FEnsaios Biologicos

F.
Ensaios biolgicos 162

F. ENSAIOS BIOLGICOS
1. INTRODUO ................................................................................................................. 164
1.1. NF-B.......................................................................................................................... 164
1.1.1. Luciferase............................................................................................................. 168
1.1.2. IL-8....................................................................................................................... 169
1.2. Elastase........................................................................................................................ 172
1.2.1. Neutrfilos............................................................................................................ 172
1.2.2. Regulao da secreo de elastase ....................................................................... 176
1.2.3. Elastase................................................................................................................. 179
1.3. Arnica montana L. (Asteraceae) ................................................................................. 182
1.4. Harpagophytum procumbens DC. (Pedaliaceae) ........................................................ 183
1.5. Isatis tinctoria L. (Brassicaceae)................................................................................. 184
2. EXPERIMENTAL............................................................................................................. 186
2.1. Metablitos secundrios testados nos ensaios biolgicos ........................................... 186
2.2. Ensaios relacionados ao fator de transcrio NF-B .................................................. 188
2.2.1. Reagentes, anticorpos, enzimas, kits, materiais e aparelhos ................................ 188
2.2.2. Cultura de clulas................................................................................................. 191
2.2.2.1. Linhagens celulares....................................................................................... 191
2.2.2.2. Congelamento de clulas............................................................................... 192
2.2.2.3. Descongelamento de clulas e meios de cultura ........................................... 192
2.2.2.4. Clulas em suspenso.................................................................................... 192
2.2.2.5. Clulas aderentes........................................................................................... 192
2.2.3. NF-B................................................................................................................... 193
2.2.3.1. Ativao do NF-B....................................................................................... 194
2.2.3.2. Extrato de protenas totais............................................................................. 194
2.2.3.3. Anlise da ligao do NF-B ao DNA.......................................................... 195
2.2.3.3.1. Marcao do oligonucleotdeo com fosfato radioativo.......................... 195
2.2.3.3.2. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)....................................... 195
2.2.3.3.2.1. Gel ................................................................................................... 195
2.2.3.3.2.2. EMSA mix....................................................................................... 196
2.2.3.3.2.3. EMSA.............................................................................................. 196
2.2.4. Luciferase............................................................................................................. 197
2.2.4.1. Produo de luciferase .................................................................................. 197
2.2.4.1.1. Ativao do NF-B................................................................................ 197
2.2.4.1.2. Extrato de protenas totais ...................................................................... 198
2.2.4.1.3. Anlise da produo de luciferase.......................................................... 198
2.2.4.1.4. Determinao de protenas totais ........................................................... 198
2.2.4.2. Atividade enzimtica da luciferase ............................................................... 199
2.2.5. IL-8....................................................................................................................... 199
2.2.5.1. Solues ........................................................................................................ 200
2.2.5.2. ELISA............................................................................................................ 201
2.2.6. Citotoxicidade ...................................................................................................... 202
2.3. Ensaios relacionados enzima elastase ...................................................................... 203
2.3.1. Reagentes, materiais e aparelhos.......................................................................... 203
2.3.2. Preparao de solues: ....................................................................................... 206
2.3.2.1. Solues estoque ........................................................................................... 206
2.3.2.2. Solues frescas ............................................................................................ 206
2.3.3. Isolamento dos neutrfilos ................................................................................... 207
2.3.3.1. Sedimentao dos eritrcitos......................................................................... 207
2.3.3.2. Separao dos neutrfilos.............................................................................. 208
F. Ensaios biolgicos 163
2.3.3.3. Lise dos eritrcitos remanescentes................................................................ 208
2.3.4. Secreo da elastase ............................................................................................. 208
2.3.5. Atividade enzimtica da elastase.......................................................................... 209
2.3.6. Citotoxicidade ...................................................................................................... 210
2.3.7. Contagem de eosinfilos ...................................................................................... 210
2.3.8. Anlise estatstica................................................................................................. 211
3. RESULTADOS E DISCUSSES ..................................................................................... 212
3.1. NF-B.......................................................................................................................... 212
3.1.1. Efeito de LSTs na ligao de NF-B ao DNA..................................................... 212
3.1.2. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na ligao de NF-B ao DNA............... 215
3.1.3. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na produo e atividade de luciferase... 217
3.1.4. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na produo de IL-8.............................. 219
3.2. Elastase........................................................................................................................ 223
3.2.1. Secreo de elastase ............................................................................................. 223
3.2.2. Efeito de LSTs na secreo e atividade enzimtica de elastase ........................... 235
3.2.3. Efeito do gel e da tintura de Arnica montana na secreo e atividade enzimtica de
elastase ........................................................................................................................... 240
3.2.4. Efeito do extrato de Harpagophytum procumbens na secreo e atividade
enzimtica de elastase .................................................................................................... 242
3.2.5. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na secreo e atividade enzimtica de
elastase ........................................................................................................................... 244
4. BIBLIOGRAFIA................................................................................................................ 246

1. INTRODUO
A inflamao compreende eventos que ocorrem nos tecidos em resposta a um
patgeno invasor. Consiste de reaes imunologicamente especficas e tambm de vrias
reaes inatas, que no possuem base imunolgica. Tais reaes so protetoras, isto ,
possuem valor de sobrevivncia, mas se desenvolvidas inapropriadamente so prejudiciais. O
resultado pode ser cicatrizao, com ou sem fibrose, ou, se o patgeno persistir, inflamao
crnica.

1.1. NF-B
O fator de transcrio NF-B uma protena que serve como um regulador central da
resposta imune e inflamatria, via transcrio de mediadores inflamatrios como citocinas,
cicloxigenase-II, xido ntrico sintase, imunoreceptores, molculas de adeso e fatores de
crescimento hematopoitico (Garcia-Pieres et al., 2001).
NF-B uma protena dimrica, cujos monmeros pertencem famlia das protenas
Rel/NF-B. Esta famlia constituda por cinco protenas: c-Rel, RelA (p65), RelB, NF-B1
(p105 que transformada em p50) e NF-B2 (p100 que transformada em p52). A
transformao destas protenas ocorre atravs de protelise. Todos os dmeros apresentam um
domnio comum chamado de RHD (Rel-homology domain), que responsvel pela
dimerizao, ligao ao DNA e interao com a protena IB inibitria, assim como pela
seqncia de localizao nuclear (NLS). O dmero mais freqente formado pelos
monmeros p65 e p50. A composio do heterodmero que confere propriedades
particulares ao NF-B, como especificidade pela seqncia de DNA e seu potencial de
transativao (Karin e Ben Neriah, 2000; Karin e Lin, 2002).
Em clulas inativas, o NF-B reside no citoplasma ligado subunidade inibitria IB.
A famlia IB de protenas inclui IB-, IB-, IB-, IB-, Bcl-3 e as protenas precursoras
p105 e p100. A regio C-terminal de p100 e p105 constituem uma protena IB, que inibe
intramolecularmente as subunidades p52 e p50, respectivamente. As protenas IB interagem
com o RHD do NF-B mascarando NLS, inibindo portanto o seu transporte ao ncleo e a
ligao do NF-B ao DNA (Garcia-Pieres, 2003).
Apesar da enorme diversidade de indutores descritos para NF-B, a principal via de
ativao ocorre por meio da ativao do complexo IB quinase (IKK). A ativao deste
complexo ocorre atravs da famlia de quinases MAPK (mitogen activated protein kinase). As
substncias que induzem ativao de NF-B so o lipopolissacardeo bacteriano (LPS),
citocinas inflamatrias, vrus, estresse fsico e fisiolgico como as radiaes UV e gama, alm
de inmeros agentes qumicos. A ativao de IKK leva fosforilao de IB- nos
aminocidos serina 32 e 36. IB fosforilado sofre ubiquitinao por um complexo ligase-
protena-ubiquitin, e subseqente degradao por uma proteasoma (Karin e Ben Neriah,
2000). A degradao de IB desmascara o NLS permitindo o transporte do NF-B livre ou
ativo at o ncleo e a sua ligao ao DNA (Fig. F1), o que leva transcrio gentica (Garcia-
Pieres, 2003).
O complexo IKK contm dois stios catalticos, IKK- e IKK-, e uma unidade
reguladora conhecida como NEMO (NF-B-essential modulator). Geralmente estmulos
como LPS e citocinas ativam o IKK-, dita via cannica, comum para os dmeros com Rel-A,
c-Rel e p50 (Rothwarf e Karin, 1999). Uma outra via de ativao, bem menos comum, ativada
por BAFF (B-cell activating factor) promove a ativao de NIK (NF-B-inducing kinase) e
envolve a ativao de p100 por IKK-. Esta segunda via ocorre em dmeros com p52 e RelB.
As duas vias so apresentadas na figura F1 (Garcia-Pieres, 2003).


Figura F1. Vias de ativao de NF-B.

Uma vez livre, o heterodmero transportado para o ncleo por meio de um
mecanismo no clssico. Entretanto, o transporte do complexo NF-B-IB para fora do
ncleo ocorre por eventos clssicos e mais rapidamente quando comparado com NF-B livre,
o que pode contribuir para a regulao do processo inflamatrio (Garcia-Pieres, 2003).
A ligao de NF-B ao DNA crucial para a iniciao da transcrio, mas no
suficiente para a transativao, que s ocorre se o NF-B estiver fosforilado. O complexo NF-
B-IB est ligado a uma subunidade cataltica da PKA (protena quinase A). Quando o
complexo desfeito, a regio para ligao de ATP da enzima liberada e torna-se ativa. O
PKA fosforila ento a subunidade p65, processo chamado de modificao ps-translacional.
Esse estado determinante no recrutamento de coativadores e enzimas da transcrio (Zhong
et al., 1997). Outras enzimas podem tambm causar a fosforilao de outros aminocidos do
NF-B (Schmitz et al., 2001). Alm da fosfofrilao, o NF-B pode sofrer acetilao ou
outras modificaes ps-translacionais. A acetilao impede que o NF-B se ligue novamente
ao IB, determinando maior tempo de permanncia no ncleo (Chen et al., 2001).
Para que o NF-B tenha acesso maquinaria de transcrio do DNA, ou seja, para que
possa se ligar a ela, preciso que ocorram modificaes na cromatina. A cromatina o
complexo nucleoprotico altamente condensado que encerra o DNA. Este complexo
condensado precisa ser aberto e para tal a modificao mais comum a acetilao. A
transcrio dividida em iniciao, elongao e terminao. A regulao da transcrio
ocorre na fase de iniciao. A iniciao muito complexa e envolve a atividade de inmeras
protenas, conhecidas como fatores gerais de transcrio. Alm disso, coativadores da
transcrio promovem as modificaes necessrias para fase de iniciao. Apesar da
complexidade do processo, a arquitetura do promotor tambm determinante para a
especificidade da transcrio. Na fase seguinte ocorre a translao de RNAm levando
sntese da protena necessria e nesta mesma fase que ocorre o controle de translao,
impedindo ou favorecendo a sntese (Ainbinder et al., 2002; Mauro e Edelman, 2002).
O NF-B promove a expresso de mais de 150 genes em resposta inflamao,
infeco viral ou bacteriana e a outras situaes de estresse (Baeuerle e Henkel, 1994; Pahl,
1999). Os genes que so regulados por NF-B incluem citocinas pr-inflamatrias e
inflamatrias como IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF- e os genes para seus receptores. Alm
disso, o NF-B regula a expresso de molculas de adeso, protenas de fase aguda e enzimas.
Porm, a transcrio gentica especfica e est associada ao tipo de clula, mas os
mecanismos que determinam a transcrio de um ou outro grupo de genes ainda no foram
esclarecidos. Algumas suposies abrangem a questo da complexidade do processo de
transcrio, da sntese de IB em diferentes velocidades e ainda a questo do transporte
diferenciado de NF-B livre e do complexo NF-B-IB (Garcia-Pieres, 2003).
A inibio farmacolgica do NF-B atravs da adio do tipo Michael in vivo pode
modular a resposta inflamatria (Rngeler et al., 1999). Foi possvel demonstrar que as LSTs
inibem a ativao de NF-B e que a alquilao da cistena 38 da subunidade p65 crucial
para esta atividade (Garcia-Pieres et al., 2001). Neste trabalho, mais trs LSTs foram
investigadas quanto atividade inibidora de NF-B. Uma vez que o mecanismo de ao das
LSTs na inibio do fator de transcrio j foi elucidado (Garcia-Pieres, 2003), outra classe
de metablitos secundrios foi estudada sob o mesmo aspecto. Para tal, quatro representantes
da classe dos alcalides foram selecionados, uma vez que foram isolados de uma planta com
propriedades antiinflamatrias.
Promotor
Gen reprter
Enzima reprter
Sinal
RNAm
TNF-
Transcrio Translao
A avaliao do efeito de substncias ativas na expresso gnica dependente de NF-B
e na decorrente sntese protica foi realizada por meio de reporter gen assay para expresso
de luciferase e mediante o mtodo ELISA para produo de IL-8, respectivamente.

1.1.1. Luciferase
Como mencionado acima, a ligao do fator de transcrio ao DNA essencial, mas
no suficiente para que o processo de transcrio seja consumado (Zhong et al., 1997). Para
estudar a expresso gnica dependente de NF-B foi desenvolvido um ensaio com genes
reprteres, chamado de reporter gen assay. Por meio deste mtodo possvel avaliar
atividades especficas de promotores e indutores com vistas regulao mediante fatores de
transcrio. Com este mtodo possvel testar se substncias so capazes de inibir outras
fases da expresso gnica e no apenas NF-B diretamente. Neste caso a inibio da
expresso gnica pode acontecer por inibio de enzimas que fosforilam o NF-B no processo
de modificao ps-translacional ou ainda inibir a maquinaria de transcrio do DNA.
O reporter gen assay (Fig. F2) codifica protenas que so facilmente detectadas,
quantificadas e diferenciadas das protenas endgenas. Normalmente emprega-se uma enzima
reprter para o estudo do promotor, isto , se clona o promotor ligado ao gene de uma
protena, que facilmente detectada e que no causa alteraes na clula clonada. A
quantidade de protena expressa, assim como sua atividade enzimtica, mostra quo ativo o
promotor. Os genes reprteres mais usados so os genes da luciferase, cloranfenicol
acetiltransferase e -galactosidase (Lindenmeyer, 2004).

Figura F2. Reporter gen assay. O TNF- induz a expresso do gene reprter e aps a transcrio e
translao a atividade enzimtica pode ser facilmente detectada.
N
S
S
N
HO
H
ATP-Mg
2+
S
N
H
S
N
S
N
O
O
S
N
O O
OH
O
OAMP
O
OAMP
O
OAMP
O
O
N
S
S
N
HO
O
Luz
+ H
+
O
2
CO
2
luciferina
luciferil-AMP
+ AMP
*
oxiluciferina
O gene reprter aqui empregado aquele destinado produo de luciferase, enzima
que catalisa a reao bioluminescente de transferncia de energia do ATP para o substrato
luciferina, onde ocorre a oxidao da luciferina a oxiluciferina com liberao de AMP, CO
2
e
luz (Fig. F3), medida a 560 nm e quantificada por luminmetro. A atividade enzimtica
medida pela a quantidade de luz emitida em RLUs (relative light units). Aps a injeo de
substrato ao sobrenadante das clulas contendo luciferase, a reao iniciada em menos de
um segundo. O teste com a luciferase rpido e muito sensvel, sendo detectadas 10 fg a 10
g da enzima.

Figura F3. Reao de oxidao da luciferina a oxiluciferina catalisada pela luciferase com consumo de
ATP, formao de CO
2
, AMP e luz. A emisso de luz detectada por um luminmetro.

Para que a produo ocorra clulas devem ser transfeccionadas com um plasmdeo que
contenha o gene para luciferase. A enzima produzida pelo verme luminescente Photinus
pyralis. O plasmdeo deve possuir tambm o promotor para NF-B, alm de um gene
selecionador, que confira, por exemplo, resistncia a um determinado antibitico, a fim de que
as clulas transfeccionadas possam ser selecionadas. A enzima s produzida quando o
promotor ativado. Ento, se as clulas produzem a enzima significa que o processo de
transcrio do NF-B est funcionando normalmente (Lindenmeyer, 2004).

