao em formaldedo, e posteriormente, em cido frmico (substncias txicas para o
sistema nervoso central). A quantidade de metanol presente no vinho quando este foi produzido
legitimamente, no atinge valores que depois do seu metabolismo originem nveis txicos de
formaldedo e cido frmico.
Introduo

24
No que respeita aos cidos, os mais importantes so os cidos tartrico, mlico e ctrico (provenientes
da uva), os cidos lctico, succnico e actico (provenientes da fermentao) e os cidos carbnico e
sulfuroso (provenientes dos gases dissolvidos).

S
OH O
OH
OH HO
O
HO
OH
O
OH
OH
O
HO
OH
O OH
O
OH
O
HO
OH
O
O
OH
O
OH
(a) (b) (c)
(g) (h)
(d)
HO
OH
O
O
OH
O OH
(f) (e)

Figura 1. cidos presentes nos vinhos: cido sulfuroso (a), carbnico (b), tartrico (c), mlico (d), ctrico (e),
lctico (f), succnico (g) e actico (h).

Por reaco dos cidos com os lcoois, formam-se os steres. Os steres mais comuns presentes no
vinho so os derivados do cido actico e do etanol.
As uvas produzem alguns aldedos importantes, como o acetaldedo, que o aldedo que mais se
encontra no vinho ( 90 % dos aldedos constituintes), e um dos produtos secundrios da
fermentao. Outros aldedos presentes so o furfural e aldedos fenlicos.
Poucas so as cetonas encontradas nas uvas, mas estas resistem fermentao.

OH
O
O
O
O
O
(a) (b) (c) (d)

Figura 2. Aldedos e Cetonas presentes no vinho: Acetaldedo (a), Furfural (b), -damascenona (c) e a -ionona
(d).

Os hidrocarbonetos so pouco solveis em gua, logo eles no tm influncia directa no vinho. No
entanto, produtos da degradao dos hidrocarbonetos podem produzir aromas importantes.
Introduo

25
Os fenis so compostos de muita importncia para as caractersticas de qualidade do vinho tinto, e,
tambm, do branco, embora neste ltimo, estes compostos estejam presentes em menor quantidade.
Podem afectar a aparncia do vinho, o gosto, o aroma e as propriedades anti-microbianas. Os
compostos mais encontrados so: o cido benzico, cido vanlico, cido glico, cido ferlico, cido
cafeico, benzaldedo, vanilina e siringaldedo (do tipo no flavonides); quercetina, antocianinas e
catequina (do tipo flavonides).

OH
O
O OH
O
OH
O OH
HO
OH
OH
O
O
O
HO
HO
OH
O
(a) (c) (d) (e) (b)
O
O
OH
O
O HO
OH O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
HO
(f) (h) (g)

Figura 3. Compostos fenlicos relevantes no vinho: cido benzico (a), cido vanlico (b), glico (c), cido
ferlico (d), cido cafeico (e), siringaldedo (f), quercetina (g) e catequina (h).

Muitos compostos nitrogenados so encontrados nas uvas e nos vinhos. Estes compostos incluem
formas inorgnicas como a amnia e nitratos, e formas orgnicas como aminas, amidas, aminocidos,
protenas e cidos nucleicos
[8]
.
No que respeita aos compostos sulfurados, os mais significativos so os sulfitos inorgnicos, a cistena,
a tiamina e a biotina
[7]
.
O vinho tambm contm gases dissolvidos, sendo os mais importantes: o dixido de carbono que se
gera durante o metabolismo das leveduras, e se liberta durante a fermentao; e o oxignio que s
comea a aparecer em concentraes significativas durante o processo de esmagamento das uvas, e
possibilita as leveduras de sintetizar compostos essenciais como cidos gordos insaturados. Outro gs
dissolvido presente o dixido de enxofre
[7]
.
Muitos elementos minerais so encontrados nas uvas e nos vinhos como o potssio, o enxofre, o
clcio, o cloro e o sdio
[7]
.
Introduo

26
2. Os Pesticidas

2.1. Introduo

Os pesticidas, so substncias ou misturas de substncias que tm como objectivo impedir, destruir,
repelir ou mitigar qualquer praga. Um pesticida pode ser uma substncia de natureza qumica ou um
agente biolgico (como um vrus ou uma bactria) que actua sobre as pragas que estejam a destruir
uma plantao, espalhando doenas, incomodando pessoas, etc. utilizada contra diversas formas de
seres vivos, tais como: insectos, ervas daninhas, moluscos, pssaros, mamferos, peixes e micrbios.
No so necessariamente substncias venenosas, porm quase sempre so txicas
[11]
.

Os pesticidas so classificados de acordo com as pragas que eles atacam: Acaricidas, para o controle de
caros; Bactericidas, para o controle de bactrias; Fungicidas, para o controle de fungos; Herbicidas,
para o controle de ervas daninhas; Insecticidas para o controle de insectos; Nematicidas, para o controle
de vermes; Rodenticidas, para o controle de ratos e outros tipos de roedores; e Moluscicidas, para o
controle de moluscos. Eles tambm podem ser classificados em: orgnicos de sntese, como
carbamatos, nitrogenados, clorados, fosforados e clorofosforados; inorgnicos, base de arsnio, tlio,
brio, azoto, fsforo, cdmio, ferro, selnio, chumbo, cobre, mercrio e zinco; e botnicos: base de
nicotina, piretrina, sabadina e rotenona.
[12, 13]
Anualmente, cerca de 30-50 % da produo mundial de alimentos destruda ou consumida por
pragas (insectos, mamferos, aves, bactrias, fungos, vrus e ervas daninhas). As maiores perdas
ocorrem nas regies tropicais e subtropicais, onde os agricultores muitas vezes produzem mais de uma
colheita por ano, o que pode permitir um grande aumento populacional de pragas; e onde os Invernos
no so rigorosos, no sendo portanto um factor que limite o nmero de espcimes que sobrevive a
essa estao. Mesmo nos pases mais avanados tecnologicamente, cerca de 40 % da produo
perdida por causa da aco das mais diversas pestes, apesar das enormes quantias gastas para o
controlo dessas pragas. A necessidade de proteger as colheitas de ataques de pragas vem desde os
tempos em que o Homem iniciou o cultivo do solo. Inicialmente porque necessitava do alimento, e mais
recentemente tambm por razes econmicas. Nesse sentido, comeou a procurar-se substncias e
prticas agrcolas que diminussem ou at eliminassem os danos causados por essas pragas.
Na segunda metade do sculo XX deu-se a grande exploso da utilizao de pesticidas na agricultura. A
descoberta dos pesticidas organoclorados trouxe riqueza, por terem custos de produo relativamente
baixos que permitiu a sua utilizao em massa, sem pensar nas consequncias ambientais. Tambm a
introduo de novas filosofias de cultivo trouxeram diferentes vises sobre a aplicao de pesticidas.
Assim, a chamada Revoluo Verde, iniciada nos anos 40, trouxe novas polticas agrcolas, que visavam
Introduo

27
a produo intensiva de alimentos, sem olhar a meios. Uma das vertentes dessa filosofia era a aplicao
de grandes quantidades de produtos qumicos de forma a no permitir a interveno das pragas nas
culturas. No entanto, verificou-se um acrscimo de ataques das pestes, nomeadamente, no cultivo de
campos sem rotao, e aps utilizao intensiva de fertilizantes e da rega.
Ao longo do tempo, o nmero de pesticidas que se encontram disponveis para utilizao tem vindo a
aumentar uma vez que os novos compostos so de aplicao cada vez mais especfica. O controlo dos
pesticidas em alimentos muito importante e tem recebido muita ateno nos ltimos anos devido ao
uso incorrecto e excessivo destas substncias.
A utilizao comum de pesticidas na produo de uvas tem levado presena de resduos destas
substncias em vinhos comercialmente disponveis para consumo pblico. Actualmente, existe um
grande interesse em determinar resduos de pesticidas presentes em vinhos para controlo de qualidade
destes, pois podem parar ou diminuir a velocidade de fermentao, ter um efeito negativo no
metabolismo das leveduras, e ser potencialmente perigosos para a sade pblica.
aceite que caso se respeitem as dosagens de pesticidas permitidas e o intervalo mnimo entre a
aplicao destas substncias e a colheita das uvas, a quantidade de resduos de pesticidas vai diminuir
de tal modo que os nveis presentes no vinho comercialmente disponvel que so esperados so
inferiores queles que podem provocar os problemas j indicados. Contudo, nem sempre as normas so
respeitadas e torna-se necessrio monitorizar os nveis de resduos de pesticidas em vinhos.
Para um controlo eficaz, a quantificao de resduos presente nos vinhos comparada com os limites
mximos de resduos legislados (LMR) para cada substncia. Esses LMR, tanto quanto o conhecimento
cientfico permite afirmar, asseguram, com alguma segurana, a sade do consumidor e a qualidade do
vinho.
Assim, torna-se necessrio o desenvolvimento de mtodos analticos apropriados para a anlise de multi-
resduos de pesticidas em vinhos
[14, 15]
.

Introduo

28
2.2. Doenas e Parasitas da Videira
[12]

Nesta parte feita uma breve descrio de algumas doenas e parasitas mais comuns da videira e que
podem ser tratadas com a aplicao dos pesticidas que so objecto de estudo neste trabalho.
o Aranhio vermelho: So minsculos acardeos parasitas da vinha que provocam importantes
estragos. Os ovos deste parasita abrem e libertam lavas na Primavera, que sofrem vrias
transformaes em 5 a 20 dias, para chegarem ao estado adulto. Larvas e seres adultos atacam as
folhas para se alimentarem com o suco celular; o desenvolvimento da vegetao travado, e por
vezes d-se o desavinho. A folhagem fica com um aspecto geral cinzento-plmbeo. Os acardeos,
visveis na face inferior, picam as folhas. Eles prejudicam a fotossntese, activam a respirao e
causam um murchar prematuro da folhagem, e uma m maturao das uvas.
o Cigarrinha Verde ou Cicadela: Esta praga era, at aos anos 80, ocasional em algumas vinhas do Sul
do pas, contudo, nos ltimos anos tem-se expandido a outras regies vincolas com grande
incidncia. As picadas que estes insectos causam na pgina inferior das folhas, liberta uma saliva
txica para o seu interior interrompendo a circulao da seiva. As folhas enrolam para a pgina
inferior, tomam uma cor amarelada nas castas brancas e avermelhada nas castas tintas, ficando
apenas verdes as nervuras.
o Mldio da videira: O mldio uma doena originria da Amrica, e que causado por um fungo,
sendo h um sculo uma das principais doenas da vinha, que ataca todos os rgos verdes da
videira. A doena manifesta-se nas folhas pelo aparecimento de manchas translcidas e oleosas na
pgina superior. Nas castas tintas as folhas tomam uma colorao avermelhada. medida que a
doena avana, acabam por aparecer necroses nas folhas. Durante a florao pode ocorrer a
destruio das inflorescncias. Os cachos e os bagos evidenciam tambm a doena por se
tornarem castanhos e acabando por engelhar, secar e quebrar ao mnimo contacto. A queda das
folhas afecta o teor de acar das uvas.
o Podrido cinzenta: causada por um fungo que pode afectar todos os rgos herbceos da videira,
mas nos cachos que se verifica maiores danos. Os maiores prejuzos ocorrem nos perodos da
florao e do fecho dos cachos at vindima. Estes traduzem-se em perdas quantitativas e
qualitativas da produo. Afecta tambm a produo de plantas de videira nos viveiros. As folhas
atacadas apresentam manchas vermelho-acastanhadas, com o aspecto de queimaduras. Estes
sintomas so visveis na altura da poda. Os cachos so sensveis doena em todas as fases do
seu desenvolvimento.
o Flavescncia Dourada
[16]
: Trata-se de uma doena especfica da vinha causada por um fitoplasma
originria da Amrica do Norte, e propaga-se por meio de uma cicadela. Na Europa, esta doena foi,
Introduo

29
primeiramente identificada em Frana, tendo, posteriormente, progredido para outros pases. Esta
doena provoca descolorao das folhas com enrolamento para a pgina inferior acompanhado de
amarelecimento nas castas brancas e vermelho nas castas tintas e as folhas tornam-se duras e
quebradias. Tem como consequncia a perda de produo e de qualidade, pois os cachos das
videiras afectadas secam ou no amadurecem.

2.3. Aplicao e Degradao
[17, 18, 19, 20]

A prtica mais comum de aplicao de pesticidas seguir um protocolo estabelecido de modo a que o
agricultor aplique os produtos fitoqumicos sem que as pragas tenham realmente afectado as culturas,
tentando actuar preventivamente. As quantidades de produtos aplicados so variveis, o que leva a
desperdcios financeiros porque a aplicao dos produtos pode ser desnecessria e originar problemas
ambientais. Esta filosofia de aplicao no a mais acertada pois no previne o aparecimento de
pragas, exige dispndio financeiro desnecessrio, e aumenta a probabilidade de contaminao de solos
e culturas.
A Revoluo Verde, outra filosofia de aplicao, um processo tecnolgico que tem como objectivo o
aumento da eficincia dos processos agrcolas para aumentar a produtividade. As tecnologias
introduzidas so de duas reas distintas: o cultivo de novas variedades de plantas e o desenvolvimento
de novas tcnicas agrcolas. As tcnicas desenvolvidas foram o uso extensivo de fertilizantes qumicos,
irrigao, o uso de maquinaria pesada, e o uso de pesticidas. Obteve-se um grande sucesso com estas
tcnicas, uma vez que a agricultura conseguia ultrapassar o crescimento da populao. No entanto, tem
vindo a ser substituda pela agricultura integrada ou pela agricultura orgnica ou biolgica porque havia
muita perda de biodiversidade e da qualidade alimentar, dependncia de combustveis fsseis, poluio
e degradao dos solos.
A filosofia de aplicao que, actualmente, se verifica ser mais eficaz e menos controversa a Proteco
Integrada. Esta tem como objectivo a utilizao de mtodos seguros, minimizando os efeitos
secundrios, e a diminuio do uso de pesticidas, conciliando as exigncias econmicas, ecolgicas e
toxicolgicas de uma forma social e ambientalmente sustentvel. Para alm de fornecer informaes
sobre a aplicao dos produtos fitoqumicos, tambm informa sobre: os procedimentos para a instalao
e para a fase de produo de uma vinha, focando aspectos climatricos, fertilizao e aplicao de
outros produtos correctores de deficincias; seleco dos cultivadores; manuteno do solo; poda e
conduo da vinha; intervenes necessrias na vinha; e rega. A tcnica assenta em 5 pontos principais:
a preveno cultural para garantir o bom desenvolvimento fitossanitrio das culturas, como a correcta
Introduo

30
localizao da plantao, a seleco do material vegetativo utilizado, e aplicao de fertilizaes
equilibradas; o diagnstico da situao, como a correcta identificao das pestes quer seja fungos,
doenas ou infestantes; a estimativa de risco, que engloba a avaliao quantitativa das pestes e a anlise
da influncia de certos factores nos prejuzos que possam causar; o nvel econmico de ataque, que se
define como a intensidade de ataque de uma peste a que se deve aplicar medidas limitativas ou de
combate para impedir que se corra o risco de prejuzos; e a seleco dos meios de proteco, que
implica o conhecimento correcto das caractersticas dos produtos, nomeadamente a sua aco sobre as
pestes, doses de utilizao, pocas de aplicao, esquemas de tratamento, toxicidade, persistncia e
intervalos de segurana.
Os compostos de aco pesticida, como muitos outros compostos sofrem degradao, transformando-se
em outras substncias. Existem vrios factores que podem provocar a degradao de um pesticida,
entre eles encontram-se as condies atmosfricas, a presena de microorganismos e as condies do
meio. No que respeita s condies atmosfricas, a presena de gua pode provocar a hidrlise dos
compostos, a presena de luz induz a fotodecomposio, e as altas temperaturas favorece a
decomposio trmica. As bactrias e fungos podem metabolizar os pesticidas, transformando-os em
outros compostos. E as condies do meio como vo sendo alteradas durante a produo do vinho,
provocando uma mudana de meio para os pesticidas, pode desencadear uma srie de novas reaces
de decomposio. As mudanas das condies do meio mais acentuadas originam a diminuio do
contedo de acares, e o aumento da quantidade de etanol presente.
A diminuio da concentrao de pesticidas durante o processo de fermentao foi verificada por
anlises de vrias amostras de mosto recolhidas ao longo da fermentao e no fim desta.

2.4. Reviso Bibliogrfica dos Pesticidas Utilizados

Seguidamente, ir ser descrita uma reviso bibliogrfica sobre os compostos de aco pesticida que iro
ser utilizados no decorrer deste trabalho, assim como o pesticida utilizado como padro interno nos
estudos prvios (Dieldrine)
[21, 22]
.

Introduo

31
Tabela 1. Caractersticas dos compostos de aco pesticida utilizados neste trabalho.
Benalaxil methyl 2-(N-(2,6-dimethylphenyl)-2-phenylacetamido)propanoate
M(C
20
H
23
NO
3
) = 325,402 g/mol
R 50/53; S 60-61
Aco Fungicida
LMR = 0,27 ppm
H
2
C
N
O O
OCH
3

Ciprodinil 4-cyclopropyl-6-methyl-N-phenylpyrimidin-2-amine
M(C
14
H
15
N
3
)=225,298 g/mol
R 36/38-43 ; S 26-36
Aco Fungicida
LMR = 1,33 ppm
H
N
N
N

Folpete 2-(trichloromethylthio)isoindoline-1,3-dione
M(C
9
H
4
Cl
3
NO
2
S)= 296,558 g/mol
R 20-36-40-43-50 ; S 36/37-46-61
Aco Fungicida
LMR = 6,67 ppm
N
O
O
S
Cl
Cl
Cl

Iprovalicarbe (S)-isopropyl 3-methyl-1-oxo-1-(1-p-tolylethylamino)butan-2-ylcarbamate
M(C
18
H
28
N
2
O
3
) = 320,427 g/mol
R 36/38-43 ; S 26-36
Aco Fungicida
LMR = 1,33 ppm
H
N
N
H
O
O
O

Metalaxil methyl-N-methoxyacetyl-N-2,6-xylyl-D-alaninate
M(C
15
H
21
NO
4
) = 279,330 g/mol
R 25-50/53 ; S 45-60-61
Aco Fungicida
LMR = 1,33 ppm
N
O
O
H
3
CO OCH
3

Pirimetanil 4,6-dimethyl-N-phenylpyrimidin-2-amine
M(C
12
H
13
N
3
) = 199,252 g/mol
R 51/53 ; S 60
Aco Fungicida
LMR = 6,67 ppm
H
N
N
N

Dieldrine (1aR,2R,2aS,3S,6R,6aR,7S,7aS)-3,4,5,6,9,9-hexachloro-1a,2,2a,3,6,6a,7,7a-octahydro-2,7:3,6-dimethanonaphtho[2,3-b]oxirene
M(C
12
H
8
Cl
6
O) = 380,910 g/mol
R 25-27-40-48 ; S 22-36-37-45

O
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
2
C

Nota: Nos Regulamentos consultados os LMR so definidos em mg de Pesticida em 1 Kg de Uvas, no entanto, so
aqui apresentados em mg de Pesticida em 1 L de Vinho (ppm), tendo em conta que 1 Kg de Uvas corresponde a
0,750 L de Vinho.

Captulo II
Tcnicas Analticas

Tcnicas Analticas

33
1. Tcnicas Analticas Utilizadas neste Trabalho

1.1. Microextraco em fase slida
[23]

A microextraco em fase slida (SPME) uma tcnica de extraco e/ou pr-concentrao, proposta no
incio dos anos 90, especialmente adequada para mtodos de anlise qumica onde a Cromatografia em
fase Gasosa (GC) ou Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) sero empregues para a posterior
separao, deteco, identificao e quantificao dos analitos presentes na amostra.
O dispositivo para SPME consiste num pedao de fibra de slica fundida com 10 mm ou 20 mm de
comprimento e dimetro at cerca de 160 m, recoberta com filmes at 100 m de espessura de
adsorventes polimricos como PDMS (polidimetilsiloxano) e PA (poliacrilato), ou de disperses de slidos
adsorventes como Carboxen (CW - carvo activo grafitizado) ou DVB (resina poliestireno-divinilbenzeno)
em aglutinantes polimricos. Essa fibra recoberta com adsorvente colada na ponta de um microtubo
de ao inox adaptado a uma agulha hipodrmica, formando o conjunto de fibra para SPME. Para uso, o
conjunto de fibra montado em um aplicador semelhante a uma microsseringa convencional: presso
no mbolo desse aplicador faz com que o microtubo com a fibra de slica presa corra no interior da
agulha hipodrmica, expondo a fibra coberta com adsorvente.

Figura 4. Dispositivo de Microextraco em Fase Slida.

