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IMPORTNCIA DA DETECO DE Sclerotinia sclerotiorum EM SEMENTES DE SOJA

HENNEBERG, L. 1 JACCOUD FilHO, D. S. 2 GRZYBOWsKi, C. R. S. 3 PANOBIANCO, M. 4

RESUMO - Epidemias de Sclerotinia sclerotiorum tm causado perdas significativas na cultura da soja, tornando-se uma das doenas mais importantes na atualidade. O uso de sementes isentas do patgeno tem sido um dos principais meios de controle de inculo da doena na fase inicial, bem como da introduo da doena em novas reas, pois a presena de uma semente infectada na amostra representa no mnimo 2.000.000 de focos de infeco. Assim, a deteco do patgeno em sementes torna-se um dos pontos importantes para tomada de deciso das estratgias de controle a serem utilizadas. Existem vrios mtodos para deteco de S. sclerotiorum na semente, com variaes na sensibilidade, reprodutibilidade, economicidade e rapidez de resultados; no entanto, esses mtodos ainda so demorados, pouco precisos e necessitam ser melhorados para uso como mtodo de rotina em laboratrio de anlise de sementes. Para deteco de S. sclerotiorum na semente devese considerar vrios fatores, tais como o grau de contaminao do patgeno, a amostragem e as condies e perodo de armazenamento. Com base na literatura, conclui-se que a doena da soja causada pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum, denominada mofo branco, pode ser transmitida pela semente, aumentar o potencial de inculo da doena no campo e que h necessidade da realizao de estudos envolvendo procedimentos mais representativos de amostragem e mtodos de deteco mais sensveis de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de soja. Termos para indexao: mofo branco, mtodos de deteco, rolo modificado.

INTRODUO Sclerotinia sclerotiorum um patgeno de importncia mundial por ocorrer tanto em regies temperadas quanto subtropicais ou tropicais, alm de ser um fungo polfago, abrangendo 408 espcies e 278 gneros de plantas hospedeiras (Bolton et al., 2006). As epidemias causadas por esse patgeno na cultura da soja tm sido responsveis pela diminuio da produo agrcola brasileira, com perdas de at 40% em condies favorveis para o desenvolvimento do fungo, tais como excesso de precipitao aliado a temperaturas amenas (Almeida et al., 2005; Leite, 2005; Carregal et al., 2010). Na Figura 1 ilustra-se uma rea com perda de produo provocada pela incidncia do fungo.

FIGURA 1. rea de plantio de soja infectada pelo fungo S. sclerotiorum (Fonte: Jaccoud Filho).

Eng. Agr., Doutoranda em Agronomia - Produo Vegetal, UFPR, lucihenne@hotmail.com. 2 Professor Associado, Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade, UEPG, Avenida Carlos Calvacanti, 4748, CEP 84030-900,Ponta Grossa, PR, dj1002@uepg.br.
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Eng. Agr., Mestranda em Agronomia - Produo Vegetal, UFPR, bolsista CNPq, camilaribeirodesouza@gmail.com. 4 Professora Adjunto, Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, UFPR, Rua dos Funcionrios, 1540, 80035-050, Curitiba-PR, maristela@ufpr.br (*Autor para correspondncia).
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A doena causada pelo patgeno S. sclerotiorum mais conhecida como mofo branco, em funo dos sintomas causados na planta. Na soja, os sintomas ocorrem geralmente no tero mdio das plantas, atingindo a haste principal, pecolos, folhas e vagens. Inicialmente, ocorre nas folhas encharcamento do limbo foliar,

sendo que com a evoluo da doena as folhas secam (Figura 2). Na haste principal observamse, primeiramente, manchas de colorao parda e de consistncia mole; com o progresso da doena, h a formao de miclio branco de aspecto cotonoso (Figura 3) e, no final do ciclo, leses avermelhadas a arroxeadas (Figura 4).

FiGUra 2. Encharcameto do limbo foliar e folha da soja causada pelo fungo S. sclerotiorum (Fonte: Hennenberg).

FIGURA3. Formao de miclio branco e esclerdios na haste da soja causada pelo fungo S. sclerotiorum (Fonte: Jaccoud Filho).