1.1.2. IL-8
Citocinas so substncias sinalizadoras, produzidas por diferentes tipos celulares, que
atuam em receptores especficos. Elas regulam a comunicao intercelular e possuem
diferentes clulas alvo e diferentes aes. As citocinas atuam apenas em distncias curtas, o
que as diferencia dos hormnios. O objetivo geral das citocinas a defesa contra
microrganismos e clulas degeneradas. As citocinas compreendem as quimiocinas,
interleucinas (IL), interferon (IFN), fatores de estimulao de colnia (CSF), citotoxinas,
como o TNF-, e fatores de crescimento (Baron, 1995).
As quimiocinas formam o maior grupo de citocinas. Elas so citocinas quimiotticas
produzidas, de forma constitutiva ou induzidas, por leuccitos e clulas de tecidos. As
quimiocinas so constitudas de 70-130 aminocidos com quatro resduos de cistena, que
formam duas pontes dissulfeto, o que caracteriza sua estrutura tridimensional, importante para
sua atividade. Conforme a posio das duas primeiras cistenas as quimiocinas so
classificadas em dois grupos principais: CC ou -quimiocinas (duas cistenas vizinhas) e CXC
ou -quimiocinas (cistenas separadas por outro aminocido). As -quimiocinas atraem
principalmente os neutrfilos e as -quimiocinas atraem moncitos, linfcitos, basfilos,
eosinfilos, clulas killer e dendrticas (Baggiolini, 2001).
A interleucina-8 (IL-8) foi inicialmente classificada como uma interleucina, mas na
realidade pertence realmente s quimiocinas. IL-8 produzida por moncitos, linfcitos T,
neutrfilos, fibroblastos, clulas epiteliais, endoteliais e tumorais. pouco encontrada em
tecidos sadios, mas sua produo aumenta de cinco a cem vezes aps estimulao por
citocinas, como TNF- e IL-1, LPS, produtos virais, estresse celular (Baron, 1995). As clulas
alvo so os neutrfilos, as clulas endoteliais e fibroblastos, mas o tipo de estmulo que
determina os alvos.
A IL-8 um mediador de inflamaes localizadas e tambm aumenta a adeso
endotelial e migrao de neutrfilos. A IL-8 estimula a quimiotaxia de clulas T e de
neutrfilos e a alterao de forma, a polimerizao da actina, o aumento da concentrao
intracelular de clcio e a degranulao de neutrfilos.
A expresso gnica de IL-8 regulada por trs mecanismos: ativao do promotor,
transativao do gene por meio do fator de transcrio NF-B e a quinase JUN e estabilizao
do RNAm por ao da p38 MAPK. Existem outros dois fatores de transcrio importantes
para mxima expresso gnica de IL-8, mas no para sua induo, que so o AP-1 (activator
protein-1) e a C/EBP (CAAT/enhancer-binding protein). Quando os estimuladores se ligam
superfcie celular, as protenas adaptadoras TRAF6 e TRAF2 so recrutadas e ativam
diferentes MAPKKK, como a TAK1, a MEKK1 e a NIK. Estas, por sua vez, ativam
diferentes vias de transduo de sinais como as que envolvem ERK, JNK, o p38 MAPK ou
IKK. Os objetivos das vias que envolvem ERK e JNK ainda no so conhecidos. p38 MAPK
responsvel pela estabilizao do RNAm e o IKK pela fosforilao de IB, o que
desencadeia a liberao de NF-B e por conseguinte a transcrio de IL-8 (Prahst, 2003;
Thelen, 2001).
O NF-B liga-se prximo ao NRE (negative regulatory element) no promotor. O
C/EBP acionado, o NRF (NF-B-repressing factor) passa a atuar como coativador, a
protena histona acetilada e promove a modificao da cromatina, o que possibilita o contato
mximo com a maquinaria de transcrio (Prahst, 2003).
Nas clulas no estimuladas, a expresso gnica de IL-8 inibida por trs
mecanismos, como a ligao de NRF ao NRE do promotor, o bloqueio do stio de ligao
para o fator de transcrio C/EBP e por desacetilao da protena histona (Prahst, 2003).
Entretanto, a produo descontrolada de IL-8 est relacionada a vrios processos
patolgicos, como a artrite reumatide, doenas pulmonares e de pele, infeces virais,
crescimento de tumores, esclerose mltipla, sinusite, pancreatite e arteriosclerose. Algumas
das doenas mais afetadas pela presena de IL-8 so discutidas a seguir (Lindenmeyer, 2004).
A IL-8 encontrada em altas concentraes nas secrees de pacientes com doenas
pulmonares, onde recruta os neutrfilos e induz a degranulao de enzimas como a elastase
(Lindenmeyer, 2004).
Das leses causadas por psorase foi isolada a IL-8. A psorase uma doena auto-
imune caracterizada pela hiperproliferao dos queratincitos. Alm disso, observa-se
acentuada infiltrao de neutrfilos. A expresso de IL-8 pode ser regulada por meio de
tratamento com imunossupresivos, mas polifenis, isolados de ch verde, e genistena, isolada
da soja, inibem no s a produo de IL-8, como tambm a proliferao dos queratincitos
(Trompezinski et al., 2003).
A artrite reumatide uma doena auto-imune caracterizada pela inflamao das
juntas e recrutamento de leuccitos, especialmente os neutrfilos, para a regio sinovial. O
recrutamento de neutrfilos e a secreo de elastase na regio sinovial so funes
desempenhadas pela IL-8. Nas articulaes, a IL-8 produzida principalmente por
macrfagos. A injeo de anticorpos anti-IL-8 na articulao acometida por uma crise aguda
leva reduo da infiltrao de neutrfilos e por conseqncia melhoria do quadro.
Com vistas ao acima discutido, entende-se que a busca por inibidores da expresso
gnica de IL-8 importante para o progresso das terapias de vrias doenas. Outro aspecto
importante no estudo da produo de IL-8 a elucidao do mecanismo de ao de
substncias com propriedades antiinflamatrias associadas ao fator de transcrio NF-B.
Para tanto, utilizou-se o mtodo ELISA para quantificar a produo de IL-8 por clulas em
cultura.
Uma vez que os efeitos das LSTs sobre a ativao de NF-B (Lyss et al., 1999; Schorr
et al., 2002) e sobre a ativao gnica para a produo de luciferase (Lindenmeyer et al.,
2004) e IL-8 j so conhecidos, bem como sua ao na liberao de elastase em neutrfilos
(Siedle et al., 2003), resolveu-se empregar estes mtodos para anlise de outras LSTs, de dois
produtos fitoterpicos e tambm de alcalides.

1.2. Elastase
1.2.1. Neutrfilos
Os leuccitos so clulas sangneas que compreendem os granulcitos, relacionados
resposta imune inespecfica, e os moncitos e os linfcitos, relacionados resposta imune
especfica. Os granulcitos, que constituem 63 % dos leuccitos, so clulas
polimorfonucleares que apresentam ncleo segmentado e grnulos especficos em seu
citoplasma (Silbernagl e Despopoulos, 2001). De acordo com a colorao que os grnulos
desenvolvem, os granulcitos so divididos em neutrfilos, eosinfilos e basfilos. Os
neutrfilos so assim designados porque seus grnulos so de difcil colorao (Fig. F4). Os
neutrfilos compreendem 90 % granulcitos. Estes granulcitos desempenham um papel
crucial na resposta imune do sistema de defesa (Bogomolski-Yahalom e Matzner, 1995; Burg
e Pillinger, 2001). Espcies reativas de oxignio e enzimas de neutrfilos so produtos
essenciais para os processos inflamatrio e de fagocitose de microrganismos (Witko-Sarsat et
al., 2000). Um adulto saudvel possui entre 3.000 e 7.500 neutrfilos por L de sangue,
porm em uma infeco este nmero pode chegar de 10.000 a 25.000. Problemas na produo
de neutrfilos que acarretem falta deles, como o caso da neutropenia, levam deficincia na
proteo contra infeces. Nos casos onde o nmero de neutrfilos menor do que 1.000/L,
a probabilidade de infeco cresce muito. Se este valor cair abaixo de 500 por L, pode
ocorrer descontrole na flora bacteriana corporal (Beck, 2002a).

Figura F4. Estrutura do neutrfilo e comparao com o tamanho dos eritrcitos.

A produo das substncias granulares ocorre apenas durante o processo de
hematopoiese e regida por citocinas como IL-3 e GM-CSF (granulocyte monocyte - colony
stimulating factor). A primeira fase da hematopoiese (Fig. F5) comea com a formao de
mieloblastos a partir de clulas tronco. Os mieloblastos diferenciam-se em promielcitos, que
geram os mielcitos, nos quais se formam grnulos especficos. Os mielcitos diferenciam-se
em metamielcitos, que no so mais capazes de se multiplicar (Beck, 2002b). Ento ocorrem
as modificaes nucleares, sendo que aps quatorze dias so formados os neutrfilos, que
tomam a corrente sangnea e dentro de sete horas comeam a migrar para os tecidos
inflamados, permanecendo l por um a quatro dias (Johnson et al., 1992).

Figura F5. Hematopoiese. Desenvolvimento das clulas sanguneas a partir de clulas tronco sob
influncias de citocinas na medula ssea (Catlogo Merck).

Em um processo infeccioso ou inflamatrio, os neutrfilos circulantes migram dos
vasos sangneos para o tecido atingido. Os neutrfilos so atrados por quimiocinas
secretadas por macrfagos aps a fagocitose de microrganismos. A seguir, penetram pelas
clulas endoteliais das vnulas, num processo denominado diapedese (Fig. F6), sendo para tal,
importantes as molculas de clulas de adeso na superfcie dos granulcitos e das clulas
endoteliais. A diapedese consiste no rolamento dos neutrfilos sobre o endotlio, havendo
uma fraca adeso causada por E e P-selectinas, molcula de adeso apresentada pelas clulas
endoteliais que se ligam a molculas de glicoprotenas na superfcie dos neutrfilos, que por
sua vez tambm apresentam L-selectina na superfcie. A firme adeso dos neutrfilos ocorre
aps sua ativao por mediadores como PAF, IL-8, fator de complemento C5a, citocinas,
fatores de crescimento como o TNF- e o GM-CSF, e produtos bacterianos, como o fMLP e
LPS. Os mediadores ligam-se ao neutrfilos por meio de receptores acoplados a protenas G.
A adeso dos neutrfilos parede do vaso sangneo finalmente ocorre por meio de uma
integrina da famlia 2 (CD11a(b,c)/CD18), que aps a ativao dos neutrfilos, capaz de se
ligar molcula de clula de adeso (ICAM-1) da superfcie endotelial. Ocorre ento aumento
da permeabilidade e os granulcitos migram para fora do vaso, processo facilitado pela ao
de enzimas proteolticas como elastase e colagenase, promotores do aumento da
permeabilidade. A partir disto os neutrfilos migram para o tecido afetado atravs de um
gradiente de quimiocinas, como mostra a figura F7 (Siedle, 2003; Witko-Sarsat et al., 2000).

Figura F6. Diapedese de neutrfilos.


Figura F7. Migrao quimiottica dos neutrfilos atravs de um gradiente de quimiocinas at o stio de
inflamao ou infeco (Witko-Sarsat et al., 2000).

A atividade antimicrobiana dos neutrfilos devido ao processo de fagocitose e
secreo de enzimas proteolticas dos grnulos. Os grnulos armazenam espcies reativas de
oxignio, produzidas por ativao de NADPH oxidase que reduz O
2
ao nion superxido (O
2
.-
). Os grnulos armazenam tambm serinaproteases, como a elastase, a catepsina G e a
proteinase 3, capazes de destruir a matriz extracelular. Existem ainda peptdeos
antibacterianos, como a defensina e a BPI (permeability increasing protein) e
metaloproteinases, como a colagenase (Borregaard e Cowland, 1997). Porm, o excesso da
secreo de enzimas pode provocar a destruio de tecidos sadios e por vezes expandir
desnecessariamente o processo inflamatrio.

1.2.2. Regulao da secreo de elastase
A estimulao dos neutrfilos por meio de quimiocinas leva ativao de diferentes
vias de transduo de sinal, que resultam na secreo de radicais de oxignio e de enzimas
proteolticas. As vias clssicas (Fig. F9) so aquelas desencadeadas pelo fosfolipdeo PAF
(fator de agregao plaquetria), pelo formiltripeptdeo bacteriano fMLP (N-formil-metionil-
leucil-fenilalanina) e pelo ster forbol PMA (12-miristato-13-acetato de forbol) apresentados
na figura F8.

PAF
O
O O
O
(CH
2
)
16
P
O-
O
O
N+
O

fMLP
HN CH C
CH
2
N
H
O
CH
2
S
CH
3
CH C
CH
2
N
H
O
CH CH
3
CH
3
CH C
CH
2
OH
O
C
O
H

PMA
O
OH
H
H
O
O
OH
H
OH
C
2
H
27
O
O

Figura F8. Estruturas dos estimuladores de neutrfilos.

O PAF, produzido por clulas do sistema imune e do endotlio, induz a homeostase
sangnea por meio da ativao de plaquetas. Tambm causa broncoconstrio e uma
substncia pr-inflamatria. O PAF considerado um ativador fraco de neutrfilos, mas por
outro lado um timo primer, pois prepara as clulas para uma potente ativao por
quimiocinas. Este um sistema de proteo do organismo contra ativao precipitada das
funes citotxicas, por isso nos ensaios laboratoriais a secreo deve ser auxiliada pela
adio de citocalasina B, um inibidor da atividade dos microfilamentos, antes da adio de
PAF ou fMLP (Henson e Oades, 1973).
Os efeitos do PAF nos neutrfilos so: depsito de actina do cistoesqueleto, aderncia
no endotlio, influxo de clcio, migrao em direo ao gradiente de quimiocinas e secreo
de enzimas proteolticas (Nick et al., 1997). O fMLP, por sua vez, alm de todos os efeitos
descritos para o PAF, causa tambm a produo de nion superxido.
As vias de transduo de sinais acionadas por PAF, fMLP e PMA so apresentadas na
figura F9. Quando a fMLP liga-se ao seu receptor transmembrana ocorre ativao, por meio
da fosfolipase C (PLC), dos mensageiros secundrios trifosfato de inositol (IP3) e
diacilglicerol (DAG), desencadeando a liberao de clcio intracelular. A PLC tambm ativa
a protena quinase C (PKC) e ativa a serina treonina quinase Raf por um lado e a MEKK-1
(MAPK/ERK quinase quinase) por outro. Essas duas quinases ativam a MEK1/MEK2,
levando ativao conseqente da p42/44 MAPK e MEKK-X, ocasionando na ativao de
p38 MAPK. A p42/44 MAPK fosforila a fosfolipase A2 (PLA2) citoslica. A PLA2 provoca
a secreo de cido araquidnico dos lipdeos de membrana e conseqente produo e
secreo de eicosanides, como prostaglandinas e leucotrienos, com efeitos pr-inflamatrios
e causando dor. O PAF, tambm dependente de receptor, alm de ativar fracamente a via

fMLP
Ras

Raf

MEKK 1

MEK1 / MEK2

ERK1 / ERK2

p42/44 MAPK

PLA2

cido araquidnico
PAF
MEKK X
MKK3

p38 MAPK

Adeso
Quimiotaxia
Degranulao

?
?
IP3 + DAG

Ca
2+

Degranulao
Eicosanides
PMA
PLC
PKC
Membrana celular
acima descrita, induz a ativao de MKK3 e por conseqncia de p38 MAPK (Burg e
Pillinger, 2001; Nick et al., 1997; Partrick et al., 2000).
O PMA um ativador inespecfico independente de receptor que ativa diretamente a
PKC, o que gera ativao das vias de p38 e de p42/44 MAPK. Ativando p42/44 MAPK
ocorre ativao da PLA2 e por conseqncia a produo dos eicosanides. Ao ativar a p38
MAPK so desencadeados os processos de adeso, quimiotaxia e degranulao (Nick et al.,
1997).

Figura F9. Vias de transduo de sinais nos neutrfilos (Nick et al., 1997).

A maior parte das enzimas envolvidas pertence famlia das MAPK, que transportam
o sinal da superfcie celular at o ncleo. Esta famlia de quinases regula a atividade de fatores
de transcrio, do citoesqueleto e de outras quinases, desempenhando papis importantes na
embriognese, diferenciao e proliferao de clulas. Elas so divididas em trs grupos:
p42/44 ERK (extracellular signal-regulated kinase), uma quinase regulada extracelularmente
que toma parte nos processos de proliferao, transformao e diferenciao celulares; p46/54
JNK (jun-N-terminal kinase) e C-Jun quinases, que esto envolvidos nos eventos de apoptose,
estresse e inflamao; e p38 MAPK, que tambm desempenha papis importantes na
apoptose, estresse e inflamao (English e Cobb, 2002).

1.2.3. Elastase
A elastase a principal enzima dos neutrfilos, mais conhecida
por seu potencial de destruio em pacientes com deficincia de
inibidores de proteinases (Bogomolski-Yahalom e Matzner, 1995; Burg e
Pillinger, 2001). O gene que codifica a elastase possui em torno de 4 kb e
est localizado na regio terminal do filamento curto do cromossomo 19,
cuja expresso gnica ocorre na fase de promielcito. A enzima elastase consiste de uma
cadeia simples de polipeptdeo com 218 aminocidos, ligados por pontes dissulfeto
(Belaaouaj, 2002; Bode et al., 1986). A enzima possui um stio cataltico formado pelos trs
aminocidos histidina (57), aspartato (102) e serina (195). Esta ordem dos aminocidos
conservada em todas as serinaproteases, como as enzimas pancreticas elastase, tripsina e
quimiotripsina.
A elastase, cujo pH timo de ao neutro, capaz de solubilizar a fibra elastina,
proteoglicanos de cartilagem, vrios colgenos, fibronectina e caderina, o que facilita a
migrao de clulas at a regio da inflamao. Ainda vrias protenas solveis como fatores
de coagulao sangnea, imunoglobulinas, fatores do sistema complemento e inibidores de
proteases so substratos da elastase.
Fisiologicamente a elastase est envolvida na degradao de bactrias gram-negativas
e materiais estranhos ingeridos durante a fagocitose. O efeito bactericida contra bactrias
gram-negativas e no gram-positivas deve-se ao fato da elastase ser capaz de degradar a
protena externa de membrana (OmpA outer membrane protein A), caracterstica de
bactrias gram-negativas (Belaaouaj, 2002). A elastase pode migrar para a membrana celular
e a ela se integrar, no intuito de reagir com estruturas de superfcie de clulas de mucosa
induzindo o aumento da produo de muco, o que promove a eliminao de bactrias mortas
do trato respiratrio (Nadel, 2000).
Por outro lado, a elastase tem um papel importante como antiinflamatrio, uma vez
que destri citocinas como IL-1, IL-2, IL-6 e TNF-, assim como fatores do sistema
complemento. A degradao dos fatores do sistema complemento leva reduo da ativao
de neutrfilos (Doring, 1994). A quebra de citocinas reduz o recrutamento de clulas T.
Em condies normais, a elastase no encontrada livremente no espao extracelular.
A -1-antitripsina o maior inibidor fisiolgico da elastase, alm de outros como o inibidor
de secreo de leucoprotease (SLP1), a elafina, que um inibidor de enzimas de moncitos e
a -2-macroglobulina. Porm, quando o processo de fagocitose falha, quando ocorre
exocitose ativa ou desequilbrio entre enzima e inibidor, a elastase livre na regio extracelular
pode ter efeitos destrutivos e pr-inflamatrios, como, por exemplo, a estimulao da
secreo de citocinas. A elastase pode destruir componentes de membrana celular, o que
causa danos ao endotlio e por isso o extravasamento de lquido para os tecidos, o que
acarreta edema (Moraes et al., 2003). Por isso, mesmo a elastase desempenhando papis
importantes no organismo, ela tambm est associada a doenas inflamatrias crnicas. Entre
elas esto as doenas do trato respiratrio, arteriosclerose, artrite reumatide e doenas de
pele, como a psorase, algumas delas comentadas a seguir.
Como os neutrfilos so importantes no sistema de defesa imunolgica natural que
estejam bastante presentes nos pulmes, onde a elastase desempenha papis importantes. Os
efeitos patolgicos da elastase no pulmo incluem asma, ARDS (adult respiratory distress
syndrome), enfisema pulmonar, bronquite e fibrose cstica, onde a quantidade de elastase
secretada muito aumentada (Lee e Downey, 2001; Moraes et al., 2003; Ohbayashi, 2002b).
A artrite caracterizada por um grande influxo de clulas mono e polimorfonucleares
para as regies sinoviais, nas articulaes sseas. Na artrite reumatide, doena auto-imune, a
concentrao de neutrfilos no lquido sinovial ainda maior. No processo inflamatrio
ocorre degradao da cartilagem e multiplicao as clulas sinoviais levando formao de
um tecido, que com o tempo causa danos cartilagem, aos ossos e aos tendes. A cartilagem
saudvel que recobre os ossos protegida por uma camada de proteoglicanas, que impede a
adeso de clulas, inclusive inibindo a atividade de elastase, que tem alta afinidade por este
tipo de tecido. Porm, se a enzima liberada em grande quantidade, ocorre adeso dos
neutrfilos na superfcie da cartilagem e inicia-se o processo de degradao. O nion
superxido, assim como outras espcies reativas de oxignio, danifica os inibidores de
elastase por meio de oxidao, favorecendo a ao da elastase sobre o tecido. O grave que
os fragmentos resultantes da protelise ativam outras clulas do sistema imune, acarretando a
fase crnica da doena (Brignone et al., 2001; Lee e Downey, 2001; Mitani et al., 2001;
Ohbayashi, 2002b; Witko-Sarsat et al., 2000).
O interesse pela descoberta de novos inibidores da elastase tem aumentado
consideravelmente. O tratamento por meio de antiinflamatrios, como corticides e
broncodilatadores no caso de doenas pulmonares, no capaz de evitar os danos teciduais
causados pela elastase. Apenas alguns inibidores de elastase foram desenvolvidos para
administrao oral, mas a relevncia teraputica destes produtos ainda no foi confirmada.
Alguns inibidores sintticos como peptdeos, compostos heterocclicos e outros agentes
alquilantes foram obtidos, mas sua eficcia no tratamento teraputico ainda no foi
comprovada (Bernstein et al., 1994b). Vrios produtos naturais isolados de plantas tambm
so conhecidos por sua atividade inibidora da elastase. Exemplos so os flavonides,
derivados do cido cafico, triterpenos e cidos graxos (Daels-Rakotoarison et al., 2003;
Loser et al., 2000; Melzig et al., 1999; Melzig et al., 2001b; Melzig et al., 2001a; Mitaine-
Offer et al., 2002; Ninomiya-Tsuji et al., 2003; Rotondo et al., 1998; Ying et al., 1991). No
entanto, a inibio da secreo da elastase poderia ser mecanisticamente mais eficaz e
interessante, como j foi observado para alguns compostos fenlicos, como resveratrol, e
tambm terpenides. Os terpenides compreendem uma enorme classe de metablitos
secundrios originada da via biossinttica do mevalonato, comum em vrias famlias de
plantas. Dentre eles, as LSTs tm tambm apresentado atividade inibidora da secreo da
elastase (Siedle et al., 2003).
Com o intuito de buscar novos inibidores da secreo enzimtica, adaptou-se um
mtodo (Johansson et al., 2002) para o uso de microplacas de 96 poos. Aqui discutimos a
otimizao de um experimento que avalia a secreo de elastase usando diferentes LSTs e
alcalides, assim como o estudo dos mecanismos envolvidos na secreo de elastase por
neutrfilos. Outro ponto importante, que ainda no havia sido discutido na literatura, a
investigao da estimulao basal da secreo do contedo granular dos neutrfilos. Esse
fenmeno, denominado de estimulao basal, consiste na secreo significativa de elastase,
mesmo na ausncia das substncias de estmulo para tal. Algumas consideraes interessantes
foram feitas em relao ao mecanismo deste fenmeno, especialmente porque as LSTs inibem
tambm esta estimulao basal.