A operao de extraco em SPME pode ser feita no modo de imerso directa ou pela tcnica de
headspace. Para extraces no modo de imerso directa, a fibra adsorvente imersa em amostras
lquidas ou gasosas. J no segundo caso, mais adequado para extraco de analitos de volatilidade
Tcnicas Analticas

34
moderada a alta e para amostras slidas, suspenses ou materiais de origem biolgica (matrizes muito
complexas), a fibra exposta ao headspace da amostra (fase vapor em contacto com uma poro dessa
amostra lacrada num recipiente confinado). Independentemente do modo operacional, espcies
qumicas presentes na amostra so retidas pelo filme que recobre a fibra at ser atingido um equilbrio
entre as fases, quando idealmente a massa das espcies sorvidas pela fibra proporcional sua
concentrao original na amostra.
Imediatamente aps a extraco, a fibra recolhida no interior da agulha hipodrmica do dispositivo e
exposta ao interior do injector aquecido de um cromatgrafo de fase gasosa, ou ao solvente, em uma
interface prpria, de um cromatgrafo de fase lquida. Os analitos extrados so dessorvidos
directamente no sistema cromatogrfico, onde ocorrer sua separao e deteco.
Em relao a tcnicas como extrao lquido-lquido convencional ou extraco em fase slida, a tcnica
de SPME dispensa o uso de solventes orgnicos extractores. Dada a sua rapidez e simplicidade toda a
operao reduzida a duas etapas simples, de extraco e de dessoro. de fcil
mecanizao/automatizao e de custo operacional relativamente baixo, uma vez que os dispositivos
comerciais para sua aplicao so consideravelmente dispendiosos, mas reutilizveis. A maior
desvantagem da tcnica de SPME, em adio ao alto custo dos conjuntos de fibra, a dependncia
pronunciada entre as massas extradas e as condies operacionais como temperatura e tempo de
extraco.
Os mtodos de extraco mais tradicionais tentam remover por completo os analitos de interesse da
amostra, mas a tcnica de SPME no opera desta forma. Com a Microextraco em Fase Slida a
quantidade de analito adsorvido pela fibra proporcional sua concentrao desde que as condies
experimentais sejam cuidadosamente controladas. A possibilidade de utilizar a SPME quantitativamente
antes de se atingir um equilbrio entre a amostra e a fibra permite preparao de amostras mais rpidas
e econmicas, no entanto a melhor opo esperar que se atinja o equilbrio. A escolha do mtodo para
a construo de uma curva de calibrao depende da matriz da amostra, nomeadamente a sua
complexidade, e o mtodo de extraco utilizado (imerso ou headspace)
[24, 25, 26]
.

Tcnicas Analticas

35
Tabela 2. Guia para a quantificao de analitos em SPME.
Mtodo de Quantificao Recomendado
Matriz Extraco Padro Externo Padro Interno Adio Padro
Gasosa
Simples Headspace
Complexa Headspace
Lquida
Simples
Headspace
Imerso
Complexa
Headspace
Imerso
Slida
Simples Headspace
Complexa Headspace

1.2. Cromatografia de Fase Gasosa
[27, 28]

A Cromatografia em fase Gasosa (GC) uma tcnica de separao e anlise de misturas de substncias
volteis. A amostra introduzida no injector, vaporizada, e arrastada por uma fase mvel - gs inerte. O
fluxo de gs com a amostra vaporizada passa por uma coluna que contm uma fase estacionria, onde
ocorre a separao dos componentes da mistura de acordo com as diferentes afinidades que estes
apresentam em relao fase estacionria.
Os componentes separados saem da coluna juntamente com o gs de arraste a tempos diferentes e
passam por um detector que gera um sinal elctrico proporcional quantidade de substncia eluda. O
registo deste sinal ao longo do tempo constitui o cromatograma. O tempo de reteno de cada
componente, o tempo desde a injeco da amostra at este alcanar o detector.

1.2.1.

Instrumentao de Cromatografia em Fase Gasosa

o Fase Mvel: gs quimicamente inerte que tem como funo arrastar os componentes da mistura a
analisar; os gases mais utilizados so N
2
, He, Ar, e H
2
.
o Injector: A amostra introduzida recorrendo ao uso de uma seringa que perfura um septo (disco
de borracha), de modo a se encontrar numa cmara aquecida a uma temperatura acima dos pontos
de ebulio dos compostos que se pretendem analisar. Se a amostra contm uma grande
quantidade de analito que se pretende determinar (mais de 0,1 %), a injeco deve ser feita em
modo split, isto , em modo de divisor de fluxo,
vapor entre na coluna, sendo o restante vapor desprezado; se, no entanto, o analito a determinar se
apresenta em quantidades residuais (menos de 0
isto , sem divisor de fluxo, de modo que todo o vapor entra na coluna. Estes modos de injeco
tornam-se necessrios, no s pelas razes acima descritas, mas tambm, porque diferentes
colunas possuem diferentes capacidades para a amostra, e dependendo do detector va
necessrio mais ou menos amostra para obter um sinal adequado.
o Fase Estacionria: pode estar contida em colunas capilares ou empacotadas dependendo da
quantidade da amostra que se pretende injectar ou da resoluo pretendida. devido s diferentes
afinidades que o composto que constitui a fase estacionria estabelece com cada componente de
uma mistura, que estes so separados, e eludos a tempos de reteno diferentes. A coluna
encontra-se contida num forno com temperatura programvel, que permite me
dos componentes de uma mistura, uma vez que a temperatura afecta
o Detector: dispositivo que traduz uma propriedade fsica num sinal que indica e quantifica os
componentes separados pela coluna. O detector deve respond
reprodutibilidade a uma grande variedade de compostos, apresentar um limite de linearidade alto, e
limites de quantificao muito baixos. Os detectores mais comuns so o detector de condutividade
trmica, ionizao de chama, captura

Figura

36
, isto , em modo de divisor de fluxo, permitindo que somente uma pequena parte do
apresenta em quantidades residuais (menos de 0,01 %), a injeco deve ser feita em modo
divisor de fluxo, de modo que todo o vapor entra na coluna. Estes modos de injeco
se necessrios, no s pelas razes acima descritas, mas tambm, porque diferentes
colunas possuem diferentes capacidades para a amostra, e dependendo do detector va
necessrio mais ou menos amostra para obter um sinal adequado.
Fase Estacionria: pode estar contida em colunas capilares ou empacotadas dependendo da
finidades que o composto que constitui a fase estacionria estabelece com cada componente de
se contida num forno com temperatura programvel, que permite me
dos componentes de uma mistura, uma vez que a temperatura afecta o tempo de reteno
Detector: dispositivo que traduz uma propriedade fsica num sinal que indica e quantifica os
componentes separados pela coluna. O detector deve responder rapidamente com boa
trmica, ionizao de chama, captura electrnica, e espectrometria de massa.
Figura 5. Esquema de um Cromatgrafo de Fase Gasosa.
Tcnicas Analticas

permitindo que somente uma pequena parte do
%), a injeco deve ser feita em modo splitless,
divisor de fluxo, de modo que todo o vapor entra na coluna. Estes modos de injeco
se necessrios, no s pelas razes acima descritas, mas tambm, porque diferentes
colunas possuem diferentes capacidades para a amostra, e dependendo do detector vai ser
Fase Estacionria: pode estar contida em colunas capilares ou empacotadas dependendo da
finidades que o composto que constitui a fase estacionria estabelece com cada componente de
se contida num forno com temperatura programvel, que permite melhorar a separao
tempo de reteno.
Detector: dispositivo que traduz uma propriedade fsica num sinal que indica e quantifica os
er rapidamente com boa
electrnica, e espectrometria de massa.

asosa.
Tcnicas Analticas

37
1.2.2. Eficincia da Separao

o Resoluo: um cromatograma possui boa resoluo quando se verifica que os picos se encontram
bem separados uns dos outros. O soluto em movimento atravs de uma coluna cromatogrfica
tende a dispersar-se (de acordo com uma distribuio gaussiana), e quanto maior o tempo de
reteno deste composto, mais largo ser o pico que origina. A resoluo de um pico em relao a
outro definida como:
WB WA
tr 2
R
+
=

Equao 1. Resoluo do pico cromatogrfico. Em que tr o intervalo de tempo que separa os picos, e W a
largura de cada pico.

o Altura do Prato terico: uma medida da eficincia da coluna e considera a coluna dividida em
seces ou pratos, em cada um dos quais se supe uma rpida partio dos solutos entre as fases
de modo que o equilbrio seja atingido antes da passagem da fase mvel para o prato seguinte
(considera-se constante o coeficiente de partio de cada soluto ao longo da coluna). A altura do
prato terico uma constante de proporcionalidade entre a varincia do pico e a distncia que ela
percorreu. Como estes pratos no so reais em cromatografia, considera-se a altura do prato terico
como um termo que relaciona a largura do pico com a distncia percorrida (quanto menor a altura
do prato terico, menor a largura do pico).
L N
L
H

= =
2

Equao 2. Altura do prato terico na coluna cromatogfica. Em que H a altura do prato terico, L o
comprimento da coluna, N o nmero de pratos tricos, e
2
a varincia do pico.

o A natureza da coluna e a velocidade de fluxo afectam a altura do prato terico, sendo esta influncia
relacionada matematicamente.
u u
u
B
A H
C C M S
+ + + =

Equao 3. Equao de Van-Deemter. Em que H a altura do prato terico, A o coeficiente de caminhos
mltiplos (em colunas capilares A=0), B o coeficiente de difuso longitudinal, u a velocidade linear das
molculas da fase mvel, C
S
o coeficiente de transporte de massa na fase estacionria, e C
M
o coeficiente de
transporte de massa na fase mvel.

Para a optimizao da perfomance da coluna
principalmente o factor de capacidade que
estacionria e a fase mvel.
mas s quando est compreendido entre 1 e 5 que se obtm tempos de reteno pequenos.

Figura 6. Variao da resoluo e do tempo de reteno com o factor de capacidade.

1.2.3. Como interpretar um cromatograma

Depois da anlise de uma mistura por Cromatografia Gasosa obtm
necessrio interpretar. Os principais dados que se deve ter em ateno so a linha de base, os picos
cromatogrficos, os tempos de reten
A identificao de cada pico cromatogrfico pode ser feita tendo em conta dados obtidos sobre o tempo
de reteno dos compostos, utilizando padres; pela adio de padro que resulta num aumento
do respectivo pico; ou utilizando tcnicas auxiliares como a Espectrometria de Massa.
A quantificao de cada composto pode ser feita atravs da utilizao de padres externos ou internos,
conforme for mais apropriado; e pela altura ou rea do res
muito utilizada devido possibilidade do pico ser pequeno, pos
flutuaes da linha de base, e diminuir ligeiramente com o tempo de reteno.

38
Para a optimizao da perfomance da coluna resoluo e tempo de reteno
actor de capacidade que depende da relao entre a quantidade de analito
De um modo geral um maior factor de capacidade melhora a resoluo,
. Variao da resoluo e do tempo de reteno com o factor de capacidade.
interpretar um cromatograma
Depois da anlise de uma mistura por Cromatografia Gasosa obtm-se um cromatograma que
cromatogrficos, os tempos de reteno de cada pico, assim como a rea, a altura e largura destes.
de reteno dos compostos, utilizando padres; pela adio de padro que resulta num aumento
conforme for mais apropriado; e pela altura ou rea do respectivo pico. A medida da altura do pico no
muito utilizada devido possibilidade do pico ser pequeno, possuir uma resoluo deficiente,
, e diminuir ligeiramente com o tempo de reteno.
Tcnicas Analticas

resoluo e tempo de reteno deve-se ter em conta
a relao entre a quantidade de analito na fase
De um modo geral um maior factor de capacidade melhora a resoluo,

. Variao da resoluo e do tempo de reteno com o factor de capacidade.
se um cromatograma que
o de cada pico, assim como a rea, a altura e largura destes.
de reteno dos compostos, utilizando padres; pela adio de padro que resulta num aumento da rea
pectivo pico. A medida da altura do pico no
suir uma resoluo deficiente, haver

Figura 7. Exemplo de um cromatograma obtido por anlise de uma mistura

A Figura 7 representa um cromatograma de uma mistura comercial de pesticidas. Como podemos
verificar a linha de base no possui flutuaes obs
para alm dos dois pesticidas que contm, cada uma delas eluda a um tempo de reteno especfico
nas condies utilizadas, e corresponde a um pico cromatogrfico; a rea dos picos de interesse pode
ser integrada pelo software do equipamento e utilizada para a quantificao dos compostos aos quais
esses picos correspondem.

1.3. Espectrometria de Massa

A Espectrometria de Massa uma tcnica analtica muito utilizada, e fornece informaes
molecular do composto, a frmula molecular e detalhes estruturais da molcula; tem grande amplitude
de aplicao pois um sistema de deteco de grande universalidade no que respeita aos analitos
(qualquer classe de compostos, qualquer tipo
muito pequena pois tem limites

39
Exemplo de um cromatograma obtido por anlise de uma mistura comercial de pesticidas por
Cromatografia Gasosa.

representa um cromatograma de uma mistura comercial de pesticidas. Como podemos
verificar a linha de base no possui flutuaes observveis; a mistura composta por vrias substncias
do equipamento e utilizada para a quantificao dos compostos aos quais
Espectrometria de Massa
[20, 27, 28]

A Espectrometria de Massa uma tcnica analtica muito utilizada, e fornece informaes
(qualquer classe de compostos, qualquer tipo de amostra), necessita de uma quantidade de am
limites de deteco muito pequenos.

Tcnicas Analticas

comercial de pesticidas por
representa um cromatograma de uma mistura comercial de pesticidas. Como podemos
ervveis; a mistura composta por vrias substncias
do equipamento e utilizada para a quantificao dos compostos aos quais
A Espectrometria de Massa uma tcnica analtica muito utilizada, e fornece informaes sobre a massa
de amostra), necessita de uma quantidade de amostra
Tcnicas Analticas

40

Bomba de Vcuo

Figura 8. Diagrama de um Espectrmetro de Massa que mostra os vrios componentes funcionais
[27]
.

O espectrmetro de massa constitudo por um sistema de vcuo, uma fonte de electres, um
analisador de massa (exemplo: Ion Trap), um detector de ies e um amplificador de sinal. A entrada da
amostra mantida a temperaturas elevadas (at 400 C), para se assegurar de que a amostra se
encontra na fase gasosa. Seguidamente, a amostra passa para a cmara de ionizao (exemplo: impacto
electrnico), onde um feixe de electres acelerado, de modo a que estes colidam com as molculas da
amostra, formando-se o io molecular, M
+
.
M + e
-
M
+
+ 2e
-

Posteriormente o io molecular fragmenta-se de modo a se tornar mais estvel.

Figura 9. Diagrama dos componentes de uma fonte de ionizao por impacto electrnico
[27]
.

Os ies entram para o analisador e so capturados pela aco de trs eltrodos: um eltrodo anelar
que aplica uma radiofrequncia, e os elctrodos de entrada e sada que aplicam uma diferena de
potencial. originado um campo magntico tridimensional que consigue capturar os ies, tendo estes
uma trajectria oscilante estvel. O movimento dos ies est dependente da diferena de potencial e
radiofrequncia aplicada, e se se aplicar radiofrequncias variveis, os ies so ejectados segundo a sua
relao massa-carga individual.
Fonte Analisador Detector Computador
Injector
Espectro
de Massa
Tcnicas Analticas

41

Figura 10. Figura ilustrativa das superfcies internas de um analisador de massas do tipo Ion Trap
[27]
.

Como j foi referido, as foras que actuam sobre os ies capturados resultam numa oscilao
tridimensional, cujo movimento pode ser descrito por solues das equaes de Mathieu. A estabilizao
da trajectria dos ies determinada pelos parmetros de Mathieu, a
z
e q
z
, que representam regies do
espao onde os ies so estveis dentro do analisador zona sombreada da Figura 11 para dados
valores de potenciais e frequncia angular
[27]
.

Equao 4. Equaes de Mathieu. A varivel U representa a diferena de potencial dos elctrodos de entrada e
sada, V a voltagem da radiofrequncia, a frequncia angular do elctrodo anelar, 2z a distncia entre os
elctrodos de entrada e sada, r o raio do eletrodo anelar, e m a massa do io.

Figura 11. Diagrama de estabilidade de Mathieu para analisadores de massa do tipo Ion Trap
[27]
.

Se se aumentar a voltagem da radiofrequncia
potencial dos elctrodos de entrada e sada a 0
q
z
=0,908.
Para a deteco dos ies, os potenciais so alterados para desestabilizar a movimentao dos ies, o
que resulta na ejeco destes pelo elctrodo de sada. Os ies so, normalmente, ejectados por ordem
crescente de relao massa-carga atravs de uma mudana gradual dos potenciais.
Esta distribuio denominada por Espectro de Massa, que consiste num grfico de barras onde se
representa a abundncia relativa dos ies em funo da sua relao massa
cada composto nas condies definidas.

Figura

Uma anlise por espectrometria d
pois de outro modo a interpretao dos
A Espectrometria de Massa possui um sistema
seleccionado numa primeira fase (io mais abundante no espectro de massa do composto de interesse),
sujeito a nova fragmentao, e depois todos os ies resultantes so analisados e detectados. Este
sistema elimina quaisquer interferncias que possam e
compostos quando a espectrometria de massa utilizada como mtodo detector.

42
Se se aumentar a voltagem da radiofrequncia do elctrodo anelar, enquanto se mantm
os elctrodos de entrada e sada a 0 V (a
z
=0), os ies so ejectados quando se atinje
carga atravs de uma mudana gradual dos potenciais.
representa a abundncia relativa dos ies em funo da sua relao massa-carga; e caracte
cada composto nas condies definidas.
Figura 12. Exemplo de Espectro de Massa de um Pesticida.

Uma anlise por espectrometria de massa pede uma amostra pura que posteriormente volatilizada
pois de outro modo a interpretao dos espectros obtidos torna-se complicada, se no impossvel.
ectrometria de Massa possui um sistema MS/MS. Devido a este sistema um io
sistema elimina quaisquer interferncias que possam existir, e muito utilizado para a quantificao de
Tcnicas Analticas

do elctrodo anelar, enquanto se mantm a diferena de
so ejectados quando se atinje
carga atravs de uma mudana gradual dos potenciais.
carga; e caracterstica de

Exemplo de Espectro de Massa de um Pesticida.
que posteriormente volatilizada,
se complicada, se no impossvel.
. Devido a este sistema um io precursor
xistir, e muito utilizado para a quantificao de
Tcnicas Analticas

43

1.4. Cromatografia de Fase Gasosa Acoplada Espectrometria de Massa

A Cromatografia Gasosa acoplada Espectrometria de Massa uma combinao de duas tcnicas
microanalticas: uma de separao e outra de identificao, respectivamente. Este acoplamento tem
vrias vantagens. Primeiramente, separam-se os componentes de uma mistura complexa por
Cromatografia Gasosa para que os espectros de massa dos compostos individuais possam ser obtidos
para objectivos qualitativos. Em segundo, fornece informao quantitativa desses mesmos compostos.
Uma vez que necessrio a volatilidade da amostra para a Cromatografia Gasosa, as tcnicas de
ionizao para a Espectrometria de Massa esto restritas quelas que requerem analitos na fase gasosa.
Estas tcnicas so a ionizao electrnica (EI), ionizao qumica (CI), ionizao qumica a presso
reduzida ou a presso atmosfrica (R/APCI), captura electrnica com ionizao negativa (ECNI) e a
ionizao de campo (FI)
[28]
.

Interface:
A ligao GC-MS limita-se insero directa do extremo de sada da coluna cromatogrfica na entrada
da fonte de ionizao do espectrmetro. No entanto, esta deve conciliar a diferena de presso em que
os dois instrumentos operam (GC sob presso; MS - vcuo), permitir transferncia total dos compostos
eludos, no contribuir para a largura da banda e no interagir quimicamente com a amostra
[20]
.

O acoplamento GC-MS ultrapassa algumas limitaes causadas pela utilizao de cada tcnica
individualmente. Por exemplo, na utilizao da Espectrometria de Massa numa amostra contaminada,
obtm-se uma sobreposio de vrios espectros de massa, o que dificulta a interpretao. Por outro
lado, a anlise de uma amostra impura por GC-MS, separa as impurezas do analito de interesse e
permite obter o espectro de massa de cada componente, individualmente. A utilizao de Cromatografia
Gasosa pode conduzir a resultados questionveis devido a ambiguidades na identificao de compostos
baseando-se somente no tempo de reteno dos compostos, no entanto, o acoplamento com a
espectrometria de massa permite obter um espectro que confirma a identidade do composto eludo. A
utilizao do sistema MS/MS acoplado Cromatografia Gasosa ainda nos fornece mais certeza uma vez
que so eliminadas quaisquer interferncias de compostos que possam co-eluir com o analito de
interesse, e permite obter limites de deteco muito mais baixos.
[28]
Outras vantagens deste acoplamento
a possibilidade de obter cromatogramas pelo mtodo SIM (Single Ion Monitoring) em que o
espectrmetro de massa s detecta ies com relao massa/carga compreendida no intervalo definido,
o que elimina a maior parte das interferncias.
Tcnicas Analticas

44

1.5. Construo da Curva de Calibrao

Mtodo do Padro Externo
O mtodo do padro externo compara a resposta do detector obtida com uma amostra com as respostas
obtidas com solues padro de concentrao bem conhecida. Preparam-se solues padro cuja
concentrao do analito de interesse bem conhecida e abranja a gama de concentrao de analito
esperada na amostra, e obtm-se as respectivas respostas do detector. Posteriormente constri-se uma
regresso linear da resposta do detector em funo da concentrao de analito correspondente, o que
permite calcular a concentrao de analito de interesse na amostra atravs da resposta que amostra
provoca no detector utilizando a equao da recta.
a b[X] A
x
+ =
Equao 5. Clculo da concentrao do analito pelo mtodo do padro interno.

Mtodo Padro Interno
O mtodo do padro interno muito utilizado em Qumica Analtica. Consiste em adicionar uma
quantidade conhecida de um composto aos padres, e s amostras. A curva de calibrao construda
a partir das razes das reas em funo das razes das concentraes. Atravs da recta obtida, a
concentrao de analito desconhecida na amostra determinada por interpolao.
] [ ] [ P
F
X
A A P X
=
Equao 6. Clculo da concentrao do analito pelo mtodo do padro interno. Em que A
X
a rea do sinal do
analito, [X] a concentrao do analito, A
P
a rea do sinal do padro interno, [P] a concentrao do padro
interno, e F a razo entre os respectivos factores de resposta.