FIGURA 4. Colorao avermelhada da haste da soja causada pelo fungo S. sclerotiorum (Fonte: Jaccoud Filho).

Os sintomas so acompanhados, frequentemente, com a formao de esclerdios (estruturas negras e compactas) que caracterizam a doena. O patgeno tambm atinge internamente a haste principal da planta, formando miclios e esclerdios (Leite, 2005; Bolton et al., 2006). O controle de S. sclerotiorum dificultado principalmente pela formao de estruturas de resistncia, os esclerdios, que podem sobreviver vrios anos na ausncia do hospedeiro e no se tem verificado eficincia dos fungicidas normalmente utilizados. Assim, as recomendaes para o controle do mofo branco baseiam-se no sistema integrado de medidas, como rotao de culturas, espaamento entrelinhas, uso de fungicidas, controle biolgico e utilizao de sementes isentas do patgeno (Lobo Jnior e Abreu, 2000; Vieira et al., 2001; Fontana et al., 2006; Remuska e Dalla Pria, 2007; Embrapa, 2008). Neste sentido, o uso de sementes isentas do
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fungo tem sido um dos principais meios de controle de inculo da doena na fase inicial, bem como da introduo do patgeno em novas reas. Alguns trabalhos tm demonstrado que S. sclerotiorum transmitido por sementes. Yang et al. (1998) comprovaram a transmisso de S. sclerotiorum pela semente de soja internamente infectada, demonstrando que a mesma um agente de disseminao do patgeno para novas reas. Silva et al. (2008) observaram a formao de esclerdios em sementes de feijo submetidas a teste de patologia, recomendando a no utilizao dessas sementes. A Portaria n 47, de 26 de fevereiro de 2009, da Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento, recomenda que sejam recusados lotes de sementes de soja que apresentam um esclerdio. Porm, a deteco da presena de uma semente infectada na amostra preocupante, pois cada semente produz mais que
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um esclerdio e que este, por si s, pode produzir 20 apotcios com a capacidade individual de liberar 2.000.000 ascosporos em 10 dias (Steadman, 1983). Neste sentido, uma semente tem a possibilidade de produzir, no mnimo, 2.000.000 de focos de infeco. MtodoS dE DEtECo dE S. Sclerotiorum Existem vrios mtodos para deteco de S. sclerotiorum na semente, com variaes na sensibilidade, reprodutibilidade, economicidade e rapidez de resultados (Machado et al., 2002; Brasil, 2009). O mtodo recomendado pelas Regras para Anlise de Sementes (Brasil, 2009) e mais utilizado em laboratrio de rotina para deteco de S. sclerotiorum o do blotter test, que consiste na incubao das sementes por 14 dias em temperaturas entre 10 a 15 C, sob escuro contnuo. Menten (1985) verificou que o uso de meio cultura de gar Batata Dextrose (BDA) em placas incubadas a 5 a 7 C durante sete a 30 dias de escuro contnuo tambm foi adequado para deteco do patgeno. Como desvantagem desses dois mtodos pode-se citar que alguns fungos fitopatognicos e saprfitas tm crescimento mais rpido que o fungo S. sclerotiorum, dificultando a anlise e podendo gerar um dado de falso negativo (ou seja, no se detectando a presena de S. sclerotiorum numa anlise de rotina). Trabalhos recentes tm destacado um mtodo promissor para a deteco de S. sclerotiorum , denominado mtodo Neon, no qual as sementes so incubadas por sete dias em temperaturas na faixa de 14 a 20 C no escuro, sendo o patgeno detectado pela mudana de colorao do meio, que ocorre na presena de substncias cidas (cido oxlico) liberadas pelo S. sclerotiorum durante seu crescimento. Este mtodo um dos recomendados pelas Regras para Anlise de Sementes (Brasil, 2009) para deteco do patgeno em semente de soja; porm, como h outros fungos que produzem cidos, para a distino dos mesmos torna-se necessrio o emprego de lupas (Nasser et al., 2010 ). Outro mtodo recomendado pelas Regras para Anlise de Sementes (Brasil, 2009) o rolo de papel modificado, que tem o mesmo princpio da germinao da semente, mas com a finalidade de detectar miclio cotonoso nas sementes analisadas, com a presena de esclerdios (Peres, 1996; Parisi et al., 2006).