1.3. Arnica montana L. (Asteraceae)
Arnica montana L. uma planta de origem europia da tribo
Helenieae, famlia Asteraceae. O nome arnica possivelmente surgiu da
deformao da palavra grega ptarmica, que significa que faz espirrar.
Foi descrita pelo mdico botnico italiano Mattioli no sculo XVI. Logo
aps sua descrio, a planta j comeou a ser receitada para os mais
diversos fins, porm os seus perigos j comearam a ser discutidos. A A.
montana era conhecida no sculo XIX como a quina-dos-pobres devido
sua propriedade febrfuga (Delaveau et al., 1983). Seus efeitos colaterais
envolvem problemas gastroenterais e cardacos e o uso externo pode
tambm causar dermatite de contato (Merfort, 2003). Hoje em dia, diferentes preparados das
flores so empregados topicamente por suas propriedades antiinflamatria, analgsica e anti-
sptica, no tratamento de hematomas, contuses, distenses e edemas em decorrncia de
quebra de ossos, artrite reumatide, furunculose, picadas de insetos, flebite, entre muitos
outros usos (Klaas et al., 2002; Merfort, 2003).
Os metablitos secundrios que mediam os efeitos antiinflamatrios so
principalmente as LSTs do tipo 10-metil-pseudoguaianolido como a helenalina e seus steres
derivados. Outros metablitos secundrios presentes na planta so compostos fenlicos, como
os flavonides e derivados do cido cafico, com efeitos antioxidantes, e leos essenciais,
com atividade antimicrobiana (Merfort, 2003).
A atividade antiinflamatria decorrente da inibio do fator de transcrio NF-B
pelas LSTs helenalina, 11,13-dehidrohelenalina e seus derivados. A tintura e o gel de A.
montana tambm inibem o NF-B a 10 L/mL e 50 L/mL, respectivamente. A tintura inibe
ainda a produo de IL-1 e de TNF-, assim como o edema de pata de rato (Klaas et al.,
2002).
Uma vez que o gel de A. montana, preparado com a tintura e gel-base, muito usado
contra artrite reumatide, e com base nas informaes supracitadas, ele foi tambm testado
com relao secreo da enzima elastase por neutrfilos. Foi avaliada ainda a ao do gel,
da tintura e do gel-base em relao atividade enzimtica de elastase.

1.4. Harpagophytum procumbens DC. (Pedaliaceae)
uma planta herbcea da famlia Pedaliaceae que se
desenvolve em reas limitadas da frica, especialmente no
deserto de Kalihari e estepes da Nambia. conhecida como
garra-do-diabo, nome dado em funo do aspecto ramoso e
lenhoso da fruta, provido de barbas semelhantes a garras. As
razes tuberosas da planta eram comumente usadas por
nativos africanos na forma de infuso para tratamento de doenas reumticas, diabetes,
arteriosclerose, malria (Clarkson et al., 2003), indigesto, febre, entre vrias outras. Embora
esta planta seja conhecida desde o sculo XIX, foi somente aps a primeira guerra mundial
que foram iniciados os estudos sobre suas propriedades farmacolgicas. O seu ch
recomendado para diabetes, alergias, senilidade, como estimulante de apetite, digestivo,
analgsico (Lanhers et al., 1992), sedativo (Chrubasik et al., 2000), diurtico e principalmente
para artrite (Andersen et al., 2004).
Entre os metablitos secundrios de H. procumbens esto os heterosdeos iridides,
como harpagosdeo, harpagdeo, harpagogdeo, procumbdeo, os compostos fenlicos
derivados do cido cinmico, cafico e clorognico, flavonides e -sitosterol.
Pela ao dos seus principais componentes, os heterosdeos e o -sitosterol, a garra-
do-diabo desempenha a atividade antiinflamatria (Lanhers et al., 1992). Os mecanismos de
ao relativos a esta atividade incluem a inibio da sntese de TNF-, de cicloxigenase-II e
da xido ntrico sintase induzvel, via inibio de NF-B (Fiebich et al., 2001; Kaszkin et al.,
2004; Kundu et al., 2005; Na et al., 2004). Por conseqncia, inibe a produo de
prostaglandinas, de onde vem a propriedade analgsica, alm da inibir a enzima elastase (Boje
et al., 2003).
Apesar de j se saber que o extrato aquoso da planta capaz de inibir a enzima
elastase diretamente, a concentrao necessria para tal bastante alta, 542 g/mL. Por isso o
extrato seco foi investigado quanto inibio da secreo de elastase por neutrfilos.

1.5. Isatis tinctoria L. (Brassicaceae)
A famlia Brassicaceae ou Cruciferae conhecida como
a famlia das hortalias, a sendo couve-flor, repolho, brcolis,
couve-manteiga, couve de bruxelas, mostarda, nabo, agrio,
rabanete e rcula, alguns de seus representantes. O anil ou
ndigo blue tambm um representante importante. Existem
relatos muito antigos de seu uso no Egito, oriente mdio, China
e ndia. Do sculo VXII em diante, ele passou a ser o corante
de tecidos mais usado do mundo.
O ndigo foi durante muitos sculos produzido a partir
de espcies do gnero tropical Indigofera, encontradas na
frica, sia, ndia e Amrica do Sul, da espcie Polygonum
tinctorium, encontrada na China e Coria, e da espcie Isatis
tinctoria, europia. O ndigo um artefato do metabolismo secundrio e hoje produzido
sinteticamente. Isatis tinctoria contm isatan B, como o maior, e o indican, como o menor
precursor do ndigo (Fig. F10). Nas folhas velhas, os precursores so hidrolisados quando elas
so machucadas e expostas ao ar. O grupo indoxil espontaneamente oxidado pelo oxignio
do ar produzindo o ndigo e isatin. A condensao de isatin com indoxil gera indirubin, sendo
um produto secundrio na produo do corante sinttico. Porm o ndigo natural possui uma
gama de produtos secundrios a esta reao, considerados impurezas de diferentes cores, que
o torna ainda mais rico em tons (Garcia-Macias e John, 2004; Maugard et al., 2001; Oberthr
et al., 2004).
Isatis tinctoria tambm h muito tempo empregada como planta medicinal por suas
propriedades antiinflamatrias (Oberthr et al., 2003). Com vistas s suas propriedades
medicinais, o principal alcalide indolquinazolnico de I. tinctoria triptantrina (Oberthr e
Hamburger, 2004), que possui diversas atividades biolgicas (Seifert e Unger, 1994). Sua
ao relacionada atividade antiinflamatria ocorre por inibio de enzimas como
cicloxigenase-II, lipoxigenase-5 e a inibio da sntese de prostaglandinas e leucotrienos
(Danz et al., 2001; Danz et al., 2002; Takei et al., 2003). O alcalide indlico indolinona inibe
quinases tirosnicas (Sun et al., 1998).
A partir destas constataes quanto s aes nos sistemas biolgicos, quatro alcalides
do tipo indlico e indolquinazolnico foram selecionados para dar continuidade aos estudos
das atividades relacionadas inflamao. Eles foram submetidos aos ensaios com NF-B,
produo de luciferase, de IL-8 e tambm secreo e atividade enzimtica de elastase.
N
O
H
N
O
H
N
O
H
N
O
H
N
O
O
H
N
O
H
N
OH
H
N
O
H
N
O
H
O
O
OH
HO
HO
OH
O
OH
HO
OH
HO
indoxil
isatan B
indican
isatin
ndigo
indirubin
a
a
b
b
b
b

Figura F10. Formao do ndigo a partir dos principais precursores presentes em folhas velhas ou
danificadas de Isatis tinctoria. a: hidrlise; b: oxidao (Maugard et al., 2001).

2. EXPERIMENTAL
2.1. Metablitos secundrios testados nos ensaios biolgicos
Os metablitos testados nos ensaios com a elastase, o NF-B, a luciferase e a IL-8 so
apresentados nas figuras F11a/b. Com exceo da LST 10, todos os outros metablitos, o gel
de Arnica montana e o extrato de Harpagophytum procumbens foram avaliados quanto ao
efeito na secreo de elastase. A LST 10 foi sujeita apenas ao ensaio sobre a atividade
enzimtica da elastase. Com relao inibio do fator de transcrio NF-B, foram testadas
as substncias 2, 11, 12, 19-22. Nos ensaios com a luciferase e a IL-8 foram testados apenas
os alcalides 19-22. As LSTs enidrina (1), uvedalina (2) e o dmero (10) foram isolados de
Smallanthus sonchifolius. A tagitinina C (11) foi isolada de Tithonia diversifolia, o 1(10),5-
trihidrxi-3,11(13)dien-8-angeloilxi-costunolido (12) de Dimerostemma brasilianum e a
budlena A (13) de Viguiera arenaria, sendo essas LSTs provenientes de espcies da tribo
Helianthea, as quais so provenientes do Laboratrio de Farmacognosia da FCFRP.. O 15-
desxi-goyazensolido (14) e o 15-acetxi-eremantolido B (15) foram isoladas de Eremanthus
arboreus (tribo Vernonieae) e gentilmente fornecidas pelo Prof. Dr. W. Vichnewski (FCFRP).
A helenalina (16) foi isolada de Arnica montana (tribo Helenieae) e a desidrosaussurea
lactona (17) de Saussurea lappa (tribo Cardueae), que foram cedidas pela empresa Hermal
(Alemanha). O partenolido (18), a principal LST de Tanacetum parthenium (tribo
Anthemideae), foi adquirido da empresa Sigma. Todas as espcies acima citadas e das quais
as LSTs foram isoladas, pertencem famlia Asteraceae. O extrato de Harpagophytum
procumbens (Pedaliaceae), o gel e a tintura de Arnica montana foram cedidos pela indstria
Bioforce (Alemanha). Os alcalides indolinona (19), triptantrina (20), isaindigotona (21) e
indirubina (22), isolados de Isatis tinctoria, foram gentilmente doados pelo Prof. M.
Hamburger (Universitt Jena, Alemanha).
Solues estoque de 100 mM das substncias-teste foram preparadas em DMSO e
diludas para 50, 20, 10, 5, 2, 1 e 0,5 mM.

O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
1
O
O
O
O
O
O
O
O
O
2
O
O
O
O
O
OH
11
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O O
10
O
OH
HO
H
OH
O
O
O
12
O
O
O
HO
O
O
O
13
O
O
O
O
O
O
14
O
O
O
O
O
O
O
OH
15
O
O
HO
O
16
O
O
H
17
O
O
O
18
Figura F11a. Estruturas das LST testadas nos ensaios biolgicos.
N
O
O
HO
O
H
19
N
N
O
HO
O
O
21
N
N
O
O
20
N
O
H
N
O
H
22
Figura F11b. Estruturas dos alcalides testados nos ensaios biolgicos.

2.2. Ensaios relacionados ao fator de transcrio NF-B
O NF-B encontra-se na clula na forma inativa, ou seja, ligada a uma protena
inibidora chamada IB. Na presena de estmulo inflamatrio, a protena fosforilada duas
vezes, sofre ubiquitinao, e ento na presena da proteasoma degradada, liberando o NF-
B. O NF-B livre sinnimo de ativo. O NF-B consiste de duas unidades que migram para
o ncleo onde se ligam ao DNA, desencadeando o processo inflamatrio.

2.2.1. Reagentes, anticorpos, enzimas, kits, materiais e aparelhos
Nas tabelas seguintes so apresentados todos os reagentes, anticorpos, enzimas, kits,
materiais, aparelhos utilizados para realizao de todos os ensaios relacionados ao NF-B e
seus respectivos fornecedores.

Tabela F1. Reagentes utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Reagentes Marca
[-
32
P]-ATP Amersham Pharmacia Biotech
cido brico Roth
Acrilamida (30 % AA, 0,8 % Bis) Roth
Aprotinina Sigma
APS (persulfato de amnio) Merck
Bromofenol blue Sigma
BSA frao V (albumina srica bovina) Sigma
Dietanolamina Merck
DMEM (Dubelccos modified eagle medium) Gibco
DMSO (dimetilsulfxido) Roth
DTT (ditiotreitol) Roth
EDTA (cido etilenodiaminotetractico) Roth
EGTA (cido N,N,N,N-etilenoglicol-bis-(-aminoetilter)-tetractico) Roth
EtOH Roth
FBS (soro fetal bovino) Sigma
Ficoll Amersham Pharmacia Biotech
Gel Slick
BME
Glicerol Roth
Glutamina Sigma
HCl Merck
HEPES (cido N-(2-hidrxietil)-piperazina-N-2-etanossulfnico) Roche Diagnostics
KCl Roth
KH
2
PO
4
Merck
LPS Sigma
LPS (lipopolissacardeo) Sigma
MgCl
2
Merck
Na
2
HPO
4
Merck
NaCl Roth
NaN
3
Merck
NP-40 (Nonidet P-40) Sigma
Penicilina Roche
PMSF (fluoreto de fenilmetil sulfonil) Sigma
PNPP (fosfato de p-nitrofenila) Sigma
Poly dIdC (cido polidexiinosnico e dexicitidlico) Roche Molecular Biochemicals
RPMI 1640 (Rochester Polytechnical Medicinal Institute 1640) Gibco
SDS (dodecil sulfato de sdio) Roth
Estreptomicina Roche
TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina) Roth
TNF- (fator de necrose tumoral-) Roche
Tris (tris-(hidrximetil)-aminometano) Roth
Tripsina-EDTA Gibco BRL
Tween-20 Roth
Papel Whatman 3 MM Schleicher & Schll
Zeocina Invitrogen

Tabela F2. Anticorpos, enzimas e kits utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Anticorpos, enzimas e kits Marca
Biotinylated mouse-anti-human IL-8 monoclonal antibody Pharmingen
Quick Start
FM
Bradford Protein Assay Bio-Rad
Colunas MicroSpin G-25 Amersham Pharmacia Biotech
Luciferase Reporter Gene Assay System Roche
Oligonucleotdeo para EMSA Promega
Purified mouse-anti-human IL-8 monoclonal antibody Pharmingen
Recombinant human IL-8 Pharmingen
Streptavidin-biotin alkaline phosphatase, StreptAB Complex/AP Dako
T4-Polinucleotdeo quinase Promega

Tabela F3. Materiais utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Materiais Marca
Frascos para cultura de clulas Greiner
Microplaca de 96 poos Greiner
Microplaca de F96 poos Maxisorp-Immuno Nunc
Microplaca F96 poos Lumitrac branca Greiner
Pipeta automtica Eppendorf e Gibson
Pipetador para pipeta graduada Eppendorf
Pipeta graduada descartvel Greiner
Pipeta multicanal Eppendorf
Pipeta Multistepper Brand
Placas de 6, 12 e 24 poos Greiner
Placas de Petri de 6 e 16 cm de dimetro Greiner
Tubos Eppendorf safe-lock Eppendorf
Tubos de 15 e 50 mL Falcon
Tubos de reao de 1,5 mL tipo Eppendorf Greiner

Tabela F4. Aparelhos utilizados nos ensaios relacionados ao NF-B.
Aparelhos Marca
Balana analtica Mettler Toledo
Bomba de vcuo Roth
Cmara de Neubauer Sigma
Cmara par gel de eletroforese Thoma
Capela de fluxo laminar CleanAir Techniek Biohazard
Centrfuga Rotina 35 R Hettich AG
Contador de clulas Wellhfer Dosimetrie
Estufa Thermo Forma Thermo Forma Lifescience
Flambador Wartewig
Microplaca Luminometer LB 96V (Micro Lumat Plus) EG & G Bechthold
Microcentrfuga Biofuge Fresco Heraeus
Microcentrfuga Eppendorf 5417R Eppendorf
Microplaca Reader Model 550 Bio-Rad
Microscpio Nikon TMS Nikon
Misturador magntico IKAMAG RCT Jahnke & Kunkel
pH-Metro CG 825 Schott
Phosphoimager FLA-3000 Fuji Photo Film Co. Ltd.
Secador para gel de eletroforese Bio-Rad
Vortex Genie 2 Scientific Industries

2.2.2. Cultura de clulas
2.2.2.1. Linhagens celulares
- Clulas Jurkat T: clulas T de leucemia humana aguda (Schneider et al., 1977),
DSZM Nr.: ACC282;
- Clulas 293 (clulas aderentes): linha permanente de clulas embrionrias
primrias de rim humano transformadas por adenovrus humano do tipo 5 DNA
(Graham et al., 1977), ATCC Nr.: CRL1573;
- Clulas 293 estavelmente transfeccionadas (clulas aderentes): clulas 293
transfeccionadas com vetor pNF-B-Luc, com gene para luciferase, promotor para
NF-B e pZeoSV, gene de resistncia ao antibitico zeocina (Lindenmeyer et al.,
2004);
- Clulas Raw 264.7 (clulas aderentes): macrfagos leucmicos de rato induzidos
pelo vrus Abelson (Ralph e Nakoinz, 1977);
- Clulas HeLa 229 (clulas aderentes): tecido epitelial de adenocarcinoma cervical,
isoladas de Henrietta Lacks (Jones, Jr. et al., 1971), ATCC Nr.: CCL2.1.
2.2.2.2. Congelamento de clulas
- As clulas devem ser soltas das paredes do recipiente, se necessrio;
- Desprezar o meio de cultura por aspirao;
- Adicionar 10 mL de novo meio de cultura e ressuspender as clulas;
- Transferir 8 mL da suspenso celular para tubo Falcon de 15 mL;
- Centrifugar por 5 min a 1.200 rpm (400 g) a 4 C;
- Desprezar o meio de cultura sobrenadante por aspirao;
- Ressuspender as clulas em 9 mL FCS e 1 mL DMSO;
- Aliquotar a suspenso celular em tubos de 1 mL e congelar a 80 C.

