NDICE

I. II. III. IV. V. VI. VII.

PRESENTACIN............................................................................................3 COMIT E INSTITUCIONES ORGANIZADORAS.............................4 COMIT DE HONOR....................................................................................5 COMIT CIENTFICO...................................................................................6 INSTITUCIONES PATROCINADORAS Y COLABORADORAS...7 FIRMAS COMERCIALES............................................................................8 INFORMACIN GENERAL .......................................................................9

VIII. PROGRAMA...................................................................................................11 IX. X. XI. XII. CONFERENCIA INAUGURAL................................................................17 MESAS REDONDAS ..................................................................................23 CONFERENCIA DE CLAUSURA ..........................................................89 COMUNICACIONES (PSTERS) POR REAS TEMTICAS.....95

XIII. PRESENTACIONES ORALES I y II ................................................... 247 XIV. RELACIN DE COMUNICACIONES POR REAS TEMTICAS.....267 XV. RELACIN DE CONGRESISTAS....................................................... 281

.1.

.2.

PRESENTACIN
El Instituto de Productos Lcteos de Asturias (IPLA-CSIC) y el Departamento de Biologa Funcional de la Universidad de Oviedo, en calidad de organizadores, les dan la bienvenida al XII Congreso Nacional de Microbiologa de los Alimentos (SEM), con el que Asturias, una de las comunidades autnomas en las que el sector agroalimentario ha adquirido un notable desarrollo, se suma al conjunto de regiones a las que la Sociedad Espaola de Microbiologa ha confiado la organizacin de un congreso sobre esta disciplina cientfica. El Congreso se articula en torno a dos Conferencias Plenarias (Inaugural y de Clausura) que nos mostrarn, por un lado, los avances cientficos alcanzados cuando se combinan en perfecta simbiosis la Microbiologa Clsica y la Biologa Molecular y, por otro, el camino a seguir para transferir los resultados de la investigacin a la industria agroalimentaria, favoreciendo as la accesibilidad de los mismos a la sociedad. Junto con las Conferencias Plenarias, las cuatro Mesas Redondas nos darn una visin profunda y actual de temas de gran relevancia para el sector agroalimentario, entre los que se incluyen los relacionados con los Procesos Fermentativos, los Residuos de Antibiticos, los Probiticos y las Nuevas Tecnologas en la Conservacin de los Alimentos. La importancia de los temas que se abordarn en el Congreso y la categora cientfica de los conferenciantes han sido decisivas para que la Consejera de Salud y Servicios Sociales del Principado de Asturias declarara este Congreso de inters sanitario. Las 125 comunicaciones, distribuidas en diez reas temticas, constituirn un buen reflejo de las lneas de investigacin que actualmente desarrollan los microbilogos espaoles y algunos microbilogos iberoamericanos, a los que agradecemos especialmente su presencia. Del conjunto de comunicaciones, doce sern presentadas oralmente, al haber sido consideradas por el Comit Cientfico como especialmente relevantes. Nuestro agradecimiento al Ayuntamiento de Oviedo por permitirnos utilizar como sede del Congreso el Auditorio Prncipe Felipe, edificio singular de reciente inauguracin. Tendrn pues la oportunidad de disfrutar de la hospitalidad de la ciudad de Oviedo y de la multitud de actividades ldicas que se celebrarn estos das, al coincidir el Congreso con sus fiestas patronales. Asimismo, nuestro agradecimiento a las Instituciones Pblicas que han contribuido con su aportacin econmica a la financiacin de los gastos de organizacin; agradecimiento que hacemos extensivo a las Firmas Comerciales que acuden a mostrar aquellos productos y equipos ms novedosos que, sin ninguna duda, facilitarn nuestro trabajo. El Comit Organizador

.3.

COMIT E INSTITUCIONES ORGANIZADORAS

INSTITUCIONES

CSIC (Instituto de Productos Lcteos de Asturias) UNIVERSIDAD DE OVIEDO (Departamento de Biologa Funcional)

COMIT ORGANIZADOR

Presidenta: Vicepresidenta: Secretario/Tesorero:

Ana Rodrguez Gonzlez Covadonga Barbs Miguel Baltasar Mayo Prez

Responsables de Area:

Juan Carlos Bada Gancedo Victoria Bascarn Rodrguez Teresa Delgado Hervs Clara Gonzlez de los Reyes-Gaviln Alma Hernndez de Rojas Beatriz Martnez Fernndez

Vocales:

Miguel Angel Alvarez Gonzlez Roberto Crcoba Ruiz Jos Luis Caso Machicado Susana Delgado Palacio Mara Fernndez Garca Fernanda Fernndez Gutirrez Pilar Garca Surez M Jos Gonzlez Fernndez Miguel Gueimonde Fernndez Vctor Ladero Losada Carmen Madera Gonzlez Abelardo Margolles Barros M Cruz Martn Martn Luis Noriega Prez Isabel Nuo Prado Natalia Rilla Villar Claudia Snchez Lara Juan E. Surez Fernndez

Secretara: M del Pilar Garcia Arenas

.4.

COMIT DE HONOR

Excmo. Sr. D. Vicente Alvarez Areces Presidente del Principado de Asturias Ilmo. Sr. D. Gabino de Lorenzo Ferrera Alcalde Presidente del Ayuntamiento de Oviedo Excmo. y Magnfico Sr. D. Juan A. Vzquez Garca Rector de la Universidad de Oviedo Ilmo. Sr. D. Csar Nombela Cano Presidente del CSIC Ilmo. Sr. D. Carlos Hardisson Rumeu Presidente de la Sociedad Espaola de Microbiologa

.5.

COMIT CIENTFICO

Vocales: Dr. Juan Llaneza Llaneza Dra. M Carmen Mendoza Fernndez Dr. Manuel Nez Gutirrez Dr. Juan A. Ordez Pereda Dr. Daniel Ramn Vidal Dra. Begoa Sesma Vea Dr. Juan E. Surez Fernndez Dr. Federico Uruburu Fernndez

Coordinadora: Dra. Ana Rodrguez Gonzlez

.6.

INSTITUCIONES PATROCINADORAS Y COLABORADORAS

CSIC Universidad de Oviedo Cajastur Consejera de Cultura. Principado de Asturias Consejera de Salud y Servicios Sociales. Principado de Asturias Ministerio de Ciencia y Tecnologa. Secretara de Estado de Poltica Cientfica y Tecnolgica. Direccin General de Investigacin. Ayuntamiento de Oviedo Sociedad Regional de Turismo. Principado de Asturias

.7.

FIRMAS COMERCIALES

Stand expositor Presentacin oral Bio-Rad Laboratories, S.A. Bioser, S.A. Foss Electric Espaa, S.A. Francisco Soria Melguizo, S.A. Instrumentos Testo, S.A. Merck Farma y Qumica, S.A. Oxoid, S.A. Panreac Qumica, S.A. Tecasa (Tecnologa Agraria, S.A.) Hispanlab S.A. Biomeriux Espaa, S.A. Biocheck S.A. Scharlab S.L.

Aporte de material y documentacin Biocen, S.L. Mundiprensa-Libros, S.A. Pacisa y Giralt, S.L. Oxoid, S.A. Biomeriux Espaa, S.A.

.8.

INFORMACIN GENERAL
Fechas: 18, 19 y 20 de Septiembre de 2000 Sede: Auditorio Prncipe Felipe C/ Prez de la Sala 33007 Oviedo El Acto Inaugural y las Sesiones Cientficas tendrn lugar en la Sala de Msica de Cmara (Planta Baja) Stands y Psters se situarn en el Vestbulo Principal (Planta Baja) La Asamblea General del Grupo de Microbiologa de Alimentos de la SEM se celebrar en la Sala de Conferencias de la Tercera Planta. Cctel de Bienvenida y Cafs se servirn en la Sala de Exposiciones (Planta Baja) Las Comidas se servirn en el Vestbulo de la Planta Segunda. Los autobuses que trasladarn a los Congresistas al Restaurante La Gruta Cena de Clausura- saldrn de la misma Sede del Congreso. Secretara del Congreso:
Instituto de Productos Lcteos de Asturias (IPLA-CSIC) Apdo. 85 33300-Villaviciosa, Asturias, Espaa Tlfnos.: +34 98 589 21 31/ +34 98 589 22 31 Fax: +34 98 589 22 33 e-mail: xllcongmical@greencom.net pgina web: http://veterinaria.unex.es/sem/XIIcongr.htm

Durante la celebracin del Congreso la Secretara estar situada en el Vestbulo Principal del Auditorio. Inscripciones: La cuota de Inscripcin incluye:
Documentacin del Congreso Asistencia a las sesiones cientficas Certificado de Asistencia Traduccin simultnea Cctel de Bienvenida (lunes, 18) Caf (martes, 19 y mircoles, 20) Comida (martes, 19 y mircoles, 20) Cena de Clausura (mircoles, 20)

La cuota de acompaante incluye:

Acceso al recinto del Congreso Cctel de Bienvenida Excursin de jornada completa incluyendo comida (martes, 19) Excursin de media jornada (mircoles, 20). Comida en el Auditorio. Cena de Clausura.

.9.

PLANO DE OVIEDO

.10.

PROGRAMA
Primera Jornada Lunes, 18 de Septiembre de 2000
17.00 h. Entrega de Documentacin y Despliegue de Psters Visita a Stands de Expositores 19.00 h. 19.30 h. Apertura Oficial del Congreso Conferencia Inaugural: Avances en la microbiologa de levaduras vnicas Dr. Daniel Ramn Vidal (IATA-CSIC, Valencia, Espaa) 20.30 h. Cctel de Bienvenida (Sala de Exposiciones del Auditorio Prncipe Felipe)

.11.

Segunda Jornada Martes, 19 de Septiembre de 2000

8.45 h. Mesa Redonda: Procesos fermentativos en alimentos Genetically improved starter strains: opportunities for the dairy industry. Dr. Beat Mollet (Nestl Research Center, Suiza) Control de la fermentacin en sidras mediante tcnicas de biologa molecular. Dra. Carmen Cabranes Benduero (SERIDA, Principado Asturias, Espaa) Biotecnologa de levaduras: una herramienta para construir levaduras de panadera a la carta. Dr. Jos Antonio Prieto Alamn (IATA-CSIC, Valencia, Espaa) 10.45 h. Caf (Sala de Exposiciones del Auditorio) Sesin de Psters (Los responsables de los psters con nmero par deben situarse a pie de pster) Visita a Expositores 11.30 h Mesa Redonda: Residuos de antibiticos en alimentos. Control de Residuos de Antibiticos. Diez Aos del Plan Nacional de Residuos Dr. Vicente Caldern (I.S. Carlos III, Majadahonda, Madrid). Aspectos reguladores de los residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos Dr. Luis F. Corbaln (Agencia Espaola del Medicamento, Madrid) Resistencia antibitica en cepas humanas de origen zoontico Dr. Emilio Prez-Trallero (Servicio de Microbiologa. Complejo Hospitalario Donostia, San Sebastin, Espaa) 13.30 h 14.00 h Sesin de Psters y Visita a Expositores Comida (En El Restaurante Auditorio)

.12.

15.45 h

Presentaciones Orales: Bio-Rad Laboratories, S.A. y Psters Seleccionados I PROBELIATM: deteccin rpida y fiable de microorganismos en alimentos mediante tcnicas de PCR. Bio-Rad Laboratories, S.A. Life Science Group. Deteccin de Listeria monocytogenes en carne mediante PCR. Rosa Aznar y B. Alarcn. Estudio comparativo de los cambios estructurales y ultraestructurales que se producen durante la autolisis de las levaduras en un medio vnico modelo y en vinos espumosos elaborados por el mtodo tradicional. Adolfo J. Martnez-Rodrguez, A.V. Carrascosa y M.C. Polo. Comparacin de dos mtodos de extraccin de RNA para la deteccin del RNA de enterovirus y VHA en mejillones mediante RT-PCR. Nerea Casas y Ester Suen Efecto antiproliferativo de tres cepas de Enterococcus faecium en una lnea celular de mieloma. Adriana Zabala, R. Martn, A. Haza, L. Fernndez, J.M. Rodrguez y P. Morales Efecto del SO2 y otros componentes del vino sobre la actividad ATPasa y la sntesis de protenas en diferentes cepas de Oenococcus oeni. Ramn Carret, A. Bordons y M. Constant Purificacin, reconstitucin y caracterizacin funcional deLmra, una protena de membrana de Lactococcus lactis implicada en la resistencia a antibiticos y compuestos citotxicos. Abelardo Margolles, M. Putman, H.W. van Veen y W. Konings

17.30 h

Asamblea General del Grupo de Microbiologa de Alimentos de la SEM

17.30 h-19.30 h Sesin de Psters y Visita a Expositores (Responsables de psters con nmero impar deben situarse a pie de pster) 18.30 h. Reunin Sobre Normalizacin de Tcnicas y Mtodos Microbiolgicos Dr. Jos Martnez Peinado (Vicepresidente de la SEM)

.13.

Tercera Jornada Mircoles, 20 de Septiembre de 2000

8.45 h Mesa Redonda: Probiticos en alimentos Probiotics: Present knowledge and future prospects Dra. Annick Mercenier (Instituto Pasteur, Lille, Francia) Probiticos en nutricin animal Dra. Margarita Garriga (IRTA, Girona, Espaa) Aplicacin de lactobacilos de origen humano en el tratamiento de trastornos digestivos Dra. Covadonga Barbs (Area Microbiologa, Univ. de Oviedo, Espaa) 10.45 h Caf (Sala de Exposiciones del Auditorio) Sesin de Psters (Responsables de psters con nmero impar deben situarse a pie de pster) Visita a expositores 11.30 h. Mesa Redonda: Nuevas tecnologas en conservacin de alimentos Pasteurizacin de alimentos por mtodos no trmicos Dr. Gustavo V. Barbosa-Cnovas (Washington State University, Pullman, WA, USA) Utilizacin de las altas presiones para la conservacin de alimentos Dr. Buenaventura Guamis (Facultad de Veterinaria, Universidad Autnoma de Barcelona, Espaa) La conservacin de alimentos por ultrasonidos Dr. Javier Raso Pueyo (Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, Espaa) 13.30 h 14.00 h. Sesin de Psters y Visita a Expositores Comida (En El Restaurante Auditorio)

.14.

15.30 h

Presentaciones Orales: Psters seleccionados II Influencia de Penicillium chrysogenum y Debaryomyces hansenii en la generacin de compuestos voltiles en jamn curado Alberto Martn, J.J. Crdoba, M.J. Benito, M. Alonso y M.A. Asensio Efecto de la competicin fngica en la colonizacin de granos de maz por Fusarium moniliforme, F. proliferatum y F. graminearum y en la produccin de fumonisina b, y de zearalenona Andrea Velluti, S. Marn, L. Bettucci, A. Ramos y V. Sanchis. Combinacin de bacteriocinas y cepas de Lactobacillus plantarum productoras de bacteriocinas en la fermentacin y conservacin de zanahorias Rufino Jimnez Daz, B. Floriano, A. Maldonado, L. Rejano, A.H. Snchez y J.L. Ruiz Caracterizacin de la respuesta al estrs por fro en cepas de levadura de panadera Sonia Rodrguez-Vargas, F. Randez-Gil y F. Estruch Desarrollo de una tcnica impedanciomtrica para la deteccin de residuos de antibiticos en carnes Manuel Lpez-Cabanillas, A.X. Roig Sagus y J.J. Rodrguez Jerez Desarrollo de un sistema para la generacin de bacterias del cido lctico recombinantes de grado alimentario Miguel A. Alvarez, M.C. Martn y J.E. Surez

17.30 h

Sesin de psters y Visita a Expositores (Responsables de psters con nmero par deben situarse a pie de pster) Conferencia de Clausura: Del laboratorio a la empresa: un ejemplo de transferencia de tecnologa Prof. Dra. Silvia Gonzlez Cienfuegos (CERELA, S.M. Tucumn, Argentina) Acto de Clausura: Sntesis y Perspectivas Dr. Juan A. Ordez Pereda (Presidente del Grupo Especializado de Microbiologa de los Alimentos de la SEM) Retirada de psters Cena de Congreso: Hotel-Restaurante La Gruta

18.00 h

19.00 h

19.30 h 21.30 h

.15.

.16.

CONFERENCIA INAUGURAL
Moderador: Dr. Juan Evaristo Surez Fernndez

.17.

.18.

AVANCES EN LA MICROBIOLOGA DE LEVADURAS VNICAS.

DANIEL RAMN Departamento de Biotecnologa; Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos; Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. 46100-Valencia, Espaa Para cualquier microbilogo el nombre de Louis Pasteur evoca un tiempo glorioso, quizs romntico, pero sin duda apasionante, de la historia de nuestra disciplina cientfica. Para aquellos que trabajamos en microbiologa enolgica aun ms, ya que fue l quin estableci las bases microbiolgicas de la fermentacin alcohlica, orientando definitivamente sus trabajos a travs de dicho estudio hacia las ciencias de la vida. Han pasado ms de cien aos, una buena parte de los cuales han sido cientficamente baldos. Sorprendentemente, los ltimos diez aos han dado lugar a avances considerables, obtenidos en buena medida gracias a la aplicacin de tcnicas de biologa molecular. Nuestro pas ha tenido un papel relevante en dichos trabajos, y nuestro grupo ha tenido la fortuna de poder participar en algunas de estas investigaciones. A lo largo de esta comunicacin pretendo repasar los distintos focos de investigacin en microbiologa de levaduras vnicas, prestando especial atencin a aquellos en los que la participacin hispana ha sido ms intensa. Construir la casa desde los cimientos: la seleccin de levaduras vnicas. La transformacin del mosto en vino es una reaccin microbiolgica que conlleva el desarrollo secuencial de varias cepas de levaduras y bacterias cido lcticas. Tradicionalmente los vinos se han producido mediante fermentaciones naturales llevadas a cabo por levaduras provenientes de las uvas y las bodegas. Las especies predominantes en la superficie del grano de uva son miembros de los gneros Kloeckera y Hanseniospora pero en el mosto inicial tambin es posible detectar especies de Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia y Rhodotura. Tras tres o cuatro das de fermentacin Saccharomyces cerevisiae comienza a predominar y es la especie responsable de la fermentacin alcohlica durante el proceso de vinificacin. Son numerosos los estudios, en nuestro pas y fuera del mismo, que han demostrado una gran variabilidad en la cantidad y distribucin de especies microbianas en los granos de uva. Estas variaciones se deben a las condiciones climatolgicas, la variedad de uva y el grado de maduracin de la misma, el uso de fungicidas y el dao fsico de los granos durante la recogida. Las diferencias entre la microbiota de los mostos son claras, tanto cuando se comparan mostos de diferentes regiones como cuando se comparan diferentes cosechas en la misma zona. Por todo ello los bodegueros han comenzado a usar durante los ltimos aos cultivos de levaduras vnicas aisladas de su zona. Estos cultivos se usan en forma de levaduras secas seleccionadas que se inoculan en el mosto para llevar a cabo una fermentacin controlada. El resultado es un vino, campaa tras campaa, con unas propiedades enolgicas repetitivas tpicas de la D.O. La seleccin de dichas levaduras se basa en diferentes criterios. Como un ejemplo podemos mencionar la seleccin por parte de nuestro grupo de una levadura de los mostos de la D.O. Alicante usando un esquema de seleccin basado en: i) la produccin de factor killer, ii) el perfil de fermentacin, y iii) el anlisis sensorial de los vinos producidos. En muchas D.O. espaolas se han llevado a cabo esquemas de seleccin similares y, como consecuencia de ello, se dispone de muchas levaduras vnicas aisladas de distintas D.O. espaolas. Este tesoro biolgico se encuentra en nuestra opinin demasiado disperso, y resultara de extraordinario inters cientfico localizar todos estos aislados en la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). En este sentido resulta importante destacar el reciente acuerdo CSIC-Universitat de Valncia, por el que a travs de un proyecto FEDER la coleccin de levaduras industriales del Instituto de Fermentaciones Industriales del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC) est siendo reordenada y replicada en la CECT.

.19.

Marcando cepas: utilizacin de las tcnicas de biologa molecular para la taxonoma de las levaduras vnicas y el estudio de la dinmica poblacional de las fermentaciones vnicas. La identificacin de levaduras vnicas es importante por dos razones. Por un lado para facilitar el control de calidad durante la produccin de las levaduras secas, y por otro para garantizar la imposicin de la levadura inoculada. La mayora de levaduras vnicas pertenecen a la especie S. cerevisiae y no pueden ser diferenciadas entre ellas por tcnicas microbiolgicas convencionales. Por ello se han empleado distintas tcnicas moleculares para llevar a cabo su identificacin. Esta tcnicas incluyen entre otras la hibridacin DNA-DNA, el anlisis de cariotipos, el anlisis de restriccin del DNA mitocondrial (mtDNA) y el anlisis de polimorfismos por PCR. Se han llevado a cabo estudios comparativos entre estos mtodos que demuestran que el anlisis del mtDNA es una opcin excelente dada su relativa simplicidad, costo y disponibilidad tcnica. En parte, la opcin del anlisis del mtDNA ha venido mediada por el desarrollo de mtodos simplificados capaces de diferenciar cepas de S. cerevisiae extraidas del mismo mosto. Usando dicho mtodo se han estudiado las dinmicas poblacionales de fermentaciones vnicas naturales e inoculadas. En estos trabajos se ha podido demostrar que en un mosto inicial conviven decenas de cepas de la especie S. cerevisiae pero slo unas pocas de ellas llegan a alcanzar niveles significativos durante la fermentacin. En otras palabras, el mosto es un reservorio natural de cepas de la especie S. cerevisiae pero hacer vino es el trabajo de tan slo algunas de ellas. En fermentaciones naturales se pueden detectar dos situaciones. Si el perfil de mtDNA entre las cepas iniciales es muy distinto (comparten pocos fragmentos de restriccin) se observa una sustitucin de las especies predominantes durante la vinificacin. Si por el contrario es alto, aunque se detectan sustituciones secundarias se puede observar la imposicin de una de las cepas. En las fermentaciones inoculadas la levadura sembrada se impone a lo largo de la fermentacin, pero lo hace sin suprimir el desarrollo de las levaduras oxidativas y apiculadas durante los primeros das de fermentacin, de forma que estos microorganismos pueden ejercer su accin beneficiosa en el aroma de los caldos finales. Estos resultados suponen un avance considerable en la comprensin de la dinmica poblacional de las fermentaciones microbianas y hubieran sido imposibles de conseguir sin el concurso de las tcnicas moleculares. El resto de tcnicas enumeradas anteriormente han sido, y son, utilizadas intensamente para el marcaje de levaduras. Su uso ha permitido establecer casos de fraudes en la venta de levaduras vnicas comerciales. Es importante destacar que nuestro pas se ha destacado en el empleo de las mismas. La aplicacin de la tcnica de anlisis del mtDNA en el esclarecimiento de la taxonoma de levaduras vnicas (estudios sobre el complejo Saccharomyces sensu stricto o clasificacin de levaduras oxidativas y apiculadas de comienzo de fermentacin) ha sido una constante de trabajo en el Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (CSIC) en colaboracin con la CECT. Dicho grupo ha transferido esta tecnologa a varias bodegas espaolas como Miguel Torres S.A. o Bodegas Torre Oria. Utilizando esta misma tcnica, el grupo del Departamento de Gentica de la Universidad de Sevilla ha realizado un estudio exhaustivo de las levaduras responsables de la crianza biolgica de los vinos finos de Jerez, correlacionando dichos aspectos moleculares con aspectos fisiolgicos. En una interesante colaboracin entre el Centro de Investigacin y Desarrollo del CSIC en Barcelona y las bodegas Ramn Nadal del Peneds, se ha llevado a cabo un trabajo similar, correlacionando en este caso los perfiles de mtDNA de distintas levaduras de cava con sus distintas propiedades fisilogicas. Asimismo el grupo del Departamento de Microbiologa de la Universitat Rovira i Virgili de Tarragona ha realizado un estudio molecular exhaustivo de las levaduras aisladas de vinos catalanes. La tcnica de electroforesis en campo pulsante ha sido usada por varios grupos espaoles, entre otros los anteriormente mencionados de la Universidad de Sevilla, la CECT y el IATA de Valencia, para estudiar las dotaciones cromosmicas de las levaduras vnicas pertecientes a denominaciones de origen espaolas. Tambin el grupo del Departamento de Microbiologa de la Universidad de Crdoba ha utilizado esta tcnica para diferenciar levaduras aisladas de la zona de Montilla-Moriles. El limitado poder de resolucin de esta tcnica en el caso de las levaduras vnicas, as como su tediosidad, ha hecho que su prctica haya cado en desuso frente a la tcnica del mtDNA. Varios grupos espaoles han usado diversas modalidades de la tcnica de PCR, en particular la denominada PCR-RAPD, para diferenciar distintas cepas de levaduras vnicas. Por ejemplo, el grupo de la Universidad de

.20.

Castilla-La Mancha la ha utilizado con xito para diferenciar distintos aislados de la zona de Valdepeas. Tambin lo ha utilizado el grupo del Departamento de Microbiologa de la Universidad Politcnica de Madrid y el grupo del Centro de Investigacin y Desarrollo Agroalimentario de Murcia. Es interesante destacar el desarrollo de un mtodo de nested PCR por parte del grupo del departamento de Gentica de la Universidad de Mlaga y bodegas Osborne que permite la deteccin rpida y fiable de mnimas contaminaciones por Dekkera y Brettanomyces en sherry. En resumen, gracias al empleo de tcnicas moleculares el conocimiento de la microbiologa vnica ha avanzado considerablemente en nuestro pas durante los ltimos aos. Diseo racional de leveaduras vnicas: aplicacin de tcnicas de Ingeniera gentica. El uso de levaduras inoculadas y la demostracin formal mediante tcnicas moleculares de su imposicin, junto con los avances en biotecnologa, abren la puerta a la modificacin gentica de las levaduras vnicas. Es posible construir cepas que expresen actividades metablicas de inters que ejerzan efectos beneficiosos en las caractersticas organolpticas de los vinos. La modificacin gentica de las levaduras vnicas exige conocer promotores de genes de levaduras que se expresen especficamente durante determinados tiempos de la fermentacin. Por ello nuestro grupo inici proyectos encaminados a entender la regulacin de la expresin gnica en S. cerevisiae durante la vinificacin. En la actualidad se dispone de varios promotores que se inducen especficamente durante la fase logartmica o la fase estacionaria de vinificacin. En este apartado de herramientas tambin merece la pena destacar que en nuestro grupo se han desarrollado protocolos de transformacin para las levaduras vnicas que rinden levaduras recombinantes GRAS (generally recognized as safe). Con estas herramientas hemos construido levaduras vnicas transgnicas que expresan genes que codifican celulasas y hemicelulasas. La adicin de estos enzimas para solventar problemas de filtracin o incrementar aromas afrutados es una prctica habitual en las bodegas, pero la heterogeneidad de las preparaciones comerciales (una mezcla de enzimas que vara de lote a lote) ha hecho de su uso algo impredecible. Nuestro grupo ha construido diversas levaduras vnicas recombinantes que contienen genes de hongos filamentosos que codifican -Larabinofuranosidasa, -glucosidasas, endo--(1,4)-glucanasas, ramnosidasas o endo--(1,4)xilanasas. Todas estas levaduras son capaces de secretar los enzimas correspondientes al mosto en cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnolgico y producir vino con adecuadas caractersticas organolpticas. Estas cepas pueden ser usadas como herramientas para investigar el papel individual de cada enzima con el objetivo final de construir una cepa de hongo filamentoso capaz de secretar al medio de cultivo la combinacin adecuada de enzimas. Tambin se ha construido una levadura transgnica que contiene un gen fngico que codifica una pectato liasa para solventar problemas de filtracin y disponemos de levaduras transgnicas que influyen en el color del vino, presentan nuevos perfiles de polisacridos de reserva o incrementan los niveles de resveratrol. No somos el nico grupo trabajando en Espaa en estos temas. El grupo del Departamento de Microbiologa de la Universidad de Santiago ha clonado y secuenciado el gen FLO2 implicado en la floculacin. El producto de este gen activa los genes FLO1 del brazo derecho del cromosoma I e incluso de pseudogenes semejantes a FLO1. Este mismo grupo ha clonado un gen de Saccharomyces cerevisiae denominado GU1 que codifica una endopoligalacturonasa. Conclusiones. Asistimos al comienzo de una nueva era en microbiologa enolgica. La OIV (Office International de la Vigen et du Vin) empieza a discutir el uso de levaduras transgnicas en la produccin de vinos. Durante los primeros aos de nuestro trabajo omos crticas constantes a nuestro trabajo: era ciencia bsica, no se podra aplicar a ningn problema tecnolgico. Fue Pasteur quin dijo que no haba ms que un tipo de ciencia, y que de la buena ciencia (la nica)

.21.

surgan las aplicaciones. Son varias las bodegas espaolas que comienzan a usar estas tcnicas. Los resultados que se han obtenido hasta ahora son significativos, probablemente inesperados cinco aos atrs. Puede la enologa cerrar los ojos a esta revolucin?. Agradecimientos El autor quiere dedicar esta Conferencia Inaugural al Dr. Rafael Vila que hasta fechas recientes fu responsable de la microbiologa clsica en el IATA. El autor agradece a todos los miembros de su grupo el entusiasmo, la cooperacin y, sobre todo, la amistad en el trabajo que da a da entre todos han creado en el laboratorio. Las investigaciones del grupo han sido subvencionadas por ayudas de la Generalitat Valenciana, la CICYT y la D.G. XII de la UE.

.22.

MESA REDONDA I
Procesos fermentativos en alimentos
Moderadora: Dra. Aida Pesce de Ruiz Holgado

.23.

.24.

GENETICALLY IMPROVED STARTER STRAINS: OPPORTUNITIES FOR THE DAIRY INDUSTRY

BEAT MOLLET Nestl Research Center, Nestec Ltd., Vers-chez-les-Blanc, 1000 Lausanne 26, Switzerland Abstract Milk can be fermented in a variety of different products varying in appearance, flavor, texture and health beneficial properties. The art of producing such different products is based on different technologies and in the selection of the lactic acid bacteria used in the fermentation process. The emergence of modern biotechnology with molecular biology and genetics as new technological tools advanced molecular selection procedures to allow screening of thousands of natural strains and mutants, and to improve strains by direct genetic engineering. This article illustrates examples of both applications in starter strain development for dairy fermentations. Furthermore, it partitions the nature of genetic modifications into three groups: i) one-step genetic events like deletions, gene amplifications, plasmid insertions or losses; ii) multi-step genetic rearrangements with DNA of a same species; and iii) trans-species genetic modifications. The nature of the genetic alteration has an impact for the safety assessment and legal implications in different countries. Introduction From the enormous variety of food preservation processes by lactic acid bacteria, the fermentation of milk is probably the best-studied and advanced example. Milk can be fermented into a variety of different products, varying in appearance, flavor, texture and health beneficial properties. The art of producing such products is based on the different technologies and on the selection of specific bacterial starter cultures; from using remains of fermented milk of the former day to the use of sophisticated starter strains which arrive to the factory in frozen or freeze dried form. Over the last decades, more and more defined starter cultures were selected and developed for specific product and quality ranges. Many of these strains are now available and commercialized by specialized culture producing companies. It is a necessity for the food companies to further distinguish their products by superior quality and taste, and by offering innovative new products satisfying the consumer needs. Hence, food companies started to develop their proprietary starter cultures for the preparation for their own fermented dairy products. The new age of strain development In earlier times, once the importance of lactic acid bacteria had been recognized for the fermentation process, starter strains were selected and combined by trial and error. Today, the dairy industry disposes of a modern microbiology, including an analytical biochemistry and fermentation technology. Furthermore, the emergence of molecular biology and gene technology has enabled a more thorough investigation and understanding of the role of lactic acid bacteria in the transformation of milk to cheese and yogurt products. Technological aspects like fermentation and storage conditions, influences on taste and texture, as well as health and nutritional effects of the lactic acid bacteria are becoming comprehensible in molecular terms. Thus, molecular biology fostered the development of genetically based selection tools to specifically screen among hundreds or thousands of natural lactic acid bacteria strains or mutants to look for the one(s) with the exact correct requirement. In this way identified strains have been selected but not modified by modern gene technology. Further advancements in molecular biology of lactic acid bacteria, however, gave rise to genetic tools to isolate, modify and re-introduce genes into a variety of different strains. Thus, it became feasible to genetically alter some specific traits of a starter strain, or to transfer them to

.25.

another, more preferable strain for a specific application. In most cases, this technology allows a much more precise and directed development of the starter strains, leading e.g. to technologically high performing strains with at the same time excellent organoleptic characteristics. Furthermore, this technology also opens doors to real product innovations which would be very difficult, or even impossible, to achieve with classical techniques. A priori, such newly developed strains have to be considered as genetically engineered because a part of their genetic make-up, as small as it may be, has been altered by a direct human intervention. However, from a safety and a food legislative point of view, it is appropriate to differentiate between the extent and the nature of the genetic modifications introduced. An earlier work on the advance of modern starter strain development already proposed to distinguish between strictly homologous, quasi-homologous and heterologous applications of gene technology for food microorganisms (Niederberger, 1989). Similarly, I will partition the different kinds of genetic modifications feasible and of potential industrial applicability into three groups. - The first group comprises genetic modifications, which could also be found spontaneously in nature and are due to a one-step genetic recombination, transformation, segregation or mutation event. Such modifications include simple genetic deletions, gene amplifications, insertions or loss of a plasmid. Principally, the same appropriate mutation can be found in nature, but a classical screening to find such a spontaneous mutation may be difficult because of e.g. inappropriate selection tools. - The second group comprises more complex genetic modifications rearranging various parts of the genetic information of a strain, by e.g. multiple rearrangements of the DNA of a specific strain, or introducting and expressing gene(s) from another strain of a same species. Such modifications can be found in nature and are part of the natural evolution process of lactic acid bacteria. However, a direct selection to find such a genetic modification spontaneously may be impossible, or at least very difficult and time consuming. - The third group describes genetic modifications implicating trans-species translocations of genetic information. This may be genes or control signals exchanged between different lactic acid bacteria species, or deriving from other food-grade microorganisms like some Bacilli, yeasts or moulds. Although horizontal gene transfer between microorganisms is well documented, one can not expect to find such a desired modified strain spontaneously in nature. In the following chapters, I will present examples for the individual groups of genetic alterations in lactic acid bacteria. The first chapter demonstrates the occurrence of a natural genetic modification, spontaneously selected from nature, and which already found its way into commercial production and onto the product shelves in European super-markets. Spontaneous genetic deletion for a mild, shelf-stable yogurt Yogurt results from growth association between Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus. They grow together in milk where they ferment lactose to lactate and lower the pH from neutral to about 4.5 - 4.2. Upon storage of the final product at 4 - 12 C for several days (in the supermarkets or at the consumers home), the pH of the yogurt may drop further to values below 4.0. This post-acidification leads to a gradually increasing acid and bitter taste of the yogurt, thus degrading the initial organoleptic quality of the product. S. thermophilus ferments milk into a mild but non aromatic product. It is L. bulgaricus which mostly contributes to the typical yogurt flavor and lowers the pH to values below 4.2 (Oberman, 1985). The approach to limit post-acidification and still produce the yogurt flavor was to regulate growth and maintenance of L. bulgaricus by controlling its energy metabolism. Hence, L. bulgaricus starter strains were screened for the presence of spontaneous Lac minus mutants, having no or reduced residual -galactosidase activity. Mutants were identified having genetic deletions within the -galactosidase gene (lacZ) or expanding beyond the lac region, thereby inactivating a further gene vital for growth in milk, encoding the cell wall bound proteinase (Mollet and Delley, 1990; Germond et al., 1995). Such Lac minus and Lac-Prt minus mutants were not able to grow in milk as single-strain cultures without the supplementation of

.26.

glucose and peptones. However, if grown in mixed cultures together with a lactose fermenting S. thermophilus strain, Lac minus L. bulgaricus strains were able to grow in spite of the absence of glucose. Hence, S. thermophilus provides the mutant L. bulgaricus strains with the necessary energy to propagate in milk. Once the fermentation process has been terminated, growth and lactose metabolism of S. thermophilus and L. bulgaricus cease, resulting in a mild, non postacidifying yogurt product. Such products have been shown to keep their mild taste and organoleptic properties for more than 6 months stored at 4C (Mollet, 1996). Genetic deletion for an improved clinical probiotic product Lactobacillus johnsonii La1 is a probiotic lactic acid bacterium commercialized in many countries as part of a mixed cultured fermented milk. It has intensively been investigated in clinical-nutritional studies for its health beneficial effects, i.e. survival in the gastrointestinal tract and positive immuno-modulating effect of the host (Brassart and Schiffrin, 1997; Link-Amster et al., 1994; Schiffrin et al., 1995). La1 is cultured in milk, where it ferments lactose to a racemic mixture of D- and L-lactate in a ca. 60:40% ratio. As with standard yogurt products, the presence of D-lactate in the La1 containing milk product and the capacity of the strain to produce Dlactate after ingestion does not pose an adverse effect for the vast majority of the adult population. Nevertheless, it is documented that D-lactate producing colonizing intestinal lactobacilli are a main factor in the pathogenesis of D-lactic acidosis and encephalopathy of patients suffering from short bowel syndrome and intestinal failures (Bongaerts et al., 1995; Hudson et al., 1990; Scully et al., 1989). In view of the probiotic and immuno-defense stimulating effects of L. johnsonii La1, a non-D-lactate-producing variant would help these patients in reconstituting their intestinal micro-flora after e.g. an antibiotic treatment. Another application of a non-D-lactate producing La1 strain would be in the nutrition of infants for building-up and regulating their intestinal flora. Because of liver immaturity, newborn infants fail to completely metabolize ingested or in situ produced D-lactate and, hence, the WHO does not recommend its use for infant products (F.A.O./O.M.S. 1967; 1974). Lactic acid is formed via reduction of pyruvate by lactate dehydrogenase (LDH) for the regeneration of NAD+. Thereby, the two isomeric forms of lactate, D(-) and L(+), are formed by distinct stereospecific NAD-dependent LDHs. Recently, the gene encoding the D-lactate dehydrogenase (ldhD) of L. johnsonii has been identified and isolated (Lapierre et al., personal communication). A small in vitro generated deletion was introduced into the coding ldhD sequence, thus inactivating the functionality of the gene. The copy of this truncated gene was then used to genetically replace the genomically located original ldhD gene of La1. The experiment was designed in such a way that at the end of the procedure no DNA fragments deriving from the plasmid vectors or the antibiotic resistance markers used in the constructions were still present in La1. Thus, the new construct is equivalent to La1 with the exception of a small DNA fragment missing within the ldhD gene. It was also shown that this new strain effectively re-routes pyruvate to L-lactate, and does not produce D-lactate anymore (Lapierre et al., personal communication). This technology to inactivate the ldhD gene rather than a screening for a spontaneous deletion event at this locus was chosen because the presence (and necessity) of a functional L-lactate dehydrogenase gene makes an effective selection procedure very difficult. Very important as well is the fact that the use of a targeted gene disruption versus a screening procedure for induced or spontaneous mutations prevents the accumulation of numerous uncharacterized mutations all over the bacterial genome. This adds to the safety aspect of the technology and better guarantees the preservation of the desired health beneficial character of the strain.