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Apesar dos avanos obtidos, os procedimentos disponveis ainda so lentos, pouco precisos e necessitam ser melhorados para uso como mtodo de rotina em laboratrio de anlise de sementes. Os mtodos moleculares tm sido utilizados na Fitopatologia para a identificao de patgenos difceis de serem detectados e identificados pelas tcnicas tradicionais disponveis. As tcnicas moleculares, especialmente as que envolvem PCR (Reao de Polimerizao em Cadeia), tm sido empregadas com sucesso para o desenvolvimento de testes de patologia de sementes visando deteco de patgenos em diversas culturas agrcolas, sendo uma metodologia a ser desenvolvida e tambm otimizada (Jaccoud Filho et al., 2002; Taylor et al., 2006). DEtECo dA TrAnSmiSSiBiLidAdE dA DoEnA PELA SEmEntE A deteco da transmissibilidade de doenas por meio da semente muito complexa, uma vez que depende do grau de contaminao do patgeno, amostragem, armazenamento, dentre outros fatores. Dependendo do grau de contaminao do patgeno na semente, a expresso da doena externa na semente pode variar, conforme demonstrado pelos mtodos de deteco nas sementes. A semente quando infectada artificialmente em laboratrio por S. sclerotiorum facilmente detectada pelos testes de sanidade de sementes. Em pesquisas onde sementes de soja foram inoculadas com S. sclerotiorum foi constatada a presena de esclerdios em poucos dias (Napoleo et al., 2006). Entretanto, so de difcil deteco as sementes infectadas naturalmente, ou seja, sementes de lotes provenientes de reas infectadas, sendo necessrio o aumento do nmero de dias de incubao das sementes pelo mtodo de deteco blotter test de sete dias para 30 dias (Brasil, 2009). Dependendo do nvel de contaminao do patgeno na semente, o grau de agressividade da doena pode variar, pois quanto maior o grau de contaminao da semente mais rpido o seu desenvolvimento, com formao de esclerdios em poucos dias. Em situao de campo, isto poder representar uma maior capacidade de produo de apotcio e menor dependncia das condies ambientais, uma vez que possivelmente no necessitaria de muitos dias de ambiente favorvel para a formao do esclerdio e apotcio. Estudos abrangendo esses aspectos ainda so escassos.
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A amostragem usada para anlise sanitria de sementes segue o mesmo procedimento empregado para a determinao da porcentagem de germinao, o que talvez possa no ser representativo para a deteco de patgenos presentes em um lote de sementes. Indiretamente, isso poderia afetar os resultados da anlise sanitria da semente resultando em falsos negativos, ou seja, considerar que o lote no contenha S. sclerotiorum na semente, sendo que o patgeno est realmente presente no lote. Henning et al. (2009) verificaram que em 10.400 sementes incubadas pelo mtodo blotter test, representando um lote, foram observadas apenas oito sementes contaminadas por S. sclerotiorum. Assim, h possibilidade que analisando somente 400 sementes no se detecte a presena do patgeno na semente, resultando num falso negativo. Estudos de amostragem devem ser uma das abordagens pesquisadas para novos parmetros de representatividade do teste de deteco de patgenos em sementes. A relao entre o perodo de armazenamento da semente e a reduo do inculo de S. sclerotiorum outro fator importante a ser considerado, principalmente na deciso do uso do tratamento da semente, pois alguns fungos tm apresentado a diminuio de sua incidncia durante o armazenamento, podendose racionalizar o tratamento de sementes (Martins Filho et al., 2001; Galli et al., 2007). No caso da S. sclerotiorum, em trabalho realizado por Michelli et al. (2009) observou-se que o perodo de armazenamento de seis meses com temperatura variando de 22 a 25 C e umidade relativa 55 a 60% no diminuiu o inculo do fungo em sementes de soja e feijo, recomendando o tratamento de semente. Porm, h necessidade de mais pesquisas sobre o assunto. Em reas de produo de sementes que tenham histrico de S. sclerotiorum, as sementes infectadas pelo patgeno aumentam o potencial de inculo da doena no campo. Tu (1988), estudando a capacidade da sobrevivncia de S. sclerotiorum em sementes infectadas por meio de miclios dormentes nos cotildones, observou que sementes infectadas, semeadas em terra/areia e que no germinaram, apodreceram e no seu lugar formaram de trs a seis esclerdios, concluindo que a deteco de miclios dormentes na semente do patgeno importante no somente na disseminao do fungo mas tambm na epidemiologia da doena. Considerando a semente como fonte inicial de inculo de S. sclerotiorum, Hartman et al. (1998)
