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CAPITULO 3
Measuring with Bioreporters
3. 1 PRINCIPALES ENSAYOS

3.1.1 MEDICIONES relativa y absoluta

Now Ahora que nos hemos ocupado de los conceptos y detalles de la circuitera gentica en la clula que componen el sensor y el sistema de presentacin de informes, podemos volver a la cuestin de cmo analizar el circuito de reportero en las clulas del sensor / reportero. En la mayora de los casos, los ensayos de reportero bio son extremadamente simple; clulas se mantienen en algn tipo de suspensin tamponada y se equilibr y se ponen en contacto con una muestra o solucin de calibrado para un perodo de tiempo determinado, despus de o durante el cual se registra la seal del informador. En un sistema de 'inducible' reportero (o "luces encendidas" - como se le llama a veces) se examina la respuesta de novo de las clulas en respuesta al compuesto objetivo, que es ms alta que la seal del informador de fondo. La incubacin de las clulas reporteras en el ensayo, incluso sin compuesto objetivo especfico que est presente, se obtienen algunos fondo reportero de la expresin, el nivel de los cuales es dependiente del tipo y caractersticas de los componentes utilizados para los circuitos del sensor / reportero (como se discute en el Captulo 2 ). El aumento de la expresin del indicador en la incubacin de la muestra que contiene la diana en comparacin con la expresin del indicador en el espacio en blanco proporciona la base para la medicin, como se explicar ms adelante. Algunos diseos reportero se basan en la medicin de una disminucin de la seal del informador (el sistema de 'luces-off'). Dependiendo del tiempo de incubacin del ensayo y el tipo de protena indicadora (estabilidad, cofactores) la seal de disminucin reportero puede ser debido a factores fisiolgicos que influyen en la actividad de la protena indicadora o a una disminucin directa en la expresin del gen indicador. La influencia fisiolgica de la actividad del indicador se explota en los periodistas bio que producen constitutivamente luciferasa. La bioluminiscencia resultante de la actividad luciferasa es un proceso de energa-y-cofactor muy exigente para la clula. Por lo tanto, cualquier interferencia con el estado de energa de la clula o con la regeneracin de los cofactores necesarios para la actividad de la luciferasa se traducir en una disminucin de la emisin de luz. Una serie de sensores de toxicidad generales bacterianas existen que operan de esta manera, y tambin el sistema Microtox despliega este principio (vase el Captulo 1). Otros diseos utilizan una combinacin de un reportero inducible (para detectar un compuesto diana) y un sistema de luces constitutiva-OFF (para reportar cualquier toxicidad interferir con la respuesta inducible) [Biran et al., 2009]. Debido a la naturaleza del sistema reportero BIO y la disposicin de ensayo, las mediciones de la seal

del informador son en la mayora de los casos mediciones relativas (Figura 3.1). Una medicin absoluta consistira en cuantificar el nmero exacto de protenas de un informador producida en una clula, pero en la mayora de los ensayos con clulas reportero se mide una actividad especfica integrada de la protena indicadora sobre un gran nmero de clulas en el ensayo. Un ejemplo de una medida relativa es la lectura en un fluormetro de

Figure 3.1: Los bioensayos con clulas de sensor / reportero bacterianas en la mayora de los casos producen mediciones relativas, debido a que la seal del informador depende de la cantidad de clulas en el ensayo y el tiempo de incubacin (A). Por esta razn, las mediciones del bioensayo de concentraciones diana en muestras desconocidas deben ir acompaadas de un conjunto de ensayos de calibracin con concentraciones diana conocidas y crecientes. La seal de la muestra se interpola a continuacin, en una curva de calibracin para obtener la 'concentracin equivalente de destino' en la muestra (B).

3.1.

un mililitro de la suspensin de ensayo que contiene 10 millones de clulas de sensores cada fluorescentes debido a una cantidad particular de GFP producido intracelularmente. La segunda razn de por qu las mediciones reportero bio son relativa es debido al efecto del tiempo de incubacin en el proceso de induccin. Cuando las clulas se dejan ms tiempo en contacto con el compuesto objetivo, la circuitera gentica puede continuar para provocar la expresin del gen reportero y esto conducir a ms protena reportera en la clula, por lo menos cuando el reportero no es una protena inestable y las clulas no se estn dividiendo ms y diluyendo la seal. Una seal del informador integrado medido en un ensayo de reportero de Bio es por lo tanto una funcin del tiempo de incubacin. Tercera razn para mediciones siendo relativa es la cantidad de clulas en el ensayo. En la prctica es muy difcil de controlar el nmero de partida exacto de clulas (bacterianas) en un ensayo de reportero de Bio. Ms clulas en un nico da producir automticamente una mayor respuesta integrada que un menor nmero de clulas en el ensayo en otro da. Reproduccin limitada de las clulas bacterianas durante la duracin del ensayo tambin puede conducir a una seal del informador en general ms alta, y tambin la fase de crecimiento de las clulas (tal como se explica en el Captulo 2 para los promotores que experimentan el silenciamiento exponencial) puede influir en la magnitud de la induccin. Con el fin de cuantificar la lectura de una medida relativa en un conjunto de muestras de uno tpicamente por lo tanto, utiliza una serie de calibracin de los ensayos simultneos con concentraciones diana conocidas. En este caso, la lectura del ensayo de una muestra desconocida, que se incub bajo las mismas condiciones que la calibracin - la misma cantidad de clulas reportero, los mismos componentes del ensayo y la temperatura, el tiempo de incubacin - se puede comparar e interpolada a los de la calibracin serie para obtener una concentracin equivalente de objetivo (Figura 3.1). Cul es el significado de "concentracin objetivo equivalente '? Recuerde que en la mayora de los casos, la capacidad de deteccin de la protena reguladora utilizada para la generacin de la seal no es completamente especfica a un solo compuesto qumico. Por ejemplo, la interaccin ArsR-operador no slo es desreprimido por arsenito, pero tambin por Antimonite con una eficiencia aproximadamente similar [Wu y Rosen, 1993]. Si la serie de calibracin se realiza con arsenito entonces la respuesta obtenida en las incubaciones con muestras desconocidas debe au fond expresarse como "concentracin arsenito equivalente, porque en la muestra desconocida que podra haber sido antimonita que provoca la respuesta reportero bio. El uso de concentraciones equivalentes a menudo complica interpretaciones reportero de ensayo bio a los ojos de los qumicos, pero si el bioensayo es visto como un rpido anlisis de primera lnea, o cuando todos los objetivos se consideran igualmente txicos o importante, el uso de concentraciones equivalentes no es problemtico. El hecho de detectar la respuesta biolgica de una mezcla completa de compuestos en realidad puede formar una ventaja adicional sobre los anlisis qumicos de los compuestos individuales.

3.1.

3.1.2 Punto final y cintica MEDICIONES, TRANSFORMACIONES DE MEDIDA

U n a p e q u e a d e sve n ta ja d e lo s s is te mas in d i cad o res q u e i mp l ican la ex p re si n d e n o vo d e g e n e s e s , si se q u ie re, el t i emp o d e reacci n n e cesario p a ra d e sa rro l la r la se a l. E ste tie mp o es u n a co mb in aci n d el tie mp o n ecesario p a ra e l c o mp u e sto o b je t ivo p ara l leg a r a la c lu la, el t ie mp o n ecesar io p a ra la ta sa d e tra n sc r ip c i n d e g e n e s d esd e el co n mu tad o r d e d estin o y la tra d u cci n m s mo d ific a c io n e s p o s tra d u ccio n ales, p o s ib le m en te, d e la p ro ten a i n d icad o ra . E n la p r c t ic a , e l t ie mp o n ecesario p ara el d e sarro l lo d e u n a se al d e p ro te n a in d ic a d o ra su f ic ie n te me n te g ran d e en u n en sa yo d e in d u cc i n es en tr e 3 0 min u to s y 2 h o ra s. E ste t ie mp o d ep en d e d el t ip o d e p ro te n a in d i cad o ra , si e l re p o rte ro la a c t i vid a d d e la p ro te n a o p resen ci a se p u e d en en sa yar d e fo r ma n o in va si va o n o , y e n la c o n f ig u ra c i n d e en sa yo y e l i n stru men to . E n mu ch o s caso s, u n o p u e d e c o n fo r ma rse c o n las med icio n es d e p u n to fin a l. E sto sig n ifica q u e se e lig e u n t ie mp o f ijo in cu b aci n d el en sa yo d esp u s d e q u e l a se a l d e l in fo r ma d o r se le e , ta n to en la serie d e ca lib raci n estn d ar y en l as mu e s tra s d e sc o n o c id a s. C u a n d o lo s b io en sa yo s es tn mu y b ien es tan d arizad o s en t r min o s d e c a n tid a d d e c lu la s, el p o ten cial d e acti vaci n d e las c lu las y la s c o n d ic io n e s d e in c u b a c i n , las resp u es tas so n mu y rep ro d u cib le y p u ed e q u e n o se a n e c e sa rio l le va r a c ab o u n a serie d e cal i b raci n co mp le ta en ca d a mo me n to . E l ti e mp o d e l p u n to fi n a l d ep en d e d e las p a rt icu lar id ad es d e l d i se o d el s e n so r / re p o rte ro y la s c e p a s h u sp ed p ara el en sa y o , p ero g en eral men te s e elig e c o mo ta l p a ra te n e r u n a re laci n mx i ma d e la in d u cci n a fo n d o l a se a l d e l in fo r ma d o r e n e l me n o r tie mp o p o sib le in cu b aci n d el en sa yo . T al co mo se re c o g e e n lo s a n e x o s 1 3 , lo s e n sa yo s d e re p o rtero B io b acterian as ms p u b licad o s u san tie mp o s d e in c u b a c i n d e 3 0 mi n u to s a 2 h o ras, p er o en caso s ex cep cio n ales o p a ra p re g u n ta s d e in ve s tig a c i n esp ec ficas p u ed en eleg i rse tie mp o s d e in cu b a c i n m s la rg o s. A d ife re n c ia d e p u n to fin al d e la med ic i n , t amb in se p u ed e o p tar p o r re a liz a r me d ic io n e s c in tic a s. E n este caso , e l a u men to reg u lar d e l a se a l d e l in fo r ma d o r o e n o tra s p a lab ras, la p en d ien te d e la ln ea d e reg res i n en la p a rte lin e a l d e la se a l d e a mp l iaci n rep o r te ro es measu red 5 y rep re se n ta r g r fic a me n te c o mo u n a fu n ci n d e la co n cen traci n d e co mp u esto d ia n a . Me d ic io n e s c in t ic a s s o n mu y ad ecu ad o s p ar a las p ro ten a s in fo r mad o ras d e lo s c u a le s la a c ti v id a d o a b u n d an cia se p u ed en med i r d e fo r ma n o in vas iva y sin d e stru ye n d o la s c lu la s (p o r eje mp lo , lu cife r asa b acterian a co n la g en era c i n d e su stra to in t ra c e lu la r, o p ro ten as au to flu o resc en tes).

3.1.

A d e m s, la s me d ic io n e s cin t icas p u ed en s er ti les p ara la mo n ito r iz a c i n c o n tin u a e n ln e a , p o r eje mp lo , d e lo s p a r metro s d el p ro ceso , cu an d o la s c lu la s in d ic a d o ra s se p u ed en man ten er su fic ien te men te b ien p ara g aran tiz a r su c o rre c to fu n c io n a mie n t o y es t ab le. S o b re la b a se d e la s me d icio n es p r i mar ias (d e p u n to fin a l o cin t ic a), se l le va n a c a b o tp ic a me n te o tr o s trata mien to s d e d at o s secu n d ario s. E sto s in clu ye n : la su stra c c i n d e l fo n d o , el trazad o lo g ar t mic o , o el clcu lo d e lo s facto re s d e in d u c c i n ( Fig u ra 3 . 2 ) . La ven ta ja d e su stra cci n d e fo n d o es qu e lo s d a to s se ve n m s b o n ita s, a u n q u e n o so n ms p reciso s (ve r secc i n 3 . 5 ). O tra fo r ma d e p re se n ta c i n d e lo s d a to s es tran sfo r mar l as se ales rep o rtero p ri ma r io s e n fa c to re s d e in d u c c i n q u e p u ed e, d e n u evo se rep resen tar g r fica men te c o mo u n a fu n c i n d e la c o n cen traci n d ian a. U n facto r d e in d u cc i n se c a lc u la d iv id ie n d o la se a l d e l in fo r mad o r en u n a c o n cen traci n p a rt icu la r p o r q u e e l e sp a c io e n b la n c o o p o r la se al en e l t ie mp o cero . Fac to res d e i n d u c c i n se u til iz a n p a ra p re se n ta r la mag n itu d d e la resp u esta a la d ian a. C u an d o lo s fa c to re s d e in d u c c i n s o n mu y b a jo , el circu it o d el sen so r / rep o rter o n o e s mu y se n sib le a la d ia n a q u mica. La cu an tif icaci n tien d e a ser i mp rec is a, ya q u e la s va r i a c io n e s e n la s me d icio n es d e mu est ras re p etid as sern ms i mp o rtan te s q u e e l in c re me n to e n la p e n d ien te d e la cu r va estn d ar ( vase ms ad ela n te la se c c i n 3 . 5 ). B a jo n in g u n a circu n stan c ia d eb e in d u cci n facto res s e calc u la r n so b re lo s a n te c e d e n te s -resta, p o rq u e van a s er art ific ial men te a lto . P o r lti mo , e s fre c u e n te e n c o n t ra r d ato s d e lo g -tran sfo r mad o , p o r e je mp lo , la p r o d u c c i n d e re p o rte ro e n fu n c i n d e l lo g ari t mo d e la c o n cen traci n o b je ti vo . D ad o q u e la ma yo r a a me n u d o la resp u esta b io l g ica si g u e u n tip o d e "sa tu r aci n ", e n e l q u e ma yo re s q u e la s co n cen tracio n es p t i mas d e d es tin o n o p ro d u c e n un a u me n to a d ic io n a l d e l a resp u esta, las cu rva s d e calib rac i n resu lta n tes m s d e u n a a mp l ia g a ma d e c o n cen tracio n es to man la fo r ma d e u n a fo r ma d e S . C lc u lo d e la l n e a d e re g re si n se p u ed e real izar en cu rvas S co mo p ara cu rvas l in e a le s u sa n d o min i miz a c i n r e sid u al d e la su ma d e lo s cu ad rad o s en tre e l p red ic h o y la s me d ic io n e s e f ic a c e s [Mu rk et a l. , 2 0 0 2 ]. 5 E n c a so d e q u e la c in tica d e d esarro llo d e la s e al d el in fo rmad o r n o se p u e d e n d e sc rib ir c o n u n a fu n c i n lin e a l, s e u t iliz a o tro p a r me tro d e a ju s te

3.1.

FIGURA 3.2: Varios tratamientos de datos tpicos de ensayos biosensor /-reportero. (A) Antecedentes resta de la seal en blanco. (B) La normalizacin de datos de seales indicadoras en los factores de induccin (B '), y una seal en blanco 1. (C) mediciones cinticas de la pendiente del incremento de la seal en diferentes concentraciones y en el espacio en blanco, transformado a un solar de concentracin pendientes-contra-objetivo (C '). (D) el diario de transformar las parcelas durante los intervalos de concentracin amplios. Disminucin de la seal a mayor que el mximo es un resultado de la toxicidad. Calibraciones lineales de los ensayos de biosensor /-reportero se pueden ver como la respuesta dentro de un intervalo de concentracin limitado de la curva en S. Posiblemente, la seal a concentraciones muy altas disminuye otra vez debido a la toxicidad objetivo (Figura 3.2 (D))

3.1.3

Mediciones de poblacion
Una serie de conceptos para la medicin de seales indicadoras son diferentes de la idea general se ha explicado anteriormente, y se han solicitado reportero ensayos biolgicos en ambientes complejos, en particular cuando se adquiere la informacin de las clulas reporteras individuales (por ejemplo, en la planta, en el suelo, o en el interior intestinos, Figuras 3.3, 3.4). Expresin reportero de clulas individuales en una poblacin es idealmente normal distribuido alrededor de una media (que se mide en un macro-ensayo en toda la poblacin), sin embargo, en algunos casos la expresin en clulas individuales es o muy dbil o no normal distribuida (Figura 3.3 ). La distribucin normal se puede probar por el trazado de los datos acumulados en grficos de probabilidad normal, para los que los datos distribuidos normales aparecen como lneas rectas [Laemmli et al., 2000]. En los casos de muy dbil

3.1.

Figura 3.3: ediciones de la seal del reportero y la transformacin de datos a partir de clulas individuales. Imagen digital o la citometra de flujo de datos reportero de clulas individuales (A) se representa como una curva de distribucin normal (B), de la cual se calcula una media de intensidad de seal de reportero. Clasificacin acumulada de las mismas seales indicadoras en toda la poblacin (C) proporciona una manera fcil de discernir cualquier aberracin de distribuciones normales, que se pueden visualizar ms mediante la presentacin de grficos de probabilidad normal. En caso de que las seales indicadoras entre los tratamientos difieren muy poco o cuando la distribucin de la seal del informador no es normal, los promedios potenciado (por ejemplo, el promedio entre el 70 y el percentil 95) se puede utilizar. Bootstrapping se utiliza para calcular intervalos de confianza [Kohlmeier et al., 2007].

La expresin de genes Porter, nosotros y otros han calculado ' impuls medias ' , el promedio entre el percentil 70 y el 95 % en una poblacin de clulas reportero acumulativamente ordenadas de acuerdo a la intensidad de reportero (Figura 3.3 (D ) ) . La ventaja de la media impulsado es que las diferencias en la seal del informador entre los tratamientos se amplifican , lo que hace que su discriminacin estadstica ms potente [ Kohlmeier et al . , 2007 ] . Tratamientos de datos adicionales ms complejas como anlisis de redes neuronales pueden ser utilizados para identificar la subpoblacin ms ptimamente realizar de clulas a partir de conjuntos de datos de citometra , tal como el desarrollado por Wells y compaeros de trabajo [ Busam et al . , 2007 ] . Un caso extremo adicional de la expresin del indicador en la poblacin dependiente es el basado en el reportero interruptor explic en la Seccin 2.8 . Este reportero - en teora - slo no produce o mxima de salida , dependiendo de la orientacin del interruptor del promotor en frente del gen reportero . Porque no hay modulacin gradual de la seal del informador en las clulas reporteras individuales ,

3.1.