Transfer of the exo-cellular polysaccharide gene-cluster for a creamier yogurt Over the past ten years, consumer preferences in the yogurt market have moved towards sweeter, thicker yogurt with a low or no fat content. Increasing thickening properties of the yogurt are required to compensate for the lower fat content. This could be achieved by adding

.27.

stabilizers, gums, pectins or starch. However, the use of exocellular polysaccharide ("slime") producing bacteria for the fermentation process satisfies much better the market need for "natural" products and the legal definition of yogurt in some European countries (e.g. Holland, France). The use of exocellular polysaccharides (EPS) producing strains increases the viscosity of yogurt and decreases susceptibility to syneresis. A significant characteristic, and problem for the yogurt industry, is the instability of the slimy property. Often, the spontaneous loss of the EPS producing ability of lactic acid bacteria has been related to the involvement and instability of plasmid encoded genes (Neve et al., 1988; Vescovo et al., 1989). However, this seems not to be true for the thermophilic bacteria like Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus, which often do not contain plasmids. The structure of several of the EPS produced by thermophilic lactic acid bacteria have been determined and revealed their nature as heteropolysaccharides (Doco et al., 1990; Gruter et al., 1993; Yamamoto et al., 1994; Lemoine et al., 1997). By taking advantage of an agar plate assay, containing ruthenium-red, colonies of EPS and non-EPS producing yogurt bacteria can be differentiated and genetic experimentation became practicable (Stingele and Mollet, 1995). Today, several genetic clusters involved in EPS synthesis and secretion have been identified from ropy starter strains and genetic transfers of the EPS character between different starter strains has been documented (Stingele et al., 1996; Griffin et al., 1996; Van Kranenburg et al., 1997). In this way it becomes now feasible to transfer a good texturing property of a selected EPS producing strain to another, non-EPS producer but industrially or organoleptically more interesting starter strain. Furthermore, the knowledge of the functions of the different glycosyltransferases encoded by the gene clusters in the generation of the heteropolysaccharide structures would allow to modify existing EPS structures, and ultimately to design novel EPS with new sugar compositions and ordering of the sugar moieties. Such genetic transfers and modifications could be achieved by exchanging DNA between strains of a same species, with omitting all vector and marker genes used in the genetic shaping of the strain. Metabolic engineering of lactic acid bacteria to produce L-alanine instead of lactate Lactic acid bacteria are used in the dairy industry primarily for their role to convert lactose to lactic acid in order to acidify and preserve the raw material milk. Thereby, depending on the starter strains and process technology used, different products are obtained varying in flavor and texture. In the recent past, consumer preferences in the yogurt and acidified milk market have moved towards milder and sweeter products. Furthermore, the market place on cheese products is very multifarious and competitive, and producers are looking for new strains to differentiate their products. Hence, it would be interesting to evaluate and develop novel starter strains giving new flavor characteristics to the fermented products. In the last few years, progress has been achieved in understanding the lactose metabolism of different lactic acid bacteria and the generation of flavors related to the secondary endproducts deviating from this pathway (Snoep et al., 1992; Platteeuw et al., 1995; de Vos, 1996; Ferain et al., 1996; Goupil et al., 1996; Swindell et al., 1996). One of the best-studied species is Lactococcus lactis, which displays a simple fermentation metabolism where lactose or glucose is mainly converted to L-lactate. The last step in this metabolism is conducted by the L-lactate dehydrogenase, converting pyruvate to L-lactate. To re-route pyruvate to L-alanine, the L-alanine dehydrogenase gene (alaDH) of a Bacillus species, unrelated to lactic acid bacteria, has been cloned and over-expressed in L. lactis (Hols et al., 1999). For controlled expression of the alaDH, the gene was linked to a nisin inducible, food-grade promoter system (de Ruyter et al., 1996; Kuipers et al., 1997). Thereby, it was possible to re-direct ca. 1/3 of the total carbon flux of L. lactis to generate and secrete alanine instead of L-lactate. Further improvements of the strain by inactivation of the residual L-lactate dehydrogenase as well as the alanine racemase genes resulted finally in a strain converting sugar stoichiometrically to L-alanine. The efficiency of this bioconversion process was reported to reach 99% (Hols et al., 1999). The use of such a L. lactis biocatalyst for converting cheap sugars into stereospecific L-alanine opens interesting perspectives for producing amino acids in a food micro-organism for applications in food.

.28.

Furthermore, it is becoming feasible to genetically engineer for example one of the yogurt starter strains in such a way that it produces L-alanine during the production process, instead of lactate. Thus, by optimally pairing lactate and alanine producing strains, yogurt products with a sweet alanine taste can be produced. This example shows a quite complex genetic construct in L. lactis, importing and expressing a gene, the alaDH, not naturally found in lactic acid bacteria. It also shows the potential of using trans-species genetic engineering in developing novel starter strains for fermentation processes, demonstrating real product innovations. Conclusions The above mentioned examples illustrate the vast potential lactic acid bacteria bear for todays and tomorrows applications in different domains of the dairy industry. They will continue to play an important role for the fermentation processes of a variety of different food products by contributing to their conservation, flavor development, texture and health beneficial properties. They will also be used increasingly as a natural source for food ingredients and additives to non-fermented products to accomplish for example organoleptic, texturing or probiotic purposes. The progress in molecular biology and genetic engineering will further broaden the possibilities of using lactic acid bacteria in food and may allow in the future to improve existing products and to develop novel products and applications. Lactic acid bacteria have a history of safe use in fermented food products. They are considered as non-toxic and have never been identified as causative agents in disease or infections. Nevertheless, all newly isolated or genetically altered lactic acid bacteria and their produced fermented food have to be carefully evaluated for their harmlessness to the consumer and the environment. They are subjected to stringent safety and regulatory procedures in the same way, as do all new food products, which are commercialized and sold to the consumer. In fact, it was only with the help of molecular biology that it became possible to correctly classify and group the diverse species of the lactic acid bacteria to better identify their origins, their natural habitats and dissemination in nature and in the intestines of humans and animals. This knowledge and the possibility to trace individual strains all along the food chain and the digestive tract further contributes to a better evaluation of potential risk factors and finally add to a better confidence and safety. An intelligent, responsible development and use of genetically improved microorganisms will lead us into the new millenium and will bring exiting new food products to the consumers. Acknowledgments: I am very gratefull to P. Niederberger and A. Constable for the valuable discussions and critical reading of the manuscript.
References: Bongaerts, G., Tolboom, J., Naber, T., Bakkeren, J., Severijnen, R., and Willems, H. (1995) D-lactic acidemia and aciduria in pediatric and adult patients with short bowel syndrome. Clinical Chemistry 41, 107-110. Brassart, D., and Schiffrin, E.J. (1997) The use of probiotics to reinforce mucosal defence mechanisms. Trends in Food Science and Technology 8, 321-326. de Ruyter, P.G.G.A., Kuipers, O.P. and de Vos, W.M. (1996) Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Applied and Environmental Microbiology 62, 3662-3667. de Vos, W.M. (1996) Metabolic engineering of sugar catabolism in lactic acid bacteria. Antonine van Leeuwenhoek 70, 223-242. Doco, T., Wieruszeski, J.-M., and Fournet, B. (1990) Structure of an exocellular polysaccharide produced by Streptococcus thermophilus. Carbohydrate Research 198, 313-321.

.29.

F.A.O./O.M.S. (1967) Normes didentit et de puret et valuation toxicologique des additifs alimentaires : divers mulsifiants et stabilisants et certaines autres substances. Dixime rapport du Comit Mixte F.A.O/O.M.S dExperts des Additifs Alimentaires. Organisation Mondiale de la Sant Srie de Rapports Technniques No. 373. F.A.O./O.M.S. (1974) Evaluation toxicologique de certains additifs alimentaires. Examen des principes gnraux et des normes. Dix-septime rapport du Comit Mixte F.A.O./O.M.S dExperts des Additifs Alimentaires. Organisation Mondiale de la Sant Srie de Rapports Technniques No.539. Ferain, T., Schanck, A.N. and Delcour, J. (1996) 13C nuclear magnetic resonance analysis of glucose and citrate end products in a ldhL-ldhD double knockout strain of Lactobacillus plantarum. Applied and Environmental Microbiology 178, 7311-7315. Germond, J.-E., Lapierre, L., Delley, M. and Mollet, B. (1995) A new mobile genetic element in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Molecular General Genetics 248, 407-416. Goupil, N., Corthier, G., Ehrlich, S.D. and Renault, P. (1996) Imbalance of leucine flux in Lactococcus lactis and its use for the isolation of diacetyl-overproducing strains. Applied and Environmental Microbiology 62, 2636-2640. Griffin, A.M., Morris, V.J., and Gasson, M.J. (1996) The cpsABCDE genes involved in polysaccharide production in Streptococcus salivarius ssp. thermophilus strain NCBF 2393. Gene 183, 23-27. Gruter, M., Leeflang, B.R., Kuiper, J., Kamerling, J.P. and Vliegenthart F.G. (1993) Structural characterisation of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus rr grown in skimmed milk. Carbohydrate Research 239, 209-226. Hols, P., Kleerebezem, M., Schank, A.N., Ferain, T., Hugenholtz, J., Delcour, J. and de Vos, W.M. (1999) Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering. Nature Biotechnology, in press. Hudson, M., Pocknee, R., and Mowat, N.A. (1990) D-lactic acidosis in short bowel syndrome an examination of possible mechanisms. Quarterly Journal of Medicine 74, 157-163. Kuipers, O.P., de Ruyter, P.G.G.A., Kleerebezem, M. and de Vos, W.M. (1997) Controlled overexpression of proteins by lactic acid bacteria. Trends in Biotechnology 15, 135-140. Lapierre, L., Germond, J.E., Ott, A., Delley, M. and Mollet, B. personal communication. Lemoine, J., Chirat, F., Wieruszeski, J.-M., Strecker, G., Favre, N., and Neeser, J.-R. (1997) Structural characterization of the exocellular polysaccharides produced by Streptococcus thermophilus Sfi39 and Sfi12, Applied and Environmental Microbiology 63, 3512-3518. Link-Amster, H., Rochat, F., Saudan, K.Y., Mignot, O., and Aeschlimann, J.M. (1994) Modulation of a specific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through fermented milk intake. FEMS Immunology and Medical Microbiology 10, 55-64. Mollet, B. (1996) New technologies in fermented milk. Cerevisia 21, 63-65. Mollet, B. and Delley, M. (1990) Spontaneous deletion formation within the -galactosidase gene of Lactobacillus bulgaricus. Journal of Bacteriology 172, 5670-5676. Neve, H., Geis, A. and Teuber, M. (1988) Plasmid encoded functions of ropy lactic strains from Scandinavian fermented milk. Biochimie 70, 437-442. Niederberger, P. (1990) Use of microorganisms in food manufacture. In: Proceedings from the European Forum on risk management in biotechnology. Defaye, J., de Roissart, H. and Vignais, P.M. (Eds.), Lavoisier, Paris, France. Oberman, H. (1985) Fermented milks. In: Microbiology of fermented foods. Vol. 1, Wood, B.J.B. (Ed.), Elsevier applied science publishers, New York, pp. 167-194. Platteeuw, C., Hugenholtz, J., Starrenburg, M., Alen-Boerrigter, I. and de Vos, W. (1995) Metabolic engineering of Lactococcus lactis: influence of the overproduction of -acetolactate synthase in strains deficient in lactate dehydrogenase as a function of culture conditions. Applied and Environmental Microbiology 61 , 3967-3971. Schiffrin, E.J., Rochat, F., Link-Amster, H., Aeschlimann, J.M., and Donnet-Hugues, A. (1995) Immunomodulation of human blood cells following the ingestion of lactic acid bacteria. Journal of Dairy Science 78, 491-497. Scully, T.B., Kraft, S.C., Carr, W.C., and Harig, J.M. (1989) D-lactate-associated encephalopathy after massive small-bowel resection. Journal of Clinical Gastroenterology 11, 448-451. Snoep, J.L, de Mattos, M.J.T., Starrenburg, M.J.C. and Hugenholtz, J. (1992) Isolation, characterization, and physiological role of the pyruvate dehydrogenase complex and -acetolactate synthase of Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis. Journal of Bacteriology 174, 4838-4841. Stingele, F. and Mollet, B. (1995) Homologous integration and transposition to identify genes involved in production of exopolysaccharides in Streptococcus thermophilus. In: Ferretti, J.J., Gilmore, M.S.,

.30.

Klaenhammer, T.R. and Brown, F. (eds.) Genetics of Streptococci, Enterococci and Lactococci, vol. 85, Karger, Basel, Switzerland, pp. 487-493. Stingele, F., Neeser, J.-R., and Mollet, B. (1996) Identification and characterization of the eps (exopolysaccharide) gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6. Journal of Bacteriology 178 , 1680-1690. Swindell, S.R., Benson, K.H., Griffin, H.G., Renault, P., Ehrlich, S.D. and Gasson, M.J. (1996) Genetic manipulation of the pathway for diacetyl metabolism in Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology 62, 2641-2643. Van Kranenburg, R., Marugg, J.D., van Swam, I.I. Willem, N.J., and de Vos, W.M. (1997) Molecular characterization of the plasmid-encoded eps gene cluster essential for exopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis. Molecular Microbiology 24, 387-397. Vescovo, M., Scolari, G.L. and Bottazzi, V. (1989) Plasmid-encoded ropiness production in Lactobacillus casei ssp. casei. Biotechnology Letters 11, 709-712. Yamamoto, Y., Murosaki, S., Yamauchi, R., Kato, K. and Sone, Y. (1994) Structural study on an exocellular polysaccharide produced by Lactobacillus helveticus TY1-2. Carbohydrate Research 261, 67-78.

.31.

.32.

CONTROL DE LA FERMENTACION EN SIDRAS MEDIANTE TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

CARMEN CABRANES Y ROSA PANDO SERIDA. Principado de Asturias, 33300 Villaviciosa, Asturias, Espaa Introduccin Asturias es la comunidad Autnoma que mas volumen de sidra elabora, estimndose la produccin en ms del 60% de la manufacturada a nivel nacional. La elaboracin de sidra tiene una gran relevancia socioeconmica, situndose en el sector agroalimentario asturiano a continuacin del sector lcteo y crnico. La sidra es el producto resultante de la fermentacin del mosto de manzana. Es por ello, que la fermentacin es el proceso fundamental de la manufactura de la sidra; en consecuencia, el correcto control del proceso fermentativo posibilitar la obtencin de productos de una calidad predecible. En el momento actual, la fermentacin es conducida por la microflora indgena que viene incorporada en la materia prima o en los tiles de elaboracin; en consecuencia, no existe un control del proceso fermentativo y es por ello que se viene manufacturando sidra con una gran variabilidad en lo que a su calidad y propiedades organolpticas se refiere; este hecho, es especialmente relevante en el caso de la sidra no sometida a procesos de estabilizacin, como es el caso de la denominada sidra natural. Teniendo en cuenta las necesidades del sector se ha trabajado en los siguientes aspectos relacionados con la fermentacin de la sidra: Seleccin y caracterizacin bioqumica y gentica de una levadura sidrera aislada de mostos y sidras asturianos. Introduccin del denominado carcter killer en el starter seleccionado, dotando de esta forma a la levadura iniciadora de una mayor facilidad para inplantarse en el ecosistema formado por microflora espontnea. Puesta a punto de un mtodo de anlisis rpido y fiable que permita el seguimiento de fermentaciones espontneas e inducidas. Aplicacin al seguimiento de una fermentacin dirigida por el iniciador seleccionado en el Laboratorio. 1. Obtencin de un starter o cultivo iniciador para la induccin de la fermentacin alcohlica. Para seleccionar las levaduras que actualmente utilizamos como iniciadores de la fermentacin se parti del aislamiento, identificacin y caracterizacin bioqumica de ms de mil cepas de levaduras que aislamos de distintos lagares de Asturias y de la bodega piloto del SERIDA. La caracterizacin bioqumica se realiz mediante fermentaciones controladas en fermentadores-reactores de dos litros de capacidad, ensayos que se repitieron en cincuenta litros y, posteriormente, en doscientos cincuenta y mil litros. Como cualquier estudio de este tipo, el trabajo se comenz por un estudio ecolgico que permitiese conocer las especies presentes de forma espontnea en nuestras sidras, la seleccin de distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae y su caracterizacin bioqumica. Para realizar posteriormente microfermentaciones y fermentaciones controladas a distintas escalas. A partir de este trabajo llevado a cabo durante varios aos se seleccion la cepa Saccharomyces cerevisiae C6 depositada en la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, segn el tratado de Budapest con el nmero CECT 11.311.

.33.

Los resultados de esta lnea de trabajo permiten al sector sidrero disponer en el momento actual de un iniciador de la fermentacin, autctono que contribuye a conseguir en los caldos fermentados los aromas y las caractersticas organolpticas propias de nuestras sidras. Los ensayos y fermentaciones llevados a cabo en nuestro llagar piloto junto con los realizados por distintos llagares colaboradores y su utilizacin como remedio de urgencia en refermentaciones encaminadas a corregir alteraciones de sidras de distintos elaboradores nos hacen confiar en su utilidad para el sector. 2. Introduccin del factor killer mediante fusin de protoplatos en Saccharomyces cerevisiae C6. Algunas levaduras poseen una curiosa capacidad para producir toxinas que afectan de forma letal a otras especies e incluso a razas o cepas de su misma especie. Esto les proporciona una ventaja ecolgica en la colonizacin de ecosistemas ricos en nutrientes como los mostos de manzana. Esta circunstancia tiene una aplicacin tecnolgica evidente. Existen distintos tipos de toxinas que se conocen con los nombres de K1, K2, K3. El factor killer estudiado en cepas k1 demostr no ser transmitido de forma Mendeliana. Se transmite en la citoduccin, donde slo hay mezcla del material citoplasmtico. Esta es una caracterstica muy interesante, ya que en la mayor parte de los casos la mezcla de los genomas de la levadura killer y la cepa receptora resulta indeseable. Parece demostrado que los preparados de las toxinas killer pueden proteger al producto en fermentacin de la accin de levaduras salvajes. Nos planteamos como alternativa a la utilizacin de preparados de toxinas la incorporacin del factor killer en nuestra cepa iniciadora Saccharomyces cerevisiae C6, por una tcnica convencional tal como la fusin de protoplastos. Para ello, se realiz una fusin de protoplastos entre una cepa Saccharomyces cerevisiae K1 y nuestra Saccharomyces cerevisiae C6. Los protoplastos son clulas de levaduras a las que se ha tratado con enzimas degradantes de la pared celular tipo zymoliasa o novozyme, y a las que se coloca en un medio isotnico que permita a la clula mantener su estructura. Para conseguir la fusin se obtienen protoplastos de dos cultivos en la fase exponencial de las dos cepas parentales. Estos se lavan, se mezclan en idnticas proporciones y la mezcla de fusin se crece sobre agar de regeneracin con el objeto de recuperar los productos de fusin. Como resultado de esta lnea de trabajo, disponemos en nuestro laboratorio de una cepa iniciadora con capacidad para secretar la toxina K1, si bien es preciso sealar que esta cepa no ha sido probada en fermentaciones controladas. 3. Puesta a punto de un mtodo para el seguimiento de fermentaciones espontneas e inducidas Los mtodos clsicos para distinguir e identificar levaduras, basados en caractersticas morfolgicas de la clula y de la colonia y en pruebas fisiolgicas y bioqumicas nos permiten, con suerte, llegar al nivel de especie o de raza, informacin sta que resulta claramente insuficiente para nuestros fines. Para realizar un control de las fermentaciones debemos de ser capaces de distinguir individuos de la misma especie y raza y para ello resulta extremadamente til la aplicacin de tcnicas de biologa molecular.

.34.

A continuacin expondremos las distintas tcnicas que hemos ensayado para resolver nuestro problema, todas ellas haban sido probadas previamente para levadura enolgicas o cerveceras. A- Anlisis de ADN mitocondrial En realidad la tcnica se basa en una extraccin mas o menos convencional del ADN total de la clula de levadura y el tratamiento posterior del mismo con 2 enzimas de restriccin (Rsa I y Hinf I) que reconocen y cortan un gran nmero de puntos en el DNA nuclear, pero muy pocos en el DNA mitocondrial (2) pudiendo ser estos fragmentos separados posteriormente por una electroforesis en agarosa y visualizados con luz UV despus de haber sido previamente teidos con bromuro de etidio. Aunque la tcnica es buena presenta el inconveniente, al menos en nuestro caso, de ser muy sensible al estado fisiolgico de la clula, provocando esto que su reproducibilidad no sea exactamente del 100% . Otro de sus inconvenientes es comn a otras tcnicas y es el hecho de que sea necesario partir de colonias o clones aislados, lo cual supone que es necesario invertir un tiempo y un trabajo previo en este aislamiento, y el tiempo es obviamente un factor crtico cuando estamos hablando de procesos industriales. De todos formas la tcnica nos permite conocer si el starter aadido esta realmente dirigiendo la fermentacin de la sidra, e incluso el equilibrio y la proporcin de las diferentes especies de levaduras espontneas en 3 das a partir de la toma de muestra. B- Aplicacin de una tcnica de DNA fingerprinting con sonda no radiactiva. De forma abreviada el mtodo consiste en una extraccin de ADN total, el tratamiento y corte del mismo mediante 4 enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII, PstI y SalI) y la separacin de los fragmentos obtenidos mediante la electroforesis en agarosa. Posteriormente los fragmentos obtenidos de DNA se transfieren del gel de agarosa a una membrana de nylon (Southern blotting) . El DNA se fija a la membrana de nylon por UV cross-linking. A continuacin se realiza una hibridacin utilizando una sonda (Ty1-15) marcada con digoxigenina. La sonda se prepara previamente por amplificacin de una secuencia de 1409 pb de Ty1-15 utilizando PCR (la reaccin en cadena de la polimerasa). Los hbridos obtenidos se revelan colorimtricamente empleando un anticuerpo anti-digoxigenina (3). Como es fcil deducir de la descripcin del mtodo, ste es ligeramente ms laborioso que el anterior, y presenta el mismo inconveniente en cuanto al requerimiento de partir de colonias aisladas. Sin embargo, nuestros resultados nos hacen pensar que la tcnica en muy buena para distinguir cepas estrechamente relacionadas procedentes de un nicho ecolgico muy prximo, y por supuesto distingue perfectamente aquellas cepas menos relacionadas. C- Aplicacin de la PCR al control de las fermentaciones. En principio el mtodo presenta la ventaja de no precisar de una purificacin previa del DNA siendo suficiente liberar el material gentico con mtodos fsicos tales como el congelado en nitrgeno lquido con posterior hervido del preparado. Sin

.35.

embargo en la prctica nuestros resultados nos han hecho concluir que los resultados son mucho mejores cuando se ha realizado una purificacin previa del DNA. Los primers o cebadores utilizados fueron dirigidos a las zonas de unin intrn-exn. Los intrones no son esenciales para la expresin de los genes, por lo que han evolucionado con una presin mnima, existiendo zonas muy conservadas (1). Como toda reaccin de PCR precisa para que se produzca de un DNA molde, de uno o mas cebadores, de una mezcla de bases nitrogenadas, una solucin tampn en la que transcurra la reaccin y por supuesto de la DNA polimerasa. El preparado se somete a varios ciclos de amplificacin en un termociclador. Los productos de amplificacin se separan en gel de agarosa mediante electroforesis. Podemos tener resultados a las 48-72 horas. El mtodo es sencillo y reproducible, pero continuamos teniendo el inconveniente del tiempo de respuesta. La solucin a este problema ( en la que se esta trabajando actualmente) pasa por localizar un banda especfica en nuestra Saccharomyces cerevisiae C6 , el aislamiento y secuenciacin de la misma y la preparacin de unos primers especficos que nos permitan distinguir nuestra levadura a partir de extractos crudos de sidra, sin necesidad de realizar un cultivo y aislamiento previo de las colonias. 4- Aplicacin de la PCR al seguimiento de una fermentacin inducida Para llevar a cabo el seguimiento de cuatro toneles inoculados con la cepa Saccharomyces cerevisiae C6, se realizaron muestreos sucesivos en cinco etapas del proceso de elaboracin, coincidiendo el primero de ellos con el momento previo a la inoculacin de la cepa iniciadora Los resultados obtenidos hacen pensar que la diversidad de especies inicial se ve rpidamente sustituida por la levadura seleccionada, que rpidamente presenta una frecuencia de aislamiento del 100% de las cepas muestreadas al azar. De todo lo dicho se desprende que en el momento actual el sector elaborador de sidra en Asturias dispone de algunas innovaciones tecnolgicas encaminadas a dirigir y controlar la fermentacin de forma que el producto obtenido presente de forma reproducible esas propiedades que tanto apreciamos en nuestras sidras. Referencias
De Barros, M., Soden, A., Henscke, P.A. and Langridge, P. (1996) PCR differentiation of comercial yeast strains using intron splice site primers. Applied and Environmental Microbiology 62, 4514-4520. Querol, A., Barrio, E. and Ramn D. (1992) A comparative study of different methods of yeast strain identification. Systematic and Applied Microbiology 15, 439-466. Meaden, P.G. (1990) DNA fingerprinting of brewers yeast: current perspectives.Journal of tHe institute of Brewing 96, 195-200.

.36.

BIOTECNOLOGA DE LEVADURAS: UNA HERRAMIENTA PARA CONSTRUIR LEVADURAS DE PANADERA A LA CARTA.

JOSE ANTONIO PRIETO ALAMAN Departamento de Biotecnologa; Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos; Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. 46100-Valencia, Espaa El proceso de panificacin constituye una de las aplicaciones ms habituales de la biotecnologa de alimentos. El trmino pan abarca una gran variedad de productos que difieren en su formulacin, ingredientes o condiciones de procesamiento. No obstante, en la mayora de stos, el uso de levadura de panadera es esencial para obtener un producto de alta calidad conforme a las demandas del consumidor. La levadura produce el CO2 responsable del incremento en el volumen de la masa, contribuye al aroma y sabor del pan, y modifica las propiedades reolgicas de la masa. La introduccin en los ltimos aos de la tecnologa del ADN recombinante, ha abierto la posibilidad de modificar de forma dirigida propiedades especficas de la levadura, o de utilizar sta como una fbrica celular capaz de elaborar protenas o metabolitos de inters en el proceso de panificacin (Randez-Gil y col., 1999). Esta tecnologa ofrece as la oportunidad de construir cepas con mayor produccin de gas, ms resistentes a estrs, o capaces de modificar la reologa de la masa, el sabor o la vida media del pan. Desarrollo de cepas de levadura con capacidad para utilizar nuevas fuentes de carbono El medio de cultivo comnmente utilizado por la industria para la produccin de levadura de panadera, es el medio industrial de melaza. La melaza, es un subproducto de la industria azucarera, con un contenido en azcares, principalmente sacarosa, en torno al 40-45% de su peso, un disacarido que Saccharomyces fermenta rpidamente. Adems, las melazas proporcionan aminocidos y vitaminas esenciales, son un substrato barato y de fcil transporte. No obstante, la introduccin en los ltimos aos de procesos ms eficientes de extraccin de azcar, ha ido reduciendo progresivamente el contenido en sacarosa de las melazas, haciendo de stas, un medio de cultivo menos productivo. Dos estrategias distintas han sido abordadas para dar solucin a este problema: (i) aprovechamiento de melibiosa y (ii) utilizacin de medios de propagacin alternativos. (i) Cepas de levadura de panadera que utilizan melibiosa. Las melazas contienen, adems de sacarosa, aproximadamente un 8% de rafinosa (fructosa-glucosa-galactosa), que es hidrolizada por la enzima invertasa, para rendir fructosa, un azcar fcilmente asimilable, y melibiosa. Este ltimo disacarido no es utilizado por S. cerevisiae, al carecer este organismo de actividad -galactosidasa. Sin embargo, esta enzima, codificada por el gen MEL1, esta presente en otras especies de Saccharomyces. Cepas de levadura de panadera con actividad galactosidasa, han sido obtenidas mediante expresin heterloga del gen MEL1 de S. bayanus (Gasent-Ramrez y col., 1995). (ii) Fuentes de carbono alternativas. La expresin de genes heterlogos en S. cerevisiae, ha permitido dotar a la levadura de la habilidad para utilizar nuevas materias primas diferentes a la melaza, como celulosa, almidn o suero lcteo. En la actualidad, se dispone de cepas industriales de levadura capaces de producir de forma combinada todas las actividades enzimticas requeridas para una hidrlisis completa del almidn, esto es, -amilasa, glucoamilasa y pululanasa (Janse y Pretorius, 1995). Asimismo, se han construido cepas industriales de levadura que expresan un sistema celuloltico completo, endoglucanasa, celobiohidrolasa y glucosidasa, y que crecen sobre residuos de celulosa de diferentes orgenes (Van Rensburg y col., 1998). Recientemente, Adam y colaboradores (1999), han obtenido cepas de levadura de panadera capaces de utilizar lactosa, mediante expresin heterloga de los genes LAC4 y LAC12 de Kluyveromyces lactis, que codifican para -galactosidasa y lactosa permeasa, respectivamente.

.37.

No obstante, la aplicacin prctica de estas cepas recombinantes, requiere una evaluacin profunda de sus propiedades, no slo en trminos de rendimiento en biomasa y poder fermentativo, sino tambin respecto a su efecto en la reologa de la masa o en la calidad del pan. Crioresistencia y osmotolerancia Durante las ltimas dcadas la produccin de masas congeladas para panadera y, especialmente, para bollera, ha experimentado un progreso constante en la industria panadera. Sin embargo, el desarrollo de una tecnologa que permita la fabricacin de un producto de calidad similar al obtenido con masas frescas se ha visto limitado por la sensibilidad al proceso de congelacin/descongelacin de las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae y a la reduccin de la capacidad fermentativa de las masas congeladas con el tiempo de almacenamiento (Attfield, 1997; Randez-Gil y col., 1999). En el caso concreto de las masas dulces, un problema aadido es la necesaria osmotolerancia de las cepas de levadura, dada las altas concentraciones de azcar (10-25%) utilizadas en la fabricacin de estos productos, que limitan el crecimiento (Myers y col., 1997) y la capacidad fermentativa. Crioresistencia. Durante la congelacin/descongelacin de microorganismos se suceden una serie de procesos que daan a las clulas y que, a menudo, conducen a la muerte de las mismas. La capacidad de la levadura para enfrentarse a este tipo de estrs depende de muchos factores, entre ellos, la fase de crecimiento, el estatus nutricional, la velocidad de congelacin, la presencia de crioprotectores y, sobre todo, las caractersticas intrnsecas de las cepas (Randez-Gil y col., 1999). En cuanto a estas caractersticas, la obtencin de cepas con mayor resistencia al fro, se ha llevado a cabo de forma emprica, a partir de colecciones de levaduras o cepas salvajes, seleccionadas por su mayor viabilidad en masas congeladas (Oda y col., 1986; Nakagawa y Ouchi, 1994). Estudios bsicos en estas cepas, han sugerido la existencia de una correlacin entre crioresistencia y algunos factores celulares, como contenido en trehalosa o composicin en lpidos de la membrana (Van Dijck y col., 1995; Kim y col., 1996; Murakami y col., 1995; Glinas y col., 1991). No obstante, la mayora de los resultados de estos anlisis son contradictorios. Adems, es evidente que las cepas existentes en el mercado no renen las caractersticas deseadas. Una posibilidad para mejorar esta situacin, sera la utilizacin de aproximaciones genticas y moleculares. Sin embargo, los estudios sobre los mecanismos especficos de proteccin frente a bajas temperaturas en levaduras son escasos. Kondo e Inouye (1991) han identificado un gen, TIP1, inducible por bajas temperaturas. Se han descrito otros dos genes homlogos a TIP1 en S. cerevisiae, TIR1 y TIR2. No obstante, la triple delecin de estos genes no da lugar a un fenotipo obvio (Kawalski y col., 1995). Recientemente, Randez-Gil y col. (2000), han aislado e identificado, mediante anlisis diferencial de la expresin de mRNA en cepas de levadura de panadera, un grupo de transcritos inducidos durante el proceso de congelacin/descongelacin. Los cDNAs clonados presentan homologa con genes de S. cerevisiae, en la mayora de los casos, implicados en la respuesta al dao celular o en rutas metablicas. Anlisis de la regin del promotor de estos genes, ha permitido identificar secuencias consenso, que podran participar en la regulacin de la respuesta transcripcional al estrs por fro. La identificacin de factores transcripcionales envueltos en dicha respuesta, permitira as el desarrollo de nuevas estrategias para la construccin de cepas de levadura de panadera con mayor crioresistencia. Osmotolerancia. Una estrategia comn a cualquier clula, que permite ajustar la osmolaridad del citosol respecto a cambios en la concentracin externa de solutos, es la produccin y acumulacin de osmolitos compatibles (Hohmann, 1997). El osmolito compatible utilizado por Saccharomyces cerevisiae es el glicerol. La acumulacin de glicerol es controlada a dos niveles, produccin y retencin. Bajo condiciones de alta osmolaridad, la sntesis de glicerol es controlada por GPD1, un gen clave en el proceso (Larsson y col., 1993; Albertyn y col., 1994). La accin de GPD1 es regulada a nivel transcripcional y depende principalmente de la ruta HOG (High Osmolarity Glycerol), una ruta de transduccin de la seal, formada por MAP

.38.

quinasas y activada por cambios en la osmolaridad del medio (Gustin y col., 1998; Posas y col., 1998). La acumulacin de glicerol tambin es controlada por su nivel de retencin. Se ha caracterizado la protena Fps1p como una protena canal responsable del eflujo de glicerol (Luyten y col., 1995). La presencia de un canal permite a la clula controlar y ajustar la permeabilidad de la membrana al glicerol. En condiciones de estrs osmtico, el canal est cerrado y el glicerol se acumula en el interior celular. Estrategias encaminadas a aumentar la osmotolerancia de cepas industriales se han basado en la posible ingenierizacin del metabolismo del glicerol en Saccharomyces cerevisiae, mediante un aumento de su produccin y una mejor retencin del mismo. Sin embargo estas estrategias han resultado negativas. La sobre-expresin de GPD1, apenas aumenta el contenido de glicerol intracelular (Albertyn y col., 1994). Por su parte, la expresin de una protena Fps1p con el extremo C-terminal truncado, permite a la clula acumular ms glicerol en condiciones de estrs osmtico, pero este hecho es letal para la clula en condiciones de crecimiento isotnico (Tamas y col., 1999). Finalmente, la hiperactivacin de la ruta de MAP-quinasas, tambin es letal para la clula (Maeda y col., 1994). Expresin de genes de utilidad en el proceso de panificacin El empleo de enzimas en la industria de panadera es una prctica habitual que tiene por objeto paliar defectos y/o estandarizar la calidad de las harinas. Sin embargo, el uso de enzimas en esta industria presenta algunos inconvenientes. La principal fuente de estos preparados es el sobrenadante del medio de cultivo del microorganismo productor (normalmente hongos filamentosos o bacterias), el cual secreta adicionalmente otras enzimas que pueden afectar negativamente a la calidad del pan. Adems, puesto que la proporcin del principio activo puede diferir de lote a lote, el panadero debe ajustar la dosis del producto comercial cuando utiliza un nuevo lote. Finalmente y, ms importante, estas enzimas pueden actuar como alergenos incrementando la prevalencia de hipersensibilidad ocupacional en forma de alergias drmicas y/o bronquiales (Baur y col., 1998; Sander y col., 1998). Una alternativa al uso tradicional de enzimas es la construccin y aplicacin tecnolgica de levaduras transgnicas, capaces de producir por s mismas aquellas enzimas requeridas en el proceso, conservando al mismo tiempo la capacidad para producir el CO2 necesario, y todas las propiedades inherentes al uso tradicional de levadura (Randez-Gil y col., 1999). Las posibilidades de esta estrategia fueron exploradas inicialmente por nuestro grupo de trabajo con la construccin de cepas de levadura de panadera capaces de expresar y secretar la enzima -amilasa de A. oryzae (Randez-Gil y col., 1995). Masas panarias elaboradas con estos transformantes resultaron en panes con un mayor volumen, una textura inicial ms blanda, y una menor velocidad de endurecimiento, efectos similares a los obtenidos por la adicin exgena de preparados comerciales conteniendo -amilasa (van Dam y Hille, 1992). Adems, la utilizacin de esta levadura permite reducir la contaminacin ambiental en forma de polvo de -amilasa y por tanto la respuesta alrgica entre un colectivo de trabajadores sensibilizados (Moneo y col. 1995; datos no publicados). A pesar de la importancia de este trabajo, el xito de esta estrategia dependa en buena parte de la posibilidad de cumplir una serie de requisitos: 1) Era necesario obtener una gama de levaduras de panadera capaces de producir otras actividades enzimticas normalmente encontradas en los preparados comerciales, e incluso de combinar la produccin simultnea de varias de ellas; 2) La produccin de la enzima deba ser regulable, de forma que simule la dosificacin controlada que efecta el panadero, y 3) Se hace estrictamente necesario la adecuacin de estas levaduras a la normativa que regula la utilizacin de O.M.G. En la actualidad se dispone de estirpes de levadura de panadera que producen la enzima arabinofuranosidasa de A. niger, diferentes tipos de xilanasas de A. nidulans, la enzima lipasa 2

.39.

de Geotrichum candidum o la cutinasa de A. oryzae (Monfort y col., 1997, 1999a), y se trabaja en la construccin de levaduras con actividad esterasa y lipoxigenasa. Adems, se ha logrado la expresin combinada de -amilasa y xilanasa (Monfort y col., 1996). Por otra parte, se dispone de una coleccin de plsmidos con promotores de levadura de distinta fuerza, que permiten regular la produccin de una protena heterloga en medios industriales en funcin de los requerimientos tecnolgicos, e incluso el momento en que esta se produce (Monfort y col., 1999b). Finalmente, se ha llevado a cabo la integracin estable en el genoma de levadura del cDNA de la -amilasa de A. oryzae, mediante la utilizacin de cassettes de expresin flanqueados por DNA ribosmico y que carecen de secuencias de origen bacteriano (Nieto y col., 1999). Anlisis de los transformantes amilolticos obtenidos mostr que stos eran funcionales en ensayos de panificacin y estables al menos durante 200 generaciones. Conclusiones y perspectivas La introduccin de la tecnologa del ADN recombinante, ha abierto la posibilidad de construir nuevas cepas de levadura de panadera capaces de satisfacer los requerimientos de industriales y consumidores, e incluso de resolver o reducir algunos problemas de salud pblica o de contaminacin ambiental. En un futuro prximo, el mayor reto biotecnolgico en esta rea ser, sin duda, la obtencin de nuevas cepas de levadura con mayor crioresistencia y osmotolerancia. En este sentido, es necesario mejorar nuestros conocimientos bsicos sobre qu genes son regulados de manera coordinada bajo estas condiciones de estrs y, cmo la regulacin de rutas de respuesta a estrs puede ser aplicada a la mejora de caractersticas de inters industrial en levadura de panadera. La aplicacin comercial de estas levaduras puede encontrar sin embargo algunas dificultades, como su aceptacin por parte de los sectores industriales implicados y en especial del consumidor. No obstante, es claro que el uso de organismos modificados genticamente se va a incrementar en los prximos aos y que es slo una cuestin de tiempo que lleguemos a la conclusin de que los beneficios superan con mucho los potenciales riesgos.
Bibliografa -Adam, A. C. y col. (1999). Yeast 15:1299-1305. -Albertyn, J. y col. (1994). Mol. Cell Biol. 14:4135-4144. -Attfield, P. V. (1997). Nat. Biotechnol. 15:1351-1357. -Baur, X. y col. (1998). J. Allergy Clin. Inmunol. 102:984-987. -Gasent-Ramrez, J. M. y col. (1995). Appl. Environ. Microbiol. 61:2113-2121. -Glinas, P. y col. (1991). Appl. Environ. Microbiol. 57:463-468. -Gustin, M. C. y col. (1998). Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:1264-1300. -Hohmann, S. (1997). Shaping up: the response of yeast to osmotic stress. In: Yeast Stress Responses (Hohmann, S. et al., Eds.), pp. 101-146. Springer, New York, NY. -Janse, B. J. y Pretorius, I. S. (1995). Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:878-883. -Kim, J. y col. (1996). Appl. Environ. Microbiol. 62:1563-1569. -Kondo, K. y Inouye, M. (1991). J. Biol. Chem. 266:17537-17544. -Kowalski, L. R. Z. y col. (1995). Mol. Microbiol. 15:341-353. -Larsson, K. y col. (1993). Mol. Microbiol. 10:1101-1111. -Monfort, A. y col. (1996). Appl. Environ. Microbiol. 62:3712-3715. -Monfort, A. y col. (1997). J. Cereal Sci. 26:195-199. -Monfort, A. y col. (1999a). J. Agric. Food Chem. 47:803-808. -Monfort, A. y col. (1999b). Biotechnol. Lett. 21:225-229. -Murakami, Y. y col. (1995). Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:167-171.