O padro interno deve ser um composto estvel, com as mesmas caractersticas do analito, mas que
possua diferente tempo de reteno (no convm que seja muito diferente).
O mtodo do padro interno til para anlises em que a quantidade de amostra introduzida, ou o sinal
obtido variam ligeiramente para cada anlise devido a razes difceis de controlar.

Tcnicas Analticas

45
Mtodo da Adio Padro
O mtodo da Adio Padro utilizado para determinar a concentrao do analito numa amostra
desconhecida por comparao da resposta obtida para essa amostra, com um conjunto de respostas
obtidas por adio sucessiva de uma quantidade conhecida do mesmo analito essa mesma amostra. A
quantidade de analito na amostra calculada a partir da evoluo do sinal analtico; isto , a
concentrao do analito obtida por extrapolao no grfico, onde se representa a resposta obtida em
funo da concentrao de analito adicionada amostra desconhecida. Este mtodo pode ser aplicado
maioria das tcnicas analticas e utilizado maioritariamente para resolver problemas de efeitos de
matriz.
t
i
i f
t
ad
ad i
i
V
V
R R
V
V
X R
X

=
] [
] [
Equao 7. Clculo da concentrao do analito pelo mtodo do padro interno. Em que [X]
i
representa a
concentrao de analito na amostra desconhecida inical, R
i
a resposta obtida para a amostra inicial, [X]
ad
a
concentrao da soluo padro adicionada em analito de interesse, V
ad
o volume de soluo padro adicionado,
V
t
o volume final da amostra, R
f
a resposta obtida para a amostra fortificada, e V
i
o volume de amostra inicial.

Tcnicas Analticas

46
2. Reviso Bibliogrfica

2.1. Extraco

A extraco de pesticidas a partir de vrias matrizes, incluindo o vinho, para posterior anlise, pode ser
efectuada por vrios mtodos de extraco. Seguidamente, apresentar-se-o alguns procedimentos e
optimizao de procedimentos para extraco de pesticidas reportados, utilizando as metodologias mais
usuais.

2.1.1. Extraco em Fase Slida
[15]

Outro mtodo possvel para a extraco de pesticidas, a extraco em fase slida. Num dos
procedimentos reportados, a extraco em fase slida efectuada em cartuchos contendo 500 mg de C-
18. Primeiramente, lavar o cartucho com 3 mL de acetato de etilo, seguido por 3 mL de etanol 96 %, e
finalmente, duas vezes por 3 mL de etanol 10 %. Passar pelo cartucho 0,5 mL de uma amostra de vinho,
e deixar secar durante 1 hora, sob vcuo. Eluir os pesticidas adsorvidos com 2 mL de acetato de etilo. O
cartucho pode ser recondicionado at 10 vezes, lavando, alternadamente, com etanol 10 % e gua, e
armazenando-o em etanol 10 %.

2.1.2. Microextraco em Fase Slida

A tcnica de SPME a mais utilizada para extraco de pesticidas. Em consequncia, existem muitos
artigos que reportam procedimentos de extraco por esta tcnica e estes foram submetidos a muitos
estudos de modo a serem optimizados.

Tcnicas Analticas

47
Estudo do Tipo de Fibra
[29]
:
Como existem vrios tipos de revestimentos polimricos utilizados em SPME, torna-se necessrio
comparar o desempenho de todos eles no que respeita extraco de pesticidas. As razes das reas
dos picos obtidas por SPME e por injeco directa de uma soluo foram utilizadas para avaliar o
desempenho da fibra na extraco de pesticidas, e apresentam-se na Tabela 3.

Tabela 3. Para cada pesticida, os valores representam a razo das reas dos picos obtidos com fibras
de revestimentos polimricos diferentes (extraco efectuada por imerso directa da fibra em 3 mL de
uma soluo padro 100 g/L em gua, em agitao magntica, durante 20 minutos) e as reas do
pico correspondente obtido por injeco directa de 1 L de uma soluo padro 100 g/L em acetona.
Pesticida PDMS PA CW-DVB PDMS-DVB
Diazino 262 117 179 312
Fenitrotio 165 183 247 385
Fentio 302 248 310 341
Quinalfos 202 178 241 305
Triazofos 92 180 283 312
Fosalona 277 275 272 438
Pirazofos 229 228 264 414

Embora a fibra PDMS-DVB se tenha mostrado a mais eficaz, prefere-se a fibra de PDMS porque para
alm de apresentar boa performance na extraco, possui maior robustez e permite a anlise de uma
maior gama de concentraes.

Estudo da Espessura da Fibra
[14]
:
As fibras para SPME so comercializadas em vrias espessuras. Para escolher aquela que possui um
melhor desempenho na extraco de pesticidas foi efectuado um estudo onde se comparou as reas dos
picos de cada pesticida obtidos com uma fibra de 7 m PDMS e outra de 100 m PDMS. O
procedimento de extraco para o estudo consistiu na imerso directa da fibra em 3 mL de uma amostra
de vinho fortificado com vrios pesticidas, a 20 C. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 4.

Tcnicas Analticas

48

Tabela 4. Variao das reas dos picos obtidas com revestimentos de diferentes espessuras, nas
condies acima indicadas.
Pesticida
rea do Pico Cromatogrfico
7 m PDMS 100 m PDMS
Mevinfos E 390 522
Diazino - 398
Dimetoato 148 1908
Lindano 581 8489
Flufenoxuro 995 3439
Heptacloro 9447 11915
Paratio-metilo 108 2131
Malatio 59 698
Diclofluanida 77 2814
Endossulfo 8131 11437
Dieldrine 9346 11898
Azinfos-metilo 1369 7761
Fosalona 160 5287

Como esperado, a fibra de 100 m apresenta um melhor desempenho para todos os pesticidas
analisados, uma vez que a superfcie de adsoro maior.

Estudo do Efeito da Agitao
[30, 31]
:
A extraco pela tcnica de SPME baseia-se no equilbrio estabelecido entre a quantidade de analito
presente em soluo e na fibra. Logo, a difuso do analito representa um parmetro importante de
extraco, uma vez que interfere na acumulao de analito na fibra. Assim, o tempo que se demora a
atingir o equilbrio, isto , o tempo depois do qual a quantidade de analito extrado permanece constante,
tambm afectado. O tempo que se demora a atingir o equilbrio foi estudado empregando diferentes
tcnicas de agitao da soluo: agitao nula, agitao magntica da soluo, vibrao da fibra, e
clula de fluxo. As condies de extraco foram as mesmas para todas as extraces, com excepo do
mtodo de agitao.

Tcnicas Analticas

49

Figura 13. Esquema representativo dos 4 tipos de agitao estudados: agitao nula (a), agitao magntica (b),
vibrao da fibra (c) e clula de fluxo (d).

Tabela 5. Tempos de equilbrio obtidos (min) para os pesticidas estudados sob diferentes condies de
agitao.
Tempo de Equilbrio (min)
Pesticida
V
amostra
= 1,4 mL V
amostra
= 12 mL V
amostra
= 10 mL
Ag.Nula Ag.Magntica Vibrao Ag.Nula Ag.Magntica Vibrao Fluxo
Simetrine 60 30 30 80 25 40 30
Ametrine >120 35 30 >120 30 50 30
Prometrine >120 30 35 >120 30 80 35
Terbutrine >120 30 35 >120 50 80 35
Paratio >120 30 20 >120 35 35 25

Mostra-se que a agitao , de facto, importante para a extraco, uma vez que quando a soluo est
esttica durante a extraco, o equilbrio demora cerca de 2 horas a ser atingido. O mtodo de vibrao
da fibra adequa-se muito bem quando o volume da soluo pequeno, onde se atinge o equilbrio em
35 minutos; frente a 80 minutos para solues de maior volume. Para amostras de volume maior a
agitao magntica mostra-se mais eficaz, atingindo-se o equilbrio para a maior parte dos compostos
em 30 minutos. Isto deve-se, provavelmente, ao facto de se formar um vortex na soluo. Quanto
clula de fluxo, esta tambm mostrou ser eficaz para um volume de soluo de 10 mL, atingindo-se o
equilbrio em 35 minutos. No entanto, a montagem da clula elaborada (Figura 14) e torna-se
desnecessria, uma vez que com a agitao magntica se obtm resultados semelhantes.
Tcnicas Analticas

50

Figura 14. Esquema da montagem para uma clula de fluxo utilizada para efectuar o estudo do efeito da
agitao.

Conclui-se assim, que para a maioria dos pesticidas estudados a agitao magntica deve ser utilizada
em solues com volumes prximos dos 10 mL, enquanto a vibrao da fibra deve ser empregue para
solues com volume prximo de 1 mL.

Na utilizao de agitao magntica durante as extraces, tornou-se necessrio fazer um estudo sobre
o efeito da velocidade rotacional da barra magntica. As condies de extraco foram as mesmas para
as extraces, com excepo da velocidade de rotao da barra magntica. Os resultados obtidos
encontram-se graficamente representados na Figura 15.

Figura 15. Efeito da velocidade de agitao na extraco de pesticidas.

As curvas representadas mostram que a agitao magntica
a quantidade de analito extrado diminui,
comear a vibrar e originar uma agitao disforme e com muita velocidade

Estudo do Efeito da Posio da Fibra
A fibra no deve ser posicionada no centro do vortex formado pela agitao magntica, mas sim mais
prximo das paredes do frasco de amostras, uma vez que a que o transporte de massa maior.

Estudo do Tempo de Extraco
Um factor a ser estudado para a construo de um procedimento de extraco adequado, o tempo
durante o qual a fibra se encontra imersa na soluo padro ou na amostra. O procedimento de
extraco para o estudo consistiu na imerso directa de uma fibra 100
amostra de vinho fortificado com vrios pesticidas, a 45
alterando o tempo de imerso da fibra. Os resultados obtidos encontram
na forma de um grfico onde se mo
do tempo de extraco.

Figura 16. Variao das reas dos picos cromatogrficos para os pesticidas

51
As curvas representadas mostram que a agitao magntica a partir de velocidade
quantidade de analito extrado diminui, isto deve-se, provavelmente, ao facto de a
a vibrar e originar uma agitao disforme e com muita velocidade.
Estudo do Efeito da Posio da Fibra
[30]
:
Estudo do Tempo de Extraco
[14]
:
para a construo de um procedimento de extraco adequado, o tempo
consistiu na imerso directa de uma fibra 100 m
amostra de vinho fortificado com vrios pesticidas, a 45 C. Este procedimento foi repetido vrias vezes,
alterando o tempo de imerso da fibra. Os resultados obtidos encontram-se representados na Figura
na forma de um grfico onde se mostra a variao das reas dos picos para cada pesticida
Variao das reas dos picos cromatogrficos para os pesticidas estudados com o tempo de
extraco.
Tcnicas Analticas

ocidades rotacionais grandes
se, provavelmente, ao facto de a barra magntica
para a construo de um procedimento de extraco adequado, o tempo
m PDMS em 3 mL de uma
C. Este procedimento foi repetido vrias vezes,
se representados na Figura 12
stra a variao das reas dos picos para cada pesticida em funo

estudados com o tempo de
Tcnicas Analticas

52
Considerando um compromisso entre o tempo total de anlise e o tempo de extraco, considera-se que
o tempo de extraco de 30 minutos seria adequado.

Estudo da Temperatura de Extraco
[14]
:
Tambm se efectuaram estudos sobre a temperatura qual se deve efectuar a extraco, uma vez que
este parmetro influencia as constantes de partio entre a fase lquida e a fibra. Analisou-se 3 mL de
uma amostra de vinho fortificada com 19 pesticidas, por imerso de uma fibra 100 m PDMS durante
30 minutos s temperaturas de 20 C e de 45 C. As reas dos picos obtidos para os pesticidas foram
analisadas e encontram-se descritas na Tabela 6.

Tabela 6. Variao das reas dos picos cromatogrficos para os pesticidas estudados com a
temperatura de extraco.
Pesticida 20 C 45 C
Diazino 951 637
Dimetoato 1102 979
Lindano 1529 1031
Flufenoxuro 2222 2699
Heptacloro 4921 6663
Aldrine 3318 5270
Paratio-metilo 956 532
Malatio 425 245
Diclofluanida 4476 2297
Endossulfo 2951 3426
Dieldrine 4183 5015
Buprofezine 610 872
Endrine 3564 4314
Etio 5504 6114
Azinfos-metilo 281 333
Fosalona 1007 835

Para 11 dos 19 pesticidas analisados as reas dos respectivos picos aumentam. Os restantes pesticidas
apresentam uma diminuio nas reas dos respectivos picos, mas esta no muito acentuada.
Considera-se que temperatura de 45 C a extraco de pesticidas melhorada.

Tcnicas Analticas

53
Estudo do Efeito da Quantidade de Etanol presente
[32]
:
De modo a analisar o efeito da matriz do vinho na extraco, assumiu-se que o etanol, sendo um dos
maiores constituintes do vinho, influenciaria no coeficiente de afinidade do pesticida entre a soluo
aquosa e a fibra. Procedeu-se extraco de alguns pesticidas, em que s se variou a quantidade de
etanol presente na soluo (0, 5, 10 e 15 % - percentagem mxima de etanol em vinhos). Os resultados
deste estudo encontram-se na Figura 17.

Figura 17. Influncia da quantidade de etanol na eficincia de extraco.

Verificou-se que a eficincia da extraco diminua quando na soluo se aumenta a percentagem de
etanol. A reduo de quantidade de analito extrada mais significativa entre os 0 e 10 %, enquanto esta
quase nula entre os 10 e os 15 %. Para os padres deve ser utilizada uma percentagem de etanol
entre 10 a 12 %, uma vez que estes valores so os mais prximos da maioria das matrizes do vinho, e
no apresentam variaes significativas na quantidade de analito extrado.

Estudo do Efeito da Fora Inica da Soluo
[33]
:
Um dos parmetros relacionados com a matriz tambm estudado foi a fora inica da soluo.
Procedeu-se extraco de alguns pesticidas em que s se variou a quantidade do sal inico. As
solues padro foram preparadas com uma soluo aquosa contendo 10, 20, 30 ou 40 % (p/p) NaCl.
Os resultados obtidos foram comparados com os resultados obtidos para uma soluo padro de
controlo (0 % NaCl).
Tcnicas Analticas

54

Figura 18. Efeito de diferentes concentraes de sal (ajustador da fora inica) na eficincia de extraco de
vrios pesticidas.

Era esperado que a adio de um sal como o NaCl, provocasse uma diminuio da solubilidade dos
analitos na fase aquosa, o que favoreceria o transporte de massa para a fibra, e melhoraria a eficincia
da extraco. Em geral, verificou-se que um aumento da fora inica causa tanto uma diminuio como
um aumento da quantidade de analito extrado. Outro sal tambm estudado foi o MgSO
4
[34]
, obtendo-se
resultados semelhantes.
Conclui-se que a quantidade de analito extrado aumenta ou diminui com a adio do sal ajustador de
fora inica, dependendo da sua solubilidade e polaridade. Assim, o efeito da fora inica deve ser tido
em conta quando se tem interesse em um s analito ou grupo de compostos muito semelhantes.

Estudo do Efeito do pH da Amostra
[35]
:
Outro parmetro referente matriz estudado foi o pH da soluo. Para avaliar o efeito deste parmetro
na eficincia da extraco, analisaram-se solues sob as mesmas condies, com excepo do pH, que
se variou de 4 a 11, por adio de quantidades adequadas de soluo tampo (cido actico/acetato de
sdio para pH cido, hidrxido de sdio para pH alcalino).
Tcnicas Analticas

55
Concluiu-se que variar o pH de 4 a 11 no altera significativamente a eficincia de extraco dos
analitos.

Estudo de outros Efeitos de Matriz
[14]
:
considerado que outros constituintes da matriz do vinho tenham efeitos na eficincia da extraco,
como acares, tartaratos e fenis, uma vez que a matriz do vinho branco diferente da matriz do vinho
tinto, e se obtm diferentes resultados quando se aplica o mesmo procedimento de extraco de
pesticidas nos dois tipos de vinho.

Estudo do Efeito da Temperatura na Dessoro
[36]
:
A temperatura de dessoro da fibra no injector foi estudada, repetindo o procedimento com
temperatura de 250, 270 e 290 C. Verificou-se que a temperatura ptima de dessoro para a fibra era
de 270 C.

Estudo do Efeito do Tempo de Dessoro
[36]
:
O tempo de dessoro, tambm foi estudado, de modo a obter um valor ptimo que corresponde
mxima resposta do detector para todos os compostos. Foi testada uma gama de tempo de 1 a 5
minutos. Verificou-se que 4 minutos eram suficiente para a dessorpo dos pesticidas estudados. No
entanto, este valor pode ser alterado conforme os analitos a analisar.

2.2. Anlise e Deteco

No que respeita aos mtodos de anlise, os mais utilizados so a Cromatografia Lquida de Alta
Performance e a Cromatografia Gasosa, no entanto, tambm se utiliza a Cromatografia Lquida. O
detector maioritariamente preferido o Espectrmetro de Massa uma vez que este pode detectar uma
gama de compostos mais universal, em relao a outros detectores que tambm podem ser utilizados
(ECD, NPD). Estes mtodos apresentam parmetros de validao muito bons como o desvio padro,
limite de deteco, recuperao e linearidade. Alguns mtodos de anlise sero seguidamente
reportados.

Tcnicas Analticas

56
2.3. Estudos de Caso

A anlise de multi-resduos de pesticidas em vinhos um tema que, de algum tempo para c, se
encontra reportado na literatura. Seguidamente vo ser apresentados alguns mtodos j utilizados,
assim como os limites de deteco e a preciso alcanados por eles.

Tabela 7. Resumo de alguns mtodos reportados para a anlise de multi-resduos de pesticidas em
vinhos.
Mtodo de Extraco Mtodo Cromatogrfico
Mtodo
Detector
LDD Preciso Ref.
SPME (PDMS 100 m)
Imerso directa
3 mL amostra
30 min, 45 C, agitao
Dessoro: 3 min, 250 C
GC (HP5890)
Coluna HP-PAS
25mx0,32mmx25m
Ar-Metano (95:5) 1,35 mL/min
P.T.: 80C durante 2 min;
40C/min; 212C durante 7 min;
6C/min; 252C durante 1 min;
5C/min; 280C durante 2 min
ECD
63
Ni
0,30-13
ppb

6-19,7 %

[14]

SPE (C-18 500 mg)
Lavagem: 3 mL de
Acetato de Etilo, 3 mL de
Etanol 96%, 2x3 mL de
Etanol 10 %
0,5 mL de amostra
1 hora de secagem sob
vcuo
Eluio com 2 mL de
Acetato de Etilo
GC (HP5890)
Coluna DB-5
30mx0,25mmx0,25m
He 1 mL/min
P.T.: 70C durante 0,5 min;
10C/min; 270C durante
0,1min; 25C/min; 290C
durante 2 min
MS (HP5972)
Voltagem
EM = 400V
2-5 ppb 3-17,7 %
[15]
SPME (PDMS 100 m)
Imerso directa
30 mL amostra sat.MgSO
4

30 min, t.a., agitao
Dessoro: 3 min, 250 C
GC (HP5890)
Coluna HP-5-MS
30mx0,25mmx0,20m
He 7 psi
P.T.: 80C durante 5 min;
5C/min; 250C durante 10 min
MS (HP5971)
EI = 70eV
1,8-3
ppb

2-18 %

[36]

Captulo III
Parte Experimental
Parte Experimental

58

1. Reagentes

Os pesticidas estudados foram o Ciprodinil, Folpete, Metalaxil, Benalaxil, Iprovalicarbe, Pirimetanil, e
Clorpirifos; tendo, as respectivas misturas comerciais, sido obtidas atravs da Empresa Tcnica Agrcola,
com excepo do pesticida Ciprodinil que foi fornecido pela Fluka. O pesticida utilizado como padro
interno foi o Dieldrine que foi obtido tambm pela Fluka. Os solventes utilizados foram o Etanol fornecido
pela Panreac, gua ultra-pura obtida num sistema de Ultra-Purificao Millipore, Metanol e cido Actico
fornecidos pela LabScan posteriormente micro-filtrados atravs de uma membrana de acetato de
celulose de 0,45 m. Para o estudo do ajuste da fora inica dos padres foi utilizado Sulfato de
Magnsio anidro fornecido pela Panreac. As amostras de vinho foram obtidas no mercado local e iro
permanecer no identificadas ao longo deste trabalho. As caractersticas dos compostos e solventes
fornecidos encontram-se especificadas na Tabela 8.

Tabela 8. Caractersticas dos Pesticidas estudados, dos compostos e solventes utilizados.