A
of cells

Reporter signal

B
of cells

Reporter signal
Figure 3.4: Reportero ensayos bio dependientes Poblacin. (A) Un interruptor de palanca-bio reportero slo puede responder con ninguna o seal mxima. La proporcin de clulas que muestran la seal mxima despus de la incubacin en un entorno complejo en particular (por ejemplo, una raz de la planta) es por lo tanto una medida de la respuesta inducible. (B) La historia bio reportero reproductiva se induce al mximo al inicio del experimento, pero se diluye cada vez que una clula se divide. En lugar de la medicin de nuevo de induccin se mide la disminucin de la seal del informador en una poblacin de clulas recuperadas despus de un tiempo de incubacin en un entorno particular. La reproduccin de las clulas se puede derivar de las proporciones de las clulas con menor fluorescencia.

La p ro p orc in de c lu las en u na po b lacin qu e mu estra la seal m x ima re po rte ro es u na me d ida ms relevan te p ara la resp uesta ind u cib le [Casava n t e t a l. , 2 00 3 ]. U n a a p lic a ci n til d e este prin cipio es qu e la in fo rmacin sob re la re spu e sta ind u c ib le p ue d e ser recup erada a p artir de bsicamen te cu alq u ie r n me r o d e c lu la s re portero (Fig u ra 3 .4 ). Clu las Repo rter p o r lo tan to p od ran se r se mb ra d as en un en to rn o co mp lejo y se recup eraron desp u s de u n c ie rto p e riod o d e in cu ba c i n , d esp us de lo cual la respu esta pu ed e ser ex trado de u n p eq ue o n me ro d e c lu las recu perad as repo rtero [No rman et al., 2 . 00 6 ]. E l se gu nd o e je mp lo e s u na fo rma d e rep o rtero de 'lu ces -o ff', en el q ue se parte de u n a p ob la c i n d e c lu la s repo rtero qu e tod o V isu alizar la se al mx ima d e u n re po rte ro esta b le

Protenas, pero que diluye cada vez que las clulas se dividen (Figura 3.4). El concepto de que el reportero es medir el xito reproductivo de las clulas indicadoras en el medio ambiente en particular. El circuito reportero se basa en el promotor lac LacI reprimida , que se convierte derepressed en presencia de un compuesto efector artificial como IPTG . Las clulas indicadoras estn por lo tanto al mximo desreprimidos al comienzo del experimento y luego introducidos en un entorno de toma de muestras de que uno espera de IPTG ( o cualquier otro inductor para el opern lac ) no estn presentes . Cada vez que una clula se divide la seal del informador se convertir en dos veces tan bajo ( puesto que no hay nueva de induccin ) , por lo tanto , la intensidad de la seal del informador en comparacin con el tiempo cero y el nmero de clulas que muestran un estado particular de la intensidad de la seal del informador se puede interpretar en trminos del nmero de divisiones que esa poblacin celular periodista en particular ha experimentado en el tiempo [ Remus - Emsermann y Leveau , 2010 ] . En la prctica , despus de cuatro divisiones celulares la seal se vuelve demasiado baja para ser detectada . El sistema es un enfoque til para la cuantificacin , por ejemplo , las cantidades de carbono y nutrientes para las clulas en microambientes como hojas de la planta disponible, o en la competencia entre las diferentes especies

3.2. T E O R A D E L A P R E S T A C I N A N A L I T O TRANSPORTE

3.1.4

Rematar
Considerando que las curvas de calibracin pueden llevarse a cabo en condiciones ptimas, las mediciones de muestras reales en el ensayo indicador de bio pueden llegar a ser problemtica debido a los compuestos adicionales que estn presentes en la muestra , que puede inhibir o estimular el rendimiento de las clulas . Con el fin de medir correctamente, por lo tanto, uno tiene que adaptar la composicin del medio para el ensayo de calibracin lo ms cerca posible a la del ensayo incluyendo la muestra . Por ejemplo , si una muestra de agua de mar se va a medir en un medio de calibracin del ensayo de otro modo sin sal , la serie de calibracin tiene que incluir la concentracin de sal introducido desde el agua de mar ( o la muestra tiene que ser limpiado para tener la sustancia pura , vase la Seccin 3.4 ) . En segundo lugar , se puede utilizar los llamados mediciones de pas , en la que una concentracin conocida del objetivo puro se aade a la muestra . El aumento medido en la muestra enriquecida puede entonces ser comparado con el aumento esperado de la curva de calibracin , y , si las pistas de aumento son diferentes , se puede utilizar para estimar un factor de correccin ( Figura 3.5 ) . Se recomienda el uso de clavar , pero la estimacin del factor de correccin no es fcil en el caso de curvas de calibracin no lineales. Si la pendiente en el control de pinchos manifiesta demasiada inhibicin , se debe producir una serie de dilucin de la muestra (por ejemplo , 0.3 , 0.1 , 0.03 , 0.01 veces) y repetir la medicin, o proceder a una limpieza de la muestra especfica antes de ejecutar el ensayo indicador . Como una alternativa adicional para la correccin para sustancias posiblemente inhibidoras en muestras desconocidas , se podra disear un circuito doble reportero como se explic anteriormente , con un parmetro inducible y uno constitutiva - la seal constitutiva que funciona como la medida de control inhibitorio [ . Biran et al , 2009 ]

3.2 TEORA DE LA PRESTACIN ANALITO Y TRANSPORTE 3.2.1 CLCULO DE LAS CONCENTRACIONES COMPUESTOS EN CLULAS REPORTERO
La seal del informador generada por las clulas es dependiente tanto de la naturaleza del circuito reportero, el tiempo de incubacin y la cantidad de compuesto (analito) experimentado por las clulas por unidad

3.2. T E O R A D E L A P R E S T A C I N A N A L I T O TRANSPORTE

y (spiked sample)

y(sample)

lnea de tendencia regular de calibracin: y = ax + b y = la seal del informador x = objetivo de concentracin a = pendiente (lnea azul) b = interseccin xsample= (ysample - b)/a spiked correction: a = slope of inhibition trend line = (yspiked sample - ysample) spiked concentration difference xsample,corr = (ysample - b)/a

signal

x(no corr)

x(spiked corr)

Target concentration

Figura 3.5:Para controlar las posibles sustancias inhibidoras en la muestra, se realiza un ensayo de pas en la que se aade una cantidad conocida de compuesto diana puro a la muestra. Cuando no est presente la inhibicin, el aumento de la seal del informador en la muestra de pas se siga la pendiente calculada a partir de la lnea de tendencia de calibracin (en azul). Si esto es menos de lo esperado, una lnea de tendencia alternativa se calcula sobre la base del aumento observado en el enriquecida frente a la muestra no-enriquecida (en rojo). Esta pendiente una 'se utiliza entonces para calcular la concentracin objetivo equivalente en la muestra. Obviamente, cuando un 'se convierte en muy plana una correccin clavar ya no puede ser calculada razonablemente y la muestra debe ser diluida o limpiado. El ejemplo de clculo que aqu se supone que la salida de reportero en concentracin objetivo cero no est cambiando en las muestras con una composicin inhibidora de las clulas reportero.

De tiempo, y puede ser calibrado arbitrariamente como se explic anteriorment. Por el contrario, no es trivial para predecir qu cantidad de compuesto objetivo pasa a travs de una clula por unidad de tiempo o se detecta por el circuito del sensor / reportero en cualquier concentracin de compuesto objetivo externo dado, aunque debe existir algn tipo de relacin entre la concentracin de analito en la medio de ensayo y la cantidad de analito en la clula del sensor /reportero [van der Meer et al 2004]. Para entender esta relacin es importante porque e l tipo de ensayo de indicador (la 'macro -ensayo') y la naturaleza de la clula reportero diseada pueden influir en el flujo de analito diana a las clulas, y por lo tanto determinar el mtodo de lmite de deteccin o sensibilidad de deteccin del ensayo. Como una primera aproximacin se podra considerar un ensayo indicador de Bio tpico en el que se incuba una cantidad arbitraria de clulas en suspensin acuosa ( por ejemplo, 5 107clulas por ml) con un compuesto diana soluble(la muestra) para una cantidad particular de tiempo. Podramos suponer, adems, que este tipo de reportero bacteriana no tiene medios especficos para transportar activamente molculas diana de la solucin a granel a su celular y en el interior de la clula, y que todas las molculas objetivo llegar a las clulas reportero por difusin molecular. Transporte difusivo de molculas solubles se describe por las Leyes de Fick, con

3.2. THEORY OF ANALYTE

AND

una aproximacin fcil ( demasiado simple pero ) que la distancia de difusin media (x ) es proporcional a la raz cuadrada del tiempo de difusin (t) veces difusividad de la molcula de (D ) veces 4 , de la que se deduce que la difusin ms del doble de la distancia tarda de cuatro veces ms largo [ Schwarzenbach et al . , 1993 ] . al difusividades tpicos de compuestos disueltos en agua (~ 10-5 cm2 s - 1 ) , una distancia media celular de ~ 36 micras en una suspensin de 5 107 clulas por ml en promedio es cubierto en aproximadamente 80 ms. De esto se deduce que es probable que los contactos entre todas las molculas diana y todas las clulas se han producido en el tiempo tpico de un ensayo de biosensor de entre 1 y 2 h . Sin embargo , cuando la difusin es el nico conduccin proceso de transporte y suponiendo que se comporta interior de las clulas como la solucin a granel , en virtud de equilibrio la concentracin del compuesto de destino fuera de la voluntad igual que en el interior ( vase, por ejemplo , [ Leveau et al . , 1998 ] ) . Supongamos un compuesto diana con una concentracin de la fase acuosa disuelta de 1 M , que corresponde a 1 106 6.0 1023 molecules per L = 6.0 1017 molecules per L, or 6.0 1014 per mL. En la densidad celular asumido de 5 107 por ml en el ensayo, esto significara que: 6.0 1014 divided by 5 107 = 1.2 107 molecules Potencialmente podran ser "disponible" por clula y podra contribuir a la obtencin de la seal indicadora. Sin embargo, bajo las condiciones de equilibrio asumidos de transporte difusivo y no hay acumulacin de compuesto diana en las clulas reporteras, y asumiendo, adems, un volumen de la clula bacteriana tpica de 1 fL (1012 mL), solo 6.0 1014 1012 = 600 molecules Sera realmente presente por clula sensor / reportero . Estos 600 molculas son , obviamente, slo una diminuta fraccin de lo que era potencialmente disponible para las clulas reportero en esta concentracin ( 1,2 107 ) . Equilibrio por difusin se puede esperar que se alcance en pocos segundos [ Leveau et al. , 1998 ] . Tambin es interesante notar es que la fraccin del compuesto dentro de las clulas indicadoras ( la biota ) en el ensayo total sera igual a 600 107 = 5 3 1010 molculas o menos del 1 por mil . Curiosamente, las concentraciones diana externas de 0,1-1 M corresponden aproximadamente con el mtodo del lmite de deteccin para muchos una solucin acuosa de 'equilibrio ' reportero ensayos bio ( anexo 1-3) , lo que sugiere a la conclusin de que algn tipo de lmite fsico de transporte se alcanza bajo tales condiciones . Sin embargo , no hay informacin experimental suficiente en este momento para concluir si un equilibrio de difusin es esttica ( es decir , una vez que se alcanzan 600 molculas en nuestro ejemplo , no hay ms afluencia ) , o cintica en el sentido de que muchas ms molculas inductoras pasan a y hacia fuera de las clulas durante el curso de la bioensayo , pero que por unidad de tiempo slo mximo 600 estn presentes por clula . Por otra parte, no tenemos forma actual de predecir si los calculados 600 molculas intracelulares pueden provocar la expresin gnica slo una vez ( por ejemplo , despus de lo cual se mantienen unida a una protena reguladora ) o tal vez varias veces. Pero tenga en cuenta , por ejemplo , el caso publicado de un reportero bio de mercurio con un mtodo de lmite de deteccin de 1 fM [ Virta et al. , 1995 ] . A una concentracin de 1 fM , el nmero de molculas por ml se convertira: 1 1015 6.0 1023 molecules per L = 6.0 108 molecules per L, or6.0 105 per mL.

3.2. THEORY OF ANALYTE

AND

En la densidad celular asumido de 5 107 por ml y suponiendo adems las condiciones de equilibrio, no habra claramente menos de una molcula disponibles por clula. Esto sugiere que una sola molcula de mercurio podra reciclar a travs de muchas clulas (va de flujo de salida y la absorcin), o la expresin de genes de activacin mltiples veces, lo que lleva a un reportero notablemente sensible.

3.2.2

BIOREPORTERS hermtico a la difusin Y no conservadora

El reportero de ensayo Bio descrito anteriormente presenta un escenario relativamente simple , que con toda probabilidad es ms complejo , en realidad, debido a la presencia de factores especficos celulares o compuestos. Clulas Reporter pueden poseer captacin activa o sistemas de eflujo especficos para el compuesto objetivo, o ser diseados especficamente para incluir a los de la clula ( vase el captulo 2 ) . Un simple equilibrio transporte difusivo entre el exterior y el interior de la clula puede cambiar drsticamente en el caso de sistemas de captacin de activos, que segn los informes se pueden acumular algo de 100 veces con respecto a la concentracin exterior (por ejemplo , [ Leveau et al .1998 ] ) . En caso de captacin activa una concentracin fuera de 1 M llevara a un 100 M dentro concentracin , lo que corresponde a ~ 60.000 molculas por clula . En tal captacin activa la fraccin total de compuesto diana en las clulas reportero sera igual a 5 107 clulas 6.0 104 molculas = 3 1012, o 3 1012/6 1014 = 0,5 %. Esto sigue siendo una fraccin marginal en comparacin con la cantidad total de la meta compuesto en el ensayo y por lo tanto poco probable que cambie ms equilibrios qumicos ( vase ms adelante ) . As podramos concluir que , potencialmente, la inclusin de un sistema de captacin activa podra aumentar el nmero de molculas efectoras provocar una seal del circuito de reportero . Por el contrario , las clulas reportero tambin pueden tener sistemas de eflujo para el compuesto objetivo o un objetivo modificado . Esto es particularmente frecuente en el caso de las clulas reportero diseados para la deteccin de metales pesados, ya que los sistemas de desintoxicacin de metales pesados a menudo implican bombas de expulsin [ de plata y le Phung ,2005 ] . Actividad de la bomba de eflujo podra potencialmente reducir la concentracin efector intracelular y , por lo tanto , aumentar el mtodo de lmite de deteccin en un ensayo de reportero de Bio . De hecho , la evidencia experimental de los mutantes de flujo de salida en diferentes sistemas de resistencia de metal apoya la idea de que la presencia de un sistema de expulsin activa aumenta y ausencia disminuye el mtodo del lmite de deteccin de aproximadamente diez veces [ Hynninen y Virta de 2010 , Rensing et al. , 2000 , Stoyanov et al . , 2003 ] . Por el contrario, hasta ahora la nica evidencia experimental sobre la influencia de un sistema de captacin ( a partir del opern mercurio) sugiri una doble disminucin magro del mtodo del lmite de deteccin en reportero cepas con mercurio trans -porter en aquellos sin tratamiento [ Selifonova et al. , 1993 ] . Como excepcin al efecto general de los sistemas de flujo de salida , vale la pena mencionar el sistema de defensa ars . En el arsenito naturales sistema ars se bombea fuera de la clula por la actividad de la bomba de eflujo ArsBC , pero Tauriainen et al no encontr ninguna diferencia en el mtodo de lmite de deteccin de cepas de E. coli que lleva un circuito reportero ars en presencia o ausencia de bomba arsBC [ Tauriainen et al . , 1999 ] . Esto sugiere que el arsenito se elimina de la clula por otro sistema de eflujo an desconocido o que otro mecanismo puede recoger pequeas cantidades de arsenito . Cada vez hay ms pruebas de que este puede ser en realidad ArsR s ; aparte de su regulador el papel de la protena tambin parece actuar como protena del tesoro para arsenite6 .
6 See, for example

recent iGEM competitions (http://2009.igem.org/Team:Groningen).

3.2. THEORY OF ANALYTE

AND

Otros mecanismos pueden influir en los procesos de transporte y particin de los compuestos de inters entre las clulas y el medio extracelular . En los ejemplos antes mencionados la cantidad total de objetivo se mantiene constante dentro de los lmites de la macro -ensayo y durante la duracin del ensayo . Uno podra imaginar un micro -ingeniera de clulas reportero de mantenimiento del sistema en un solo lugar , pero muestra que fluye sobre las clulas. En este caso , potencialmente muchos ms molculas pueden pasar a travs de las clulas y obtener la seal . Otros mecanismos pueden inmovilizar un compuesto de destino o cambiar su forma qumica , con el fin de retirarla de la piscina de destino libremente disponibles en el ensayo . Para los metales pesados , se podra pensar en las protenas de barrido (como ArsR o metalotionenas ) , de reductasas (como el Mera Hg2 + - Hg reeduca , que conducen a la volatilizacin de mercurio ) , o de coprecipitacin como sales insolubles ( por ejemplo , PbPO4 ) [ Hynninen et al. , 2009 ] . Como consecuencia de ello , de la retirada de una especie qumica del ensayo , la difusin puede continuar conduciendo a un flujo constante de la meta en las clulas reportero (Figura 3.6). En el caso de la meta orgnica y, a menudo lipfilo molculas surgir una particin entre la fase acuosa fuera de las clulas , las membranas bacterianas lipfilos, y el interior citoplsmica ( Figura 3.6 ) . Dependiendo de su carcter lipfilo , que a menudo est representado por el coeficiente de particin octanolwater , compuestos pueden enriquecerse 1000 - a 100.000 veces en la membrana [ Sikkema et al , 1995 . ] . Suponiendo un espesor de la membrana aproximada en una clula bacteriana de algunos 20 nm , el volumen de la membrana por clula bacteriana sera tomar hasta ~ 8 % . En un equilibrio de particin las membranas bacterianas seran por lo tanto , con mucho, llevar a la mayora de tal compuesto lipoflico en comparacin con el citoplasma . Sin embargo , en la mayora de las densidades de clulas para mediciones de biosensores (~ 5 107 clulas por ml ) , la fraccin de masa total de compuesto en las clulas bacterianas ser muy pequea ( < 5 % ) . Curiosamente , la mayora de las protenas reguladoras para los compuestos orgnicos estn todava supone que son protenas citoplasmticas [ Tropel y van der Meer , 2004 ] . A pesar de una reserva potencial ms elevado de molculas diana en las membranas , tales protenas se muestrean el ( mucho menor ) disuelto la concentracin de compuesto de destino en el citoplasma, pero desde un punto de ingeniera reportero ortogonal de vista sera mucho ms interesante tener un protena reguladora de la deteccin de la membrana disuelta compuesto objetivo . Incluso ms de los metales , compuestos orgnicos son susceptibles de transformacin o degradacin por la clula reportero , con la consecuencia de que su desaparicin impulsar an ms el transporte molcula diana a las clulas indicadoras . Como se explica en el Captulo 2 algunos circuitos reportero incluso se basan en trans - formacin de una molcula diana aadido externamente a un metabolito interno que provoca la induccin del sistema . Prediccin de concentraciones efectoras intracelulares en cualquier concentracin fuera dado se vuelve cada vez ms difcil en el caso del metabolismo de compuesto diana , a menos que se conocen los parmetros cinticos de la captacin de compuesto y el metabolismo . Desde nuestro propio trabajo en un sistema modelo de cido 2,4- diclorofenoxiactico (2,4 -D) la degradacin en Cupriavidus necator JMP134 derivamos que el 2,4- D captacin difusa en ausencia de sistema de captacin activa pero en presencia de metablica inducida va procedi en el orden de 110 molculas por segundo por clula a una concentracin fuera de 1 M [ Leveau et al . , 1998 ] .