.40.

-Myers, D. K. y col. (1997). Appl. Environ. Microbiol. 63:145-150. -Nakagawa, S. y Ouchi, K. (1994). Appl. Environ. Microbiol. 60:3499-3502. -Nieto, A. y col. (1999). Biotechnol. Progr. 15:459-466. -Oda, Y. y col. (1986). Appl. Environ. Microbiol. 52:941-943. -Posas, F. y col. (1998). Curr. Opin. Microbiol. 1:175-182. -Randez-Gil, F. y col. (1995). J. Cereal Sci. 21:185-193. -Randez-Gil, F. y col. (1999). Trends Biotechnol. 17:237-244. -Randez-Gil, F. y col. (2000). Nat. Biotechnol. (sometido a publicacin). -Sander, I. y col. (1998). J. Allergy Clin. Inmunol. 102:256-264. -Tamas, M. y col. (1999). Mol. Microbiol. 31:1087-1104. -Van Dam, H. W. y Hille, J. D. R. (1992). Cereal Foods World 37:245-252. -Van Dijck, P. y col. (1995). Appl. Environ. Microbiol. 61:109-115. -Van Rensburg, P. y col. (1998). Yeast 14:67-76.

.41.

.42.

MESA REDONDA II
Residuos de Antibiticos en Alimentos
Moderadora: Dra. Mara Luisa Garca Lpez

.43.

.44.

CONTROL DE RESIDUOS DE ANTIBITICOS: DIEZ AOS DEL PLAN NACIONAL DE RESIDUOS

VICENTE CALDERN PASCUAL Centro Nacional de Alimentacin. Instituto de Salud Carlos III 28220 Majadahonda, Madrid, Espaa. INTRODUCCION Los antibiticos se utilizan ampliamente en los animales destinados al consumo humano o productores de alimentos. Segn datos de la Federacin Europea de Sanidad Animal (Fedesa), en 1997 un 33 % del consumo (toneladas de principio activo) de antibiticos en la Unin Europea se destin al uso teraputico en animales y un 15 % al uso como aditivos en pienso frente a un 52 % utilizado en medicina. Esta utilizacin est regulada, tanto en lo que se refiere a su uso como medicamentos (Ley 109/1995), como a su uso como aditivos promotores del crecimiento (Directiva 70/524/CEE). A diferencia de algunos compuestos de efecto hormonal, los antibiticos se utilizan, en muchas ocasiones, de forma legal requirindose el respeto a los tiempos de espera o periodos de supresin necesarios para asegurar que en los alimentos procedentes del animal tratado no permanezcan residuos peligrosos para el consumidor. Prcticamente todos los alimentos de origen animal pueden contener residuos de antibiticos: carne, vsceras y derivados, leche y productos lcteos, pescado y productos de acuicultura, huevos o miel. Si no se utilizan en las condiciones establecidas, se pueden producir problemas que afecten tanto a la industria alimentaria como a la poblacin en general. La presencia de residuos de antibiticos en los alimentos tiene importantes repercusiones para la industria alimentaria ya que puede impedir la produccin de alimentos en los que intervienen cultivos bacterianos tales como yogur, queso o embutidos. Los consumidores tambin se pueden ver afectados por la presencia de residuos en los alimentos debido a su toxicidad y poder alergnico. La poblacin en general tambin sufre las consecuencias del empleo indiscriminado de antibiticos ya que las resistencias seleccionadas en la poblacin animal pueden ser transferidas a la flora bacteriana patgena para el hombre. MARCO LEGAL Como consecuencia de la importancia de estos problemas sanitarios, con el fin de proteger la salud de los consumidores y para facilitar los intercambios comerciales de alimentos de manera que los sistemas de control de los distintos pases tengan un reconocimiento mutuo que impida el establecimiento de barreras, surge una legislacin de mbito europeo. Esta legislacin incluye: Directiva sobre el control de residuos (96/23/CE de 29-4-96, DOCE N L 125) Decisiones sobre muestreo para control de residuos (97/747/CE de 27-10-97, DOCE N L 303) (98/179/CE de 23-2-98, DOCE N L 65) Reglamentos sobre Limites Mximos de Residuos (CE N 2377/90 de 26-6-90, DOCE N L 224) y sus modificaciones

.45.

El objetivo del plan de control de residuos es: Detectar cualquier tratamiento ilegal (utilizacin de productos no autorizados o de productos autorizados pero en condiciones distintas de las establecidas). Comprobar si los residuos de medicamentos veterinarios cumplen los lmites mximos de residuos fijados en los anexos I y III del Reglamento CEE 2377/90. PLANES NACIONALES DE RESIDUOS Para realizar estos controles surgen Planes Nacionales de Residuos en cada uno de los pases de la Unin Europea. En Espaa se denomina PNIR: Plan Nacional de Investigacin de Residuos. Se inici en 1989 (Real Decreto 1262/1989) y actualmente est regulado por el Real Decreto 1749/1998.

Los residuos de antibiticos suponen un grupo muy importante dentro del Plan Nacional de Residuos. En 1999 se tomaron en Espaa 63.000 muestras para el control de residuos, 24.000 corres- pondan a residuos de antibiticos.

Las Comunidades Autnomas ejecutan el Plan Nacional de Residuos (PNIR) con la coordinacin de los Ministerios de Sanidad y Consumo y de Agricultura, Pesca y Alimentacin. Cada Comunidad Autnoma designa a los laboratorios autorizados que deben realizar los anlisis. Adems existen cuatro Laboratorios Nacionales de Referencia que se encargan de distintos grupos de Residuos. El Centro Nacional de Alimentacin del Instituto de Salud Carlos III es el Laboratorio Nacional de Referencia para Residuos de Antibiticos. ESTRATEGIA ANALTICA Dado que hay que realizar el control de un gran nmero de compuestos en muchas muestras y matrices distintas, hay que disear una estrategia analtica para el anlisis de cada residuo o grupo de residuos. Cuando el nmero de muestras es elevado, interesa utilizar tcnicas de cribado (screening) que seleccionen aquellas muestras que, en principio, pueden contener el residuo que se investiga. Estas tcnicas de cribado deben ser simples, econmicas, rpidas y capaces de detectar un gran nmero de residuos. Adems, su lmite de deteccin debe estar ajustado al lmite mximo de residuos para no dar lugar a falsos resultados positivos o negativos. La tcnica de cribado indica la posible presencia de un determinado residuo pero es necesario confirmarlo (identificar y cuantificar) mediante tcnicas de alta especificidad. No hay mtodos oficiales para el control de residuos de productos zoosanitarios. nicamente se han establecido los criterios que deben cumplir los mtodos para control de compuestos de actividad hormonal a travs de la Directiva 93/256/CEE que est en revisin y que, por otra parte, no se refiere a las tcnicas microbiolgicas.

.46.

Las tcnicas microbiolgicas juegan un importante papel en el control sanitario de los residuos de antibiticos en alimentos ya que la nica caracterstica comn a todos los antibiticos es su actividad antibacteriana. Por tanto, estas tcnicas, al estar basadas en esa caracterstica, cubren un nmero muy amplio de residuos de antibiticos con un solo anlisis. Adems de cmo tcnica de cribado, tambin se pueden utilizar como tcnicas de post-cribado para identificar el grupo de antibiticos al que pertenece el residuo detectado. Despus deben utilizarse tcnicas de alta especificidad (HPLC) para confirmar (identificar y cuantificar) plenamente el residuo. TCNICAS MICROBIOLGICAS ANTIBITICOS DE CONTROL DE RESIDUOS DE

En Europa la tcnica de cribado de residuos de antibiticos ms extendida es la tcnica de las cuatro placas. Se basa en la difusin del antimicrobiano contenido en la muestra en varias placas con medios de cultivo inoculados con Bacillus subtilis (BGA) o Micrococcus luteus (ATCC 9341). Las sustancias antibacterianas presentes en las muestras difunden alrededor de los discos de tejido provocando la aparicin de zonas de inhibicin del crecimiento del microorganismo. La informacin sobre la identidad del residuo que se obtiene a travs de la tcnica de cribado es insuficiente para saber qu tcnica de alta especificidad debera aplicarse en la confirmacin Es necesario emplear una tcnica de post-cribado que identifique el grupo antes de proceder a la confirmacin. Las tcnicas microbiolgicas de post-cribado cuentan con varias ventajas por su sencillez, bajo coste y capacidad de deteccin. En Estados Unidos se utiliza, desde hace tiempo, una tcnica microbiolgica (bioensayo mltiple) que permite identificar cinco grupos de antibiticos (tetraciclinas, -lactmicos, macrlidos y aminoglucsidos (en 2 grupos) RESULTADOS DEL CONTROL DE RESIDUOS DE ANTIBITICOS En el Centro Nacional de Alimentacin se realizan anlisis de confirmacin de muestras remitidas por algunos laboratorios de control. Los resultados del anlisis de estas muestras no representan al conjunto del Plan Nacional de Residuos, pero son indicativos. Desde 1990 a 1999 se han analizado 4.272 muestras para determinar la presencia de residuos de inhibidores del crecimiento bacteriano; el 67 % de estas muestras corresponden a anlisis de confirmacin de resultados positivos obtenidos por otros laboratorios. Un 55 % de las muestras correspondan a msculo y un 30 % a rin. En cuanto a la distribucin por matrices, un 62 % de las muestras de confirmacin eran de ovino, 12,5 % de porcino y 14 % de bovino. La desproporcin a favor de las muestras de ovino que se reciben para confirmar, no se debe a un mayor muestreo de esta especie. Por lo que se refiere a los de grupos de antibiticos detectados, un 98 % de los resultados positivos a la presencia de inhibidores en muestras de ovino correspondieron a tetraciclinas. En porcino tambin se detectaron mayoritariamente residuos de tetraciclinas (79 % de los positivos en msculo y 76 % en rin) pero tambin se detectaron quinolonas y betalactmicos en msculo (7 y 11 %, respectivamente) y aminoglucsidos del tipo de la neomicina en rin (20 % de los positivos). Las muestras de vacuno son las que ms diversidad de antibiticos presentan. En msculo los resultados positivos se debieron principalmente a tetraciclinas (42 %), betalactmicos (25 %) o aminoglucsidos del tipo de la neomicina (5 %), pero tambin se detectaron macrlidos y quinolonas. En rin los positivos se debieron a aminoglucsidos del tipo de la neomicina (32 %), tetraciclinas (29 %), aminoglucsidos del tipo de la estreptomicina (6 %) o betalactmicos (4 %). En ambos casos se detectaron inhibidores que no se podan identificar en un 3 a 4 % de las muestras positivas.

.47.

Si se consideran todas las matrices y especies, las tetraciclinas son el residuo predominante en las muestras positivas:

% TETRACICLINAS AMINOGLUCSIDOS TIPO NEOMICINA -LACTMICOS QUINOLONAS AMINOGLUCSIDO TIPO ESTREPTOMICINA INHIBIDOR NO IDENTIFICABLE ERITROMICINA TILOSINA COMBINACIONES DE ANTIBITICOS 84,6 3,32 2,86 2,86 0,97 0,91 0,4 0,23 3,85

Uno de los resultados ms llamativos que se obtienen es el de la gran proporcin de residuos de tetraciclinas en las muestras de ovino positivas a la presencia de inhibidores bacterianos. La gran mayora de estas muestras presentaban niveles de residuo muy por debajo del lmite mximo establecido. La tcnica de cribado es muy sensible a clortetraciclina y ello explica que se detecten ms positivos a tetraciclinas que a otros antibiticos. Sin embargo, este alto porcentaje de tetraciclinas tambin refleja un uso muy extendido de este grupo en el ganado ovino. La implantacin del Plan Nacional de Residuos en alimentos de origen animal, adems de proteger al consumidor de los residuos que presentan un riesgo sanitario, permite ejercer una presin sobre los productores para que utilicen los antibiticos de una manera ms consciente y racional con el consiguiente beneficio de las poblaciones animal y humana.

.48.

ASPECTOS REGULADORES DE LOS RESIDUOS DE LOS MEDICAMENTOS VETERINARIOS EN LOS ALIMENTOS

LUIS F. CORBALN Agencia Espaola del Medicamento. C/ Huerta, 75 28014, Madrid. No cabe la menor duda que la sociedad actual reclama mayor calidad y seguridad en los productos que consume, existiendo un estado de opinin con un alto grado de sensibilizacin en lo referente a la seguridad alimentaria. La preocupacin de la opinin pblica por la seguridad de los alimentos que consume es un hecho diario en nuestra sociedad y cualquier acontecimiento sobre este asunto tiene una gran repercusin en la misma. Hechos acaecidos recientemente como las vacas locas, las dioxinas o el engorde de animales productores de alimentos con sustancias prohibidas son asuntos que no hacen otra cosa que ratificar la gran preocupacin social existente sobre la salud alimentaria en el mbito europeo. Bajo diferentes pticas se puede abordar la cuestin de la seguridad de los alimentos, nosotros nos centraremos en unas cuestiones que en la mayora de los casos no es bien conocida por la opinin pblica, como es la seguridad de los residuos de los medicamentos veterinarios en los alimentos de origen animal. En este contexto y con la intencin de salvaguardar la salud de los consumidores de alimentos de origen animal la Unin Europea, en 1990 elabora, aprueba y publica el Reglamento 2377/90 del Consejo por el que se establece el procedimiento comunitario para la fijacin de los lmites mximo de residuos (LMR) de los principios activos de los medicamentos veterinarios utilizados en animales productores de alimentos. Este Reglamento tiene un doble objetivo, de una parte proteger la salud de los consumidores de alimentos de origen animal en el territorio comunitario y favorecer la libre circulacin de estos en el espacio Econmico Europeo garantizando unos niveles idnticos de seguridad para los consumidores comunitarios. Es un hecho que este reglamento desde su publicacin y ms concretamente desde su entrada en vigor en 1992, ha supuesto un impacto importante tanto en la industria farmacutica veterinaria, en la teraputica veterinaria como en las autoridades sanitarias tanto reguladoras como de control. La industria farmacutica veterinaria. Esta normativa ha supuesto que para el lanzamiento de medicamentos que contengan en su composicin nuevas sustancias farmacologicamente activas se precisa un mayor esfuezo econmico y cientfico para establecer el LMR correspondiente. Igualmente para la puesta en el mercado de un medicamento de uso veterinario es preciso que el solicitante en el expediente de registro aporte un estudio de deplecin de residuos para el establecimiento del tiempo de espera en la especie de destino y en el tejido diana. Todo esto incrementa el esfuerzo econmico y cientfico que las empresas tienen que realizar para obtener una autorizacin de comercializacin de un medicamento destinado a animales productores de alimentos. La teraputica veterinaria. En la prescripcin de medicamentos de uso veterinario el cumplimiento del tiempo de espera se ha convertido en un elemento esencial de la misma y de la conjugacin de estos tiempos de espera con los periodos productivos de los animales. Un efecto no esperado que ha tenido este reglamento ha sido la aparicin, de lo que podemos empezar a denominar, de principios activos y especies animales Hurfanos. Crendose en ocasiones vacos teraputicos en determinadas producciones y especies para patologas concretas.

.49.

Las autoridades sanitarias reguladoras y de control. Este reglamento supone que para conceder una autorizacin de comercializacin de un medicamento con destino a animales productores de alimentos las autoridades reguladoras deben evaluar los estudios de deplecin de residuos que permitan establecer un tiempo de espera para que ese medicamento resulte seguro para los consumidores de alimentos de origen animal. Las autoridades sanitarias de control tienen un herramienta valiosa para el seguimiento del cumplimiento de los tiempos de espera, lo que supone un esfuerzo tanto en la labor de inspeccin como en poner a punto los mtodos analticos correspondiente para la deteccin de los residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos.

Aspectos reguladores A la hora de hablar de los residuos de los medicamentos veterinarios hay siempre que tener en cuenta dos aspectos, los reguladores y los cientficos. La regulacin de los residuos de los medicamentos veterinarios en la Unin Europea es relativamente reciente; el reglamento 2377/90 es por el se establece el procedimiento comunitario para fijar los lmites mximos de residuos de los medicamentos veterinarios en los alimentos de origen animal entrando en vigor en 1992. Este reglamento establece dos tipos de procedimientos dependiendo de que se traten de sustancias activas antiguas, es decir aquellas sustancias que con anterioridad a 1992 estuvieran contenidas en algn medicamento de uso veterinario destinado a animales productores de alimentos autorizado en la Comunidad Europea o por el contrario se traten de sustancias activas novedosas que con posterioridad a la fecha de entrada en vigor del reglamento se incorporen a un medicamento veterinario destinado a animales productores de alimentos. Para estas ltimas, es decir las sustancias activas novedosas, el reglamento establece que ningn medicamento veterinario destinado a animales productores de alimentos podr ser puesto en el mercado si la sustancia activa que contiene no tiene establecido el LMR correspondiente. Sin embargo, para las denominadas viejas sustancias establece un periodo transitorio hasta el 1 de enero de 1998, esto es que hasta dicha fecha pueden seguir comercializndose los medicamentos que contengan estas sustancias sin que tengan establecidos los correspondientes LMR. Tras este periodo transitorio sino ha sido establecido dicho lmite los medicamentos que contuvieran alguna de estas sustancias, deberan cesar su comercializacin. Como consecuencia del volumen de trabajo que se gener, la Unin Europea en 1997 ante la imposibilidad de evaluar todas las solicitudes para establecer los LMRs de las viejas sustancias public el reglamento 434/97 por la que se ampliaba el plazo previsto en el reglamento base, hasta el 1 de enero de 2000. Por lo tanto, en el momento actual no se puede comercializar ningn medicamento de uso veterinario destinado a animales productores de alimentos que no tenga establecido sus sustancias activas el correspondiente Lmite Mximo de Residuos o que est la sustancia activa expresamente prohibida por esta reglamentacin por razones de salud pblica por ejemplo el caso del cloranfenicol o nitrofuranos. La estructura de este reglamento consiste en cuatro anexos en dnde se encuentran las diferentes sustancias activas tras la evaluacin cientfica de sus respectivos Lmites Mximos de Residuos. En el Anexo I, se encuentran las sustancias activas para las cuales ha sido establecido un Lmite Mximo de residuos definitivo. En el anexo II, se encuentran sustancias activas para las que no es preciso establecer un Lmite Mximo de residuos en determinadas condiciones.

.50.

En el Anexo III, se encuentran las sustancias activas para las cuales ha sido establecido un Lmite Mximo de residuos provisional. En el Anexo IV, se encuentran las sustancias que estn expresamente prohibidas por razones de salud pblica. En este punto es necesario aclarar un aspecto y es que los lmites mximos de residuos se fijan para las sustancias activas y los tiempos de espera se establecen para los medicamentos en concreto. Correspondiendo el primer aspecto a la Unin Europea y el segundo a las Autoridades reguladoras competentes. Procedimiento para el establecimiento de un lmite mximo de residuos El establecimiento de un lmite mximo de residuos corresponde a la Comisin Europea a travs de reglamentos y por lo tanto son directamente aplicables en los diferentes Estados Miembros. El proceso se inicia a instancia de parte, es decir son los laboratorios los que solicitan el lmite mximo de residuos para una determinada sustancia activa. Esta solicitud debe estar sustentada por un expediente que contiene bsicamente las pruebas cientficas referentes a la farmacotoxicologa de la sustancias y a las pruebas necesarias para fijar el lmite mximo de residuos de la sustancias en los distintos tejidos diana. La evaluacin cientfica, corresponde al Comit de Medicamentos Veterinarios de la Agencia Europea para la Evaluacin de Medicamentos, que emite una opinin cientfica sobre la solicitud presentada por el laboratorio. Dicha opinin es trasmitida a la Comisin Europea que a travs del Comit Permanente de Medicamentos veterinario en dnde estn representados los Estados Miembros de Unin Europea, adoptando una decisin sobre la opinin de la Agencia y su Comit cientfico. Dicha decisin, es publicada en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas en forma de reglamento que modifica los anexos del reglamento base es decir el Reglamento 2377/90.

.51.

.52.

RESISTENCIA ANTIBITICA EN CEPAS HUMANAS DE ORIGEN ZOONTICO

EMILIO PREZ-TRALLERO Jefe de Servicio de Microbiologa, Complejo Hospitalario Donostia Profesor Titular Medicina Preventiva y Salud Pblica, Fac. Medicina, Universidad del Pas Vasco La mayora de las infecciones humanas del tracto gastrointestinal tienen su fuente de infeccin en los animales. En los ltimos aos el nmero de enteritis humanas no slo no ha disminuido respecto a dcadas anteriores, como hubiese sido de esperar, sino que su incidencia ha aumentado. Este aumento global se debe sobre todo a la influencia de tres grandes infecciones zoonticas: salmonelosis, campylobacteriosis y yersiniosis. La poblacin ms afectada es la infantil, a menor edad mayor incidencia. Tambin, a menor edad mayor gravedad de la enteritis, que ocasionalmente pone en peligro la propia vida del afectado. Algunas mejoras en la higiene del manejo de los alimentos supuso una disminucin en la transmisin de estas bacterias en la poblacin adulta, pero no as en la poblacin infantil. Cantidades pequeas de bacterias que para un adulto inmunocompetente no son capaces de infectar o caso de infectarle producira infecciones inaparentes, pueden ocasionar enfermedad (diarrea, vmitos y sepsis en algunas ocasiones) en la poblacin infantil, especialmente la poblacin menor de cinco aos. No menos grave que esta situacin paradjica del aumento de la incidencia es el llamativo incremento de la resistencia a los antimicrobianos que estas bacterias zoonticas van adquiriendo en aos recientes. Nuestro grupo en la Universidad y en el Servicio de Microbiologa del Complejo Hospitalario Donostia viene estudiando este problema desde hace ms de una dcada, colaborando muy estrechamente con el laboratorio de Salud Pblica del Departamento de Sanidad de Gipuzkoa. Resistencia a sulfamidas y estreptomicina en Yersinia enterocolytica o a cloranfenicol en esta misma bacteria fueron los problemas detectados en nuestra comunidad a mediados de los aos ochenta. Como un ejemplo muy demostrativo de lo que puede suponer para la salud de los humanos el uso indiscriminado de antibiticos en veterinaria, tenemos la evolucin de la resistencia a quinolonas en Campylobacter jejuni y Campylobacter coli. Hasta hace apenas diez aos la practica totalidad de las cepas de Campylobacter jejuni/coli aisladas de enfermos humanos eran sensibles a ciprofloxacino y otras quinolonas. Tal era as que la susceptibilidad al cido nalidixico era una prueba caracterstica que facilitaban la identificacin microbiolgica de estas cepas. Desde inicios de la dcada de los noventa, coincidiendo con el uso de quinolonas fluoradas en veterinaria, la resistencia a estos antimicrobianos fue llamativamente incrementndose tanto en cepas aisladas de humanos como de animales de la industria alimentaria. Para el ao 1993 ya se aislaban ms Campylobacter resistentes a ciprofloxacino que sensibles, superando con creces las resistentes en aos sucesivos. Campylobacter puede en una mutacin de un solo paso cambiar de sensible a muy resistente y de ah la facilidad con la que fueron seleccionadas las poblaciones resistentes. Otras bacterias como Salmonella tienen mayor dificultad para alcanzar resistencia de alto nivel a quinolonas fluoradas y a otros antimicrobianos y las mutantes resistentes parece que tienen disminuida su capacidad de causar enfermedad en el ser humano. No obstante la presin antibitica tambin ha terminado afectando a las bacterias del gnero Salmonella. En los ltimos cinco aos Salmonella se ha ido haciendo resistente a las quinolonas de primera generacin (actualmente >25%) siendo 'aparentemente' sensibles a ciprofloxacino. Todas estas cepas de Salmonella resistentes al cido nalidixico presentan mutaciones en sitios clave para la actuacin de todas las quinolonas y frecuentemente las quinolonas 'aparentemente sensibles' no son eficaces en el tratamiento de la infeccin. Las bacterias zoonticas causantes de enteritis en el hombre presentan similar porcentaje de resistencia antimicrobiana a las cepas aisladas en los animales. Aunque todo es posible, no es probable que la seleccin se haya producido en el hombre y que este infecte a los animales.

.53.

.54.

MESA REDONDA III

Probiticos en Alimentos
Moderador: Dr. Jos Luis Caso Machicado

.55.

.56.

PROBIOTICS: PRESENT KNOWLEDGE AND FUTURE PROSPECTS

ANNICK MERCENIER Department of Microbiology of Ecosystems. Institut Pasteur de Lille, France Introduction Dietary lactic acid bacteria (LAB) are mostly known for their widespread use in the preparation of fermented food and feed products. Yet, the health promoting effect that specific strains or species of this family of bacteria may exert in human or animals has also been the matter of active investigation over the past century. Despite its potential socio-economic impact, the research associated with probiotics has remained very weak over many decades [29, 33]. Even though recent clinical trials have substantiated given effects, the mechanisms underlying the studied health beneficial actions remain vastly unknown. Today, the probiotic area is benefiting from the interest of both the industry and scientists skilled in the multiple disciplines necessary to cover this complex research domain. It is foreseen that the availability of modern molecular tools will, in the next future, help to provide sound scientific basis for the claimed health effects. History and present situation The beneficial effects of LAB in human and animal health have been investigated since the early observations of Elie Metchnikoff. Almost a century ago, this Nobel Prize Winner suggested that the long healthy life of Bulgarian peasants resulted from their consumption of fermented milk products. He believed that when consumed, the fermenting bacillus (Lactobacillus) positively influenced the microflora of the gut, decreasing putrefaction and toxic microbial activities there. E. Metchnikoff established that bacteria are not necessarely detrimental to man but may on the contrary play an important role in our well-being. He was the first to recommend ingestion of live cultures of beneficial microorganisms, the LAB [2, 21]. Metchnikoffs theory thus gave birth to the concept of probiotics . It is however much later than the word itself (pro- bios , i.e. pro-life) was proposed by Parker [23] in contrast to anti-biotics . The effect of probiotics on the intestinal ecosystem is proposed to impact in some beneficial way on the consumer. This is implicit in the first definition of probiotic given by Fuller in 1989. Following this author, a probiotic is a live microbial feed supplement which benificially affects the host animal by improving its intestinal microbial balance [11]. Although referring to the supplementation of animal feeds, today the definition applies also to the human situation and has been recently reformulated by Guarner and Schaafsma as living microorganisms, which upon ingestion in certain numbers, exert health benefits on the host beyond inherent basic nutrition [13]. Positive health effects have also been described for prebiotics which were defined by Gibson & Roberfroid as non-digestible food ingredients that beneficially affect the host by selectively stimulating the growth and/or activity of one or a limited number of bacteria in the colon, that can improve the host health [12]. The prebiotic field corresponds also to an active area of research as described in recent reviews (see for example [6, 10, 12, 26]). The expression synbiotic designates the synergistic combination of pre- and probiotics, a concept which looks most promising but still remains in its infancy [26]. Today, the major consumption of probiotics by humans is in the form of dairy-based foods containing mainly lactobacilli and/or bifidobacteria, even though some probiotic preparations are based on Enterocccus strains or yeasts such as Saccharomyces boulardii. The probiotics are also available to the consumers as powders or tablets that, like the milk-based products, are mostly available from retail outlets, usually supermarkets, grocery and health food stores.

.57.

The gastro-intestinal ecosystem and the well-being After the respiratory tract, the gastro-intestinal (GI) tract constitutes the second largest body surface area, described to be somewhere between 250 and 400 m2. In addition to the enormous quantity of food (60 tons) which passes through this canal during a normal lifetime, the GI surfaces are continuously challenged by a number of chemicals including pharmaceuticals. They also correspond to the entry site of most pathogenic microorganisms. As such, the mucosal surfaces represent the first line of defense against infections caused by bacteria, viruses or parasites. Moreover, they are the target of several disturbances induced by the modern lifestyle and food habits [1, 14, 27, 28]. The protective roles of indigenous microflora are multiple. Not only does it create a barrier effect against potential pathogens, a mechanism known as colonisation resistance, but it is also leads to improved integrity and reduced permeability of the mucosal epithelium. In addition, it contributes to the host defense by modulating and improving the homeostasis of its immune function [7, 8, 17, 19, 20, 24, 25, 27, 28, 30]. This is a key issue as the mucosal surfaces are specialized in two opposite functions : tolerance to environmental antigens (such as dietary antigens, commensal microflora) and immunity to foreign antigens such as pathogenic microorganisms. The role of the gut micrflora in the maturation of the mucosal immune barrier is regarded as predominant and expected to take place in the first years of life [3,4]. It is suspected that the increasing incidence of allergic diseases seen among children of industrialized countries is connected to their difficulty to establish a satisfactory protective endogenous gut flora, as a consequence of a lowered consumption of foods produced by natural fermentation [1, 3, 4]. This and modern life or environmental conditions have been cited as stresses that predispose humans to inflammatory, ulcerative, degenerative and infectious diseases [1]. The latter constitute a major public health problem as the resistance to antimicrobial agents is constantly increasing which will necessitate to develop alternative strategies for microbial interference treatments. The World Health Organisation recently recommended to reduce the use of antibiotics both in human and animals and to increase efforts to prevent diseases by improving immunisation coverage and reconsidering older therapeutic approaches such as bacterial interference [see 1, 9]. It is to note that both aspects are part of the probiotic applications presently under investigation. Taken together these arguments underline the importance of the role played by beneficial bacteria in the gut and clearly show that probiotic preparations with proven effect would respond to the existing demand of low cost and low risk health functional ingredients. The potential health benefits of probiotics: facts or fiction? The list of potential health promoting traits attributed in particular to LAB is quite impressive [30, 31]). Nevertheless, as recognized unanimously, even though many of these effects are supported by progressively increasing evidence resulting from a variety of in vitro and animal studies, most of them remain to be substantiated by human randomized double-blind and placebo-controlled clinical studies. Today, it may be considered that proven medical indications for probiotic use have been gained only in the case of the following gastrointestinal disturbances [18]: lactose intolerance, antibiotic associated diarrhea, recurrence of relapsing diarrhea due to Clostridium difficile and shortening/reduction of rotavirus enteritis in children. In addition, based on recent clinical studies, probiotics have been proposed as a novel approach in the management of allergic diseases, especially in infants. Strinkingly, while an important effort is presently being made to confirm or prove the other claimed health benefits, experiments to unravel the mechanisms underlying different actions remains are just starting. Notably, very active research is being carried out to characterize the interaction of probiotic strains with different components of the immune stystem [5, 7, 8, 19, 20, 24] or with intestinal cell lines [see 34].

.58.

It is important to bear in mind that not all LAB strains exhibit probiotic effects. Although, it is tempting to speculate that one species will mediate specific effects, and different strains of that species should be expected to give comparable results, research hasnt supported this conclusion. For many targets, strains of lactobacilli, bifidobacteria and other genera have all shown positive effects. As head-to-head comparison of different species (or genera) or strains (belonging to the same species) are very rarely done, generalizations about genera and species performance as probiotics are difficult to make. It is also unlikely that a simple strain will bear the multitude of proposed benefits. Further research and development in probiotics will thus necessitate to perform a molecular analysis of the postulated physiological effect, that is to use modern biological tools to identify the genetic determinants and the exact nature of events it involves. This could be achieved, for example, by comparing isogenic pairs of strains affected in a defined manner in the proposed active factors [15, 16, 31] such as adhesion, bacteriocin production, cell wall composition which are currently postulated to be the mediators of given health properties. In addition, it will be crucial to establish validated functional models, preferably in vitro, that would allow proper pre-screening for probiotic strains exhibiting the desired property. This will rely, on one hand, on the verification of the present working hypotheses and, on the other hand, on the establishment of a better corellation between the huge variety of in vitro tests, animal models or human studies that have been used or performed so far. The data generated until now were based on a multitude of systems that differed at the level of the targeted effect, the probiotic candidate strain, the selected models or the read-out parameters, and this has greatly obscured fundamental knowledge in the field. As expected, variations in the probiotic response have also resulted from factors affecting the physiological conditions of the host or the quality of the probiotic product itself. Administration of levels too low to be effective, improper identification of the strain used and failure to validate counts of microbes in test products have all contribuated to dfficulty in interpreting results [see 31]. While our present understanding of the gut ecosystem is too fragmentary to define precisely the microbial balance to which one aspires in a definition of an ideal probiotic strain and the impact the latter may have on the composition and function of the intestinal microflora [16, 33], the perceived desirable qualities of probiotics are many (see for ex. [8, 16, 34]). The implementation of a functionally active strain in the final probiotic food or product will indeed determine wether or not the strain is utilized at its full potential. It is moreover recommended that each potential probiotic strain be documented and assessed independently, with results preferably confirmed by independent research groups. Extrapolation of data from closely related strains is considered as non acceptable [see 8]. Public and Legal implications The present definition of both fermented milk and probiotics emphasizes the viability of the microorganisms. However, it remains unclear whether viable bacteria are necessary for all specified health claims. A number of studies have compared the properties of viable and non viable probiotic bacteria in applications such as improved lactose digestion, immunostimulation, anti-tumor and anti-mutagenic activities, anti-hypertensive or anti-cholesterol effects and protection against candiasis (for recent reviews see [22, 31]). It is hard to draw definitive conclusions from these studies as they were generally not conducted to assess the efficacy of non-viable bacteria but rather included killed microorganisms as placebo. Also, different killing methods were used and this may have influenced the results. Nevertheless, it appears that cell components, enzymatic activities or fermentation products derived from probiotic bacteria may be the mediators of specific or partial health beneficial effects. For example, non-viable probiotic bacteria trigger the immune system in the same way as viable ones when given parenterally. In contrast, upon oral administration, viable microorganisms are more effective than killed ones. At present, there seems to be a general trend that, for many applications, viable preparations are more effective. Nevertheless, this would deserve to be confirmed by studies specifically set up to clarify the active ingredient mediating the studied effect, i.e. intact viable cell or cell component(s). The use of non-viable preparations would indeed offer both economic and social advantages, e.g. facilitating their use in developing countries [22].