Frmula
Molecular
Massa
Molecular
(g/mol)
Nome
Comercial
Percentagem
constituinte
(m/m)%
Frases de
Risco
Frases de
Segurana
Etanol C
2
H
6
O 46,07 Ethanol p.a. 11 7-16
Metanol CH
4
O 31,99 Methanol p.a.
11-23/24/25-
39
7-16-36/37-
45
cido Actico C
2
H
4
O
2
59,98 Acetic Acid p.a. 36/38 26
Dieldrine C
12
H
8
Cl
6
O 308,91 Dieldrine 98,9 25-27-40-48 22-36-37-45
Ciprodinil C
14
H
15
N
3
225,29 Cyprodinil 99,8 25-50/53 45-60-61
Folpete C
9
H
4
Cl
3
NO
2
S 296,56 SidecarF 48,0
20-36-40-43-
50
36/37-46-61
Metalaxil C
15
H
21
NO
4
279,33 Armetil 50 10,0 25-50/53 45-60-61
Benalaxil C
20
H
23
NO
2
325,40 SidecarF 3,75 50/53 60-61
Iprovalicarbe C
18
H
28
N
2
O
3
320,43 Melody 9,0 36/38-43 26-36
Pirimetanil C
12
H
13
N
3
199,25 Scala 37,2 51/53 60
Clorpirifos C
9
H
11
Cl
3
NO
3
PS 350,59 Pirifos 48 44,0 25-50/53 45-60-61
Sulfato de
Magnsio
MgSO
4
120,37
Magnesium
Sulphate
anhidrous
97,0 22-24-25 36-37

Parte Experimental

59

2. Instrumentao

o Balana Analtica Precisa 40SM-200A ( 0,00001 g);
o Aparelho de Ultra-Sons Ultrasonic Cleaner da Fungilab;
o Aparelho de purificao de gua Millipore de 0,22 m da Millipark, onde se obtm gua ultra-
purificada, com 18,2 M.cm;
o Material de vidro diverso de classe A: bales volumtricos de 10,000,04 mL, 50,000,06 mL,
100,00,1 mL, 250,000,15 mL e 500,000,25 mL; pipeta volumtrica de 10,000,04 mL;
pipetas graduadas 1,0000,007 mL, 2,000,01 mL, 5,000,03 mL e 25,00,1 mL; e vials de
capacidade volumtrica de 15 mL.
o Uma Placa de Aquecimento com Agitao Magntica Heidolf MR2002;
o Dispositivos de Microextraco em Fase Slida de suporte manual com fibra recoberta com
PDMS 100 m;
o Cromatgrafo de Fase Gasosa VARIAN 4000 Performance com uma coluna CP8944 VF-5ms 30
m L. x 0,25 mm I.D. x 0,39 mm O.D. e com espessura de filme 0,25 m, acoplado a um
Espectrmetro de Massa (detector) do tipo Ion Trap e que foi operado no modo de ionizao de
impacto electrnico (EI) na opo Full Scan e MS/MS. Nas condies experimentais, o software
apresenta uma biblioteca de espectros de massa NIST/EPA/NIH (Nist 05) e NIST MassSpectral
Search Program (version 2.0d);
o Equipamento de HPLC com bomba e amostrador automtico Finigan Surveyor, equipado com
uma coluna cromatogrfica Termo Electron Corporation, Hypersil GOLD (dimenses 100x4,6
mm e partculas de enchimento de 5 m) e acoplado a um Espectrmetro de Massa (detector)
do tipo Linear Ion Trap e que foi operado no modo de ionizao por electrospray (ESI) na opo
Full Scan.

Parte Experimental

60

3. Preparao de Solues

3.1. Estudos Prvios

3.1.1. SPME-GC-MS

a) Solues-Me de Pesticida Metalaxil e Dieldrine

Soluo Me de Pesticida Metalaxil: Pesou-se 37,5 mg de preparado comercial Armetil 50, que foi
transferido para um balo volumtrico de 500,00 mL, e dissolvido em 60,0 mL de Etanol. Perfez-se o
volume com gua ultra-pura de modo a obter um solvente hidroalcolico 12 % em Etanol.
Soluo Me de Pesticida Dieldrine (Padro Interno): Pesou-se 20,20 mg de Dieldrine, que foi transferido
para um balo volumtrico de 500,00 mL, e dissolvido em 60,0 mL de Etanol. Perfez-se o volume com
gua ultra-pura de modo a obter um solvente hidroalcolico 12 % em Etanol.

Tabela 9. Caractersticas da Soluo-Me Metalaxil para estudos prvios por GC-MS.
m ARMETIL 50 (mg) V Soluo (L) [Metalaxil] (ppm)
37,51 0,01 0,50000 0,00025 7,500 0,004
m Dieldrine (mg) V Soluo (L) [Dieldrine] (ppm)
20,20 0,01 0,50000 0,00025 40,0 0,2

b) Solues Padro

As solues padro foram preparadas por diluio das solues me descritas anteriormente.

Parte Experimental

61

Tabela 10. Preparao das Solues Padro para estudos prvios por GC-MS.
Padro
V final
(mL)
V
i
(mL)
(Dieldrine)
V
i
(mL)
(ARMETIL 50)
[Dieldrine]
(ppm)
[Metalaxil]
(ppm)
1 100,00,1 1,250,02 1,700,02 0,5050,008 0,1300,002
2 100,00,1 1,250,02 2,700,04 0,5050,008 0,2020,003
3 100,00,1 1,250,02 5,000,04 0,5050,008 0,3750,003
4 100,00,1 1,250,02 10,000,02 0,5050,008 0,7500,001
5 100,00,1 1,250,02 20,00,1 0,5050,008 1,5000,008
6 100,00,1 1,250,02 33,30,2 0,5050,008 2,500,02
7 100,00,1 1,250,02 66,700,15 0,5050,008 5,000,01

3.1.2. LC-MS

a) Soluo Me de Pesticida Metalaxil

Pesou-se 10,10 mg de preparado comercial Armetil 50, que foi transferido para um balo volumtrico de
100,00 mL, e dissolvido em 12,0 mL de Metanol. Perfez-se o volume com gua ultra-pura de modo a
obter um solvente hidroalcolico 12 % em Metanol.

Tabela 11. Caractersticas da Soluo-Me de Metalaxil para estudos prvios por LC-MS.
m Armetil 50 (mg) m Metalaxil (mg) V Soluo (L) [Metalaxil] (ppm)
10,100,01 1,0100,001 0,10000,0001 10,10,1

b) Solues Padro

As solues padro foram preparadas por diluio das solues me descritas anteriormente.

Parte Experimental

62

Tabela 12. Caractersticas das Solues Padro de Metalaxil para estudos prvios por LC-MS.
Padro V
f
(mL) V
i
(mL) (Sol. Me) [Metalaxil]
f
(ppm)
1 10,000,04 1,600,03 1,600,03
2 10,000,04 2,200,03 2,200,03
3 10,000,04 2,700,03 2,700,04
4 10,000,04 3,200,03 3,200,05
5 10,000,04 4,300,03 4,300,05

3.2. Optimizao das Condies de Extraco

3.2.1. Estudo do Ajuste da Fora Inica

Preparou-se 250,00 mL de soluo padro para cada pesticida a ser estudado.
Os pesticidas Ciprodinil, Folpete, Metalaxil e Pirimetanil foram inicialmente dissolvidos em 30,00 mL de
Etanol, e posteriormente perfez-se o volume com gua ultra-pura. Os restantes pesticidas, Benalaxil e
Iprovalicarbe foram dissolvidos em gua ultra-pura, de seguida adicionou-se 30,00 mL de Etanol, e
perfez-se o volume com gua ultra-pura.
Para os pesticidas cujas preparaes comerciais se encontram na forma lquida foram preparadas
solues me, e posteriormente por diluio que foram preparadas as solues padro.

comerciais de pesticidas na forma de slido para o estudo do Ajuste da Fora Inica.
Pesticida m (mg) m Pesticida (mg) V
f
(L) Concentrao (ppm)
Ciprodinil 1,350,01 0,250000,00015 5,400,04
Metalaxil 13,510,01 1,350,01 0,250000,00015 5,400,04
Folpete 11,250,01 5,400,05 0,250000,00015 21,600,07
Benalaxil 32,670,01 1,230,01 0,250000,00015 4,920,04
Iprovalicarbe 12,510,01 1,130,01 0,250000,00015 4,520,04

Parte Experimental

63

Tabela 14. Caractersticas das solues padro preparadas a partir de uma soluo comercial de
pesticida por diluies sucessivas para o estudo do Ajuste da Fora Inica.
Pesticida
C
inicial

(ppm)
V
inicial1

(mL)
V
final1

(mL)
C
final1

(ppm)
V
inicial2
(mL)
V
final2

(mL)
C
final2

(ppm)
Pirimetanil 400000 0,01000,0001 100,00,1 40,00,4 31,20,2 250,00,15 4,990,06

Para o estudo das solues sem adio de ajustador de fora inica (MgSO
4
), foram transferidos 3x10,00
mL de soluo para os vials. Este processo foi repetido para todos os pesticidas a serem estudados.
Para o estudo das solues com uma determinada concentrao de ajustador de fora inica, pesou-se
uma massa o mais prxima possvel de 0,30000 g de MgSO
4
que foram transferidos para um balo
volumtrico de 50,00 mL. Perfez-se o volume com soluo padro de pesticida e dissolveu-se o sal com
o auxlio de um aparelho de ultra-sons, obtendo-se assim, uma concentrao de 0,05 M de ajustador de
fora inica. Posteriormente foram transferidos 3x10,00 mL de soluo para os vials. Este processo foi
repetido para todos os pesticidas a serem estudados.
Para o estudo das solues saturadas em ajustador de fora inica, tomou-se cerca de 70 mL de
soluo para um copo e adicionou-se MgSO
4
, gradualmente, at estar saturada (pequenas quantidades
de cada vez, com intervalos de tempo para garantir a solubilidade/saturao). Filtrou-se a soluo por
gravidade, e posteriormente foram transferidos 3x10,00 mL de soluo para os vials. Este processo foi
repetido para todos os pesticidas a serem estudados.

3.2.2. Estudo da Temperatura e do Tempo de Extraco

Preparou-se 100,00 mL de soluo padro para cada pesticida a ser estudado.
Para os pesticidas cujas preparaes comerciais se encontram na forma lquida foram preparadas
solues me, e posteriormente por diluio que foram preparadas as solues padro.

Parte Experimental

64

comerciais de pesticidas na forma de slido para o estudo da Temperatura e do Tempo de Extraco.
Pesticida m (mg)
m Pesticida
(mg)
V
f
(L)
Concentrao
(ppm)
Ciprodinil 0,540,01 0,10000,0001 5,40,1
Metalaxil 5,410,01 0,540,01 0,10000,0001 5,400,01
Folpete 4,500,01 2,160,05 0,10000,0001 21,600,04
Benalaxil 13,070,01 0,4900,004 0,10000,0001 4,9010,006
Iprovalicarbe 5,010,01 0,4510,009 0,10000,0001 4,510,01

Tabela 16. Caractersticas das solues padro preparadas a partir de uma soluo comercial de
pesticida por diluies sucessivas para o estudo da Temperatura e do Tempo de Extraco.
Pesticida
C
inicial

(ppm)
V
inicial1

(mL)
V
final1

(mL)
C
final1

(ppm)
V
inicial2
(mL)
V
final2
(mL)
C
final2

(ppm)
Pirimetanil 400000 0,01000,0001 100,00,1 40,00,4 12,50,1 100,00,1 5,000,05

Para cada pesticida, transferiram-se 6x10,00 mL de soluo para os vials.

3.3. Anlise Quantitativa

3.3.1. Mtodo Full Scan

Preparou-se 100,00 mL de Soluo-Me para cada pesticida a ser estudado.

Parte Experimental

65

Tabela 17. Preparao das Solues-Me dos Pesticidas em estudo para a construo das Rectas de
Calibrao pelo mtodo Full Scan.
Composto V final (mL) m (mg) V (mL)
m Composto
(mg)
[Composto]
f

(ppm)
Ciprodinil 100,00,1 1,130,01 11,30,1
Folpete 100,00,1 2,080,01 1,000,05 10,000,09
Metalaxil 100,00,1 5,080,01 0,510,01 5,0800,001
Benalaxil 100,00,1 13,480,01 0,5060,004 5,10,1
Iprovalicarbe 100,00,1 5,740,01 0,5160,009 5,20,1
Pirimetanil 100,00,1 0,01000,0001 40,00,4

calibrao pelo mtodo Full Scan.
Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Ciprodinil] (ppm)
1 100,00,1 0,4400,004 0,04970,0006
2 100,00,1 0,8800,008 0,0990,001
3 100,00,1 1,7700,009 0,2000,002
4 50,000,06 1,7700,009 0,4000,004
5 50,000,06 3,540,02 0,8000,008
6 50,000,06 5,300,05 1,1980,008
7 50,000,06 9,300,05 2,100,02

Tabela 19. Preparao das Solues Padro do Pesticida Metalaxil para construo da recta de
Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Metalaxil] (ppm)
1 100,00,1 1,000,03
0,0510,001
2
100,00,1
2,000,03
0,1020,002
3
100,00,1
4,000,03
0,2040,002
4 50,000,06 4,000,03
0,4060,004
5
50,000,06
8,000,06
0,8130,006
6
50,000,06
12,000,06
1,2190,006
7
50,000,06
21,000,06 2,1340,007

Parte Experimental

66

Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Folpete] (ppm)
1 100,00,1 0,5000,005
0,05000,0005
2
100,00,1
1,000,01
0,1000,001
3
100,00,1
2,000,01
0,20000,0008
4 50,000,06 2,500,02
0,5000,004
5
50,000,06
4,900,02
0,9800,006
6
50,000,06
14,700,05
2,940,01
7
50,000,06
34,30,1 6,860,03

Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Benalaxil] (ppm)
1 100,00,1 0,9900,009 0,0500,001
2 100,00,1 1,4000,007 0,0710,001
3 100,00,1 2,000,01 0,1020,002
4 50,000,06 2,000,01 0,2040,004
5 50,000,06 4,000,02 0,4080,008
6 50,000,06 5,000,05 0,500,01
7 50,000,06 9,900,05 1,010,02

Tabela 22. Preparao das Solues Padro do Pesticida Iprovalicarbe para construo da recta de
Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Iprovalicarbe] (ppm)
1 100,00,1 1,000,03 0,0520,002
2 100,00,1 2,000,03 0,1040,003
3 100,00,1 4,000,03 0,2080,004
4 50,000,06 4,000,03 0,4160,008
5 50,000,06 8,000,06 0,860,02
6 50,000,06 12,000,06 1,300,02
7 50,000,06 21,000,06 2,270,04

Parte Experimental

67

Tabela 23. Preparao das Solues Padro do Pesticida Pirimetanil para construo da recta de
Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Pirimetanil] (ppm)
1 100,00,1 0,1250,001 0,05000,0006
2 100,00,1 0,2500,003 0,1000,001
3 100,00,1 0,5000,005 0,2000,003
4 50,000,06 0,6250,006 0,5000,007
5 50,000,06 1,300,03 1,040,03
6 50,000,06 3,800,03 3,040,04
7 50,000,06 8,750,05 7,040,08

3.3.2. Mtodo MS/MS

Preparou-se 100,00 mL de Soluo-Me para cada pesticida a ser estudado.

Tabela 24. Preparao das Solues-Me dos Pesticidas em estudo para a construo das Rectas de
Calibrao pelo mtodo MS/MS.
Composto V final (mL) m (mg) V (mL)
m Composto
(mg)
[Composto]
f

(ppm)
Ciprodinil 100,00,1 1,190,01 11,90,1
Folpete 100,00,1 2,350,01 1,1280,005 11,280,02
Benalaxil 100,00,1 2,350,01 0,0880,001 0,880,05
Pirimetanil 100,00,1 0,01000,0001 40,00,4

Parte Experimental

68

calibrao pelo mtodo MS/MS.
Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Ciprodinil] (ppm)
1 100,00,1 0,0800,001 0,00950,0001
2 100,00,1 0,1700,002 0,02020,0003
3 100,00,1 0,2500,003 0,02980,0004
4 50,000,06 0,1700,002 0,04040,0006
5 50,000,06 0,2500,003 0,05960,0008
6 50,000,06 0,3350,003 0,0800,001
7 50,000,06 0,4200,004 0,1000,001

Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Folpete] (ppm)
1 100,00,1 0,4400,004 0,04970,0005
2 100,00,1 0,7100,007 0,08020,0009
3 100,00,1 1,300,03 0,1470,003
4 50,000,06 1,300,03 0,2940,006
5 50,000,06 2,200,03 0,4980,008
6 50,000,06 3,100,03 0,7000,008
7 50,000,06 4,400,03 0,9940,008

Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Benalaxil] (ppm)
1 100,00,1 0,4400,004 0,00400,0004
2 100,00,1 0,7100,007 0,00640,0004
3 100,00,1 1,300,03 0,0120,001
4 50,000,06 1,300,03 0,0230,002
5 50,000,06 2,200,03 0,0400,004
6 50,000,06 3,100,03 0,0560,006
7 50,000,06 4,400,03 0,0790,008

Parte Experimental

69

Tabela 28. Preparao das Solues Padro do Pesticida Pirimetanil para construo da recta de
Padro V final (mL) V inicial Soluo Me (mL) [Pirimetanil] (ppm)
1 100,00,1 0,0250,001 0,01000,0004
2 100,00,1 0,1000,001 0,04000,0006
3 100,00,1 0,1750,002 0,0700,001
4 50,000,06 0,1250,001 0,1000,001
5 50,000,06 0,1650,002 0,1320,002
6 50,000,06 0,2000,002 0,1600,002
7 50,000,06 0,2500,003 0,2000,002

Parte Experimental

70

4. Procedimentos

4.1. Acondicionamento e Limpeza Trmica da Fibra de Microextraco

A fibra de microextraco utilizada neste trabalho deve ser acondicionada e limpa termicamente expondo
a mesma ao injector do Cromatgrafo de Fase Gasosa aquecido a 250 C durante 30 minutos. O
mtodo foi definido em modo split com um ratio elevado de modo a reduzir substancialmente a
quantidade de impurezas que entram para a coluna, e depois do acondicionamento/limpeza trmica
deve-se aumentar a temperatura do forno de modo a remover algum contaminante.

4.2. Extraco

4.2.1. SPME-GC-MS e Estudo da Fora Inica

Transferiu-se 10,00 mL de soluo para um vial, que posteriormente foi fechado e colocado num banho
a 45 C. Iniciou-se a agitao da soluo a 750 rpm e esperou-se que a temperatura se igualasse.
Inseriu-se o dispositivo de SPME atravs do septo da tampa do vial e mergulhou-se a fibra na soluo de
modo a que esta se encontre afastada do vortex originado pela agitao. Esperou-se 30 minutos.
Recolheu-se a fibra e retirou-se o dispositivo de SPME.

4.2.2. Estudo da Temperatura de Extraco

a 25, 35, 45 ou 55 C, conforme a temperatura de extraco a ser estudada. Iniciou-se a agitao da
soluo a 750 rpm e esperou-se que a temperatura se igualasse. Inseriu-se o dispositivo de SPME
atravs do septo da tampa do vial e mergulhou-se a fibra na soluo de modo a que esta se encontre
afastada do vortex originado pela agitao. Esperou-se 30 minutos. Recolheu-se a fibra e retirou-se o
dispositivo de SPME.

Parte Experimental

71

4.2.3. Estudo do Tempo de Extraco

a 35 C. Iniciou-se a agitao da soluo a 750 rpm e esperou-se que a temperatura se igualasse.
Inseriu-se o dispositivo de SPME atravs do septo da tampa do vial e mergulhou-se a fibra na soluo de
modo a que esta se encontre afastada do vortex originado pela agitao. Esperou-se 20, 30 ou 40
minutos, conforme o tempo de extraco a ser estudado. Recolheu-se a fibra e retirou-se o dispositivo de
SPME.

4.2.4. Anlise Quantitativa

Transferiu-se 10,00 mL de soluo padro para um vial, que posteriormente foi fechado e colocado num
banho a 35 C. Iniciou-se a agitao a 750 rpm e esperou-se que a temperatura se igualasse. Inseriu-se
o dispositivo de SPME atravs do septo da tampa do vial e mergulhou-se a fibra na soluo de modo a
que esta se encontre afastada do vortex originado pela agitao. Esperou-se 30 minutos. Recolheu-se a
fibra e retirou-se o dispositivo de SPME.

Parte Experimental

72

5. Condies de Anlise

5.1. Estudos Prvios

5.1.1. GC-MS

a) Mtodo GC-MS 1: as primeiras condies de anlise para o mtodo GC-MS utilizadas foram:
Fase Mvel: He 1 mL/min;
Injector: 270 C, em modo splitless;
Programa de Temperatura: 80 C durante 1 min, 10 C/min at 270 C, 270 C durante 15
min;
Anlise de Massa: 0-2 min EI off, 2-40 min EI Auto-Full, Mass Range 50-1000 m/z;
Corrente de Ionizao: 10 Amps.

b) Mtodo GC-MS 2: as condies optimizadas de anlise para o mtodo GC-MS utilizadas foram:
Programa de Temperatura: 80 C durante 1 min, 8 C/min at 270 C, 270 C durante 10 min;
Anlise de Massa: 0-2 min EI off, 2-35 min EI Auto-Full, Mass Range 50-1000 m/z;

5.1.2. LC-MS

a) Mtodo LC-MS 1: as primeiras condies de anlise para o mtodo LC-MS utilizadas foram:
Eluente: 50 % Metanol (com cido Actico 1 %) + 50 % gua (com cido Actico 1 %), no modo
isocrtico;
Fluxo do eluente: 0,300 mL/min;
Volume Injectado: 25 L;
Anlise de Massa: 0-1 min ESI off, 1-40 min ESI Auto-Full, Polaridade Positiva;
Mass Range 50-1000 m/z;
Temperatura do Capilar: 300 C;
Fluxo de Gs Auxiliar: 15 mL/min;
Fluxo de Gs de Varrimento: 5 mL/min;
Parte Experimental

73

Fluxo de Gs de Cortina: 70 mL/min;
Potencial da Fonte: 5 kV;
Potencial do Capilar: 41 V;
Corrente da Fonte: 100 mA.

b) Mtodo LC-MS 2: as condies de anlise optimizadas para o mtodo LC-MS utilizadasforam:
Eluente: 80 % Metanol (com cido Actico 1 %) + 20 % gua (com cido Actico 1 %), no modo
isocrtico;
Fluxo do eluente: 0,400 mL/min;
Volume Injectado: 25 L;
Anlise de Massa: 0-1 min ESI off, 1-25 min ESI Auto-Full, Polaridade Positiva;
Mass Range 50-1000 m/z;
Temperatura do Capilar: 300 C;
Fluxo de Gs Auxiliar: 15 mL/min;
Fluxo de Gs de Varrimento: 5 mL/min;
Fluxo de Gs de Cortina: 70 mL/min;
Potencial da Fonte: 5 kV;
Potencial do Capilar: 41 V;
Corrente da Fonte: 100 mA.