3.2. THEORY OF ANALYTE

AND

Con el sistema de captacin activa TfdK y complete Metabolismo de 2,4- D en su lugar esta tasa aument a 2.100 en estimados molculas por segundo por clula. A los 4 108 clulas por ml utilizados por los autores en su sistema de esta tasa implicara un total

Gas phase

Gas phase

phase

lipophilic phase concentration concentration

lipophilic phase

Aqueous phase

Aqueous phase

Gas phase lipophilic phase time

Gas phase lipophilic phase time

phase

3.3.

OF BIOAVAILABILITY AND

Figura 3.6: Periodistas destructivos y no destructivos. En el caso de las clulas de sensor que no transforman el compuesto objetivo (izquierda), el compuesto se particionan en fase gaseosa, fase acuosa y fase lipfila (o biomasa). La fraccin de compuesto en cada fase se calcular de acuerdo con el equilibrio de particin qumica, por lo que la cantidad total de compuesto en el ensayo (suponiendo un vial cerrado) no va a cambiar. Clulas reportero destructiva transformar el compuesto diana, lo que conduce a su agotamiento en el transcurso del ensayo, sino tambin a un aumento del flujo de compuesto objetivo hacia las clulas y a travs del circuito reportero. La cantidad total de compuesto diana en el ensayo disminuir constantemente y el reparto de fases est en un equilibrio dinmico.

81011molculas que desaparecen por seg . Para quitar 6 1014 molculas por ml (a 1 M) sera por lo tanto tener ms o menos 1.300 segundos o 22 minutos, lo que significa que el ensayo se haya agotado completamente para el 2,4 -D dentro de un tiempo de ensayo de 1 h . Hay et al informaron de un lmite inferior de deteccin de C. necator TFDC - promotor basado indicador de luciferasa para la deteccin de 2,4- D de 2 M [ Hay et al, 2000 . ] . Esta cepa reportero tambin degrada 2,4 - D , lo que sugiere que un informador tal sera de hecho necesitar aproximadamente 107 molculas por clula ( tal como se calcula anteriormente para 1 M en equilibrio ) para responder de manera significativa por encima del fondo . Sin embargo , como otros datos sugieren , de estos 107 molculas por clula la fraccin ms grande desaparece en el metabolismo del compuesto . Por consiguiente, sera interesante especular si las 107 molculas inductoras que pasan a travs de las clulas de nuevo quiz slo conducen a los 600 ms o menos molculas inductoras libre a twitch el circuito del sensor / reportero ( tal como se calcula anteriormente para una situacin de equilibrio ) . Mediante la medicin de la formacin de ARNm directamente en las clulas cultivadas bajo condiciones de cultivo continuo , Leveau et al tambin pudieron demostrar que la magnitud de la expresin de ARNm a partir de los promotores de TFD para la degradacin del 2,4 - D en C. necator JMP134 en 10 mM externo de 2,4-D concentracin es slo efmera detectable directamente despus de una transicin de medio sin al medio con 2,4 - D , pero luego disminuye a niveles no significativamente diferentes de las condiciones no inducidas [ Leveau et al . , 1999 ] . Este 10 mM , a ser correcta , se aadi a una cultura quimiostato en condiciones de estado estacionario , lo que resulta en concentraciones de compuesto real en el medio en el orden de 10 nM , debido a la dilucin constante de una gota de entrada de medio ( 50 l ) en un 500 ml del reactor . De hecho , Fuechslin et al mide 15 g C por L o 0,15 mM concentracin real en cultivos chemostat de C. necator que crece en 2,4 - D a una concentracin media de entrada de 125 mg de C por L [ Fchslin et al . , 2003 ] . Esto sugiere que , una vez que se forma la va metablica de 2,4-D , el inductor real para la va (el metabolito 2,4 - cis , cis - dichloromuconate , DCM ) es ms rpidamente degradado ms que el que puede contribuir a ms gen expresin de los promotores tfd . Reporteros fusionados con uno de los promotores tfd en la misma clula sern pues esencialmente no ser capaz de " interceptar " ms seal. Como se discute en la Seccin 2.1 , esto es frustrante desde el punto de vista de la deteccin de 2,4 D mayor sensibilidad posible , pero representa correctamente el comportamiento de la bacteria degradar el 2,4-D . Curiosamente, los datos obtenidos por Leveau mostraron tambin muy claramente que cuando las clulas estn expuestas a concentraciones ms altas fuera de 2,4- D ( 100 micras y 1

3.3.

OF BIOAVAILABILITY AND

mM) , expresin tfd per se no llega a ser ms alto, pero contina por ms tiempo , lo que sugiere que el efector de DCM , se produce temporalmente a un nivel mayor que el necesario para la ARN polimerasa para procesar los promotores TFD en su velocidad mxima [ Leveau et al.1999 ] . Cuando s DCM se transforma ms y su concentracin intracelular disminuye por debajo del umbral mximo para la expresin gnica , expresin TFD vuelve a bajar [ Leveau et al .1999 ] . La formacin de protena indicadora , por lo tanto no sigue el mismo patrn que la expresin de ARNm . Similares conclusiones pueden extraerse de un estudio de nuestro grupo con un reportero naftaleno en P. putida , equipado con un nahR - nahG' - luxAB gen reportero copia simple de fusin y que contiene el plsmido NAH7 para la degradacin de naftaleno [ Werlen et al. , 2004 ] . Para los ensayos de reportero de bio las clulas fueron tomadas de un cultivo continuo en succinato y se incubaron en suspensin acuosa con diferentes concentraciones de naftaleno . Hemos observado que la actividad de luciferasa aument entre 30 min y 3 h , pero no para todas las concentraciones de naftaleno igualmente , despus de 30 min, la respuesta reportero fue saturado a 0,5 M naftaleno, after1h AT2 M, y slo despus de 2,5 horas a 5 mM . Por lo tanto , slo despus de que se obtuvo relacin de 2,5 hectreas lineal entre la actividad de luciferasa y la concentracin de naftaleno entre 0 y 5 M [ Werlen et al . , 2004 ] . Esto sugiri que - como para el ejemplo 2,4 - D - altas concentraciones de naftaleno conducen temporalmente a una sobredosis del metabolito salicilato de inductor en las clulas , lo que lleva tiempo para convertirse en metabolizado y prolonga la induccin del circuito reportero . En tiempos de incubacin ms largos concentraciones ms bajas de naftaleno se degradan completamente , pero debido a la estabilidad de la protena indicadora su actividad todava se puede medir despus de 2,5 h de incubacin . Adems punto de inters fue que tambin las clulas reportero naftaleno consumidos completamente el compuesto objetivo durante el ensayo . El mtodo de lmite de deteccin de 0,5 M ( en 2,2 107 clulas en el ensayo ) indic que 3 1014 /2,2 107 es igual a 107 molculas por clula son necesarias para obtener una seal reportero por encima del fondo , que es similar a los valores calculados anteriormente. Por ltimo , este estudio demostr que el mtodo aparente de lmite de deteccin en el ensayo se puede bajar al menos diez veces cambiando las condiciones de transporte del compuesto diana a las clulas . Con naftaleno esto era posible mediante la explotacin de su volatilidad y permitiendo naftaleno se evapore de un volumen de muestra de diez veces mayor para ser capturado por las clulas reportero expuestos en la fase de vapor en un filtro [ Werlen et al . , 2004 ] . A partir de estos clculos, por lo tanto podemos sacar la conclusin de que en la mayora de los " no destructivo " Ensayos del nmero de molculas inductoras probablemente presente en una enorme sobredosis en comparacin con el nmero de clulas reportero y no todas las molculas inductoras pueden contribuir a provocar el circuito reportero . La absorcin activa o sistemas de eflujo desactivados pueden aumentar la cantidad de compuesto diana en la clula y disminuir el mtodo de lmite de deteccin en el ensayo indicador de Bio . Clulas reportero destructivas tienen la ventaja de transformar el compuesto objetivo y la conduccin ms difusin compuesto a las clulas , pero la desventaja de que una gran fraccin de compuesto objetivo se desperdicia en el metabolismo y no est contribuyendo a reportero de induccin circuito .

3.3.

OF BIOAVAILABILITY AND

3.3 3.3.1

CONCEPTO DE BIODISPONIBILIDAD Y bioaccesibilidad FRACCIONES biodisponible

Por lo que hemos comentado anteriormente podemos ver que las clulas reportero ' muestra ' una fraccin de molculas diana que estn a disposicin en el ensayo total. Clulas reportero no destructivos probablemente no cambiarn drsticamente el equilibrio de particin entre la fase acuosa y de vapor (al menos a densidades celulares moderadas ; como se explic anteriormente , se espera que menos de 1 % de compuesto a estar presentes en la biota ) . Los compuestos ms lipoflicos se harn ms enriquecido en la membrana celular, pero en densidades de clulas reportero bajos presentados por encima de su fraccin permanece por debajo de 1 % , as . Desde particionamiento compuesto diana entre las clulas / acuosa y fase de vapor en una mezcla acuosa de clulas suspendidas es una cuestin de segundos , por lo tanto uno puede definir que la cantidad de molculas diana que est presente en cualquier momento durante el ensayo en la biomasa reportero ( fsicamente unido , disuelto en la membrana o disueltos en el citoplasma de las clulas ) que compone la fraccin compuesto biodisponible (Figura 3.7). De acuerdo con la discusin anterior la fraccin compuesto biodisponible sera diferente para una clula sin transporte activo ( ~ 600 molculas por clula en 1 M de concentracin fuera ) , con transporte activo ( ~ 60.000 molculas por clula en 1 M ) , o con o sin flujo de salida . Una clula reportero Bio destructiva sera producir una fraccin biodisponible muy diferente ( en los ejemplos anteriores ~ 107 molculas por clula en 1 M de concentracin fuera ) , y no llegar a un equilibrio de la particin . De hecho , despus de 30 minutos todo el compuesto puede haber sido degradado . Por lo tanto , la seal que se inform por las clulas bajo estas condiciones de ensayo puede ser interpretado como una medida de la biodisponibilidad compuesto.

3.3.

OF BIOAVAILABILITY AND

A
Gas phase

Compound fraction in
Gas Aqueous

lipophilic phase

phase

Biota non-destructive destructive

B
Gas phase

Compound fraction in
Gas Aqueous

lipophilic phase

phase

Soil Degraded

Soil phase

Biota non-destructive

destructive

Figure 3.7:Fracciones biodisponibles accesibles y nutritivos para los diferentes tipos de reporteros bio. (A) de equilibrio de particin tpica en un ensayo de fase acuosa con compuesto diana soluble. Una pequea fraccin (no a escala) de las particiones compuesto en la biomasa celular reportero (biota). Esta fraccin puede ser diferente para el tipo de clula reportero, por ejemplo, uno que incluye un sistema de captacin activa o no. Clulas reportero destructivas va a transformar parte del compuesto objetivo; posiblemente durante todo el tiempo del ensayo. La fraccin total de compuesto en el sistema disminuye. (B) El sistema ms complejo en el que el compuesto objetivo puede ser fuertemente unido a, por ejemplo, las partculas del suelo. Reportero clulas bio no destructivos no disminuirn significativamente la fraccin de compuesto fuertemente unido y muestra un equilibrio de particin con fases acuosas y gas. Dependiendo del tiempo de ensayo, las clulas reportero bio destructivos pueden recuperar parte de la fraccin fuertemente unido y degustar la fraccin accesible bio

3.4.

TYPES

El concepto biodisponibilidad es muy significativo en la eco toxicologa , porque no se refiere a la concentracin total del compuesto o disuelto en el sistema , pero para que la fraccin que es percibida por la biota y puede ejercer su toxicidad . Notwithstandingly , varios debates recientes en la literatura cientfica muestran que mientras que la biodisponibilidad es un concepto claramente definido , su cuantificacin y el valor numrico en realidad puede depender de muchos factores, como el tipo de compuesto , el organismo , la actividad de ese organismo o tiempo de contacto [ Harms y Bosma , 1997 , Semple et al . , 2007 ] . Citando el peridico ms influyente sobre el tema, " la biodisponibilidad ( es ) definido como" lo que est disponible gratuitamente para cruzar una de organismo ( celular) de la membrana desde el medio del organismo habita en un punto dado en el tiempo " ( ... ) . Accesibilidad Bio ( es ) define como "lo que est disponible para cruzar un organismos ' ( celular) de la membrana del ambiente que habita, si el organismo tena acceso a ella , sin embargo , puede ser eliminado fsicamente del organismo o slo biodisponible despus un perodo de tiempo " [ Semple et al. ,2007 ] . De acuerdo con esta definicin, por lo tanto podemos ver cmo las clulas reportero no destructivo mediran biodisponibilidad , debido a que la fraccin de compuesto libre disposicin se repartir en la clula durante el tiempo de ensayo , pero las clulas no modificaremos el compuesto . Periodistas bio destructivas medirn (diferentes) fracciones accesibles biodisponibles y bio , dependiendo de la hora del ensayo (Figura 3.7)

3.3.2 Biodisponibilidad y REPORTERO bioaccesibilidad MEDICIONES

llevar a cabo las incubaciones de ensayo reportero de larga duracin tales como sea necesario para las mediciones de accesibilidad bio plantea la dificultad de que el comportamiento de las clulas y la formacin de la protena indicadora es menos bien controlada . Un concepto til , que se ilustrar ms adelante consiste en el uso de protenas informadoras extremadamente estables tal como GFP que registrar la historia de la exposicin durante perodos ms largos de tiempo (por ejemplo, das ) . Esto en s mismo lleva el riesgo de que las clulas reportero se dividirn y diluir la seal sobre una base por clula , en cuyo caso habra que medir la cantidad total de protena reportera en la poblacin o utilizar reporteros inestables ( como se ilustra abajo ) . Para sustituir ensayo de largo tiempos de incubacin varios grupos han experimentado con los procedimientos de extraccin no exhaustivos , con el fin de extraer qumicamente la fraccin compuesto accesible Bio partir de una muestra compleja y posteriormente se incuba este extracto en un corto perodo reportero de ensayo Bio [ Dawson et al . , 2008 , Paton et al. , 2009 ] . Podemos ilustrar las medidas de accesibilidad bio bio reportero con dos ejemplos. En uno de los casos de nuestra propia investigacin , nos interesaba medir la biodisponibilidad y bio accesibilidad de fenantreno, un hidrocarburo aromtico policclico muy poco soluble . Una cepa reportero fue construido sobre la base de Burkholderia RP007 sartisoli , un naftaleno y fenantreno degradar bacteria. Un circuito de plsmido reportero fue implantado en esta bacteria que consiste en el promotor para los PHNS de genes transcripcionalmente fusionado a un gen para EGFP estable [ Tecon et al . , 2006 ] .

3.4.

TYPES

Fenantreno es tan poco soluble ( < 7 mg por litro ) que no hay curvas de calibracin clsicos con diferentes concentraciones del compuesto en la fase acuosa 2-3 h ensayos podran establecerse , porque las seales reportero no fueron significativamente diferente de la de las clulas no expuestas. Reportero ensayos fueron as desarrolladas para registrar la historia de exposicin a lo largo de varios das , en presencia de fenantreno como fase slida. Desde el reportero Bio degrada fenantreno de la solucin que impulsar an ms la disolucin del slido en la fase acuosa, que se traducir en un flujo de fenantreno 'a travs' las clulas reportero bio , algunos de los cuales ( como en el ejemplo de la reportero naftaleno P. putida se explic anteriormente ) provocar la expresin del gen reportero . Este flujo fenantreno es por definicin una medida para el compuesto bio accesibilidad a las clulas reportero en que el sistema de ensayo particular . Una especie de calibracin de flujo se puede establecer mediante el uso de diferentes fases slidas de fenantreno , por ejemplo , cristales con diferente relacin de superficie a volumen o materiales sobre el que fenantreno fue absorbido . Esto dio lugar a los flujos medidos de entre 1 ( para cristales grandes ) y 60 fg fenantreno por clula despus de 2 das (para cristales pequeos) ; correspondiente a 1 10-15 / 182 = 5 10 a 18 mol, o 5 6 10-18 1023 = 3 106 molculas por celda a la respuesta ms baja , un valor no a diferencia de las 107 molculas por clula necesaria para provocar la respuesta del reportero bio naftaleno en un 3 h ensayo. Considerando que estos ensayos todava consistieron en clulas incubadas en reportero fase acuosa con la fase slida fenantreno , nuestro grupo tambin experiment con ensayos basados en difusin, en el que las clulas estn incrustadas en gel de agarosa y se expone a una fuente de punto desde el que el compuesto diana se difunde a lo largo del tiempo del ensayo ( Figura 3.8 ) . La ventaja de este ensayo es que la disponibilidad de compuesto a partir de una fuente de complejo se puede observar en el tiempo sin cambiar la integridad del ensayo [ Tecon et al . , 2009 ] . Para compensar el crecimiento de las clulas reportero ( y en consecuencia, la disminucin de la seal del informador ) puede incluir un segundo marcador producida constitutivamente en las clulas para ser utilizado como un contador de clulas . En el segundo ejemplo Leveau et al estudiaron disponibilidad de fructosa en las hojas de las plantas [ Leveau y Lindow , 2001 ] . En contraste con los reporteros anteriores desarrollaron un reportero con una EGFP inestable a fin de no registrar la historia de la exposicin , sino ms bien para detectar en cualquier momento la poblacin activa de clulas reportero . Su Erwinia herbicola fruBp - EGFP ( AAV ) reportero se pulveriz sobre las hojas de frijol y se lavaron las clulas de las hojas en diferentes intervalos de tiempo para registrar la intensidad de la seal de EGFP y la proporcin de clulas con EGFP . Curiosamente , mientras que la mayora de las clulas producidas egfp despus de incubacin corto ( 1 , 3 o 7 h ) , slo muy pocos egfp todava se produce despus de 24 h ( vase, por ejemplo , la figura 3.3) . Esto significaba que la mayora de las clulas en realidad haban metabolizado el azcar disponible en unas pocas horas , pero algunas clulas aparentemente haban estado expuestos a los bolsillos de azcar ms disponible en la hoja de la que podran beneficiarse , incluso despus de 24 h . Las estimaciones de las tasas de crecimiento locales y el consumo de azcar sugirieron que ~ 84 % de las clulas aplicadas inicialmente estn expuestos a 0.15 pg , que no permite una nica duplicacin celular. Algunos 11 % de la poblacin de clulas aplicadas a las hojas tena acceso a 4,6 pg , permitiendo un par de duplicaciones celulares ( Leveau et al asumi 0,4 pg fructosa necesario para una divisin celular ). Una cantidad estimada de 4,4 ng fructosa estaba disponible para 1 a 2 por ciento de las clulas , las que mostr EGFP incluso despus de 24 h [ Leveau y Lindow , 2001 ] .