.59.

Accurate information on the content and counts of bacteria in commercial products is one important aspect of communication on probiotics, which nowadays remains too frequently inadequate. But the emphasis of the message addressed to the consumers lies obviously at the level of the health claims. Although most consumers will not know precisely what probiotic means scientifically, it is apparent that they expect special properties in a food so labeled. At present, most products are presented in the market as foodstuffs not targeted to specific populations with a labeling that mentions inclusion of probiotic microorganisms and that, eventually, includes general claims such as contributing to health or influencing the immune system. It is actually forbidden by law to mislead consumers as to the true nature of the product and, currently, medicinal claims are forbidden. Regulatory and product labeling issues are the matter of active discussions in many parts on the world and the current legal situations are different in Japan, USA, Australia, New-Zealand and the european countries (for recent reviews see [20, 30, 31]). It might be assumed that progress in the harmonization of regulatory and product labeling issues will again heavily depend on progress in science. Conclusion The interest in establishing scientific credibility for probiotic effects is of high importance to companies and scientists. Research to support health claims will have to take into account the intestinal microbiota and its intercation with the host. One of the reasons which raised scepticism in the field is the vast array of health benefits attributed to LAB strains especially. However, when considering that many of these effects stem from the impact of the potential probiotic strain on the balance and/or activity of the gut ecosystem, the variety of the claimed actions is easier to comprehend. The recently developed molecular technologies will certainly help in acquiring a better understanding of this complex interaction. A multidisciplinary approach, combining molecular taxonomy and biology, modern microbial ecology, immunolgy, gastroenterology, physiology and biochemistry, will be necessary to gain knowledge in the cross-talk that most certainly takes place between the intestinal microbes and the host cells. While unravelling of the mechanisms of action may greatly facilitate future selection of novel probiotic strains with a specific health benefit, any postulated effect will have to be definitevely proven by well conducted clinical studies. This might be easier to achieve when targeting the improvement of pathological situations. In a climate of increasing consumer awarness that diet and health are linked, research in probiotics remains more than ever a fascinating challenge.
References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Bengmark S. Gut 42 (1998) 2-7. Bibel, D. J. 1988. ASM News 54: 661. Bjrkstn B. Allergy 49 (1994) 400-407. Bjrkstn B. Nutr. Rev. 56 (1998) S106-S112. Blum S., Alvarez S., Haller D., Perez P., Schiffrin E.J. Antonie van Leeuwenhoek 76 (1999) 199-205. Crittenden R.G. in : Tannock G.W. (Ed.), Probiotics A critical review, Horizon Scientific Press, Norfolk, England, 1999, pp. 141-156. Dugas B., Mercenier A., Lenoir-Wijnkoop I., Arnaud C., Dugas N., Postaire E. Immunol. Today 20 (1999) 387-390 Dunne C., Murphy L., Flynn S., OMahony L., OHalloran S., Feeney M., Morrissey D., Thornton G., Fitzgerald G., Daly C., Kiely B., Quigley E.M.M., OSullivan G.C., Shanahan F., Collins K.J. Antonie van Leeuwenhoek 76 (1999) 279-292. Elmer, G. W., Surawicz, C. M. and McFarland. L. V. 1996. JAMA 275: 870. Fooks L.J., Fuller R., Gibson G.R. Int. Dairy J. 9 (1999) 53-61. Fuller R. J. Appl. Bacteriol. 66 (1989) 365-378 Gibson G.R., Roberfroid M.B. J. Nutr. 125 (1995) 1401-1412. Guarner F., Schaafsma G.J. Int. J. Food Microbiol. 39 (1998) 237-238. Holzapfel W. H., Haberer P., Snel J., Schillinger U., Huis int Veld J. H. J. Int. J. Food Microbiol. 41 (1998) 85-101. Klaenhammer T. R. Int. Dairy J. 5 (1995) 1019-1058.

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

.60.

16. Kullen M.J., Klaenhammer T. in : Tannock G.W. (Ed.), Probiotics A critical review, Horizon Scientific Press, Norfolk, England, 1999, pp. 65-83. 17. Marteau P., Rambaud, J.-C. FEMS Microbiol. Rev. 12 (1993) 207-220. 18. Marteau P., de Vrese M., Cellier C., Schrezenmeyer J. Am. J. Clin. Nutr., In press. 19. McCracken V.J., Gaskins H.R. in : Tannock G.W. (Ed.), Probiotics A Critical Review, Horizon Scientific Press, Norfolk, England, 1999, pp. 85-111. 20. Mercenier A., Grangette C., Arnaud C. Immunity and probiotics. Danone Nutrition and Health collection, Jonh Libbey Eurotext, 1999. 21. Metchnikoff E. The prolongation of life. Heinemann, London, 1907. 22. Ouwehand A.C., Salminen, S.J. Int. Dairy J. 8 (1998) 749-758. 23. Parker R.B. Anim. Nutr. Health 29 (1974) 4-8. 24. Perdign G., Alvarez S., Rachid M., Agero G. and Gobbato N. J. Dairy Sci. 78 (1995) 1597. 25. Perdign G. and Alvarez S. 1992. in : Fuller R. (Ed.), Probiotics. The scientific basis, Chapman and Hall, London, 1992, pp.146-180. 26. Roberfroid M.B. Brit. J. Nutr. 80 (1998) S197-S202. 27. Salminen S., Isolauri E., Salminen E. Antonie van Leeuwenhoek 70 (1996) 347-358. 28. Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault M.-C., Cummings J. H., Franck A., Gibson G. F.R., Isolauri E., Moreau M.-C., Roberfroid M. and Rowland, I. Brit. J. Nutr. 80 (1998) S147- S171. 29. Sanders M.E. Adv. Food Nutr. Res. 37 (1993) 67-130. 30. Sanders M.E., Huis int Veld, J.H.J. Antonie van Leeuwenhoek 76 (1999) 293-315. 31. Sanders M.E. Probiotics. Int. Dairy Fed., In press. 32. Tannock G.W. Probiotics : A Critical Review. Horizon Scientific Press, Norfolk, England, 1999. 33. Tannock G.W. in : Tannock G.W. (Ed.), Probiotics A Critical Review, Horizon Scientific Press, Norfolk, England, 1999, pp. 1-4. 34. Vaughan E.E., Mollet B., de Vos W.M. Curr. Opinion Biotechnol. 10 (1999) 505-510.

.61.

.62.

PROBITICOS EN NUTRICIN ANIMAL

MARGARITA GARRIGA & MARTA HUGAS IRTA-Centro de Tecnologa de la Carne. Monells-Girona, Espaa La microbiota intestinal de los animales constituye el reservorio bacteriano ms importante en los mismos. Formando parte de esta microbiota, que se instaura rpidamente despus del nacimiento siguiendo un orden ms o menos determinado segn la especie animal, encontramos dos tipos de microorganismos: aquellos que colonizan el tracto intestinal de forma permanente y los que lo hacen de forma transitoria. Cada especie animal presenta una composicin distinta y especfica, con una gran diversidad de cepas, siendo las bacterias lcticas las que se encuentran en mayor cantidad y regularidad, por tanto presentan un inters especial a la hora de estudiar dicha microbiota. Las funciones de la microbiota intestinal son diversas y entre ellas cabe destacar: la mejora del trnsito gastrointestinal, la sntesis de vitaminas del grupo B y vitamina K, la influencia en las secreciones digestivas y hormonales, la digestin y/o absorcin de los aminocidos, la degradacin de glcidos y protenas, la hidrlisis de lpidos, la produccin de substancias antimicrobianas... En condiciones de salud, la microbiota intestinal tiende a mantener un estado de equilibrio en el que todos los microorganismos se encuentran presentes en una proporcin determinada, no obstante ciertos factores, como privacin de comida y/o agua, desplazamientos, estrs, administracin de antibiticos... pueden desestabilizar el sistema permitiendo a los patgenos colonizar el tracto intestinal. Esta colonizacin oportunista puede acabar desembocando en una infeccin. En aves, Campylobacter, Escherichia coli y Salmonella son los principales microorganismos patgenos que colonizan el tracto gastrointestinal. Aunque su presencia no causa, por lo general, demasiados problemas de salud en los propios animales, s que como portadores pueden representar un riesgo para la seguridad alimentaria. Salmonella enteritidis, S. typhimurium y S. heidelberg han sido implicadas en aproximadamente el 50% de las salmonelosis registradas en Estados Unidos. Muchas de las intoxicaciones fueron provocadas por huevos contaminados por S. enteritidis (Mishu y col. 1994). Generalmente es difcil conocer el nmero exacto de casos, porque no todas las intoxicaciones alimentarias son enfermedades de declaracin obligatoria y en este sentido los datos son siempre estimativos. El uso continuado de antibiticos, como promotores del crecimiento, en las explotaciones animales con el fin de aumentar el ndice de conversin y prevenir infecciones intestinales conlleva a un desequilibrio de la microbiota intestinal beneficiosa y a la aparicin de bacterias multiresistentes y agresivas, a la vez que se facilita la transmisin de grmenes peligrosos entre los animales, estabulados en poco espacio y que se encuentran en situacin de estrs. Para solventar dichos problemas y como alternativa se est investigando en el desarrollo de probiticos, especialmente despus de que la Comisin Europea haya prohibido recientemente determinados antibiticos frecuentemente incluidos en piensos como promotores de crecimiento. As pues es muy importante mantener en orden la microbiota intestinal para estabilizar o reforzar la barrera protectora contra los microorganismos patgenos. Esta es la misin que pretenden llevar a cabo los probiticos. Un probitico es un cultivo de microorganismos vivos que es administrado al animal con la primera intencin de prevenir enfermedades infecciosas reforzando la barrera de la microbiota intestinal o mediante un estimulacin inespecfica del sistema immunitario (Sgaard & Suhr-Jessen, 1990). Un probitico debe cumplir una serie de requisitos, como por ejemplo: ser un habitante normal del tracto gastrointestinal de la especie a la que pretende ser administrado, debe ser capaz de adherirse al epitelio intestinal, resistir el ambiente agresivo intestinal que supone un pH bajo en el estmago, sales biliares en el intestino y competir con otros microorganismos presentes.

.63.

Desde que Nurmi y Rantala, en 1973, observaron que administrando suspensiones o cultivos de materia fecal procedente de pollos adultos sanos daba como resultado una disminucin del nmero de animales infectados por Salmonella, efecto que se conoce como efecto Nurmi o de exclusin competitiva, diversos son los productos que han ido surgiendo en el mercado. Segn diversos autores, los productos de composicin indefinida parecen ser los mas efectivos en la prevencin de la colonizacin cecal por Salmonella, sin embargo el riesgo de transmisin de cualquier patgeno mediante este sistema debe ser valorado. La utilizacin de probiticos como suplementos alimenticios para animales de granja se ha venido practicando desde hace 30 aos. Durante este tiempo muchas preparaciones de composicin diversa han aparecido en el mercado, aunque con resultados variables y muchas veces inconsistentes. Dicha inconsistencia puede ser atribuida a diferentes factores, como escasa viabilidad, inapropiada administracin, utilizacin de organismos errneos para el animal y para la condicin que se est tratando, etc. El conocimiento de los factores que determinan una respuesta probitica ptima haran posible la utilizacin de las preparaciones existentes para conseguir el mximo efecto y descartar aquellas con nula actividad. Una elevada viabilidad es de crucial importancia en la expresin del efecto probitico, pero cul es la mnima dosis efectiva y cmo y cundo debe ser administrada esta dosis: de forma continua, peridica,...? Una situacin ideal seria esperar que despus de una dosis nica, el probitico fuera capaz de establecerse de forma permanente en el tracto digestivo del animal y all persistir durante toda la vida del mismo. En este sentido y asignando a la capacidad de colonizacin un papel de vital importancia, factores como la adhesin y la resistencia al ambiente intestinal del hospedador son factores a tener en cuenta. Las bacterias cido lcticas han sido utilizadas ampliamente como probiticos porque forman parte de la microbiota natural de la mayora de los animales, son GRAS (Generally Regarded as Safe) y poseen actividad antagonista frente a patgenos. En un proyecto realizado en el IRTA se aislaron 296 cepas de lactobacilos de pollitos de diversas edades y procedencias y se investigaron sus propiedades antagonistas, su capacidad de adhesin y su resistencia a sales biliares y a pH 3.0. De entre todas las cepas investigadas, 8 fueron seleccionadas por cumplir in vitro todas aquellas caractersticas que las convertan en potenciales probiticos. Finalmente una cepa, Lactobacillus salivarius CTC2197 fue seleccionada como la ms idnea, por sus propiedades antagonistas in vitro frente Salmonella, por su elevada adherencia y por su capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal de pollitos (Garriga y col. 1998). Posteriormente se llev a cabo un estudio en granja para valorar la competitividad de dicha cepa preseleccionada como probitico y su capacidad de minimizar la colonizacin por S. enteritidis durante el engorde de pollos. En los dos ensayos efectuados los pollitos fueron alojados en jaulas Petersime con seis niveles y cuatro compartimentos en cada nivel, donde cada tratamiento ocupaba un nivel. La inoculacin de los animales, con S. enteritidis y/o L.salivarius CTC2197 fue oral, al da de vida, mediante una cnula introducida directamente en el proventrculo. A los 14 y a los 21 das se sacrificaron 4 (en el primer ensayo) y 6 animales (en el segundo ensayo) y a partir de los ciegos se determin el recuento de lactobacilos y la presenciaausencia de Salmonella. La trazabilidad tanto de S. enteritidis como de L.salivarius CTC2197 en una poblacin microbiana tan numerosa, fue realizada por la resistencia al cido nalidxico y al cloruro mercrico que presentaba la cepa de Salmonella inoculada, y por la resistencia a la rifampicina que portaba de forma natural L.salivarius CTC2197. Los resultados obtenidos estn reflejados en la tabla 1. Como puede observarse, aquellos animales que haban recibido la cepa probitica, en forma oral (ensayo 1) y adems suplementada en el pienso y agua del primer da (ensayo 2), no estaban colonizados por Salmonella a los 21 das. Ensayos posteriores para estudiar la viabilidad en pienso de la cepa probitica evidenciaron que una dosis nica de 105 ufc/g en el pienso del primer da resultaba suficiente para asegurar la colonizacin intestinal de los animales despus de una semana. Sin embargo entre los 21 y 28 das de engorde no se detect la cepa

.64.

probitica en algunos broilers, lo que sugiere que serian necesarias dosis peridicas para asegurar su colonizacin hasta el final. En el mercado existen probiticos diversos, compuestos nicamente por una cepa de microorganismos, como por ejemplo GAIA (Lactobacillus reuteri) o preparaciones con muchas cepas como PROTEXIN, que adems de bacterias lcticas contiene hongos y levaduras. Mientras que los probiticos bacterianos han sido efectivos en pollos y cerdos, los probiticos fngicos como YEASACC (Saccharomyces cerevisiae) y AMAFERM (Aspergillus oryzae) han dado mejores resultados en rumiantes adultos. El uso de un probitico multi-cepa puede estar justificado por el hecho de que est actuando en un amplio espectro y del que se espera sea activo en varias especies animales diferentes y frente un rango de condiciones adversas, incluyendo infecciones microbianas. El tipo de probitico tendra que estar tambin relacionado con la edad del animal; un animal recin nacido es mucho ms receptivo a un probitico que un animal adulto con una microbiota ms estable y en consecuencia ms difcilmente influenciable. Mucha de la informacin sobre el uso de probiticos en animales de granja deriva de ensayos experimentales desarrollados por organizaciones comerciales productoras de probiticos, que pocas veces ven la luz en publicaciones cientficamente reconocidas, por lo que es difcil valorar los resultados. Algunas veces las interpretaciones son ms que optimistas y ayudan a crear una mstica de los probiticos carente de una adecuada y real valoracin (Barrow, 1992). Sin embargo tambin existen publicaciones cientficas de la probada eficacia de los probiticos en animales de granja. Puede concluirse que si el probitico adecuado es suministrado en el momento apropiado y a la dosis correcta, ejercer un efecto significativo en la salud del animal y/o en su crecimiento lo que se ver reflejado en una mejora econmicamente significativa para el granjero. Actualmente la Unin Europea prohibe que substancias activas utilizadas como aditivos alimentarios puedan ser comercializadas como materias primas o como alimentos dietticos. La normativa actual permite la utilizacin de probiticos como aditivos alimentarios y segn la Directiva 94/40/CEE del 22 de Julio de 1994 (D.O.C.E n L208-11/8/94), en donde se fijan las directrices para la evaluacin de los aditivos en alimentacin animal, para homologar un aditivo alimentario es necesario depositar, en un pas de la Unin Europea, un dossier que contenga: identificacin del producto, caractersticas y condiciones de uso, estudios sobre la probada eficacia del mismo en animales de la especie sobre la que pretende ser utilizado, as como estudios toxicolgicos que determinen la seguridad de su utilizacin, tanto para el propio animal como para el hombre que manipule o consuma los productos derivados.

.65.

Tabla 1.

Medias marginales del recuento de lactobacilos y lactobacilos Rifr en ciegos y porcentaje de animales colonizados por Salmonella

Recuento en ciegos (log10 UFC g-1)*

% animales colonizados por Salmonella

Tratamiento Da 14

Lactobacilos Da 21

Lactobacilos Rifr

P
NS <0.001 NS

Da 14

Da 21

P
NS NS NS NS NS

Da 14 0 90 100 50 0

Da 21 0 70 100 0 0

Control (A (ensayo 1)) Inoculacin de S.enteritidis C-114 B (ensayo 1) B (ensayo 2) Inocul. de L. salivarius CTC2197 C (ensayo 1) C (ensayo 2)

8.76 0.28a 9.04 0.12a 8.54 0.29 ND 6.00 1.31b

8.60 0.12a 7.76 0.24b 8.90 0.31 ND 7.81 0.32b

<2.00 0.00b 2.21 0.31b <2.00 0.00b 6.75 0.72a 4.18 1.23

<2.00 0.00b <2.00 0.00b <2.00 0.00b 6.10 0.71 5.64 1.56

<0.05

Inoculacin de S.enteritidis C-114 y L.salivarius CTC2197 D (ensayo 1) ND D (ensayo 2) 6.62 0.51b

ND 8.36 0.82b

<0.01

6.29 0.74 5.51 1.11

6.15 0.54 6.25 1.02

NS NS

100 100

0 0

* Los valores son medias desviaciones standard. El nivel mnimo de deteccin es 2 log10 UFC g-1 . Dentro del mismo ensayo se comparan las medias de los distintos tratamientos. Valores en una misma columna con distinto superndice (p.ej. a y a) difieren significativamente (P<0.05). La significacin de las diferencias entre el da 14 y el da 21 post-inoculacin para cada tratamiento se muestra en las filas. NS, no significativo ND, no determinado

Bibliografia Barrow, P.A. 1992. Probiotics for chicken, p.225-257. En R. Fuller (ed.). Probiotics. The scientific basis. Chapman and Hall, London. Garriga, M., Pascual, M., Monfort, J.M. & Hugas, M. 1998. Selection of lactobacilli for chicken probiotic adjuncts. J. Appl. Microbiol. 84 (1): 125-132. Mishu, B., Koehler, J., Lee, L.A., Rodrigues, D., Brenner, F.H., Blake, P. & Tauxe, R.V. 1994. Outbreaks of Salmonella enteritidis infection in the United States, 1985-1991. J. Infect. Dis. 169: 547-552. Pascual, M., Hugas, M., Badiola, J.I., Monfort, J.M. & Garriga, M. 1999. Lactobacillus salivarius CTC2197 prevents Salmonella enteritidis colonization in chickens. App. Environm. Microbiol. 65 (11): 4981-4986. Sgaard, H. & Suhr-Jessen, T. 1990. Beyond lactic acid bacteria. Feed International April, 32-37.

.66.

APLICACIN DE LACTOBACILOS DE ORIGEN HUMANO EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DIGESTIVOS Y EN ALIMENTOS FUNCIONALES

COVADONGA BARBS Dpto. Biologia Funcional. Area de Microbiologia. Facultad de Medicina. Universidad de Oviedo. El gnero Lactobacillus En 1884 A. Doderlein aisl unos bacilos Gram-positivos, catalasa negativos, y no formadores de esporas de la vagina de embarazadas (Hughes y Hillier, 1990). Los "bacilos de Doderlein" probablemente se referan a numerosos gneros y especies diferentes de bacterias, posteriormente, en 1901 M.W. Beijerinck describi el gnero Lactobacillus, y en 1928 S. Thomas identific los "bacilos de Doderlein" como Lactobacillus acidophilus utilizando mtodos bioqumicos. Actualmente el gnero Lactobacillus est bien caracterizado y est formado por bacilos o coco-bacilos, inmviles o mviles por flagelacin pertrica, con una temperatura ptima de crecimiento entre 20 y 53 C, y un pH entre 5,5 y 6,2. Son anaerobios bastante aerotolerantes, vindose su crecimiento favorecido en una atmsfera microaerfila, con un 5-10% de CO2. En cuanto a su hbitat, los lactobacilos se encuentran presentes en una amplia variedad de nichos ecolgicos, siempre que en ellos exista una abundante fuente de carbohidratos solubles, productos de degradacin de protenas, vitaminas y baja tensin de oxgeno. Algunos de ellos son: leche y sus derivados, vegetales, carne y sus derivados, bebidas fermentadas, hombre y animales. En el hombre, en el momento del nacimiento, la cavidad oral y tracto digestivo son rpidamente colonizados por una microbiota muy diversa, dentro de la que son parte fundamental los lactobacilos. Esta microbiota va cambiando en funcin de la edad, factores fisiolgicos e inmunolgicos, as como de otros factores externos, como la dieta, el estrs o los tratamientos antibiticos orales. En la cavidad oral, inicialmente slo se encuentra un 1% de lactobacilos, pero este porcentaje va aumentando a medida que aparece la denticin. En el tracto gastrointestinal, la microbiota normal intestinal est formada por una poblacin numerosa y diversa de microorganismos (Mital y Garg, 1995; Salminen et al., 1995). Aumenta en cantidad y complejidad a medida que avanzamos por el tracto gastrointestinal desde el estmago, que contiene escasos microorganismos, el leon con recuentos de 102-105 ufc/g hasta el colon, donde encontramos unas 1012 ufc/g y al menos 500 especies diferentes (Drasar y Hill, 1974; Gorbach et al., 1967). La microbiota intestinal constituye un ecosistema complejo en el que son muy importantes las relaciones entre las bacterias que la componen y de stas con el husped, de modo que cualquier desequilibrio en la misma puede desencadenar diarreas y otras alteraciones intestinales. Adems esta microbiota acta como una barrera que nos protege frente a infecciones causadas por patgenos. (Fuller, 1989). En la vagina la microbiota est constituida por una variedad de bacterias aerobias y anaerobias, predominando las del gnero Lactobacillus, que representan un 61,5% del total de los microorganismos aislados. Su presencia es mayor cuando los niveles de estrgenos son elevados (embarazo, estado neonatal y menarquia), que coincide con un depsito mayor de glucgeno sobre el epitelio vaginal. Este sustrato es fermentado por los lactobacilos hasta cido lctico, lo que hace descender el pH, y sto acta como defensa frente a posibles infecciones (Redondo-Lpez et al., 1990; McGroarty, 1993; Mehta et al., 1995).

.67.

Lactobacillus como probitico Tras las definiciones de Parker (1974) y de Fuller (1989), los probiticos fueron definidos recientemente (Guarner y Schaafsma, 1998) como microorganismos vivos que, ingeridos en determinado nmero, ejercen efectos saludables, ms all de los inherentes a la nutricin bsica. La funcin de los probiticos tal y como se deduce de su definicin es mejorar el equilibrio de la microbiota normal del husped, y por tanto ayudar a que sta cumpla con su cometido de actuar como barrera defensiva en las mucosas y la piel de los animales y el hombre. Este fenmeno se ha denominado resistencia a la colonizacin (Van der Waaij et al., 1971), efecto barrera (Ducluzeau et al., 1977), interferencia bacteriana (Reid et al.,1990) o antagonismo bacteriano (Kennedy y Volz, 1985). Los lactobacilos ejercen su funcin protectora mediante diversos mecanismos: exclusin competitiva, coagregacin y compuestos antimicrobianos. Lactobacillus, pertenece al grupo de microorganismos ms frecuentemente utilizado en la preparacin de probiticos, sin embargo algunas especies han sido aisladas como patgenos oportunistas en inmunodeprimidos, particularmente aquellos que reciben terapia antibitica de amplio espectro. La identificacin de estas propiedades potencialmente patgenas en los lactobacilos facilitar el uso de estos microorganismos con propsitos probiticos (Harty et al., 1994). Esta asociacin con enfermedad humana sugiere que debe tenerse una gran precaucin en la seleccin de cepas para su uso como probiticos o agentes bioterapeticos. Muchos autores (Dunne et al., 1999; Sanders et al., 1999, entre otros) han sealado las propiedades necesarias para que una cepa pueda ser utilizada como probitica, que podemos resumir, separando aspectos generales, funcionales y tecnolgicos. En cuanto a los caracteres generales, es importante que su origen sea humano, ya que de este modo se trata de microorganismos no ajenos al organismo al que se administran y su mecanismo de transporte gastrointestinal, metabolismo y digestin estn bien estudiados, debe estar demostrada su seguridad biolgica, en el caso de las BAL se admiten como seguras (Adams y Marteau, 1995) y debe de sobrevivir en el lugar de accin, si se trata del intestino la cepa debe ser capaz de tolerar: acidez, enzimas gstricos y pancreticos y sales biliares. Como caractersticas tecnolgicas, para que un probitico pueda tener acceso a la industria alimentaria o farmacutica debe presentar un buen crecimiento tanto in vivo como in vitro. Adems ha de mantener altos niveles de viabilidad, estabilidad y actividad durante su procesado, liofilizacin y mantenimiento (Lee y Salminen, 1995). En el caso particular de los probiticos para alimentacin, es deseable que adems confieran al producto cualidades organolpticas agradables. Finalmente como aspectos funcionales, hay una serie de caractersticas que no son imprescindibles en un probitico pero su presencia favorece la accin beneficiosa del microorganismo que las posea como: adherencia, accin antagnica, estimulacin del sistema inmune y alteracin del metabolismo. Aplicaciones. Las aplicaciones de los lactobacilos como probiticos son muy variadas, abarcando fundamentalmente 2 sectores: el mbito de la salud y el de la alimentacin. En cuanto al primer aspecto, aparte de su aplicacin como tratamiento o prevencin de infecciones del tracto genitourinario, accin anticolesterolmica y actividad antitumoral nos centraremos aqu en su aplicacin en trastornos digestivos, como son la intolerancia a la lactosa y las infecciones entricas.

.68.

El uso de bacterias como probiticos o agentes bioterapeticos, aunque empricamente, es tan antiguo como el consumo de leches fermentadas o el uso de determinadas frutas en la prevencin de enfermedades, de lo que tenemos referencia desde hace 2000 aos. Sin embargo, los primeros estudios cientficos acerca de este tema datan de 1885 cuando Cantani utiliz Bacterium termo en el tratamiento de la tuberculosis, instilndolo en el pulmn de los enfermos. Posteriormente, Metchnikoff en sus trabajos de 1907 demuestra los efectos beneficiosos de las leches fermentadas en el hombre y adems el autor disea un tratamiento utilizando cultivos puros de lo que hoy conocemos como L. acidophilus ssp. bulgaricus, que junto con S. salivarius ssp. termophilus son utilizados en la fermentacin de leche para la produccin del yogurt tradicional. Se han realizado numerosos estudios sobre el uso de probiticos en el tratamiento y prevencin de infecciones del tracto gastrointestinal, algunos ejemplos se citan en una revisin sobre el tema (Salminen et al., 1996) y se refieren al tratamiento de diarrea por rotavirus, dermatitis atpica, enfermedad de Crohn, diarrea consecutiva a radioterapia, inflamacin intestinal y otros parmetros relacionados con el cncer de colon. Se han ensayado distintas cepas de L. acidophilus, comprobndose que Lactobacillus rhamnosus (GG) y L. acidophilus LA1 colonizan el intestino y se adhieren a l y a clulas de la cavidad orofarngea con mayor intensidad que otros cultivos iniciadores utilizados en la industria lctea (Silva et al., 1987). Cuando se administra la cepa GG de L. rhamnosus tanto en forma liofilizada como en productos lcteos fermentados, se aisla en heces en niveles de 106 ufc/g. El uso de probiticos en la prevencin y/o tratamiento de enfermedades y alteraciones del tracto gastrointestinal tiene un gran potencial como alternativa o complemento de los tratamientos clsicos. En lo que se refiere al sector alimentario, los alimentos funcionales han sido definidos como alimentos similares en apariencia a los convencionales, que son consumidos como parte de una dieta normal y han demostrado beneficios fisiolgicos y/o reduccin del riesgo de enfermedad crnica adems de las funciones nutricionales bsicas. Es de gran inters la inclusin en los mismos de organismos probiticos que no solo protegen al intestino de patgenos sino que estimulan el sistema inmune del hospedador (German et al., 1999), aunque no hay que olvidar que la finalidad de los alimentos funcionales es promover salud y no curar enfermedad, es decir considerar que ciertos alimentos forman parte de una dieta saludable, reduciendo el riesgo de ciertas enfermedades, pero no que sean capaces de tratar o curar una enfermedad. Los beneficios de la ingestin de bacterias vivas solo se obtienen cuando mltiples propiedades son expresadas por una sola especie o una mezcla apropiada de varias. En trminos generales stas seran la capacidad de sobrevivir simultaneamente en el alimento en gran nmero, resistencia al pH gstrico, sales biliares y enzimas gastrointestinales, adherencia e interaccin con la superficie intestinal, colonizacin de dicho medio, sin fenmenos de translocacin bacteriana, desplazamiento y/o inhibicin de competidores patgenos bacterianos y evitar la sensibilidad o susceptibilidad inmune por el hospedador. Berner et al. (1998) sealan como posible funcionalidad de la adicin de probiticos, mejorar la funcin gastrointestinal, estimular el sistema inmune, disminucin de riesgo de cncer de colon y disminucin de riesgo de alergia a alimentos. En cuanto a la incorporacin de probiticos en alimentos destinados a consumo humano y ms concretamente productos lcteos, ya en 1920 fueron utilizados en el Japn siendo L. acidophilus y L. casei las primeras bacterias empleadas como componentes de leches fermentadas, desde entonces a la actualidad muchas bacterias se han usado con xito (Sanders and Huis int Veld, 1999), como ejemplo Nestl ha sido particularmente exitoso con el yogurt LC1 en Francia en 1994 y actualmente en la mayora de los mercados europeos. No obstante, hay que considerar que se plantean algunos problemas al aplicar estas bacterias a productos lcteos, asi pues el crecimiento en leche y las condiciones del medio durante el procesamiento de la misma como t, pH, potencial red-ox y pO2 son aceptables para

.69.

bacterias de lcteos pero no ptimas para aquellas que normalmente se desarrollan en el intestino humano. Algunas propiedades podran ser mejoradas por modificacin gentica pero hay que tener en cuenta, que aunque sta ha sido ampliamente utilizada en la industria farmacetica, en el sector alimentario el desarrollo y la implicacin de tecnologa moderna ha sido mucho ms bajo. Analizaremos fundamentalmente dos productos lcteos: las leches fermentadas y el queso. En la produccin de las primeras, los microorganismos son seleccionados por su capacidad de crecimiento y produccin de cidos orgnicos en leche asi como por sus propiedades organolpticas y reolgicas mientras que en el caso de los microorganismos probiticos, como ya se seal anteriormente son principalmente seleccionados por sus propiedades asociadas a la salud por lo que hay que aadir que los efectos de las cepas sobre la naturaleza del producto final es de gran importancia. Por ello, la combinacin de probiticos y organismos tradicionales iniciadores es importante. Para subsanar algunos problemas se pueden utilizar ciertas estrategias (U. Svensson, 1999) como realizar fermentaciones por separado y mezclarlas en el producto final, esto es muy til cuando las condiciones de crecimiento de los cultivos son muy diferentes. Otra opcin es iniciar la fermentacin con el probitico seguido de la adicin de un cultivo acidificante y finalmente la adicin de un cultivo concentrado despus de la fermentacin de la leche. En lo que se refiere al queso pocos estudios se han realizado excepto los de Cheddar con bifidobacterias y lactobacilos, Stanton et al. (1998) en queso probitico Cheddar vieron que cepas de Lactobacillus de intestino humano sobreviven en l sin impactar negativamente en la calidad del queso incluyendo aroma, sabor y textura, concluyendo que es tan eficaz como el yogurt como vehculo. El queso probitico posee una serie de ventajas sobre otros alimentos probiticos ya en el mercado, como leches fermentadas y yogures, stos son productos frescos y generalmente consumidos en pocos dias o semanas desde su elaboracin, por el contrario los quesos tienen un tiempo de maduracin ms largo. Se ha sealado que quesos como el Cheddar pueden ofrecer ciertas ventajas sobre los otros productos, en trminos de mantenimiento de probiticos viables, tales como acidez reducida del queso en comparacin con el yogurt, el alto contenido en grasa asi como la textura pueden proteger a los microorganismos durante el paso por el tracto gastrointestinal, ya que este es un medio complejo y en cierto modo hostil. La incorporacin del probitico al queso originara un alimento funcional si el cultivo mantiene su viabilidad durante la maduracin y conservacin y si no afecta negativamente a la composicin, textura o sabor del producto Podemos concluir que es improbable que una sola especie bacteriana probitica tenga capacidad para influir sobre la ecologia microbiana del husped y afectar beneficiosamente la intolerancia a la lactosa, incidencia de diarrea, respuestas inmunes mucosas, niveles de colesterol en sangre e induccin de cncer. Consideramos que ms probablemente estos efectos requerirn la introduccin de combinaciones de cepas, por ello creemos que es importante la bsqueda y caracterizacin de nuevas cepas de microorganismos potencialmente probiticos.

Bibliografa Adams, M.R. and P. Marteau. 1995. Int. J. Food Microbiol. 27: 262-264. Berner, L.A. and J.A. O`Donnell. 1998. Int. Dairy J. 8: 355-362. Drasar, B.S. and M.J. Hill. 1974. Human intestinal flora. Acad. Press, New York. Ducluzeau, R., M. Ladire, C. Callut, P. Raibaud and G.D. Abrams. 1977. Infect. Immun. 17: 415-424. Dunne, C., Murphy, L., Flynn, S., OMahony, L., OHalloran, S., Feeney, M., Morrisey, D., Thornton, G., Fitzgerald, G., Daly, Ch., Kiely, B., Quigley, E.M.M., O`Sullivan, G.C., Shanahan, F. and J.K. Collins.1999. Antonie van Leeuwenhoek 76: 279-292. Fuller, R. 1989. J. Appl. Bacteriol. 66: 365-378. German, B., Schiffrin, E.J., Reniero, R., Mollet, B., Pfeifer, A. and J.R. Weeser. 1999. Tibtech 17: 492-499.

.70.

Gorbach, S.L., L. Nahas and P.I. Lerner. 1967. Gastroenterol. 53: 845-855. Guarner, F. and G.J. Schaafsma. 1998. Int. J. Food Microbiol. 39: 237-238. Harty, D.W. H.J. Oaky, M. Patrikakis, E.B. Hume and K.W. Knox. 1994. Int. J. Food Microbiol. 24: 179-189. Hughes, V.L. and Sh. L. Hillier. 1990. Obstret Gynecol. 75: 244-248. Kennedy, M.J. and P.A. Volz. 1985. Infect. Immun. 49: 654-663. Lee, Y-K and S. Salminen. 1995. Trends Food Sci. Technol. 6: 241-245. McGroarty, J.A. 1993. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 6: 251-264. Mehta, A., J. Talwalkar, C.V. Shetty and N.D. Motashaw. 1995. In Microecology and Therapy Vol. 23. A. B. Onderbondk, P. J. Heidt and V. C. Rusch (eds.) pp. 1-7. Institut fr Mikrokologie, Herbon-Dill. Mital, B. and S. Garg. 1995. Crit. Rev. Microbiol. 21: 175-214. Redondo-Lpez, V., R.L. Cook and J.D. Sobel. 1990. Rev. Infect. Dis. 12: 856-872. Reid, G., J.A. McGroarty, P.A. Gil Domingue, A.W. Chow, A.W. Bruce, A. Eisen and J.W. Costerton. 1990. Current Microbiol. 20: 47-52. Salminen, S., E. Isolauri and T. Onnela. 1995. Chemotherapy. 41(Suppl. 1): 5-15. Salminen, S., E. Isolauri and E. Salminen. 1996. Antonie van Leeuwenhoek 70: 347-358. Sanders, M.E. and Huis int Veld, J.H. 1999. Antonie van Leeuwenhoek. 76: 293-315 Silva, M., N.V. Jacobus, C. Deneke and S.L. Gorbach. 1987. Antimicrob. Agents. Chemother. 31: 1231-1233. Stanton, C., Gardiner, G., Lynch, P.B., Collins, J.K., Fitzgerald, G. and R.R. Ross. 1998. Int. Dairy J. 8: 491496. Svensson, U. 1999. In Probiotics: a critical review. Horizon Scientific Press. Wymondham U.K. pp 57-64. Van der Waaij, D., J.M. Berghuis and J.E.C. Lekkerker. 1971. J. Hyg. (Camb.) 69: 405-411.

.71.

.72.

MESA REDONDA IV
Nuevas Tecnologas en Conservacin de Alimentos
Moderador: Dr. Jos Martnez Peinado

.73.

.74.