2.2.2.3. Descongelamento de clulas e meios de cultura
Para descongelar as clulas, basta adicionar o contedo do tubo de clulas
descongeladas ao longo de 30 min ao meio de cultura adequado: clulas Jurkat T e HeLa 229
em meio RPMI 1640 e clulas Raw 264.7, 293 e 293 estavelmente transfeccionadas em meio
DMEM. Todos os meios foram suplementados com 2 mM glutamina, 10 % de FCS, 100
IU/mL de penicilina e 100 g/mL de estreptomicina.

2.2.2.4. Clulas em suspenso
As clulas Jurkat T so cultivadas em frasco de 175 cm
2
a 37 C e 5 % CO
2
. A
densidade deve ser mantida entre 2 x 10
5
e 1 x 10
6
clulas/mL. Na diluio, realiza-se a
contagem das clulas em cmara de Neubauer. Um dado volume da suspenso transferido
para um novo frasco e adicionado meio de cultura previamente aquecido em q.s.p. cerca de
30 mL. Esse processo deve ser realizado a cada dois ou trs dias.

2.2.2.5. Clulas aderentes
As clulas 293 e 293 estavelmente transfeccionadas so cultivadas em frascos de 175
cm
2
e as clulas HeLa 229 em frascos de 75 cm
2
. J as clulas Raw 264.7 so cultivadas em
placas de Petri de 16 cm de dimetro a 37 C e 5 % CO
2
. Todas as culturas so mantidas na
posio horizontal a uma densidade abaixo de 80 % da confluncia.
As clulas 293 so soltas do frasco por shake-off, ou seja, forte agitao. A partir
disto possvel homogeneizar a suspenso e contar as clulas, para ento avaliar a
necessidade de diluio com meio DMEM geralmente em q.s.p. 30 mL.
As clulas 293 estavelmente transfeccionadas so manipuladas da mesma forma que
as clulas 293. Porm, durante o processo de cultivo, elas recebem 15 L do antibitico
zeocina, com o intuito de manter apenas a linha transfeccionada e impedir que clulas
mutantes com perda da transfeco se multipliquem.
As clulas Raw 264.7 so desprendidas da placa com auxlio de uma esptula
apropriada, a suspenso ento homogeneizada com auxlio de pipeta descartvel e a 2 mL de
suspenso celular em nova placa so adicionados 8 mL de meio aquecido DMEM.
As clulas HeLa 229 so to aderentes que devem ser tratadas com tripsina para que se
soltem da parede do frasco. A tripsina uma enzima proteoltica que, juntamente com EDTA,
desnatura protenas e complexa o clcio, que responsvel pela aderncia, permitindo que as
clulas se desprendam por meio de agitao (Richter, 2003). O processo consiste em:
- Desprezar o meio de cultura e as clulas continuam aderidas;
- Adicionar 3 mL de tampo PBS* estril, para lavar;
- Desprezar o tampo PBS por aspirao;
- Adicionar 2 mL de tripsina com EDTA aquecidos a 37 C;
- Incubar por apenas 5 min a 37 C;
- Adicionar 8 mL de meio RPMI 1640 e homogeneizar;
- Transferir a suspenso celular para tubo Falcon de 15 mL;
- Centrifugar por 5 min a 1600 rpm (533 g) a 4 C;
- Desprezar o sobrenadante por aspirao;
- Adicionar 10 mL de meio RPMI 1640 e homogeneizar o precipitado de clulas;
- Adicionar a 2,5 mL de suspenso celular em novo frasco cerca de 10 mL de meio
RPMI 1640.

* Tampo PBS (10x): 80 g NaCl (1,37 mM), 2 g KCl (27 mM), 7,65 g Na
2
HPO
4
* 2H
2
O (43 mM), 2 g KH
2
PO
4
(14 mM), 1 L gua Millipore
(Salina tamponada de fosfato)

Estes processos de diluio devem ser repetidos a cada dois ou trs dias. Vale ressaltar
que todos os procedimentos que envolvem manuseio de clulas foram realizados sob capela
de fluxo laminar em ambiente estril.

2.2.3. NF-B
O ensaio para avaliao da ativao e conseqente ligao do NF-B ao DNA foi
realizado com quatro linhagens celulares: Jurkat T, 293, Raw 264.7 e HeLa 229. As clulas
foram plaqueadas em placas de Petri de 6 cm de dimetro com 5 mL de cultura. A densidade
de 3-5 x 10
5
clulas/mL foi utilizada para clulas Jurkat T. As clulas 293, Raw 264.7 e HeLa
229 foram plaqueadas um dia antes do experimento ser iniciado e, portanto a densidade
utilizada foi de 1-2 x 10
5
clulas/mL, uma vez que no dia do experimento o dobro de clulas
est presente.

2.2.3.1. Ativao do NF-B
As placas foram marcadas considerando as amostras, o controle positivo que
receberam apenas estmulo, e o negativo, que no receberam nem o estmulo. A amostras
foram incubadas por uma hora a 37 C com 5 % CO
2
na presena das substncias teste em
diferentes concentraes. Aps este perodo, as amostras receberam o estmulo e foram
incubadas por mais uma hora. A ativao do NF-B foi estimulada por meio da adio de 1
L (0,5 g/mL ou 200 U/mL) de TNF- no caso das clulas Jurkat T, 293 e HeLa 229, e 1L
(1 g/mL) de LPS para as clulas Raw 264.7.

2.2.3.2. Extrato de protenas totais
A preparao do extrato de protenas consiste em promover a lise das membranas
celulares, o que se consegue por meio de um tampo de lise conforme:
- Promover a homogeneizao das clulas j estimuladas (por raspagem, tripsinao
ou pipetagem);
- Transferir as clulas para tubos Falcon de 15 mL, acondicionados no gelo;
- Adicionar 1 mL de tampo PBS gelado e homogeneizar;
- Transferir a suspenso celular para tubo tipo Eppendorf e manter sobre gelo;
- Centifugar por 1 min a 13.000 rpm (1.000 g) e 4 C;
- Ressuspender as clulas com 50 L de tampo de lise Totex*;
- Deixar em repouso no gelo por 30 min (para que ocorra a lise de membranas);
- Centrifugar por 5 min a 13.000 rpm (1.000 g) e 4 C;
- Transferir o sobrenadante, extrato de protenas, para um tubo Eppendorf safe-lock
e congelar imediatamente a 80 C.
A quantidade de protenas totais constante e para o experimento de eletroforese
foram empregados 10-20 g de protenas por amostra (5 L do extrato).

* Tampo Totex: 20 mM HEPES, pH 7,9, 350 mM NaCl, 20 % (v/v) glicerol, 1 % (p/v) NP-40, 1 mM MgCl
2
,
0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM DTT, 0,1 % PMSF, 1 % aprotinina

2.2.3.3. Anlise da ligao do NF-B ao DNA
2.2.3.3.1. Marcao do oligonucleotdeo com fosfato radioativo
O oligonucleotdeo foi marcado radioativamente usando uma polinucleotdeo quinase
de bacterifagos T4. Esta enzima catalisa a transferncia de -fosfato do ATP para a
extremidade 5-OH da dupla fita de DNA. Usando [-
32
P]-ATP como substrato, o -fosfato
radioativo transferido para o 5-OH do DNA, gerando um oligonucleotdeo 5-[
32
P]-fosfato
marcado. Inicialmente misturou-se:
- 1 L do oligonucleotdeo de dupla fita (25 g/L);
- 5 L tampo quinase 10x (acompanha o kit para EMSA);
- 1 L da T4 polinucleotdeoquinase;
- 37 L gua Millipore
esterilizada.
Esta mistura foi incubada por 40 min a 37 C. A purificao do produto foi realizada
por meio da coluna cromatogrfica MicroSpin G-25. A coluna foi centrifugada para ocorrer a
eluio, levando obteno de cerca de 50 L de oligonucleotdeo marcado, que foram
armazenados a 4 C.

2.2.3.3.2. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
2.2.3.3.2.1. Gel
O gel de poliacrilamida (4 %) deve ser preparado algumas horas antes da sua
utilizao. O gel foi preparado misturando-se:
- 56,5 mL de gua Millipore
;
- 7 mL de tampo TBE* 5x;
- 10 mL de soluo de acrilamida;
- 40L de TEMED;
- 400 L APS (10 %).

* Tampo TBE 10x: 108 g Tris, 55 g cido brico, 40 mL 0,5 M EDTA pH 8 em 1 L gua Millipore

Com a adio de APS e TEMED a reao de polimerizao foi iniciada, sendo que
dentro de no mximo 5 min o gel assume sua forma definitiva. A cmara foi montada com
placas de vidro, espaadores de plstico e presilhas de metal, sendo que a placa de vidro
superior recebeu Gel Slick
para permitir que o gel descole facilmente ao final do processo. A

soluo foi ento cuidadosamente vertida na cmara. A completa polimerizao ocorre dentro
de duas horas.
2.2.3.3.2.2. EMSA mix
Antes de aplicar as amostras no gel de eletroforese, os extratos de protenas foram
incubados com o oligonucleotdeo radioativo. Se a amostra contm NF-B livre, este se liga
ao DNA radioativo, formando um complexo estvel que migra como uma banda no gel de
eletroforese. O oligonucleotdeo radiativo e foi misturado a uma dupla fita sinttica de DNA
Poly (dIdC), no marcada radioativamente. O Poly (dIdC) compete por protenas que se ligam
ao DNA inespecificamente, deixando o DNA radioativo livre para a ligao com o NF-B.
O EMSA mix foi preparado para o nmero de amostras mais um, da seguinte forma:
- 2 L de BSA (10 g/L);
- 2 mg de Poly (dIdC) (1 g/L);
- 2 l de tampo D+*;
- 4 l de tampo F**;
- 4 L de gua Millipore
;
- 1 L de oligonucleotdeo radioativo marcado com
32
P (0,5 g correspondem a ~25
fmol, ~100.000 c.p.m., Cerenkov - 3000 Ci/mmol).
A cada amostra de 5 L de extrato de protena foram adicionados 14 L de EMSA
mix. As amostras foram centrifugadas por 15 segundos e incubadas por 25 min a temperatura
ambiente.

* Tampo D
+
: 20 mM HEPES, pH 7,9; 20 % glicerol, 100 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,25 % NP-40, 2 mM DTT,
0,1 % PMSF
** Tampo F: 20 % Ficoll 400, 100 mM HEPES, 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1 % PMSF

2.2.3.3.2.3. EMSA
O gel foi acondicionado no suporte apropriado com tampo TBE 0,5x. Foi efetuada
pr-corrida de 10 min a 200 V. No gel foi ento aplicado um corante com bromofenol, que
serve como um marcador visual. As amostras foram aplicadas no gel e a separao das bandas
se deu a 200 V aps 90 min ou 10 cm de corrida do corante.
O gel foi tirado do suporte e da cmara, aderido a uma folha de papel Whatman 3
MM, coberto com folha de plstico e secado em secador de gel sob vcuo a 80 C. O tempo
de secagem foi de aproximadamente 50 min
Depois de seco, o gel foi exposto a um filme Phosphoimager-BAS. Depois de
exposio do gel por cerca de 24 a 48 horas, os sinais foram detectados pelo aparelho
Phosphoimager.

2.2.4. Luciferase
2.2.4.1. Produo de luciferase
Por meio de reporter gen assay possvel avaliar atividades especficas de promotores
e indutores com vistas regulao mediante fatores de transcrio. O mais utilizado aquele
destinado produo de luciferase, enzima que catalisa a oxidao de luciferin a oxiluciferin
com liberao de luz, a qual quantificada por luminmetro. Para que a produo ocorra, as
clulas devem ser transfeccionadas. Transfeco consiste em introduzir em clulas
eucariticas um DNA estranho. Para tanto, vrios mtodos foram desenvolvidos, como
mecnico, eltrico, qumico e biolgico. Por meio do mtodo qumico com lipossoma um
plasmdeo contendo o gene para luciferase, o promotor para NF-B e um gene selecionador
que confere resistncia a um antibitico, zeocina, as clulas 293 foram transfeccionadas. Os
lipossomas penetram facilmente nas clulas liberando o plasmdeo. Aps dois dias, as clulas
que assimilaram o DNA esto aptas a produzir luciferase. A presena do gene que confere
resistncia determinante para a manuteno do clone celular selecionado, por isso dito
estvel (Lindenmeyer, 2004).
Quando as clulas so estimuladas com TNF-, o NF-B liberado e migra para o
ncleo, ligando-se ao gene promotor e assim inicia-se a sntese de luciferase. Quando na
presena de uma substncia-teste no se observa a produo de luciferase, o que pode estar
ocorrendo : interferncia direta na ligao do NF-B com o DNA; que a substncia inibe a
enzima luciferase propriamente dita; que inibe a liberao do NF-B; que inibe o NF-B
diretamente; que inibe o processo de transcrio. O processo de transcrio bastante
complexo, por isso o reporter gen assay uma ferramenta importante para avaliar-se o
mecanismo de ao dos metablitos que inibem o processo normalmente desencadeado pelo
fator de transcrio NF-B.

2.2.4.1.1. Ativao do NF-B
As clulas 293 estavelmente transfeccionadas foram plaqueadas sem zeocina na
densidade de 2 x 10
5
clulas/mL em placas de 24 poos, em volume de 1 mL. Aps dois dias
deu-se incio ao experimento, quando a densidade de clulas devia estar em torno de 8 x 10
5

clulas/mL. Os poos foram marcados considerando as amostras os controles positivos ,
que receberam apenas estmulo e os negativos , que no receberam nenhum o estmulo. As
amostras foram incubadas por uma hora a 37 C com 5 % CO
2
na presena das substncias-
teste em diferentes concentraes. Aps este perodo, as amostras receberam 2 L (5 g/mL
ou 2000 U/mL) de TNF- e foram incubadas por mais trs horas.
2.2.4.1.2. Extrato de protenas totais
O extrato de protenas foi preparado conforme procedimento a seguir:
- Homogeneizar as clulas j estimuladas com pipeta;
- Transferir as clulas para tubos tipo Eppendorf, acondicionados no gelo;
- Adicionar 1 mL de tampo PBS gelado e homogeneizar;
- Centifugar por 3 min a 13.000 rpm (1.000 g) e 4 C;
- Ressuspender as clulas com 150 L de tampo de lise do kit Luciferase Reporter
Gene Assay System;
- Deixas em repouso por 15 min a temperatura ambiente para que ocorra a lise de
membranas;
- Centrifugar por 3 min a 13.000 rpm (1.000 g) e 4 C;
- Usar o sobrenadante para o ensaio com luciferina e determinao de protenas
totais.

2.2.4.1.3. Anlise da produo de luciferase
A produo da enzima luciferase foi determinada por meio do kit Luciferase Reporter
Gene Assay System. Para isso, 50 L do extrato de protenas foram pipetados em microplaca
96 poos-Lumitrac-Platte com fundo branco. O substrato luciferina foi preparado
adicionando-se 10 mL do tampo de reao do kit com o p do substrato. O substrato foi
fornecido ao aparelho luminmetro, o qual injetou automaticamente 100 L do mesmo em
cada amostra e a leitura foi feita aps 0,5 segundos com medidas de 3 segundos para emisso
de luz. O fton liberado durante a reao de transformao da luciferina em oxiluciferina foi
detectado e integrado pelo aparelho.

2.2.4.1.4. Determinao de protenas totais
A atividade da enzima foi normalizada pelo total de protenas de cada amostra,
determinado com auxlio do kit Quick Start
FM
Bradford Protein Assay. Foram pipetados 5 L
de extrato de protenas e de padro BSA em diferentes concentraes em microplaca de 96
poos. cada amostra ou padro foram adicionados 250 L do reagente Dye do kit. A
microplaca foi deixada em repouso por 30 min a temperatura ambiente e logo aps a absoro
a 595 nm foi medida em Microplate Reader.
2.2.4.2. Atividade enzimtica da luciferase
A enzima QuantiLum Recombinant Luciferase (14,6 mg/mL), parte do kit Luciferase
Reporter Gene Assay System, foi dissolvida em tampo de lise com BSA (1 mg/mL) para que
a concentrao final de 1 g luciferase/15 L tampo. A luciferase foi ento incubada por
uma hora a temperatura ambiente com as substncias-teste, sendo que 0,5 L de soluo a 10
mM origina uma concentrao final de 100 M. Logo aps, 15 L da soluo de reao em
microplaca de 96 poos-Lumitrac-Platte com fundo branco receberam 50 L da soluo de
substrato sob injeo automtica do luminmetro e a leitura foi efetuada.

2.2.5. IL-8
A interleucina-8 tambm produzida em decorrncia da transcrio induzida pelo
fator de transcrio NF-B. A diferena para com o ensaio anterior est no fato da IL-8 ser
uma substncia endgena. J a luciferase produzida nas clulas estudadas atravs de um
sistema artificialmente construdo. As clulas empregadas para este ensaio so as HeLa 229.
A produo de IL-8 aps incubao das clulas com substncias-teste e estimulao
com TNF- pode ser quantificada por meio de ELISA (Fig. F12). O princpio da tcnica
consistiu basicamente em fixar um anticorpo em uma microplaca adsorvente, bloquear os
pontos adsorventes remanescentes com protenas inespecficas, fornecer um antgeno ao
anticorpo, acrescentar um outro anticorpo marcado com uma protena, formando um
sanduche, fornecer ento uma enzima que se liga protena marcadora e a seguir um
substrato para a enzima. A reao de degradao do substrato leva formao de um produto
colorido, cuja intensidade de absoro facilmente medida em espectrofotmetro. Assim, as
protenas inespecficas so as presentes no soro fetal bovino, o anticorpo inicial o anti-IL-8,
o antgeno a IL-8 produzida pelas clulas, o segundo anticorpo o anti-IL-8 marcado com a
protena biotina, a enzima a streptavidin-biotin alcalino fosfatase e o substrato o p-
nitrofenilfosfato, cuja degradao gera produto amarelo p-nitrofenila.

Figura F12. Apresentao esquemtica de ELISA (http://www.activemotif.com/).

2.2.5.1. Solues
- Tampo PBS 10x (item 2.2.2.5);
- Tampo de lavagem: 1 L tampo PBS 1x, 0,5 mL Tween-20 (0,05 %);
- Soluo de ligao: 0,1 M Na
2
HPO
4
, pH 9,0;
- Tampo de bloqueio: 18 mL de tampo PBS 1x, 2 mL de FCS (10 %) preparar
no momento da utilizao;
- Tampo de bloqueio/Tween-20: 20 mL tampo bloqueio, 10 L Tween-20 (0,05
%);
- Tampo para substrato ELISA:
- 100 mg NaN
3
;
- 400 mg MgCl
2
*6H
2
O;
- 48,5 mL dietanolamina;
- pH 9,8 com HCl.

2.2.5.2. ELISA
A processo requer trs dias de trabalho, como apresentado a seguir.

1
o
. Dia
- Plaquear as clulas HeLa 229 na densidade de 25 x 10
3
clulas/mL em placas de
24 poos no volume de 1 mL;
- Adicionar 30 L de mouse Anti-IL-8-Antibody a 5 mL da soluo de ligao;
- Pipetar 50 L soluo acima/poo da microplaca de 96 poos - Immunosorbant-
Platte;
- Cobrir a placa com parafina e incubar por uma noite a 4 C.