3.4.

TYPES

3.4 TIPOS DE ENSAYO bioinformador 3.4.1 Ensayos ACUOSA

La forma ms simple de un bioensayo con clulas bacterianas reportero es en la que las clulas se suspenden en solucin acuosa con la muestra, se incubaron durante la cantidad de tiempo apropiado, despus de lo cual se registra la seal del informador (Figura 3.8). En caso de una medicin continua de la seal del informador, el ensayo puede ser incubado durante el tiempo que es necesario para obtener una respuesta significativamente diferente de la

A
Gas phase

B
Gas phase

Aqueous phase Soil phase

C
Gas phase

D
Source

Aqueous gel Aqueous phase

Figure 3.8: Bio tipos de ensayo reportero. (A) la suspensin acuosa. Reportero de expresin se puede medir en clulas individuales o de la poblacin como un todo. (B) la suspensin acuosa que incluye la fase slida. Expresin reportero se mide tpicamente en las clulas recuperadas del ensayo para evitar la difraccin de la seal (la luz) en partculas en fase slida. (C) Gas ensayo de fase de los compuestos diana voltiles. Las clulas se incubaron en una gota colgante o en un filtro en la parte superior de un gel para evitar la desecacin. Ensayo se puede realizar en presencia de fase slida. (D) ensayo de Fuente-difusin. Fuente con compuesto diana se pone en contacto con las clulas inmovilizadas reportero en un gel. Difusin de la fuente se traducir en un gradiente compuesto objetivo que se est formando con el tiempo. La expresin del indicador se mide como una funcin del tiempo y la distancia a la fuente

En blanco ( ver Figura 3.1). Tan simple como estas reportero ensayos biolgicos estn , habr una serie de consideraciones que se hicieron con respecto a amortiguar la composicin , la presencia o no de los sustratos de crecimiento , cultivo previo y el estado de crecimiento de las clulas, cerrados o ensayos abiertos. Con el estado de crecimiento , los microbilogos se refieren en general a " crecimiento exponencial " versus " no crecimiento " o clulas en fase estacionaria . Crecimiento exponencial es realmente un poco mal la terminologa, ya que a menudo se toma como equivalente a la fase de crecimiento en un cultivo discontinuo cuando todas las clulas se reproducen a una velocidad mxima (en que el medio de cultivo en particular). Sera , sin embargo , probablemente sera ms correcto referirse a la tasa de crecimiento exacto durante el tiempo del cultivo previo o en el ensayo , pero esto es ms difcil de lograr . Cul es el ms importante para el ensayo es que ninguno de los parmetros en el medio de ensayo es la inhibicin de las clulas de inducir o derepressing el promotor que controla el gen informador en presencia del compuesto objetivo . En la prctica , por lo tanto , las clulas bacterianas reportero se cultivan en un medio de crecimiento general para obtener el nmero de clulas necesarias para el ensayo ( s ) , contando todos los triplicados , nmeros de muestra y series de calibracin , recogidas durante la fase en la que todos ellos estn reproduciendo de manera exponencial , y diluida en el medio de ensayo de la misma composicin que el medio de crecimiento - excepto tal vez para la presencia de sustrato de crecimiento . La idea de este procedimiento es que las clulas de la mayora de los "activos" , que reaccionan inmediatamente al compuesto objetivo . Muchas clulas reportero puede tambin simplemente ser congeladas en medio de crecimiento ms un 15 % de glicerol durante la fase exponencial y se almacenaron a -80 C hasta que se usaron para el ensayo de [ Tecon et al . , 2010 ] . El almacenamiento a largo plazo de las clulas reportero activos en forma liofilizada no es del todo trivial, pero quedan muchos misterios acerca de los protocolos ptimos [ Bjerketorp et al. , 2006 ] . Alcuotas congeladas se pueden quitar para el ensayo , se preincubaron durante un par de minutos a 20 C , despus de lo cual sern inmediatamente reaccionando a las condiciones (en nuestra experiencia , la imagen microscpica de clulas reportero gfp apuntar mostraron que en realidad alrededor del 20 % de las clulas puede lisar o formar clulas fantasma al descongelarse alcuotas congeladas ) . En otros casos las clulas reporteras pueden tener que ser crecido en cultivo continuo con el fin de obtener las clulas que reaccionan ms rpidamente [ Werlen et al . , 2004 ] . Reportero cepas Toxicidad pueden tener que ser cultivadas con cuidado ( es decir , no hay cambios en la temperatura de crecimiento o medio ) o bien se muestran las seales de fondo ms altos debido a la induccin de programas de reparacin mientras creciente [ Norman et al . , 2005 ] .

Cepas informador sensible de metales pesados por lo general pueden ser cultivadas y se ensayaron en cualquier tipo de medio ( con excepcin de los metales bajo consideracin ) , ya que los circuitos reportero no estn influenciados por los sustratos de carbono o de nitrgeno . Por el contrario, reportero cepas sensibles a compuestos orgnicos pueden ser sensibles represin y se debe tener cuidado para proporcionar una fuente de energa para permitir la sntesis de protenas reportero para catabolito pero que no debe inhibir la induccin del circuito reportero [ Marques et al. , 2006 ] . La densidad celular reportero elegido , como se discuti anteriormente , puede ser dependiente del tipo y de la sensibilidad del instrumento necesario para grabar la seal del informador de las clulas . Encontramos que los bioensayos todo horizonte con reportero cepas bacterianas basados en E. coli , P. putida , Burkholderia , P. fluorescens , etc , una densidad celular de entre 2 y 5 107 clulas por ml es, con mucho suficiente , con luciferasa , gfp o beta- galactosidasa como reportero . La matriz de la propia muestra acuosa no siempre es problemtico para el ensayo de indicador , debido a la presencia de otros elementos contaminantes y compuestos inhibidores (por ejemplo , metales pesados y compuestos orgnicos ) , la presencia de protenas o pptidos ( potencialmente inhibidoras por ejemplo , orina o muestras de sangre ) , o la sal de concentracin (por ejemplo, muestras marinas ). Nos encontramos con que la mayora de las cepas reportero con sede en E. coli pueden funcionar en muestras marinas cuando stos se diluyen al menos cuatro veces ( y la serie de calibracin se lleva a cabo en la misma agua marina diluida) [ Tecon et al . , 2010 ] . Otros mostraron que un reportero bio E. coli an funcionaba impecable en el suero sanguneo diluido [ Turner et al. , 2007 ] o diluido ( cangrejo) la orina [ Lewis et al. ,2009 ] . Cuando la dilucin est comprometiendo el lmite de deteccin de compuesto en el ensayo de uno tendra que extraer la muestra y limpiarlo antes de realizar el ensayo . La mayora de las clulas indicadoras , sin embargo , son sensibles a disolventes orgnicos , aunque bajas concentraciones de dimetilsulfxido o metanol (por debajo 1 % ) puede ser tolerado [ Patterson et al . , 2004 ] [ Paton et al . , 2009].

3.4.2 Mediciones de fase de GAS

Mediciones Reporter en el gas o en fase de vapor pueden tener un nmero de ventajas sobre los ensayos de fase acuosa con clulas suspendidas . Muchos compuestos orgnicos txicos pueden ser suficientemente voltil que se evapora de una muestra . En este caso , la medicin en la fase de gas tiene la ventaja de que difusividad compuestos son mucho ms rpidos que en la fase acuosa , la cual, como se ha demostrado ms arriba , puede ser explotado para compuesto diana ' concentrado ' de tamaos de muestra ms grandes en volmenes ms pequeos de clulas reportero . Esto es til porque inferior mtodo de los lmites de deteccin se puede lograr [ Werlen et al . ,2004 ] . Una ventaja adicional de muestreo de la fase de gas con las clulas indicadoras es que los compuestos no voltiles potencialmente txicos en la muestra no perturbar el ensayo . Por ejemplo , los metales pesados txicos estn a menudo presentes en la misma muestra contaminada como compuestos orgnicos y pueden provocar bajo rendimiento de las clulas reportero . Sin embargo , ya que no son voltiles que no se inhiben las clulas reportero que se incuban en la fase de vapor . Tercera ventaja de someter a ensayo en la fase de gas es que las muestras complejas (por ejemplo, suelos fangosos ) pueden ser incubadas sin ningn riesgo para la difraccin de la luz de la seal del informador de la materia en partculas [ Kohlmeier et al . , 2008 ] .

En ensayos en fase gas ms descritas las clulas reportero no son en realidad incubaron en estado seco de aire , pero tpicamente expuestos en forma de suspensiones concentradas de clulas en pequeas gotas con medio acuoso que cuelgan en la parte inferior de la tapa que cierra el vial de muestreo [ Deepthike et al . , 2009 , Kohlmeier et al. , 2008 ] , en los filtros en la parte superior del medio de agar en pequeos tubos dentro de viales de muestreo para evitar la desecacin [ Werlen et al. , 2004 ] , o en placas de agar en las proximidades de una fuente voltil [ de las Heras et al . , 2008 ] . Clulas reportero tambin se han inmovilizado en geles en las puntas de las fibras pticas [ Heitzer et al . , 1994 ] , que permite para someter a ensayo la respuesta reportero en la fase de vapor . Enfoques interesantes futuros pueden consistir en el muestreo de la contaminacin atmosfrica a travs de clulas informadoras unidas a superficies de las hojas [ Sandhu et al. , 2007 ] . La evidencia anecdtica sugiere que la presencia ubicua de oxgeno alrededor de las pequeas gotitas de clulas reportero que cuelgan en la fase gaseosa es ventajoso para la maduracin y la actividad de los reporteros tales como GFP o luciferasa , pero esto no se ha investigado sistemticamente en comparacin con los ensayos de lquidos.

3.4.3

Ensayos en fase slida

Para muchos propsitos , incluyendo ensayos de fases slidas tales como suelos o sedimentos seran muy tiles . La razn de esto es que la fuente de contaminacin es muy a menudo el propio material slido ( por ejemplo , suelo, sedimento ) , y el muestreo de las aguas subterrneas no est haciendo justicia a evaluar el nivel de contaminacin en un sitio . Otras pruebas pueden ensayar los productos alimenticios slidos o materiales complejos de muestra como tejidos. Por lo que yo s no hay reportero de ensayo bio funciona directamente con la fase slida de contacto celular reportero, pero siempre a travs de un intermedio de (algunos ) acuosa o en fase gaseosa. Varios procedimientos de este modo se han desarrollado para extraer productos qumicos adsorbidos de fases slidas o enzimticamente destruir una matriz alimentaria y liberar los productos qumicos diana para el ensayo de indicador Bio . Por ejemplo , se utilizaron mtodos de extraccin no exhaustivas para recuperar diferentes fracciones de naftaleno de suelos contaminados y correlacionar las respuestas reportero bio a la fraccin compuesto mineralizada por la actividad microbiana en un suelo tan [ Paton et al. , 2009 , Patterson et al. , 2004 ] . De diversos productos qumicos probados (por ejemplo , ciclodextrinas , metanol , agua , XAD - 4 ) , un extracto de hidroxipropil - beta- ciclodextrina produjo una respuesta reportero bio que correlaciona el ms cercano con tasas de mineralizacin , aunque metanol recupera la fraccin de compuesto ms grande de los suelos y sedimentos [ Paton et al. , 2009 ] . En principio tambin tensioactivos bio se pueden utilizar para la extraccin qumica de destino a partir de slidos contaminados [ Tecon y van der Meer , 2009 ] . En nuestro propio trabajo hemos desarrollado un procedimiento eficaz para extraer los compuestos arsenicales inorgnicos de arroz contaminado , utilizando polvo finamente puesta a tierra y la digestin enzimtica con pancreatina a pH bajo y una temperatura de 55 C [ Baumann y van der Meer, 2007 ] . Aunque tales procedimientos prolongan el reportero de ensayo Bio que son necesarias con el fin de obtener seales de fieles y valores significativos.

Ensayos de reportero Bio tambin se han desarrollado para cuantificar la disponibilidad de fructosa en las hojas de plantas [ Leveau y Lindow , 2001 ] , tetraciclina en las heces de cerdo [ Hansen et al . , 2002 ] , lactonas N - acylhomoserine en el tejido o el suelo [ Burmlle et al . ,2003 ] , o las tetraciclinas en ( homogeneizada ) tejido de los peces [ Pellinen et al. , 2002 ] . En el caso de los ensayos de reportero Bio en hojas de plantas, races , los intestinos o el suelo , las clulas reporteras fueron incubadas con la muestra y luego separados especficamente de la matriz de la muestra con el fin de evitar reportero de blanqueo de la seal o de difraccin . Separacin de clulas reportero de las partculas del suelo puede llevarse a cabo utilizando gradientes de Nycodenz , despus de lo cual la seal del informador en las clulas individuales se pueden analizar usando citometra de flujo [ Burmlle et al . , 2003 ] . Alternativamente, las clulas indicadoras se pueden incubar con el suelo o sedimento sino que permanecen en un compartimento separado tal como una cmara de dilisis , que se puede quitar despus de que el tiempo de contacto necesario y se analizaron para la expresin del indicador [ Deepthike et al . , 2009 ] . En caso de sustancias voltiles - como se describe anteriormente , las clulas reportero puede tambin ser incubadas a una distancia de un suelo o muestra de sedimento en una gota colgante o en un filtro [ Kohlmeier et al , 2008 , Werlen et al , . .2004 ] .Por ltimo, tambin experiment con la incorporacin de clulas reportero en pequeas tiras de agarosa, que se ponen en contacto con los materiales slidos en un extremo. A travs de la disolucin y la difusin molecular se forma un gradiente del compuesto objetivo en la tira de agarosa , que va a cambiar con el tiempo y como una funcin de la actividad de las clulas reportero ( Figura 3.8 ) . Mediante el anlisis de la expresin del indicador a travs de la distancia y en diferentes perodos de incubacin , una seal reportero acumulada se puede conseguir que representa la fraccin compuesto acceso total en el que el material [ Tecon et al. , 2009 ].

3.5

Lmites de deteccin, la exactitud y precisin

A finSe necesita una ltima palabra sobre la exactitud de los ensayos de reportero bio . Por lo general, uno deseara para calcular factores de mrito , que incluyen el mtodo del lmite de deteccin del analito (MDL ) , la desviacin estndar relativa media basada en mediciones repetidas (RSD ) , la incertidumbre asociada a la determinacin de una muestra desconocida usando una calibracin curva , el coeficiente de correlacin de la curva de calibracin ( R2 ) y la sensibilidad de calibracin ( S ) . El MDL se puede calcular de una manera similar como para el anlisis qumico por ser la concentracin de analito calculada correspondiente a un valor de la ordenada de la pieza en bruto ms tres veces la desviacin estndar de las mediciones en la pieza en bruto , utilizando la curva de calibracin [ Wells et al . , 2005 ] . Otros textos se utilizan las siguientes definiciones para el MDL : (i) la concentracin que provoca un pliegue de la induccin de ( 1 + 2 OVC) / ( 1 - 2 OVC) en comparacin con el espacio en blanco , con el turismo siendo el coeficiente de variacin en las mediciones en blanco [ Hynninen y Virta , 2010 ] , (ii ) una concentracin que causa un pliegue de la induccin de 2 + ( 6 SB / Sb ) en comparacin con el espacio en blanco , con SB siendo la desviacin estndar en las mediciones en blanco y Sb siendo la seal en el blanco [ Ivask et al. , 2009 ] .

Para una visin general de la LMD reportados vase el anexo 1 y 2. Cabe sealar el MDL es no slo una caracterstica de la cepa reportera o lnea celular , pero la mayora de las mediciones del ensayo , los nmeros de repeticiones e instrumentos [ Wells et al . , 2005 ] . La precisin de la medicin es equivalente a la desviacin estndar relativa media de todas las repeticiones , que depende de nuevo del nmero de repeticiones y el uso de instrumentos para la cuantificacin de la respuesta reportero Bio . No era de esperar , por ejemplo , microscopa de epifluorescencia es menos precisa en la cuantificacin de las seales de EGFP que es fluorimetra estado estacionario [ Kohlmeier et al . , 2007 , Wells et al . , 2005 ] . La sensibilidad del ensayo se refiere al por ciento de aumento de la seal en el tiempo o como una funcin de la concentracin de analito .