PASTEURIZACION DE ALIMENTOS POR METODOS NO TERMICOS

GUSTAVO V. BARBOSA-CNOVAS, JUAN J. FERNNDEZ-MOLINA Y BARRY S. SWANSON Washington State University, Pullman, WA, USA. La esterilizacin de alimentos sin calor por mtodos no trmicos constituye una alternativa novedosa de preservacin y conservacin de los alimentos. Tecnologas que aparecieron al comienzo del siglo XX como prometedoras en la pasteurizacin de alimentos lquidos como la leche vienen a ser ahora tecnologas de avanzada que ofrecen grandes ventajas en el procesado de alimentos con poco o sin calor. Los mtodos elctricos para pasteurizar y esterilizar alimentos estn recibiendo gran atencin en los ltimos tiempos debido al inters de la industria alimentaria en identificar mtodos rpidos y uniformes de calentaniento o mtodos de procesamiento a bajas temperaturas. Existen variedades de mtodos para procesar alimentos a bajas temperaturas entre los que figuran los calentamientos ohmicos y microondas, campos elctricos de baja intensidad, campos magnticos oscilantes, arcos de descarga elctrica, campos elctricos pulsantes de alta intensidad, luz ultravioleta, ulrasonido y altas presiones hidrstaticas. La energa elctrica puede ser aplicada al alimento en forma continua generando calor en ste y promoviendo la inactivacin de los microorganismos debido al efecto calrico. Por otra parte, si la energa es aplicada en forma de pulsos elctricos cortos de alta intensidad muy poco calor se generar en el alimento y la inactivacin microbiana se logra con la destruccin de la membrana celular. Campos Elctricos Pulsantes de Alta intensidad (CEPAI) Los CEPAI es una de las tecnologas mas prometedoras para la preservacin de los alimentos. La pasteurizacin con CEPAI involucra la utilizacin de pulsos elctricos de alto voltaje en el alimento colocado entre dos electrodos. El tratamiento es conducido a temperatura ambiente o por debajo de sta en milsimas de segundos y las prdidas de energa por calor son minimizadas. Esta tecnologa es considerada superior al tratamiento calrico convencional debido a que reduce en forma significativamente los cambios que ocurren en las propiedades sensoriales (sabor, color), y fsicas (textura, viscosidad) de los alimentos (Quass, 1997). Adems de conservar los atributos sensoriales de los alimentos, los CEPAI no introducen cambios qumicos significativos en los alimentos y no son considerados aditivo alimentario por las agencias reguladoras de alimentos. Por el contrario, es una tecnologa efectiva, segura y limpia. Varias teoras han sido propuestas para estudiar la inactivacin de los microorganismos con CEPAI. Las ms estudiadas son la ruptura dielctrica, la electroporacin, y el desprendimiento de la membrana celular (Zimermmann y Benz, 1980; 1986; Castro y col., 1993; Sale y Hamilton, 1967; Vega Mercado, 1996a, b). La aplicacin de campos elctricos a clulas biolgicas en un medio causa la formacin de cargas elctricas en la membrana celular (Schoenbach y col., 1997). La destruccin de la membrana ocurre cuando el potencial elctrico inducido en la membrana de muchos sistemas celulares excede el valor crtico de 1 voltio lo que corresponde a un campo elctrico externo de aproximadamente de 10 kV/cm para la bacteria Eschericia coli (Castro y col., 1993). Los aspectos ms importantes de esta tecnologa son la generacin de campos elctricos pulsantes de alta intensidad, el diseo de cmaras para el tratamiento del alimento de tal manera que ste reciba un tratamiento uniforme con un minmo incremento de la temperatura, y el buen diseo de electrodos para minimizar la electrlisis. Un banco de capacitadores conteniendo mas de un capacitador es utilizado para generar los campos elctricos de alta intensidad, gran cantidad de esta energa es almacenada en los capacitores mediante la carga de una fuente de poder de corriente alterna, el voltaje es entonces suministrado en forma de pulsos en la medida que el capacitador es descargado (Zhang y col., 1995).

.75.

La aplicacin de los CEPAI esta restringida a aquellos productos alimenticios que puedan soportar campos elctricos de alta intensidad. La constante dielctrica del alimento esta estrechamente relacionada a su estructura fsica y composicin qumica. Los lquidos homgeneos de baja conductividad elctrica proporcionan las condiciones ideales para el tratamiento continuo con CEPAI. Alimentos slidos tambin puden ser procesados con CEPAI en operaciones por lotes siempre y cuando la ruptura dielctrica en el alimento sea prevenida. Las burbujas de aire en el fluido alimentario deben ser removidas cuando se usa este mtodo debido a que ellas pueden soportar los campos elctricos de alta intensidad causando arcos elctricos que pudieran causar daos a la cmara y a los electrodos. En general, esta tecnologa no es recomendable para el tratamiento de alimentos slidos que retengan burbujas de aire al ser colocados en la cmara de tratamiento. Otra limitacin es el tamao de partcula de los alimento lquidos. Para mantener una operacin de proceso adecuada, el tamao mximo de partcula en el fluido alimentario debe ser menor que la abertura de la regin de tratamiento dentro de la cmara. Tecnologa de Pulsos de Luz (PL) Los pulsos de luz son mtodos de conservacin de alimentos que involucran el uso de pulsos de luz de corta y alta intensidad en un amplio espectro de luz. El espectro de luz incluye longuitudes de ondas en la regin ultravioleta y en la regin cercana al infrarojo. La potencia es magnificada por la acumulacin de energa elctrica en un capacitador que almacena energa por tiempos relativamente largos (fracciones de segundos). Esta energa almacenada es utilizada para realizar el trabajo en tiempos mucho ms cortos (fracciones de millones o miles de segundos). El resultado es una potencia elevada durante el ciclo de trabajo, con un gasto moderado en el consumo de energa (Dunn, 1996). La letalidad de los pulsos de luz es diferente a distintas longitudes de ondas. Por lo tanto el espectro completo o la longitud de onda seleccionada puede ser utilizada para tratar los alimentos. Las longitudes de onda conocidas que producen productos indeseables en los alimentos son eliminadas por filtracin a travs de filtros de vidrio o lquidos. Los pulsos de luz inducen reacciones fotoqumicas o fototermales en el alimento. La luz ultravioleta causa cambios fotoqumicos mientras que la luz visual e infraroja causan cambios fototermales. Los efectos antimicrobianos de estas longitudes de ondas son primariamente transmitidos a travs de la absorcin de sistemas conjugados de dobles enlaces carbono-carbono en protenas y acidos nucleicos. El material a ser esterilizado es expuesto por lo minmo a un pulso de luz con una energa de densidad en el rango de 0,01 a 50 J/cm2 en la superficie usando una distribucin de longitud de onda de tal manera que por lo menos un 70% de la energa electromagntica sea distribuida en un rango de longitud de onda de 170 nm a 2600 nm (Barbosa-Cnovas y col., 1997). La duracin de los pulsos vara entre 1 s y 0,01 s. Los rayos son aplicados a una tasa de 1 a 20 rayos por segundo. Para la mayoria de las aplicaciones pocos rayos aplicados en fracciones de segundo suministran un alto nivel de inactivacin microbiana. Por lo tanto el proceso es muy rpido y sencillo para la obtencin de altos rendimientos. Campos Magnticos Oscilantes La utilizacin de campos magnticos oscilantes para la inactivacin de microorganismos tiene el potencial de pasteurizar alimentos con un mejoramiento en la calidad y la vida de anaquel en comparacin con los procesos convencionales de pasteurizacin. La exposicin a los campos magnticos causa inhibicin en el crecimiento y reproduccin de los microorganismos. Un simple pulso de intensidad de 5 a 10 Telsa (T) y frecuencia de 5 a 500 kHz se aplica generalmente para reducir el nmero de microorganismos por lo mnimo a dos ciclos logartmicos. Campos magnticos oscilantes de esta magnitud pueden ser generados utilizando: (1) alambres superconductores; (2) alambres que producen campos DC; o (3) alambres energetizados por la descarga de energa almacenada en un

.76.

capacitador (Barbosa-Cnovas y col., 1998). La inhibicin o estmulo de microorganismos expuestos a campos magnticos puede ser el resultado de un campo magntico o de campos elctricos inducidos. Este ltimo es medido en trminos de la intensidad del campo elctrico inducido y la densidad de corriente inducida. Para diferenciar entre efectos de campos magnticos y campos elctricos se recomienda el uso de un cilindro que contiene clulas y un medio que pueda ser adaptado a estudios in vitro empleando campos magnticos uniformes de fases sencillas y frecuencias extremadamente bajas. Arcos de Descarga Elctrica de Alto Voltaje Los arcos de descarga elctrica de alto voltaje constituyen una de las primeras aplicaciones de la electricidad en la pasteurizacin de alimentos lquidos. La tcnica se aplica mediante las descargas de voltajes muy rpidas a travs de una abertura de un electrodo sumergido en una suspensin acuosa de microorganismos. La inactivacin de microorganismos con arcos de descarga de alto voltaje ha sido reportada por varios investigadores y se argumenta que su letalidad sobre las bacterias est relacionada con la generacin de una onda de choque hidrulica producida por un arco elctrico. Los arcos de descarga elctrica inducen la formacin de radicales libres provenientes de los compuestos qumicos presentes en los alimentos. Estos radicales libres son compuestos txicos que contribuyen a la inactivacion de ciertos componentes intracelulares necesarios para el metabolismo celular. Algunas enzimas de origen microbiano, como la dehidrogenasa lctica, tripsina, y proteasas de Bacillus subtilis han sido inactivadas mediante el empleo de choque elctro-hidrulico. Ultrasonido El ultrasonido es una forma de energa generada por ondas sonoras de entre 20.000 o ms vibraciones por segundo. Datos sobre la aplicacin del ultrasonido en alimentos son muy escasos y la mayora de las aplicaciones han ido acompaadas de otras tecnologas de conservacin. El efecto bactericida del ultrasonido es atribuido a la cavitacin intracelular, es decir, pequeos choques mecnicos que rompen la estructura celular y los componentes funcionales hasta el punto de inactivacin la clula microbiana. Altas Presiones Hidrstaticas (APH) Los alimentos procesados con altas presiones hidrstaticas son sometidos a presiones que oscilan entre 100 y 800 Mpa y la temperatura de proceso puede estar en un rango de 0 a 100C o ms. El proceso se lleva a cabo en tiempos muy cortos que van desde milsimas de segundos hasta ms de 20 min. Las APH actuan uniformemente sobre toda la masa de alimento, independientemente del tamao, forma y composicin del mismo. La compresin aumentar uniformente la temperatura del alimento aproximadamente 3C por cada 100 MPa. Los cambios qumicos que sufre el alimento durante el proceso de APH son generalmente, una funcin de la temperatura de proceso y del tiempo de tratamiento. En conclusin las tecnologas de conservacin revisadas en esta presentacin constituyen mtodos novedosos, de alternativa. para la conservacin de alimentos sin calor. La combinacin de estas tecnologas con otros procesos amplia su rango de accin sobre los microorganismos patgenos y de deterioro de los alimentos.

.77.

Referencias Barbosa-Canovas, G.V., Gongora-Nieto, M.M., y Swanson, B.G. 1998. Nonthermal electrical methods in food preservation. Food Sci. Technol. Int. 4(5):363-370. Barbosa-Canovas, G.V., Palou, E., Pothakamury., U.R., y Swanson, B.G. 1997. Application of light pulses in the sterilization of foods and packaging materials. In: Nonthermal Preservation of Foods. Cap. 6, Marcell Dekker, New York. Quass, D.W. 1997. Pulsed electric field processing in the food industry. A status report. CR-109742. Electric Power Institute. Palo Alto California. Castro, A.J., Barbosa-Cnovas, G.V., y Swanson, B.G. (1993). Microbial inactivation of foods by pulsed electric fields. J. Food Process & Preserv. 17:47-73. Dunn, J. 1996. Pulsed light and pulsed electric field for foods and eggs. Poultry Science. 75:1133-1136. Sale, A.J., y Hamilton, W.A. (1967). Effect of high electric fields on microorganisms. I. Killing of bacteria and yeast. Biochim. Biophys. Acta. 148:781-788. Schoenbach, K.H., Peterkin, F.E., Alden, R.W., y Beebe, S.J. (1997). The effect of pulsed electric fields on biological cells: Experiments and applications. IEEE Trans. Plasma Sci. 25(2):284-292. Vega-Mercado, H., Martn-Belloso, O., Chang, F.J., Barbosa-Cnovas, G.V., y Swanson, B.G (1996a). Inactivation of Escherichia coli and Bacillus subtilis in pea soup using pulsed electric fields. J. Food Process & Preserv. 20:501-510. Vega-Mercado, H., Pothakamury, U.R., Chang, F.J., Barbosa-Cnovas, G.V., y Swanson, B.G (1996b). Inactivation of Escherichia coli by combining pH, ionic strength and pulsed electric fields. J. Food Research International. 29(2): 117-121. Zimmermann, U., y Benz, R. (1980). Dependence of the electrical breakdown voltage on the charging time in Valonia utricularis. J. Membr. Biol. 53:33-43.

.78.

UTILIZACIN DE LAS ALTAS PRESIONES PARA LA CONSERVACIN DE ALIMENTOS.

BUENAVENTURA GUAMIS Facultat de Veterinaria.Tecnologa dels Aliments. Universidad Autnoma de Barcelona. 08193 Bellaterra, Barcelona, Espaa. La tecnologa de las altas presiones es ampliamente conocida en el campo de la ciencia de los materiales inorgnicos, donde se combinan presiones a partir de 100 MPa con temperaturas del orden de los 1000C, para la produccin de cermicas, aleaciones de metales y la creacin de materiales sintticos (Hoover y col. 1989). Su aplicacin en el procesado de alimentos ha adquirido especial importancia en las dos ltimas dcadas, si bien su utilidad en este campo ya fue sealada por el equipo de investigadores de Bert H. Hite, a partir de los estudios iniciados en 1897 sobre los efectos de presiones de hasta 1000 MPa en la conservacin de leche, carne y zumos de frutas (Johnston, 1995). Durante mucho tiempo, los problemas tecnolgicos derivados de la manipulacin a tan elevadas presiones supusieron un freno para el desarrollo de la tcnica, pero una vez superadas las dificultades gracias a los avances realizados en la industria de materiales y atendiendo a la creciente demanda de productos seguros, sometidos a procesado mnimo y libres de aditivos se ha retomado el inters por la utilizacin de la alta presin en el procesado de alimentos. En la dcada de los ochenta, la universidad y la industria japonesas, apoyadas por el Ministerio de Agricultura, fueron pioneras en el desarrollo de la alta presin para su utilizacin en la industria alimentaria. En 1992 los primeros productos tratados por alta presin salieron al mercado y a finales de 1995 ya eran siete las compaas que comercializaban productos (mermeladas, zumos de fruta, salsas, vino de arroz, pastel de arroz) tratados por esta tecnologa (Hayashi, 1997). En 1997 una industria estadounidense inici la comercializacin de guacamole y en Francia empezaban a lanzar al mercado zumos de frutas tratados por alta presin (Tonello, 1997). A partir del ao 1999 existen en el mercado espaol productos crnicos tratados por alta presin. El principal atractivo de esta tecnologa reside en que, al poderse realizar el tratamiento a temperatura ambiente, se conservan los parmetros de calidad del producto original (Cheftel, 1992). Inicialmente su principal ventaja resida en que poda utilizarse como un sustituto parcial o total del tratamiento trmico cuando el objetivo era la destruccin microbiana. Por ejemplo, en las aplicaciones a temperaturas por debajo de los 50C se consigue la inactivacin de las clulas vegetativas microbianas sin alterar el aroma, el sabor o el color de los alimentos (Cheftel, 1995), aunque deberamos matizar esta afirmacin y aadir que, dependiendo del tratamiento empleado y del producto inicial, pueden aparecer cambios en las caractersticas organolpticas. Efectos de la alta presin sobre los microorganismos de los alimentos. 1. Efectos sobre las clulas vegetativas. La resistencia de los microorganismos a la presin es muy variable. Segn Cheftel (1995) las bacterias gram positivas son ms resistentes que las gram negativas. Los hongos y las levaduras son muy sensibles, mientras que las esporas bacterianas son muy resistentes y pueden sobrevivir a presiones de 1000 MPa. La alta presin induce cambios en la morfologa, en las reacciones bioqumicas, en los mecanismos genticos y en la pared y membrana celulares de los microorganismos (Hoover, 1989). Probablemente, la alteracin de la membrana celular sea la principal causa de la aparicin de microorganismos con daos subletales despus del tratamiento de alta presin, un fenmeno que ha sido descrito por otros investigadores (Raffalli y col., 1994; Metrick, 1989; Styles, 1991; Patterson y col., 1995b) y que es el causante de que las clulas supervivientes no puedan crecer en medio selectivo y necesiten un perodo de recuperacin.

.79.

Dentro de los factores que afectan a la sensibilidad de las clulas vegetativas a la alta presin tienen importancia los siguientes: Estado fisiolgico de las clulas. Las clulas en fase estacionaria son ms resistentes a la presin que las clulas en fase logartmica de crecimiento. Las bacterias en fase estacionaria son ms pequeas y esfricas que cuando estn en fase de crecimiento, y la acumulacin de componentes como protenas y carbohidratos puede reducir los efectos de la presin (Isaacs y Chilton, 1995). Variaciones inter- e intra- especies. Patterson y col. (1995a) encontraron variaciones significativas en la sensibilidad a la alta presin (700 MPa/20C) de diferentes cepas de Escherichia coli y Listeria monocytogenes suspendidas en tampn fosfato. Otros autores han hallado cepas de distintas especies que muestran altos niveles de resistencia a la alta presin. Hauben y col. (1997a; 1977b) seleccionaron mutantes de Escherichia coli exponiendo a los microorganismos a ciclos alternos de alta presin y cultivo de los supervivientes. En un estudio complementario Verroens y col.(1997) han aplicado 10 ciclos alternos de alta presin e incubacin a presin atmosfrica para seleccionar mutantes de distintas especies concluyendo que distintos organismos difieren significativamente en la capacidad de desarrollar resistencia a la presin y que en algunos casos dicha capacidad no existe. Magnitud y duracin de la presin. Las clulas vegetativas de los microorganismos varan en su sensibilidad a la alta presin y por lo general, los microorganismos gram positivos son ms resistentes a sus efectos que los gram negativos (Earnshaw (1995) y Cheftel (1995). Estudios ms recientes sugieren que no parece existir relacin con el tipo gram, sino con la morfologa de las clulas. Ludwig y Schreck (1997) apuntan tres categoras de bacterias vegetativas con respecto a su sensibilidad a la presin: las ms sensibles seran las clulas con forma bacilar, las ms resistentes las esfricas, y las bacterias medianamente sensibles corresponderan a la variedad de formas existentes entre bacilos cortos y cocos. Por lo general, un aumento en la magnitud de la presin aplicada aumenta el efecto letal, pero no lo hace necesariamente un aumento del tiempo de tratamiento. En algunos casos, las reacciones de inactivacin son de primer orden, aunque tambin se han observado casos complejos de reacciones de inactivacin. Normalmente, para una cepa bacteriana dada, la cintica vara segn la temperatura de tratamiento (Ludwig y Schreck, 1997). Efecto de la temperatura. Segn Ludwig y col.(1992) la inactivacin de Escherichia coli a 200 MPa durante 15 min presenta un mnimo a 20 C, mientras que a temperaturas entre 0 y 20C el efecto de la presin es mayor y el mximo se consigue a partir de los 40C. Carlez y col.(1993) observaron un efecto similar al tratar Citrobacter freundii y Listeria innocua inoculados en carne picada de buey. Gervilla y col. (1997a y b) detectaron que cuando trataban Listeria innocua y Pseudomonas fluorescens inoculadas en leche de oveja, la resistencia a la presin era mayor a 25 C que cuando se presurizaron a 2, 10 o 50 C. Por otro lado, la resistencia a la alta presin de Escherichia coli fue mayor en los tratamientos a 10 C que a 25 C. Efectos del medio

.80.

Takahashi (1992) investig el efecto de distintos ingredientes alimentarios sobre la proporcin de supervivientes de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae despus del tratamiento. De los estudiados, el NaCl aumentaba la proporcin de supervivientes. Patterson y col. (1995) compararon el efecto de 700 MPa/20C sobre distintas cepas de Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus inoculados en tampn fosfato, leche UHT y carne de pollo. En todos los casos, los microorganismos fueron ms resistentes a la presin cuando se trataron en leche UHT que en carne de pollo o tampn fosfato. Metrick (1989) y Styles (1991) observaron el mismo efecto protector del alimento con respecto a la solucin tampn cuando Salmonella y Listeria fueron tratadas en carne de pollo y en leche UHT, respectivamente. Dichos autores evidenciaron la presencia de clulas daadas subletalmente cuando se utilizaron presiones inferiores a las requeridas para causar la destruccin total de los microorganismos. Gervilla y col. (2000) han estudiado el posible efecto baroprotector de la grasa en leche de oveja, observando que la leche con un 0% de materia grasa ejerce un efecto baroprotector con respecto a la solucin de Ringer, pero que mayores porcentajes de grasa (6 y 50%) no muestran un efecto baroprotector progresivo. El pH del medio tambin tiene influencia sobre la reduccin en el nmero de microorganismos cuando se aplica un tratamiento de alta presin (Mackey et al., 1995, Yuste et al., 1998). Los componentes de los alimentos juegan un papel protector o sensibilizador dependiendo de los casos, pero adems hay que tener en cuenta el efecto que pueda representar la matriz fsica en la que se hallan ubicados los microorganismos. 2. Efectos sobre las esporas. Como sucede con las clulas vegetativas, la resistencia a la presin de las esporas de las distintas especies y cepas de microorganismos vara enormemente (Gould,1995). Clouston y Wills (1969)han observado que la alta presin induce la germinacin de las esporas de Bacillus pumilus a presiones por encima de los 50 MPa. Gould y Sale (1970), trabajando con esporas del mismo gnero indicaron que las presiones ms efectivas para inducir la germinacin se encuentran por debajo de los 100 MPa. Nishi y col. (1994) indican que la activacin de la germinacin de esporas de Bacillus subtilis en leche entera a presiones de 200 MPa y temperaturas entre 25 y 60C es ms efectiva que la activacin por calor a 80C. Consiguen germinar la mayora de esporas al cabo de una hora de incubacin a 37 C a las presiones mencionadas. Las esporas residuales que no germinan, muestran un estado de latencia profundo, y tampoco lo hacen despus de una incubacin durante 6 h. Los tratamientos combinados a temperatura elevada permiten la inactivacin de las esporas. Reddy (1997) estudi la inactivacin de una suspensin de 1 x 106 esporas/ml de Clostridium botulinum tipo E en tampn fosfato. Se consigui la inactivacin completa tratando a 828 MPa/60C/10 min. Rovere y col.(1997) han aplicado presiones a partir de 800 MPa combinadas con temperaturas entre 60 y 90C consiguiendo, en la mayora de los casos, la inactivacin total en medio lquido de distintas esporas. Combinacin de alta presin y bacteriocinas. Kalchayanad y col. (1994) proponen la combinacin de bacteriocinas para alcanzar mayor efectividad antibacteriana que con la alta presin o la electroporacin aisladamente. Ambos tratamientos producen daos subletales en las clulas de los microorganismos supervivientes que provocan la sensibilizacin a la pediocina AcH y a la nisina tanto en microorganismos gram positivos como negativos. Roberts y Hoover (1996), investigaron los efectos combinados de la alta presin, el calor, la acidez y la nisina sobre las esporas de Bacillus coagulans suspendidas en tampn fosfatocitrato. Los resultados del trabajo indican que la nisina puede tener un efecto sinrgico usada conjuntamente con la presin a temperaturas moderadas (400 MPa / 45 y 70C / 15 y 30 min) y

.81.

pH bajos. Stewart y col. (1997) realizaron un estudio similar con esporas de Clostridium sporogenes. Yuste y col. (1998) han observado un efecto sinrgico del tratamiento combinado alta presin a 2C y nisina sobre los microorganismos mesfilos y psicrtrofos de carne recuperada mecnicamente de ave. Morgan y col. (2000) han estudiado el efecto combinado de la alta presin y la lacticina 3147 sobre la inactivacin de S. aureus y L. innocua inoculados en leche y suero. Por una parte, observan que presiones superiores a 400 MPa producen un aumento de la actividad de la bacteriocina y, por otro lado, demuestran que el tratamiento combinado produce un efecto superior al observado con la utilizacin de la alta presin y la bacteriocina por separado.
Bibliografa Carlez A., Rosec J. P., Richard N. y Cheftel, J. C. 1993. Lebensmittel Wissenchaft und Technologie, 1993, 26(4), 357-363. Clouston J. G. y Wills, P.A. 1969. Journal of Bacteriology, 1969, 97(2), 684-690. Cheftel J.-C. 1992. En: High Pressure and Biotechnology, 195-210. (Eds.) C. Balny, R. Hayashi, K. Heremans and P. Masson. John Libbey Eurotext, Montrouge. Cheftel, J.Cl. 1995. Food Science and Thecnology International, 1, 75-90. Gervilla R., Capellas M., Ferragut V. and Guamis B. 1997. Journal of Food Protection, 60, 1, 33-37. Gervilla R., Felipe X., Ferragut V. and Guamis B. 1997. Journal of Dairy Science, 80:2297-2303. Gervilla R., Ferragut V. and Guamis B. 2000. Journal of Dairy Science, 83:1-9 (en prensa). Johnston D. E. 1995. En: High pressure processing of foods, 99-122. (Eds.) Ledward L. A., Gould G. W. 1995. En: High pressure processing of foods, 27-36. (Eds.) Ledward L. A., Johnston D. E., Earnshaw R. G. y Hasting A. P. M. Nottingham University Press, Leicestershire. Gould G. W. y Sale A. J. H. 1970. Journal of General Microbiology, 1970, 60, 335-346. Hauben K. J. A., Bartlett D. H., Soontjens C. C. F., Cornelis K., Wuytack E. Y., Michiels C. W. 1997b. Applied and Environmental Microbiology, 3, 945-950. Hayashi R. 1997. High Pressure Research in the Biosciences and Biotechnology, 1-4. (Ed.) K. Heremans Leuven University Press, Leuven. Hoover D. G., Metrick C., Papineau A. M., Farkas D. F. y Knorr D. 1989. Food Technology, 43(3) 99-107. Isaacs N. S. y Chilton P. 1995. En: High pressure processing of foods, 65-80. (Ed.) Ledward L. A., Johnston D. E., Earnshaw R. G. y Hasting A. P. M. Nottingham University Press, Leicestershire. Kalchayanand N., Sikes T., Dunne C.P., Ray B. 1994. Applied and Environmental Microbiology 60, 4174-4177. Metrick C., Hoover D.G., Farkas D.F. 1989. Journal of Food Science 54, 1547-1549. Morgan S. M., Ross R.P., Beresford T., Hill C. 2000. Journal of Applied Microbiology 88, 414-420. Patterson M.F., Quinn M., Simpson R., Gilmour A. 1995. Journal of Food Protection 58, 524-529. Rafalli J., Rosec J.P., Carlez A., Dumay E., Richard N., Cheftel J.C. 1994. Sciences des Aliments 14, 349-358. Roberts C.M., Hoover D.G. 1996. Journal of Applied Bacteriology 81, 363-368. Stewart C.M., Jewett F.F., Dunne C.P., Hoover D.G. 1997. Journal of Food Safety 17, 23-26. Stiles M.E. 1996. Antonie van Leeuwenhoek 70, 331-345. Tonello C., Largeteau A., Jolibert F., Deschamps A. y Demazeau G. 1992. En: High Pressure and Biotechnology. C. Balny, R. Hayashi, K. Heremans and P. Masson (Eds.). John Libbey Eurotext, Montrouge, France. Verroens P., Hauben K. y Michiels C. 1997. Book of Abstracts of the 35th Meeting on High Pressure Food Science, Bioscience and Chemistry of the EHPRG. Reading Yuste J., Mor-Mur M., Capellas M., Guamis B. y Pla R. 1998. Food Microbiology,15, 407-414

.82.

LA CONSERVACIN DE LOS ALIMENTOS POR ULTRASONIDOS

JAVIER RASO PUEYO. Tecnologa de los Alimentos. Dpto. Produccin Animal y Ciencia de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza Introduccin Los sistemas de conservacin que actan inactivando microorganismos, adems de prolongar la vida til de los alimentos, permiten obtener alimentos seguros desde el punto de vista sanitario. Tradicionalmente, el calor ha sido el principal agente inactivador utilizado por la industria alimentaria. Sin embargo, en ocasiones, los tratamientos trmicos producen modificaciones importantes en las caractersticas sensoriales y nutritivas de los alimentos. Debido a estos efectos no deseables, en los ltimos aos se est realizando un esfuerzo importante en la bsqueda de nuevos sistemas de inactivacin que sustituyan ventajosamente al calor [1]. Entre estas alternativas se pueden destacar las altas presiones hidrostticas, los pulsos elctricos de alto voltaje, los campos magnticos de alta intensidad y los ultrasonidos. Los ultrasonidos son ondas sonoras con una frecuencia superior a la perceptible por el odo humano (>16 kHz). Sin embargo, la frecuencia mnima que puede considerarse como ultrasnica no ha sido definida con precisin, ni se trata de una frecuencia a la que ocurran cambios importantes en las caractersticas de la onda [2]. Los generadores de ultrasonidos producen estas ondas de alta frecuencia aprovechando las propiedades de los materiales piezoelctricos. Estos, se caracterizan porque vibran con una determinada amplitud, a la frecuencia ultrasnica, cuando se les aplica, en forma de pulsos de alta frecuencia, una diferencia de potencial [3]. Cuando los ultrasonidos de alta intensidad (20-100 kHz) se transmiten en un medio lquido, provocan el fenmeno de la cavitacin. La cavitacin consiste en la formacin, crecimiento y sbita implosin de burbujas. Como consecuencia de la implosin de estas burbujas se libera, localmente, una gran cantidad de energa, alcanzndose, en el seno del lquido, elevadas temperaturas (5000C) y presiones (1000 atm) [4]. Se estima que, en el punto de la implosin, estas condiciones se mantienen durante un periodo de tiempo inferior a 1 s y que las velocidades de calentamiento y enfriamiento del lquido son del orden de 109 C/s [5]. Los efectos que los ultrasonidos de alta intensidad provocan en un medio lquido dependen del nmero de burbujas que implosionan por unidad de tiempo y de la intensidad con la que stas implosionan [6]. INACTIVACIN MICROBIANA POR ULTRASONIDOS El efecto inactivador de los ultrasonidos sobre los microorganismos se conoce desde principios de los aos 30 [7]. A partir de este momento se realizaron diversas investigaciones encaminadas a estudiar el efecto inactivador de estos tratamientos solos [8, 9, 10, 11] o en combinacin con otros agentes [12, 13, 14]. A comienzos de los aos 70, se observ que la aplicacin de un tratamiento ultrasnico previo, sensibilizaba a determinados microorganismos esporulados a un tratamiento trmico [15] y, posteriormente, que la aplicacin de ultrasonidos simultneamente a un tratamiento trmico (termoultrasonicacin) era ms eficaz que un tratamiento trmico a la misma temperatura [16]. A principio de los aos 90, nuestro grupo de investigacin inici el estudio de la inactivacin de microorganismos mediante tratamientos ultrasnicos bajo presin (Manosonicacin, MS) y tratamientos combinados de ultrasonidos bajo presin y calor (Manotermosonicacin, MTS). La inactivacin microbiana por ultrasonidos depende de numerosos factores. Estos, pueden clasificarse en tres grupos: condiciones de tratamiento, caractersticas de los microorganismos y caractersticas del medio de tratamiento.

.83.

1.- Condiciones de tratamiento El tiempo y la amplitud del tratamiento ultrasnico, junto con la presin y temperatura del medio son las principales condiciones de tratamiento que influencian la inactivacin microbiana por ultrasonidos. 1.1.- Tiempo de tratamiento La inactivacin microbiana por ultrasonidos aumenta al incrementar el tiempo de tratamiento. En general, como muestran las figuras 1 y 2, se observa una relacin exponencial entre el nmero de supervivientes a un tratamiento ultrasnico y el tiempo de tratamiento. Por lo tanto, al igual que en los tratamientos trmicos, se puede estimar la resistencia de los microorganismos a un determinado tratamiento ultrasnico a partir del tiempo de reduccin decimal (Valor D) que es el tiempo de tratamiento necesario para reducir la poblacin microbiana a la dcima parte. 1.2.- Presin hidrosttica Cuando se aumenta la presin hidrosttica del medio de tratamiento se observa un incremento en el efecto inactivador de los tratamientos ultrasnicos, tanto en levaduras [17], como en clulas vegetativas y esporos bacterianos [18, 19]. Estos incrementos de presin, en funcin de las condiciones de tratamiento, son efectivos hasta valores de alrededor de 200300 kPa. Por encima de estas presiones, nuevos incrementos no aumentan el efecto letal de los ultrasonidos. La figura 1 muestra la inactivacin de Escherichia coli a distintas presiones de tratamiento. La influencia de la presin sobre el efecto inactivador de los ultrasonidos puede explicarse a partir de la influencia que sta ejerce sobre el fenmeno de la cavitacin. La presurizacin del medio de tratamiento provoca un aumento en la intensidad con la que implosionan las burbujas y un descenso del nmero de burbujas que implosionan por unidad de tiempo [6]. Por lo tanto, aunque al aumentar la presin, la intensidad de la implosin de las burbujas individuales es mayor, el menor nmero de burbujas que implosionan, podra explicar que a partir de una determinada presin hidrosttica, nuevos incrementos de presin no incrementen el efecto letal de los ultrasonidos.

1.3.- Amplitud La amplitud ultrasnica es el valor mximo del desplazamiento de la superficie que vibra para generar los ultrasonidos en el medio de tratamiento. Este valor est directamente relacionado con la intensidad del tratamiento ultrasnico. Se ha observado, tanto en clulas vegetativas como en esporos bacterianos, que al aumentar linealmente la amplitud, la velocidad de inactivacin microbiana aumenta exponencialmente [18, 19]. La figura 2 muestra la influencia de la amplitud en el efecto inactivador de un tratamiento ultrasnico sobre E. coli.

.84.

