EQUIPO 6 ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS:

CINTICA ENZIMTICA: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR. Resumen

Para evaluar el xito de la purificacin de la enzima LDH se calculo el rendimiento y las veces de purificacin mediante ensayo cintico, construyendo las curvas temporales de actividad de la LDH midiendo la disminucin de absorbancia del NADH a 340nm. Se determin la actividad enzimtica de la enzima LDH del musculo de pollo empleando la reaccin en sentido de piruvato a lactato, utilizando como fuente de enzima la fraccin 3 obtenida durante el protocolo de purificacin de la LDH, de igual manera se determinaron sus constantes enzimticas, Km y Vmax, as como el tipo de inhibicin del oxamato. El ensayo se bas en la deteccin de los cambios de absorcin del NADH y el NAD+, tanto en presencia como en ausencia de un inhibidor en este caso el oxamato. El NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no.

Introduccin
CINTICA ENZIMTICA El mtodo ms antiguo utilizado en enzimologa, desarrollado por Leonor Michaelis y Maud Menten, y que en la actualidad sigue siendo de gran utilidad, consiste en analizar como vara la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente en funcin de algunos parmetros experimentales como la concentracin del sustrato o la de la propia enzima, lo que globalmente se conoce con el nombre de cintica enzimtica. La cintica de las reacciones catalizadas por enzimas muestra un rasgo caracterstico que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin del enzima por el sustrato. Cuando se mide la velocidad inicial de una reaccin catalizada enzimticamente se observa que para concentraciones de sustrato bajas la velocidad de reaccin es proporcional a dicha concentracin, como ocurre con carcter general para las reacciones no enzimticas. A medida que la concentracin de sustrato aumenta la velocidad de reaccin deja de ser proporcional a sta. Con un aumento posterior la velocidad de reaccin llega a ser totalmente independiente de la concentracin del sustrato y se aproxima asintticamente a un valor mximo que es caracterstico de cada enzima y que se conoce como velocidad mxima. Se dice entonces que la enzima se haya saturado por el sustrato. La concentracin de sustrato a la cual la reaccin alcanza la mitad de su velocidad mxima se conoce con el nombre de Km (constante de Michaelis-Menten). Km es un valor caracterstico de cada enzima y constituye una medida de la afinidad del enzima por el sustrato: valores bajos de Km indican una alta afinidad mientras que valores altos representan una baja afinidad. La enzima y el sustrato se combinan de modo transitorio para formar un complejo enzima-sustrato en el que se alcanza el estado de transicin con mayor probabilidad que en la reaccin no catalizada. Una vez alcanzado dicho estado el complejo enzima-sustrato se descompone para dar lugar a los productos y la enzima libre. INHIBICIN ENZIMATICA. Existen una serie de sustancias, llamadas inhibidores, que inhiben o anulan la accin de las enzimas sin ser transformados por ellos. Su estudio resulta de gran utilidad a la hora de comprender los mecanismos de catlisis, la especificidad de los enzimas y otros aspectos de la actividad enzimtica. La inhibicin enzimtica

puede ser irreversible o reversible, esta ltima comprende a su vez tres tipos: inhibicin competitiva, acompetitiva y no competitiva. INHIBICIN IRREVERSIBLE. Algunos inhibidores se combinan de modo permanente con el enzima unindose covalentemente a algn grupo funcional esencial para la catlisis con lo que el enzima queda inactivado irreversiblemente. INHIBICIN REVERSIBLE. Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se combinan con el enzima libre sino con el complejo enzima-sustrato. S distinguen tres tipos de inhibicin reversible: INHIBICIN COMPETITIVA. El inhibidor es una molcula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con l por acceder al centro activo, pero que no posee ningn enlace susceptible de ser atacado por el enzima. El inhibidor forma con el enzima libre un complejo enzima-inhibidor de caractersticas cinticas anlogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que, lgicamente, no puede descomponerse a continuacin para dar lugar al enzima libre y a los productos INHIBICIN INCOMPETITIVA. El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unin al sustrato, sino que lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los productos. El inhibidor se coloca prximo al centro activo situado de tal manera que impide fsicamente la salida de los productos: INHIBICIN NO COMPETITIVA. El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo en la accin de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en el una alteracin que dificulta bien la formacin del complejo enzima-sustrato o bien la descomposicin de ste para dar lugar a los productos.

Hiptesis
Dado que la actividad de la LDH aumenta con la adicin de diferentes concentraciones de sustrato, entonces al aadirse cantidades mayores de aquel, llegar a su saturacin, momento en el cual se mantendr constante la actividad enzimtica. Si el oxamato presenta una estructura similar al piruvato se espera que sea un inhibidor de tipo competitivo y que la eficiencia de dicha enzima se vea afectada con la adicin de este.

Objetivos
Medir la actividad enzimtica de la LDH mediante ensayo cintico a travs de la disminucin de la absorbancia resultante de la oxidacin del NADH a NAD+ que permita seguir y evaluar la purificacin de la enzima (actividad especfica, rendimiento y grado de pureza) Construir la tabla de purificacin con los datos de actividad enzimtica. Conocer las caractersticas generales de las enzimas y medir la actividad de una enzima utilizando el mtodo espectrofotomtrico. Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad mxima. Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa utilizando grficos de la ecuacin de Michaelis Menten.

Comparar los resultados con y sin inhibidor para determinar el tipo de inhibicin y el efecto del inhibidor sobre la enzima.