REFERENCIAS
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CAPITULO 4
E plogo
4.1 SUMARIO
El desarrollo de la tecnologa reportero bio bacteriana durante los ltimos 15-20 aos en retrospectiva puede ser visto como una de las primeras aplicaciones de la biologa sinttica. Aunque fundamentalmente no tan difcil como la refactorizacin del genoma o de ingeniera va metablica , biosensores con reporteros bio bacterianas es una de las reas de amplia y pblicamente vistos positivamente de la biologa sinttica y la biotecnologa. La idea de montaje de partes a circuitos genticos simples destilados fuera de la amplia utilizacin de un nmero limitado de genes reporteros , cuya expresin se puso bajo el control de elementos promotores y reguladores de la transcripcin de una variedad de fuentes . Como la conferencia anterior demuestra , an carecemos de muchos detalles , incluso de circuitos genticos muy simples tales basados en una sola activacin transcripcional reguladora o reprimir un gen reportero de un promotor afn , lo que limita la aplicacin racional completa de la amplia variedad de piezas existentes . La razn de esto es que la mayora de los reguladores de la transcripcin de los biosensores son significativamente distantes de los reguladores conocidos como TetR o LacI , que son todava muy popular en los estudios fundamentales de la red de genes, pero de poca relevancia cuando se trata de la deteccin de compuestos txicos . Por otro lado , a pesar de las lagunas en nuestra comprensin del funcionamiento bioqumico de muchas de las piezas usadas, la mayora de los circuitos reportero funcionan bastante bien en el sentido de que las medidas exactas se pueden realizar y los niveles de deteccin razonablemente bajos pueden ser alcanzados para el compuesto objetivo ( s ) . Creo que es esta simplicidad de la construccin , ms la posibilidad de desarrollar un ensayo para la deteccin de un compuesto correspondiente que hace biosensores con reporteros bio bacterianas tan atractivos.

4.2

DIRECTRICES PARA EL FUTURO

Como espero haber convencido al lector , biosensores con reporteros bio clulas individuales bacterianas y otras es un campo maduro de la investigacin . El trabajo futuro se duda rellenar muchos detalles en la comprensin bioqumica de piezas usadas, y va a mejorar an ms la tecnologa de la construccin del circuito reportero en otras especies bacterianas o lneas celulares . Ms piezas estarn disponibles para apuntar a una mayor variedad de productos qumicos o productos qumicos especficos con mayor precisin , ya sea a travs de la minera de secuencias del genoma y metagenome bacterianas o por medio de estrategias de diseo y evolucin directa.

La nueva direccin ms difcil en la investigacin bio reportero vendr de una fusin con la microtecnologa . Reportero clulas Bio estn muy bien de tamao para adaptarse a la microfludica y otros dispositivos micro -ingeniera , lo que significa que los bioensayos pueden ser reducidos a adaptarse a dispositivos ms pequeos y los reactivos de repuesto. Microbiosensores se han integrado detectores para registrar las seales indicadoras y de fluidos podran ser optimizado para proporcionar clulas con nutrientes necesarios para lograr menor tiempo de activacin. Al mismo tiempo , la miniaturizacin podra ser utilizado para el nmero mltiple de posibles objetivos en un solo dispositivo biosensor . Reportero de mltiples cepas todos basados en la misma cepa husped pero con diferentes circuitos regulador de la transcripcin dirigidos a diferentes compuestos diana puede ser empotrado en la misma micro - dispositivo . Hay ejemplos publicados de estos y otros ya las ideas (van der Meer y Belkin , 2010 ) , y creo que es muy probable que su nmero seguir aumentando a medida que ms posibilidades se exploran . En combinacin con la simplicidad y el bajo coste de la produccin de cepas reportero bio , este presentar biosensores como alternativas realistas para una amplia gama de aplicaciones de monitoreo. .

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APPENDIX A
Bacterial Bio reporter Designs Targeting Organic Compounds
Compuesto o compuesto de cido 2,4 la clase diclorofenoxiac tico actico (2,4 - D) caractersticas interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen r diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia Alcanos interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo especificidades Diseo PDII ( tfdDII ) TfdR tfdDIICIIEIIFIIBK (degradacin chlorocatechol ) - pJP4 plsmido Eutropha Ralstonia ( Cupriavidus necator ) JMP134 luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : el cromosoma : transposn insercin aleatoria en el cromosoma (Tn [ tfdR - PDII :: Eutropha - Homlogo - Degradacin: + luxCDABERalstonia ]) Tiempo de induccin 100 min - Fresh - medio rico - 28 C luminometra 2,4 - D , 2,4 - diclorofenol , 3 - clorobenzoato 2 mM - 5 mM ( 112 mM ) Extractos de suelo acuosas y lodos de suelos de suelos contaminados con Agente Naranja (Hay, Rice et al. 2000 ) PalkB ( AlkB ) ALKS alkBFGHJKL (degradacin n- alcanos ) octubre plsmido P. oleovorans luxAB ( V. h . ) Prom . fusin : plsmido : pJAMA7 ( PalkB :: luxAB ) Regulador: plsmido : pGEc74 ( alkST ) - Degradacin: E. coli - heterlogo. Tiempo de 60 min de incubacin - Frozen - medio rico - 30 C luminometra pentano , hexano , heptano , octano , nonano , decano , 3 methylheptaney 25 nM - 6,3 mM agua subterrnea de calefaccin de aceite contaminado , aceite contaminado el agua de mar ) ( Tecon , Beggah et al. 2010 ) ( Sticher , Jaspers et al. 1997 PalkB ( AlkB ) ALKS alkBFGHJKL (degradacin n- alcanos ) octubre plsmido P. oleovorans gfp - F64L - S65T ( A. c ) Prom . fusin + regulador : plsmido : pJAMA30 ( ALK - PalkB :: GFP - F64L - S65T )

Alcanos

Compuesto o clase de compuestos

caractersticas medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin

especificidades Diseo Fluorometra , microscopa de epifluorescencia octano 10 nM - 1 M Pruebas de difusin Fuente ( Jaspers, Meier et al. 2001 ) Pm ( xylX ) - XylS xylXYZLTEGFJQKIH ( inferior va para la degradacin de tolueno / xileno ) Plsmido TOL P. putida luxAB ( V. harveyi ) Prom . fusin + regulador : transposn insercin aleatoria en el cromosoma (Tn [ xylS - Pm- :: luxAB ] ) P. putida - Homlogo - Degradacin: Fresh - medio rico - 30 C - 16 h Tiempo de incubacin luminometra benzoato 5 mm - 100 mm ( 50 mM) Las soluciones acuosas (de Lorenzo , Fernndez et al. 1993 ) Pm ( xylX ) - XylS xylXYZLTEGFJQKIH ( inferior va para la degradacin de tolueno / xileno ) Plsmido TOL P. putida gfp - mut3b ( A. c ) Prom . fusin + regulador : transposn insercin aleatoria en el cromosoma (Tn [ xylS - Pm- :: GFP mut3b ] ) - homloga - Degradacin: + P. putida , Que se cultiva en las biopelculas Fresh - MM - 24 h tiempo de incubacin microscopa Epiffluorescence 3 - metilbenzoato de metilo 5 mM - ND Las soluciones acuosas ( Mller , Sternberg et al. 1998 ) PfcbA ( FCBA ) - ND fcbABC (degradacin clorobenzoato ) Arthrobacter sp luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : Pasu ( regulador PfcbA unknown :: luxCDABE )

benzoatos

benzoatos

A. BACTERIAL

Compuesto o clase de compuestos

caractersticas compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista

especificidades Diseo 2-/3-/4-chlorobenzoate , 2-/3-/4-bromobenzoate , 4 - fluorobenzoato 0,4 mM - 26 mM Las aguas residuales industriales ( Rozen , Nejidat et al . 1999 ) PhbpC ( HBPC ) - HbpR hbpCA (meta -divisin va de hydroxybiphenyls ) P. azelaica HBP1 luxAB ( V. harveyi ) Prom . de fusin :

hidroxibifenil

Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente hidroxibifenil s organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin

cromosoma : transposn insercin aleatoria en el cromosoma (Tn [ PhbpC :: luxAB ] ) Regulador: cromosoma : host codificado P. azelaica - Homlogo - Degradacin: + Congelado - MM - 30 C - 75 min tiempo de incubacin luminometra 2 -hidroxi-bifenilo , 2,2 ' -dihidroxi-bifenilo , 2 - aminobifenilo , 2 9 M - 5 mm ( 0,5 mm) hydroxydiphenylmethanei Las soluciones acuosas ( Jaspers, Suske et al. 2000 ) PhbpC ( HBPC ) - HbpR hbpCA (meta -divisin va de hydroxybiphenyls ) P. azelaica HBP1 luxAB ( V. harveyi ) Prom . fusin + regulador : Plsmido : pJAMA8 - hbpR - PhbpC :: luxAB ] ) E. coli - Heterlogo - degradacin: Fresh - MM + glucosa - 30 C - 03.02 h tiempo de incubacin luminometra 2 - hidroxibifenilo 0,4 M - 8 M Orina Cangrejo, plasma sanguneo (Turner , Xu et al 2007 ; . . Lewis, Beggah et al 2009 ) PhbpC ( HBPC ) - HbpR - CBP6 hbpCA (meta -divisin va de hydroxybiphenyls ) Enfoques de evolucin dirigida - P. azelaica HBP1

A. BACTERIAL

Compuesto o

caractersticas ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista

especificidades Diseo Fresh - MM + glucosa - 30 C - 2,5-4 h tiempo de incubacin Fluorometra , citometra de flujo 2 - hidroxi - y 2 - clorobifenilo 1,5 M - 100 M Las soluciones acuosas , triclosn , Aroclor ( Beggah , Vogne et al . 2008 ) Psal ( nahG ) - NahR nahGTHINLOMKJ ( menor va para la degradacin de naftaleno ) P. fluorescens plsmido pKa1 luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador :

naftalina

Anfitrin de tensin para la construccin ensayo

plsmido : pUTK21 , derivado del plsmido pKa1 , que contiene transposn insercin en el gen nahG ( Nahr- Psal - nahG' - Tn [ luxCDABE ] )

medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin

P. fluorescens - Homlogo - Degradacin : + j Fresh (King, DiGrazia et al , 1990; . . Heitzer , Applegate et al 1998) 1994 ) inmovilizadas en la parte superior de un cable de fibra ptica ( Heitzer , Malachowskyen Inmovilizada etun al. reactor de lecho fijo (Webb , Bienkowski et al. 1997 ) MM ( extracto de levadura + succinato ) (King, DiGrazia et al. 1990 )

Naftalina

referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

Medio enriquecido ( Heitzer , Webb et al. 1992 ) 25 (King, DiGrazia et al. 27 ( Heitzer , Webb et al . 1992 ) 1990 ) Luminometra , fibras pticas naftaleno , salicilato 0,35 M - 44 M ( . Heitzer , Webb et al 1992 ) extractos acuosos de petrleo contaminado el suelo ( Heitzer , Applegate et al. 1998 ) , los extractos acuosos de suelo MPGK ( Heitzer , Malachowsky et al. 1994 (King, DiGrazia ) , las soluciones et al. 1990acuosas ) saturadas de JP - 4 combustible de avin ( Heitzer , Applegate et al. 1998 ) ( Heitzer , Malachowsky et al. PNAH ) - NahR contaminado suelos fangosos ( Burlage , Palumbo 1994 ) (, Naha el combustible nahABCDEF superior paraMPG la degradacin de naftaleno ) )( et al 1994 . )(,va suelos fangosos ( king, DiGrazia et al. 1990 Plsmido P. putida NAH7 Sanseverino , Werner et al. 1993 ) luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin : plsmido : pUTK9 ( PNAH :: luxCDABE ) Regulador: plsmido : NAH7 ( nahR )

A. BACTERIAL

Compuesto o

caractersticas interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

especificidades Diseo Psal ( nahG ) NahR nahGTHINLOMKJ ( menor va para la degradacin de naftaleno ) Plsmido P. putida NAH7 luxAB ( V. h ) . Prom . fusin : mini- transposn Tn [ nahR' - Psal :: luxAB } en el cromosoma Regulador : El plsmido NAH7 ( nahR ) P. putida ( NAH7 ) - Homlogo - Degradacin: + (Clulas cultivadas quimiostato ) Fresh , ensayo acuosa MM - 30 C , 2-3 h Tiempo de incubacin luminometra El naftaleno , 2 - metil - , 2,3 - dimetilnaftaleno , salicilato 0,5 M - 5 M ( ensayo de fase acuosa ) 0,05 a 0,5 M ( de ensayo en fase de gas ) Sitios y aguas residuales de aceite contaminado ( Werlen , Jaspers et al. 2004 ) PphnS ( PHNS ) - PhnR phnSFECDAcAbB ( trayectoria superior de la degradacin de fenantreno ) RP007 sartisoli Burkholderia gfp - F64L - S65T ( A. c ) Prom . de fusin : phnS' - EGFP en pPROBE Regulador: phnR (cromosoma ) B. RP037 sartisoli - Homlogo - degradacin : + , MM + acetato Fresh - 30 C; ensayos acuosos o ensayos de difusin , el EFM Sola tiempo declula incubacin de 1 3d Fenantreno , naftaleno Gama Flux : 2-70 fg / clula Suelos contaminados o los ensayos de difusin ( Tecon , Wells et al. 2006 ) ( Tecon , Binggeli et al. 2009 ) PphnS ( PHNS ) - PhnR phnSFECDAcAbB ( trayectoria superior de la degradacin de fenantreno ) RP007 sartisoli Burkholderia luxAB ( V. H. ) Prom . fusin : phnS' -EGFP en pPROBE -lux Regulador: phnR (cromosoma ) B. RP037 sartisoli - Homlogo - degradacin : + Fresh , MM - 30 C; ensayos acuosos , 3 h Tiempo de incubacin luminometra

naftalina

fenantreno

Fenantreno

A. BACTERIAL

Compuesto o Fenoles

caractersticas interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

especificidades Diseo Po ( DMPK ) - DMPR dmpKLMNOPQBCDEFGHI ( degradacin de fenol ) Pseudomonas sp . plsmido pVI150 luxAB - ( . V. h ) Prom . fusin : plsmido : pVI360 (Po :: luxAB ) Regulador: cromosoma : host codificada P. putida :: DMPR - Homlogo - Degradacin: , MM fresca - 30 C , 90 min de tiempo de incubacin luminometra fenol , 2-/3-/4-methylphenol , 3,4 - dimethylphenozl 3,2 M - 2 mM Las soluciones acuosas ( Shingler y Moore 1994 ) PbphA1 ( bphA1 ) k ND bphA1A2 ( orf3 ) bphA3A4BC (meta va la divisin de ( cloro ) bifenilos ) Ralstonia eutropha luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin : plsmido : pUTK60 ( orf0 - PbphA1 - bphA1 :: luxCDABE ) Regulador: cromosoma : acoger codificada Eutropha Ralstonia - Homlogo - Degradacin: + Fresh , MM + piruvato - 26 C , 120 min tiempo de incubacin luminometra bifenilo, 2-/3-/4-chlorobiphenyl 0,79 M - 0,11 mM Las suspensiones acuosas { Layton, 1998 # 553 PstyA Stys / R styABCDE ( monooxigenacin estireno ) Pseudomonas sp . Y2 Strain luxCDABE ( V. f . ) Prom . Fusin traslacional + regulador : el cromosoma : insercin del transposn al azar en el cromosoma ( Tn [ Psty :: lacZ ] ) Pseudomonas sp . PAL1 Y2 Strain - Homlogo - Degradacin: + Fresh - M9 glicerol - medio 28 C - 60 min Tiempo de induccin Espectrofotometra Estireno , tolueno, epoxiestireno , fenilacetaldehdo y 2- feniletanol 1 M - 0,1 mm ( 100 micras ) Las suspensiones acuosas

Los bifenilos policlorados

A. BACTERIAL

Compound or Characteristics compound class Toluene Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds Concentration range Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds Concentration range Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds Concentration range Application Reference

Design specificities Ptod (todX) TodST todXFC1C2BADEGHI (degradation of toluene) P. putida F1 luxCDABE (V. f.) Prom. fusion: plasmid: pUTK30 (Ptod-todXF::luxCDABE) Regulator: chromosome: host encoded P. putida F1- Homologous - Degradation: + Fresh; Immobilised in a packed-bed reactor, Rich medium 27C, 90 min incubation time Luminometry toluene 1 M 0.5 mM aqueous solutions saturated with JP-4 jet fuel (Applegate, Kelly et al. 1997) Ptod (todX) TodST todXFC1C2BADEGHI (degradation of toluene) P. putida F1 luxCDABE (V. f.) Prom. fusion: chromosome: random transposon insertion in chromosome (Tn[Ptod-todXF::luxCDABE)]) Regulator: chromosome: host encoded P. putida F1- Homologous - Degradation: + Fresh, MM 28C, 120 min incubation time Luminometry toluene, benzene, 2-/3-xylene, phenol, trichloroethylene (Shingleton, Applegate et al. 1998) 0.3 M 0.5 mM aqueous solutions saturated with JP-4 jet fuel (Applegate, Kehrmeyer et al. 1998) PtbuA1 (tbuA1) - TbuT tbuA1UBVA2CT (upper pathway for toluene/benzene degradation) R. picketti PKO1 gfp (red shifted variant) (A. v.) Prom. fusion: PtbuA1::gfp (location not described) Regulator : tbuT driven expression from constitutive promoter (location not described) P. fluorescens A506 Heterologous Degradation: ND Fresh, ND, ND, 3 h incubation time Epifluorescence microscopy, fluorometry Toluene, benzene, trichloroethylene 20 nM - 2 M rhizosphere (Halverson 1999)

Toluene

Toluene

A. BACTERIAL

Compuesto o clase de compuestos tolueno

caractersticas interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

especificidades Diseo PtbuA1 ( tbuA1 ) - TBUT tbuA1UBVA2CT ( va superior para la degradacin de tolueno / benceno ) R. picketti PKO1 luxAB ( V. h . ) Prom . fusin + regulador : pPROBE - TBUT - PtbuA1 :: luxAB E. coli - Heterlogo - degradacin: Frozen , MM + glucosa, 30 C , 2 h tiempo de incubacin luminometra tolueno 0,24 a 10 M Aceite contaminado las aguas marinas ( Tecon , Beggah et al. 2010 ) Pu ( xylU ) - XylR xylUWCMABN ( va superior para la degradacin de tolueno / xileno ) P. putida mt- 2 plsmido TOL luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : plsmido no descrita (Pu ::: luxCDABE ) Regulador: plsmido : plsmido TOL P. putida ( TOL) - Homlogo - Degradacin: + , MM , 27 C , 120 min Tiempo de incubacin fresco luminometra tolueno , 2-/3-/4-xylene 15 Mn (ND ) Combustible contaminado suelos fangosos ( Burlage , Palumbo et al . 1994 ) Pu ( xylU ) - XylR xylUWCMABN ( va superior para la degradacin de tolueno / xileno ) P. putida mt- 2 plsmido TOL mut3 gfp ( A. c ) Prom . fusin + regulador : el cromosoma : transposn insercin aleatoria en el cromosoma (Tn [ xylR - Pu- :: GFP - mut3b ] ) P. putida - homloga - Degradacin: + , Que se cultiva en biofilmso , MM , ND, 24 h tiempo de incubacin Fresh microscopa de epifluorescencia alcohol benclico 0,26 mM (ND) solucin acuosa ( Mller , Sternberg et al. 1998 )

xilenos

A. BACTERIAL

Compound or Characteristics compound class Xylenes Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds Concentration range Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds Concentration range Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds

Design specificities Pu (xylU) - XylR xylUWCMABN (upper pathway for toluene/xylene degradation) P. putida mt-2 TOL plasmid lucFF (P. p.) Prom. fusion + regulator : plasmid: pGLTUR(xylR-Pu:::lucFF) E. coli Heterologous - Degradation: Fresh, Rich medium, 37C, 30 min incubation time Luminometry toluene, benzene, 2-/3-/4-xylene, 2-/3-/4-chlorotoluene, 2-/3-/4methylbenzylalcohol, 2-/3-/4-nitrotoluene 10 M 1 mM (ND) BETXp contaminated deep aquifer water; ethyl alcohol extracts of BETX contaminated soil (Willardson, Wilkins et al. 1998) Pu (xylU) - XylR xylUWCMABN (upper pathway for toluene/xylene degradation) P. putida mt-2 TOL plasmid luxCDABE (V.f.) Prom. fusion + regulator : plasmid: pTOLLUX (xylR-P u :::luxCDABE) E. coli Heterologous - Degradation: Fresh, Rich medium, 37C, 2 h incubation time Luminometry toluene, 2-/3-/4-xylene, benzylaldehyde, naphthalene 7.5 M 1 mM Contaminated groundwaters or soil-water extracts (Li, Li et al. 2008) P s (xylS) - XylR xylS (regulation of the xylXYZLTEGFJQKIH genes, encoding the lower pathway for toluene/xylene degradation) P. putida mt-2 TOL plasmid lucFF (P. p.) Prom. fusion + regulator: plasmid: pTSN316 (xylR-Ps::lucFF) E. coli Heterologous - Degradation: Fresh (Kobatake, Niimi et al. 1995) Immobilized at the top of a fiber-optic cable (Ikariyama, Nishiguchi et al. 1997) , Rich medium, 37C, 120 min incubation Luminometry benzene, toluene, ethylbenzene, 2-/3-/4-xylene, 3-ethyltoluene, 2-/3-/4chlorotoluene

Xylenes

Xylenes

A. BACTERIAL

Compuesto o clase de compuestos

caractersticas El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin

especificidades Diseo 5 M - 1 mM ( 0,5 mM) Aguas subterrneas contaminadas o extractos de agua del suelo ( Kobatake , Niimi et al . 1995 ) PibpA ( IbpA ) - IbpR ibpACDABE ( degradacin de alquilbenceno ) P. putida luxCDABE ( V.f. ) Prom . fusin + regulador : plsmido : pOS25 ( ibpR - PibpA :: luxCDABE ) E. coli - Heterlogo - degradacin: , Mm + piruvato , 22 C , 250 min Tiempo de incubacin fresco luminometra isopropilbenceno , benceno , tolueno , etilbenceno , n - butilbenceno , naftaleno , trichloroethyleneq 1 M - 1 mM ( 0,1 mM ) la gasolina , combustible de aviacin JP - 4 y JP - 5 , combustible diesel , ( Selifonova y Eatonde 1996 ) de hidrocarburos contaminados lago creosota , extracto etanol sedimentos auxotroph Lisina E. coli Gfpmut3 Prom . de fusin : GFP expresado constitutivamente a partir de mini Tn5E. inserta en E. coli lysA De coli - homloga , la degradacin :+ , M9 , 37 C , 6 h Tiempo de incubacin Fresh fluorometra Lisina 0,5-2 mg / ml Productos de alimentacin ( Chalova , Woodward et al. 2006 ) PTet - TetR tetA ( resistencia a la tetraciclina ) E. coli Gfpmut3 Prom . fusin : plsmido pTGFP2 ( pTet - gfp ) E. coli - Homlogo - degradacin: (Colonizacin intestinal) Fresh , 1-7 en tiempo d de incubacin - Anlisis de citometra heces La de flujo tetraciclina

Varios compuestos hidrfobos

Lisina

Tetraciclina

A. BACTERIAL

Compuesto o clase de compuestos

caractersticas

especificidades Diseo La exposicin intestino de rata ( Bahl , Hansen et al . 2004 ) PluxI - LuxR luxI ( sistema de deteccin de qurum luciferasa ) luminescens Photorabdus Gfpmut3 Prom -fusion + regulador : plsmido pAHL -GFP ( luxR - PluxI - gfpmut3 ) E. coli - Heterlogo - degradacin: Medio fresco , rico , 37 C ( acuoso) , 25 C ( microcosmos de suelo ) , 20 h tiempo de incubacin La citometra de flujo N - octanoil homoserina lactona 0,1 a 10 M (acuoso) ( 10 mM) , 0,5 nM / g de suelo Soluciones , suelos , tejidos ( Burmlle , Hansen et al . 2003 ) PsepA - SEPR sepABC ( sistema de flujo de salida de disolvente ) P. putida F1 luxCDABE (P. l . ) Prom . fusin : mini- Tn5 [ PsepA - luxCDABE ) Regulador: Cromosoma P. putida F1 - homloga , la degradacin : + , M9 glucosa ms , 30 C , 2 h tiempo de incubacin Fresh luminometra El benceno , isopropilbenceno , 4 - etil- , 4 - clorotolueno , naftaleno , estireno ( y otros) 0,5 a 20 mM ( acuosa ) Jet- combustible, la contaminacin del petrleo ( Phoenix, Keane et al. 2003 ) Pu - XylR5 evolucin dirigida - xylU ( va superior para la degradacin de tolueno ) P. putida mt- 2 ( evolucin dirigida en XylR ) luxCDABE (P. l . ) Prom . + regulador de fusin : mini- Tn5 [ xylR5 - Pu- luxCDABE ) P. putida KT2400 , homloga , la degradacin : Medio fresco , rico , 30 C , el vapor , 20 h Tiempo de ensayo imagen CCD 2,4 - dinitrotolueno , salicilato 100 mg deteccin de minas

aplicacin referencia interruptor genes Fuente Homoserinlacto organism Fuente nas N-acilo gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia 2,4interruptor dinitrotolueno genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

Varios compuestos orgnicos

caractersticas Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

especificidades Diseo P. putida KT2400, homloga, la degradacin: Medio fresco, rico, 30 C, el vapor, 20 h Tiempo de ensayo imagen CCD 2,4-dinitrotolueno, salicilato 100 mg deteccin de minas (de las Heras, Carreo et al. 2008)

REFERENCIAS
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117

APENDICE B
Reportero bacteriana Bio Diseos Targeting (Heavy) Metales y metaloides
compuesto arsnico naturaleza interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para ensayo la construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para ensayo la construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para ensayo la construccin medicin compuestos detectados especificidades Pars ( ArsR ) - ArsR arsRDABC ( resistencia a arsenato / arsenito ) E. coli plsmido R773 lucFF (P. p. ) Prom . fusin + regulador : plsmido pTOO31 ( ARSR - Pars :: lucFF ) E. coli - Homlogo - Resistencia: m Liofilizado , mm + casena , 30 C , 90 min de tiempo de luminometra incubacin ASO2 - , AsO43 - , SBO2 - , Cd2 + 33 nM - 1 mM (10 mM) Las soluciones acuosas ( Tauriainen , Virta et al. 1999 ) Pars ( ArsR ) - ArsR arsRBC ( resistencia a arsenato / arsenito ) E. coli cromosoma luxAB ( V. h . ) Prom . fusin + regulador : cromosoma : insercin del transposn en el gen BSRA ( ARSR E. coli - Homlogos - Resistencia: + Pars - arsB' - Tn [ luxAB ]) Medio fresco , rico , 37 C , tiempo de induccin 60 min luminometra ASO2 , 80 nM - 2 mM (0,8 mm) arseniato de cobre cromado ( conservante de la madera ) ( Cai y ( Cai y DuBow DuBow 1997 ) 1996 ) Pars ( ArsR ) - ArsR arsRBC ( resistencia a arsenato / arsenito ) Staphylococcus aureus plsmido pI258 luxAB ( V. h . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : PC200 ( Pars - arsRB ':: S. aureus luxAB ) - Homlogo - Resistencia : + Medio fresco , rico , 37 C , 120 min de tiempo de ensayo

arsnico

arsnico

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto

arsnico

naturaleza El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin

Specificities 1 mM - 20 mM ( 5 mM) Aqueous solution (Corbisier, Ji et al. 1993) Pars (arsR) - ArsR arsRBC (arsenate/arsenite resistance) Staphylococcus aureus plasmid pI258 lucFF (P. p.) Prom. fusion + regulator: plasmid: pTOO21 (Pars-arsR::lucFF) S. aureus Homologous - Resistance: + Fresh, Lyophilized, MM + casein, 30C, 120 min assay time Luminometry AsO2-, SbO2-, AsO43-, Cd2+ 0.1 M - 10 mM ( 3.3 mM) Aqueous solutions (Tauriainen, Karp et al. 1997) Pars (arsR) - ArsR arsRDABC (arsenate/arsenite resistance) E. coli plasmid R773 luxAB (V. h.) Prom. fusion + regulator: plasmid: pRLUX (Pars-arsRD::luxAB) E. coli Homologous - Resistance: m Fresh, rich medium, 37C, 180 min assay time Luminometry, fiber optics AsO2-, SbO21 aM - 1 mM (10 nM) Aqueous solutions (Ramanathan, Shi et al. 1997) Pars (arsR) - ArsR arsRDABC (arsenate/arsenite resistance) E. coli plasmid R773 luxAB (V. h.) or egfp or lacZ or ccp Prom. fusion + regulator: with or without extra ArsR binding site on E. coli Homologous - Resistance: + plasmid Fresh or from frozen stocks, MM medium with Glu, 30-37C, 2-4 h assay time Luminometry, fluorimetry, histology AsO2-, AsO4-, SbO210 nM 4 M linear Aqueous solutions, groundwater, food stuffs (Stocker, Balluch et al. 2003; Baumann and van der Meer 2007; Wackwitz, Harms et al. 2008)

arsnico

referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

arsnico

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto arsnico

naturaleza interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero

cadmio

especificidades Pars ( ArsR ) - ArsR arsRDABC ( resistencia a arsenato / arsenito ) E. coli plsmido R773 luxCDABE ( V. h . ) o lucFF o gfp Prom . + regulador de fusin : plsmidos parsRlucFFGFP , parsRGFP , larsRluxCDABE E. coli MC1061 - Heterlogo - Resistencia: + / Fresca , M9 ms de casena , 37 C , 0,5 a 2 h Luminometra ( o fluorometra ) As (III ) 30 nM - 1 M ( luc o lux) Las soluciones acuosas ( Hakkila , Maksimow et al . 2002 ) PcadC ( CADC ) - CADC ( represor ) Cadca (resistencia de cadmio) S. aureus plsmido pI258 lucFF (P. p. ) Prom . fusin + regulador : plsmido : pTOO24 ( PcadC - CADC :: lucFF ) B. subtilis - heterlogos - Resistencia : Liofilizado , MM (casena ) , 30 C , 120 min Tiempo de ensayo luminometra Cd2 + , Pb2 + , SBO2 - , Sn2 + 10 nM - 10 M ( Tauriainen , Karp et al. 1998 ) PcadC ( CADC ) - CADC ( represor ) Cadca (resistencia de cadmio) S. aureus plsmido pI258 egfp de pPROBE -NT Prom . fusin + regulador : plsmido : pVLCD1 ( PcadC - adca ' :: GFP ) E. coli - Heterlogo - Resistencia : Medio fresco , rico , 37 C , 120 min de tiempo de ensayo fluorometra Cd2 + , Sb3 + , Pb2 + , Zn21 10 nM - 10 M Extractos de agua del suelo ( Liao , Chien et al . 2006 ) PcadC ( CADC ) - CADC ( represor ) Cadca (resistencia de cadmio) S. aureus plsmido pI258 luxAB ( V. h . )

arsnico

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto

naturaleza diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista

especificidades Prom . fusin + regulador : plsmido : PC300 ( PcadC - adca ':: luxAB ) S. aureus - Homlogo - Resistencia : + Medio fresco , rico , 37 C , 120 min de tiempo de ensayo luminometra Cd2 + , Bi3 + , Pb2 + 0,5 mm - 0,1 mm ( 20 mM ) Las soluciones acuosas o suspensiones ( Corbisier , Ji et al . 1993 ) PzntA - ZntR zntRA ( cadmio y la resistencia de zinc a partir de E. coli ) E. coli luxCDABE ( V. f . ) Dos plsmido sistema : pSLZntR ( ZntR ) y pDNPzntAlux ( zntAp - lux) o mini - Tn5 ( zntRPzntAlux ) MC1061 de E. coli o P. fluorescens OS8 Fase expo, medio M9 con Glu, 30 C , 2 h tiempo de ensayo - Fresh luminometra CdCl2 , HgCl2 , Pb ( NO3 ) 2 , ZnSO4 10 nM - 1 M Las soluciones acuosas ( Ivask , Rolova et al. 2009 ) PchrB ( ChrB ) chrBA ( resistencia cromato ) C. metallidurens plsmido pMOL28 luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin : plsmido : pEBZ141 ( PchrB - chrBA ':: luxCDABE ) Regulador: cromosoma : host codificada C. metallidurens - Homlogos - Resistencia: + , MM de glicerol , 28 C , 120 min de tiempo de ensayo fresco luminometra CrO42 - , Cr2O42 - , Cr3 + 1 nM - 0,1 mM ( 50 mM) Las suspensiones o soluciones acuosas ( Peitzsch , Eberz et al . 1998 ) PchrB ( ChrB ) chrBA ( resistencia cromato ) C. metallidurens plsmido pMOL28

cadmio

cromo

cromo

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto

cobre

naturaleza Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin

cobre compuesto cobre

especificidades C. metallidurens - Homlogos - Resistencia: + , MM gluconato , 23 C , 300 min de tiempo de ensayo fresco luminometra CrO42 - , Cr3 + 2 M - 80 M ( 40 micras ) Las suspensiones o soluciones acuosas ( Corbisier , van der Lelie et al. 1999 ) Genes taza - ND CuPc (resistencia de cobre) C. metallidurens plsmido pMOL28 luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : derivado del plsmido pMOL90 , que contiene la insercin del transposn en el gen CuPc ( cupC' - Tn [ C. metallidurens - Homlogos - Resistencia: + luxCDABE ]) Liofilizado , mM de acetato , 23 C , 300 min de tiempo de ensayo luminometra Cu2 + , Cd2 + , Zn2 + 2 M - 0,1 mm ( 40 micras ) Las cenizas volantes ( Corbisier , Thiry et al. 1996 ) , suelos fangosos pesados metlicos contaminados ( Corbisier , Thiry et al. 1996 ) ( Corbisier , Thiry et al. 1994 ) n PcopA - CueR COPA , cueR (tolerancia de cobre) E. coli luxCDABE (P. l . ) o lucFF (P. p. ) Dos plsmido sistema : pSLcueR ( ZntR ) y pDNPcopAlux ( zntAp - lux) o mini - Tn5 ( cueRPcopAlux ) o P. fluorescens OS8 MC1061 de E. coli Fase expo, medio M9 con Glu, 30 C , 2 h tiempo de ensayo - Fresh luminometra CuSO4 , AgNO3 , 100 nM - 1 mM Las soluciones acuosas ( Rensing , Fan et al 2000 ; . Hakkila , Green et al 2004 ; . Ivask , Rolova et 2009 al. ) PpbrA - PbrR pbrRA ( resistencia del cable ) C. metallidurens plsmido pMOL30 luxCDABE (P. l . )