La mayor eficacia de los tratamientos a mayor amplitud est relacionada con el aumento del volumen de lquido que experimenta cavitacin [20] y con el aumento del nmero de burbujas que implosionan por unidad de tiempo [4]. 1.4.- Volumen de la cmara de tratamiento Cuando los ultrasonidos se transmiten en un medio, su amplitud disminuye con el cuadrado de la distancia. Por lo tanto, si mantenemos constante la intensidad del tratamiento, su efecto inactivador estar influenciado por el volumen de la cmara de tratamiento. Distintos autores han observado un menor efecto letal de los tratamientos ultrasnicos al aumentar el volumen de la cmara de tratamiento [8, 21]. 1.5.- Temperatura Con objeto de reducir la intensidad de los tratamientos trmicos, se ha estudiado el efecto inactivador de tratamientos combinados de ultrasonidos bajo presin y calor (Manotermosonicacin). En un determinado rango de temperaturas, el tratamiento combinado es ms eficaz en la inactivacin de clulas vegetativas y esporos bacterianos Adems se ha observado un efecto sinrgico en Streptococcus faecium y en los esporos de Bacillus subtilis y un efecto aditivo en el resto de las clulas vegetativas investigadas [18, 19]. 2.-. Factores dependientes de las caractersticas de los microorganismos 2.1.- Tipo de microorganismo No todos los microorganismos presentan la misma resistencia a los tratamientos ultrasnicos. Los cocos son ms resistentes que los bacilos [9], los esporos bacterianos son mucho ms resistentes que las clulas vegetativas y las bacterias Gram + son ms resistentes que las bacterias Gram - [12, 18]. A pesar de la diferente resistencia de las clulas vegetativas a los ultrasonidos, se ha observado que la influencia de la presin hidrosttica y la amplitud ultrasnica en el efecto inactivador de estos tratamientos es la misma. Es decir, que un mismo aumento de la presin hidrosttica o de la amplitud provocan el mismo descenso en la resistencia al tratamiento de diferentes microorganismos. Se han desarrollado dos ecuaciones matemticas, una para la influencia de la presin y otra para la influencia de la amplitud, que permiten predecir el efecto inactivador de un tratamiento ultrasnico de unas determinadas caractersticas a partir de un nico valor experimental [18]. 2.2.- Fase de crecimiento Los resultados sobre la influencia de la fase de crecimiento en la resistencia microbiana a los ultrasonidos son contradictorios. Mientras que algunos autores han observado que no influye en el efecto inactivador de los ultrasonidos [8], otros han observado que E. coli era ms sensible a los tratamientos en fase de crecimiento exponencial que en fase de crecimiento logartmico [22]. 2.3.- Temperatura de crecimiento La temperatura a la que crecen los microorganismos determina su resistencia frente a distintos agentes inactivadores como el calor o las altas presiones. Sin embargo, se ha observado que sta no influencia la resistencia a los tratamientos ultrasnicos de distintos microorganismos como Listeria monocytogenes o Yersinia enterocolitica [21]. 2.4.- Tratamientos trmicos subletales Es bien conocido que cuando los microorganismos son sometidos a un tratamiento trmico subletal aumenta considerablemente su termorresistencia. Se cree que este

.85.

incremento es debido a la sntesis por parte de stos de unas protenas denominadas protenas del shock trmico que los protegen frente al calor. Pagn y col. [23] estudiando la resistencia a los tratamientos ultrasnicos de clulas de L. monocytogenes sometidas previamente a un tratamiento trmico subletal, observaron que un choque trmico a 45C durante 180 min. aumentaba su termorresistencia a 62C seis veces, mientras que no modificaba su resistencia a un tratamiento de ultrasonidos bajo presin (117 m, 200 kPa, 40C). Adems, el efecto inactivador de los tratamientos de MTS sobre las clulas que haban recibido el tratamiento trmico subletal era sinrgico en un determinado rango de temperaturas. 3.- Caractersticas del medio de tratamiento 3.1.- pH El pH del medio de tratamiento tambin es un factor que afecta a la resistencia microbiana a distintos agentes inactivadores. Es bien conocido que los microorganismos suelen ser menos termorresistentes al descender el pH del medio de tratamiento. Sin embargo, diferentes autores han observado que la acidificacin del medio de tratamiento no afecta a la inactivacin microbiana por ultrasonidos [23, 24]. 3.2.- Aw La elevada resistencia al calor que presentan los microorganismos en medios de baja actividad de agua obliga a aplicar tratamientos trmicos muy intensos para su esterilizacin. Aunque el descenso de la aw tambin aumenta la resistencia de los microorganismos a los tratamientos ultrasnicos, este incremento es mucho menor. As, por ejemplo, mientras que la adicin de sacarosa a una concentracin del 57% al medio de tratamiento multiplica la termorresistencia de L. monocytogenes por 25, la resistencia de este microorganismo a un tratamiento de manosonicacin solamente se duplica. Tambin, se ha observado un efecto sinrgico de la MTS en la inactivacin de distintos microorganismos como L. monocytogenes o Salmonella senftenberg en medios de baja actividad de agua [datos no publicados]. 3.3.- Composicin del medio de tratamiento. En general, se ha observado que la resistencia microbiana a los tratamientos ultrasnicos aumenta al suspender los microorganismos en los alimentos [9]. El efecto protector depende de su composicin. Lee y col. [25] observaron que un tratamiento ultrasnico que produca cuatro ciclos logartmicos de inactivacin sobre Salmonella eastbourne suspendida en agua de peptona, inactivaba menos de un ciclo logastitmico cuando se suspenda en leche chocolateada. Por otro lado, mientras que la resistencia de L. monocytogenes a un tratamiento de Manosonicacin es la misma en leche desnatada que en tampn McIlvaine de pH 7 [23] la de S. senftenberg se duplica cuando el tratamiento se aplica en huevo lquido [26]. Mecanismo de accin de los tratamientos ultrasnicos La inactivacin microbina por los ultrasonidos se atribuye al fenmeno de cavitacin. Como consecuencia de la implosin de las burbujas se generan elevadas temperaturas y presiones que provocan la aparicin en el seno del lquido de intensas fuerzas de cizalla y la formacin de radicales libres. Por lo tanto, en la inactivacin de los microorganismos podran participar: el calor debido a las elevadas temperaturas que se alcanzan en el punto de la implosin, la ruptura mecnica de las clulas debido a las fuerzas de cizalla y/o la accin bactericida de los radicales libres. A pesar de que los estudios tericos indican que en el punto de la implosin se alcanzan temperaturas de varios miles de grados centgrados, debido al pequeo volumen del mismo y a las elevadas velocidades de calentamiento y enfriamiento, no se produce un aumento importante

.86.

de la temperatura del medio durante su sonicacin. Adems, en la mayora de las investigaciones donde se estudia la inactivacin microbiana por ultrasonidos se controla la temperatura del medio de tratamiento para que se mantenga constante y por debajo de valores letales para los microorganismos. Por otra parte, es bien conocido que tras aplicar un tratamiento trmico a una poblacin microbiana, parte de los supervivientes al mismo no son capaces de crecer cuando se recuperan en un medio desfavorable. Se considera que estos microorganismos han sido daados por el tratamiento trmico y solo son capaces de multiplicarse cuando las condiciones de recuperacin son ptimas. Sin embargo, no se han encontrado diferencias en el nmero de microorganismos que se recuperan tras un tratamiento de ultrasonidos al cultivarlos en un medio favorable o desfavorable. Por lo tanto, parece que el calor no interviene en el efecto inactivador de estos tratamientos. Tampoco parece que los radicales libres sean responsables de la inactivacin microbiana por los ultrasonidos. Diversos autores han comprobado que la presencia en el medio de tratamiento de una sustancia secuestrante de radicales libres (cisteamina) no influye en el efecto inactivador de un tratamiento ultrasnico [22, 27]. Por lo tanto, parece que la inactivacin microbiana por los ultrasonidos es debida, a la ruptura mecnica de las clulas debido a las intensas fuerzas de cizalla que se generan como consecuencia de la implosin de las burbujas. De hecho, se ha observado al microscopio electrnico la presencia de clulas con su pared celular rota tras un tratamiento ultrasnico [22] y, al microscopio de contraste de fases, una correspondencia entre el nmero de clulas rotas con el nmero de microorganismos inactivados determinado por un recuento en placa [27]. Esta destruccin celular tambin es corroborada por el incremento progresivo de la concentracin proteica en el medio donde se encuentran suspendidos los microorganismos durante un tratamiento de sonicacin [22]. Aplicaciones de los ultrasonidos en la conservacin de los alimentos A pesar de que el efecto inactivador de los ultrasonidos sobre los microorganismos se conoce desde hace varias dcadas, hasta la fecha no se han utilizado como sistema de conservacin de los alimentos debido fundamentalmente a su escasa eficacia letal. El incremento del efecto letal de los tratamientos ultrasnicos al aplicarlos bajo presin y al combinar estos tratamientos con el calor abre nuevas posibilidades a su utilizacin como alternativa a la conservacin de los alimentos por el calor. Adems, diversas investigaciones han demostrado que los tratamientos de MS y MTS tambin son capaces de inactivar a determinados enzimas de inters en la conservacin de los alimentos [8]. Por lo tanto, la MS y/o la MTS podran ser una alternativa para la conservacin de alimentos lquidos sensibles al calor. Sin embargo, la imposibilidad de obtener, a escala industrial, las intensidades ultrasnicas que se obtienen en el laboratorio, limitan, por el momento, su aplicacin.
Bibliografa 1. Barbosa Cnovas, G. V., Pothakamury, U. R., Palou, E. & Swanson, B. G. (1998). Nonthermal preservation of foods. Marcel Dekker, Inc, New York. 2. Cracknell, A. P. (1983). Ultrasonidos. Paraninfo, Madrid. 3. Cartwright, D. (1998). "Off-the-shelf" ultrasound instrumentation for the food industry. In M. J. W. Povey, T. J. Mason, Ultrasound in food processing. Blackie Academic & Professional, London 4. Suslick, K. S. (1990). Sonochemistry. Science, 247, 1439-1445. 5. Flint, E. B. & Suslick, K. S. (1991). The temperature of cavitation. Science, 253, 1397-1398. 6. Whillock, G. O. H. & Harvey, B. F. (1997). Ultrasonically enhanced corrosion of 304L stainless stell I: The effect of temperature and hydrostatic pressure. Ultrasonics Sonochem., 4, 23-31. 7. Harvey, E. & Loomis, A. (1929). The destruction of luminous bacteria by high frequency sound waves. Journal of Bacteriol., 17, 314-318.

.87.

8. Hamre, D. (1949). The effect of ultrasonic waves upon Klebsiella pneumoniae, Saccharomyces cerevisiae, Miyagawanella felis, and influenza virus A. J. Appl. Bacteriol., 57, 279-295. 9. Jacobs, S. E. & Thornley, M. J. (1954). The lethal action of ultrasonic waves on bacteria suspended in milk and other liquids. J. Appl. Bacteriol., 17, 38-56. 10. Hughes, D. E. & Nyborg, W. L. (1962). Cell disruption by ultrasound. Science, 138, 108-114. 11. Davies, R. (1959). Observations of the use of ultrasound waves for the disruption of microorganisms. Biochem. et Biophys. Acta, 33, 481-493. 12 Ahmed, F. I. K. & Russell, C. (1975). Synergism between ultrasonics waves and hydrogen peroxide in the killing of micro-organisms. J. Appl. Bacteriol., 39, 31-41. 13. Boucher, R. M. G., Pisano, M. A., Tortora, G. & Sawicki, E. (1967). Sonochemical sterilization. Ultrasonics, 7, 168-172. 14. Burleson, G. R., Murray, T. M. & Pollard, M. (1977). Inactivation of viruses and bacteria by ozone, with and without sonication. Appl. Microbiol., 29, 340-344. 15. Burgos, J., Ordoez, J. A. & Sala, F. J. (1972). Effect of ultrasonic waves on the heat resistance of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis spores. Appl. Microbiol., 24, 497-498. 16. Garca, M. L., Burgos, J., Sanz, B. & Ordoez, J. A. (1989). Effect of heat and ultrasonic waves on the survival of two strains of Bacillus subtilis. J. Appl. Bacteriol., 67, 619-628. 17. Neppiras, E. A. & Hughes, D. E. (1964). Some experiments on the disintegration of yeast by high intensity ultrasound. Biotechnol. Bioeng., 4, 247-270. 18. Pagn, R., Maas, P., Raso, J. & Condn, S. (1999). Bacterial resistance to ultrasonic waves under pressure at no lethal (Manosonication) and lethal (Manothermosonication) temperatures. Appl. Environ. Microbiol.,65, 297-300. 19. Raso, J., Palop, A., Pagn, R. & Condn, S. (1998). Inactivation of Bacillus subtilis spores by combining ultrasonic waves under pressure and mild heat treatment. J. Appl. Microbiol., 85, 849-854. 20. Suslick, K. S. (1988). Homogeneus sonochemistry. In K. S. Suslick, Ultrasound. Its chemical, physical, and biological effects. VCH Publishers, Inc., New York. 21. Pagn, R. (1997). Resistencia frente al calor y los ultrasonidos bajo presin de Aeromonas hydrophila, Yersinia enterocolitica y Listeria monocytogenes. Tesis Doctoral. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. 22. Allison, D. G., DEmanuele, A., Egington, P. & Williams, A. R. (1996). The effect of ultrasound on Escherichia coli viability. J. Basic Microbiol., 36, 3-11. 23. Pagn, R., Maas, P., Alvarez, I. & Condn, S. (1999). Resistance of Listeria monocytogenes to ultrasoncis waves under pressure at sublethal (manosonicacition) and letthal (manothermosonicacation) temperatures. Food Microbiol., 16, 139-148. 24. Kinsole, H., Ackerman, E. & Reid, J. J. (1954). Exposure of microoganisms to measured sound fields. J. Bacteriol., 68, 373-380. 25. Lee, B. H., Kermasha, S. & Baker, B. E. (1989). Thermal, ultrasonic and ultraviolet inactivation of Salmonella in thin films of aqueous media and chocolate. Food Microbiol., 6, 143-152. 26. Maas, P., Pagn, R., Raso, J., Sala, F. J. & Condn, S. (2000). Inactivation of Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium and Salmonella senftenberg by ultrasonic waves under pressure. J. Food Protec., (En prensa). 27. Raso, J., Pagn, R., Condn, S. & Sala, F. J. (1998). Influence of temperature and pressure on the lethality of ultrasound. Appl. Environ. Microbiol., 64, 465-471. 28. Vercet, A., Lpez, P. & Burgos, J. (1999). Inactivation of heat-resistant pectinmethylesterase from orange by manothermosonication. J. Agr. Food Chem., 47, 432-437.

.88.

CONFERENCIA DE CLAUSURA
Moderadora: Dra. Ana Rodrguez Gonzlez

.89.

.90.

DEL LABORATORIO A LA EMPRESA: Un Ejemplo de Transferencia de Tecnologa

SILVIA GONZLEZ CIENFUEGOS y GUILLERMO OLIVER CERELA, S.M. Tucumn. C/ Chacabuco, 145, Argentina Podramos definir a los ALIMENTOS como "una mezcla compleja de una variedad de compuestos qumicos", que generalmente pueden cumplir funciones que van ms all de ser una simple funcin de nutricin. Son transportadores de sustancias cuyo verdadero potencial sobre la salud todava es motivo de numerosos estudios. Podemos definir a los ALIMENTOS FUNCIONALES O NUTRACEUTICOS, como alimentos similares, en apariencias convencionales, su consumo forma parte de una dieta normal, y su estructura ha sido modificada o no, para cumplir roles fisiolgicos ms all de ser un requerimiento nutricional. Los ALIMENTOS FUNCIONALES constituyen para la industria alimentaria, un rea de mucha importancia y en constante expansin para el desarrollo de nuevos productos de consumo masivo. Los productos lcteos fermentados han sido una parte importante en la dieta de las poblaciones de todo el mundo. Hay numerosas publicaciones haciendo referencia a los efectos benefeciosos de estos alimentos sobre la salud. En la pasada dcada y actualmente ha habido y hay un creciente inters en el uso de microorganismos probiticos, en alimentos y productos nutricionales. Los PROBIOTICOS pueden ser definidos como suplementos alimenticios microbianos vivos que benefician la salud del consumidor manteniendo o restaurando el balance normal de la microflora del intestino (Fuller) La venta y el consumo de productos probiticos ha aumentado dramaticamente en los paises de Europa, Asia del Pacfico y Amrica y el 90% de ellos contiene Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterias, solos o asociados. Estos productos alimenticios estn en los supermercados de muchos pases. Se ha demostrado que los beneficios que los alimentos probiticos tienen sobre la salud, se debe a las bacterias probiticas vivas. El nmero mnimo de estas bacterias para que tengan actividad sobre los individuos que consumen estos alimentos es de poblaciones de 106 ufc/gr. producto. Suplementos dietarios no digeribles han sido motivo de estudios, ya que modifican el balance de la microflora intestinal, estimulando el crecimiento y/o la actividad de organismos beneficiosos y suprimiendo bacterias potencialmente nocivas. A estas sustancias se las conoce como PREBIOTICAS. Pertenecen a este grupo lactulosa y lactitol, una variedad de oligosacridos e inulina. En particular los PREBIOTICOS promueven la proliferacin de bifidobacterias en el coln. En la Repblica Argentina el desarrollo de investigaciones probiticas comenzaron en el ao 1984, cuando mdicos del Hospital de Nios de Tucumn buscaban una solucin para las muertes de nios de corta edad por las diarreas estivales que en la regin superaban el 20 %o. La hiptesis que manejamos fue, que se trataba de un problema de perdida del equilibrio ecolgico del intestino que tenamos que restablecer. Si introducamos con un alimento en el instestino de un nio enfermo, poblaciones elevadas de bacteras lcticas probiticas de origen humano, con propiedades que les permitiera eliminar enteropatgenos, podra restablecerse el

.91.

equilibrio perdido. Para nuestra hipotess, se us una leche fermentada que contena 108 ufc/gr producto. Trabajamos con nios que sufran de diarreas prolongadas que en algunos casos superaban el ao de duracin. Los resultados fueron inesperados, ya que de cada 10 nios enfermos curaban 9 en un plazo relativamente corto (entre 8 y 15 das). Se estudiaron las propiedades del producto y se lleg a la conclusin que era un alimento con cualidades especiales para consumo masivo, para cualquier edad y por personas sanas. Estos estn includos entre los alimentos funcionales o nutracuticos. Este producto desarrollado en nuestro pas, fue posible, gracias a la asociacin en un proyecto de riesgo compartido con la empresa lechera ms grande del pas "SANCOR" Cooperativas Unidas Limitada y nuestro grupo de trabajo. Hoy, CONICET y SANCOR son dueos de la patente de este producto. La leche SANCOR BIO ejemplifica uno de los ms exitosos resultados de complementacin entre una empresa privada con cientficos de organismos del gobierno argentino. Su desarrollo se ha debido al trabajo asociado de los investigadores del Laboratorio de ECOFISIOLOGIA TECNOLOGICA de CERELA y los grupos de Investigacin y Desarrollo de SANCOR. La incorporacin sistemtica de los conocimientos cientficos y tecnolgicos a todas las actividades econmicas, sociales y culturales es uno de los desafos fundamentales que enfrentamos en Argentina para avanzar en el proceso de desarrollo econmico y social sostenido. En la medida en que la actividad cientfica genere nuevos conocimientos, aporte a la formacin de recursos humanos y provea los insumos cientficos que son indispensables para la construcin de una sociedad basada en el conocimiento, esta actividad debe ser una prioridad nacional. El estado tiene la responsabilidad indelegable de financiar la actividad cientfica, acorde con criterios de calidad y pertenencia y de programar la formacin de recursos humanos para dotar al pas de una amplia base cientfica. Una industria de alimentos exitosa depende no solamente en la seguridad que el alimento sea elaborado en condiciones tecnolgicas adecuadas, sino tambin en la capacidad para innovar, aceptar y satisfacer los requerimientos del consumidor. Un crecimiento provechoso, la innovacin y explotacin de nuevas tecnologas, requiere que los trabajos de Investigacin y Desarrollo, fabricacin, manipulacin, venta, distribucin, junto a los productos tradicionales deben ser provistos a la poblacin, y que por reunir las exigencias de calidad puedan ser comprados una y otra vez. El papel de la investigacin y Desarrollo es enfrentar las necesidades del mercado y crear productos nuevos, con el costo correcto, con la calidad correcta y con el nivel de satisfaccin tecnolgica correcta. El desarrollo de alimentos funcionales y probiticos requiere cuidadosa antencin para la seguridad, rotulado, descripcin del producto as como las propiedades nutricionales, fisiolgicas y sensoriales dependiendo fuertemente de los fundamentos cientficos de los cuales la seguridad y eficiencia son los componentes principales. Hay ya un reconocimiento que la investigacin en los pases debe ser la vanguardia en el conocimiento del papel que tienen los alimentos en el mantenimiento de la salud humana, del bienestar y la reduccin del riesgo de las principales enfermedades. Cada vez son ms importantes los esfuerzos de colaboracin entre investigadores, el gobierno y las industrias. La leche SANCOR BIO propone una nueva manera de pensar en alimentos y nutricin fudamentado en evidencias cientficas de sus propiedades y funciones fisiolgicas para el mantenimiento en las personas de un estado de bienestar y salud y/o para reducir el riesgo de una enfermedad.

.92.

La idea fundamental es que la ecologa y el equilibrio biolgico establecido por la Naturaleza debe ser respetado, como la nica forma de preservar la vida y el bienestar del hombre sobre la tierra.

.93.

.94.

COMUNICACIONES

.95.

.96.

AREAS TEMATICAS DE COMUNICACIONES Y SUS ABREVIATURAS

1.ABA APLICACIN DE MICROORGANISMOS EN LA BIOCONSERVACIN DE ALIMENTOS 2.CC CONTROL DE CALIDAD EN EL ANLISIS MICROBIOLGICO. 3.FM FERMENTACIN Y MADURACIN DE ALIMENTOS. 4.FYM FISIOLOGA Y METABOLISMO. 5.GM GENTICA MICROBIANA. 6.MA MICROORGANISMOS ALTERANTES. 7.MIS MICROORGANISMOS DE INTERS SANITARIO. 8.PRO PROBITICOS. 9.TPC TECNOLOGAS DE LA PRODUCCIN Y CONSERVACIN DE ALIMENTOS. 10.O OTROS.

.97.

.98.

APLICACIN DE MICROORGANISMOS EN LA BIOCONSERVACIN DE ALIMENTOS

.99.

.100.

ABA/1

EFECTO DE DISTINTAS BACTERIOCINAS Y SUS COMBINACIONES FRENTE A MICROORGANISMOS PATGENOS.

J.L. Arqus, E. Rodrguez, M. Nuez y M. Medina Dpto. Tecnologa de Alimentos, INIA, Ctra. La Corua Km 7, 28040-Madrid OBJETIVOS Se ha investigado la actividad inhibitoria de la nisina en combinacin con otras bacteriocinas frente a distintos microorganismos patgenos Gram-positivos y Gram-negativos asociados a leche y productos lcteos. MTODOS Las bacteriocinas ensayadas fueron: nisina, lacticina 481 producida por Lactococcus lactis subsp. cremoris TAB 24, enterocina I producida por Enterococcus faecalis TAB 52, enterocina AS-48 producida por E. faecalis TAB 70, y las bacteriocinas no caracterizadas TAB 7 y TAB 57 producidas por E. faecium TAB 7 y Lc. lactis TAB 57, respectivamente. La nisina (100 UI/ml) se adicion a partir del preparado comercial Nisaplin, mientras que las dems bacteriocinas se aadieron como sobrenadantes neutralizados y filtrados de los cultivos bacteriocinognicos. Como microorganismos indicadores se utilizaron las cepas Listeria monocytogenes Ohio, Staphylococcus aureus CECT 976, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894, Salmonella choleraesuis CECT 409 y Campylobacter jejuni LMG 6629. Se inocularon los distintos caldos de cultivo con aprox. 104 ufc/ml del microorganismo indicador y se aplicaron las seis bacteriocinas individualmente y en combinaciones de cada una de ellas con nisina. Los cultivos se mantuvieron a la temperatura ptima de crecimiento del microorganismo indicador durante 24 h. Se realizaron recuentos en placas de TSA o Agar sangre en el caso de Campylobacter, a las 4 h y 24 h. RESULTADOS L. monocytogenes alcanz en el caldo control niveles de 5.72 log ufc/ml a las 4 h y de 8.89 log ufc/ml a las 24 h. A las 4 h los niveles de L. monocytogenes en caldo con nisina fueron de 1.11 log ufc/ml y no se detect con enterocina I, enterocina AS-48 ni con las combinaciones de nisina con lacticina 481, nisina con enterocina I, nisina con enterocina AS-48 y nisina con bacteriocina TAB 7. A las 24 h, L. monocytogenes se recuper en el caldo con nisina alcanzando 7.94 log ufc/ml. No se detect en presencia de enterocina I y sus niveles con enterocina AS-48 y bacteriocina TAB 57 fueron de 0.61 y 3.31 log ufc/ml, respectivamente. Sin embargo, con la bacteriocina TAB 7 se alcanzaron niveles de 9.19 log ufc/ml. Los tratamientos combinados de nisina con bacteriocina TAB 7 y nisina con bacteriocina TAB 57 mostraron un efecto inhibitorio sinrgico, mientras que la combinacin de nisina y enterocina AS-48 tuvo un efecto aditivo. S. aureus alcanz a las 24 h niveles de 8.07 log ufc/ml en el caldo control. En caldo con nisina no se detect presencia del microorganismo a las 24 h. El resto de las bacteriocinas aplicadas individualmente no mostr efecto inhibitorio sobre S. aureus. Ninguna bacteriocina interfiri en la accin de la nisina, obtenindose en todos los tratamientos combinados ausencia de S. aureus a las 24 h. Ninguno de los tratamientos mostr inhibicin sobre E. coli O157:H7, S. choleraesuis o C. jejuni. CONCLUSIONES Los aislamientos bacteriocinognicos E. faecium TAB 7 y Lc. lactis TAB 57 en combinacin con concentraciones bajas de nisina presentan un efecto inhibitorio sinrgico que apunta a su inters como cultivos protectores frente a la contaminacin de alimentos por L. monocytogenes.

.101.

ABA/2 CARACTERIZACIN DE UNA BACTERIOCINA PRODUCIDA POR ENTEROCOCCUS FAECALIS TAB 52 J. Fernndez, E. Rodrguez, M. Nuez y M. Medina. Departamento de Tecnologa de Alimentos. INIA. Carretera de la Corua Km 7. 28040-Madrid OBJETIVOS Enterococcus faecalis TAB 52 aislado de leche cruda de cabra, produce una bacteriocina con un amplio espectro inhibitorio que incluye a Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium tyrobutyricum y Lactobacillus buchneri. El objetivo del presente trabajo fue purificar dicha bacteriocina mediante tcnicas de cromatografa lquida y llevar a cabo su caracterizacin. MTODOS El proceso de purificacin consisti en dos pasos cromatogrficos. El extracto crudo a partir del cual se purific la bacteriocina se obtuvo a partir del sobrenadante del medio de cultivo una vez separadas las clulas de E. faecalis TAB 52. Las protenas contenidas en el extracto crudo se precipitaron con sulfato amnico al 90%. El precipitado resuspendido en tampn fosfato se aplic a una columna de interaccin hidrofbica con Phenyl-Sepharose. Dado el carcter hidrofbico de la bacteriocina, sta se retuvo fuertemente en la columna de forma que en la elucin con tampn fosfato se elimin la mayor parte de las protenas contenidas en el extracto. La elucin de la bacteriocina se realiz utilizando isopropanol al 50%. Una vez evaporado el isopropanol y resuspendido el extracto en tampn fosfato, se aplic a una columna de exclusin molecular con Sephadex G-50. Las fracciones con actividad inhibitoria frente al cultivo indicador de L. buchneri St2A se unieron y congelaron a 40C hasta su posterior utilizacin. El peso molecular de la bacteriocina se estim en SDS-PAGE utilizando un equipo PhastSystem (Pharmacia). Para determinar la secuencia de aminocidos se transfiri la bacteriocina a una membrana de PVDF mediante electroblotting. La bacteriocina se digiri con la enzima Lys-C y los fragmentos originados se separaron utilizando un equipo SmartSystem (Pharmacia). Cada fragmento se secuenci por separado en un equipo Procise Sequenator (Applied Biosystems). La secuencia obtenida se envi al Instituto Europeo de Bioinformtica en la direccin de Internet www2.ebi.ac.uk para la bsqueda de secuencias similares a la bacteriocina utilizando el programa FASTA3. RESULTADOS La bacteriocina producida por E. faecalis TAB52 se purific 653 veces con un rendimiento del 90%. El peso molecular estimado para la bacteriocina en SDS-PAGE fue de 6 kDa. Se secuenciaron 3 fragmentos diferentes, identificndose en total 29 aminocidos. Tras realizar una comparacin con las bases de datos de protenas se obtuvo una elevada homologa con la enterocina I de E. faecalis. La nica diferencia encontrada entre la TAB 52 y la enterocina I fue el aminocido en posicin 38 (cido asprtico por cido glutmico).

.102.

ABA/3

AISLAMIENTO Y SELECCIN DE LACTOBACILOS PRODUCTORES DE REUTERINA A PARTIR DE HECES DE CERDO

E. Rodrguez, J. Fernndez, J.L. Arqus, P. Gaya, M. Nuez y M. Medina Dpto. Tecnologa de Alimentos, INIA, Ctra. La Corua Km 7, 28040-Madrid OBJETIVOS La reuterina (-hidroxipropionaldehido) es una potente sustancia antimicrobiana de amplio espectro de actividad producida por Lactobacillus reuteri durante la fermentacin anaerbica del glicerol (Axelsson et al. 1989; Microb. Ecol. Health Dis. 2:131-136). Se pretende obtener aislamientos de lactobacilos capaces de producir reuterina en cantidades elevadas para el empleo de dicha sustancia inhibitoria en la mejora de la calidad microbiolgica de alimentos. MTODOS El aislamiento de lactobacilos se realiz en placas de agar Rogosa a partir de 33 muestras de heces de cerdos procedentes de distintas granjas de La Corua. La produccin de reuterina a partir de glicerol se investig en los aislamientos productores de gas en caldo MRS. Las clulas procedentes de 1 ml del cultivo crecido de cada aislamiento se resuspendieron en 0,5 ml de glicerol 250 mM y se incubaron a 37C durante 3 h en anaerobiosis. La reuterina presente en los sobrenadantes se cuantific mediante el ensayo colorimtrico de Circle et al. (1945; Ind. Eng. Chem. Ed. 2:259-262) utilizando como cepa de referencia la cepa productora de reuterina L. reuteri DSM 20016. La actividad inhibitoria de la reuterina se determin segn el mtodo descrito por El-Ziney et al. (1996; Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent 61/4a:1573-1583) utilizando como cepa indicadora Escherichia coli K12. RESULTADOS Se seleccionaron 30 de los 165 aislamientos efectuados a partir de heces de cerdo por producir reuterina en cantidad superior a 0,5 g/ml. La cantidad de reuterina producida por la cepa de referencia L. reuteri DSM 20016 fue de 0,96 g/ml de sobrenadante. Se confirm la produccin de reuterina en cantidades superiores a la de la cepa de referencia L. reuteri DSM 20016 en 29 de los 30 aislamientos seleccionados. Siete de los aislamientos presentaron en su sobrenadante concentraciones de reuterina superiores a 20g/ml, 16 aislamientos entre 10 y 20 g/ml y 6 aislamientos entre 1 y 10 g/ml. Se detect la presencia de actividad inhibitoria frente a E. coli K12 en los sobrenadantes de los 30 aislamientos seleccionados. La MIC (mnima concentracin inhibitoria) de reuterina para E. coli K12 fue de 4 U/ml con L. reuteri DSM 20016. La mayora de los sobrenadantes de los aislamientos ensayados presentaron actividades inhibitorias muy superiores a la de la cepa de referencia. CONCLUSIN Los aislamientos de lactobacilos obtenidos podran utilizarse en la produccin de reuterina para su aplicacin en la mejora de la calidad microbiolgica de alimentos.

.103.

ABA/4

COMBINACIN DE BACTERIOCINAS Y CEPAS DE Lactobacillus plantarum PRODUCTORAS DE BACTERIOCINAS EN LA FERMENTACIN Y CONSERVACIN DE ZANAHORIAS
R. Jimnez Daz, B. Floriano, A. Maldonado, L. Rejano, A.H. Snchez y J.L. Ruiz Barba. Dpto. de Biotecnologa de Alimentos, Instituto de la Grasa (CSIC) Avda. Padre Garca Tejero, 4, Aptdo. 1078, 41012 Sevilla OBJETIVOS Estudiar si la utilizacin de cepas de L. plantarum productoras de bacteriocinas en la fermentacin de zanahorias y la adicin posterior de bacteriocinas al producto envasado supone una ventaja en la conservacin a largo plazo de dichos productos vegetales. MATERIALES Y MTODOS Como cultivos iniciadores se utilizaron L. plantarum LPCO10 SmR [productora de plantaricina S (plS+) y resistente a la misma (plSR), 105 UFC/ml], L. plantarum LP128/2 RifR (plS-, plSS, 104 UFC/ml) y L. plantarum LP55-1 SmR (plS-, plSR, 105 UFC/ml). Las zanahorias se sumergan en agua a 80 C durante 5 min, se cortaban a rodajas y se colocaban en salmuera (7% NaCl) en fermentadores de 5 kg. Los ensayos de fermentacin se realizaron de la siguiente forma: los fermentadores -por parejas- se inocularon con las cepas LPCO10, LP55-1, LP128/2 en cultivos simples, y con las cepas LP128/2 y LP55-1, LPCO10 y LP128/2 en cultivos mixtos, incubndose durante 15 das a 30 C. Peridicamente se realizaban anlisis microbiolgicos y fisico-qumicos de las salmueras. Para los ensayos de conservacin, las zanahorias se trataron como se describe anteriormente, inoculndose dos fermentadores con L. plantarum LPCO10 SmR (plS+, plSR) y otros dos con L. plantarum LP55-1 SmR (plS-, plSR). A los 2 das de fermentacin (fermentacin incompleta) las zanahorias pertenecientes a cada grupo de fermentacin se envasaron en frascos de cristal (140 g de zanahorias/100 ml de salmuera), dividindolos a su vez en tres series: una, de envasados a acidez alta (0,5%), otra, a acidez media (0,3%), y una tercera, a acidez baja (0,03%). A la serie correspondiente a acidez baja se le aadi tambin sorbato (0,12 g/frasco). Los frascos se pasteurizaron (6 min a 80 C) y a cada uno de ellos se les aadi aprox. 102 UFC/ml de la cepa L. plantarum 128/2 y dos niveles diferentes de enterocina I (ENTI, una bacteriocina producida por Enterococcus faecium 6T1a) semipurificada: 6 105 y 6 104 unidades de ENTI por ml (UENTI/ml), respectivamente. Los frascos se incubaron a 25 C y se tomaron muestras a t = 0, t = 30 das, t = 120 das y t = 180 das, determinndose en cada caso los parmetros fisico-qumicos y microbiolgicos de las muestras. RESULTADOS Las fermentaciones de zanahorias utilizando cultivos iniciadores de cepa nica evolucionaron de manera similar, tanto desde el punto de vista microbiolgico como desde el punto de vista fisico-qumico. Sin embargo, en las fermentaciones donde se utilizaron cultivos mixtos, la cepa LP128/2 predomin sobre la cepa LP55-1, mientras que la cepa LPCO10 lo hizo sobre la cepa LP128/2. En cuanto a la conservacin, en todos los casos hubo desarrollo de la cepa inoculada (LP128/2) a t = 30 das (aprox. 107 UFC/ml). Sin embargo, a t =120 y 180 das, la cepa inoculada se mantuvo en valores comprendidos entre 104 y 106 UFC/ml en el caso de las zanahorias fermentadas con el cultivo iniciador L. plantarum LP55-1, mientras que prcticamente no se detect en ninguno de los frascos que contenan las zanahorias fermentadas con la cepa bacteriocinognica L. plantarum LPCO10, ms cualquiera de los niveles de ENTI. CONCLUSIONES 1) De los cultivos iniciadores utilizados, la cepa LPCO10 result ser el mejor para la fermentacin de zanahorias. 2) Existe un efecto sinrgico entre la bacteriocina exgena (ENTI) y la producida in situ por la cepa LPCO10 (plS), lo que demuestra la conveniencia de dicha combinacin para una conservacin adecuada del producto.

.104.

ABA/5

PRESENCIA DEL OPERN plnABCD, PRECURSOR DE LA PLANTARICINA A, EN BACTERIAS LCTICAS DE VINOS DE D.O.C. RIOJA
Navarro, L., Zarazaga, M., Dizy, M., Ruiz-Larrea, F., Torres, C. Departamento de Agricultura y Alimentacin. Universidad de La Rioja. Avda de la Paz, 105. 26004 Logroo. La Rioja. OBJETIVOS Estudio del opern plnABCD en cepas de bacterias lcticas (BL) de vinos de la D.O.C. Rioja: frecuencia de aparicin del gen plnA precursor de la plantaricina A y de los genes, plnB, plnC y plnD que componen el sistema regulador de dicho opern. MATERIAL Y MTODOS Cepas estudiadas: Lactobacillus plantarum (21), Lb. brevis (6), Leuconostoc mesenteroides (6), Lb. paracasei (2), Pediococcus pentosaceus (1), Lactococcus lactis lactis (1), P. damnosus (1), P. acidilactici (1). Deteccin de la produccin de bacteriocina segn el mtodo "spot on the lawn". Diseo de los cebadores para la reaccin en cadena de la polimerasa mediante el paquete informtico GCG (Genetics Computer Group). Amplificacin por PCR de los genes plnA, plnB, plnC y plnD RESULTADOS Se detect produccin de bacteriocina en 9 de las 21 cepas de Lb. plantarum estudiadas no detectndose actividad antimicrobiana en ninguna de las otras especies estudiadas. En 16 de las 21 cepas de Lb. plantarum estudiadas (9 cepas productoras, Bac+ y 7 no productoras, Bac-), se observ la presencia del gen plnA que codifica el precursor de la plantaricina A. En las 9 cepas de Lb. plantarum Bac+ se detect la presencia de cada uno de los genes que constituyen el opern plnABCD, plnA precursor de la plantaricina A y el sistema regulador plnBCD. De las 7 cepas de Lb. plantarum Bac- en las que se amplific el gen plnA, en 6 de ellas tambin se observ la presencia de los 3 genes reguladores del opern plnABCD, mientras que en la otra cepa restante slo se detect el gen plnC, resultando negativas las PCRs de los genes plnB y plnD. En ninguna de las 23 cepas restantes Bac- estudiadas (incluyendo 5 Lb. plantarum) se observ la presencia del gen plnA. La PCR para el gen plnD fue positiva en 1 Lb. plantarum y 1 Lactococcus lactis lactis, siendo la plnC positiva en 1 Lb. brevis y la plnB negativa para todos ellos. CONCLUSIONES 1) En todas las cepas de Lb. plantarum con actividad Bac+ se detect la presencia de cada uno de los genes que constituyen el opern plnABCD, aunque dicho opern tambin se puso en evidencia en cepas de Lb. plantarum sin actividad bacteriocina demostrable. 2) El opern plnABCD slo se detect en Lb. plantarum, especie aislada frecuentemente en vinos de D.O.C. Rioja. 3) Ciertas cepas que poseen el opern plnABCD completo se inhiben entre s, lo que lleva a pensar que la inhibicin detectada pueda tambin deberse a otras actividades diferentes a la plantaricina A. Este hecho abre nuevas espectativas en la bsqueda y caracterizacin de bacteriocinas y/o de cepas de BL productoras aisladas de vinos. El empleo de bacteriocinas puede considerarse como un mtodo biolgico alternativo a los conservantes qumicos que actualmente se utilizan en enologa.

.105.

ABA/6

CONTROL DEL DESARROLLO DE MICROORGANISMOS PATGENOS (Staphylococcus aureus) Y ALTERANTES (Clostridium tyrobutyricum) EN QUESOS MEDIANTE CEPAS PRODUCTORAS DE NISINA Z
N. Rilla, B. Martnez, y A. Rodrguez. Instituto de Productos Lcteos de Asturias (IPLA-CSIC). Crta de Infiesto s/n 33300, Villaviciosa-Asturias OBJETIVOS. El presente trabajo pretende determinar la capacidad de la cepa Lactococcus lactis ssp. lactis IPLA 729, productora de nisina Z, para controlar el desarrollo de microorganismos alterantes (ej. Clostridium tyrobutyricum) y patgenos (ej. Staphylococcus aureus, coagulasa + ) durante la maduracin de quesos. Para ello, se ha incluido la cepa bacteriocinognica en el cultivo iniciador diseado previamente en el Instituto de Productos Lcteos de Asturias. MATERIAL Y MTODOS El cultivo iniciador utilizado est constituido por las cepas Lactococcus lactis ssp. lactis IPLA 729 (productora de nisina Z), L. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis IPLA 838 y Leuconostoc citreum IPLA 616. El efecto inhibitorio de la nisina Z sobre S. aureus se estudi en un queso de coagulacin cida (Afuegal Pitu), mientras que el efecto sobre C. tyrobutyricum se ensay en un queso de coagulacin enzimtica (Vidiago). Los recuentos microbianos se realizaron a lo largo del perodo de maduracin de los quesos, utilizando los siguientes medios: M17-agar para lactococos; M17-N agar (M17 suplementado con nisina comercial) para la cepa productora de nisina Z; MSE agar para leuconostoc; Medio Tyrobutyricum-Rojo Neutro para C. tyrobutyricum; Baird Parker para S. aureus. Para determinar el efecto que la cepa productora de nisina Z tiene sobre el desarrollo de S. aureus, se contamin con 1,8 x 104 ufc/ml de dicho microorganismo la leche pasterizada destinada a la elaboracin de queso. En el caso de C. tyrobutyricum, se procedi a contaminar con 1,2 x 106 ufc/g de clulas vegetativas de dicho microorganismo quesos elaborados con leche pasterizada de 2 das de maduracin. RESULTADOS En los quesos de coagulacin cida, donde se estudi la evolucin de S. aureus, ya en la cuajada se produce un leve descenso del nivel de este microorganismo patgeno, mientras que en ausencia de la cepa nis+, S. aureus aumenta casi 1 log. A los 15 das de maduracin, S. aureus ha desaparecido completamente en presencia del productor de nisina, y se mantiene en torno a 102 ufc/ml en ausencia de la misma. En los quesos de coagulacin enzimtica contaminados con C. tyrobutyricum, los niveles de este microorganismo alterante descienden hasta 3 log a lo largo de la maduracin y se sitan en 1,7 x 103 ufc/ml a los 30 das en los quesos elaborados con la cepa productora de nis Z. En ausencia de la cepa nis+, los niveles de Clostridium aumentan progresivamente alcanzando al final de la maduracin niveles de 5,4 x 109 ufc/g. CONCLUSIN La incorporacin de cepas productoras de nisina Z a cultivos iniciadores constituye una interesante estrategia para controlar la contaminacin por microorganismos patgenos y alterantes en quesos.

