10 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Pesquisa
PCR em tempo real
Uma Inovao tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Caroline Monteiro Novais
Estudante do curso de farmcia do
Centro Universitrio de Barra Mansa.
E-mail: carol_farmacia@hotmail.com
Melissa Pires-Alves
Doutora em Biologia Celular e Molecular pela
Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Professora do Centro Universitrio de Barra Mansa.
E-mail: melalves@ig.com.br
Colaborador
Fbio Freitas Silva
Introduo
advent o da bi ol ogi a
molecular foi certamente
um dos maiores passos das
cincias biolgicas durante
o Sculo XX. A descoberta da Reao
em Cadeia da Polimerase (PCR) trou-
xe enormes benefcios e desenvolvi-
ment os ci ent fi cos como o
seqenciamento de genomas, a ex-
presso de genes em sistemas
recombinantes, o estudo de gentica
molecular, a determinao rpida da
paternidade e o diagnstico rpido de
doenas infecciosas.
Ultimamente, uma inovao
tecnolgica resultante da PCR, deno-
minada de PCR em Tempo Real, vem
ganhando espao nos diagnsticos cl-
nicos e nos laboratrios de pesquisa
por apresentar a capacidade de gerar
resultados quantitativos. Essa tcnica
permite o acompanhamento da rea-
o e a apresentao dos resultados de
forma mais precisa e rpida, em rela-
o PCR que apresenta somente
resultados qualitativos.
PCR
A Reao em Cadeia de Polimerase
(PCR, do ingls Polymerase Chain
Reaction), uma metodologia que
pode ser executada inteiramente in
vitro sem o uso de clulas (BRUCE,
1999). A tcnica da PCR foi desenvol-
vida nos anos 80 por Kary Mullis, que
recebeu, em 1994, o prmio Nobel.
A PCR possibilita a sntese de
fragmentos de DNA, usando a enzima
DNA-polimerase, a mesma que parti-
cipa da replicao do material genti-
co nas clulas. Esta enzima sintetiza
uma seqncia complementar de DNA,
desde que um pequeno fragmento (o
iniciador, ou primer, em ingls) j
esteja ligado a uma das cadeias do
DNA no ponto escolhido para o incio
da sntese. Os iniciadores definem a
seqncia a ser replicada e o resultado
obtido a amplificao de uma deter-
minada seqncia DNA com bilhes
de cpias (MULLIS, 1990).
Utilizao da tcnica da PCR
O desenvolvimento da tcnica
de amplificao de segmentos de DNA
utilizando a PCR abriu enormes pers-
pectivas para a anlise de genes, diag-
nstico de doenas genticas e
deteco de agentes infecciosos como
citomegalovrus, vrus da hepatite B e
C, herpes vrus simples, vrus da rub-
ola, vrus da imunodeficincia humana
(HIV), Chlamydia trachomatis,
Helicobater pylori, Mycobacterium
tuberculosis e Pneumocistis carinii.
O avano da cincia sobre a com-
preenso dos genes trouxe para a
rotina do laboratrio de gentica, fer-
ramentas que permitem o diagnstico
em nvel molecular. Na linha das doen-
as genticas, o permanente desen-
volvimento de novos protocolos tem
permitido a pesquisa de pequenas
alteraes na seqncia de DNA, como,
por exemplo, na fibrose cstica.
Outras aplicaes especialmente
teis para a PCR a clonagem de um
determinado fragmento de DNA, que
pode ser um gene e o conhecimento
do DNA codificante (cDNA) obtido a
partir da molcula de RNA, o que
permite o estudo da expresso de
genes.
Finalmente, a PCR tem um gran-
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de potencial na medicina forense. Sua
sensibilidade torna possvel utilizar uma
amostra bastante pequena (traos m-
nimos de sangue e tecidos que pode-
riam conter os restos de somente uma
nica clula) e ainda se obter uma
impresso digital de DNA da pessoa
da qual a amostra foi coletada, poden-
do assim fazer comparaes com aque-
les obtidos de vtimas e/ou suspeitos
de casos de infrao penal (SILVA &
PASSOS, 2002).
O genoma de cada ser humano
(exceto dos gmeos idnticos) dife-
rente nas regies polimrficas, sendo
possvel amplificar essas regies. As-
sim, a pesquisa de STRs (Small Tan-
dem Repeats) atravs da PCR, utilizan-
do um conjunto de iniciadores que
cobrem estas partes altamente vari-
veis do genoma humano, pode gerar
uma impresso digital caracterstica de
DNA para cada indivduo (BRUCE,
1999).