5.2. Condies de Anlise utilizadas para a construo das Rectas de Calibrao em GC-MS

5.2.1. Mtodo Full Scan

O mtodo de anlise GC-MS utilizado foi o Mtodo GC-MS 2 descrito em 5.1.b:

Parte Experimental

74

Tabela 29. Parmetros de identificao utilizados nas anlises efectuadas pelo mtodo Full Scan.
Composto
Tempo de Reteno
(min)
Pico Base
(m/z)
Outros Picos
(m/z)
Ciprodinil 19,5 225 226
Metalaxil 17,8 206 160
Folpete 20,1 260 130
Benalaxil 22,7 148 91
Iprovalicarbe 21,1 134 116
Pirimetanil 16,5 198 199

5.2.2. Mtodo AMD

A optimizao das condies de ionizao foi realizada para cada composto individualmente, para uma
corrente de ionizao de 20 Amps e Excitation Storage Levels calculados automaticamente pelo
software para o parmetro de Mathieu q value = 0,4 uma vez que, segundo o manual de intrues do
equipamento, este valor proporciona os melhores resultados para a obteno de ies filhos para a
maioria dos compostos.

Tabela 30. Parmetros escolhidos para a optimizao das condies de ionizao para as anlises a
efectuar pelo mtodo MS/MS.
Composto
Precursor Ion
(m/z)
Ionization
Storage Level
(m/z)
Isolation
Window
(m/z)
WaveForm
Type
Excitation
Storage Level
(m/z)
Excitation
Amplitude
(V)
Ciprodinil 225 35 3,0 Ressonant 99,1 0,10-1,00
Ciprodinil 225 35 3,0 Ressonant 99,1 1,10-2,00
Metalaxil 206 35 3,0 Ressonant 90,7 0,10-1,00
Folpete 260 35 3,0 Ressonant 114,5 0,10-1,00
Benalaxil 148 35 3,0 Ressonant 65,2 0,10-1,00
Iprovalicarbe 134 35 3,0 Ressonant 59,0 0,10-1,00
Pirimetanil 198 35 3,0 Ressonant 87,2 0,10-1,00

Parte Experimental

75

5.2.3. Mtodo MS/MS

Mtodo GC-MS/MS 1: As condies de anlise para o mtodo GC-MS/MS utilizadas foram:
Programa de Temperatura: 80 C durante 1 min, 8 C/min at 270 C, 270 C durante 10 min;
Anlise de Massa: 0-2 min EI off, 2-35 min EI MS/MS, Mass Range 50-1000 m/z;

Tabela 31. Parmetros escolhidos para as anlises efectuadas pelo mtodo MS/MS.
Composto
Precursor
Ion
(m/z)
Ionization
Storage
Level (m/z)
Isolation
Window
(m/z)
WaveForm
Type
Excitation
Storage
Level
(m/z)
Excitation
Amplitude
(V)
Product
Ion Start
Mass (m/z)
Product
Ion End
Mass
(m/z)
Ciprodinil 225 35 3,0 Ressonant 99,1 1,60 99 235
Metalaxil 206 35 3,0 Ressonant 90,7 0,40 115 216
Folpete 260 35 3,0 Ressonant 114,5 0,60 115 270
Benalaxil 148 35 3,0 Ressonant 65,2 0,44 115 158
Iprovalicarbe 134 35 3,0 Ressonant 59,0 0,36 73 144
Pirimetanil 198 35 3,0 Ressonant 87,2 0,80 115 208

Tabela 32. Parmetros de identificao utilizados nas anlises efectuadas pelo mtodo MS/MS.
Composto
Tempo de Reteno
(min)
Pico Base
(m/z)
Outros Picos
(m/z)
Ciprodinil 19,0 208 209; 222
Metalaxil 17,3 162 132; 207
Folpete 19,6 232 262; 200
Benalaxil 22,2 133 149; 119
Iprovalicarbe 20,6 93 134; 135
Pirimetanil 15,9 183 197; 157

Nota: Para as anlises pelo mtodo MS/MS os tempos de reteno so ligeiramente diferentes devido a
uma mudana necessria no equipamento, nomeadamente, a eliminao de uma vlvula da interface
GC-MS que foi retirada devido ao seu mal funcionamento.

Captulo IV
Apresentao e Discusso dos Resultados

1. Condies Experimentais

Tendo em conta os mtodos reportados na literatura, construiu
condies especificadas na Tabela 3

Tabela 33. Condies de Anlise iniciais pelo mtodo
Condies de Extraco
SPME PDMS 100 m;
10,00 mL de Soluo Padro desgaseificada,
Saturada em MgSO

Primeiramente foi efectuada uma extraco e anlise do solvente (gua/Etanol 12
linha de base. Obteve-se uma linha de base adequada, como se pode verificar pela Figura 1
prosseguiu-se com o trabalho.

Figura 19. Cromatograma obtido pela anlise do solvente utilizado durante este trabalho (gua/Etanol 12
Procedeu-se extraco e anlise
cromatogrficas utilizadas existiam algumas co
maiores a 25 minutos no havia eluio de compostos
de amostras de vinho, a fibra
maioria de trabalhos desenvolvidos e publicados. Optou
15 minutos para garantir que todos os composto


77
s Experimentais
Tendo em conta os mtodos reportados na literatura, construiu-se um mtodo de
es especificadas na Tabela 33.
Condies de Anlise iniciais pelo mtodo SPME-GC-MS.
Condies de Extraco Condies Cromatogrficas
m;
mL de Soluo Padro desgaseificada,
Saturada em MgSO
4
, 30 min a 45C.
Mtodo GC
Primeiramente foi efectuada uma extraco e anlise do solvente (gua/Etanol 12
se uma linha de base adequada, como se pode verificar pela Figura 1
trabalho.
Cromatograma obtido pela anlise do solvente utilizado durante este trabalho (gua/Etanol 12
linha de base.

se extraco e anlise de amostras de vinhos e verificou-se que com as condies
cromatogrficas utilizadas existiam algumas co-eluies de compostos, e que para tempos de reteno
maiores a 25 minutos no havia eluio de compostos (Figura 20). Verificou-
de amostras de vinho, a fibra no deve ser retirada do injector ao fim de 3 minutos, como descrito na
maioria de trabalhos desenvolvidos e publicados. Optou-se por no se retirar a fibra durante os primeiros
15 minutos para garantir que todos os compostos eram dessorvidos.

se um mtodo de anlise inicial com as
Condies Cromatogrficas
GC-MS 1
Primeiramente foi efectuada uma extraco e anlise do solvente (gua/Etanol 12 %), para verificao da
se uma linha de base adequada, como se pode verificar pela Figura 19, e

Cromatograma obtido pela anlise do solvente utilizado durante este trabalho (gua/Etanol 12 %)
se que com as condies
eluies de compostos, e que para tempos de reteno
-se, tambm que, no caso
ser retirada do injector ao fim de 3 minutos, como descrito na
se por no se retirar a fibra durante os primeiros

Fizeram-se algumas modificaes s condies de anlise, nomeadamente ao programa de temperatura
do forno, de modo a melhorar a separao de compostos. As novas condies de anlise
especificadas na Tabela 34.

Tabela 34. Condies de Anlise melhoradas pelo mtodo SPME
Condies de Extraco
SPME PDMS 100
10,00 mL de Soluo Padro desgaseificada,
Saturada em MgSO

Procedeu-se anlise do mesmo vinho
eram desprezveis. Assim prosseguiu

Figura 20. Cromatograma obtido pela anlise de
uma amostra de vinho
experimentais iniciais.


78
se algumas modificaes s condies de anlise, nomeadamente ao programa de temperatura
do forno, de modo a melhorar a separao de compostos. As novas condies de anlise
Condies de Anlise melhoradas pelo mtodo SPME-GC-MS.
Condies de Extraco Condies Cromatogrficas
100 m;
mL de Soluo Padro desgaseificada,
Saturada em MgSO
4
, 30 min a 45C.
Mtodo GC
se anlise do mesmo vinho pelo novo mtodo e verificou-se que as co
eram desprezveis. Assim prosseguiu-se o trabalho com estas condies.
Cromatograma obtido pela anlise de
de vinho com as condies
Figura 21. Cromatograma obtido pela anlise de
uma amostra de vinho com as
experimentais melhoradas.


se algumas modificaes s condies de anlise, nomeadamente ao programa de temperatura
do forno, de modo a melhorar a separao de compostos. As novas condies de anlise esto
Condies Cromatogrficas
GC-MS 2
se que as co-eluies existentes

Cromatograma obtido pela anlise de
uma amostra de vinho com as condies
experimentais melhoradas.

79
2. Pesticidas de Interesse

Inicialmente, foi obtida uma lista de compostos de aco pesticida com interesse para analisar. Aps
uma pequena pesquisa bibliogrfica sobre estes, verificou-se que nem todos poderiam ser submetidos a
este estudo por terem forma polimrica. Posteriormente, decidiu-se, por razes de limitao de tempo,
utilizar para este estudo, os restantes pesticidas presentes nessa mesma lista e que estariam presentes
em amostras de vinho.
Para decidir os pesticidas a estudar, foram analisadas 6 amostras de vinhos brancos diferentes.
Aps anlise dos picos cromatogrficos de cada cromatograma obtido a partir das amostras de vinho
branco foram identificados os 6 pesticidas utilizados neste estudo: Ciprodinil, Folpete, Metalaxil,
Benalaxil, Iprovalicarbe e Pirimetanil. A atribuio dos picos foi realizada de acordo com a biblioteca de
espectros e/ou confirmada pela anlise dos respectivos espectros de massa. Para alguns picos
presentes nos espectros de massa dos compostos foi sugerido um possvel mecanismo de fragmentao
com o apoio de um programa informtico Mass Frontier 1.0 fornecido pela Thermo LQX.
Foi necessrio utilizar um padro interno para a realizao de alguns estudos, tendo sido escolhido o
pesticida Dieldrine para tal finalidade.
Procedeu-se optimizao das condies de ionizao de modo a poder analizar-se o composto pelo
mtodo MS/MS. A optimizao foi realizada para um q value = 0,4 uma vez que, segundo o manual de
intrues do equipamento, este valor proporciona os melhores resultados para a obteno de ies filhos
para a maioria dos compostos.

2.1. Pesticida Ciprodinil

O Pesticida Ciprodinil foi identificado em uma das amostras de vinho analisadas. A atribuio dos picos
foi realizada de acordo com bibliografia consultada e confirmada pela anlise dos respectivos espectros
de massa e pela biblioteca de espectros disponvel no software, tendo, este pesticida, sido identificado
pela presena de ies com m/z 225 e 224.

Figura 22. Cromatograma de um vinho fortificado
com Ciprodinil, onde inicialmente se identificou o
mesmo pesticida (GC-MS Full).
H
N
N
N
-
Figura 24. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Ciprodinil.

Na optimizao das condies de ionizao,
Level, e depois de uma srie de anlises (
Ciprodinil 1,60 V.


80
Cromatograma de um vinho fortificado
).
Figura 23. Espectro de massa obtido para o
composto eludo no pico anteriormente destacado
(Figura 22.) Ciprodinil (cima); e Espectro de mass
presente na Biblioteca de esp
mesmo composto (baixo).

H
N
N
N
- e
-
m/z=225

, i
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Ciprodinil.
Na optimizao das condies de ionizao, o software calculou, automaticamente, o
, e depois de uma srie de anlises (AMD) verificou-se que a Excitation Amplitude

Espectro de massa obtido para o
il (cima); e Espectro de massa
presente na Biblioteca de espectros de massa para o

H
N
N
N
m/z=210
m/z=77

Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Ciprodinil.
calculou, automaticamente, o Excitation Storage
Excitation Amplitude ptima para o

Figura 25. Cromatograma d
mesmo pesticida (GC-MS/MS).
H
N
N
N
m/z=225
H
N
N
N
rH
A
rH
A

Figura 27. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o


81
).
(Figura 25.) Ciprodinil.

H
N
HN
N
H
N
NH
N
m/z=225
m/z=225

rH
A
H
N
N
N
H
N
N
N
m/z=225 m/z=183
i
Mecanismo de Fragmentao sugerido para os novos picos obtidos por
Ciprodinil.

H
N N
H
N
NH
2
N
m/z=225
m/z=209
A
, i
por MS/MS para o composto

2.2. Pesticida Metalaxil

2.2.1. GC-MS
O Pesticida Metalaxil foi identificado em uma das amostras de vinho analisadas. A atribuio dos picos
de massa e pela biblioteca de espectros disponve

Figura 28. Cromatograma de um vinho
com Metalaxil, onde inicialmente se identificou o

N
O
O
O
O
- e-
Figura 30. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Metalaxil.

82

MS
de massa e pela biblioteca de espectros disponvel no software, tendo, este pesticida, sido identificado
il, onde inicialmente se identificou o
.
(Figura 28.) Metalaxil (cima); e Espectro de massa
presente na Biblioteca de esprectros de massa para o
N
O
O
O
O
N
O
O
O
O
H
N
O
O
O
O
H
N
O
O
O
H
N
O
O
O
N
O
O
N
HO
O
N
HO
O
m/z=279 m/z=279
m/z=279
m/z=249 m/z=234
m/z=220
m/z=220
m/z=220

rHA

rHC
rHC rHB
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Metalaxil.

, tendo, este pesticida, sido identificado

Metalaxil (cima); e Espectro de massa

N
O
O
N
H
O
N
H
m/z=206
m/z=160
m/z=146
rHC

Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Metalaxil.

Na optimizao das condies de ionizao, o
uma srie de anlises (AMD) verificou

Figura 31. Cromatograma de um vinho fortificado com
Metalaxil, onde inicialmente se identificou o mesmo
pesticida (GC-MS/MS).
N
O
O
O
O
m/z=279
rH
Figura 33. Mecanismo de Fragmentao sugerido para

2.2.2. LC-MS
foi realizada de acordo com
identificado pela presena de ies com m/z 280
outros compostos desconhecidos os quais no foi possvel serem separados.

83
Na optimizao das condies de ionizao, o software calculou o Excitation Storage Level
) verificou-se que a Excitation Amplitude ptima para o Metalax
Cromatograma de um vinho fortificado com
Metalaxil, onde inicialmente se identificou o mesmo
Figura 32. Espectro de massa obtido para o composto
eludo no pico anteriormente destacado (Figura
Metalaxil.

N
O
O
N
H
2
m/z=279
m/z=207
rHB HA
O
O
O
O
Mecanismo de Fragmentao sugerido para alguns dos novos picos obtidos
composto Metalaxil.

foi realizada de acordo com a anlise do respectivo espectro de massa, tendo, este pesticida, sido
identificado pela presena de ies com m/z 280 [M+H
+
]. O composto de interesse foi co
outros compostos desconhecidos os quais no foi possvel serem separados.

Excitation Storage Level, e depois de
ptima para o Metalaxil 0,40 V.

Espectro de massa obtido para o composto
eludo no pico anteriormente destacado (Figura 31.)
NH3
m/z=121
rHB
O

picos obtidos por MS/MS para o
de massa, tendo, este pesticida, sido
O composto de interesse foi co-eludo com

Figura 34. Cromatograma de uma mistura
comercial de pesticidas com um pico destacado que
foi identificado como pertencendo ao pesticida
Metalaxil.

2.3. Pesticida Folpete

O Pesticida Folpete foi identificado em uma das amostras de vinho analisadas. A atribuio dos picos foi
realizada de acordo com bibliografia consultada e confirmada pela anlise dos respectivos espectros de
massa e pela biblioteca de espectros disponvel
presena de ies com m/z 260 e 130.

com Folpete, onde inicialmente se identificou o

84
Cromatograma de uma mistura
comercial de pesticidas com um pico destacado que
foi identificado como pertencendo ao pesticida
(Figura 34.) Metalaxil.

massa e pela biblioteca de espectros disponvel no software, tendo, este pesticida, sido identificado pela
com Folpete, onde inicialmente se identificou o
).
(Figura 36.) Folpete (cima); e Espectro de massa
presente na biblioteca de esprectros de massa para o

, tendo, este pesticida, sido identificado pela

Folpete (cima); e Espectro de massa
presente na biblioteca de esprectros de massa para o

N
O
O
S
C Cl
Cl
Cl
- e
-
Figura 38. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto


com Folpete, onde inicialmente se identificou o mesmo
pesticida (GC-MS/MS).
O mecanismo de fragmentao pelo qual se origina o pico base do espectro de massa da Figura
representado anteriormente na Figura 3

2.4. Pesticida Benalaxil

O Pesticida Benalaxil foi identificado em trs das amostras de vinho analisadas. A atribuio dos picos foi
massa e pela biblioteca de espectros disponv
presena de ies com m/z 148 e

85
N
O
O
S
C Cl
Cl
Cl
N
O
O
S
C Cl
Cl
HN
O
O C

m/z=260
m/z=295
m/z=260
i
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto
) verificou-se que a Excitation Amplitude ptima para o Folpete
com Folpete, onde inicialmente se identificou o mesmo
(Figura 39.) Folpete.

O mecanismo de fragmentao pelo qual se origina o pico base do espectro de massa da Figura
representado anteriormente na Figura 38.
Pesticida Benalaxil
massa e pela biblioteca de espectros disponvel no software, tendo, este pesticida, sido identificado pel

N
O
S
C Cl
Cl
SH
C Cl
Cl
m/z=232
-CO
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Folpete.
ptima para o Folpete 0,60 V.

O mecanismo de fragmentao pelo qual se origina o pico base do espectro de massa da Figura 40 j foi
, tendo, este pesticida, sido identificado pela

Figura 41. Cromatograma de um vinho fortificado com
Benalaxil, onde inicialmente se identificou o mesmo
pesticida (GC-MS Full).

O
N
O
O
rH
A



86
Cromatograma de um vinho fortificado com
Benalaxil, onde inicialmente se identificou o mesmo
Figura 42. Espectro de massa obtido para o composto
eludo no pico anteriormente destacado (Figura
Benalaxil (cima); e Espectro de massa presente na
Biblioteca de esprectros de massa para o mesmo
composto (baixo).

O
N
O
O
H
N
O
O
O
N
O
O
OH
N
O
O
m/z=325
m/z=325
m/z=325
m/z=234
rH
A
rH
A
rH
A

Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto
) verificou-se que a Excitation Amplitude ptima para o

Espectro de massa obtido para o composto
eludo no pico anteriormente destacado (Figura 41.)
Benalaxil (cima); e Espectro de massa presente na
Biblioteca de esprectros de massa para o mesmo
H
N
O
N
O
O
m/z=325
m/z=148
m/z=91

i
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Benalaxil.
ptima para o Benalaxil 0,44 V.

com Benalaxil, onde inicialmente se identificou o

m/z=14

2.5. Pesticida Iprovalicarbe

O Pesticida Iprovalicarbe foi identificado em uma das amostras
picos foi realizada de acordo com bibliografia consultada e confirmada pela anlise dos respectivos
espectros de massa, tendo, este pesticida, sido identificado pela presena de ies com m/z 134 e 116.


87
com Benalaxil, onde inicialmente se identificou o
).
(Figura 44.) Benalaxil.

H
N
48
rH
C
N
H
N
rH
B
i
rH
B
m/z=118
m/z=91
m/z=134 m/z
Mecanismo de Fragmentao sugerido para um dos novos picos obtidos
composto Benalaxil.
Pesticida Iprovalicarbe
O Pesticida Iprovalicarbe foi identificado em uma das amostras de vinho analisadas. A atribuio dos
tendo, este pesticida, sido identificado pela presena de ies com m/z 134 e 116.

NH
2
z=106

novos picos obtidos por MS/MS para o
de vinho analisadas. A atribuio dos
tendo, este pesticida, sido identificado pela presena de ies com m/z 134 e 116.

com Iprovalicarbe, onde inicialmente se identificou o

H
N
O
N
H
O
O


88

(Figura 47.) Iprovalicarbe.

H
N
O
N
H
O
O
N
H
O
O
N
H
O
O
H2
N
O
N
H
O
O
i
rH
B
i
rH
A

m/z=320
m/z=320
m/z=158
m/z=116
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Iprovalicarbe

Iprovalicarbe.
H2
N
O
N
H
O
O
rH
C
NH2
m/z=305
m/z=134
m/z=119
Iprovalicarbe.

V.


2.6. Pesticida Pirimetanil

O Pesticida Pirimitanil foi identificado em cinco das amostras de vinho analisadas. A atribuio dos picos
de massa, tendo, este pesticida, sido identificado pela presena de ies com m/z 198 e 199.


89
) verificou-se que a Excitation Amplitude ptima para o Iprovalicarbe 0,36
).
(Figura 46.) Iprovalicarbe.

NH2
m/z=134
NH2
m/z=134
rH
A,B
i
Mecanismo de Fragmentao sugerido para um dos novos picos obtidos
composto Iprovalicarbe.
Pesticida Pirimetanil
massa, tendo, este pesticida, sido identificado pela presena de ies com m/z 198 e 199.

ptima para o Iprovalicarbe 0,36

Iprovalicarbe.
m/z=91

novos picos obtidos por MS/MS para o
massa, tendo, este pesticida, sido identificado pela presena de ies com m/z 198 e 199.

com Pirimetanil, onde inicialmente se identificou o
H
N
N
Figura 55. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Pirimetanil.