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fizeram levantamento da deteco de S. sclerotiorum em lotes de sementes obtidas da Assocition Improvement Crop Illinois - EUA e concluram a necessidade do levantamento da incidncia do fungo na semente para determinar o potencial de disseminao de S. sclerotiorum para novas reas. LEVAntAmEnto dA InCidnCiA dE Sclerotinia Sclerotiorum Em SEmEntES dE SoJA Diante da importncia do patgeno, foi realizado um levantamento da incidncia S. sclerotiorum em sementes de soja, produzidas em vrias reas do Estado do Paran. Utilizaram-se amostras de sementes de 50 cultivares de soja da safra 2008/09 (Tabela 1), provenientes de reas de produo dos Campos Gerais - Paran. As amostras foram coletadas entre os meses de outubro e dezembro de 2009 e armazenadas por seis meses em temperatura ambiente. Posteriormente, foram encaminhadas para o Laboratrio de Anlise de Sementes do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo da Universidade Federal do Paran, em Curitiba-PR, onde foi conduzido o estudo. A deteco do fungo S. sclerotiorum em sementes foi realizada pelo mtodo de incubao em rolo de papel (Brasil, 2009). Foram utilizadas trs repeties por cultivar, sendo feito para cada repetio exame laboratorial de 400 sementes, distribudas em oito rolos. Cada rolo foi constitudo de trs folhas esterelizadas de papel germitest (28,0 x 37,5 cm), umedecidas com gua destilada na proporo de 2,5 vezes a massa do substrato, colocando duas folhas sob 50 sementes e uma folha cobrindo-as. Posteriormente, as repeties de sementes de cada cultivar foram incubadas no germinador, a 20 C, sob condies de 100% de umidade relativa e regime de escuro contnuo, mantidos no perodo de 14 dias. Aps esse perodo, foi observada a formao ou no de esclerdios nas sementes e plntulas. Pelos resultados obtidos, verificou-se que nas amostras de sementes das 50 cultivares de soja estudadas no foi detectada a presena do fungo S. sclerotiorum, ou seja, no observou a formao de esclerdios. Foram analisadas no total 1.200 sementes por cultivar, visando obter uma amostragem e resultados mais confiveis. Embora no tenha sido detectado o patgeno nas amostras coletadas, os dados encontrados no levantamento so considerados preliminares, visto
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que h necessidade de continuidade nas pesquisas envolvendo procedimentos mais representativos de amostragem e mtodos de deteco mais sensveis de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de soja, para assim se poder afirmar com segurana que uma semente no est infectada. CONSIDERAES FINAIS Com base na literatura, conclui-se que: - A doena da soja causada pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum, denominada mofo branco, pode ser transmitida pela semente; - Sementes de soja infectadas pelo patgeno Sclerotinia sclerotiorum aumentam o potencial de inculo da doena no campo; - necessria a realizao de estudos envolvendo procedimentos mais representativos de amostragem e mtodos de deteco mais sensveis de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de soja. AGRADECIMENTO Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPq, pelo auxlio pesquisa. REFERNCIAS ALMEIDA, A.M.R.; FERREIRA, L.P.; YORINORI, J.T.; SILVA, J.F.V.; HENNING, A.A.; GODOY, C.V.; COSTAMILAN, L.M.; MEYER, M.C. Doenas de Soja. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A. CAMARGO, L.E.A. (Ed.) Manual de Fitopatologia: doenas de plantas cultivadas. So Paulo: Agronmica Ceres, 2005. v.2. p. 569-588. BRASIL. Ministrio da Agricultura e Reforma Agrria. Manual de anlise sanitria de sementes. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Braslia, DF: MAPA/ACS, 2009. 200p. BOLTON, M.D.; THOMMA, B.P.H.J.; NELSON, B.D. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology, v.7, n.1, p.1-16, 2006.

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