PCR em Tempo Real
A possibilidade de monitorar a
PCR em tempo real revolucionou o
processo de quantificao de frag-
mentos de DNA e RNA. A PCR em
tempo real realiza a quantificao des-
tes cidos nuclicos de maneira preci-
sa e com maior reprodutibilidade, por-
que determina valores durante a fase
exponencial da reao. O ponto que
detecta o ciclo na qual a reao atinge
o limiar da fase exponencial denomi-
nado de Cycle Threshold (C
T
) (Figura
1). Este ponto permite a quantificao
exata e reprodutvel baseado na
fluorescncia.
A emisso dos compostos fluo-
rescentes gera um sinal que aumenta
na proporo direta da quantidade de
produto da PCR. Sendo assim, os valo-
res da fluorescncia so gravados du-
rante cada ciclo e representam a quan-
tidade de produto amplificado (http:/
/www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/
WhatIs.asp, 2004). Os compostos flu-
orescentes mais utilizados so o SYBR
Green e TaqMan.
A PCR em tempo real requer uma
plataforma de instrumentao que con-
tm um termociclador com sistema
tico para a excitao da fluorescncia
e na coleo da emisso e um compu-
tador com um software para aquisio
de dados e anlise final da reao.
Estas mquinas, disponveis de diver-
sos fabricantes, diferem na capacidade
da amostra (96-poos padro,
processamento de poucas amostras
ou requerem tubos capilares de vidro
especializados), no mtodo da excita-
o (lasers ou fontes claras do espec-
tro largo com filtros ajustveis), e na
sensibilidade total. H tambm dife-
renas nos soft wares para o
processamento dos dados (http://
www.ambion.com/techlib/tn/81/
813.html, 2004).
Fluorforos
Os fluorforos so molculas que
absorvem e emitem luz em um com-
primento de onda especfico. Os siste-
mas de deteco da PCR em Tempo
Real utilizam estas molculas que pro-
porcionam o acompanhamento da re-
ao ao longo dos ciclos.
SYBR Green
O SYBR Green se liga entre a
fita dupla de DNA (Figura 2) e com a
excitao da luz emitida pelo sistema
tico do termociclador, emite uma
fluorescncia verde. As vantagens da
utilizao do SYBR Green so: baixo
custo, facilidade no uso e sensibilida-
de. A desvantagem a ligao em
todo DNA fita dupla que surge durante
a reao, incluindo os dmeros dos
iniciadores e outros produtos
inespecficos, podendo superestimar
a concentrao do fragmento alvo. O
SYBR Green no ligado ao DNA
exibe uma fluorescncia muito pe-
quena. Entretanto, a fluorescncia
realada quando ligado na fita dupla
do DNA.
No comeo da amplificao, a
mistura da reao contm o DNA
desnaturado, os iniciadores e o SYBR
Green. As molculas no-ligadas do
SYBR Green apresentam
fluorescncia fraca produzindo um si-
nal mnimo sendo este subtrado du-
rante a anlise de computador. Aps o
reconhecimento dos iniciadores, algu-
mas molculas do SYBR Green po-
dem ligar-se na fita dupla previamen-
te formada. Durante a polimerizao
catalisada pela enzima Taq DNA
polimerase, as molculas do SYBR
Green vo se ligando ao DNA recen-
temente sintetizado. Assim, a reao
Figura 1: Curva de amplificao do PCR em Tempo Real. C
T
Cycle Threshold. A
amplificao mostra 3 fases distintas (1) linha basal: no houve produtos da PCR
suficiente para detectar a fluorescncia; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR
dobra a cada ciclo e (3) fase plat: no h mais aumento no nmero de produtos.
Figura 2: Molcula de SYBR
Green entre a fita dupla de
DNA.
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monitorada continuamente e um au-
mento da fluorescncia observado
em tempo real. No ciclo seguinte, na
etapa de desnaturao do DNA, as
molculas do SYBR Green so libe-
radas e h queda no sinal da
fl uorescnci a. A deteco da
fluorescncia no fim da etapa de ex-
tenso de cada ciclo da PCR permite
monitorar a quantidade crescente de
DNA amplificado (VITZTHUM et al.,
1999).
As duas alternativas mais utiliza-
das alm do SYBR Green so
TaqMan e Molecular Beacons, am-
bos com capacidade de hibridizao
gerando transferncia de energia para
quantificao.
4.1.2. TaqMan
TaqMan uma sonda (fragmen-
to de DNA marcado usado para
hibridizar outra molcula de
DNA) utilizada para detectar
seqncias especficas nos
fragmentos de DNA amplifi-
cados na PCR. Esta sonda apre-
senta em uma extremidade
um fluorforo, e na outra ex-
tremidade um quencher (mo-
lcula que aceita energia do
fluorforo na forma de luz e a
dissipa na forma de luz ou calor) como
mostrado na Figura 3. Os produtos da
reao so detectados pel a
fluorescncia gerada aps a atividade
exonuclease 5'>3' da Taq DNA
polimerase.