Mtodos
Ensayo de actividad de la LDH La actividad de la LDH se midi utilizando NADH como sustrato, para lo cual se agregaron para cada fraccin/celda 600 L de 100 mM de amortiguador de fosfatos, 36 L de 10 mM de piruvato y 291 L de agua. Posteriormente se adicionaron 63 L de NADH y se comprob que ste presentara una absorcin superior a 1, colocando 10 L de cada fraccin. Se realizaron una serie de diluciones para las fracciones F1, F2, F3. La FPA fue ensayada directamente. La curva temporal de actividad se construy monitoreando la disminucin en la absorbancia de NADH a 340nm cada 30 segundos por minuto y medio y mediante la ecuacin de la recta se calculo el cambio en absorbancia del NADH. Se realizaron curvas temporales para determinar la actividad de la LDH en la fraccin F3, basado en la deteccin del NADH. Se prepar una sola dilucin suficiente para medir ambas actividades, se ajusto el espectrofotmetro con agua y lemos a 340nm la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato. Realizamos la grfica de Michaelis-Menten y la de dobles recprocos. Calculamos los parmetros cinticos. Se ley la actividad enzimtica igual que en el paso anterior pero en presencia de un inhibidor (oxamato). Realizamos los mismos pasos de grficas y clculos que en la primera. Comparamos los datos obtenidos de ambas determinaciones para posteriormente analizar el tipo de inhibidor que es el oxamato.

Resultados
Actividad enzimtica de la LDH. La actividad enzimtica de la Enzima en las muestras se detect como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a que en la reaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, NAD+.

El NADH es una molcula que se absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no.

Absorbancia vs Tiempo
2 1.5
absorbancias
F3

1 0.5 0 0 100
Tiempo (s)

F2 FPA F1

200

300

400

Grafico 3. Relacin absorbancia vs tiempo del NADH

Tabla 1. Pendientes de cada una de las fracciones M F1 F2 F3 FPA

Pendiente 0.0023 0.0032 0.0034 0.0005

Tabla 2. Tabla de purificacin de la LDH de pechuga de pollo

PROCEDIMIENTO HOMOGENEIZADO (F1) SOBRENADANTE DE LA PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO 45% (F2) BOTON OBTENIDO DE LA PP CON SULFATO DE AMONIO 7O% (F3) PRIMER FRACCION QUE SALIO DE LA CROMATOGRAFIA (FPA) PT (mg) 4.986 5.637 6.693 0.003 A mmolmin 1 -1 mL 0.0222 0.0309 0.0328 0.0482 AT mmolmin-1 1mL 443.73 1543.41 4919.61 4.82 AEE -1 (mmol/min -1 mg ) 88.99 273.77 735.03 1555.86 VP 1 3 8 17 R 100.0 28.8 31.4 102000.0

PT=protena total A= actividad; AT=Actividad Total; AEE= Actividad especfica enzimtica total; R= rendimiento; VP= Veces de purificacin. El volumen total de ensayo fue de 1mL. Las muestras se diluyeron 10 veces. El ensayo se llevo a cabo con 1 L de cada muestra.

Curva temporal de la LDH

2.9 2.4
Absorbancia
0.06 0.09 0.15 0.36 0.5 0.25

1.9 1.4 0.9 0.4 0 50 100 150 200

Tiempo (s) Grfico 2.- Determinacin de la actividad enzimtica de la lactato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de piruvato.

Tabla 3. Pendientes y actividad de cada concentracin de piruvato [Piruvato] Pendiente Actividad (UI) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5 0.0035 0.0035 0.0048 0.0046 0.0035 0.0036 0.0757 0.0757 0.1038 0.0994 0.0757 0.0778

1.6 1.4
Absorbancia

Curva temporal de la LDH

1.2 1

0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

0.8 0.6 0.4 0 100 200 300 400

Tiempo (s) Grfico 3.- Determinacin de la actividad enzimtica de la lactato deshidrogenasa utilizando oxamato como inhibidor, a diferentes concentraciones de piruvato.

Tabla 4. Pendientes y actividad de cada concentracin de piruvato en presencia de oxamato. [Piruvato] Pendiente Actividad (UI) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5 0.0005 0.0006 0.0008 0.0011 0.0013 0.002 0.0108 0.0130 0.0173 0.0238 0.0281 0.0432

Curva de Michaelis-Menten
Velocidad (mol/min)
0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0.2 0.4 0.6 con inhibidor Sin inhibidor

Piruvato (mM)
Grafico 4. Curva de Saturacin de la LDH Grfica de Michaelis- Menten en presencia y ausencia de inhibidor.

Curva de Lineweaver-Burk
120 100 80 60 40 20 0 -10 -5 -20 0 5 1/[S]
Grfico 5. Representacin de Lineweaver-Burk de la LDH en presencia y ausencia de oxamato

y = 4.5247x + 22.084 R = 0.9585 1/v con inhibidor Sin inhibidor y = 0.0856x + 11.413 20 R = 0.082

1/V

10

15

Tabla 3. Parmetros cinticos de la LDH Km (mM) Enzima Enzima + oxamato Resultado 7.4986x10-3 0.2050 Aumenta Vmax (mM/min) 0.0876 0.0453 Aumento pequeo Km/Vmax (m) 0.0856 4.5247 Aumenta Vmax/Km (1/min) 11.6821 0.2209 Disminuye

Bibliografa
Campbell Mary K. 2004. Bioqumica. 4 edicin. Editorial Thomson. Mxico. pp 135-145.