2
o
. Dia
- Trocar o meio de cultura das clulas por 1 mL de meio novo;
- Incubar clulas por 1 hora a 37 C com 5 % CO
2
na presena das substncias-teste;
- Estimular clulas por 6 horas com 2,4 L (6 g/mL ou 2.400 U/mL) de TNF- ou
por 24 horas com 0,8 L (2 g/mL ou 800 U/mL) de TNF-;
- Despejar o sobrenadante da microplaca;
- Lavar a microplaca quatro vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Bloquear com 200 L tampo de bloqueio/poo por 2 horas a temperatura
ambiente;
- Lavar trs vezes com 200 L tampo de lavagem/poo;
- Adicionar 100 L/poo de sobrenadante da cultura de clulas e de padres de IL-8:
- Padro IL-8 recombinante a 50 g/L (estoque):
- 1 L soluo estoque + 1.249 L de meio RPMI 1640 (a) - 1 g/25
L;
- 25 L de a + 1.225 L de meio (b) 800 g/mL;
- 500 L de b + 500 L de meio (c) 400 g/mL;
- 500 L de c + 500 L de meio (d) 200 g/mL;
- 500 L de d + 500 L de meio (e) 100 g/mL;
- 500 L de e + 500 L de meio (f) 50 g/mL;
- 500 L de f + 500 L de meio (g) 25 g/mL;
- 500 L de g + 500 L de meio (h) 12,5 g/mL;
- 500 L de meio (i) 0 g/mL.

3
o
. Dia
- Adicionar 5 L biotinylated mouse Anti-IL-8-Antibody a 10 mL de tampo de
bloqueio/Tween-20 (0,05 %);
- Pipetar 100 L da soluo acima/poo;
- Incubar por 1 hora a temperatura ambiente;
- Enquanto isso, preparar conjugado:
- 491 L de PBS 1x;
- 4,5 L de StreptavidinA (soluo A);
- 4,5 L de AP biotinilada (soluo B);
- Misturar em Vortex, incubar por 30 min a temperatura ambiente;
- Adicionar a estes 500 L 24,5 mL PBS 1x;
- Pipetar 50 L conjugado/poo;
- Incubar por 1 h a 37 C;
- Minutos antes solubilizar um comprimido de PNPP em 5 mL tampo substrato
ELISA e incubar por 5 min a 37 C;
- Pipetar 50 L de soluo de substrato/poo;
- Incubar por 20 min a 37 C no escuro;
- Medir a intensidade de absoro do produto amarelo a 405 nm em Microplate
Reader.

2.2.6. Citotoxicidade
Procedimento geral:
- Aps estimulao das clulas, adicionar 0,5 mL MTT;
- Incubar por 3 h a 37 C em estufa com CO
2
;
- Centrifugar amostras a 13.000 rpm (1000 g);
- Dissolver o precipitado formazan, produto colorido resultante da metabolizao do
MTT, por clulas vivas com 100 L DMF/SDS por 16 h a 37 C;
- Misturar e transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir a absoro a 595 nm em Microplate Reader.

2.3. Ensaios relacionados enzima elastase
A elastase secretada por neutrfilos, clulas importantes do complexo sistema
sangneo, portanto necessrio isol-las. As clulas isoladas so tratadas ento com
citocalasina B, que promovem o relaxamento do citoesqueleto, favorecendo a exocitose. A
secreo ocorre de fato aps a estimulao das clulas, e a quantidade secretada pode ser
medida por meio de uma reao enzimtica, cujo produto colorido. Esta reao ocorre entre
a enzima elastase e um substrato apropriado, SAAVNA, e o produto amarelo a p-
nitroanilina.

2.3.1. Reagentes, materiais e aparelhos
Nas tabelas abaixo so apresentados todos os reagentes, anticorpos, enzimas, kits,
materiais e aparelhos utilizados para realizao de todos os ensaios relacionados enzima
elastase e seus respectivos fornecedores.

Tabela F5. Reagentes utilizados nos ensaios realizados com elastase.
Reagentes Marca
cido ctrico Sigma
BSA fraction V (albumina srica bovina) Roth e Sigma
CaCl
2
Merck
Citocalasina B Sigma
Dextran T500 Amersham Pharmacia Biotech
DMF (N,N-dimetilformamida) Roth
DMSO (dimetilsulfxido) Roth
EtOH Roth
Ficoll-Paque
TM
Plus Amersham Pharmacia Biotech
fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina) Bachem
Giemsa Stain Fluka
Heparina-Na
+
Braun
HEPES (cido N-(2-hidrxietil)-piperazina-N-2-etanossulfnico) Roche Diagnostics
KCl Roth
KH
2
PO
4
Merck
LPS (lipopolissacardeo) Sigma
MeOH Roth
MgCl
2
Merck
MTT ((dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolio) Roth
Na
2
HPO
4
Merck
NaCl Roth
PAF (fator de agregao plaquetria) Bachem
PMA (12-miristato-13-acetato de forbol) Calbiochem
SAAVNA (Suc-Ala-Ala-Val-pNA) Bachem
Sacarose Acar comum
SB203580 Sigma
SDS (dodecil sulfato de sdio) Boehringer Mannheim
U0126 Sigma

Tabela F6. Materiais utilizados nos ensaios realizados com elastase.
Materiais Marca
Agulha longa de seringa Braun
Balo volumtrico
Estantes
Lminas e lamnulas
Microplaca de 96 poos Greiner
Pipeta Multistepper Brand
Pipetas automticas Eppendorf
Pipetas de Pasteur Greiner
Ponteiras para pipeta Multistepper Brand
Provetas
Relgio
Seringas de 10 mL S-Monovette Li-Heparin e K-EDTA Sarstedt
Tubos de 15 e 50 mL Falcon
Tubos de reao de 1,5 mL tipo Eppendorf Greiner

Tabela F7. Aparelhos utilizados nos ensaios realizados com elastase.
Aparelhos Marca
Balana analtica Mettler Toledo
Banho-maria com agitao GFL
Bomba de vcuo Roth
Centrfuga Rotina 35 R Hettich AG
Estufa Thermo Forma Thermo Forma Lifescience
Microcentrfuga Biofuge Fresco Heraeus
Microcentrfuga Eppendorf 5417R Eppendorf
Microplate Reader Model 550 Bio-Rad
Microscpio Modelo Micro-Optic Nosch Zeiss
pH-Metro CG 825 Schott
Vortexer Genie 2 Scientific Industries

2.3.2. Preparao de solues:
Algumas solues foram preparadas e armazenadas como solues estoque e outras
foram preparadas no mesmo dia do ensaio, denominadas solues frescas.
2.3.2.1. Solues estoque
- NaCl: 0,9 % (0,9 g em 100 mL gua Millipore
)
- Tampo PBS com/sem Ca
2+
/Mg
2+
:
- Soluo estoque PBS (concentrado 10 vezes):
80 g de NaCl (1,37 mM)
2 g de KCl (27 mM)
7,65 g de Na
2
HPO
4
* 2H
2
O (43 mM)
2 g de KH
2
PO
4
(14 mM)
1 L de gua Millipore

- Tampo PBS: diluir uma parte da soluo estoque PBS em nove
partes de gua Millipore

- Tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
: diluir uma parte da soluo estoque
PBS em nove partes de gua Millipore

e adicionar:
0,9 mM CaCl
2
: 66,25 mg/500 mL
0,49 mM MgCl
2
: 49,75 mg/500 mL
- SAAVNA: 300 mM em DMSO (250 mg SAAVNA em 1735 L DMSO,
aliquotar)
- PAF: 10
2
M em EtOH (5,24 mg em 1 mL EtOH, aliquotar)*
- cido ctrico: 2 % (2 g em 100 mL de gua Millipore

)
- Citocalasina B: solubilizar 0,965 mg em 200 L DMSO e diluir com 800 L gua
Millipore

- MTT: 5 mg/mL (5 mg MTT em 1 mL de tampo PBS)
- DMF/SDS: 10 % SDS / 50 % DMF (5 g SDS em 25 mL tampo PBS, adicionar 25
mL DMF)

Variaes testadas: *fMLP: 10
2
M em EtOH (4,38 mg em 1 mL de EtOH, aliquotar).
PMA: 1 mg/mL em DMSO
LPS: 5 g/L

2.3.2.2. Solues frescas
- Dextran: 10 % (0,75 g Dextran com 7,5 g NaCl 0,9 %)
- Tampo albumina: 10 % (45 mg BSA em 45 mL de tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
)*
- Colocar recipiente com gua Millipore
no gelo
- SAAVNA: 45 mg de BSA em 45 mL tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
(medido no
tubo Falcon), adicionar 154 L soluo estoque SAAVNA
- Tampo HEPES-sacarose:
- 10,954 g de sacarose em 80 mL de gua Millipore

- 250 L HEPES 1M
- pH 7,4
- q.s.p. 100 mL em balo volumtrico, manter a 4 C.
- PAF**:
- PAF 1: 25 L de soluo estoque PAF com 2475 L tampo
albumina
- PAF 2: 50 L de soluo 1 com 4950 L tampo albumina
- Solues de substncias-teste:
- Soluo estoque: 100 mM (massa [mg]/massa molecular* 10)* 100
= volume DMSO [L] e diluir para 50, 20, 10, 5, 2, 1 e 0,5 mM

Variaes testadas: * Roth foi usada normalmente, Sigma s para comparao
** fMLP: preparar solues 1 e 2 como acima
PMA: 100 g/mL (diluir uma parte da soluo estoque em 999 partes de tampo
albumina)
LPS: diluir 0,48 L soluo estoque em 4999 L de tampo albumina

2.3.3. Isolamento dos neutrfilos
Os neutrfilos foram isolados em trs etapas, conforme os procedimentos a seguir.
2.3.3.1. Sedimentao dos eritrcitos
- Pipetar 100 L de heparina em cada tubo Falcon*;
- Coletar duas seringas e meia de sangue de dois doadores voluntrios (25 mL
sangue de cada), verter imediatamente sobre a heparina*;
- Adicionar 3 mL de Dextran em cada tubo;
- Misturar lenta e cuidadosamente;
- Deixar em repouso por 40 min para a sedimentao dos eritrcitos e separao de
cerca de 15 mL de plasma na fase superior.

Variaes testadas: *seringa simples ou S-Monovette com Li-Heparin ou K-EDTA
2.3.3.2. Separao dos neutrfilos
- Transferir o sobrenadante com auxlio de pipeta de 1 mL para outro tubo Falcon;
- Completar o volume para 40 mL com tampo PBS;
- Com auxlio de agulha longa de seringa adicionar 10 mL Ficoll-Paque
TM
Plus na
parte inferior do tubo;
- Centrifugar por 30 min a 1.500 rpm (500g) e 20 C*;
- Programar banho-maria para 37 C.

Variaes testadas: *centrifugao a 4 C

2.3.3.3. Lise dos eritrcitos remanescentes
- Programar a centrfuga para 4 C;
- Desprezar o sobrenadante dos dois tubos Falcon por aspirao;
- Adicionar em proveta 44 mL tampo HEPES-sacarose*;
- Coletar em seringa 5,5 mL gua Millipore

gelada;
- Programar 23 segundos no relgio e aos 21 segundos adicionar a gua gelada ao
precipitado de clulas, solubiliz-lo cuidadosamente;
- Aps 21 segundos adicionar o tampo HEPES-sacarose*;
- Centrifugar por 10 min a 1.500 rpm (500 g) e 4 C;
- Suspender as clulas em 5,5 mL de tampo PBS com Ca
2+
/Mg
2+
;

- Misturar cuidadosamente as suspenses de clulas dos dois doadores (10-30 x 10
6

clulas/mL).

Variaes testadas: *a) tampo PBS (hipotnico), b) tampo PBS duas vezes mais concentrado (isotnico), c)
NaCl
1,8 % e tampo PBS (isotnico), d) tampo HEPES-sacarose (hipertnico) e repouso por
0,
10, 30 e 60 min a 4 C e temperatura ambiente.

2.3.4. Secreo da elastase
Neste ensaio, foi possvel avaliar o efeito das substncias-teste sobre a secreo da
elastase. Porm o efeito de inibio relacionado apenas secreo s pde ser confirmado
aps a submisso da respectiva substncia-teste ao ensaio com a enzima isolada (item 2.3.5).
Procedimento:
- Deixar a suspenso de clulas em repouso por 30 min em banho-maria a 37 C*;
- Em tubo Falcon (nmero de amostras mais um): 2,5 L citocalasina B** (5 g/mL
concentrao final), 1 L substncia-teste*** ou DMSO****, 375 L SAAVNA
(0,8 mM de concentrao final);
- Distribuir 378,5 L em cada tubo tipo Eppendorf *****;
- Adicionar 50 L da suspenso de clulas;
- Incubar por 5 min a 37 C;
- Adicionar 50 L de estimulador PAF (0,1 mM de concentrao final) nas amostras
e controles positivos ou tampo albumina nos controles negativos******;
- Incubar por 20 min a 37 C*******;
- Adicionar 125 L cido ctrico (5,2 mg/mL concentrao final);
- Centrifugar por 5 min a 2.000 rpm (500 g) e 20 C;
- Transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir absoro de p-nitroanilina (pNA), produto colorido amarelo resultante da
quebra de SAAVNA por elastase, a 405 nm em Microplate Reader.

Variaes testadas: *0 (mtodo A), 30 (mtodo B) e 60 min de repouso das clulas
**sem citocalasina B
***efeitos dos inibidores clssicos SB203580 e U0126
****curva de efeito do DMSO
*****experimento realizado em microplaca de 96 poos
******efeitos de fMLP (0,1 mM), PMA (0,1 g/mL) e LPS (1 g/mL)
*******curva de tempo X resposta

2.3.5. Atividade enzimtica da elastase
Neste ensaio, a elastase foi isolada aps estimulao dos neutrfilos. A elastase isolada
foi ento colocada em contato com as substncias-teste e seu substrato, para avaliar o efeito
das mesmas diretamente sobre atividade enzimtica de elastase. Procedimento:
- Incubar suspenso celular com citocalasina B (5 g/mL concentrao final) em
banho-maria por 5 min a 37 C;
- Adicionar PAF (0,1 mM concentrao final);
- Incubar por 20 min a 37 C;
- Centrifugar a suspenso a 500 g por 10 min e temperatura ambiente;
- Distribuir pores de 50 L do sobrenadante, que contm elastase, nas amostras
contendo 375 L SAAVNA (0,8 mM concentrao final) e 1 L substncias-teste
ou DMSO em tubos tipo Eppendorf e incubar por 30 min a 37 C;
- Adicionar 125 L de cido ctrico (5,2 mg/mL concentrao final);
- Transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir absoro de pNA, produto colorido amarelo resultante da quebra de
SAAVNA por elastase, a 405 nm em Microplate Reader.

2.3.6. Citotoxicidade
A citotoxicidade era inicialmente determinada por colorao das clulas com Trypan
blue e contagem de clulas mortas sob microscpio; entretanto, em funo do mtodo ser
demorado, trabalhoso e pouco preciso, optou-se pelo mtodo com Thiazolblau (MTT), que
menos trabalhoso e mais preciso.
Procedimento:
- Antes da adio de cido ctrico, adicionar 1mL MTT (3,4 mg/mL concentrao
final);
- Incubar por 3 h a 37 C em estufa com CO
2
;
- Centrifugar amostras a 3200 g por 10 min a 20 C;
- Dissolver o precipitado formazan, produto colorido resultante da metabolizao do
MTT por clulas vivas, com 100 L DMF/SDS por 16 h a 37 C;
- Misturar e transferir 100 L do sobrenadante para microplaca de 96 poos;
- Medir absoro a 595 nm em Microplate Reader.

2.3.7. Contagem de eosinfilos
Os eosinfilos secretam PAF e outras molculas que podem estimular os neutrfilos.
Por isso, a estimulao basal pode ser exacerbada em amostras que possuam um nmero
maior de eosinfilos do que o normal. O nmero de eosinfilos aumenta especialmente em
casos de alergia. Por isso, realizou-se a anamnsia dos voluntrios doadores de sangue para
evitar este fenmeno.
Procedimento para contagem de eosinfilos:
- Gotejar 5 L da suspenso de clulas em lmina, secar;
- Descolorir com MeOH por 10 min; secar;
- Colorir com soluo de Pappenheim (May-Grnwald, Giemsa) por 45 min;
- Lavar abundantemente em gua; secar;
- Gotejar gua, cobrir com lamnula, gotejar leo;
- Realizar a contagem em microscpio (objetiva 10 x 100).
A contagem foi realizada escolhendo-se no mnimo oito campos nas direes
horizontal, vertical e inclinada. O resultado foi dado em porcentagem relativa ao nmero de
clulas totais.

2.3.8. Anlise estatstica
Todas as anlises foram realizadas pelo menos trs vezes com triplicatas para cada
amostra e controle. Os graus de inibio foram calculados em porcentagem relativa aos
controles. As anlises estatsticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 4
Version 4.02. Os resultados so expressos considerando-se o desvio padro da mdia ( SD) e
significncia. As anlises estatsticas de significncia foram efetuadas via ANOVA com o
software Origin Version 7.0.

3. RESULTADOS E DISCUSSES
3.1. NF-B
O fator de transcrio NF-B um mediador central da resposta imune e inflamatria.
NF-B constitudo pelas subunidades p50 e p65 na forma de heterodmero inativo no
citoplasma, formando um complexo com a subunidade inibidora IB. Infeces e mediadores
da inflamao levam a uma ativao do complexo IB quinase, que causa a fosforilao de
IB. Esta subunidade sofre ubiquitinao e ento destruda por uma proteasoma. O NF-B
livre migra para o ncleo, liga-se ao DNA e promove a transcrio de inmeros genes de
mediadores da inflamao, como citocinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 e TNF-), protenas da fase
aguda, molculas de clulas de adeso, cicloxigenase-II e xido ntrico sintase (Barnes e
Karin, 1997; Chen e Ghosh, 1999). Para que isto ocorra, preciso que haja modificao ps-
translacional, modificao da cromatina e modificao ps-transcricional. O processo de
transcrio complexo envolvendo a iniciao, elongao e terminao.

3.1.1. Efeito de LSTs na ligao de NF-B ao DNA
O
O
O
O
O
O
O
O
O

2
O
O
O
O
O
OH

11
O
OH
HO
H
OH
O
O
O

12
Figura F13. LSTs testadas quanto ligao de NF-B ao DNA.

No presente trabalho foram testados os efeitos das LSTs 2, 11 e 12 em clulas Jurkat T
e Raw 264.7. As clulas foram incubadas com diferentes concentraes das LSTs. As clulas
Jurkat T foram estimuladas com TNF- e as clulas Raw 264.7 com LPS. O extrato de
protenas foi preparado e analisado por meio de EMSA (Fig. F14). O fator de transcrio NF-
B ligado ao DNA radiativamente marcado migra como a primeira banda superior no gel de
eletroforese. Em trabalho anterior esta banda foi identificada como sendo do heterodmero
p50/65 por meio de comparao com anticorpo (Pahl e Baeuerle, 1995). A segunda banda

2 11 12
M: 2 , 5

5

10

20

10

20

50

100

5

10

20

50
TNF - :

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + +

+

*

#

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 13

14

2 11 12
M: 2,5 5 10 20 10 20 50 100 5 1 0 20 50
TNF-:

-

+ + + +

+ +

+

+

+

+

+

+

+
*

?
#
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

devido ao complexo de DNA marcado com protenas inespecficas e a terceira constitui
apenas o DNA marcado, que migra mais rapidamente pelo gel.
A concentrao de LST necessria para inibir a ligao de NF-B ao DNA em clulas
Raw 264.7 maior do que em clulas Jurkat T (Tab. F8, Fig. F14). O grau de citotoxicidade
foi avaliado em experimento com MTT, porm tambm visvel na segunda banda do gel. Se
esta banda menor do que as bandas adjacentes, devido menor quantidade de protenas
especficas, indicando que havia um nmero menor de clulas viveis. A LST 2 citotxica
para clulas Raw 264.7 a 20 M, mas no para clulas Jurkat T. J as LSTs 11 e 12 no so
citotxicas para ambas as clulas.