Durante a PCR em tempo real a
sonda TaqMan hibridiza com a se-
qncia da fita simples de DNA com-
plementar alvo para a amplificao.
No processo da amplificao a sonda
TaqMan degradada devido ativi-
dade exonuclease 5'>3' da Taq DNA
polimerase, separando o quencher da
molcula fluorescente durante a ex-
tenso. A separao do fluorforo do
quencher resulta em um aumento da
intensidade da fluorescncia (Figura
4). Assim, durante o processo de am-
plificao a emisso de luz aumenta-
da de forma exponencial. Esse au-
mento da fluorescncia ocorre apenas
quando a sonda hibridiza e quando a
amplificao da seqncia alvo
estabelecida (HEID et al., 1996).
A reao com a TaqMan con-
siderada um mtodo sensvel para
determinar a presena ou ausncia de
seqncias especficas (HOLLAND et
al., 1991).
Molecular beacons
Molecular beacons so
oligonucleotdeos usados como son-
das de fita simples que formam uma
estrutura secundria entre as extremi-
dades 5 e 3, chamada de haste-e-
loop. O loop contm uma seqncia
que complementar seqncia-alvo
e a haste formada pelo anelamento
das seqncias complementares que
esto localizadas nas extremidades.
Um fluorforo covalentemente liga-
do no final de uma extremidade e um
quencher covalentemente ligado na
outra extremidade (Figura 5A). Os
oligonucleotdeos molecular beacons
no emitem fluorescncia quando es-
to livres em soluo. Entretanto, quan-
do hibridizam com a fita de DNA
contendo a seqncia-alvo, as sondas
assumem uma mudana
conformacional tornando-a capaz de
emitir fluorescncia (Figura 5B).
Figura 3: Ilustrao de uma sonda TaqMan.
F Fluorforo e Q quencher.
Figura 4: PCR em tempo real com sonda TaqMan.
1.Polimerizao
3.Clivagem
2.Substituio da fita
Fluorforo
Quencher
4.Polimerizao finalizada
Iniciador reverso
Iniciador foward
SONDA
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Na ausnci a de al vos, o
ol i gonucl eot deo no emi t e
fluorescncia, pois o quencher est
prximo do fluorforo captando ener-
gia. No momento em que o molecular
beacon encontra o seu alvo, ocorre a
hibridizao resultando em uma reor-
ganizao conformacional, onde o
fluorforo de dissocia do quencher,
emitindo assim a fluorescncia.
Os molecular beacons podem
ser sintetizados com diferentes cores
de fluorforos, possibilitando ensaios
que necessitam detectar diferentes
alvos em uma mesma reao. So
altamente especficos permitindo dis-
criminar seqncias-alvo que diferem
entre si por apenas um nucleotdeo
substitudo. So sondas ideais, no en-
saio diagnstico para identificao ge-
ntica, deteco de SNP (single
nucleotide polymorfism) e aplicaes
farmacogenticas (KRAMER, 2004).
Utilizao da PCR em
Tempo Real
O sistema de quantificao em
tempo real tem as seguintes aplica-
es:
Identificao de alelos em DNA
genmico;
Anlise de seqncias virais,
bacterianas ou de protozorios a partir
de vrias fontes;
Anlise de patgenos em ali-
mentos;
Anl i se de produt os
transgnicos;
A aplicao em diagnsticos, como
a deteco de patgenos, ou doenas,
torna-se interessante uma vez que
esta tcnica permite a quantificao e
rapidez do resultado, pois no mais
requer a deteco em gel de
eletroforese, necessrio na anlise da
PCR.
Concluso
As tcnicas associadas biologia
molecular e engenharia gentica
progrediram muito desde a dcada de
50, quando o DNA teve sua estrutura
descrita. O avano foi to grande que
em pouco tempo, pouco mais de 50
anos, suas aplicaes prticas j
permeiam o nosso cotidiano.
A descoberta da PCR faz parte
desse progresso, sendo que o mais
novo avano tecnolgico partiu da
prpria PCR, gerando a PCR em Tem-
po Real, que permite a quantificao
das amostras amplificadas, sendo de
grande relevncia para diagnsticos
de patgenos e doenas genticas.
Dentre as vantagens, esta tcnica em
relao PCR qualitativa esto a faci-
lidade na quantificao, maior sensibi-
l i dade, mai or preci so,
reprodutibilidade e acurcia, velocida-
de na anlise, melhor controle de qua-
lidade no processo e menor risco de
contaminao.
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Figura 5: (A) Oligonucleotdeo usado como sonda sintetizado de modo a
possibilitar a formao de uma estrutura secundria nas extremidades 5e 3. (B)
Toda fita nova formada durante a amplificao alvo para o anelamento do
molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescncia.
A
B