90
).
(Figura 53.) Pirimetanil.

N
H
N
N
N
- e
- , i
m/z=199
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Pirimetanil.
) verificou-se que a Excitation Amplitude ptima para o
).
(Figura 56.) Pirimetanil.


m/z=77

Mecanismo de Fragmentao sugerido para o composto Pirimetanil.
ptima para o Pirimetanil 0,80 V.


H
N
N
N
rH
A
m/z=199
Figura 58. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o

2.7. Pesticida Dieldrine

O Pesticida Dieldrine foi utilizado como padro interno neste estudo. A atribuio dos picos
de acordo com bibliografia consultada e confirmada pela anlise dos respectivos espectros de massa e
pela biblioteca de espectros disponvel no software, tendo, este pesticida, sido identificado pela presena
de ies com m/z 279, 264 e 81.
co-eluio com o pesticida (Metalaxil)

Figura 59. Cromatograma de
de pesticida Dieldrine (GC-MS Full

91
H
N
N
H
N

H
N
N
NH
m/z=199 m/z=199
Mecanismo de Fragmentao sugerido para o pico base obtido por MS/MS para o

O Pesticida Dieldrine foi utilizado como padro interno neste estudo. A atribuio dos picos
de ies com m/z 279, 264 e 81. Este composto eludo aos 21,4 minutos, o que significa que no h
(Metalaxil) para o qual este foi utilizado como padro interno.
Cromatograma de uma soluo padro
MS Full).
(Figura 59.) Dieldrine (cima); e Espectro de massa


rH
A
H
N
N
NH
2
H
N
N
, i
m/z=199
m/z=183
para o composto Pirimetanil.
O Pesticida Dieldrine foi utilizado como padro interno neste estudo. A atribuio dos picos foi realizada
ste composto eludo aos 21,4 minutos, o que significa que no h
para o qual este foi utilizado como padro interno.

Dieldrine (cima); e Espectro de massa


92

O Cl
2
C
Cl
Cl
Cl
Cl
O Cl
2
C
Cl
Cl
Cl
Cl
O Cl
2
C
Cl
Cl
Cl
Cl
O
O Cl
2
C
Cl
Cl
Cl
Cl m/z=378 m/z=378 m/z=378
m/z=81
rH
A

Figura 61. Mecanismo de Fragmentao sugerido para o pico base obtido para o composto Dieldrine.


93
3. Estudos Prvios

Antes de se proceder ao desenvolvimento do mtodo analtico propriamente dito, fizeram-se alguns
estudos com um dos pesticidas de interesse (Metalaxil), nomeadamente a comparao entre o uso do
mtodo GC-MS e LC-MS, e a utilizao da tcnica do padro externo ou padro interno na construo da
recta de calibrao. As condies experimentais j foram descritas anteriormente (Captulo III, 3.1).

3.1. SPME-GC-MS (PE)

O primeiro estudo a ser efectuado foi o pesticida Metalaxil por SPME-GC-MS em que a recta de
calibrao foi construda pelo mtodo do padro externo, e foram obtidos os resultados apresentados na
Folha de Clculo 1. Com este tratamento de resultados obteve-se uma correlao linear com um
coeficiente de 0,9978 e limites de deteco e quantificao inferiores ao limite mximo de resduo para
o pesticida em estudo em vinho.

Tabela 35. Resultados obtidos no estudo prvio do pesticida Metalaxil por SPME-GC-MS(PE).
[Metalaxil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas

0,1300,002 (11)x10
4
Regresso Linear
0,2020,003 (22)x10
4
A = (1,980,06)x10
6
c (51)
0,3750,003 (63)x10
4
R
2
= 0,9978
0,7500,001 (62)x10
5
LDD = 0,198 ppm (Metalaxil)
1,5000,008 (2,60,6)x10
6
LDQ = 0,660 ppm (Metalaxil)
2,500,02 (4,190,07)x10
6
LMR = 1,33 ppm (Metalaxil)
5,000,01 (91)x10
6

Figura 62. Recta de calibrao obtida para o pesticida Metalaxil pelo mtodo SPME-GC-MS(PE).
-2,00E+06
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
1,20E+07
0 2 4 6
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

D
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s

O
b
t
i
d
o
s
[Metalaxil] (ppm)
Estudo do Metalaxil por SPME-GC-MS(PE)

94
3.2. SPME-GC-MS (PI)

O estudo foi repetido para o mesmo pesticida, no entanto, a recta de calibrao foi construda pelo
mtodo do padro interno, tendo sido escolhido para padro interno o pesticida Dieldrine. Os resultados
obtidos encontram-se na Folha de Clculo 2. Com este tratamento de resultados obteve-se uma
correlao linear com um coeficiente de 0,9943 e limite de deteco inferior ao limite mximo de
resduo para o pesticida em estudo em vinho, no entanto, o limite de quantificao obtido superior ao
LMR.

Tabela 36. Resultados obtidos no estudo prvio do pesticida Metalaxil por SPME-GC-MS(PI).
[Metalaxil]
ppm
[Dieldrine]
ppm
[M]/[D]
Mdia da
relao entre as
reas
Cromatogrficas
A
M
/A
D

0,1300,002 0,5050,008 0,2570,006 (44)x10
-5
Regresso Linear
0,2020,003 0,5050,008 0,4000,009 (65)x10
-5
A
M
/A
D
= (2,90,3)x10
6
[M]/[D] (11)
0,3750,003 0,5050,008 0,740,01 (1,70,9)x10
-4
R
2
= 0,9943
0,7500,001 0,5050,008 1,490,02 (2,10,7)x10
-3
1,5000,008 0,5050,008 2,970,05 (63)x10
-3
2,500,02 0,5050,008 4,950,09 (1,10,7)x10
-2
5,000,01 0,5050,008 9,90,2 (2,80,5)x10
-2

Figura 63. Recta de calibrao obtida para o pesticida Metalaxil pelo mtodo SPME-GC-MS(PI).

-5,000E-03
0,000E+00
5,000E-03
1,000E-02
1,500E-02
2,000E-02
2,500E-02
3,000E-02
0 2 4 6 8 10 12
R
a
z
o

e
n
t
r
e

a
s

M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

D
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s

O
b
t
i
d
o
s

p
a
r
a

o

C
o
m
p
o
s
t
o

e

P
a
d
r
o

I
n
t
e
r
n
o
[Metalaxil] / [D]
Estudo do Metalaxil por SPME-GC-MS(PI)

95
3.3. LC-MS (PE)

O mesmo estudo foi tambm efectuado pela tcnica LC-MS. A recta de calibrao foi construda pelo
mtodo do padro externo e os resultados obtidos podem ser verificados na Folha de Clculo 3. Com
este mtodo e tratamento de resultados obteve-se uma correlao linear com um coeficiente de 0,9892
e limite de deteco inferior ao limite mximo de resduo para o pesticida em estudo em vinho, no
entanto, o limite de quantificao obtido superior ao LMR.

Tabela 37. Resultados obtidos no estudo prvio do pesticida Metalaxil por LC-MS(PE).
[Metalaxil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas

1,600,03 (4,10,5)x10
6
Regresso Linear A = (1, 80,2)x10
6
c (84)
2,200,03 (4,730,09)x10
6
R
2
= 0,9892
2,700,04 (5,560,08)x10
6
3,200,05 (6,410,08)x10
6
4,300,05 (8,90,1)x10
6

Figura 64. Recta de calibrao obtida para o pesticida Metalaxil pelo mtodo LC-MS(PE).
0,000E+00
2,000E+06
4,000E+06
6,000E+06
8,000E+06
1,000E+07
0 1 2 3 4 5
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

D
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s

O
b
t
i
d
o
s
[Metalaxil] (ppm)
Estudo do Metalaxil por LC-MS(PE)

96

3.4. Concluses

Comparando os resultados obtidos pela tcnica de GC-MS com os obtidos por LC-MS, verifica-se que,
apesar de a gama de trabalho no ser a mesma (devido ao facto de a relao sinal/rudo por LC-MS ser
maior comparando com o mtodo GC-MS) na Cromatografia Gasosa, se obtm um melhor coeficiente de
correlao e limites de deteco e quantificao menores.
Sendo este mtodo para aplicao em vinhos, isto , amostras lquidas e ligeiramente complexas, a
curva de calibrao deveria, teoricamente, ser construda pelo mtodo da adio padro, no entanto,
este mtodo no foi estudado uma vez que mais demorado, dispendioso, h um aumento do erro final
pois a concentrao calculada por extrapolao e os mtodos utilizados apresentam resultados
melhores.
No que respeita aos estudos efectuados por GC-MS verifica-se que o mtodo do padro externo origina
melhores resultados, tendo sido este mtodo implementado no desenvolvimento do mtodo analtico
(SPME-GC-MS(PE)). muito comum a utilizao do mtodo do padro interno em GC-MS de forma a
minimizar o erro que advm da incerteza do volume que realmente injectado a altas temperaturas, no
entanto como a injeco realizada por fenmenos de dessoro dos compostos de uma fibra
polimrica a temperaturas altas, este problema no muito relevante.


97

4. Optimizao das Condies de Extraco

Uma vez que as condies analticas j foram optimizadas, a vez das condies de extraco serem
submetidas ao mesmo processo. As variveis estudadas foram o ajuste da fora inica da soluo, a
temperatura e o tempo de extraco, tendo estas sido optimizadas uma a uma, e tratadas como
independentes entre si. A preparao das solues e as condies experimentais utilizadas j foram
descritas anteriormente (Captulo III, 3.2.).

4.1. Estudo do efeito da Fora Inica da Soluo

Para estudar o efeito da fora inica da soluo na extraco, prepararam-se, para cada pesticida,
solues padro com a mesma concentrao de composto de interesse, mas com concentraes
diferentes de ajustador de fora inica, MgSO
4
. Efectuaram-se 3 rplicas para cada pesticida e para cada
concentrao de ajustador de fora inica, e trataram-se os resultados de modo a concluir sobre qual a
melhor condio.

Tabela 38. Resultados obtidos no estudo do efeito da Fora Inica da soluo para cada pesticida.
Mdia das reas dos Picos Cromatogrficos Desvio Padro
Composto [MgSO
4
] = 0 M [MgSO
4
] = 0,05 M [MgSO
4
] = sat.
Ciprodinil (2,90,1)x10
8
(4,00,4)x10
8
(3,050,08)x10
8

Metalaxil (6,90,2)x10
6
(7,20,2)x10
6
(7,50,3)x10
6

Folpete (1,40,7)x10
9
(5,30,9)x10
7
no detectado
Benalaxil (1,330,09)x10
6
(1,790,05)x10
8
(2,360,04)x10
8

Iprovalicarbe (2,80,1)x10
7
(2,700,01)x10
7
(3,260,04)x10
7

Pirimetanil (4,350,02)x10
8
(4,830,05)x10
8
(6,740,07)x10
8

Somatrio (2,30,5)x10
9
(1,20,2)x10
9
(1,20,2)x10
9


98

Figura 65. Resultados obtidos no estudo do efeito da Fora Inica da soluo para o conjunto de pesticidas.

4.2. Estudo do efeito da Temperatura de Extraco

Para o estudo do efeito da temperatura de extraco tambm se efectuaram 3 rplicas para cada
pesticida e para cada temperatura estudada. Uma vez que j se verificou que se no se efectuar ajuste
de fora inica as extraces so melhor sucedidas, no se procedeu mais adio do sal ajustador de
fora inica.

Tabela 39. Resultados obtidos no estudo do efeito da temperatura de extraco para cada pesticida.
Composto T = 25C T = 35C T = 45C T = 55C
8
(3,60,1)x10
8
(2,90,1)x10
8
(2,10,1)x10
8

6
(6,90,1)x10
6
(6,90,1)x10
6
(5,30,7)x10
6

Folpete (2,510,09)x10
9
(2,840,04)x10
9
(1,40,7)x10
9
(21)x10
8

8
(1,830,03)x10
8
(1,330,09)x10
8
(1,190,02)x10
8

7
(3,20,1)x10
7
(2,70,1)x10
7
(2,470,09)x10
7

8
(1,410,04)x10
8
(4,350,02)x10
8
(9,30,1)x10
7

9
(41)x10
9
(2,30,5)x10
9
(6,80,9)x10
8

0,000E+00
2,000E+08
4,000E+08
6,000E+08
8,000E+08
1,000E+09
1,200E+09
1,400E+09
1,600E+09
0M 0,05M sat.
r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[MgSO
4
]
Variao da rea com o Ajuste da Fora Inica
Ciprodinil
Metalaxil
Folpete
Benalaxil
Iprovalicarbe
Pirimetanil

99

Figura 66. Resultados obtidos no estudo do efeito da temperatura de extraco para o conjunto de pesticidas.

4.3. Estudo do efeito do Tempo de Extraco

O estudo do efeito do tempo de extraco foi efectuado do mesmo modo que os dois estudos anteriores.
Uma vez que j se concluiu qual a temperatura qual a extraco mais eficaz, este estudo foi
realizado temperatura de 35 C.

Tabela 40. Resultados obtidos no estudo do efeito do tempo de extraco para cada pesticida.
Composto t = 20 min t = 30 min t = 40 min
8
(3,60,1)x10
8
(5,30,2)x10
8

6
(7,00,1)x10
6
(7,20,2)x10
6

Folpete (2,440,08)x10
9
(2,80,4)x10
9
(2,50,4)x10
9

8
(1,830,03)x10
8
(1,480,09)x10
8

7
(3,200,1)x10
7
(2,40,2)x10
7

8
(1,410,03)x10
8
(1,090,04)x10
7

9
(41)x10
9
(3,20,9)x10
9

0,000E+00
5,000E+08
1,000E+09
1,500E+09
2,000E+09
2,500E+09
3,000E+09
25C 35C 45C 55C
r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
Temperatura de Extraco
Variao da rea com a Temperatura de
Extraco
Ciprodinil
Metalaxil
Folpete
Benalaxil
Iprovalicarbe
Pirimetanil

100

Figura 67. Resultados obtidos no estudo do efeito de tempo de extraco para o conjunto de pesticidas.

4.4. Concluses

Com o tratamento dos resultados obtidos e para as variveis estudadas, verifica-se que as condies de
extraco ptimas para o conjunto de todos os pesticidas estudados no so as mesmas para todos os
pesticidas individualmente. No estudo do efeito da fora inica da soluo tanto se observa aumento das
reas dos picos cromatogrficos como diminuies e oscilaes, dependendo do pesticida, assim como
no estudo da temperatura e tempo de extraco. No entanto, verificou-se que as variveis estudadas
tinham um efeito muito significativo no pesticida Folpete, ao qual se decidiu dar maior importncia.
A adio de um sal, uma varivel que se comeou a estudar relativamente h pouco tempo e pode
melhorar a eficincia de extraco atravs do aumento da fora inica da soluo, o que provoca uma
diminuio na solubilidade dos analitos, aumentando o transporte de massa destes para a fibra e
melhorando a eficincia de extraco
[33]
. O aumento da fora inica faz diminuir a solubilidade dos
analitos menos polares, favorecendo a eficincia de extraco destes. Esta observao consistente com
os resultados obtidos, uma vez que no estudo aqui realizado o analito mais polar Folpete foi aquele
em que a eficincia de extraco foi mais prejudicada com a adio de Sulfato de Magnsio. Tendo em
conta todo o conjunto de pesticidas, verifica-se que a adio de um sal ajustador de fora inica da
soluo prejudicial para a eficincia de extraco.
A temperatura de extraco muito importante para a quantificao de amostras, sendo necessrio que
esta seja constante durante todo o processo e entre rplicas para assegurar a preciso. Para
temperaturas baixas a eficincia de extraco diminuda uma vez que a superfcie de adsoro pode
no estar activada, e para temperaturas for muito elevada os analitos podem volatilizar para o headspace
0,000E+00
5,000E+08
1,000E+09
1,500E+09
2,000E+09
2,500E+09
3,000E+09
20min 30min 40min
r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
Tempo de Extraco
Variao da rea com o Tempo de Extraco
Ciprodinil
Metalaxil
Folpete
Benalaxil
Iprovalicarbe
Pirimetanil

101
do vial, havendo um deslocamento do equilbrio no sentido inverso, e provocando a libertao do analito
de interesse da fibra
[25]
. Tal foi verificado no estudo realizado, para temperaturas mais baixas e mais
altas.
O tempo de extraco outra varivel importante uma vez que necessrio algum tempo para que se
atinja um equilbrio entre a fase lquida e a fibra, variando para cada composto. O comportamento
esperado seria um aumento da eficincia com o tempo de extraco at que a partir de um certo tempo
(tempo de equilbrio) esta se torne constante. No entanto, segundo alguns casos reportados, um
aumento excessivo do tempo de extraco tem um efeito negativo, o que se verificou neste trabalho para
tempos maiores a 30 minutos. Uma possvel explicao para esta observao o facto de outras
substncias presentes na soluo e que tambm apresentam afinidade com a fibra extractora entrarem
em competio com o analito de interesse, fazendo com que este seja dessorvido da fibra
[38, 39]
.

As variaes quadrticas da eficincia de extraco em funo da temperatura ou do tempo de extraco
obtidas, foram j verificadas como sendo as variaes esperadas para este tipo de estudo em vrios
trabalhos reportados
[38, 39]
.
A escolha das condies optimizadas de extraco foi realizada segundo um compromisso devido ao
grande efeito que as variveis estudadas tm no pesticida Folpete. Estas condies so aquelas que
favorecem o conjunto: 30 minutos de extraco, a 35 C, e sem adio de sal ajustador de fora inica.


102
5. Rectas de Calibrao

A anlise quantitativa dos pesticidas estudados foi efectuada pelo mtodo do padro externo. Na Tabela
41 e 42 apresentam-se as solues padro, por ordem de injeco, com a respectiva concentrao do
composto de interesse e mdias das reas dos picos cromatogrficos obtidos (3 rplicas).
As concentraes das solues padro utilizadas para anlise pelomtodo Full Scan foram escolhidas de
modo a que a menor origine um pico bem visvel e identificvel, e a maior fosse semelhante
concentrao mxima permitida por legislao (LMR).

Tabela 41. Concentrao dos pesticidas de interesse presente nas solues padro analisadas por GC-
MS Full Scan e respectiva mdia das reas dos picos cromatogrficos obtidos (2 rplicas para o
pesticida Benalaxil, 3 rplicas para os restantes).
[Ciprodinil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
[Metalaxil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
[Folpete]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
0,04970,0006 (71)x10
6
0,0510,001 (2,40,3)x10
3
0,05000,0005 (1,480,06)x10
4

0,0990,001 (9,10,5)x10
6
0,1020,002 (8,70,2)x10
3
0,1000,001 (3,300,09)x10
4

0,2000,002 (1,90,2)x10
7
0,2040,002 (2,250,07)x10
4
0,20000,0008 (5,40,4)x10
4

0,4000,004 (3,50,2)x10
7
0,4060,004 (4,30,1)x10
4
0,5000,004 (1,80,1)x10
5

0,8000,008 (5,90,2)x10
7
0,8130,006 (9,10,3)x10
4
0,9800,006 (8,00,6)x10
5

1,1980,008 (8,70,3)x10
7
1,2190,006 (1,280,04)x10
5
2,940,01 (3,20,2)x10
6

2,100,02 (1,520,03)x10
8
2,1340,007 (2,40,2)x10
5
6,860,03 (9,70,1)x10
6

[Benalaxil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
[Iprovalicarbe]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
[Pirimetanil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
0,0500,001 (1,350,08)x10
6
0,0520,002 (9,30,4)x10
2
0,05000,0006 (5,00,6)x10
5

0,0710,001 (1,80,2)x10
6
0,1040,003 (5,70,9)x10
4
0,1000,001 (1,20,2)x10
6

0,1020,002 (2,600,1)x10
6
0,2080,004 (1,270,09)x10
5
0,2000,003 (2,20,2)x10
6

0,2040,004 (4,30,2)x10
6
0,4160,008 (2,70,2)x10
5
0,5000,007 (6,20,3)x10
6

0,4080,008 (7,50,4)x10
6
0,860,02 (5,30,2)x10
5
1,040,03 (1,210,03)x10
7

1,300,02 (7,60,7)x10
5
3,040,04 (3,300,03)x10
7

2,270,04 (1,260,03)x10
6
7,040,08 (6,200,05)x10
7


103
Tabela 42. Concentrao dos pesticidas de interesse presente nas solues padro analisadas por GC-
MS/MS e respectiva mdia das reas dos picos cromatogrficos obtidos (3 rplicas).
[Ciprodinil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
[Folpete]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
0,00950,0001 (2,810,05)x10
5

0,04970,0005
(1,20,1)x10
4

0,02020,0003 (62)x10
5

0,08020,0009
(31)x10
4

0,02980,0004 (9,40,8)x10
5

0,1470,003
(93)x10
4

0,04040,0006 (1,150,02)x10
6

0,2940,006
(41)x10
4

0,05960,0008 (1,80,2)x10
6

0,4980,008
(72)x10
4

0,0800,001 (2,360,02)x10
6

0,7000,008
(1,20,3)x10
5

0,1000,001 (3,00,3)x10
6
0,9940,008 (2,60,3)x10
5

[Benalaxil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
[Pirimetanil]
ppm
Mdia das reas
Cromatogrficas
0,00400,0004
(5,00,7)x10
4
0,01000,0004 (1,50,3)x10
5

0,00640,0004
(81)x10
4
0,04000,0006 (5,00,2)x10
5

0,0120,001
(1,410,06)x10
5
0,0700,001 (7,50,2)x10
5

0,0230,002
(3,20,5)x10
5
0,1000,001 (1,10,3)x10
6

0,0400,004
(51)x10
5
0,1320,002 (1,480,05)x10
6

0,0560,006
(72)x10
5
0,1600,002 (1,70,2)x10
6

0,0790,008 (102)x10
5
0,2000,002 (2,080,06)x10
6

A partir dos valores apresentados (Tabela 41 e 42) foi possvel construir as rectas de calibrao para
cada pesticida que se pretende analisar. As equaes das rectas foram obtidas segundo o mtodo dos
mnimos quadrados e esto representadas sob a forma y=(btsb)+(atsa), tendo cada parmetro sido
calculado de acordo com as frmulas matemticas apresentadas no Anexo II, assim como os erros
associados para 95 % de confiana.
As solues utilizadas para a anlise por MS/MS no so de concentrao equivalente s utilizadas para
a anlise por Full Scan, uma vez a optimizao das condies de fragmentao foram realizadas com
solues de concentrao pequena, e para concentraes maiores as mesmas condies no eram
eficazes. Para a anlise das amostras, se for necessrio, deve-se proceder a diluies para no
extrapolar valores no grfico obtido.