Jurkat T Raw 264.7

Figura F14. EMSA mostrando o efeito das LSTs 2, 11 e 12 na ligao de NF-B ao DNA (oligonucleotdeo-
32
P) em clulas Jurkat T e Raw 264.7. As duas primeiras colunas representam os controles negativo (sem
TNF- ou LPS) e positivo (com TNF- ou LPS). Da terceira coluna em diante as clulas foram incubadas
com as LSTs por 1 h e estimuladas com TNF- ou LPS por 1 h. *NF-B + DNA radiativo; protenas
inespecficas + DNA radioativo; # DNA radiativo.

As LSTs 2 e 12 apresentam potente atividade inibidora. A LST 1, enidrina, inibe a
ativao de NF-B com um IC
100
de 10 M em clulas Jurkat T (Garcia-Pieres, 2003). A
LST 2 consideravelmente mais ativa (IC
100
= 2,5 M) do que a LST 1, apesar das estruturas
diferirem apenas quanto presena de um grupo epxido (1) e uma insaturao entre C4 e C5
(2). Este experimento indica que a ligao dupla nesta posio deve ser importante para
aumentar a atividade.
A diferena de reatividade entre as LST 11 e 12 talvez se deva ao fato de 12 possuir
um ster do tipo ,-insaturado, considerado um grupo funcional importante para a
alquilao. As LSTs bifuncionais, com dois sistemas ,-insaturados, so mais ativas que as
monofuncionais quanto inibio de NF-B. A LSTs bifuncionais apresentam portanto dois
sistemas que podem sofrer adio do tipo Michael, enquanto as monofuncionais podem sofrer
esta adio em apenas um ponto. Embora o sistema conjugado presente na LST 11 parece no
contribuir para a atividade.

Tabela F8. Valores de IC
100
para a inibio da ativao do NF-B pelas LSTs 1, 2, 11 e 12.
LST IC
100
= M
Jurkat T Raw 264.7
1 10* -
2 2,5 5
11 10 20
12 5 10
*(Siedle et al., 2004)

O mecanismo de ao pelo qual as LSTs inibem o fator de transcrio NF-B j foi
elucidado (Garcia-Pieres, 2003). O aminocido cistena 38 da subunidade p65 de NF-B,
mas no da subunidade p50, alquilado pelas LSTs via adio do tipo Michael, assim
inibindo o NF-B. A alquilao d-se apenas no aminocido cistena, porm h indcios de
que in vivo tambm possa ocorrer nos aminocidos arginina e lisina. Uma vez alquilado, o
NF-B no pode se ligar ao DNA. Esta alquilao independente de o NF-B estar livre ou
ligado ao IB. Foi tambm constatado que as LSTs inibem a degradao de IB-, mas em
pequeno grau. O tipo de mecanismo est relacionado com o tipo celular (Garcia-Pieres,
2003; Garcia-Pieres et al., 2004; Rngeler et al., 1999).

3.1.2. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na ligao de NF-B ao DNA
importante ressaltar que estes so os primeiros ensaios realizados com alcalides
(Fig. F15) e o fator de transcrio NF-B por meio de EMSA. Portanto ainda no existem
estudos com relao ao seu mecanismo de ao, no sendo pertinente este tipo de discusso
aqui. Os ensaios foram realizados com as clulas HeLa 229 e 293 a ttulo de comparao com
os resultados obtidos com relao produo de IL-8 e luciferase.. Apesar do comportamento
de LSTs com relao ligao de NF-B ao DNA ser teoricamente semelhante em diferentes
linhagens celulares, optou-se por trabalhar com este grupo de clulas em funo de ainda no
haver informaes a respeito deste aspecto com relao aos alcalides.

N
O
O
HO
O
H
19
N
N
O
O
20
N
N
O
HO
O
O
21
N
O
H
N
O
H
22
Figura F15. Estruturas dos alcalides de I. tinctoria testados nos ensaios biolgicos com o NF-B.

O alcalide indlico 19 (indolinona) nas concentraes de 150 e 50 M inibe a ligao
do NF-B ao DNA em clulas HeLa 229 e em clulas 293 (Fig. F16). No obstante muitos
dos alcalides sejam citotxicos, importante observar que este alcalide no , mesmo na
concentrao de 200 M.
A triptantrina, 20, um potente inibidor da cicloxigenase-II e da lipoxigenase, enzimas
importantes no processo inflamatrio e diretamente relacionadas ao fator de transcrio NF-

2 0 21 22 19
M: 50 100 150 10 100 1 50 50 100 150 50 100 150
TNF - : - + + + + + + + + + + + + +

?

?
#
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

*

20 21 22 19
M:
50 100150 10 100 1 50 50 100 150 50 100 150
TNF-: - + + + + + + + + + + + + +
?
?
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
#
*
B, inibe a ativao do NF-B em clulas 293, mas induz a uma leve ativao do mesmo em
clulas HeLa 229 (Fig. F16). Tambm no apresentou citotoxicidade, mesmo na concentrao
de 150 M.
J a isaindigotona (21), um alcalide quinazolnico, tende a inibir a ativao de NF-B
em clulas HeLa 229. J a indirubina (22), alcalide indlico, inibe tal ativao. Entretanto
no foi possvel concluir qual a sua ao nas clulas 293, uma vez que a oscilao dos
resultados foi grande (Fig. F16). Em todos os casos foi possvel comprovar que estes
alcalides no apresentam citotoxicidade.

HeLa 229 293

Figura F16. EMSA mostrando o efeito dos alcalides 20, 21, 22 e 19 na ligao do NF-B ao DNA
(oligonucleotdeo-
32
P) em clulas HeLa 229 e 293. As duas primeiras colunas representam os controles
negativo (sem TNF-) e positivo (com TNF-). Da coluna 3 em diante as clulas foram incubadas com os
alcalides por 1 h e estimuladas com TNF- por 1 h. *NF-B + DNA radiativo; protenas inespecficas +
DNA radiativo; #DNA radiativo.

y = 0.0004x + 0.4599
R
2
= 0.9457
0.000
0.300
0.600
0.900
1.200
1.500
0 1000 2000 3000
A
U
3.1.3. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na produo e atividade de
luciferase
Enzimas-reprter como a cloranfenicol acetiltransferase, luciferase e -galactosidase
so freqentemente usadas para estudos de atividade, regulao e expresso gnica em clulas
eucariticas (Lindenmeyer, 2004). A luciferase tem sido muito utilizada em biologia
molecular e celular por sua reao ser sensvel e relativamente simples. Vale ressaltar que, no
caso das LSTs, o uso deste mtodo no relevante porque estas substncias inibem a
atividade enzimtica de luciferase, no sendo possvel ento obter informaes a respeito da
sua influncia quanto transcrio gnica induzida por NF-B. Neste caso, o intuito
observar se os alcalides afetam este complexo processo de transcrio gnica.
Foram empregadas clulas 293 estavelmente transfeccionadas com plasmdeo
contendo gene para luciferase, promotor para NF-B e gene para resistncia ao antibitico
zeocina. As clulas foram tratadas com as substncias-teste, estimuladas para ativao do NF-
B com TNF- e ento a produo de luciferase foi determinada por meio do kit com
substrato luciferina. Uma vez que o substrato degradado oxiluciferina, ocorre liberao de
luz, que detectada por um luminmetro.
Os resultados foram normalizados com o nmero de protenas totais, determinado para
cada amostra com base na curva de calibrao do padro de BSA (Fig. F17)

Figura F17. Curva de calibrao do padro de BSA.

A indolinona (19) tambm inibe a produo de luciferase em clulas 293 estavelmente
transfeccionadas (IC
50
28,86 5,65M; Fig. F18). Este alcalide no inibe a atividade
enzimtica da luciferase, o que indica que sua ao est realmente relacionada inibio da
0 50 100 150 200
0
20
40
60
80
100
Indolinon (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

p
r
o
d
u
o

d
e

l
u
c
i
f
e
r
a
s
e

(
%
)
liberao de NF-B ou inibio da sua ligao ao DNA. Porm, no caso destes efeitos serem
reversveis, o que pode ocorrer ainda que a indolinona iniba a maquinaria de transcrio.

Figura F18. Efeito da indolinona (19) na produo de luciferase por clulas 293 estavelmente
transfeccionadas. As clulas foram incubadas com indolinona por 1 h e estimuladas com TNF- por 1 h a
37 C e CO
2
. A produo de luciferase foi medida por reao luminescente.

Os resultados relativos produo de luciferase so insuficientes para proposies
acerca do efeito da triptantrina (20). Foi possvel apenas observar que a substncia no inibe a
atividade enzimtica.
Os alcalides isaindigotona (21) e indirubina (22) no apresentaram efeito sobre a
produo de luciferase. Os resultados obtidos no permitem concluir que estes causem
inibio ou ativao da sua produo, corroborando com os resultados obtidos no experimento
com EMSA, em que as substncias no foram capazes de inibir NF-B em clulas 293. Estes
alcalides tambm no tm efeito significativo sobre a atividade enzimtica de luciferase.
Nenhum dos alcalides apresentou citotoxicidade para as clulas 293 estavelmente
transfeccionadas quando submetidos ao ensaio com MTT.

N
O
O
HO
O
H
19
3.1.4. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na produo de IL-8
Uma vez que o NF-B promove a transcrio de muitas citocinas, interessante
observar se h realmente reduo na produo das mesmas no caso de inibio de NF-B, o
que permite tambm avanar no estudo do mecanismo de ao das substncias-teste. Uma das
citocinas produzidas em decorrncia da ativao do fator de transcrio a IL-8, que por sua
vez ativa vrias clulas, em especial os neutrfilos, no intuito de desencadear o processo
inflamatrio e fagocitrio. As LSTs inibem a produo de IL-8, uma vez que inibem o NF-B
de forma irreversvel. Como foi possvel provar que alguns dos alcalides so capazes de
inibir a ligao de NF-B ao DNA, resolveu-se testar qual a extenso deste efeito no processo
de transcrio. No caso de inibio reversvel do fator de transcrio, a produo das
citocinas, mais especificamente de IL-8, poderia no ser afetada.
Por meio do mtodo ELISA foi possvel determinar o grau de inibio da produo de
IL-8. As clulas foram incubadas com as substncias-teste, ento estimuladas com TNF-, e o
sobrenadante contendo IL-8 exocitada foi analisado em ELISA. O tempo de estimulao das
clulas foi avaliado no intuito de diminuir o tempo de exposio s substncias-teste, o que
poderia eventualmente aumentar os riscos de citotoxicidade, e ainda reduzir o tempo de
anlise, uma vez que o tempo de exposio original era de 24 h. Portanto, foi construda uma
curva de tempo versus concentrao de IL-8 (Fig. F19) para avaliar qual o tempo e a
concentrao de TNF- mais apropriados para obteno da mesma resposta. Quanto maior o
tempo de estimulao, menor a concentrao de TNF- necessria; por exemplo, para 24 h
so necessrios 2 g e para quatro horas de 8 a 10 g de TNF-. Os resultados levaram a se
fazer a opo por estimular as clulas por apenas 6 h, utilizando para tal 6 g de TNF- por
amostra.
O experimento foi realizado apenas com amostras controle, sendo que o efeito
citotxico de cada concentrao de TNF- foi concomitantemente testado via MTT. Porm,
mesmo 10 g de TNF-, quantidade usada para quatro horas de estimulao, no
apresentaram efeitos citotxicos.
A mudana no tempo de estimulao foi testada para a dexametasona, um corticide
conhecido por inibir a produo de IL-8 quando as clulas so estimuladas por 24 h com 2 g
de TNF-, sendo que a alterao no tempo no provocou alterao significativa no resultado.
Esse procedimento tambm foi realizado com os alcalides e os resultados foram comparados,
no havendo diferenas significativas.

0
1000
2000
3000
4000
4 h 6 h 8 h 24 h
horas
I
L
-
8

(
p
g
/
m
L
)
2,4,6,8 ng TNF-
2,6,8,10 ng TNF-
y = 0 .0 0 0 5 x - 0 .0 4 7 4
R
2
= 0 . 9 9 4 7
-0 .1 0 0
0 .0 0 0
0 .1 0 0
0 .2 0 0
0 .3 0 0
0 .4 0 0
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0
Pa dr o de I L -8 ( pg/ mL )
A
U

Figura F19. Curva de tempo versus concentrao de IL-8 produzida aps estimulao com diferentes
concentraes de TNF-. As amostras foram estimulados por 4, 6, 8 e 24 h com 8 ou 10, 6 ou 8, 4 ou 6 e 2
g de TNF-, respectivamente para cada tempo. A produo de IL-8 foi determinada por ELISA.

A quantidade de IL-8 produzida foi determinada com base em curva de calibrao para
o padro de IL-8 humana recombinante (Fig. F20), realizada em paralelo a todos os
experimentos.

Figura F20. Curva de calibrao do padro de IL-8 humana recombinante. As solues-padro foram
submetidas ao mtodo ELISA.

A indolinon (19) tambm inibe a produo de IL-8 em clulas HeLa 229 (IC
50
13,80
5,46 M, Fig. F21). Este resultado confirma a ao do alcalide, que impede a liberao do
NF-B, a ligao do fator ao DNA ou o complexo processo da transcrio.
0 10 20 30 40 50 60
0
25
50
75
100
Indolinon (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

p
r
o
d
u
o

d
e

I
L
-
8

(
%
)

Figura F21. Efeito da indolinona (19) na produo de IL-8 por clulas HeLa 229. As clulas foram
incubadas com indolinon por 1 h e estimuladas com 6 g de TNF- por 6 h a 37 C e CO
2
. A produo de
IL-8 foi medida por reao colorimtrica com o mtodo ELISA.

Surpreendentemente, contrastando com resultado acima descrito, o alcalide
triptantrina (20), por sua vez, estimulou a produo de IL-8 (Fig. F22). Este resultado
confirma o obtido no experimento com EMSA, onde ocorreu a tendncia de aumento da
ligao de NF-B com o DNA radiativo.

Figura F22. Efeito da triptantrina (20) na produo de IL-8 em clulas HeLa 229. As clulas foram
incubadas com triptantrina por 1 h e estimuladas com 6 g de TNF- por 6 h a 37 C e CO
2
. A produo
de IL-8 foi medida por meio de reao colorimtrica com o mtodo ELISA.

Quanto isaindigotona (21) e indirubina (22), no foi possvel obter resultados
satisfatrios para a avaliao dos seus efeitos na produo de IL-8. Todos os experimentos
com NF-B, luciferase e IL-8 foram realizados diversas vezes e todas as substncias foram
submetidas ao mesmo tempo s mesmas condies. Porm, o grau de variao dos dados no
permite avaliao estatstica segura, sendo que os valores distribuem-se ao longo do eixo
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
-175
-150
-125
-100
-75
-50
-25
0
25
Tryptanthrin (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

p
r
o
d
u
o

d
e

I
L
-
8

(
%
)

N
O
O
HO
O
H
19
N
N
O
O
20
horizontal, variando entre valores positivos e negativos com relao ao eixo vertical. Uma das
hipteses que estas substncias no sejam aptas para a realizao deste ensaio. Alm disto,
apresentaram tambm problemas de solubilidade no meio de cultura durante o processo de
incubao.
interessante observar que a indolinona (19) apresenta atividades importantes no que
concerne a inibio de processos inflamatrios. J a triptantrina (20) tende sua ativao. Os
dois outros alcalides, estruturalmente uma mistura dos dois primeiros (Fig. F23), no
apresentam efeitos definidos.
N
O
O
HO
O
H

19 indolinona
(3-(3,5-dimetxi-4-hidrxibenzilidenil)-indolin-2-on)
N
N
O
O

20 triptantrina
(indolo-(2,1-b)-quinazolina-5,12-diona)
N
N
O
HO
O
O

21 - isaindigotona
N
O
H
N
O
H

22 - indirubina
Figura F23. Alcalides de Isatis tinctoria.

3.2. Elastase
3.2.1. Secreo de elastase
Neutrfilos so os agentes de primeira linha de defesa contra microrganismos e so
tambm clulas cruciais tanto para a imunidade inata quanto humoral (Burg e Pillinger, 2001).
Entretanto, desequilbrios resultam em danos srios dos tecidos normais adjacentes a
processos inflamatrios. Por isso de grande interesse encontrar substncias que inibam a
secreo das enzimas que causam esta destruio tecidual.
Baseado em um ensaio previamente publicado, otimizou-se o mesmo no sentindo de
selecionar substncias com atividade inibidora da secreo de elastase por neutrfilos
(Johansson et al., 2002; Siedle et al., 2003). O ensaio foi transferido para tubos tipo
Eppendorf e para microplacas de 96 poos, evitando assim o consumo de tempo em funo do
uso de cubetas para medidas de absoro na regio do UV. Alm disso, o ensaio pode ser
usado para o estudo do efeito diretamente sobre a enzima elastase isolada. A incubao dos
neutrfilos com as substncias teste e sua estimulao foram realizados em tubos tipo
Eppendorf usando 65 x 10
4
clulas/amostra. Medidas fotomtricas da pNA, resultado da
quebra do substrato SAAVNA pela elastase, foi realizada em microplaca de 96 poos aps
separao das clulas por centrifugao. Este procedimento tem a vantagem de ter disponvel
um grande nmero de clulas. Nos ensaios realizados inteiramente na microplaca de 96 poos
houve problemas quanto reprodutibilidade dos resultados, devido ao pequeno nmero de
clulas em cada poo, o que acarreta um aumento da probabilidade de erro. Usando tubos tipo
Eppendorf, assim como microplacas de 96 poos, o experimento tem a vantagem de usar um
grande nmero de clulas no comeo do experimento e mesmo assim permitir medida
automtica rpida do resultado.
Alm disso, o mtodo ainda foi otimizado para suprimir o fenmeno de ativao dos
neutrfilos na ausncia de estimuladores clssicos. interessante notar que esta estimulao
basal, como o fenmeno foi denominado, raramente mencionada, considerada ou discutida
na literatura (Junger et al., 1998; Partrick et al., 2000). Quando a secreo basal de elastase
muito alta, os estimuladores clssicos falham, no havendo estimulao adicional suficiente
para aumentar a secreo. Alm disso, quando a secreo basal negligenciada, os valores
calculados para IC
50
para uma dada substncia correspondem no apenas a uma via de
ativao, como por exemplo, quela estimulada por PAF, mas tambm a outras no
consideradas.