.106.

ABA/7

PRODUCCIN DE BACTERIOCINAS POR BACTERIAS LCTICAS DE ORIGEN ANIMAL.

B. Robredo, C. Tenorio y C. Torres. Departamento Agricultura y Alimentacin. Universidad de La Rioja. Avda. de la Paz, 105, 26004 Logroo, La Rioja. OBJETIVOS Se pretende evaluar la produccin de bacteriocinas por 29 bacterias lcticas de origen intestinal de animales y analizar su papel en la ecologa intestinal. MATERIAL Y MTODOS Las cepas estudiadas fueron las siguientes: 18 Lactobacillus salivarius, 1 Lb fructivorans, 2 Pediococcus pentosaceus, 1 P. acidilactici, 3 Lb. fermentum, 1 Lb. viridescens, 1 Lb. brevis, 2 Lactobacillus spp. obtenidos a partir de muestras fecales de cerdos (20) y de animales de compaa (9). Se utilizaron 59 cepas como indicadoras de diferentes gneros (7) y especies (27) (Bacillus, Listeria, Micrococcus, Staphylococcus, Escherichia, Lactobacillus y Pediococcus). La deteccin de bacteriocinas se realiz como se ha referido con anterioriodad (Navarro, L. et al, J. Appl. Microbiol. 1999, 88:44-51). Se utiliz la tcnica de PCR para la deteccin del gen plnA (Remiger, A. et al. System. Appl. Microbiol. 1996, 19:28-34). RESULTADOS: En 11 de las 18 cepas de Lb. salivarius (61%) (todas ellas aisladas a partir de muestras intestinales de cerdos) se detect actividad antimicrobiana, cuyo espectro de accin se refleja en la tabla siguiente: Lb. salivarius productores de bacteriocinas X13 X61 X19 X24, X25 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + X8, X16, X19, X20, X21, X63 + -

INDICADORES Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Micrococcus luteus Listeria murrayi Listeria monocytogenes Lactobacillus paracasei Lactobacillus salivarius Lactobacillus fermentum Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus

Todas las cepas productoras presentaron actividad inhibitoria frente a Staphylococcus aureus y 5 de ellas frente a Staphylococcus epidermidis. Dos de estas cepas (X13 y X61) presentaron actividad antimicrobiana frente a 9 y 6 especies diferentes, respectivamente. Ninguna de estas 11 cepas productoras present actividad inhibitoria frente a E. coli o Bacillus. El resultado de la PCR para plnA utilizando estas cepas fue negativo en todos los casos. No se detect produccin de bacteriocinas en ninguna de las otras especies de bacterias lcticas estudiadas.

Las cepas de Lb. salivarius de origen intestinal con frecuencia producen sustancias
antimicrobianas frente a Staphylococcus. La produccin de bacteriocinas por Lb. salivarius frente a otras bacterias lcticas podra justificar la predominancia de esta especie en el intestino de los cerdos.

CONCLUSIONES

.107.

ABA//8

INHIBICIN DE BACTERIAS PATOGENAS POR BACTERIOCINAS Y/O BLIS PRODUCIDOS POR LA MICROBIOTA DEL CHORIZO DE CANTIMPALOS (SEGOVIA)
J. Javier Sanz-Gmez, M.N. Gonzlez-Rodrguez, V.M. Fernndez-Barata, Irma Caro-Canales*, A. Otero y M.L. Garca-Lpez. Dpto. Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Univ. de Len. C.U. Vegazana s/n, 24071-Len. *Univ. Autnoma del Estado de Hidalgo, Mxico. OBJETIVOS Diferentes microorganismos patgenos aislados frecuentemente de embutidos fermentados no se aislaron en las muestras analizadas del chorizo de Cantimpalos (Segovia). Por ello se plante el estudio de la microbiota salvaje con el objeto de conocer su capacidad para controlar o inhibir la microbiota patgena a travs de la produccin de bacteriocinas y/o BLIS. METODOS Se llev a cabo el estudio sobre muestras de chorizo de Cantimpalos listos para el consumo (48 muestras) y sobre las muestras resultantes del estudio del seguimiento del proceso de fabricacin (4 lotes de fabricacin) de este embutido. Se consideraron como poblaciones microbianas de potencial inters: bacterias acidolcticas (BAL), enterococos (E. faecium) y bacilos aerobios esporulados (Bacillus y otros gneros). La actividad antimicrobiana se estudi siguiendo los esquemas propuestos por Schilliger y Lcke (1989, Appl. Environ. Microbiol., 55, 1901), Vignolo et al, (1993, J. Appl. Bacteriol., 75, 344) y Sutherland y Murdoch (1994, Int. J. Food Microbiol., 21, 279). RESULTADOS La accin antibacteriana de las BAL frente a la microbiota patgena considerada (Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Listeria monocytogenes) fue considerable: el 16,45% de las BAL estudiadas (158 cepas ). Estas se identificaron como Lactobacillus curvatus subsp. curvatus (17), Lactobacillus sakei subsp. carnosus (2) y pediococos (3). La accin inhibidora de estas cepas no fue debida ni al cido ni a la presencia de perxido de hidrgeno. Es interesante destacar el importante nmero de cepas con efecto positivo de control y su accin sobre microorganismos Gram-negativos, actividad raramente recogida en la bibliografa. Las cepas de Enterococcus faecium no hemolticas se estudiaron en relacin con su actividad anti-Listeria. De las 12 cepas seleccionadas inicialmente, slo dos manifestaron dicha actividad despus de tamponar los sobrenadantes (pH 6,8) y tratarlos con H 2O 2. Estos filtrados se sometieron a tratamientos enzimticos y trmicos. La mxima actividad anti-Listeria se manifest en los filtrados correspondientes a las 15 y 20 horas de incubacin y obtenidos en cultivos en caldo BHI (Unipath). La congelacin y la adicin de catalasa no afectaron a la actividad de estos compuestos, pero s lo son a los diferentes enzimas ensayados. Estos compuestos no manifestaron actividad proteoltica, lipoltica ni hemoltica; y no manifestaron efecto inhibidor sobre las cepas de bacterias acidolcticas que mostraron actividad antimicrobiana. En las muestras de chorizo de Cantimpalos analizadas no se detect la presencia de Bacillus cereus. En nuestro estudio se comprob como cepas identificadas como B. subtilis y que no manifestaron actividad citotoxignica fueron capaces de inhibir a cepas de B. cereus toxignicas ensayadas (7 cepas de origen lcteo y ambiental). CONCLUSIONES Las poblaciones de bacterias acidolcticas, E. faecium y B. subtilis aisladas de chorizo de Cantimpalos manifestaron una importante actividad de control sobre diferentes microorganismos patgenos aislados frecuentemente de embutidos; y se requiere de un conocimiento ms exacto de la caracterizacin bioqumica de estos productos, y su comportamiento en embutidos en condiciones de planta piloto e industrial.

.108.

CONTROL DE CALIDAD EN EL ANLISIS MICROBIOLGICO

.109.

CC/1

ANLISIS MICROBIOLGICO DE YOGURES Y LECHES FERMENTADAS COMERCIALIZADOS EN ESPAA

J. M. Aguiar, M. P. Gonzlez, S. Marcos, y P. Nicols. Laboratorio CONTROL MICROBIOLGICO S.L., C/ Leopoldo Alas Clarn n 53, 28035 Madrid. OBJETIVOS Conocer la calidad bacteriolgica de yogures y de leches fermentadas comercializadas en Espaa aplicando la normativa microbiolgica recogida en el Real Decreto 874/1.987 y efectuando recuentos diferenciales de los diferentes microorganismos fermentantes. METODOS Se adquirieron yogures y leches fermentadas en diferentes establecimientos comerciales pertenecientes a las siguientes marcas: Central Lechera Asturiana, Clesa, Danone, Frixia, Kaiku, Nestle y Yoplait. Los productos analizados incluyeron desde yogures clsicos (naturales, azucarados y desnatados), variantes de yogures como los denominados griego, bulgaro y musse de yogur hasta leches fermentadas por bifidobacteras o por L. acidophilus. De cada producto se analizaron 3 muestras calculndose la media de los recuentos obtenidos de los diferentes microorganismos fermentantes. Para el recuento de dichos microorganismos se utilizaron los siguientes medios: Agar MRS para Lactobacillus bulgaricus, Agar M17 para Streptococcus thermophilus, Agar MRS (pH 6,5 y 5,2) para L. acidophilus y Agar MRS-NNLP (con cido nalidxico, neomicina, cloruro de litio, paramomycina y cistena) para bifidobacterias. RESULTADOS Se analizaron un total de 123 muestras pertenecientes a 41 productos comerciales diferentes procedentes de 7 fabricantes. Los productos analizados pertenecan a las siguientes categoras: 10 yogures naturales, 8 azucarados, 7 desnatados, 4 variantes de yogures (griego, bulgaroy musse de yogur natural y azucarada), 10 leches fermentadas por bifidobacterias (6 naturales y 4 desnatadas) y 2 por L. acidophilus (1 natural y uno desnatado). En ninguna de las 123 muestras analizadas se superaron las tolerancias microbiolgicas contempladas en la normativa vigente no detectndose en ningn caso enterobacterias lactosa (+), Escherichia coli, Salmonella spp. ni Shigella spp. Los recuentos de microorganismos fermentantes encontrados en los yogures superaron, en la mayora de los casos 107 ufc/ml. Sin embargo, en 5 de los 26 yogures definidos por nosotros como clsicos (naturales, azucarados y desnatados) la media de los recuentos obtenidos en las tres muestras de cada producto fueron inferiores a 107 ufc/ml de L. bulgaricus as como en todas las muestras analizadas de las variantes de yogures denominadas yogur griego y musse de yogur. Respecto a las leches fermentadas, destacamos que en 5 de las mismas se detectaron recuentos inferiores a 107 ufc/ml de bifidobacterias. CONCLUSIONES 1. Todos los productos analizados cumplieron la normativa microbiolgica recogida en el Real Decreto 874/1.987. 2. El 19% de los yogures analizados presentaron recuentos de L. bulgaricus inferiores a lo exigido por dicha legislacin para definir a una leche fermentada como yogur. 3. En alguna de las leches fermentadas analizadas se detectaron recuentos inferiores a 107 ufc/ml de bifidobacterias, cantidad inferior a la mnima considerada como necesaria para conferir al producto propiedades probiticas.

.110.

CC/2

DETECCION DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN CARNE MEDIANTE PCR

R. Aznar y B. Alarcn. Dpto. Microbiologa, Universitat de Valncia. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA)(CSIC). Apartado de correos 73, Burjassot 46100, Valencia. OBJETIVOS Disear un mtodo, rpido y sensible para la deteccin de Listeria monocytogenes en carne, basado en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que permita su aplicacin rutinaria en el anlisis microbiolgico, reduciendo el tiempo de deteccin a 1-2 das en lugar de los 7 das que se requieren con los mtodos tradicionales. MTODOS La deteccin de L. monocytogenes por PCR se realiz utilizando dos iniciadores especficos que amplifican 234 pares de bases del gen que codifica para la listeriolisina O (Ericsson & Stalhandske, 1997). Previamente se comprob su especificidad sobre una coleccin de 26 cepas, 13 L. monocytogenes, cinco de otras especies de Listeria, dos Staphylococcus aureus, cuatro Salmonella spp y dos Escherichia coli. Se ensayaron diferentes tiempos de incubacin y mtodos de tratamiento de la muestra para conseguir la mayor sensibilidad de deteccin en el menor de tiempo. Las muestras de carne se procesaron utilizando bolsas de plstico estriles con filtro lateral, diludas 1/10 en caldo Fraser y se homogeneizaron mediante Stomacher durante un minuto. La mezcla resultante tomada del lado del filtro, se reparti en alicuotas de 40 ml que se inocularon en proporcin 1:100 a partir de diluciones decimales seriadas de un cultivo de 18 h de L. monocytogenes CECT 4031T, cubriendo el rango de 1 a 107 cel/ml. Se tomaron muestras de 1 y 10 ml, a tiempo 0 y tras incubacin a 37C durante 2, 6, y 22 horas. Las muestras de 1 ml se sometieron a un gradiente de densidad BactXtractor (QRAB) o bien directamente a PCR, tras calentamiento a 100 C 10 min. Las de 10 ml se sometieron a extraccin de DNA utilizando el mtodo de Pitcher et al. (1989). Se ensayaron, adems, tres mtodos comerciales de extraccin y purificacin de ADN que se aplicaron a las muestras de 10 ml: DNeasy Tissue Kit (Qiagen), Wizard DNA Clean-up (Promega), Generation (Gentra). RESULTADOS Los iniciadores utilizados resultaron especficos amplificndose el fragmento esperado slo en las cepas de L. monocytogenes y no en el resto de cepas ensayadas. Se realizaron cinco experimentos independientes de deteccin a partir de carne de vacuno inoculada artificialmente. A partir de las muestras de 1 ml se obtuvieron niveles de deteccin de 9x105 cel/ml a tiempo 0, 9x104 cel/ml tras 2 h de incubacin, entre 5x102 y 9x103 tras 6 h y de 5x10-1 cel/ml tras 22 h utilizando el gradiente de densidad BactXtractor. Utilizando 10 ml y el mtodo de Pitcher et al. (1989) aumentaba la sensibilidad del mtodo alcanzndose niveles de deteccin de un orden logartmico inferior. Los valores obtenidos a partir de la muestra sin incubar (tiempo 0) fueron muy variables oscilando entre 540 y 9x104 cel/ml. Tras incubacin, dichos valores se normalizaron resultando de 9x103 cel/ml tras 2 h, 5x102 cel/ml tras 6 h y de 5x10-1 tras 22 h. De los cuatro mtodos de extraccin de DNA utilizados, el de DNeasy Tissue Kit permiti el nivel de deteccin ms bajo, siendo adems el ms rpido y de ms fcil manejo. El de Wizard Clean-up no result apropiado dado que las muestras colapsaron las columnas. Con el Generation no se observ amplificado. CONCLUSIONES Dada la variabilidad encontrada en los resultados de deteccin directa a tiempo 0, se propone someter la muestra a un perodo de incubacin de al menos 6 h, realizar la extraccin de DNA a partir de 10 ml para aumentar la sensibilidad, y utilizar las columnas de DNeasy Tissue Kit. Como alternativa, se propone incubar 22 h y tomar 1 ml para procesar bien con Dneasy Tissue Kit o bien someterlo a gradiente de densidad en BactXtractor.
Ericsson, H. & P. Stalhandske (1997) PCR detection of Listeria monocytogenes in gravad rainbow trout. Int. J. Food Microbiol. 35: 281-285.

Pitcher, D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiumthiocyanate. Letts. Appl. Microbiol. 8: 151-156.

.111.

CC/3

PROBELIATM: DETECCION RAPIDA Y FIABLE DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS MEDIANTE TECNICAS DE PCR

Bio-Rad Laboratories, S.A. Life Science Group. C/ Lpez de Hoyos, 245-247. 28043 Madrid OBJETIVOS Se persigue el desarrollo de un sistema rpido y sensible para la deteccin de Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7 y Campylobacter en alimentos. METODOS Tras un perodo de enriquecimiento de la muestra en un medio de cultivo, se extrae el DNA y se realiza la amplificacin de secuencias gnicas por PCR utilizando oligonucletidos especficos dependiendo del microorganismo a detectar. Posteriormente se lleva a cabo una hibridacin de los fragmentos de DNA amplificados con sondas especficas que se encuentran inmovilizadas a una placa multipocillo. Tras un lavado de los fragmentos no hibridados, la reaccin se revela mediantes tcnicas colorimtricas utilizando un oligonucletido marcado con peroxidasa. La fiabilidad de los resultados se garantiza mediante una solucin enzimtica que evita la contaminacin por DNA previamente amplificado y un control interno que revela factores inhibitorios en la muestra. RESULTADOS La combinacin de oligonucletidos y sondas especficas patentadas junto con el uso de tcnicas de amplificacin y deteccin utilizados en PROBELIATM permite la determinacin de microorganismos en alimentos en 24 h. Asimismo, se aumenta la sensibilidad en 103-105 veces sobre los mtodos clsicos a la vez que se produce un incremento en la especificidad evitando la reactividad cruzada. Una ventaja aadida es que los resultados positivos no requieren posterior confirmacin, lo que de nuevo supone un ahorro de tiempo y costes con respecto a otros mtodos. CONCLUSIONES Comparado con los mtodos bacteriolgicos convencionales, generalmente ms lentos y caros, PROBELIATM ha demostrado ser un mtodo altamente sensible y especfico para la deteccin de Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7 y Campylobacter en alimentos.

.112.

CC/4

DETECCION DIRECTA DE ARCOBACTER EN AGUAS POR PCR

M.S. Botella1 , M. A. Ferrs1, A. Jimnez1, G. Aguirre2, A. Soriano2 y J. Hernndez1 1 Dpto. Biotecnologa, Universidad Politcnica de Valencia, 46022 Valencia. 2 GAMASER, S.L., 46014 Valencia.

OBJETIVO La reciente consideracin de las bacterias del gnero Arcobacter como causantes de enfermedades en el hombre ha aumentado la necesidad de disponer de mtodos fiables y rpidos para su deteccin directa e identificacin a partir de las muestras estudiadas, por lo que se plante el siguiente objetivo: evaluar la eficacia de la tcnica PCR para la deteccin directa de cepas de Arcobacter en aguas de pozo frente a la tcnica tradicional de cultivo en placa. METODOS Las muestras de agua fueron sometidas a filtracin y las membranas se incubaron en caldo nutritivo suplementado con 5-Fluorouracilo a 30C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis. Para la extraccin del ADN presente en 1 mL del caldo de enriquecimiento se utiliz el mtodo CTAB. Se amplific el gen del 23S ADNr mediante los iniciadores ARCO 1 y ARCO 2, de secuencias 5-GTC GTC CCA AGA AAA GCC A-3 y 5-TTC GCT TGC GCT GAC AT-3 respectivamente, en un volumen de reaccin de 50 L con 1L del extracto de ADN, 100 M de cada nucletico, 200 mg de cada primer y 2,5 U de ADN-polimerasa. La reaccin consisti en un ciclo inicial de desnaturalizacin durante 1 minuto a 95C, 27 ciclos de amplificacin con tres segmentos: desnaturalizacin durante 1 minuto a 95C, unin del iniciador durante 1 minuto a 61C y una extensin durante 1 minuto a 72C, y un ltimo ciclo para la extensin final de 5 minutos a 72C. El producto de amplificacin (un fragmento de 331 pb) se detect mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% a 90V durante 30 minutos. RESULTADOS Con los iniciadores y las condiciones de amplificacin utilizados, se observ amplificacin del fragmento de 331 pb en 7 de las 10 muestras analizadas, pero slo se pudieron aislar, por mtodos tradicionales, cepas perntenecientes al gnero Arcobacter en 4 de las muestras en las que se detect la banda amplificada. CONCLUSIONES La tcnica PCR demostr mayor sensibilidad en la deteccin de Arcobacter que la tcnica tradicional de cultivo en placa. Adems, mediante PCR se obtuvieron resultados en 30 horas, acortando en el tiempo necesario para su deteccin e identificacin por mtodos culturales (entre 4 y 5 das), mostrando la considerable ventaja que esta tcnica supone en el anlisis de rutina de muestras de agua.

.113.

CC/5

INCIDENCIA DE CAMPYLOBACTER EN PRODUCTOS CRNICOS.

Moreno, Y., Hernndez, M., Vanoostende, A., Esteban, J. R, Sez, R. Y Hernndez, J. Departamento Biotecnologa, rea de Microbiologa, Universidad Politcnica, Valencia. OBJETIVOS Miembros del gnero Campylobacter se presentan en la actualidad como los principales responsables de gastroenteritis humanas, siendo los productos crnicos y sus derivados los principales implicados en la transmisin de estos microorganismos. En este trabajo se pretende analizar la incidencia de cada una de las especies pertenecientes a este gnero en muestras crnicas procedentes de distintos orgenes. MTODOS Se analizaron 83 muestras de las cuales 63 procedan de productos derivados de pollo (visceras, piel, carcasas y hamburguesas) y 20 de despojos de cerdo. Para el aislamiento de Campylobacter las muestras se sometieron a un preenriquecimiento en caldo nutritivo en aerobiosis (37C, 4 h.) y posterior cultivo en los medios agar CCDA y Preston modificado, en condiciones de microaerofilia a 37C durante 24-48 h. La confirmacin de colonias tpicas se realiz mediante observacin de la morfologa caracterstica por tincin Gram e identificacin bioqumica mediante la galera miniaturizada APICampy (Biomrieux). Los resultados dudosos fueron confirmados r por PCR, mediante la amplificacin de un fragmento del gen 23S rRNA. RESULTADOS La incidencia de Campylobacter en las muestras de cerdo analizadas fue del 40%. Se aislaron 5 cepas de C. coli, 2 de C. hyointestinalis y 1 C. jejuni. En productos de pollo se obtuvo un 89% de aislamientos. Por tipo de muestra, se aisl Campylobacter del 100% de piel y hamburguesas. De vsceras y carcasa, se obtuvieron aislamientos en el 88% de los casos. La especie predominante fue C.jejuni. Se aislaron tambin 8 cepas de C. coli y en 8 de los casos no se pudo llegar a la identificacin a nivel de especie. CONCLUSIONES La incidencia de C. jejuni en carne de pollo fue bastante elevada (80 %). La tasa de aislamiento en piel y productos derivados indica que la contaminacin aumenta durante la manipulacin de los mismos. Esto plantea la necesidad de tomar las precauciones pertinentes para evitar este tipo de transmisin. La presencia de Campylobacter en cerdo es considerablemente menor, aunque la contaminacin en los productos derivados podra aumentar debido al riesgo de contaminaciones cruzadas como en el caso del pollo.

.114.

CC/6

CARACTERIZACIN DE PETRIFILM SERIES 2000 COMO UN POSIBLE MTODO RAPIDO PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES EN ALIMENTOS
R. Priego, L.M. Medina y R. Jordano. Dpto. Bromotologa y Tecnologa de los Alimentos (Microbiologa de los Alimentos), Univ. de Crdoba, Campus Rabanales, 14071 Crdoba. OBJETIVOS Se pretende comparar el mtodo Petrifilm 2000 con la tcnica tradicional para la enumeracin de coliformes en seis lotes de diferentes alimentos (huevos, judas verdes congeladas, embutido fresco, producto de bollera, carne picada y leche cruda). Asimismo valorar la fiabilidad de los recuentos presuntivos del mtodo Petrifilm 2000 realizado a las 10, 12 y 14 horas de incubacin con respecto al recuento total realizado a las 24 h. MTODOS Las muestras fueron diluidas y sembradas por duplicado sobre VRBA (Oxoid, Unipath Ltd., Basingstoke, Inglaterra) y Petrifilm Series 2000 Recuento Rpido de Coliformes en Placa (Microbiology 3M Health Care, St. Paul, Minn.). El recuento en Petrifilm 2000 se facilita al poseer un indicador de pH muy sensible que indica la presencia de cido desde la formacin de la colonia, un acelerador de crecimiento que reduce el plazo de respuesta. La lectura presuntiva se bas en el recuento de zonas amarillas cidas asociadas o no a colonias rojas y la lectura confirmativa en el recuento de colonias rojas asociadas o no a burbujas de aire debido a la fermentacin de la lactosa. RESULTADOS El coeficiente de correlacin (r=0.860) entre los recuentos obtenidos por ambos mtodos mostr que son altamente comparables, demostrando ser una eficaz alternativa a los mtodos tradicionales para el recuento de coliformes. Asimismo Petrifilm 2000 presentr mayor sensibilidad (9333 % de los recuentos) e incluso los recuentos obtenidos en diferentes muestras de un mismo alimento fueron ms homogneos que los obtenidos por el mtodo tradicional. La fiabilidad de la lectura presuntiva se constata debido a que sta represent alrededor del 90% de los recuentos totales de los diferentes lotes analizados. Incluso en el anlisis de regresin de los recuentos realizados a las diferentes horas de incubacin de la lectura presuntiva se observa una lnea cuya pendiente (= 0.032) demuestra su proximidad con la del recuento confirmativo a las 24 h.

CONCLUSIONES La posibilidad de reducir el tiempo necesario para obtener el recuento de coliformes permitira una deteccin temprana de los problemas de calidad microbiolgica. El mtodo Petrifilm 2000 representa una alternativa idnea al mtodo tradicional, incorporando adems de todas las ventajas de un producto automatizado la posibilidad de obtener resultados en menos de 12 h de incubacin, lo que permite incluirlo en la categora de mtodos rpidos.

.115.

CC/7

ELABORACIN DE SUSPENSIONES ESTANDARIZADAS DE Staphylococcus aureus PARA EL CONTROL DE CALIDAD ANALTICA EN ALIMENTOS.
E. Razquin, E. Peir, M. de Simn, M.D. Ferrer. Laboratorio Municipal. Instituto Municipal de Salud Pblica de Barcelona. Ayuntamiento de Barcelona. Av. Drassanes 13-15, 08001 Barcelona. OBJETIVOS Se describe la preparacin de lotes de suspensiones estandarizadas de S. aureus de alta y baja densidad poblacional cuyas porciones analticas cumplen los requisitos de homogeneidad y estabilidad exigidos a un material de referencia, para controlar procedimientos de recuento y de investigacin, respectivamente. MTODOS Las suspensiones estandarizadas se prepararon a partir de un cultivo overnight en TSB de la cepa S. aureus ATCC 25923 diluido en leche descremada estril hasta obtener las suspensiones stock de concentracin bacteriana necesaria para elaborar un lote de alta densidad (30-300 pfc/porcin analtica) y un lote de baja densidad (3-30 pfc/porcin analtica). Los cultivos stock se distribuyeron a razn de 1,1 mL en microtubos y fueron conservados a 705C. Los estudios estadsticos para evaluar la homogeneidad y estabilidad de los lotes incluyeron el clculo peridico del valor medio de pfc/porcin analtica (z) y de su variabilidad. Para ello se realizaron recuentos en placa de agar Baird-Parker de 10 unidades de lote (I), cada 7-15 das durante un periodo mximo de 2 meses, y se emplearon los tests de dispersin de Cochran T1 (nivel de variacin entre porciones analticas de un mismo microtubo) y T2 (nivel de variacin entre porciones analticas de distintos microtubos). Los valores de T2 obtenidos en los estudios peridicos se combinaron para calcular la dispersin global de cada lote mediante el ndice Thom/N, (N = n microtubos analizados - n de tests T2 realizados). La comprobacin de la estabilidad de los niveles de contaminacin se realiz mediante regresin lineal de los valores z de cada lote. As mismo se calcul la fraccin de porciones analticas negativas esperable en el lote de baja densidad mediante el estudio de 40 microtubos por procedimientos de presenciaausencia. RESULTADOS Los niveles medios de z hallados fueron de 63,1 pfc con un Thom/N = 1,27 en el lote de alta densidad y de 10,9 pfc con Thom/N = 1,64 en el lote de baja densidad. En ambos casos dichos niveles de contaminacin se consideraron homogneamente distribuidos en las distintas unidades de lote al haberse hallado que todos los valores de T2/(I-1) y Thom/N eran inferiores a 2, lmite de dispersin superior admitido para una distribucin de Poisson en la que se considera el efecto de la sobredispersin. Adems en el lote de alta densidad no se hallaron diferencias significativas entre los valores de T1 calculados y la distribucin de la 2 con [(I)(n de rplicas 1)] grados de libertad. Por otro lado la estabilidad de los niveles de contaminacin a lo largo del periodo de estudio fue confirmada al no hallarse tendencias significativamente decrecientes en ninguno de los lotes. Finalmente, se calcul para el lote de baja densidad una fraccin de porciones analticas negativas del 2,5% con un lmite superior del intervalo de confianza del 95 % de dicha proporcin del 11,3%. CONCLUSIONES Se considera que los dos lotes de S. aureus preparados cumplen los criterios de homogeneidad exidos para su utilizacin como material de referencia. Respecto a los resultados de estabilidad, se observa que la conservacin a -705C no ha afectado negativamente la viabilidad de los microorganismos y que los niveles medios de contaminacin se mantienen suficientemente estables durante el periodo estudiado como para su utilizacin en el control de calidad analtica de procedimentos de recuento e investigacin.

.116.

CC/8

INFLUENCIA DEL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO EN TEMPERATURAS DE CONGELACIN SOBRE LA CARGA MICROBIANA EN HELADOS.
F.C. Snchez Hernndez, R. Castillo Lpez y A. Serrano Vera. Dpto. de Control de Calidad de Helados Julin, S.L. Avd. Andaluca, 1. 18850 Cllar (Granada). OBJETIVOS Estudiar el comportamiento de la carga microbiana en helados referida al Contenido de Grmenes (Aerobios mesfilos totales) a 30 C bajo condiciones de almacenamiento en congelacin a lo largo del tiempo, estudiadas en distintos rangos de temperatura. Al ser un caso de actividad industrial real, las temperaturas de almacenamiento de cada uno de los lotes y, como consecuencia, de las muestras en s, estarn expuestas a los imponderables de cada momento, por lo que tambin se pretende observar los cambios en la flora que puedan deberse a dichas situaciones. MTODOS El universo muestral est compuesto por dos tipos de helado de produccin industrial, uno es bloque de 1 litro sabor nata chocolate (NCH) y el otro bombn de nata recubierto con cobertura especial y cobertura de chocolate con leche (CHB), siendo la formulacin bsica de ambos leche en polvo 1% m.g. 10%, grasa no lctea 10%, azcares 18%, estabilizantes y emulsionantes 0.5%, aroma de nata y cobertura especial y cacao en polvo segn el caso. Se realizan 4 lotes de cada tipo de helado que se almacenaran a distintas temperaturas. Con las muestras se hacen cuatro diluciones decimales de cada una en agua de peptona tamponada (P.W.T.), que se siembran en masa en plate count agar (P.C.A.) para su recuento a las 72 horas de incubacin a temperatura regulada que dio como media 30.07 C. Las temperaturas de las cmaras de almacenamiento y de cada muestra previa a su anlisis se toman con termmetro calibrado. La contaminacin que aparece inicialmente en las muestras es provocada mediante incorrecto proceso tecnolgico de produccin de los helados. RESULTADOS En los cuatro lotes estudiados al final del experimento con datos al da de la fecha se produce un descenso en la tasa de grmenes en torno al 20%, si bien tambin en todos los casos las oscilaciones varan a lo largo del estudio y no existen un decrecimiento progresivo si no que en algunos das las tasas presentan recuperaciones en sus niveles, en uno de los lotes, B, los ascensos y descensos respecto del contaje inicial son alternativos y no hay un acusado efecto negativo hasta casi el final, en los otros casos ya a las 24 horas de almacenamiento hay un acusado descenso en la tasa. Lote A: NCH, tra. de almacn durante 46 das 24.6 C, tra. media del producto 23.0 C. Tasa inicial 600.875x103 u.f.c./ml. (todas las tasas posteriores sern x 103 u.f.c./ml.), al final es de 498.75, a las 24 h. era 421.5, el descenso final es del 16.99%, el descenso promedio es del 22.91%. Lote B: NCH, tra. de almacn en 46 das 18.9 C, tra. producto 17.9 C. Tasa inicial 600.875, final 433.25, a las 24 h. 687, descenso final 27.89%, promedio 5.88%. Lote C: CHB, tra. de almacn tras 31 das 23.3 C, tra. producto 18.5 C. Tasa inicial 370, final 283, a 24 h. 282, descenso final 23.51%, promedio 22.37%. Lote D: CHB, tra. almacn tras 31 das 18.3 C, tra. producto 16.4 C. Tasa inicial 370, final 301.75, a 24 h. 254.25, descenso final 18.44%, promedio 29.46%. CONCLUSIONES Existe un rpido descenso en la tasa inicial de microorganismos presentes, que se amortigua posteriormente e incluso aparecen recuperaciones en los niveles de grmenes, por lo que, si bien ya no se recuperan los contajes iniciales, debe existir una lenta multiplicacin de los microorganismos presentes y que no son daados por efecto de la congelacin por estar protegidos por la compleja estructura ntima del helado.

.117.

CC/9

VALIDACIN INTERLABORATORIO DEL MTODO PRESENCIA/ AUSENCIA PARA ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS.
J. Sanchs Solera Laboratorios MICROKIT y otras 9 entidades independientes*. Apdo. 44 - 28210 Madrid. OBJETIVOS Una de las mayores consecuencias de la nueva Directiva Europea 98/83 de calidad de las aguas destinadas a consumo humano es su implicacin directa en todo tipo de industria alimentaria que utilice agua en sus procesos productivos. Para facilitar a la misma, y a todos los dems analistas de agua, su labor, queremos corroborar nuestras experiencias previas, mediante un estudio interlaboratorio, que demuestre que el mtodo Presencia/Ausencia (P/A) es tan vlido como el de Filtracin de Membrana (MF), con la ventaja de una mayor comodidad en el anlisis, que no necesita aparataje, una mayor facilidad en la interpretacin de resultados y una minimizacin del coste. MTODOS Se han ido comparando, entre Enero de 1998 y Junio del 2000, muestras paralelas de 100 ml de agua, entre el mtodo P/A y el MF, para Coliformes, E.coli y Legionella pneumophila, entre 10 laboratorios (Depuradoras de aguas potables, Laboratorios de anlisis a terceros, Industrias alimentarias, Hospitales, Laboratorios municipales y Delegaciones de Sanidad). RESULTADOS De los 500 datos comparativos se enfrentan los positivos y los negativos para cada mtodo. Para Coliformes, existe un 94,98% de coincidencias entre el mtodo MF y el P/A (81,36% si se tuviese en cuenta el medio no selectivo Chapman-Tergitol): de las no coincidencias, el 2,87% (7,53%) son falsos negativos de MF y el 2,15% son falsos negativos del P/A (9,32% si se tiene en cuenta el Chapman-Tergitol, pero en realidad se trata de falsos positivos de ste). Para E. coli, existe un 97,49% de coincidencias entre el mtodo MF y el P/A: de las no coincidencias, el 1,79% son falsos negativos de MF y el 0,72% son falsos negativos de P/A. Para Legionella pneumophila, la coincidencia entre ambos mtodos es del 100%. CONCLUSIONES Aunque los resultados no son tan dramticos para MF como en otras publicaciones comparativas de USA, s se demuestra la idoneidad del mtodo P/A frente al MF, por su sensibilidad, que no slo es muy similar sino que resulta incluso mayor para el mtodo P/A. Se demuestra tambien su mayor idoneidad para aguas de mar, ya que los microorganismos no cambian de hbitat en P/A y en cambio sufren shock de desalinizacin por MF. Las ventajas adicionales de mayor comodidad, menor manipulacin, ms fcil interpretacin y menor coste por anlisis, le hacen el mtodo de eleccin para todo consumidor, grande o pequeo, que no necesite recuentos, sino la ausencia absoluta de los indicadores, para poder declarar la potabilidad del agua de la red, de sus productos y de sus instalaciones.
*: AMVISA, Depuradora de aguas potables de lava. Laura Muro Molina./ Laboratorio Municipal de Zaragoza. Juan Jos Marcn Letosa./ Policlnica Naval de Madrid. Laboratorio de aguas JUCEN. Jos Luis Escamilla Francs, Jos Luis Snchez de la Nieta, Nieves Almodvar Dez, Miguel Angel Garca Sancha./ Agua Mineral Piloa ACQUA MUNDO,S.A. Asturias. M Jos Muoz, Rubn lvarez./ Compaa Cervecera de Canarias,S.A. Fbrica 03, Las Palmas. Antonio Gutirrez, Santiago Ortega, ngel Casaas./ SERSANYAM,S.L. Laboratorio independiente, Las Palmas de Gran Canaria. Federico Santana Orihuela./SANIDAD de la Xunta de Galicia, La Corua. Laboratorio acreditado por ENAC. Jos Luis Martnez, Luisda Lodeiro./ SACIM,S.L. Laboratorio Independiente, Cat, Castelln. Juan Gozalbo Gmez, Jordi Cid Foix./ SOGESUR,S.A. Grupo General de Aguas de vila. Manuel Sarmiento, M Luz Sanz, Luis M. Fuentes.

.118.

FERMENTACIN Y MADURACIN DE LOS ALIMENTOS

.119.

.120.