104

5.1. Pesticida Ciprodinil

Figura 68. Rectas de calibrao obtida para o pesticida Ciprodinil pelo mtodo SPME-GC-MS(PE).

Teste de Mandel: Linear Teste de Mandel: Linear
A = (7,010,08)x10
7
c + (4,00,8)x10
6
A = (2,980,04)x10
7
c - (0,22)x10
4

R
2
= 0,9996 R
2
= 0,9995
LDD = 0,04 ppm LDD = 0,002 ppm
LDQ = 0,12 ppm LDQ = 0,01 ppm
S = (7,010,08)x10
7
S = (2,980,04)x10
7

Para o mtodo Full Scan, verificou-se pelo teste de Mandel que a tendncia dos pontos experimentais
linear. Assim, obteve-se uma regresso linear com coeficiente de correlao de 0,9996, limite de
deteco de 0,04 ppm, e limite de quantificao de 0,12 ppm que menor que o limite mximo de
resduo permitido (1,33 ppm).
Para o mtodo MS/MS, verificou-se que a tendncia tambm linear. A regresso linear obtida est
associada a um coeficiente de correlao de 0,9995, que muito semelhante ao obtido pelo primeiro
mtodo. Foi possvel uma melhoria dos limites de deteco e quantificao de 20 e 12 vezes,
respectivamente; enquanto se verificou uma pequena perda de sensibilidade que pode ser devida
diferena de gama de trabalho.

0,00E+00
2,00E+07
4,00E+07
6,00E+07
8,00E+07
1,00E+08
1,20E+08
1,40E+08
1,60E+08
0 0,5 1 1,5 2 2,5
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Ciprodinil] (ppm)
Recta de Calibrao Ciprodinil (Full Scan)
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
2,50E+06
3,00E+06
3,50E+06
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Ciprodinil] (ppm)
Recta de Calibrao Ciprodinil (MS/MS)

105

5.2. Pesticida Metalaxil

Figura 69. Recta de calibrao obtida para o pesticida Metalaxil pelo mtodo SPME-GC-MS(PE) (Full Scan).

Teste de Mandel: Linear
A = (1,160,02)x10
5
c - (32)x10
3

R
2
= 0,9991
LDD = 0,06 ppm
LDQ = 0,18 ppm
S = (1,160,02)x10
5

No foi possvel a melhoria das condies com o mtodo MS/MS, devido a avaria do Instrumento.

0,00E+00
5,00E+04
1,00E+05
1,50E+05
2,00E+05
2,50E+05
3,00E+05
0 0,5 1 1,5 2 2,5
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Metalaxil] (ppm)
Recta de Calibrao Metalaxil (Full Scan)

106

5.3. Pesticida Folpete

Figura 70. Recta de calibrao obtida para o pesticida Folpete pelo mtodo SPME-GC-MS(PE).

A = (1,420,06)x10
6
c - (42)x10
5

R
2
= 0,9955
LDD = 0,36ppm
LDQ = 1,22ppm
S = (1,420,06)x10
6

Para o mtodo MS/MS, verificou-se uma disperso irregular dos pontos experimentais, talvez devido a
um erro na preparao das solues ou degradao das mesmas. No foi possvel repetir estes pontos
experimentais devido a uma avaria do Instrumento.

-2,00E+06
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
1,20E+07
0 2 4 6 8
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Folpete] (ppm)
Recta de Calibrao Folpete (Full Scan)
0,00E+00
5,00E+04
1,00E+05
1,50E+05
2,00E+05
2,50E+05
3,00E+05
0 0,5 1 1,5
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Folpete] (ppm)
Recta de Calibrao Folpete (MS/MS)

107
5.4. Pesticida Benalaxil

Figura 71. Recta de calibrao obtida para o pesticida Benalaxil pelo mtodo SPME-GC-MS(PE).

Teste de Mandel: Linear (rejeio dos dois pontos de maior concentrao) Teste de Mandel: Linear
A = (1,700,06)x10
7
c + (71)x10
5
A = (1,180,03)x10
7
c - (11)x10
4

R
2
= 0,9979 R
2
= 0,9983
S = (1,700,06)x10
7
S = (1,180,03)x10
7

no linear, no entanto, tendo em conta somente os cinco pontos experimentais de menor concentrao
e rea, esta torna-se linear. Deve-se desprezar os restantes pontos, uma vez que a diferena entre os
pontos experimentais e os pontos interpolados na recta para a mesma concentrao superior ao dobro
da estimativa do desvio padro dos pontos experimentais recta de regresso (y
exp
-y
int
>2s
y/x
). Conclui-se
que existe perda de linearidade do mtodo para concentraes superiores a 0,4 ppm. Assim, obteve-se
uma regresso linear com coeficiente de correlao de 0,9979, limite de deteco de 0,02 ppm, e limite
de quantificao de 0,08 ppm que menor que o limite mximo de resduo permitido (0,27 ppm). Estes
resultados foram obtidos com apenas duas rplicas para cada ponto experimental, uma vez que a
restantes rplicas foram rejeitadas pelo teste de Grubbs, e se verificou impossvel a adio de novas
rplicas por avaria do Instrumento.
Para o mtodo MS/MS, verificou-se que a tendncia linear. A regresso linear obtida est associada a
um coeficiente de correlao de 0,9983, que muito semelhante ao obtido pelo primeiro mtodo. Foi
possvel uma melhoria dos limites de deteco e quantificao de 7 e 8 vezes, respectivamente;
enquanto se verificou uma pequena perda de sensibilidade que pode ser devida diferena de gama de
trabalho.
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Benalaxil] (ppm)
Recta de Calibrao Benalaxil (Full Scan)
0,00E+00
2,00E+05
4,00E+05
6,00E+05
8,00E+05
1,00E+06
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Benalaxil] (ppm)
Recta de Calibrao Benalaxil (MS/MS)

108

5.5. Pesticida Iprovalicarbe

Figura 72. Recta de calibrao obtida para o pesticida Iprovalicarbe pelo mtodo SPME-GC-MS(PE) (Full Scan).

A = (5,60,2)x10
5
c + (11)x10
4

R
2
= 0,9980
LDD = 0,09 ppm
LDQ = 0,30 ppm
S =(5,60,2)x10
5

No foi possvel a melhoria das condies com o mtodo MS/MS, devido a avaria do Instrumento.

0,00E+00
2,00E+05
4,00E+05
6,00E+05
8,00E+05
1,00E+06
1,20E+06
1,40E+06
0 0,5 1 1,5 2 2,5
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Iprovalicarbe] (ppm)
Recta de Calibrao Iprovalicarbe (Full Scan)

109

5.6. Pesticida Pirimetanil

Figura 73. Recta de calibrao obtida para o pesticida Pirimetanil pelo mtodo SPME-GC-MS(PE).

Teste de Mandel: Linear Teste de Mandel: Linear
A = (8,80,4)x10
6
c + (11)x10
6
A = (1,020,03)x10
7
c + (73)x10
4

R
2
= 0,9951 R
2
= 0,9987
S = (8,80,4)x10
6
S = (1,020,03)x10
7

linear, obtendo-se uma regresso com coeficiente de correlao de 0,9951, limite de deteco de 0,39
ppm, e limite de quantificao de 1,31 ppm que menor que o limite mximo de resduo permitido
(6,67ppm).
Para o mtodo MS/MS, verificou-se que a tendncia linear. A regresso linear obtida est associada a
um coeficiente de correlao de 0,9987, que superior ao obtido pelo primeiro mtodo. Foi possvel
uma melhoria dos limites de deteco e quantificao de 49 e 44 vezes, respectivamente; enquanto se
verificou um aumento da sensibilidade do mtodo.
0,00E+00
1,00E+07
2,00E+07
3,00E+07
4,00E+07
5,00E+07
6,00E+07
7,00E+07
0 2 4 6 8
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Pirimetanil] (ppm)
Recta de Calibrao Pirimetanil (Full Scan)
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
2,50E+06
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
M
d
i
a

d
a
s

r
e
a
s

d
o
s

P
i
c
o
s

C
r
o
m
a
t
o
g
r
f
i
c
o
s
[Pirimetanil] (ppm)
Recta de Calibrao Pirimetanil (MS/MS)

Captulo V
Concluso
Concluso

111

Este trabalho foi efectuado com a finalidade de estabelecer um mtodo de anlise de multi-resduos de
pesticidas por SPME-GC-MS para posterior implementao na anlise de vinhos brancos.
Em primeiro lugar, foi realizada a optimizao das condies experimentais cromatogrficas em GC, onde
se utilizaram amostras de vinho para estabelecer o programa de separao. Ao fim de algumas tentativas
chegou-se s condies que permitem a separao dos compostos presentes na matriz do vinho e que
ficam retidos na fibra de extraco.
Seguidamente, foi feito um levantamento dos pesticidas com interesse para analisar. Para tal foram
analisadas vrias amostras de vinho branco, onde aps extenso estudo dos respectivos cromatogramas foi
possvel identificar vrios pesticidas, como: o Ciprodinil, o Metalaxil, o Folpete, o Benalaxil, o Iprovalicarbe
e o Pirimetanil. Estes pesticidas foram obtidos na forma quase pura ou na forma de mistura comercial, e
caracterizados pelo tempo de reteno e pelo espectro de massa. Os mecanismos pelos quais os
compostos estudados podem fragmentar tambm foram estudados, embora no se tenha conseguido
concluir sobre todos os picos de interesse para alguns compostos.
Foram realizados estudos prvios de modo a poder comparar diferentes mtodos de anlise,
nomeadamente: SPME-GC-MS(PE), SPME-GC-MS(PI) e LC-MS. Foi necessrio fazer uma optimizao das
condies experimentais para LC-MS. Segundo os resultados obtidos foi possvel concluir que os melhores
resultados para o pesticida estudado eram obtidos com a utilizao do mtodo SPME-GC-MS(PE).
Aps ter o mtodo cromatogrfico optimizado, seguiu-se para a optimizao das condies de extraco.
As variveis estudadas foram aquelas que, segundo a pesquisa bibliogrfica, pareceram ser as mais
importantes, como a adio de um sal para ajuste da fora inica, a temperatura e o tempo de extraco.
A optimizao foi feita a uma varivel de cada vez e os resultados foram tratados como se estas fossem
independentes umas das outras. Concluiu-se que as condies que originavam uma maior soma das
reas dos picos cromatogrficos de cada composto era a extraco sem ajuste da fora inica, durante 30
minutos a 35 C.
Prosseguiu-se com a construo das rectas de calibrao. Para o composto Ciprodinil obteve-se uma
regresso linear com coeficiente de correlao 0,9996, limite de deteco de 0,04 ppm e limite de
quantificao de 0,12 ppm para o modo de aquisio Full Scan. Foi realizado uma melhoria pela utilizao
do mtodo de aquisio MS/MS para este composto, onde se obteve um limite de deteco de 0,002
ppm e limite de quantificao de 0,01 ppm, que muito semelhante a resultados reportados para o
mesmo mtodo (LDQ = 0,013 ppm)
[40]
.
Para o composto Metalaxil obteve-se uma regresso linear com coeficiente de correlao 0,9991, limite de
deteco de 0,06 ppm e limite de quantificao de 0,18 ppm para o modo de aquisio Full Scan, que
bastante superior a resultados reportados para o mesmo mtodo (LDQ = 0,04 ppm)
[40]
.
Concluso

112
Para o composto Folpete obteve-se uma regresso linear com coeficiente de correlao 0,9955, limite de
deteco de 0,36 ppm e limite de quantificao de 1,22 ppm para o modo de aquisio Full Scan, que
um pouco superior a resultados reportados para o mesmo mtodo (LDQ = 1,00ppm)
[41]
.
Para o composto Benalaxil obteve-se uma regresso linear com coeficiente de correlao 0,9979, limite de
deteco de 0,02 ppm e limite de quantificao de 0,08 ppm para o modo de aquisio Full Scan. Foi
realizado uma melhoria pela utilizao do mtodo de aquisio MS/MS para este composto, onde se
obteve um limite de deteco de 0,003 ppm e limite de quantificao de 0,01 ppm, que tambm o
resultado reportado para o mesmo mtodo (LDQ = 0,01ppm)
[40]
.
Para o composto Iprovalicarbe obteve-se uma regresso linear com coeficiente de correlao 0,9980,
limite de deteco de 0,09 ppm e limite de quantificao de 0,30 ppm para o modo de aquisio Full
Scan, que superior a resultados reportados para o mesmo mtodo (LDQ = 0,1 ppm)
[41]
.
Para o composto Pirimetanil obteve-se uma regresso linear com coeficiente de correlao 0,9951, limite
de deteco de 0,39 ppm e limite de quantificao de 1,31 ppm para o modo de aquisio Full Scan. Foi
realizado uma melhoria pela utilizao do mtodo MS/MS para este composto, onde se obteve um limite
de deteco de 0,008 ppm e limite de quantificao de 0,03 ppm, que superior aos resultados
reportados para o mesmo mtodo (LDQ = 0,012 ppm)
[40]
.
Devido a algumas avarias no Instrumento GC-MS, o seguimento deste trabalho foi impossibilitado, pois era
o plano melhorar as condies de anlise para o mtodo MS/MS para todos os compostos de interesse, e
analisar vrias amostras de vinho de modo a identificar e quantificar os pesticidas estudados.

Bibliografia
Bibliografia

114
[1] Instituto da Vinha e do Vinho (www.ivv.min-agricultura.pt);
[2] Regulamento (CE) n1493/1999;
[3] Encyclopedia Britannica Online, Wine;
[4] Worlds Earliest Wine, Arqueology, vol.49 (1996);
[5] Wine: A Scientific Exploration, Merton Sandler, Roger Pinder, CRC Press, pg.66;
[6] Nem leigo nem expert Manual bsico do mundo do vinho, RUSSO, Didi, Ativa/M. Editorial
grfica, 34, So Paulo, 2005;
[7] Enologia Practica: Conocimiento y elaboracin del vino, Alfredo Gonzlez Salgueiro, 3 Edio,
Ediciones Mundi-Prensa, 1989;
[8] Wine Science: Principles & Applications, Ronald S. Jackson, 3rd Edition, Elsevier, 2008;
[9] Le Vin De lanalyse lelaboration, D. Delanoe, C. Maillard, D. Maisondieu, Traduo de R.
Casquilho, Publicaes Europa-Amrica, Lda, Mem Martins, 1989;
[10] Methods for analysis of musts and wines, M.A. Amerine, C.S. Ough, 2 Edio, John Wiley & Sons
Inc., Davis, 1988;
[11] What is a pesticide?, U.S. E.P.A. definitions;
[12] Bayer Crop Science Portugal (www.agro.bayer.com.pt/internet/asp/default.asp);
[13] Human Impacts on Ecossystems, Oregon State University
(oregonstate.edu/instruction/bi301/agpestic.htm);
[14] M. Correia, C. Delerue, A. Alves, Journal of Chromatography A, vol.889 (2000) pg.59-67;
[15] G.J. Soleas, J. Yan, K. Hom, D.M. Goldberg, Journal of Chromatography A, vol.882 (2000) pg.205-
212;
[16] Joo Garrido, A Flavescncia Dourada da Vinha Uma nova preocupao na Regio dos vinhos
verdes, Estao Vitivincula Amndio Galhano, 9 de Abril de 2008;
[17] Bayer Crop Sciences, Manual da Proteco Integrada da Vinha, Lisboa 2003;
[18] Direco Geral de Proteco de Culturas, Instituto Nacional de Investigao Agrria, Produo
Integrada da Vinha, DGPC, Oeiras 2000;
[19] U.S. E.P.A., Integrated Pest Managment (IPM) and Food Production
(http://www.epa.gov/pesticides/factsheets/ipm.htm);
Bibliografia

115
[20] Estudo da Eliminao de pesticidas ao longo da produo de um vinho, Hugo Alexandre Dias
Ferreira de Oliveira e Silva, Dissertao para Mestrado em Qumica, Faculdade de Cincias da
Universidade do Porto, 2004;
[23] Solid Phase Microextraction: Theory and Practice, J.Pawliszyn, Wiley-VCH, Inc., 1997;
[24] Supelco Bulletins 923;
[27] Comprehensive Analytical Chemistry 47, S. Ahuja, N. Jesperson, Elsevier, 2006];
[28] Determinao de pesticidas nos vegetais por cromatografia gasosa espectrometria de massa,
Liliana de Jesus Maia, Relatrio de Estgio Curricular, Departamento de Qumica, Universidade do
Minho, 2008;
[29] A.L.Simplcio, L.V. Boas, Journal of Chromatography A, vol.883 (1999) pg.35-42;
[30] R. Eisert, J. Pawliszyn, Journal of Chromatography A, vol.776 (1997) pg.293-303;
[31] I. Valor, J. Molt, D. Apraiz, G. Font, Journal of Chromatography A, vol.767 (1997) pg.195-203;
[32] S. Milln, M. Sampedro, N. Unceta, M. Goicolea, E. Rodrguez, R. Barrio, Journal of
Chromatography A, vol.995 (2003) pg.135-142;
[33] S. Magdic, A. Boyd-Boland, K. Jinno, J.B. Pawliszyn, Journal of Chromatography A, vol.736 (1996)
pg.219-228;
[34] R. Otero, C. Ruiz, B. Grande, J. Gndara, Journal of Chromatography A, vol.942 (2002) pg.41-52
[35] A. Boyd-Boland, J. Pawliszyn, Journal of Chromatography A, vol.704 (1995) pg.163-172;
[36] J. Beltran, F.J. Lopez, O. Cepria, F. Hernandez, Journal of Chromatography A, vol.808 (1998)
pg.257-263;
[37] J. Beltran, F.J. Lopz, F. Hernndez, Journal of Chromatography A, vol.885 (2000) pg.389-404;
[38] K. Sukola, J. Koziel, F. Augusto, J. Pawlisyn, Analytical Chemistry, vol.73 (2001) pg.13-18;
[39] T. Srot, C. Lafficher, Food Chemistry, vol.82 (2003) pg.513-519;
[40] G.-F. Pang, C.-L. Fan, Y.-M. Liu, Y.-Z. Cao, J.-J. Zhang, B.-L. Fu, X.-M. Li, Z.-Y. Li, Y.-P. Wu, Food
Additives and Contaminants, 23(8) (2006), pg.777-810;
Bibliografia

116
[41] L. Alder, K. Greulich, G. Kempe, B. Vieth, Mass Spectrometry Reviews, vol.25 (2006) pg.838-865;
[42] Anlise de polifenis em vinhos por LC-MS e voltametria cclica, Ana Maria Dias, Relatrio do
Estgio Curricular, Departamento de Qumica, Universidade do Minho, 2008;
[43] J. Sherma, Journal of AOAC International, vol.84 n5 (2001) pg.1303-1312;
[44] J. Wong, M. Webster, C. Halverson, M. Hengel, K. Ngim, S. Ebeler, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, vol.51 (2003) pg.1148-1161;
[45] K.-J. Chia, S.-D. Huang, Rapid Communications in Mass Spectroscopy, vol.20 (2006) pg.118-124;
[46] I. Barnabas, J. Dean, I. Fowlis, S. Owen, Journal of Chromatography A, vol.705 (1995) pg.395-312;
[47] M.-R. Lee, Y.-C. Yeh, W.-S. Hsiang, C.-C. Chen, Journal of Chromatography B, vol.707 (1998) pg.91-
97;
[48] M. Sng, F. Lee, H. Lakso, Journal of Chromatography A, vol.759 (1997) pg.225-230;
[49] C. Aguilar, S. Penalver, E. Pocurull, F. Borrull, R. Marc, Journal of Chromatography A, vol.795
(1998) pg.105-115;
[50] R. Ferrari, T. Nilsson, R. Arena, P. Arlati, G. Bartolucci, R. Basla, F. Cioni, G. Del Carlo, P.
Dellavedova, E. Fattore, M. Fungi, C. Grote, M. Guidotti, Stefania Morgillo, L. Mller, M. Volante,
Journal of Chromatography A, vol.795 (1998) pg.371-376;
[51] M.-R. Lee, Y.-C. Yeh, W.-S. Hsiang, B.-Huey Hwang, Journal of Chromatography A, vol.806 (1998)
pg.317-324;
[52] T. Nilsson, D. Baglio, I. Galdo-Miguez, J. Madsen, S. Facchetti, Journal of Chromatography A,
vol.826 (1998) pg.211-216;
[53] J. Jimnez, J. Bernal, M. Del Nozal, M. Martn, A. Mayorga, Journal of Chromatography A, vol.829
(1998) pg.269-277;
[54] S. Cunha, J. Fernandes, A. Alves, M. Oliveira, Journal of Chromatography A, vol.1216 (2009)
pg.119-126;
[55] S. Patil, K. Banerjee, S. Dasgupta, D. Oulkar, S. Patil, M. Jadhav, R. Savant, P. Adsule, M.
Deshmukh, Journal of Chromatography A, vol.1216 (2009) pg.2307-2319;
[56] K. Jinno, T. Muramatso, Y. Saito, Y. Kiso, S. Magdic, J. Pawliszyn, Journal of Chromatography A,
vol.754 (1996) pg.137-144;
[57] B. Page, G. Lacroix, Journal of Chromatography A, vol.757 (1999) pg.173-182;
Bibliografia

117
[58] C. Aguilar, A. Penalver, E. Pocurrull, J. Ferr, F. Borrull, R. Marc, Journal of Chromatography A,
vol.844 (1999) pg.425-432;
[59] R. Eisert, K. Levsen, Journal of Chromatography A, vol.733 (1996) pg.143-157;
[60] C. Gonalves, M. Alpendurada, Journal of Chromatography A, vol.1026 (2004) pg.239-250;
[61] J. Jimnez, J. Bernal, M. Nozal, L. Toribio, E. Arias, Journal of Chromatography A, vol.919 (2001)
pg.147-156;
[62] S. Abreu, M. Correia, P. Herbert, L. Santos, A. Alves, Food Additives and Contaminants, vol.22
(2005) pg.549-556;
[63] Pesticide Analytical Manual Vol. I: Multiresidue Methods, F.D.A., 3
rd
Edition, 1994.