O nmero de publicaes que descrevem a busca por inibidores da secreo da
elastase (Johansson et al., 2002; Siedle et al., 2003) muito menor do que aquelas que
concernem a busca por inibidores da atividade enzimtica de elastase (Becker et al., 2003;
Bernstein et al., 1994b; Bernstein et al., 1994a; Copp et al., 1987; Daels-Rakotoarison et al.,
2003; Damewood, Jr. et al., 1994; DelVal et al., 2002; Dryden et al., 1992; Kokot et al., 1987;
Krantz et al., 1990; Loser et al., 2000; Melzig et al., 1999; Melzig et al., 2001a; Mitaine-Offer
et al., 2002; Odagaki et al., 2001; Ohbayashi, 2002a; Partrick et al., 1999; Reed e
Katzenellenbogen, 1991; Tamura et al., 2002; Vicentini et al., 2001; Ying et al., 1991). Em
geral, as publicaes que relatam investigaes a respeito de secreo de enzimas ou
superxido de neutrfilos discutem aspectos fisiolgicos e patolgicos relacionados a eles. As
discusses so freqentemente relacionadas ativao dos neutrfilos usando diferentes
primers associados a estimuladores clssicos e inibio ou reduo desta ativao, porm
no h discusses sobre a estimulao basal destas clulas. Foi observado em vrias
publicaes que a diferena na quantidade de elastase secretada das clulas estimuladas e no
estimuladas relativamente baixa (Brown et al., 2003; Junger et al., 1998; Partrick et al.,
2000; Tamura et al., 2002), sendo algumas vezes de apenas 5 %. Em outras, a absoro
relativa ao produto de quebra de substrato fica em 0,195 para clulas estimuladas e em 0,150
para as no estimuladas (Junger et al., 1998; Tamura et al., 2002). Na realidade, a quantidade
de elastase secretada por controles estimulados resultado de dois estmulos, um que
compreende um estimulador desconhecido e outro um estimulador clssico, como fMLP, PAF
ou PMA. Nos experimentos aqui realizados, foi observada uma diferena to pequena entre
controles positivos e negativos que se decidiu estudar as vias de ativao envolvidas com um
pouco mais de detalhes.
Na literatura, os resultados que concerniam busca por inibidores da degranulao so
calculados em relao a apenas controles positivos. Isto significa que no est claro se estes
compostos inibem apenas as vias clssicas ou ainda as vias no conhecidas, ou seja, a basal. O
interesse na estimulao basal aumentou ainda mais quando se constatou que as LSTs inibem
tambm a secreo basal de elastase.

Alm disso, tambm foram examinados vrios parmetros que podem influenciar este
fenmeno, como o solvente das solues-estoque das substncias-teste, tempo de estimulao,
estresse mecnico e qumico. Como o DMSO foi usado para a solubilizao das substncias
teste, foi realizado um estudo para avaliar sua influncia na secreo de elastase. A figura F24
mostra que o DMSO inibe a secreo de elastase de forma dose dependente. Portanto, a sua
concentrao deve ser mnima em cada amostra e igual em todas, inclusive nos controles.
Apesar de 0,25 % de DMSO causar 20 % de inibio da secreo, esta foi a concentrao de
escolha, pois uma quantidade menor no foi suficiente para a realizao do ensaio.

Figura F24. Efeito de DMSO na secreo de elastase estimulada com o PAF. Os controles
compreendem amostras sem DMSO com e sem estmulo.

0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
20
30
40
50
60
70
80
90
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
e

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)
DMSO (%)
A secreo da elastase pode ser induzida por diversos fatores, como por exemplo
estresse, radiao UV e choque trmico (Schwenger et al., 1998). Os estimuladores mais
utilizados so o fMLP e o PAF. Porm, havia falta de estudos com relao ao tempo de
estimulao que induza o mximo de secreo. A curva de tempo versus estimulao com o
PAF e o fMLP revelou que a maior diferena entre os controles negativos e positivos ocorre
com 20 min de estimulao (Fig. F25) Interessante o fato de que com o passar do tempo a
secreo de elastase aumenta mesmo nos controles negativos, ou seja, sem estmulo. Este
experimento deixou evidente o fenmeno da estimulao basal.

Figura F25. Efeito do tempo (min) na estimulao de neutrfilos para a secreo de elastase. As amostras
compreendem clulas, SAAVNA, citocalasina B e fMLP ou PAF. Controles negativos sem estmulo.

Ficou comprovado ainda que a diferena de temperatura de 4 a 20 C durante o
processo de centrifugao das clulas pode influenciar, mas no determinante no fenmeno
da estimulao basal.
A via clssica envolvida na secreo de elastase compreende a cascata de MAPK, a
qual ativa as quinases p38 MAPK e ERK1/2 (Fig. F9). O PAF e o fMLP so ativadores
dependentes de receptor, levando fosforilao de p38 MAPK e ERK1/2, respectivamente. O
fMLP tambm pode ativar a via p38 MAPK, mais especificamente a MEKK-X por meio da
PKC. A exposio ao fMLP resulta num grande nmero de respostas funcionais, incluindo o
influxo de clcio e exocitose de enzimas (Nick et al., 1997). Alm de ativar o mensageiro
secundrio PLC com subseqente gerao de IP3 e DAG, seguida pelo aumento da
concentrao de clcio intracelular, o fMLP tambm ativa a protena Ras, que seguida pela
ativao das vias p38 MAPK e ERK1/ERK2 (p42/44). O fosfolipdeo PAF afeta apenas
levemente a via p42/44 MAPK, mas mais fortemente a via p38 MAPK (Nick et al., 1997;
Partrick et al., 2000). Esta a razo pela qual a estimulao mais efetiva quando se usa PAF
0 5 10 15 20 25 30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
min
fMLP
PAF
sem estmulo
*

*
**
**
*
**
**
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
sem
est .
sem
est .
SB
sem
est . U
fMLP fMLP
SB
fMLP
U
PAF PAF
SB
PAF
U
PMA PMA
SB
PMA
U
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
como primer e fMLP como estimulador. o PMA ativa diretamente a PKC, que por sua vez
ativa ambas as vias descritas acima e tambm liga-se ao clcio intracelular, aumentando assim
a secreo de elastase (Kokot et al., 1987). Isto explica porque a estimulao com PMA
mais eficiente do que com PAF ou fMLP. Embora tenha sido sugerido que a PKC
desempenha um papel pouco importante na secreo de elastase (Cabanis et al., 1996),
existem tambm vrios relatos que comprovam que o PMA mais eficiente do que o fMLP e
o PAF (Daels-Rakotoarison et al., 2003; Junger et al., 1998; Partrick et al., 2000; Tamura et
al., 2002).
Foi possvel demonstrar que os inibidores da p38 MAPK, SB203580, e da MEK1/2,
U0126, reduzem a secreo de elastase causada pela estimulao basal (Fig. F26). Estes
resultados evidenciam que as vias p38 MAPK e MEK1/2 so induzidas por um estimulador
inespecfico. Estes compostos tambm inibem a exocitose de elastase induzida por fMLP,
PAF e PMA, confirmando que as quinases p38 MAPK e MEK1/2 participam de todas as vias
(Junger et al., 1998; Partrick et al., 2000). No que concerne o envolvimento da p38 MAPK, os
resultados obtidos com o emprego do LPS concordam com os relatos de que o LPS ativa p38
MAPK, mas as respostas funcionais no incluem o influxo de clcio ou degranulao (Nick et
al., 1996).

Figura F26. Efeito do SB203580 (SB) e U0126 (U) na secreo da elastase em clulas estimuladas e no
estimuladas. As clulas foram incubadas com SB (10 M) e U (10 M) por 30 min. Controles negativos
no recebem estimulador. Valores de p < 0,05 versus respectivos controles so considerados significativos e
designados por *. p < 0,005 por **; est. = estmulo.

No sentido de evitar este problema, os efeitos da heparina e do EDTA como
anticoagulantes na coleta do sangue foram comparados. Para tanto, foram utilizadas seringas
S-Monovette
com Li-Heparin e K-EDTA. Quando diretamente em contato com os

neutrfilos a heparina poderia inibir a secreo de elastase (Brown et al., 2003) e o EDTA,
como quelante de clcio, poderia atenuar sua liberao (Kokot et al., 1987). Porm no
experimento realizado estas duas substncias foram utilizadas apenas como anticoagulantes,
sendo que no processo de isolamento dos neutrfilos elas so removidas, desta forma no
interferindo na secreo da enzima. Mesmo assim, importante evitar o uso do EDTA porque
o transporte de clcio do espao extracelular para o interior dos neutrfilos crucial para a
secreo de elastase. Alm disso, j foi comprovado que o EDTA atenua a secreo no caso
de ativao com PMA (Kokot et al., 1987). Apesar de todas estas informaes, no foram
observados efeitos de reduo ou inibio da secreo para os dois anticoagulantes, tanto em
clulas estimuladas como em clulas no estimuladas, no caso de secreo basal. No entanto,
decidiu-se empregar a heparina, uma vez que este o anticoagulante geralmente utilizado
para ensaios que envolvem neutrfilos.
O estresse mecnico provocado durante a coleta de sangue e isolamento das clulas
poderia estimular a secreo de elastase, por exemplo, devido ao pequeno dimetro da agulha
ou ainda ao filtro. Esta constatao corrobora com o fato de que a elastase liberada durante
os processos de hemodilise (Kokot et al., 1987). Para investigar o efeito deste estresse
mecnico, dois tipos de seringas foram empregados e as clulas foram estimuladas com
fMLP. Foram empregadas seringas simples, que compreendem tubo de coleta e agulha de
metal, e seringas S-Monovette, que compreendem o tubo de coleta de sistema a vcuo com
filtro na ponta acoplado a uma cnula com agulha (Fig. F27). Os controles positivos com
clulas coletadas em seringas simples apresentaram absoro de 0,768. Controles positivos
com clulas coletadas em seringas S-Monovette apresentaram absoro de 0,972. Os
valores para os controles negativos, no caso de estimulao basal, foram de 0,708 e 0,752,
respectivamente para seringas simples e S-Monovette. Estas diferenas comprovam que o
estresse mecnico acentua a estimulao basal, porm o tipo de seringa no a sua nica
causa. Apesar disto, optou-se pelo uso das seringas simples para minimizar o problema.

Figura F27. Seringa simples esquerda e S-Monovette direita.

X
O BSA, um ingrediente do tampo usado para solubilizar o substrato SAAVNA e
assim impedir a sedimentao das clulas no meio de reao, poderia ser uma causa da
estimulao basal. Existem diferentes mtodos de extrao da albumina do soro bovino que
leva a diferentes graus de pureza, os quais poderiam induzir a degranulao de neutrfilos.
Por isso, foram testadas BSAs de duas empresas, ambas as fraes V, sendo uma da empresa
Roth, obtida por precipitao, e a outra da empresa Sigma, obtida por eletroforese, produto
tambm utilizado no protocolo do ensaio original (Siedle et al., 2003). Porm no foi
observada diferena significativa entre os dois produtos. Os valores de absoro dos controles
negativos foram de 0,492 e 0,428 para BSA da marca Sigma e da Roth, respectivamente. Os
controles positivos apresentaram absores de 0,585 e 0,567, respectivamente, indicando a
ocorrncia da estimulao basal. Portanto, foi possvel demonstrar que o tipo de albumina no
tem influncia no fenmeno.
Alm disso, a albumina pode ligar-se substncia-teste influenciando na sua
concentrao (Wagner et al., 2004). Um simples grupo sulfidrila (Cys-34) da protenas, que
o grupo tiol mais reativo no sangue, pode reagir, por exemplo, com um grupo carbonila ,-
insaturado de uma LST via adio tipo Michael. O partenolido, cujo efeito sobre a secreo de
elastase j foi previamente estudado (Siedle et al., 2003), reage covalentemente com a
albumina humana (Wagner et al., 2004). Em funo disto, tambm foi investigado se o efeito
do partenolido difere na presena das albuminas provenientes das duas empresas. Porm,
como mostra a figura F28, no h influncia significativa das mesmas sobre o efeito de
partenolido.

Figura F28. Efeito da albumina proveniente de duas empresas na inibio da secreo de elastase pelo
partenolido. As amostras compreendem clulas, SAAVNA em diferentes solues de BSA (Sigma e Roth),
citocalasina B e fMLP. Controles negativos sem estmulo.
0 5 10 15 20
-20
0
20
40
60
80
100
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
e

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)
Partenolido (M)
BSA Sigma
BSA Roth
**
**
*
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
sem est . PAF fMLP 0.5 1 5 10 20 50
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
a
*
a'
b
*
b'
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
sem estmulo LPS fMLP LPS+fMLP
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
sem est. basal com est. basal
O LPS considerado um primer fraco de neutrfilos e por vezes mencionado at
como um estimulador fraco (Bishop et al., 2003; Norgauer et al., 1991; Ottonello et al., 1997).
Portanto, deve ser levado em conta que a contaminao com bactrias gram-negativas poderia
induzir a estimulao basal dos neutrfilos, uma vez que o experimento realizado em
condies no estreis. Concordando com esta hiptese, o LPS foi testado como estimulador e
o ensaio foi realizado em condies estreis. A figura F29 mostra que LPS em concentraes
de 0,5 50 g/mL tem apenas um leve efeito na secreo da elastase, em contraste com o
PAF (0,1 mM) e o fMLP (0,1 mM), ambos usados como controles positivos. Quando o LPS
foi empregado como primer para fMLP subseqentemente adicionado como estimulador, as
clulas, cujos controles negativos apresentaram uma pequena estimulao basal, secretaram
quantidade consideravelmente maior de elastase do que quando o fMLP foi empregado
sozinho como estimulador (Fig. F30). Por isso a contaminao por LPS no pode ser
considerada como causadora da estimulao basal, o que exclui a necessidade de se realizar o
ensaio sob condies
estreis.

Figura F29. Comparao da secreo de elastase entre os estmulos LPS (0,5 50 g/mL), PAF (0,1 mM) e
fMLP (0,1 mM) mtodo A. Valores de p < 0,05 versus controle negativo (sem estmulo) so considerados
significativos e designados por *. p < 0,005 por **; est. = estmulo.

Figura F30. Efeito de LPS como iniciador e fMLP como estmulo da secreo da elastase mtodo A.
Valores de p < 0,05 para diferenas entre a-a e b-b so considerados significativos e designados por *.
est. = estmulo.

0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
sem estmulo fMLP PAF
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
doador A doador B A + B
A estimulao basal no ocorre em cada experimento, o que indica que este fenmeno
pode estar relacionado aos doadores de sangue. Isto pode estar relacionado s caractersticas
individuais ou apenas ao estado de sade do doador. extremamente difcil determinar qual
tipo de estresse no doador poderia induzir a estimulao basal dos neutrfilos. Para explorar
este aspecto, foram comparados os resultados obtidos com clulas misturadas de dois
doadores com aqueles dos dois doadores em separado. Existe a possibilidade de que as clulas
de dois doadores poderiam se estimular mutuamente. Apesar de que todos os doadores
estavam aparentemente saudveis, complicado saber se um voluntrio tinha alguma pequena
inflamao ou desordem que causasse o fenmeno. Foi observado que quando clulas de
determinados doadores eram empregadas, ocorria a estimulao basal e com clulas de outros
isto raramente ocorria. A figura F31 mostra que a quantidade de elastase secretada por clulas
de dois doadores corresponde mdia da quantidade secretada pelas clulas de cada doador
em separado. Portanto, a mistura dos granulcitos de dois doadores no resulta em problemas
de incompatibilidade ou de estimulao mtua. Isto sugere que o problema da estimulao
basal pode ser causado por meio de estresse mecnico durante a coleta e isolamento das
clulas, quando as clulas foram endogenamente primadas, mas se isso no ocorreu, ento os
estresse mecnico no suficiente para induzir a estimulao celular.

Figura F31. Secreo de elastase em clulas de dois doadores; mtodo A, separadas (A, B) e
misturadas (A + B).

Outra razo para a estimulao basal poderia ter origem em processos alrgicos dos
doadores, como rinite alrgica, por exemplo. Os processos alrgicos so geralmente
acompanhados por um aumento do nvel de eosinfilos, que podem estimular os neutrfilos a
liberar produtos enzimticos (Moy et al., 1990). A protena MBP (major basic protein)
presente nos grnulos dos eosinfilos ativa os neutrfilos para a degranulao de proteases e
superxido. Este fato aumentado ainda pelo sinergismo entre MBP e PAF, que tambm
secretado por eosinfilos em quantidades significativas. PAF funciona como um mediador na
fase tardia do processo alrgico (Moy et al., 1990). Esta afirmao poderia explicar a
estimulao basal, mesmo que a diferena na quantidade de eosinfilos no fosse to grande
entre experimentos com ou sem a estimulao basal. Apesar de ainda no estar claro se h
alguma correlao entre o estresse mecnico e a liberao de MBP e PAF, os eosinfilos
podem ser muito evasivos e facilmente ativados. A elastase, por exemplo, causa degranulao
de eosinfilos num mecanismo parcialmente dependente de clcio e filamentos de actina (Liu
et al., 1999). Normalmente os eosinfilos compreendem cerca de 1 a 2 % dos granulcitos.
Ao corar as clulas isoladas, foi possvel observar que a quantidade de eosinfilos aumenta
quando os neutrfilos esto basalmente estimulados, chegando a 4 ou 5 %. Supe-se que esta
diferena de 2 a 4 % possa ser significativa na causa da estimulao basal de neutrfilos,
porm estudos adicionais so necessrios para confirmar a hiptese.
A presena de citocalasina B decisiva para a degranulao de elastase. Se as clulas
esto basalmente estimuladas e entram em contato com esta substncia, a degranulao ocorre
imediatamente. Porm, se a estimulao basal no estiver ocorrendo, a citocalasina B no
pode causar a degranulao, pois h a necessidade de um estmulo externo. O controle sem a
citocalasina B apresentou absoro de, por exemplo, 0,043, e os controles com esta substncia
apresentaram absoro de 0,645 e 0,683, respectivamente para os estimuladores fMLP e PAF.
Isso comprova que na ausncia desta substncia no h secreo de elastase.
Estudos mostraram que solues salinas hipertnicas podem suprimir a ativao de
neutrfilos via interceptao de vrios sinais dependentes de receptor, como por exemplo os
sinais originados quando o receptor para fMLP ativado (Junger et al., 1998). Quando a
sinalizao desencadeada por PMA, ao invs de fMLP, a adio de salina hipertnica
aumenta a degranulao por amplificao da via p38 MAPK. Alguns autores sugerem
inclusive que a salina hipertnica pode prevenir a ativao de neutrfilos por agentes
quimiotticos (Junger et al., 1998). O isolamento dos granulcitos envolve a lise de eritrcitos
com gua gelada, o que resulta em um estresse qumico para os neutrfilos, o que poderia
induzir a sua ativao. No mtodo original, a adio de gua seguida pela adio de tampo
fosfato para restabelecer a tonicidade, mas a soluo resultante era hipotnica, uma vez que a
gua no era removida. A soluo hipotnica poderia tambm ser um estresse qumico.
Portanto, resolveu-se estudar qual a tonicidade ideal para os neutrfilos. Assim realizou-se a
comparao entre as solues hipotnica (tampo PBS 1x), isotnica (tampo PBS 2x e
soluo salina) e hipertnica (tampo HEPES com sacarose). Com o uso da soluo
hipertnica, a estimulao basal foi mais freqente e eficientemente suprimida (Fig. F32).
Entretanto, em alguns casos de estimulao basal, mesmo o tampo hipertnico no foi capaz
0
0.2
0.4
0.6
0.8
sem estmulo fMLP PAF PMA
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
hipotnico isotnico hipertnico
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 min 30 min 60 min
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
sem estmulo fMLP PAF PMA
de suprimi-lo. Adicionalmente foram testados os efeitos dos estimuladores fMLP e PAF
concomitantemente ao uso das solues de diferentes tonicidades. Como os efeitos de fMLP e
PAF no foram to eficientes quando o tampo hipertnico foi utilizado, resolveu-se testar
outro estimulador. O PMA um estimulador inespecfico, independente de receptor que
apresentou a maior taxa de estimulao quando o tampo hipertnico foi empregado (Fig.
F32).

