ELECTROFORESIS DE DNA Y TRANSFERENCIA DE CELULOSA

GALAN, Sindy; MENDOZA, Yiseth; PEREZ, Andreina DEPARTAMENTO DE BIOLOGA- QUIMICA. FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS. UNIVERSIDAD DE PAMPLONA, NORTE DE SANTANDER COLOMBIA.

RESUMEN En la prctica se realiz electroforesis con gel agarosa para determinar la cantidad de ADN, y se elabor siguiendo las reglas adecuadas para la realizacin de este, utilizando anteriormente la extraccin de ADN de sangre humana. Previamente se encontr la preparacin del gel agarosa a un 1% donde se corrieron las muestras de ADN extrado con anterioridad para determinar la presencia de ADN y el estado en que se encuentra este, posteriormente se procede la preparacin de la muestra para poder observar la corrida del ADN en el gel agarosa y finalmente se hace observacin electroforticamente de este, donde fue transportado al cuarto oscuro para hacer la observacin en los rayos UV y determinar la calidad, cantidad de ADN y si el procedimiento se realiz correctamente. PALABRAS CLAVES: ADN, gel de agarosa, electroforesis

INTRODUCCION

La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. [1] La agarosa es un polmero lineal extrado de algas marinas, en el cual las molculas de ADN de doble cadena migran de manera inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (log 10) de sus tamaos moleculares. Dado que el ADN est cargado negativamente debido a los

grupos fosfato de la molcula, la Migracin en la cmara de electroforesis ocurre del polo negativo al polo positivo. [2] Entre los factores que afectan la tasa de migracin del ADN en los geles de agarosa se incluyen: el tamao del fragmento, concentracin de agarosa, la conformacin del ADN, voltaje aplicado y amortiguador utilizado (Puerta, Urea, 2005). Las molculas de ADN de 50 pares de

bases (pb) a varias megas bases en longitud pueden ser separadas en geles de agarosa de varias concentraciones y configuraciones. Fragmentos pequeos de ADN (50 20000 pb) son separados en geles de agarosa corridos en configuracin horizontal en un flujo elctrico de fuerza y direccin constante. Bajo estas condiciones, la velocidad de los fragmentos de ADN decrece a medida que incrementa la longitud de estos y es proporcional a la fuerza del flujo elctrico. Despus de la electroforesis los fragmentos de ADN pueden observarse al utilizar compuestos fluorescentes o pueden marcarse radiactivamente. El bromuro de etidio es el colorante msutilizado para la visualizacin de ADN en los geles, se intercala en las bases delos cidos nucleicos y emite una fluorescencia cuando es iluminado con los rayos ultravioleta que permite visualizar pequeas cantidades de ADN, el uso de este compuesto debe ser manejado con mucho cuidado y con el cumplimiento riguroso de los protocolos de bioseguridad de los laboratorios debido a que se considera un agent e altamente cancergeno. PARTE EXPERIMENTAL

de electroforesis respectivo.

con

el

peine

Preparacin de muestra Colocar 1/4 de buffer de carga a las muestras de ADN. Una vez polimerizado el gel de agarosa retire con cuidado el peine, adicionar la cubeta dentro de la cmara de electroforesis colocar buffer TAE XI hasta que la solucin sobrepase 1mm por encima del gel. En el primer paso servir 10l del tubo (100mg/l) y en el segundo paso servir 10 l de ADN de timo (10mg/l).El ADN de timo se utiliza para comparar la cantidad de ADN obtenido. Se sirve la muestra previamente pre parada se deja asentar las muestra por 5 minutos se tapa la cmara de electroforesis y conectar a la fuente de energa y se deja correr el gel a 10V/cm por 30 minutos. Observacin electroforticamente el ADN Terminado los 30 minutos se desmonta la cubeta de electroforesis, el gel se transporta hasta el cuarto oscuro; agregar colorante Bio-Safe DNA o azul de metileno, dejar por 20min. Se coloca el gel sobre el transiluminador. Mientras observa el ADN, dejar la cubeta dentro del recipiente plstico se tapa el transiluminador y en el laboratorito se debe proteger la visin de los rayos UV con una mscara se enciende transiluminador, se limpia con toalla de papel el vapor formado en el interior de la tapa del equipo y posteriormente se observa la calidad y cantidad de ADN finalmente se toma un registro

-preparacin en gel de agarosa Se prepara gel de agarosa a un 1%. Donde se corren las muestras de ADN extrado con anterioridad para determinar la presencia de ADN y el estado en que se encuentra, se hace una reparacin de la cubeta

fotogrfico de sus resultados y se apaga el equipo.

RESULTADOS

ANALISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA [1] Sambrook J,Rusell D. Molecular cloning a laboratory manual. Tercera Edicin. Editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. USA.2001. [2] Puerta C & Urea C. Prcticas de Biologa Molecular. Primera Edicin. Editorial Coleccin Biblioteca del Profesional. Pontificia Universidad Javeriana. Colombia. 2005.