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto

plomo

naturaleza ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin

especificidades Fase expo, medio M9 con Glu, 30 C , 2 h tiempo de ensayo - Fresh luminometra Pb2 + , Cd2 + , Hg2 + , Zn2 + , 0,2-1 mM Las soluciones acuosas ( Ivask , Rolova et al. 2009 ) PpbrA - PbrR pbrRA ( resistencia del cable ) C. metallidurens plsmido pMOL30 luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : no se describe ms plsmido ( PpbrR - pbrRA ':: luxCDABE ) C. metallidurens - Homlogos - Resistencia: + Liofilizado , MM gluconato , 23 C , 300 min Tiempo de ensayo luminometra Pb2 + 0.5 mm - 20 mm ( 5 mm) Las suspensiones acuosas ( Corbisier , van der Lelie et al. 1999 ) PTPCAD ( Mert ) - MerR (activador / represor ) merTPCAD ( resistencia al mercurio ) E. coli transposn Tn21 luxAB ( V. h . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : pCC306 ( Merr - PTPCAD :: luxAB ) E. coli - Homlogo - Resistencia : Medio fresco , rico , 37 C , 15 min de tiempo de ensayo luminometra Hg2 + 20 nM - 2 mm ( 0,2 mm) Las soluciones acuosas ( Condee y Summers 1992 ) PTPCAD ( Mert ) - MerR (activador / represor ) merTPCAD ( resistencia al mercurio ) E. coli transposn Tn21 luxCDABE ( V. f . ) Prom . + regulador de fusin : plsmido : pRB28 ( Merr - PTPCAD :: luxCDABE ) E. coli - Homlogo - Resistencia : , MM piruvato , RT, 100 minutos de tiempo de ensayo Fresh Hg2 +

mercurio compuesto plomo

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto

naturaleza aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

mercurio

especificidades aguas superficiales contaminadas con mercurio, extracto acuoso del suelo del mercurio contaminado el suelo ( Rasmussen , Srensen et al. ( Selifonova , Burlage et al . 1993 ) 2000 ) PTPCAD ( Mert ) - MerR (activador / represor ) merTPCAD ( resistencia al mercurio ) E. coli transposn Tn21 luxCDABE ( V. f . ) Prom . + regulador de fusin : plsmido : pOS14 ( Merr - PTPCAD merTPC :: luxCDABE ) E. coli - Homlogos - Resistencia: + , MM piruvato , RT, 100 minutos de tiempo de ensayo Fresh luminometra Hg2 + 0,5 nM - 0,5 M ( 50 nm) agua superficial contaminada con mercurio ( Selifonova , Burlage et al . 1993 ) PTPCAD ( Mert ) - MerR (activador / represor ) merTPCAD ( resistencia al mercurio ) E. coli transposn Tn21 lucFF (P. p. ) Prom . + regulador de fusin : plsmido : pTOO11 ( Merr - PTPCAD :: lucFF E. coli)- Homlogo - Resistencia : , MM casena , 30 C , 60 min de tiempo de ensayo fresco luminometra Hg2 + , Cd2 + 0,1 fM - 1 mM ( 0,1 mM) Las soluciones acuosas ( Virta , Lampinen et al. 1995 ) PTPCAD ( Mert ) - MerR (activador / represor ) merTPCAD ( resistencia al mercurio ) E. coli transposn Tn21 luxCDABE ( V.f. ) o Peso gfp ( A. c ) Prom . fusin + regulador : plsmido : - mergfp put ( Tn [ Merr - PMER :: GFP E. coli ] )- Homlogo - Resistencia : Fresh , MM leucina + prolina , RT, a 80 minutos de ensayo o medio fresco 30 C , 16 h tiempo de ensayo , rico, Luminometra o fluorometra Hg2 + 0,25 - 2,5 ng / ml ( como el HgCl2 ) o 50 a 250 ng / ml para GFP

mercurio

mercurio

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto mercurio

naturaleza interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente

especificidades PTPCAD ( Mert ) - MerR (activador / represor ) merTPCAD ( resistencia al mercurio ) E. coli transposn Tn21 lucFF o gfp o DsRed o luxCDABE Prom . fusin + regulador : plsmido : pmerRlucFFGFP , pmerRGFP , pmerRDsred , pmerRluxCDABE E. coli - Homlogos - Resistencia: + , M9 ms casena, 37 C , 0,5 a 4 h tiempo de ensayo Fresh Luminometra o Fluorimetra Hg 100 pM - 2 nM ( luc o lux) Las soluciones acuosas ( Hakkila , Maksimow et al . 2002 ) PmerT ( Mert ) - MerR (activador / represor ) Merta ( resistencia al mercurio ) Serratia marcescens luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : pMerlux (no se describe ms adelante) E. coli - Heterlogo - Resistencia : Medio fresco , rico , 28 C , 30 min de tiempo de ensayo luminometra Hg2 + , acetato de mercurio , Hg + 20 nM - 4 mm ( 0,4 mM) Las soluciones acuosas ( Tescione y Belfort 1993 ) PmerT ( Mert ) - MerR (activador / represor ) Merta ( resistencia al mercurio ) Serratia marcescens luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido pmerRBSBpmerlux o o mini - Tn5 ( merRBSBpmerlux ) pDNmerRBSBpmerlux MC1061 de E. coli o P. fluorescens OS8 Fase expo, medio M9 con Glu, 30 C , 2 h tiempo de ensayo - Fresh luminometra CH3HgCl , HgCl2 , CdCl2 8 PM - 1 nM agua superficial contaminada con mercurio ( Ivask , Hakkila et al 2001 ; . . Ivask , Rolova et al 2009 ) cnrHp ( CNRH ) CnrY , CnrX (anti complejo sigma factor ECF)

mercurio

mercurio

nquel

B. BACTERIAL

METALS AND

compuesto

nquel

naturaleza gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista

especificidades luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : pMOL1550 ( cnrYXH :: luxCDABE ) C. metallidurens ( pMOL28 , pMOL30 ) - Homlogo - Resistencia: + , MM gluconato, 23 C , 16 h tiempo de ensayo Fresh luminometra Ni2 + , Co2 + 20 M - 1 mm ( 0,3 mm) Aguas subterrneas contaminadas o extractos de agua del suelo ( Tibazarwa , Wuertz et al . 2000 ) PCEL ( cel ) celABCDF (degradacin celobiosa ) i E. coli luxAB ( V. h . ) Prom . de fusin :

Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero

cromosoma : insercin del transposn en el gen CELF ( PCEL - celABCDF' Tn [ luxAB ] ) Regulador: cromosoma E. coli - Homlogo - Resistencia : - : encodedo anfitrin Medio fresco , rico, 37 C , 18-24 h tiempo de ensayo luminometra Ni2 + , Co2 + 4 M - 0,2 mM solucin acuosa ( Guzzo y DuBow 1994 ) ND TLL genes (resistencia talio ) C. metallidurens plsmido pMOL30 luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin + regulador : plsmido : derivado del plsmido pMOL30 , que C. metallidurens contiene la insercin - Homlogos del transposn - Resistencia: en + el gen tllB ( tllB' - Tn [ luxCDABE ]) No hay datos luminometra Tl + 4 M - 0,1 mm ( 40 micras ) solucin acuosa ( Collard, Corbisier et al. 1994 ) PczcD ( czcD ) CzcI / CzcD ( / protena sensor periplsmico respuesta regulador putativo ) czcDRS ( regulacin de los genes que codifican czcCBA cobalto, zinc y cadmio C. metallidurens resistencia plsmido ) pMOl30

Talio

zinc

compuesto

naturaleza diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

zinc

especificidades Prom . fusin + regulador : plsmido : derivado de pMOL30 plsmidos que contienen la insercin del transposn en el gen CZCS ( czcICBADRS' C. Tnmetallidurens [ luxCDABE ] ) - Homlogos - Resistencia: + , MM gluconato, 25 C , 48 h tiempo de ensayo Fresh luminometra Zn2 + , Pb2 + , Cd2 + , Co2 + 0.1 mm - 0.4 mm ( 0,2 mM) solucin acuosa ( van der Lelie , Schwuchow et al . 1997 ) PzntA - ZntR zntRA ( cadmio y la resistencia de zinc ) E. coli luxCDABE (P. l . ) Dos plsmido sistema : pSLZntR ( ZntR ) y pDNPzntAlux ( zntAp - lux) o mini - Tn5 ( zntRPzntAlux ) MC1061 de E. coli o P. fluorescens OS8 Fase expo, medio M9 con Glu, 30 C , 2 h tiempo de ensayo - Fresh luminometra CdCl2 , HgCl2 , Pb ( NO3 ) 2 , ZnSO4 1 M - 1 mM Las soluciones acuosas ( Ivask , Rolova et al. 2009 ) PsmtA ( ANTM) SMTB ( represor ) ANTM ( metalotionena que confiere resistencia contra de zinc ) Synechococcus sp . luxCDABE ( V. f . ) Prom . fusin : plsmido : pJLE23 ( PsmtA :: luxCDABE ) Regulador: cromosoma : host Synechococcus sp .codificada - Homloga - resistencia: + , MM , 30 C , 60 min de tiempo de ensayo fresco luminometra Zn2 + , Cd2 + , Cu2 + 0.5 mm - 16 mm ( 4 mm) solucin acuosa

zinc

REFERENCES
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APENDICE

Reportero Bio bacteriana Diseos de respuesta a la toxicidad o condiciones de estrs

mecanismo Alka caracterstica interruptor genes Fuente alquilacin de organism Fuente gen reportero ADN diseo Periodista especificidades Paka ( Alka ) Ada (activador ) Alka ( reparacin del ADN de la enzima capaz de escindir bases E. coli metiladas de ADN) luxCDABE ( V. f . ) Prom . fus : . plsmido : pAlkALux1 ( Paka :: luxCDABE ) Regulador: cromosoma : acoger codificada Anfitrin de tensin para E. coli - homlogas ensayo Liofilizado , mm + casena , 30 C , 90 min de tiempo de la construccin medicin luminometra incubacin compuestos detectados MNNGi El rango de concentracin estrs Fosfotristeres y bases generados por alquilacin de ADN referencia ( Vollmer , Belkin et al. 1997 ) metilado interruptor PfabA ( faba) FadR ( activador ) genes Fuente Beta - hidroxi - decanoil - ACP- deshidrasa organism Fuente E. coli cromosoma fabA gen reportero luxCDABE ( V. f . ) Prom . de fusin : plsmido pFabA' - Lux La biosntesis diseo Periodista de cidos Anfitrin de tensin para Cromosoma del husped Regulador codificada grasos ensayo E. coli rpsL200 , tolC la construccin medicin Medio fresco , rico , 37 C , tiempo de induccin 60 min compuestos detectados luminometra El rango de concentracin fenol estrs referencia Equilibrio entre la sntesis y degradacin de los cidos grasos interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista (Ben -Israel , Ben -Israel et al 1998 ; . Bechor , Smulski et al 2002 ; PclpB ( clpB DnaK ( factor anti -SH ) . . Pedasur ,) Polyak et al 2004) dnaK ( acompaante ; factor anti -SH ) E. coli gfpuv ( A. c )

Anfitrin de tensin para Prom . fus : . plsmido : pGFPuv - ClpB ( PclpB :: gfpuv ) ensayo E. coli - homlogas la construccin Regulador: cromosoma : acoger codificada medicin

mecanismo

caracterstica compuestos detectados El rango de concentracin estrs referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor

especificidades fenol Aumento en el nivel de protenas mal plegadas debido a la presencia de ciertos compuestos o un aumento de la temperatura (Cha, Srivastava et al. 1999) PdnaK (dnaK) DnaK (factor anti-SH) dnaK (acompaante; factor anti-SH) E. coli luxCDABE (V. f.) Prom. fus:. plsmido: pRY002 (PdnaK :: luxCDABE) Regulador: cromosoma: acoger codificada E. coli - homlogas luminometra pentaclorofenol, 2,4-diclorofenoxiactico, 2-/4-nitrophenol, fenol, Cu2 +

dnaK El choque trmico

(Van Dyk, Majarian et al. 1994) PdnaK (dnaK) DnaK (factor anti-SH) dnaK (acompaante; factor anti-SH) E. coli GFP-uv Prom. fus:. plsmido: pGFPuv-DnaK (PdnaK :: gfpuv) Regulador: cromosoma: acoger codificada E. coli - homlogas fluorometra fenol

dnaK El choque trmico

genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo

(Cha, Srivastava et al. 1999) PgrpE (grpE) DnaK (factor anti-SH) grpE (acompaante) (Yura y Nakahigashi 1999) E. coli luxCDABE (V. f.) Prom. fus:. plsmido: pGrpELux5 (PgrpE :: luxCDABE) Regulador: E. coli - homlogas cromosoma: acoger codificada

C. BACTERIAL

TO TOXICITY OR STRESS

mecanismo

caracterstica compuestos detectados

especificidades pentaclorofenol, cido 2,4-diclorofenoxiactico, 2-/4-nitrophenol, fenol,

lon El choque trmico

El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo

Cu2 +, 2,4-dinitrofenol, Cd2 + (Van Dyk, Smulski et al. 1995), 2-clorofenol, Cloruro de 4-bromofenol, metileno, bromid de metileno, cloroformo, bromoformo, bromodiclorometano (Belkin, Smulski et al. 1997) (Van Dyk, Majarian et al. 1994) Plon (lon) DnaK (factor anti-SH) lon (proteasa) E. coli luxCDABE (V. f.) Prom. fus:. plsmido: pLonLux2 (Plon :: luxCDABE) Regulador: cromosoma: acoger codificada E. coli luminometra pentaclorofenol

rpoH El choque trmico

(van Dyk, Reed et al. 1995) PrpoH (rpoH) DnaK (factor anti-SH) factor sigma rpoH E. coli GFP-uv Prom. fus:. plsmido: pGFPuv-Sigma (PrpoH :: gfpuv) Regulador: E. coli - homlogas cromosoma: acoger codificada fluorometra fenol

(Cha, Srivastava et al. 1999) PkatG (katG) OxyR (activador) katG (catalasa) (Storz y Imlay 1999) E. coli luxCDABE (V. f.)

C. BACTERIAL

TO TOXICITY OR STRESS

mecanismo

caracterstica medicin compuestos detectados

micF

El rango de concentracin estrs referencia interruptor

especificidades luminometra ( . Schweigert , Belkin et al 1999) catecol , fenol, 2-/4-nitrophenol , 2 clorofenol, 4 -bromofenol ( Belkin , Smulski et al 1997 . ) , Hg2 + , Pb2 + , Zn2 + ( Ben- Israel, Ben -Israel et al . 1998 ) H2O2 , nitrosotioles ( Belkin , Smulski et al. 1996 ) PmicF ( micF ) SoxR / soxS ( activadores ) ( Storz y Imlay 1999 ); MarA ( . Oh , Cajal et al 2000) micF ( ARN antisentido contra ompF ) E. coli luxCDABE ( V.f. ) Prom . fus : . plsmido : pMicFLux1 ( PmicF :: luxCDABE ) Regulador: cromosoma : acoger codificada E. coli - homlogas luminometra paraquat , 4 - nitrofenol, 2 - clorofenol, 4 -bromofenol , bromoformo , bromodiclorometano ( Belkin , Smulski et al. 1997 ) El anin superxido ( O2 - ) , xido ntrico (NO ) ( Storz y Imlay 1999 ) ( Dukan , Dadon et al 1996 ; . . Oh , Cajal et al 2000) PfumC ( FUMC ) - SoxR / SoxS FUMC fumarasa C E. coli RFM443 cromosoma luxCDABE ( V. f . ) Fusin Prom : plsmido PBC- Fum -Lux E. coli RFM443 luminometra paraquat

estrs odixative genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin estrs referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero estrs oxidativo diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo FUMC medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo

(Kim , Park et al. 2005 ) PsoxS ( soxS ) - SoxR soxS doble activador de la transcripcin en respuesta reguln superxido E. coli RFM443 cromosoma luxCDABE ( V. f . ) Fusin Prom : plsmido PBC- Medias -Lux E. coli RFM443

C. BACTERIAL

TO TOXICITY OR STRESS

mecanismo

caracterstica medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia INAA interruptor genes Fuente estrs oxidativo organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente Soda organism Fuente gen reportero estrs oxidativo diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin

especificidades luminometra paraquat

(Kim, Youn et al. 2005) PinaA (INAA) - SoxR / SoxS INAA respuesta a condiciones cidas E. coli RFM443 cromosoma luxCDABE (V. f.) Fusin Prom: plsmido PBC-Ina-Lux E. coli RFM443 luminometra paraquat

(Kim, Youn et al. 2005) PsodA (sosa) - SoxR / SoxS superxido dismutasa Soda E. coli RFM443 cromosoma luxCDABE (V. f.) Fusin Prom: plsmido PBC-sosa-Lux E. coli RFM443 luminometra paraquat

(Kim, Youn et al 2005;.. Lee, Youn et al 2007) PCDA (cda) LexA / Reca (represor / anti-represor) cda (inhibidor de la sntesis de protenas) E. coli plsmido pColD luxCDABE (P. l.) Prom. fus:. plsmido: ppls-1 (PCDA :: luxCDABFE) Regulador: cromosoma: acoger codificada E. coli luminometra sulfato de dimetilo, Cr2O72-(Rettberg, Baumstark-Khan et al. 1999)

C. BACTERIAL

TO TOXICITY OR STRESS

mecanismo

caracterstica estrs

referencia interruptor genes Fuente respuesta SOS organism Fuente gen reportero diseo Periodista reca Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente reca organism Fuente gen reportero respuesta SOS diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados

especificidades Hebras de ADN de cadena sencilla que aparecen como consecuencia de ADN inhibicin de la replicacin ( Ptitsyn , Horneck et al . 1997 ) Preca - LexA / Reca ( represor / anti -represor ) Reca recombinasa implicada en la reparacin de ADN despus de la E. coli replicacin gfp - mut3 ( A. c ) Prom . fus : . plsmido : pRGM5 ( Preca :: GFP - mut3 ) Regulador: cromosoma : acoger codificada E. coli fluorometra MNNG , cido nalidxico , mitomicina C

( Kostrzyska , Leung et al . 2002 ) Preca - LexA / Reca ( represor / anti -represor ) Reca recombinasa implicada en la reparacin de ADN despus de la replicacin E. coli luxCDABE ( V. f . ) Prom . fus : . plsmido : pRecALux3 ( Preca :: luxCDABE ) Regulador: E. coli - homlogas cromosoma : acoger codificada luminometra

El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente reca organism Fuente gen reportero mecanismo diseo Periodista Anfitrin de tensin para la reca construccin ensayo medicin respuesta SOS compuestos detectados El rango de concentracin

El fenol , 2 - chloropheno , cloruro de metileno , bromuro de metileno , cloroformo ( Belkin , Smulski et al . 1997 ) , el benzo [a ] pireno , naftaleno , Cd2 + ( mnima, Kim et al . 1999 ) ( Vollmer , Belkin et al. 1997 ) Preca - LexA / Reca ( represor / anti -represor ) Reca recombinasa implicada en la reparacin de ADN despus de la ADP1 baylyi Acinetobacter replicacin luxCDABE (P. l . ) Integracin cromosmica: recA' - luxCDABE baylyi Acinetobacter 3h luminometra MMC , pireno , benzo [a ] pireno

C. BACTERIAL

TO TOXICITY OR STRESS

Mechanism

recN SOS response

Characteristic Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds

Specificities MDL for MMC and benzo[a]pyrene 1.5 nM and 0.4 nM, respectively (Song, Li et al. 2009) PrecN (recN) recN (protein involved in post-replication DNA repair) E. coli luxCDABE (V. f.) Prom. fus.: plasmid: pMOL1067 (PrecN::luxCDABE) Regulator: chromosome: host encoded Salmonella typhimurium -Heterologous

Mitomycin C, nalidixic acid, carbaryl, pentachlorophenol, SeO2, K2Cr2O7, benzo[a]pyrene, chrysene, pyrene, 2,4,5,7-tetranitro-9-fluorenone, 4nitroquinoline-N-oxide, fluoranthene, phenanthrene, N-nitrosodiethylamine, 2aminofluorene, MMS, hydrazine

Concentration range Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay Measurement Detected compounds Concentration range Application Reference Switch Source genes Source organism Reporter gene Reporter design Host strain for construction Assay (van der Lelie, Regniers et al. 1997) PumuD (umuD) LexA/RecA umuDC (enzymes involved in mutagenic DNA repair) E. coli luxAB (V. h.) or gfp Prom. fusion: plasmid: pTJ10 (umuDC::luxAB) or plasmid: pTJgfp (umuDC::gfp) Regulator: chromosome: host encoded E. coli - Homologous Luminometry or fluorometry MNNG, MMS

Umu SOS response

uvrA SOS response

(Justus and Thomas 1998) PuvrA (uvrA) LexA/RecA uvrA(DNA repair enzyme involved in the excision of pyrimidine dimers and bulky lesions) E. coli luxCDABE (V.f.) Prom. fus.: plasmid: pUvrALux1 (PuvrA::luxCDABE) Regulator: chromosome: host encoded E. coli - Homologous

mecanismo

usp

caracterstica medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia interruptor genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista

Specificities Luminometry Mitomycin C

Anfitrin de tensin para la construccin ensayo medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia Sula interruptor respuesta SOS genes Fuente organism Fuente gen reportero diseo Periodista Anfitrin de tensin para la ensayo construccin medicin compuestos detectados El rango de concentracin aplicacin referencia

(Vollmer, Belkin et al. 1997) PuspA (uspA) uspA universal stress protein E. coli luxCDABE (V.f.) Prom. fus.: plasmid: pUspALux2 (PuspA::luxCDABE) Regulator: chromosome: host encoded E. coli - Homologous - Resistance: Luminometry 4-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol, phenol, pentachlorophenol, Cu2+

(Van Dyk, Smulski et al. 1995) PsulA (sulA) LexA/RecA sulA SOS cell division inhibitor E. coli luxCDABE (P.l.) Prom. fusion:plasmid: psulA::luxCDABE Regulator provided on chromosome of host E. coli - Homologous Fresh, LB broth, shaking at 37C to early exponential growth phase (OD600 a 0.12). 2 h assay time. Luminometry Nalidixic acid 1 10 mg/L Aqueous solutions (Yagur-Kroll, Bilic et al. 2009) (Norman, Hestbjerg Hansen et al. 2005)

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APENDICE

Ejemplo de Bio reportes de protocolos

D.1 MEDICIONES arsenito CUANTITATIVOS CON UN E. COLI luxAB luciferasa bioinformador
Principio de la Prueba En la presencia de arseniato (AsV) y arsenito (AsIII) las clulas reportero Bio arsnico de Escherichia coli DH5a-1478 (pJAMA8-ArsR) producen bioluminiscencia que puede medirse fcilmente con un luminmetro. Materiales de vidrio Material de luminmetro (4 ml) Agitador rotatorio (30 C) Soluciones Solucin de arsenito de valores (1,000 mg As (III) / L 50 mM) estril de Caldo Luria (LB) Ampicilina solucin de stock (50 mg / ml), esterilizada por filtracin a travs de una solucin de n-decanal 0,2 micras filtro estril (18 mM en 1:1 v / v de etanol-agua) Glicerol estril (87% (vol / vol)) Cultivo y almacenamiento de las clulas reportero bio Placa de Escherichia coli DH5a (pJAMA8-ArsR) sobre agar LB suplementado con 50 g / ml de ampicilina. Incubar toda la noche a 37 C. Elige una colonia e inocular 5 ml de LB suplementado con 50 mg / ml de ampicilina. Incubar toda la noche a 37 C. Inocular 50 ml de LB con 1 ml del cultivo durante la noche. Se incuba a 37 C con agitacin a 200 rpm hasta una densidad ptica de 0.6 (longitud de onda 600 nm). Mezclar todo el cultivo (50 ml) con 10 ml fros y glicerol estril (87% (vol / vol)).

Dividir en partes alcuotas de 0,65 ml en viales Eppendorf estriles y almacenarlos a -80 C . Reporte de bio ensayo Preparar una serie de calibracin con 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, y 1,0 M AsIII en agua; Stocks Descongele de clulas reportero bio de 2 minutos a 30 C y diluirlas en LB (1,3 ml reportero clulas bio en 10 ml de LB); Mezclar 0,5 ml de esta suspensin reportero Bio con 0,5 ml de muestra de agua en un vial de 4 ml de vidrio adecuadas para el luminmetro; Incubar las muestras de agua desconocidos a ensayar para la contaminacin por arsnico de la misma manera; Tapar los frascos con tapn de rosca y los incuban en un agitador rotatorio a 200 rpm y 30 C durante al menos 30 minutos; Aadir solucin de n decanal 50 l a cada vial; Mezclar e incubar durante otros 3 minutos; Mida la emisin de luz en el luminmetro. Emisin de Lighte se expresa como unidades de luz relativas (RLU). Manejo de datos Las concentraciones de arsnico inorgnico en las muestras desconocidas se interpolan a partir de una curva de calibracin . Observaciones 1) La intensidad de la bioluminiscencia es proporcional a la concentracin de arsnico en el rango de 7,5 a 75 g AsIII / L (= 0,1 a 1 M Como). 2) Las clulas reportero Bio tambin reaccionan a arseniato (ASV) en aproximadamente el 10% de la respuesta a arsenito (AsIII). 3) en lugar de 4 viales ml de vidrio, placas de 96 pocillos se pueden utilizar para el ensayo. En ese caso, el volumen de ensayo ha sido reducida a 200 l. Las proporciones relativas de clulas y productos qumicos siguen siendo los mismos. 4) Las muestras de agua pueden tener que ser pretratado cuando contienen grandes cantidades de hierro. Ver: Trang et al. [2005].

REFERENCES

143

REFERENCIAS
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D.2 MEDICIN DE ARSNICO UTILIZANDO UN E. COLI GFP BIOSENSOR POR MICROSCOPIA epifluorescencia
Principio de ensayo En la presencia de arseniato y arsenito las clulas reportero Bio E. coli DH5a-1598 (pProbe-ArsRABS) sintetizar GFP (protena fluorescente verde). La fluorescencia emitida por tales clulas puede ser visualizada por microscopa de epifluorescencia. Para un anlisis cuantitativo de la fluorescencia de GFP emitida a partir de bacterias individuales fluorometra, citometra de flujo o anlisis de imagen digital tiene que ser utilizado Material Microscopio de epifluorescencia, portaobjetos y cubreobjetos EGFP-filtro (longitud de onda de emisin de 525 nm) Greiner placa de 24 pocillos centrfuga Eppendorf 50 ml tubos Greiner Soluciones Solucin madre arsenito (1000 mg de As (III) / L, 50 mM) estril de Caldo Luria (LB) Sulfato de kanamicina (50 mg / ml), esterilizada por filtracin a travs de un filtro estril de 0,2 micras. Mnimo de sales estriles medianas (HSH; por litro: 0,5 g NaCl, 1 g de NH4 Cl, 5,5 g MOPS cido libre, 5,1 g de sal de sodio MOPS, 0,05 g Na2 HPO4 2H2 O, 0,045 g KH2 PO4, 0,02% de glucosa, 20 mmoles MgSO4, 1 mmol de CaCl2, pH 7. MOPS = 3 - (Nmorfolin-O) propanosulfnico) Bio reporte de la preparacion de celulas de cultivo Placa de Escherichia coli DH5a (pProbe-ArsR-ABS) en agar LB suplementado con 50 mg / ml sulfato de kanamicina. Incubar toda la noche a 37 C; Elige una colonia e inocular 5 ml de LB suplementado con 50 mg / ml de sulfato de kanamicina. Incubar durante 14 horas (una noche) a 37 C en una plataforma de agitacin; Diluir 0,4 ml de cultivo durante la noche en 20 ml de LB suplementado con 50 mg / ml de sulfato de kanamicina; Continuar la incubacin durante aproximadamente 3 h a 37 C hasta que la turbidez de la suspensin de clulas es 0,6 (longitud de onda 600 nm);

D.2. MEDICIN DE ARSNICO UTILIZANDO UN E. COLI GFP BIOSENSOR POR MICROSCOPIA

epifluorescencia

Centrifugar 20 ml de la suspensin en un tubo de 50 ml de Greiner durante 5 min. ya temperatura ambiente a 4'500 rpm; Decantar el sobrenadante; Resuspender pellet de clulas en 20 ml de MSM por agitacin lentamente. Bio reporter ensayo (epifluorescence microscopy) Preparar una serie de calibracin con 0, 0,5, 1,0 y 5,0 mM AsIII en el agua; Las mezclas de ensayo contienen: 0,5 ml de suspensin celular diluida (HSH) y 0,5 ml de muestra (o solucin de calibracin arsenito). Mezclar en Eppendorfs o pocillos de una placa de 24 pocillos; Se incuba a 37 C con agitacin, si es posible; Muestra a 1h, 2h y 4h Cuantificacin GFP por microscopio de epifluorescencia Transferencia de 1 l de la mezcla de ensayo a analizar a un portaobjetos de microscopio. Coloque una hoja de cubierta y observar al 400-1000 magnificacin veces con un filtro adecuado para EGFP; Si es necesario para concentrar la cantidad de clulas visibles en la imagen de microscopio, se centrifuga una muestra de 0,2 ml durante 1 min a 13.000 rpm; Decantar el sobrenadante y resuspender en 10-50 l de HSH; Transfer 1 l con un cubre portaobjetos de microscopio y lugar. Manejo de datos Intensidades de fluorescencia pueden ser comparados con un control negativo (sin arsnico aadido) y los controles positivos por 'inspeccin visual'; Para el anlisis cuantitativo, es necesario para que las imgenes estandarizadas, por ejemplo, con una cmara digital y tiempos de exposicin fijos (100 - 500 ms); El brillo de los objetos en el archivo de imagen digital, posteriormente, se puede analizar con el software especializado, como ImageJ o NIHImage (freeware) o Metaview (Corporacin de imagen).

Reporte de ensayo alternativos usando fluorometra Preparar una serie de calibracin con 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,0, y 2,0 M AsIII en agua; Las mezclas de ensayo contienen: 100 l de suspensin celular diluida (HSH) y 100 l de muestra (o solucin de calibracin arsenito). Mezclar en pocillos de una placa de 96 pocillos; Se incuba a 37 C con agitacin, si es posible; Medir la absorbancia (por ejemplo, a 600 nm) y de fluorescencia (a 525 nm) en un fluormetro despus de 1, 2 y 4 h; Los valores de fluorescencia correctos para la cultura turbidez; Parcela corrige los valores de fluorescencia frente a las concentraciones de arsenito y calcular concentraciones equivalentes arsenito en las muestras desconocidas por interpolacinp . Observaciones Si MOPS no est disponible, se puede sustituir por un tampn fosfato (20 mM, pH 7). En este protocolo, la glucosa es esencial para proporcionar energa a las clulas. Vase ms arriba para el protocolo de luciferasa: tratamiento previo es necesario para la muestra de agua con alto contenido en hierro .

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D.3. MEDICIONES DE ARSNICO CON UN E. COLI BETA -galactosidasa bioinformador

D.3 M E D I C I O N E S D E A R S N I C O C O N U N E . C O L I Bioinformador BETA-galactosidasa

Principio de ensayo En la presencia de arseniato y arsenito las clulas reportero Bio arsnico E. coli DH5a -1595 (PMVArsR-ABS) sintetizar la enzima beta-galactosidasa. La actividad de la beta-galactosidasa puede ser cuantificado por ensayo espectrofotmetro (ensayo de Miller con ONPG), por ensayo potenciomtrica usando PNPG como sustrato, o observ visualmente mediante el uso de X-Gal como sustrato. X-Gal se convierte por la enzima a un color azul. La intensidad del color azul es una medida de la exposicin de las clulas al arsnico. Esta es la versin ms simple de la prueba biosensor arsnico. Materiales Palillos de dientes estriles Placas de 24 pocillos Greiner (o viales de incubacin transparentes equivalentes Soluciones Solucin de arsenito de valores (1,000 mg As (III) / L 50 mM) estril Caldo Luria (LB) Ampicilina solucin de stock (50 mg / ml), esterilizada por filtracin a travs de un filtro estril de 0,2 micras Solucin de X-Gal (25 mg / ml en dimetilformamida, almacenar a -20 C en la oscuridad) Preparacin de cultivos de clulas bio reportero Placa de Escherichia coli DH5a (PMV-ArsR-ABS) en agar LB suplementado con 50 mg / ml ampicilina. Incubar toda la noche a 37 C; Elige una colonia e inocular 5 ml de LB suplementado con 50 mg / ml de ampicilina. Incubar durante 14 horas (una noche) a 37 C en una plataforma de agitacin; Diluir 0,4 ml de cultivo de una noche en 20 ml de LB; Transferencia de 2 ml de esta suspensin celular diluida a un nuevo vial y aadir 0,1 ml de solucin de X-Gal. Esta es la suspensin de clulas para ser utilizado en el ensayo.

Ensayo de bio reporte Preparar una serie de calibracin con 0, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 y 5,0 mM AsIII en el agua; Las mezclas de ensayo contienen: 0,1 mL de suspensin diluida de clulas (en LB) y 0,9 ml de muestra (o solucin de calibracin arsenito). Mezclar en Eppendorfs o pocillos de una placa de 24 pocillos; Incubar a 30-37 C; Inspeccione el desarrollo del color despus de 3-5 horas de incubacin. (El ensayo se puede incubar durante tanto tiempo como el control negativo permanece incolora.) Interprete la intensidad de los colores en muestras desconocidas en comparacin con el blanc (sin arsnico) y para la 0,1 (= 7,5 g Como / L) y 0.5 M (= 37,5 microgramos Como / l) (los valores de calibracin correspondientes a la bebida de arsnico ms comn los estndares de agua)

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D.4 D.4.1

STRATAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA AGUA

FONDO Las muestras de agua con un contenido de hierro por encima de 0,5 mm se arsnico complejo en solucin, lo que hace que no est disponible para las clulas reportero bio. El tratamiento previo utiliza la acidificacin hasta pH 2, despus de lo cual el hierro est complejado con pirofosfator. Soluciones Solucin de pirofosfato de sodio 200 mM (Na4 P2 O7, 10H2 O, Sigma)) HNO3 Viales de 4 ml de vidrio Tratamiento y analisis Preparar bio reportero suspensin celular de las existencias congeladas (1,3 ml congelaron alcuotas con 10 ml de medio LB esterilizada); Se acidifica la muestra de agua con HNO3 a pH 2 (concentracin final de HNO3 = 0,015 mM); Mezclar la muestra se acidific con suspensin reportero Bio en LB en un (v / v) relacin de 01:01; PH resultante debe ser de al menos 5,5 (comprobar);

Inmediatamente despus, aadir 25 l de 200 mM de solucin Na4 P2 O7 (concentracin final 5 mM). pH debe ser 7. Incubar ensayo a 30 C durante 90 minutos y a 200 rpm Aadir 50 l de 18 mM n-decanal para medir la actividad de la luciferasa

D.4.2

ARROZ
FONDO No slo las muestras acuosas, sino tambin los productos alimenticios pueden contener (grandes) cantidades de arsnico. Parte de este arsnico est en forma de compuestos arsenicales orgnicos, una parte significativa es biolgicamente disponible como arsenito o arsenato. Para liberar el arsenito y arseniato de los alimentos y lo pongo en solucin acuosa, un pretratamiento enzimtico es necesario Materiales Cuentas de vidrio ( 0,1 mm) disruptor celular baos de agua Soluciones 15 mM HNO3 phosphat Solucin tampn de fosfato de Srensen (0,67 M, pH 7,4) solucin de pancreatina fresco (200 mg de pancreatina por 1,5 ml) Extraccion Mezclar 0,1 g de harina de arroz, 0,1 g de perlas de vidrio y 1,4 ml de HNO3 [15 mM] en 2 ml de tubos con cierre de tornillo; Vortex dos veces en Fastprep (velocidad de 6,5, el tiempo de 45 s); enfriar en hielo y agitar dos veces en Fastprep (velocidad 6,5, el tiempo 45 s); aadir 0,1 ml de pancreatina solucin incubar durante 8 horas a 37 C con agitacin; Vortex y se incuba durante 16 horas a 55 C, por ejemplo en un horno de hibridacin; Centrifugar durante 1 min a 13.000 rpm y la temperatura ambiente

transferir 600 l de sobrenadante a un tubo limpio, desechar el sobrenadante restante; aadir de nuevo 1 ml de HNO3 [15 mM] para el precipitado de extracto de nuevo durante 3 horas a 55 C centrifugar durante 1 min a 13.000 rpm transferir 0,6 ml de sobrenadante a un segundo tubo limpio la inactivacion de la inzima Coloque los tubos con el sobrenadante en un bao de agua hirviendo durante 15 minutos; Neutralizacion aadir 10% en volumen de solucin tampn de fosfato de Srensen al sobrenadante de cada tubo (por ejemplo, 70 l a 0,7 ml de sobrenadante) Reportero de ensayo Bio (por ejemplo, con el ensayo de luciferasa) descongelar cuatro alcuotas de cepas congeladas (4 x 0,65 ml de suspensin celular) centrifugadora 1 min para 13.000 rpm eliminar el sobrenadante resuspender cada pellet de clulas en 0,4 ml de LB y poner en comn las cuatro suspensiones (volumen final: 1,6 ml) Mezclar en un pocillo de una placa de 96 pocillos: 170 muestra tratada arroz l, suspensin de 10 l de clulas reportero bio, 20 l 10 veces concentradas medio LB; Preparar serie de calibracin como anteriormente pero usando HNO3 y tampn Srensen; Incubar durante 30 min a 1 h, aadir n-decanal y medir la actividad de luciferasa .

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153

Biografia del autor

JAN ROELOF VAN DER MEER
Jan Roelof van der Meer es Profesor Asociado en Microbiologa Ambiental en el Departamento de Microbiologa Fundamental de la Universidad de Lau-Sanne, Suiza. Se uni a la Universidad de Lau-sanne en 2003, despus de pasar diez aos, como lder de grupo en el Instituto Suizo de Ciencia Acutica y Tecnologa (EAWAG). Complet una maestra en Ciencias Ambientales por la Universidad Agrcola de Wageningen (Pases Bajos), y tiene un doctorado de la misma universidad especializada en microbiologa molecular. Antes de unirse a Eawag fue becario postdoctoral en el Dairy Instituto Nacional de Holanda. Su principal campo de inters se refiere a las interacciones muchas veces de bacterias con contaminantes qumicos en el medio ambiente. En la investigacin en curso su grupo persigue activamente los mecanismos evolutivos que subyacen a la adaptacin de las bacterias a la utilizacin de contaminantes orgnicos como fuente de carbono y energa nicas. Otra parte de su investigacin se centra en la degradacin de contaminantes por las bacterias en el medio ambiente. Una tercera actividad de su grupo se centra en el diseo, construccin y aplicacin de los periodistas bio bacterianas para medir la calidad del medio ambiente, que es el tema de esta conferencia. El Dr. van der Meer coordina el 7PM g ran BACSIN proyecto europeo integrado en la supervivencia bacteriana y la adaptacin en el medio ambiente. Antes de eso se desempe como coordinador del proyecto FaceIt 7PM, que se centr en las herramientas de deteccin de base biolgica para la evaluaci n de la calidad del medio ambiente