Figura F32. Efeito da tonicidade do tampo no isolamento dos neutrfilos na presena da estimulao
basal e efeito de fMLP, PAF e PMA na secreo de elastase.

Embora o uso de soluo hipertnica tenha otimizado o ensaio, algumas vezes a
estimulao basal voltava a ocorrer. O problema foi efetivamente resolvido quando as clulas
isoladas foram deixadas em repouso antes do incio do ensaio por 30 ou 60 min a 37 C em
tampo fosfato com clcio e magnsio (Fig. F33). Novamente os estimuladores fMLP, PAF e
PMA foram testados sob estas condies. O PAF e o PMA provaram ser os mais eficientes.
Deixar os granulcitos em repouso por 60 min no apresentou vantagens com relao ao
repouso de 30 min.

Figura F33. Efeito de tempo de repouso (0, 30 e 60 min) dos neutrfilos em PBS com Ca
2+
/Mg
2+
na
estimulao basal e na secreo de elastase estimulada por fMLP, PAF, PMA em meio hipertnico.

Por fim, foi possvel mostrar que o mtodo est apto para a seleo de compostos com
atividade de inibio da secreo da elastase. A combinao do uso de tampo hipertnico e
de repouso de 30 min antes do incio do ensaio provou ser a melhor maneira de solucionar o
problema da supra regulao dos neutrfilos.

3.2.2. Efeito de LSTs na secreo e atividade enzimtica de elastase
Dez LSTs foram testadas quanto ao efeito sobre a exocitose de elastase por neutrfilos
humanos, as quais so mostradas na figura F34.
Figura F34. LSTs testadas quanto secreo da elastase por neutrfilos humanos.

O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
1
O
O
O
O
O
O
O
O
O
2
O
O
O
O
O
OH
11
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O O
10
O
OH
HO
H
OH
O
O
O
12
O
O
O
HO
O
O
O
13
O
O
O
O
O
O
14
O
O
O
O
O
O
O
OH
15
O
O
HO
O
16
O
O
H
17
O
O
O
18
As curvas de inibio da secreo de elastase so apresentadas na figura F35. Na
tabela F9 so apresentados os respectivos valores de IC
50
. Alm dos controles normais, foram
empregados controles negativos para as substncias-teste, ou seja, para cada concentrao
foram feitas triplicatas sem estmulo. Assim, observou-se que as mesmas tambm inibem a
estimulao basal, como por exemplo, 1 que apresenta valor de IC
50
igual a 11,75 1,87.

10 20 30 40 50 60 70 80 90
-25
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
1 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
2 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

0 50 100 150 200 250
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
12 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

25 50 75 100 125
-20
0
20
40
60
80
100
fMLP
PAF
13 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

-10 15 40 65 90
-10
10
30
50
70
90
110
fMLP
PAF
14 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

0 20 40 60 80 100
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
15 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

0 20 40 60 80 100
-10
10
30
50
70
90
110
fMLP
PAF
16 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

0 25 50 75 100 125
-10
10
30
50
70
90
110
fMLP
PAF
17 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

50 100 150 200
-25
0
25
50
75
100
fMLP
PAF
18 (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

Figura F35. Efeito das LSTs na secreo de elastase. As clulas foram incubadas a 37 C com citocalasina
B, SAAVNA e LSTs por 5 min e ento estimuladas com PAF ou fMLP por 20 min em banho com agitao
mtodo A. A reao foi parada com cido ctrico, as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante
transferido para microplaca de 96 poos e a absoro medida a 405 nm. Os controles compreendem
amostras com e sem estmulo.

11
17
16
15
14
13
12
Tabela F9. Valores de IC
50
(M) desvio padro da mdia

para a inibio da secreo de elastase por
LSTs.

GraphPad Prism 4 Version 4.02

Siedle et al., 2003 demonstraram que LSTs bifuncionais, ou seja, aquelas que possuem
dois grupos carbonila ,-insaturados, so mais ativas do que aquelas monofuncionais. Ainda
foi demonstrado que a ocorrncia da estrutura -metileno--butirolactona no pr-requisito
para a atividade, mas sim o nmero de ocorrncia de grupos carbonila ,-insaturados. A LST
mais ativa o furanoeliangolido trifuncional 14. A LST 15, bifuncional com um ster em C15
e sem -metileno--butirolactona, menos ativa que 14, corroborando a informao de que o
nmero de estruturas funcionais relevante para a atividade. Embora 13 seja estruturalmente
similar a 14, apresenta atividade semelhante a 15, o que talvez possa ser explicado pela
diferena de reatividade do ster quanto adio do tipo Michael, pois em 13 existe o ster
angelato e em o 14 metacrilato.
O partenolido (18), uma LST do tipo germacrolido isolada de Tanacetum parthenium,
considerado uma pr-droga, mesmo sendo monofuncional. Isto deve-se ao fato de que em
meio cido o epxido entre C4-C5 do partenolido pode formar um intermedirio catinico,
que reage facilmente com nuclefilos (Siedle et al., 2003). Assim como o partenolido, o
melampolido 1 tambm possui um grupo epxido entre C4 e C5, o que pode explicar sua
maior atividade em relao a 2. Alm disto, ele tambm possui um outro grupo epxido no
ster da cadeia lateral. O germacrolido 12 bifuncional, porm no possui nenhum grupo
epxido e sim trs grupos hidroxila. Apesar de se tratar de outro tipo de esqueleto, a menor
reatividade da LST 12 em relao LST 2 poderia ser indcio da importncia de um grupo
epxido para esta atividade. J a LST 11, tambm um germacrolido, muito pouco ativa,
porm trifuncional. As LSTs 1, 2, 12 e 18 pertencem classe dos germacranolidos,
caracterizados por possurem um anel de dez membros com grande flexibilidade
conformacional. Porm a flexibilidade de 11 um pouco mais restrita devido presena do
sistema de duplas com a carbonila em C3, o que pode justificar a diferena de atividade.
LST fMLP PAF
1 12,46 2,64 12,32 1,99
2 18,36 1,97 22,66 4,44
11 93,62 10,52 84,52 12,84
12 27,45 1,24 23,28 1,37
13 16,83 1,96 11,84 1,62
14 5,98 0,91 9,21 1,21
15 15,11 0,81 10,94 0,59
16 15,57 1,46 12,28 0,63
17 67,28 4,38 78,33 8,66
Apesar do pseudoguaianolido 16 no possuir a mesma flexibilidade que os germacranolidos,
apresenta uma atividade similar da LST 1. O elemanolido 17, alm de no ser flexvel,
apenas monofuncional e no apresenta estruturas como um grupo hidroxila ou epxido, o que
esclarece os elevados valores de IC
50
que foram obtidos.
Para avaliar se o efeito das LSTs est relacionado apenas secreo da enzima,
investigou-se inclusive sua ao diretamente sobre a atividade enzimtica. Curiosamente
observou-se que as duas nicas LSTs do tipo germacrolido (11 e 12) inibem diretamente a
enzima elastase (Tab. F10). O dmero 10 tambm foi testado e no inibe a atividade
enzimtica de forma significativa.

Tabela F10. Efeito das LSTs sobre a atividade enzimtica de elastase ( desvio padro da mdia).
LST M Inibio (%)
1 75 8,0 5,8
2 75 6,6 3,3
10 50 12,9 7,2
11 200 42,0 9,0
12 100 52,7 26,1
13 100 6,0 9,3
14 50 -1,4 8,8
15 100 0,4 9,0
16 75 3,7 4,7
17
150 3,3 3,5

Constatou-se ainda que a maioria das LSTs no citotxica para os neutrfilos. Porm
2 levemente citotxica (27 % a 75 M), enquanto 17 citotxica a 200 M, matando cerca
de 50 % dos neutrfilos.
No obstante algumas consideraes a respeito do comportamento das LSTs j terem
sido feitas, o mecanismo de ao ainda no est claro. Algumas etapas j foram esclarecidas,
por exemplo, j sabido que o partenolido no capaz de inibir a MAPK p38 (Lindenmeyer,
2004). Entretanto, foi comprovado que o partenolido inibe a fosforilao desta mesma
quinase, assim como impede a fosforilao de enzimas que ativam a MAPK quinase-3/6 em
clulas dendrticas (Uchi et al., 2002). O partenolido tambm capaz de inibir a fosforilao
de MAPK p42/44 em clulas microgliais primrias de rato (Fiebich et al., 2002). O
germacrolido costunolido (o mais simples dos germacrolidos) tambm inibe a fosforilao de
MAPK p38 em clulas Raw 264.7 (Kang et al., 2004). O pseudoguaianolido helenalina, por
sua vez, no inibe a PKC (Powis et al., 1994). Apenas duas enzimas ainda no foram
estudadas com relao s LSTs: a PLC e a MEKK-X. Portanto, possvel concluir que as
LSTs provavelmente inibem a secreo de elastase por inibirem a atividade de MEKK-X (Fig.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
fMLP PAF PMA sem estmulo
A
b
s
o
r
o

4
0
5

n
m
controles 1 10 20 50 75 100 M
F9). Porm, h ainda a possibilidade de que inibam tambm a PLC (Nick et al., 1997). Uma
vez que os testes com estas duas enzimas sejam realizados, acredita-se que o exato
mecanismo de ao das LSTs seja elucidado.
As LSTs foram investigadas quanto inibio da secreo de elastase estimulada por
PAF e fMLP. A enidrina (1) foi a selecionada para ser avaliada tambm quanto secreo
estimulada por PMA e se os efeitos do meio hipertnico e do repouso de 30 min das clulas
influenciam nos valores de IC
50
. A figura F36 mostra que a secreo basal foi suprimida. A
enidrina (1) um inibidor tambm para clulas estimuladas com PMA (30,03 2,99), porm
necessria uma concentrao consideravelmente maior da mesma do que quando as clulas
so estimuladas por fMLP (9,03 2,26 M) e PAF (12,80 1,73 M). Isto pode ser
explicado pelo fato de que o PMA tambm induz a secreo de elastase por meio da ativao
da via de clcio, a qual no pode ser totalmente inibida pelas LSTs (Siedle, 2003).
Recentemente, relatos tem mostrado que o PMA no promove o aumento do clcio citoslico
em neutrfilos, mas que a afinidade da PKC pelo clcio visivelmente aumentada, o que ativa
esta enzima (Kokot et al., 1987). A enidrina foi submetida ao ensaio com PMA sob as
condies do mtodo com tampo hipotnico e sem repouso das clulas e o valor de IC
50
(38,22 1,37) ainda maior do que no segundo caso de repouso e meio hipertnico (30,03
2,99). Esta diferena nos valores de IC
50
nos dois casos (8,19 M) no muito significativa
porque deve ser levado em conta que mais de uma via estava sendo ativada, uma vez que o
repouso das clulas pode influenciar na afinidade da PKC pelo clcio intracelular. Os valores
de IC
50
obtidos aps estimulao com fMLP e PAF no diferem significativamente daqueles
obtidos para os mesmos estimuladores em outras condies, sem o repouso e em meio
hipotnico, o que comprova que a estimulao basal no interfere nos resultados obtidos e
que, alm disso, ela ocorre por meio da ativao das vias clssicas.

Figura F36. Efeito da enidrina (1) utilizando o mtodo B na secreo da elastase.
0
20
40
60
80
100
1 5 10 20 50
(mg/mL)
I
n
i
b
i
o

d
a

e
n
z
i
m
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)
gel de arnica extrato de arnica gel
3.2.3. Efeito do gel e da tintura de Arnica montana na secreo e atividade
enzimtica de elastase
Preparados de flores de A. montana so utilizados para tratamento de
doenas inflamatrias na medicina tradicional h muito tempo. Os princpios
ativos so as LSTs do tipo pseudoguaianolido. O principal pseudoguaianolido a
helenalina (16), j conhecida por sua atividade inibidora da ligao de NF-B ao
DNA, isso , exerce importante funo no processo antiinflamatrio (Merfort,
2003). Dando continuidade aos estudos com relao atividade antiinflamatria, um produto
da indstria de fitoterpicos e seu principal metablito secundrio, helenalina (16), foram
investigados quanto secreo de elastase por neutrfilos humanos. Foram empregados os
trs estimuladores da degranulao fMLP, PAF e PMA.
O gel de A. montana na concentrao de 50 mg/mL inibe 88,6 % da atividade
enzimtica de elastase (Fig. F37) e a mesma concentrao inibe 91,2 % da secreo da enzima
por neutrfilos (Fig. F38). Isto significa que o gel de A. montana praticamente no tem efeito
sobre a secreo da enzima, mas sim sobre a sua atividade enzimtica e de forma dose
dependente. Entretanto, este efeito no est relacionado presena da LST helenalina (16),
que inibe a secreo da enzima (Fig. F35) e no sua atividade enzimtica (Tab. F9). A tintura,
principal componente do gel de A. montana, tambm foi testada, e 50 mg/mL inibem 85,6 %
da atividade enzimtica (Fig. F37). O gel base desta formulao (atrogel), na mesma
concentrao, inibe apenas 14,8 % da atividade enzimtica (Fig. F37). Estes resultados
indicam que a inibio da atividade enzimtica provavelmente no se deve presena de
LSTs, que aparecem em pequena concentrao no extrato etanlico, mas sim presena de
compostos fenlicos, presentes em maiores concentraes. Esta afirmao corrobora os
resultados encontrados para flavonides e derivados de cido cinmico, que inibem a
atividade enzimtica da elastase (Melzig et al., 1999; Melzig et al., 2001a).
O gel de A. Montana no citotxico para os neutrfilos.

-10 0 10 20 30 40 50
-25
0
25
50
75
100
PMA
fMLP
PAF
Gel de arnica (mg/ml)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
e

H
N
E

(
%

c
o
n
t
r
o
l
e
)

Figura F37. Efeitos do gel e da tintura de A. montana e do gel base (atrogel) na atividade enzimtica de
elastase. Os controles negativos receberam cido ctrico ao mesmo tempo que SAAVNA.

Figura F38. Efeito do gel de A. montana na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com fMLP
(IC
50
= 4,40 0,30), PAF (IC
50
= 4,16 0,423) e PMA (IC
50
= 6,52 0,63).

3.2.4. Efeito do extrato de Harpagophytum procumbens na secreo e
atividade enzimtica de elastase
O extrato seco de H. procumbens empregado no preparo de formulaes de uso
externo para o combate artrite reumatide e artrose. Seu principal metablito secundrio, o
iridide harpagosdeo, possui atividades analgsicas, mas sua ao contra processos
inflamatrios ainda no foi comprovada. Por isso, a avaliao quanto ao efeito do extrato na
secreo de elastase e na atividade enzimtica vem a contribuir com o processo de estudo
deste vegetal, que h muito utilizado na medicina tradicional na frica e Europa.
Os resultados mostraram que 750 g/mL de extrato de H. procumbens inibem 64,6 %
da atividade enzimtica da elastase. Por isso, uma curva dose-resposta foi construda (Fig.
F39), havendo ento a comprovao de que o extrato inibe a atividade enzimtica de forma
dose dependente. No experimento relativo secreo da elastase foi possvel observar o
mesmo efeito, ou seja, a diminuio da intensidade de absoro conforme aumento da
concentrao (Fig. F40). Apesar de se entender que o efeito se deva principalmente inibio
da atividade enzimtica, possvel observar na curva sobre a secreo que o extrato tambm
capaz de inibi-la, sendo que 750 g/mL de extrato inibem cerca de 75 % da secreo de
elastase. O extrato de H. procumbens no citotxico para os neutrfilos.
Como os princpios ativos que exercem a atividade antiinflamatria ainda no so
conhecidos, pressupe-se que os responsveis pela inibio enzimtica sejam os flavonides,
tambm presentes no vegetal. Esses resultados respaldam, pelo menos em parte, o uso
tradicional deste vegetal, que inclusive vem sendo largamente comercializado na Europa.

0
20
40
60
80
100
50 100 300 500 750
Extrato de Harpagophytum procumbens (g/mL)
I
n
i
b
i
o

d
a

e
n
z
i
m
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

Figura F39. Efeito do extrato de H. procumbens na atividade enzimtica de elastase. Os controles
negativos receberam cido ctrico ao mesmo tempo que SAAVNA.

Figura F40. Efeito do extrato de H. procumbens na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com
fMLP (IC
50
= 563,7), PAF (IC
50
= 427,2) e PMA (IC
50
= 443,7).

I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
e

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)

Extrato de Harpagophytum procumbens (g/mL)
0 25 50 75 100
0
20
40
60
80
100
fMLP
PAF
Indolinon (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
e

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)
5 10 15 20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
PAF
Tryptanthrin (M)
I
n
i
b
i
o

d
a

s
e
c
r
e
o

d
a

e
l
a
s
t
a
s
e

(
%
)
3.2.5. Efeito dos alcalides de Isatis tinctoria na secreo e atividade
enzimtica de elastase
Isatis tinctoria, conhecida como ndigo, utilizada h muito tempo na China e Europa
para produo de corante para tecidos e tambm na medicina tradicional como
antiinflamatrio. No intuito de avanar um pouco no aspecto da atividade biolgica, quatro
alcalides isolados da planta foram submetidos aos ensaios relacionados enzima neutroflica
elastase.
O alcalide 19, indolinona, inibe a secreo de elastase (IC
50
PAF = 5,62 2,36 M;
IC
50
fMLP = 14,35 2,82M; Fig. F41), porm no inibe a atividade enzimtica. O alcalide
no apresentou citotoxicidade.

Figura F41. Efeito da indolinona na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com fMLP e PAF.

O alcalide 20, triptantrina, inibe apenas levemente a secreo de elastase (Fig. F42),
no inibe a atividade enzimtica e no citotxico.

Figura F42. Efeito da triptantrina na secreo de elastase por neutrfilos estimulados com PAF.

N
O
O
HO
O
H
20
N
N
O
O
21
Quanto aos alcalides 21, isaindigotona, e 22, indirubina, no foi possvel obter
resultados satisfatrios para a avaliao dos seus efeitos sobre a secreo de elastase. Todos
os experimentos foram realizados diversas vezes e todas as substncias foram submetidas ao
mesmo tempo s mesmas condies. Porm, os dados no permitem avaliaes estatsticas
seguras, sendo que os valores distribuem-se ao longo do eixo horizontal, variando entre
valores positivos e negativos com relao ao eixo vertical.

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