Anexos

119
Anexo I Frases de Risco

Cdigos Frases de Risco
R 1 Explosivo em estado seco.
R 2 Risco de exploso por choque, frico, fogo ou outras fontes de ignio.
R 3 Grande risco de exploso por choque, frico, fogo ou outras fontes de ignio.
R 4 Forma compostos metlicos explosivos muito sensveis.
R 5 Perigo de exploso em caso de aquecimento.
R 6 Explosivo em contacto e sem contacto com o ar.
R 7 Pode provocar incndios.
R 8 Perigo de incndio em caso de contacto com materiais combustveis.
R 9 Perigo de exploso se misturado com materiais combustveis.
R 10 Inflamvel.
R 11 Facilmente inflamvel.
R 12 Extremamente inflamvel.
R 13 Gs liquefeito extremamente inflamvel.
R 14 Reage violentamente com a gua.
R 15 Reage com a gua libertando gases extremamente inflamveis.
R 16 Explosivo se misturado com substncias comburentes.
R 17 Inflama-se espontaneamente em contacto com o ar.
R 18 Pode formar misturas de ar-vapor explosivas/inflamveis durante a utilizao.
R 19 Pode formar perxidos explosivos.
R 20 Nocivo por inalao.
R 21 Nocivo em contacto com a pele.
R 22 Nocivo por ingesto.
R 23 Txico por inalao.
R 24 Txico em contacto com a pele.
R 25 Txico por ingesto.
R 26 Muito txico por inalao.
R 27 Muito txico em contacto com a pele.
R 27 a Muito txico em contacto com os olhos.
R 28 Muito txico por ingesto.
R 29 Em contacto com a gua liberta gases txicos.
R 30 Pode inflamar-se facilmente durante o uso.
R 31 Em contacto com cidos liberta gases txicos.
R 32 Em contacto com cidos liberta gases muito txicos.
R 33 Perigo de efeitos cumulativos.
R 34 Provoca queimaduras.
R 35 Provoca queimaduras graves.
R 36 Irritante para os olhos.
R 36 a Lacrimogneo.
R 37 Irritante para as vias respiratrias.
R 38 Irritante para a pele.

120
R 39 Perigo de efeitos irreversveis muito graves.
R 40 Possibilidade de efeitos irreversveis.
R 41 Risco de leses oculares graves.
R 42 Possibilidade de sensibilizao por inalao.
R 43 Possibilidade de sensibilizao em contacto com a pele.
R 44 Risco de exploso se aquecido em ambiente fechado.
R 45 Pode causar cancro.
R 46 Pode causar alteraes genticas hereditrias.
R 47 Pode causar m formaes congnitas.
R 48 Risco de efeitos graves para a sade em caso de exposio prolongada.
R 49 Pode causar cancro por inalao.
R 50 Muito txico para os organismos aquticos.
R 51 Txico para os organismos aquticos.
R 52 Nocivo para os organismos aquticos.
R 53 A longo prazo pode provocar efeitos negativos no ambiente aqutico.
R 54 Txico para a flora.
R 55 Txico para a fauna.
R 56 Txico para os organismos do solo.
R 57 Txico para as abelhas.
R 58 A longo prazo pode provocar efeitos negativos no meio ambiente.
R 59 Perigoso para a camada do ozono.
R 60 Pode comprometer a fertilidade.
R 61 Risco durante a gravidez com efeitos adversos para descendncia.
R 62 Possveis riscos de comprometer a fertilidade.
R 63 Possveis riscos, durante a gravidez, de efeitos indesejveis na descendncia.
R 64 Pode causar danos nos bebs alimentados com o leite materno.
R 65 Nocivo: pode causar danos nos pulmes se ingerido.
R 66 A exposio repetida pode causar pele seca e gretada.
R 67 Os vapores podem causar tonturas e sonolncia.

121
Anexo II Frases de Segurana

Cdigos Frases de Segurana
S 1 Conservar bem trancado.
S 2 Manter fora do alcance das crianas.
S 3 Conservar em lugar fresco.
S 4 Manter longe de lugares habitados.
S 5 Conservar em... (lquido apropriado a especificar pelo fabricante).
S 6 Conservar em... (gs inerte a especificar pelo fabricante).
S 7 Manter o recipiente bem fechado.
S 8 Manter o recipiente ao abrigo da humidade.
S 9 Manter o recipiente num lugar bem ventilado.
S 10 Manter o contedo hmido.
S 11 Evitar o contacto com o ar.
S 12 No fechar o recipiente hermeticamente.
S 13 Manter longe de comida, bebidas incluindo os dos animais.
S 14 Manter afastado de (materiais incompatveis a indicar pelo fabricante).
S 15 Conservar longe do calor.
S 16 Conservar longe de fontes de ignio - No fumar.
S 17 Manter longe de materiais combustveis.
S 18 Abrir manipular o recipiente com cautela.
S 20 No comer nem beber durante a utilizao.
S 21 No fumar durante a utilizao.
S 22 No respirar o p.
S 23 No respirar o vapor/gs/fumo/aerossol.
S 24 Evitar o contacto com a pele.
S 25 Evitar o contacto com os olhos.
S 26 Em caso de contacto com os olhos lavar imediata abundantemente em gua e chamar um
mdico.
S 27 Retirar imediatamente a roupa contaminada.
S 28 Em caso de contacto com a pele lavar imediata e abundantemente com... (produto
adequado a indicar pelo fabricante).
S 29 No atirar os resduos para os esgotos.
S 30 Nunca adicionar gua ao produto.
S 33 Evitar a acumulao de cargas electrostticas.
S 34 Evitar choques e frices.
S 35 Eliminar os resduos do produto e os seus recipientes com todas as precaues possveis.
S 36 Usar vesturio de proteco adequado.
S 37 Usar luvas adequadas.

122
S 38 Em caso de ventilao insuficiente usar equipamento respiratrio adequado.
S 39 Usar proteco adequada para os olhos/cara.
S 40 Para limpar os solos e os objectos contaminados com este produto utilizar... (a especificar
pelo fabricante).
S 41 Em caso de incndio e/ou exploso no respirar os fumos.
S 42 Durante as fumigaes/pulverizaes, usar equipamento respiratrio adequado
(denominao(es) adequada(s) a especificar pelo fabricante).
S 43 Em caso de incndio usar... (meios de extino a especificar pelo fabricante. Se a gua
aumentar os riscos acrescentar "No utilizar gua").
S 44 Em caso de indisposio consultar um mdico (se possvel mostrar-lhe o rtulo do produto).
S 45 Em caso de acidente ou indisposio consultar imediatamente um mdico (se possvel
mostrar-lhe o rtulo do produto).
S 46 Em caso de ingesto consultar imediatamente um mdico e mostrar o rtulo ou a
embalagem.
S 47 Conservar a uma temperatura inferior a... C (a especificar pelo fabricante).
S 48 Conservar hmido com... (meio apropriado a especificar pelo fabricante).
S 49 Conservar unicamente no recipiente de origem.
S 50 No misturar com... (a especificar pelo fabricante).
S 51 Usar unicamente em locais bem ventilados.
S 52 No usar sobre grandes superfcies em lugares habitados.
S 53 Evitar a exposio obter instrues especiais antes de usar.
S 54 Obter autorizao das autoridades de controlo de contaminao antes de despejar nas
estaes de tratamento de guas residuais.
S 55 Utilizar as melhores tcnicas de tratamento antes de despejar na rede de esgotos ou no meio
aqutico.
S 56 No despejar na rede de esgotos nem no meio aqutico. Utilizar para o efeito, um local
apropriado para o tratamento dos resduos.
S 57 Utilizar um contentor adequado para evitar a contaminao do meio ambiente.
S 58 Elimina-se como resduo perigoso.
S 59 Informar-se junto do fabricante de como reciclar e recuperar o produto.
S 60 Elimina-se o produto e o recipiente como resduos perigosos.
S 61 Evitar a sua libertao para o meio ambiente. Ter em ateno as instrues especficas das
fichas de dados de Segurana.
S 62 Em caso de ingesto no provocar o vmito: consultar imediatamente um mdico e mostrar
o rtulo ou a embalagem.

123
Anexo III - Frmulas matemticas

a. Mdia
n
i
1 n
i
x
X

=
=

b. Desvio Padro
1
1
) (
=

=
n
i
n i
x x
s

c. Declive / Sensibilidade
=

=
i
n
x
i
x
i
n
y
i
y x
i
x
b
1
2
) (
1
)) )( ((

d. Ordenada na Origem
x b y a =

e. Coeficiente de Correlao
)
1
2
) ( )(
1
2
) ( (
1
)) )( ((
=

=

=

=
i
n
y
i
y
i
n
x
i
x
i
n
y
i
y x
i
x
r

f. Estimativa do Desvio Padro dos pontos experimentais recta de regresso
2
1
2
) (
/

=

=
n
i
n
y
i
y
y x
s

g. Estimativa do Desvio Padro da Ordenada na Origem
2
)
1
(
1
2
/

=

=
=
i
n
x
i
x n
i
n i
x
y x
s
a
s

h. Estimativa do Desvio Padro do Declive
2
)
1
(
/
=

=
i
n
x
i
x
y x
s
b
s

i. Limite de Deteco
a
s a LDD 3 + =

124

j. Limite de Quantificao
a
s a LDQ 10 + =

k. Clculo da Concentrao (ppm)
) (
) (
L V
mg m
C =

l. Clculo da Concentrao (por diluio) (ppm)
f
V
i
V
i
C
f
C
f
n
i
n = =

m. Clculo do erro da Concentrao (ppm)
2
) (
2
) (
V
V
m
m
C C

+
=

n. Clculo do erro da Concentrao (por diluio) (ppm)
2
) (
2
) (
2
) (
f
V
f
V
i
V
i
V
m
m
C C

+
=

o. Teste de Mandel
Regresso Linear: bx+a
s
x/y
(alnea f anterior)
Regresso Quadrtica: cx
2
+bx+a
s
y2
(calcula-se do mesmo modo que s
x/y
)
DS
2
= (n-2) s
x/y
(n-2) s
y2

PG = DS
2
/s
y2

Se PGF(0,05;n
l
;n
q
) Tendncia Linear

125

Anexo IV - Instrues de funcionamento do GC-MS

Construo do Mtodo de Anlise e Injeco de Padres/Amostras em GC-MS

Clicar no cone do Software > System Control / Automation e esperar que todos os componentes se
apresentem operacionais;
Verificar o nvel de ar e gua no sistema: clicar em Manual Control > Air/Water Check > Begin,
esperar enquanto o sistema faz a medio, e uma vez lendo os resultados, clicar em Done.
Clicar em Aquisition.
Se o Air/Water Check apresentar nveis de Ar ou gua elevados deve-se passar gs de arraste pela
coluna, e durante esse tempo fazer a temperatura subir de modo a evaporar a gua presente; se o
Air/Water Check apresentar nveis aceitveis, pode-se proceder com as anlises.
Para construir o mtodo de anlise com as condies experimentais pretendidas: clicar no nome do
mtodo e de seguida em View/Edit Method; clicar em Auto Sampler e seleccionar None (no se
pretende utilizar Injector automtico); clicar em Flow Pressure e defini-lo a 1 mL/min; clicar em
Column Oven e definir a Rampa de Temperatura; clicar em Injector, definir a temperatura do injector
e introduzir o tempo total de anlise; clicar em MS Aquisition Method e definir os intervalos de tempo
em que o filamento est ligado e desligado, seleccionar Ionization On, e em Scan Type escolher Full
ou MS/MS. No caso do mtodo Full Scan em Ionization seleccionar EI, e em Internal EI Parameters
definir a Emission Current a 10 Amps; no caso MS/MS em Ionization seleccionar EI, e em Internal
EI Parameters definir a Emission Current a 20 Amps, em MS/MS Parameters introduzir a relao
m/z do io precursor, em WaveForm Type escolher Ressonant, em Excitation Storage Level calcular a
relao m/z para um q value de 0,4, em Excitation Amplitude introduzir o valor determinado numa
optimizao de condies pelo mtodo AMD.
Optimizao das Condies: Abrir o mtodo e clicar em MS Aquisition Method, e em Scan Type
seleccionar AMD. Clicar em AMD Parameters; em Precursor Ion e introduzir a relao m/z do pico
base para o composto em estudo; em Waveform Type seleccionar Resonant; em Excitation Amplitude
introduzir as seguintes voltagens de cima para baixo: 0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,50, 0,60, 0,70, 0,80,
0,90 e 1,00; em Product Ion Start Mass introduzir a relao m/z mnima a detectar (50), em Product
Ion End Mass introduzir a relao m/z mxima a detectar (m/z do pico base + 10). Ao fazer a
injeco com estas definies, o cromatograma tem 10 verses diferentes, uma para cada voltagem
de ionizao. Deve-se fazer uma anlise deles todos de modo encontrar um intervalo de voltagens
(por exemplo 0,40-0,50 V) em que o io base passe a ter uma intensidade menor e aparea um novo
io base. Seguidamente redefinir novamente as voltagens (seguindo o exemplo: 0,40, 0,41, 0,42,
0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49 e 0,50 V), e analisar todas as verses de modo a verificar
qual a voltagem de ionizao ptima para a anlise MS/MS, sendo esta a que produz um espectro de

126
massa em que o io base inicial passe a ter uma intensidade de cerca de 30% e exista um novo io
base.
Clicar em File > Save As, e dar um nome o mtodo. Fechar o Method Builder.
Clicar em File > Open Method, e seleccionar o mtodo definido anteriormente.
Clicar no nome do mtodo e de seguida em Re-Activate Method.
Clicar em Single Injection, dar o nome ao cromatograma a ser criado, e clicar em Injection.
Esperar que o equipamento passe do estado Not Ready para Waiting/Ready. Fazer a injeco.
Uma vez obtido o cromatograma, para fazer a integrao do pico deve-se primeiramente ampliar o
pico cromatogrfico de interesse. Carregar na Tecla I e ao mesmo tempo desenhar uma linha na
base do mesmo. Largar a Tecla I para obter a rea correspondente a esse pico.

Construo de Rectas de Calibrao em GC-MS (Full Scan)

Abrir o Mtodo (Full Scan) e clicar em Calculations Setup. Seleccionar o Measurement Type (Area), e
o Calibration Type (External Standard). Clicar em Compound Table, e de seguida em Select Data File.
Seleccionar o cromatograma com o composto de interesse. Clicar em Build Compound List e aparece
o cromatograma. Clicar em cima do(s) pico(s) cromatogrfico(s) desejado(s). No Method Builder
clicar em Import Compound List e aparece uma tabela, na qual se deve seleccionar o(s) tempo(s) de
reteno de interesse, e clicar em Select. Clicar duas vezes em cima do tempo de reteno na
Compound List para aparecer uma nova caixa de dilogo. Clicar em Calculations, seleccionar
#Calibration Levels (7), e Calibration Level Amounts (inserir as 7 concentraes diferentes da recta de
calibrao, sendo a primeira a mais diluda). Clicar em Ok. Clicar em File e de seguida em Save.
Clicar em File > New Sample List. Na linha 1 seleccionar New Calib Block, nas restantes (2 a 8)
inserir o nome do cromatograma a ser criado para cada nvel de calibrao e seleccionar Calibration
no Sample Type. Em Calibration Level inserir os nmeros de 1 a 7 sucessivamente, e em Injection
inserir o nmero de rplicas para cada nvel de concentrao. Clicar em Begin.

Construo de Rectas de Calibrao em GC-MS/MS

Abrir o mtodo (MS/MS) e em Calculations Setup. Seleccionar o Measurement Type (Area), e o
Calibration Type (External Standard). Clicar em Compound Table, e de seguida em Select Data File.
Seleccionar o cromatograma com o composto de interesse. Clicar em Build Compound List e aparece
o cromatograma. Clicar em cima do(s) pico(s) cromatogrfico(s) desejado(s). No Method Builder
clicar em Import Compound List e aparece uma tabela, na qual se deve seleccionar o(s) tempo(s) de

127
reteno de interesse, e clicar em Select. Clicar duas vezes em cima do tempo de reteno na
Compound List para aparecer uma nova caixa de dilogo. Clicar em Calculations, seleccionar
#Calibration Levels (7), e Calibration Level Amounts (inserir as 7 concentraes diferentes da recta de
calibrao, sendo a primeira a mais diluda). Clicar em Ok. Clicar em File e de seguida em Save.
Clicar em File > New Sample List. Na linha 1 seleccionar New Calib Block, nas restantes (2 a 8)
inserir o nome do cromatograma a ser criado para cada nvel de calibrao e seleccionar Calibration
no Sample Type. Em Calibration Level inserir os nmeros de 1 a 7 sucessivamente, e em Injection
inserir o nmero de rplicas para cada nvel de concentrao. Clicar em Begin.

128
Anexo V - Instrues de funcionamento do LC-MS
[42]

Instrues de Funcionamento do LC-MS: Ligar os trs interruptores do LC (no Surveyor AS, no
Surveyer LC Pump e no Surveyor PDA Plus); Abrir o software XCalibur e clicar em Instrument Setup;
Clicar em Surveyor LC Pump, na caixa de dilogo aberta; Seleccionar General e preencher o quadro
(nome dos eluentes); Clicar em Gradient Program e escolher a percentagem de cada componente
(exemplo 50 % de eluente A e 50 % de eluente B).
Realizao da Purga: Rodar o Drain 180 para a direita, no Surveyor LC Pump; na caixa de dilogo do
Instrument Setup, clicar um Surveyor LC Pump e na barra de ferramentas seleccionar: Surveyor LC
Pump > Direct Control > Operation; Seleccionar Solvent valve A e clicar em Purge (efectua a purga do
eluente A); Efectuar o mesmo procedimento para os outros eluentes; Voltar o Drain 180 para a
esquerda.
Lavagem da Seringa: Na caixa de dilogo do Instrument Setup, clicar em Surveyor AS e na barra de
ferramentas selecionar em Surveyor AS > Direct Control > Operation; Clicar em Wash needle e na
caixa de dilogo clicar em Reservoir e escolher flush bottle e indicar o volume de lavagem (L); Clicar
em Apply.
Definir sequncia de anlise: No menu principal do X-Calibur, clicar em Sequence Setup e definir a
sequncia directamente na caixa de dilogo; Gravar a sequncia; Para verificar as condies do
mtodo, clicar com o boto direito do rato em Instrument Method e seleccionar Open File; Na caixa
de dilogo aberta, escolher Scan Type (Full Scan), Polarity (Positive), Data Type (Centroid), MSMS
(Parent Mass m/z), Tune Method (Cafena); Na mesma caixa de dilogo aberta clicar em Divert Valve,
seleccionar Use Divert Valve, escolher em Number of valve positions: 3, e Position at Start to Run: To
Waste, e com o cursor escolher a posio em que do Waste se passa para o Load-Detector no
equipamento do MS, Depois de definidas as condies do mtodo, clicar em File > Save As; Na caixa
de dilogo aberta do lado esquerdo da sequncia, clicar no boto direito do rato em Surveyor LC
Pump e clicar em Turn On Device; Proceder de igual modo no Surveyor PDA Plus; Clicar em Real
Time na barra de ferramentas.
Integrao dos Picos Cromatogrficos: No menu principal do X-Calibur, clicar em Qual Browser; Clicar
em File > Open e seleccionar o cromatogrma que se pretende integrar; Clicar no cone que se
encontra esquerda no ecr do monitor do cromatograma; Clicar no boto direito do rato, escolher
Peak Detection > Set Peak Detection Algorithm and Detect all in this Plot > Genesis; Clicar em Ranges
> Scan Filter > Peak Algorithm: Genesis > Detector: MS > Plot Type: base peak > Ok; Clicar em
Display Options > Labels > Area/Height > Ok.
Precaues: Pelo menos uma vez por semana, os solventes devem ser desgaseificados durante pelo
menos 30 minutos no banho de ultra-sons; todos os solventes utilizados devem ser previamente
filtrados; a purga deve ser feita sempre que o equipamento ligado; a seringa deve ser lavada entre
cada anlise.

Analise Uva

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Analise Uva

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Sara Sofia Marques Fernandes

You might also like