FM/1

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD PROTEOLTICA DE Debaryomyces hansenii Dh345 AISLADA DE JAMN CURADO M. Alonso, F. Nez, M.J. Benito*, M.A. Asensio, M.E. Bermdez Higiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. UEX. 10071. Cceres. Correo Electrnico: meralon@unex.es (*)Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EIA. UEX. 06071. (Badajoz). Una de las principales levaduras que se encuentra con frecuencia en productos crnicos curados es Debaryomyces hansenii. En el caso del jamn, debido a que las condiciones ecolgicas le son favorables, esta levadura es la especie mayoritaria durante la maduracin. La cepa de D. hansenii Dh345, aislada de jamn curado ha mostrado una considerable actividad hidroltica sobre la miosina en medio de cultivo. Esta actividad podra contribuir a la proteolisis observada durante la maduracin del jamn. Sin embargo, no se conoce la actividad de esta cepa frente a otras protenas crnicas, especialmente las miofibrilares, que son las que se degradan mayoritariamente en el jamn curado. OBJETIVOS Estudiar la actividad proteoltica de la cepa de D. hansenii Dh345 aislada de jamn curado frente a protenas miofibrilares, para evaluar su posible utilidad como cultivo iniciador en este producto. MTODOS D. hansenii Dh345 se cultiv en un medio que contena protenas miofibrilares (2 mg/ml) extradas en condiciones aspticas a partir de lomo de cerdo, a las que se aadi 5% (p/v) de NaCl y 0.1% de caldo nutritivo (p/v). Se inocularon aproximadamente 105 u.f.c./ml y se incub a 25C durante 21 das. Como control se utiliz el medio sin inocular incubado en las mismas condiciones. El crecimiento de las levaduras se determin mediante recuento en Agar Extracto de Malta. La hidrlisis de las protenas se estudi mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Asimismo se determin la concentracin de nitrgeno no proteico (NNP). RESULTADOS En los geles de poliacrilamida no se detect degradacin de las protenas miofibrilares durante los primeros 7 das. A partir de este tiempo se empez a observar una disminucin en la intensidad de las bandas de protenas miofibrilares, as como la aparicin de diferentes bandas de productos de degradacin de estas protenas. Posteriormente tambin disminuy la intensidad de estos productos de degradacin. La hidrlisis proteica provoc un aumento paulatino del NNP, que alcanz un mximo entre los 13 y 14 das. Posteriormente se produjo una cada rpida en la concentracin de NNP, probablemente debido a la disminucin de las protenas disponibles. CONCLUSIONES Debaryomyces hansenii Dh345 presenta actividad hidroltica frente a las protenas miofibrilares de lomo de cerdo, que se traduce inicialmente en un aumento de NNP. Aunque su actividad proteoltica puede considerarse moderada, teniendo en cuenta el largo perodo de maduracin del jamn curado, los productos resultantes de su actividad proteoltica podran tener influencia en el sabor y el aroma de este producto. En consecuencia, la cepa estudiada muestra aptitudes para ser utilizada como cultivo iniciador en jamn curado.

.121.

FM/2

ACTIVIDAD HIDROLTICA SOBRE PROTENAS MIOFIBRILARES DE Penicillium chrysogenum AISLADO DE JAMN CURADO
M.J. Benito*, F. Nez, M. M. Rodrguez, A. Martn* y J.J. Crdoba Higiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. UEX. 10071. Cceres (*) Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EIA. UEX. 06071.Badajoz Correo electrnico: mjbenito@unex.es Durante el proceso de maduracin del jamn se desarrolla superficialmente una poblacin fngica capaz de contribuir a la proteolisis que ocurre en este producto. Una cepa de Penicillium chrysogenum aislada de jamn curado ha mostrado una intensa actividad proteoltica frente a miosina, y sobre la fraccin de protenas miofibrilares en ensayos en un sistema crnico modelo. No obstante, no se conoce la susceptibilidad de las distintas protenas miofibrilares al efecto del moho, ni la dinmica de la hidrlisis proteica. Esta informacin permitira correlacionar los cambios detectados en la maduracin del jamn con la presencia de este microorganismo. OBJETIVOS. El objetivo es determinar la dinmica de la actividad proteoltica de la cepa Pg222 de P. chrysogenum sobre las protenas miofibrilares durante el perodo de incubacin. MTODOS. Se desarroll un medio mnimo (0,1% de caldo nutritivo), con 5% de cloruro sdico al que se le adicion una concentracin aproximada de 2 mg/ml de protenas miofibrilares extradas de lomo de cerdo en condiciones estriles. Este medio se inocul con P. chrysogenum Pg222 y se incub a 25C en agitacin durante 92 h. Cada 4 h de incubacin se determin el grado de crecimiento del moho, el contenido en protenas totales y de nitrgeno no proteico. As mismo, se evalu las modificaciones de las protenas miofibrilares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Como control se utiliz un medio sin inocular incubado en las mismas condiciones que las muestras. RESULTADOS. La concentracin de protenas totales disminuye significativamente (P<0,05) tras 68 h de incubacin. Esta disminucin coincide con un incremento significativo en la concentracin de nitrgeno no proteico en el medio inoculado con P. chrysogenum. Los resultados de SDSPAGE revelaron que a partir de las 36 h se produce una disminucin significativa de la mayora de las bandas correspondientes a las protenas miofibrilares, siendo la troponina T y la protena C las primeras en desaparecer. A las 84 h de incubacin la miosina no se detecta en los electroferogramas y la actina slo es observada en concentraciones muy bajas. La alfa-actinina aunque se reduce durante la incubacin se sigue detectando tras 92 h de incubacin. Por otra parte aparecen nuevas bandas correspondientes a productos resultantes de la hidrlisis de las protenas que desaparecen durante la incubacin. Durante este tiempo no se aprecian modificaciones significativas en las bandas de protenas miofibrilares en las muestras no inoculadas. CONCLUSIONES. P. chrysogenum muestra una elevada actividad proteoltica sobre las protenas miofibrilares, especialmente sobre miosina, troponina T y protena C, produciendo una hidrlisis prcticamente total de la mayora de las protenas tras 4 das de incubacin. Esta hidrlisis genera compuestos nitrogenados de bajo peso molecular que pueden influir en el sabor y el aroma de productos crnicos madurados. Esta cepa de P. chrysogenum muestra unas buenas aptitudes tecnolgicas para ser utilizada como cultivo iniciador en productos crnicos.

.122.

FM/3

CARACTERIZACIN TAXONMICA Y TECNOLGICA DE BACTERIAS CIDO-LCTICAS AISLADAS DE QUESO TIPO CASTELLANO.

I. Caro*, A. Alonso-Llamazares**, C. Alonso-Calleja**, J. Mateo** y M.R. Garca-Armesto**. *Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo, Mxico; **Dep. Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. Campus Universitario s/n, 24071 Len. OBJETIVOS Obtencin de una coleccin de bacterias cido-lcticas aisladas de queso elaborado en la Comunidad Autnoma de Castilla y Len, que presenten buenas caractersticas tecnolgicas (actividad acidificante; proteoltica, y/o inhibidora de microorganismos patgenos) y que puedan ser utilizadas en un futuro para la obtencin de cultivos iniciadores autctonos. MTODOS Se estudiaron un total de 96 cepas de bacterias cido-lcticas aisladas de queso de oveja y oveja/vaca tipo Castellano. Las cepas aisladas se sometieron a pruebas confirmatorias iniciales (Gram, catalasa y oxidasa); posteriormente, se efectu la caracterizacin taxonmica (a nivel de gnero) y tecnolgica de las mismas, siguiendo los esquemas y mtodos propuestos por Harrigan (1997. Laboratory methods in food microbiology, 3rd edn, Academic Press) y Cogan et al. (1997. J. Dairy Res., 64, 409-421). Las pruebas efectuadas fueron: crecimiento a 10, 40 y 45C; crecimiento en presencia de diferentes concentraciones de sal (4 y 65 %); hidrlisis de la arginina, produccion de dextrano a partir de la sacarosa, crecimiento en presencia de 40% de bilis, hidrlisis de la esculina y produccin de CO 2 a partir de glucosa. Para la caracterizacin tecnolgica se realizaron las siguientes determinaciones: produccin de cido; accin sobre litmus milk; y actividad proteoltica. Asmismo, se realizaron estudios de inhibicin de microorganismos patgenos con 22 cepas, de acuerdo con Schillinger and Lcke (1989, Appl. Environ. Microbiol., 55, 1901-1906). RESULTADOS Del total de cepas estudiadas, el 67% presentaron morfologa de cocos y el 33% de bacilos. Dentro del 1er grupo: el 52% de las cepas se adscribieron provisionalmente al genero Enterococcus spp.; y aproximadamente el 36% y el 11% de las cepas restantes, al gnero Leuconostoc spp. y Lactococcus spp., respectivamente. La totalidad de las cepas con morfologa bacilar, se adscribieron al gnero Lactobacillus spp. Por lo que respecta a las propiedades tecnolgicas: el 26 % de las cepas presentaron buena actividad acidificante (coagulacin del medio Litmus milk en 24 h; y descenso del pH de la leche 1 unidad, despus de 6 h de incubacin a 30C); el 125 %, buena actividad proteoltica (dimetro de los halos de hidrlisis 2 mm); y el 525% presentaron, simultaneamente, ambas caractersticas. Finalmente, de 22 cepas que presentaban buena actividad acidificante y/o proteoltica, el 50 % presentaron algn grado de inhibicin frente a S. aureus y aproximadamente el 64 % frente a Listeria monocytogenes (halos de inhibicin 1 mm). CONCLUSIONES Las cepas que presentaron mejores aptitudes tecnolgicas pertenecieron, por orden decreciente de frecuencia, a los siguientes gneros: Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Enterococcus spp. y Leuconostoc spp. Del total de cepas que presentaban algn grado de inhibicin frente a Staphylococcus aureus y/o Listeria monocytogenes (19), aproximadamente el 68% no mostraron inhibicin frente a Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium.

.123.

FM/4

MEJORA DE LAS PROPIEDADES SENSORIALES DE LOS EMBUTIDOS CRUDOS CURADOS MEDIANTE LA ADICIN DE UNA PROTEASA (PRONASA E) Y/O UN EXTRACTO INTRACELULAR DE Penicillium camemberti.
L. Hoz, J.M. Bruna, M. Fernndez y J.A. Ordez. Dpto. Nutricin y Bromatologa III. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. Espaa. OBJETIVO El objetivo de este trabajo fue potenciar la liberacin de aminocidos y los fenmenos degradativos que stos sufren posteriormente mediante la accin conjunta de una proteasa y de un extracto intracelular obtenido de P. camemberti. Este moho fue seleccionado para el presente trabajo por su actividad L-amino oxidsica (0,44 unidades/ml). MTODOS Se fabricaron 4 lotes de embutidos: Lote Control (C); Lote PE (lote C al que se aadieron 600 unidades Pronasa E/kg embutido); Lote P (lote C al que se adicionaron 125 ml del extracto fngico; 23, 9 mg protena/kg de embutido) y lote PE+P (lote P al que se aadieron 600 unidades de Pronasa E/kg de embutido). Los aminocidos se analizaron por HPLC siguiendo el mtodo descrito por Bruna y col. (2000). El amoniaco se determin utilizando el kit enzimtico de Boehringer Mannheim. El perfil de textura (TPA y ensayo de corte) y los anlisis sensoriales (triangular y descriptivo) se realizaron segn los mtodos descritos por Bruna y col. (2000). RESULTADOS La adicin de Pronasa E produjo un aumento significativo (2,3) en la concentracin de los aminocidos libres, especialmente Ile (5,0), Trp (4,6), His (4,1) y Thr (4,0). Por otro lado, la adicin del extracto intracelular de P. camemberti produjo un descenso significativo (0,87) en la mayora de los aminocidos, sobre todo Met (0,55), Tyr (0,64), Lys (0,64) y Phe (0,70). La accin conjunta de la Pronasa E y del extracto intracelular produjo un efecto similar al de la Pronasa E, aunque el aumento en la concentracin de aminocidos fue algo menor (0,82) debido a la actividad del extracto. La concentracin de amoniaco se increment en todos los lotes, especialmente en aquellos a los que se aadi Pronasa E (1,9). La adicin del extracto intracelular (lotes P y PE+P) produjo un aumento muy ligero (1,1-1,2) en el contenido de este compuesto respecto a sus respectivos controles (C y PE). La adicin de Pronasa E disminuy significativamente todos los parmetros de textura estudiados (dureza, adhesividad, elasticidad, gomosidad, masticabilidad y fuerza y trabajo de corte) debido a la actividad protelitica registrada durante la maduracin. El extracto intracelular slo modific ligeramente la dureza y los parmetros relacionados con ella (gomosidad y masticabilidad). Por lo que se refiere al anlisis sensorial, el test triangular revel diferencias significativas (p<0,05) entre todos los lotes estudiados. La prueba descriptiva mostr que la Pronasa E mejoraba significativamente los atributos de textura y sabor, mientras que el extracto intracelular mejor, adems, el olor. La accin combinada de ambos produjo mejoras significativas en todos los parmetros estudiados, salvo el color. CONCLUSIONES La adicin de Pronasa E y/o de un extracto enzimtico de P. camemberti mejoran significativamente las propiedades sensoriales de los embutidos crudos curados al potenciar la liberacin de los aminocidos y su posterior degradacin.
AGRADECIMIENTOS Trabajo financiado por la CICYT (Proyecto ALI96-0928). BIBLIOGRAFA Bruna, J.M.; Fernndez, M.; Hierro, E.M.; Ordez, J.A. y Hoz, L. 2000. Meat Science 5 4 , 135-145.

.124.

FM/5

PRESENCIA Y ESTUDIO DEL CARCTER FLOCULANTE EN CEPAS VNICAS DE Saccharomyces cerevisiae

M. C. Fajardo, B. Simn, N. Luna, K. Fernndez y P. Hidalgo*. Instituto Madrileo de Investigacin Agraria y Alimentaria (IMIA). Comunidad de Madrid. Finca El Encn. Apdo. 127. 28800. Alcal de Henares. Madrid. OBJETIVOS Se pretende determinar y estudiar el carcter floculante en distintas cepas de levadura pertenecientes a la especie Saccharomyces cerevisiae, autctonas de la Denominacin de Origen (D.O.) Vinos de Madrid, al tratarse de un parmetro tecnolgico de gran inters por permitir una rpida separacin de la levadura del medio en que se encuentra, con el fin de facilitar las operaciones de removido y degelle y reducir los costes de produccin en la elaboracin de vinos espumosos de calidad. MTODOS Partiendo de 571 cepas de S. cerevisiae representativas de las tres subzonas vitivincolas de la D.O. Vinos de Madrid, Arganda (A), Navalcarnero (N) y San Martn de Valdeiglesias (SM), se estudi el carcter floculante de las mismas utilizando dos tcnicas complementarias: una determinacin espectrofomtrica (Test de Helm) y una estimacin visual del tamao de los flculos formados. Se investig la influencia del medio de cultivo en la capacidad de flocular de las clulas de levadura (66 cepas), realizando los ensayos en LM y mosto varietal blanco, inoculando una poblacin inicial aprox. de 106 cels/mL, siendo incubados a 25C, 72 h. En las cepas que presentaban la habilidad de formar agregados, se distingui si se trataba de verdadera floculacin (las clulas en las que desapareca la agregacin tras aadir al precipitado EDTA 0,25M, fueron consideradas como floculantes segn la definicin de Stratford, 1996), o de otro tipo de agregacin celular (se estudi la formacin de pseudomicelio mediante observacin microscpica, utilizando un medio de crecimiento especfico, SLAD). Posteriormente se determin el efecto y la influencia en la floculacin de parmetros fsico-qumicos como son el pH, concentracin de sales, etanol y azcares. RESULTADOS Y CONCLUSIONES De todas las cepas estudiadas se observ que un bajo porcentaje (9,3%) present la capacidad de flocular en el medio sinttico elegido, correspondiendo el 52,8% de las mismas a la subzona de A., el 13,21% a N. y el 33,96% a S.M, por tanto, esta propiedad est presente de forma natural en la microbiota autctona de la D.O. considerada. El mayor nmero de cepas floculantes (52,83%) fue aislado en las etapas medias y final de la fermentacin espontnea en las tres subzonas vitivincolas. Se ha puesto en evidencia que el medio de cultivo influye en la manifestacin del carcter floculante de las cepas de levaduras ensayadas, observndose que un 6,2% lo expres solo en el medio sinttico y el 19,7% lo hizo nicamente en el medio natural, aunque la mayora (74,2%), present la capacidad de flocular en ambos medios. En conjunto, el 93,8% de las cepas estudiadas pudieron flocular en mosto mientras que el 81,5% de las mismas lo realiz en LM. El medio natural utilizado es ms favorable para el desarrollo del carcter floculante que el medio sinttico, obtenindose adems grados superiores respecto al mismo. Todas las cepas cultivadas tanto en LM como en mosto, pudieron clasificarse como verdaderamente floculantes y alguna de ellas adems, presentaron la capacidad de producir pseudomicelio en medio SLAD. Se detectaron variaciones en la capacidad de flocular debido a la influencia de los parmetros fsico- qumicos estudiados.

.125.

FM/6

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD -GLUCOSIDSICA EN Saccharomyces cerevisiae

M. Fernndez,, L.F. Hernndez, J.C. Espinosa y A.I. Briones. Dpto. Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, Univ. de Castilla La Mancha, Avda. Camilo Jos Cela s/n, 13071 Ciudad Real. OBJETIVOS Estudio cuali y cuantitativo de la actividad -glucosidsica en una levadura vnica con buenas propiedades enolgicas perteneciente a la especie Saccharomyces cerevisiae. MTODOS Para la determinacin cualitativa se realizaron ensayos en placa adicionando a distintos medios base (YEP, MM, YNB y mosto de uva) diferentes sustratos slidos con un enlace glucosdico como la esculina, la arbutina, el p-nitrofenil--D-glucopiransido (pNPG) y el metilumbelliferil--D-glucopiransido (MUG). El ensayo cuantitativo, se llev a cabo por la medida del p-nitrofenol (pNP) liberado a partir del sustrato pNPG. La actividad se determin tras crecer la levadura en varios medios de cultivo (YEP, YNB+glucosa y mosto de uva), en condiciones aerobias y anaerobias, tanto en el sobrenadante como en las clulas. Se estudi el efecto de la congelacin, del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica. RESULTADOS De los sustratos slidos ensayados, los mejores resultados se obtuvieron en los medios base adicionados de MUG y de esculina y en MM con pNPG. La arbutina no se revel como un buen sustrato para el anlisis de dicha actividad. Esta cepa de Saccharomyces cerevisiae presenta una mayor actividad enzimtica al final de la fase de crecimiento exponencial, y fue ms elevada en condiciones de aerobiosis. Respecto a los medios de cultivo estudiados, la actividad se reduce notablemente cuando se emplea mosto de uva, frente a un medio complejo como el YEP y en medio YNB+glucosa fue prcticamente nula. La congelacin tanto en el sobrenadante como en las clulas no supuso prdida de la actividad enzimtica, en cambio, sta desapareci tras someter a las muestras a temperaturas de esterilizacin y presin de 1 atmsfera. La temperatura y el pH ptimo de la actividad enzimtica fueron de 50C y 4 respectivamente. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos se puede concluir que la cepa de Saccharomyces cerevisiae ensayada es capaz de hidrolizar, con distinta intensidad, algunos de los sustratos probados con enlace -glucosdico. El medio base y las condiciones de cultivo influyen notablemente en el comportamiento de dicha cepa.

.126.

FM/7

IDENTIFICACIN DE LAS BACTERIAS LCTICAS AISLADAS DEL CHORIZO DE CEBOLLA (EMBUTIDO TRADICIONAL GALLEGO)
Garca, M.C., Castao, A., Tornadijo M.E. y Carballo, J. rea de Tecnologa de los Alimentos, Facultad de Ciencias de Orense, Universidad de Vigo, 32004 Orense OBJETIVOS El objetivo de este trabajo fue estudiar la poblacin de bacterias lcticas aisladas del chorizo de cebolla elaborado tanto por procedimientos artesanales como industriales. MTODOS Se elaboraron tres partidas de chorizo de cebolla de modo artesanal y otras tres industrialmente. En los sis lotes se tomaron muestras de la masa antes de embutir y del chorizo a los 2, 7, 14, 21, 28 y 42 das de maduracin. El medio de cultivo empleado para el recuento y aislamiento de bacterias lcticas fue agar MRS (despus de ajustar el pH a 5,6). El medio sembrado se incub a 30C durante 5 das. De este medio se aislaron 10 cepas por cada lote y punto de muestreo, un total de 420 cepas, que tras su purificacin fueron sometidas a las pruebas de identificacin, segn los criterios de Kandler y Weiss (1986), Garvie (1986) y Roisant y Luquet (1994) RESULTADOS El 55,24% de las cepas aisladas de los chorizos artesanales se adscribi a la especie Lactobacillus sake, el 6,66% a L. fermentum, el 6,19% a L. plantarum, el 1,43% a Lactobacillus alimentarius, el 0,95% a L. curvatus, el 0,48% a L. divergens, el 0,48% a L. viridescens y se incluy como Lactobacillus sp. el 3,81% de las cepas aisladas. A la especie Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides se adscribi el 18,57% de las cepas aisladas, a L. mesenteroides subsp. dextranicum el 0,95% y a Leuconostoc paramesenteroides el 1,43%. El 48,60% de las cepas aisladas de los chorizos industriales fue adscrito a la especie Lactobacillus plantarum, el 12,61% a L. sake, el 7,48% a L. fermentum, el 7,48% a Lactobacillus alimentarius, el 7,01% a L. divergens, el 2,80% a L. curvatus, el 1,87% a L. farciminis y el 7,94% se incluy como Lactobacillus sp. A la especie Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides se adscribi el 0,47% de las cepas aisladas, y un 0,47% se adscribi a las especies Leuconostoc paramesenteroides y L. carnosum. CONCLUSIONES La especie dominante en los chorizos artesanales fue Lactobacillus sake, que mantiene proporciones elevadas durante toda la maduracin, seguido de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. En los chorizos industriales la especie dominante fue Lactobacillus plantarum, seguido de L. sake, mientras que los leuconostoc se aislaron en una proporcin muy baja.
BIBLIOGRAFA
Garvie, E.I. (1986). Genus Leuconostoc, p. 1071-1075. En P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe y J.G. Holt (eds.), Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, voll 2. Williams & Wilkins, Baltimore. Kandler, O. y Weiss, N. (1986). Genus Lactobacillus, p. 1209-1234. En P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe y J.G. Holt (eds.), Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, voll 2. Williams & Wilkins, Baltimore. Roissart, H. y Luquet, F.M. (1994). Caractristiques gnrales des bactries lactiques, p. 1116. En Bactries Lactiques Aspects fondamentaux et technologiques. Vol. 1. Lorica. Uriage.

.127.

FM/8

ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGA DEL ZUMO DE MELN Y SU IDONEIDAD COMO SUSTRATO DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA
L.F. Hernndez. J. beda. A.I. Briones. G. Rodriguez y M. Fernndez. Dpto. Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas, Univ. de Castilla La Mancha, Avda. Camilo Jos Cela s/n, 13071 Ciudad Real. OBJETIVOS La finalidad es la comprobacin de la idoneidad del zumo de meln como sustrato de la fermentacin alcohlica para la obtencin de un derivado con posible aplicacin industrial, estudindose tanto la microbiologa del zumo como las condiciones ptimas del proceso. MTODOS Se ensayaron las mejores condiciones de desfangado de cuatro tipos de zumo, molturacin del fruto entero, pelado, pulpa y meln sin pipas, mediante la adicin de distintos clarificantes convencionales a diferentes dosis y tiempos y se determin la limpidez del zumo por medida de su absorbancia. La fermentacin de los distintos tipos de zumo se llev a cabo por duplicado en matraces provistos de vlvulas Mller para crear las condiciones de anaerobiosis adecuadas. Se analiz el rendimiento de la extraccin de zumo y del grado alcohlico alcanzado tras la fermentacin, as como otras variables convencionales (grados Brix, SO2, acidez total y voltil, cido lctico, azcares reductores, prdida de CO2, etc). Con los datos obtenidos se optimizaron variables como el pH, la temperatura, la cantidad de cultivo iniciador aadida, la correccin del contenido de azcares, etc. La microbiota se estudi por tcnicas microbiolgicas clsicas, aplicndose tcnicas de biologa molecular (PCR/RFLP de la regin ITS- 5,8S del rDNA) para comprobar la dominancia de una cepa en el proceso. RESULTADOS Los zumos obtenidos a partir del fruto pelado y entero son los que desfangaron mejor con bentonita y gelatina. Para los otros tipos de zumos, la clarificacin fue menor. El zumo de meln entero es el ms adecuado como sustrato para la fermentacin, debido a que presenta un mayor contenido en nutrientes y unos valores de pH ms bajos, lo que evita problemas de contaminacin por bacterias lcticas. Como producto final se obtiene un fermentado con un grado alcohlico de 4-6 % Vol.. La produccin de sulfhdrico es mas elevada en los zumos con mayor contenido en pulpa. Los recuentos de bacterias lcticas son elevados en algunas experiencias tanto en el zumo de partida como en el fermentado. Las cepas inoculadas, se imponen desde el inicio del proceso.

.128.

FM/9

APLICACIN DE NUEVAS CEPAS DE LEVADURA DE PANADERA DE Torulaspora delbrueckii CON MAYOR TOLERANCIA A LA CONGELACIN
1

Hernandez-Lopez, M.J.1,2; Prieto, J.A.2 y Randez-Gil, F.2 Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad de Valencia, Dr. Moliner s/n, 46100-Burjassot (Valencia). 2 Departamento de Biotecnologa, Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (C.S.I.C.), Apdo. de Correos 73, 46100-Burjassot (Valencia).

Durante las ltimas dcadas, la produccin de masas congeladas para panadera y especialmente para bollera, ha experimentado un notable incremento. Sin embargo, el desarrollo de una tecnologa que permita la fabricacin de un producto de calidad similar al obtenido con masas frescas se ha visto limitado por la sensibilidad al proceso de congelacin/descongelacin de las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae y a la reduccin de la capacidad fermentativa de las masas congeladas con el tiempo de almacenamiento. Como resultado, el tiempo de fermentacin se alarga y el volumen del producto final se reduce, obligando a los industriales a una sobredosificacin de levadura en las formulaciones, con el consiguiente incremento del coste del producto. Estos efectos son ms acusados en masas dulces congeladas, donde la levadura es sometida adicionalmente a un estrs hiperosmtico debido a los altos niveles de sacarosa (10-25%) empleados en su elaboracin, que limitan su crecimiento. Numerosos esfuerzos se han dirigido a la obtencin, muchas veces de forma emprica, de cepas de levadura de S. cerevisiae con una mayor tolerancia al fro. No obstante, es evidente que las cepas existentes en el mercado no renen las caractersticas tecnolgicas deseadas. Por ello, el inters industrial por disponer de levaduras crio y osmotolerantes es cada da mayor. Una posibilidad para mejorar esta situacin podra ser el empleo de cepas de levadura no convencionales que exhiban mayor tolerancia a la congelacin que la observada en S. cerevisiae, manteniendo al mismo tiempo su capacidad para producir CO2 y todas las caractersticas inherentes al uso tradicional de levadura. Dos cepas de Torulaspora delbrueckii, IGC5321 e IGC5323, aisladas de masas de centeno y maz, han sido caracterizadas por su elevada viabilidad y capacidad fermentatva en masas congeladas. A la vista de estos resultados, nuestro grupo de trabajo abri una lnea de investigacin para explorar las posibilidades de aplicacin de estas cepas al proceso de panificacin. Los resultados obtenidos han mostrado que estas dos cepas son capaces de crecer en medios industriales de melaza con un rendimiento en biomasa similar al obtenido para cepas comerciales de S. cerevisiae. Producen tambin, niveles de CO2 similares en masas no congeladas y significativamente ms altos en masas sometidas a congelacin. As mientras masas panaras elaboradas con levaduras comerciales perdieron en torno a un 60% de su capacidad fermentatva durante su almacenamiento en congelacin (-20C, 62 das), las perdidas fueron tan slo de un 30% en el caso de masas elaboradas con las cepas de T. delbrueckii analizadas. Adems, panes elaborados con estas levaduras mostraron caractersticas organolpticas, color, aroma y sabor, similares a los observados en panes elaborados con cepas de S. cerevisiae. La potencial aplicacin de estas cepas en la elaboracin de masas dulces y masas dulces congeladas ha sido ensayada, en especial la cepa IGC5321, muestran una excelente capacidad fermentatva en masas elaboradas con un 8 o un 20% de azcar, obtenindose valores ms altos de produccin de CO2 que los observados con una cepa control comercializada por su mayor tolerancia a condiciones de estrs osmtico. En cuanto a su comportamiento tras el almacenamiento en congelacin, de nuevo las masas dulces elaboradas con la cepa IGC5321 de T. delbrueckii mostraron el mejor patrn de produccin de gas.

.129.

FM/10

POTENCIACION DE LAS CARACTERISTICAS SENSORIALES DE EMBUTIDOS CRUDOS CURADOS MEDIANTE LA ADICION DE UN EXTRACTO ENZIMATICO CRUDO DE Bacilus pumilus Y/O PAPAINA
B. Herranz, J.A. Ordez, J. Bruna, M. Fernndez y L. de la Hoz. Dpto. Nutricin y Bromatologa III. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. Espaa. OBJETIVO Se pretende potenciar el sabor y aroma de embutidos crudos curados mediante la adicin de papana y de un extracto enzimtico crudo de un microorganismo aislado de embutidos artesanales (B.pumilus) debido a su actividad L-amino-oxidsica, implicada en la transformacin de los aminocidos que ocurre durante la maduracin de los mismos. MTODOS Se fabricaron lotes de embutidos: Lote Control (C); Lote P(lote control ms 300 unidades de papana/kg de embutido); Lote E (lote control ms 125ml de extracto enzimtico de B.pumilus) y Lote P+E (lote control ms 300 unidades de papana y 125ml extracto enzimtico). Se determinaron los aminocidos libres a los 5, 15 y 22 das de maduracin por HPLC mediante el mtodo de Bruna y col. (2000); el contenido de amoniaco con el kit enzimtico de Boechringer Mannheim; y al final de la maduracin (22 das) se determin la fuerza mxima de corte y de compresin mediante la utilizacin de texturmetro TA-TX2i. El anlisis sensorial se llev a cabo mediante una prueba triangular y una preferencial. RESULTADOS Los resultados relativos a la concentracin de aminocidos libres reflejan un ligero aumento de los mismos a medida que lo hace el tiempo de maduracin, correspondiendo los valores ms elevados al lote P (debido a la accin de la papana) seguido del lote P+E, con valores muy parecidos a los del lote P aunque ligeramente inferiores. No se observa diferencia muy notable entre los lotes atribuible al extracto enzimtico (lote E) vs lote control (lote C). Lo mismo ocurre con el contenido de amoniaco, que aumentaba ligeramente en todos los lotes excepto en el lote E donde incluso disminuy suavemente en los ltimos das de la maduracin. Los anlisis de textura indicaban que el nico efecto claro fue el de la actividad de la proteasa, que disminuye la dureza y la fuerza mxima de corte en los lotes elaborados con esta enzima (lote P y lote E+P), mientras que el extracto enzimtico no parece que afecte demasiado a estos parmetros. Los anlisis sensoriales mostraron una mejora significativa (p<0.05) en la aceptabilidad general del lote P con respecto a todos los dems, reflejo de una potenciacin del sabor y aroma. CONCLUSIONES La adicin de papana y/o del extracto enzimtico crudo de Bacillus pumilus mejora ligeramente las caractersticas sensoriales de embutidos crudos curados que concuerda con las modificaciones qumicas ocurridas en aminocidos libres y amoniaco.
AGRADECIMIENTOS Trabajo financiado por la CICYT (Proyecto ALI96-0928).

.130.

FM/11

IDENTIFICACIN,TIPIFICACIN Y COMPORTAMIENTO FERMENTATIVO DE LEVADURAS AUTCTONAS DE LA D.O. VINOS DE MADRID CON CAPACIDAD FLOCULANTE
1

P. Hidalgo1 , M.C. Fajardo1, N. Luna1, B. Simn1, I. Martnez1 y F.J. Gallego2. Instituto Madrileo de Investigacin Agraria y Alimentaria (IMIA). Comunidad de Madrid. Finca El Encn. Apdo. 127. 28800 Alcal de Henares. Madrid. 2 Unidad Marcadores Moleculares. Departamento de Mejora Gentica y Biotecnologa. SECE-INIA. Autova A-6. Km7,5. 28040 Madrid

OBJETIVOS En el presente trabajo se determina el perfil taxonmico y molecular de cepas de levadura autctonas de la D.O. Vinos de Madrid que manifiestan la propiedad de flocular, con el fin de contribuir a su tipificacin y al establecimiento de su diversidad gentica. Tambin se evalua el comportamiento enolgico que poseen las cepas bajo determinadas condiciones bsicas que se dan en la segunda fermentacin, enfocadas hacia su posible utilizacin en la elaboracin de vinos espumosos. MTODOS Se han estudiado en 27 cepas de Saccharomyces cerevisiae con carcter floculante su pertenencia a una raza fisiolgica concreta, mediante la determinacin de los perfiles de fermentacin de determinados azcares establecidos en el sistema de clasificacin propuesto por Kreger van Rij (1984). La caracterizacin gentica de las mismas se ha llevado a cabo aplicando el anlisis PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) de microsatlites, como marcadores moleculares (Gallego y col. Am. J. Enol. Vitic. 1998, 49(3), 350-351). Se ha realizado con las cepas en estudio microvinificaciones en un medio sinttico que posee caractersticas comunes a las que puede presentar un vino base para llevar a cabo la segunda fermentacin en la elaboracin de vinos espumosos en cuanto al pH, grado alcohlico, concentracin de sacarosa y contenido de SO2, incubndolo en condiciones de anaerobiosis a baja temperatura (16-18C). La cintica de fermentacin se determin mediante pesada diaria de los frascos hasta valores prcticamente constantes. Posteriormente se realiz la caracterizacin qumica de las muestras mediante las determinaciones de sacarosa y azcares reductores residuales, grado alcohlico y SO2. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Los resultados obtenidos han mostrado que todas las levaduras pertenecientes a la especie Saccharomyces cerevisiae estudiadas que presentan carcter floculante pertenecen nicamente a la raza fisiolgica cerevisiae. Sin embargo los perfiles genticos generados para cada cepa han permitido tipificar, agrupar y diferenciar las levaduras de forma rpida, fiable y precisa, manifestndose la existencia de variabilidad gentica intraespecfica. Se ha puesto en evidencia diferentes comportamientos en la cintica de la fermentacin y en la degradacin de azcares del medio por parte de las cepas estudiadas, evalundose de manera conjunta la incidencia del etanol, SO2, condiciones de aireacin y bajas temperaturas en el desarrollo del proceso.

.131.

FM/12

ESTUDIO CLONAL DE CEPAS DE BACTERIAS LACTICAS ENDOGENAS DE VINOS DE D.O.C. RIOJA

Lpez, I., G. Alegra, E., Fernndez, E., Dizy, M., Torres, C. y Ruiz-Larrea, F. Departamento de Agricultura y Alimentacin. Universidad de la Rioja. Avenida de la Paz 105. 26004 Logroo. (e.mail: fernanda.ruiz@daa.unirioja.es) OBJETIVO Estudiar mediante electroforesis de campos pulsados (PFGE) el DNA genmico de cepas aisladas de muestras de vinos de D.O.Ca Rioja en fermentacin malolctica (FML) espontnea de distintas bodegas de la Comunidad Autnoma de La Rioja, con el fin de determinar las cepas predominantes, y por ende, las mejor adaptadas al crecimiento en las condiciones naturales y de fermentacin tradicional del vino. MTODOS Se muestrearon bodegas de las distintas zonas vitivincolas (Rioja Alta, Alavesa y Baja) y en todos los casos las FMLs fueron llevadas a cabo segn el mtodo tradicional. Se tomaron muestras de vinos tintos (uvas de la variedad Tempranillo, Garnacha, Mazuelo y Graciano) de la cosecha de 1999, en FML y al final de la misma. Las muestras fueron sembradas para el recuento de colonias viables (ufc/ml); se utiliz MRS-agar en presencia de nistatina (200 mg/ml) y las muestras fueron incubadas a 30C en condiciones de 10% CO2 y 98% humedad, as como en anaerobiosis total. Se realizaron reaislamientos de 3 colonias por cada depsito, en medio MLO y MRS-agar. Las identificaciones se llevaron a cabo mediante pruebas morfolgicas (tincin de Gram) y mediante la tcnica de PCR utilizando primers especficos para la identificacin de especies (Dellaglio et al., 1998; Quere et al., 1997). Las cepas aisladas fueron inmovilizadas en agarosa de alta pureza para la aplicacin de la tcnica de PFGE. Se realiz el anlisis de restriccin con la endonucleasa Sfi I y la electroforesis se llev a cabo con el sistema CHEF-DR II de BioRad. RESULTADOS 1) La especie mayoritaria encontrada fue Oenococcus oeni, en contraste con resultados de cosechas anteriores en las cuales predominaba la especie Lactobacillus plantarum en la FML (Senz et al., 1995; Lopez et al., 1998). 2) Se encontraron diversos patrones de restriccin mediante PFGE. Se observ una amplia variabilidad gentica entre las cepas aisladas de un mismo depsito a lo largo de la FML y se constat la presencia simultnea de varias cepas en algunos depsitos durante dicha FML. 3) Algn clon de Oenococcus oeni apareci en depsitos en FML de bodegas de zonas vitivincolas distantes, demostrando con ello que su adaptacin al medio y a las condiciones de fermentacin son ptimas. CONCLUSIONES La especie Oenococcus oeni fue la mayoritaria en la cosecha de 1999. Los patrones de restriccin del DNA genmico utilizando la enzima Sfi I permiten una identificacin precisa de los distintos clones dentro de esta especie bacteriana. Las cepas mejor adaptadas al crecimiento en condiciones naturales y siguiendo el mtodo tradicional de FML son las que se imponen en el vino y llevan a cabo la transformaciones que conlleva esta fermentacin.
REFERENCIAS
Dellaglio, F., Zapparoli, G., Pesente, P. and Torriani, S. Les entretiens scientifiques Lallemand. Verone, pp 29-32 (1998). Lpez, I., Navarro, L., Dizy, M., Zarazaga, M., Ruiz-Larrea, F. y Torres, C. XI Congreso Nacional de Microbiologa de los Alimentos, Pamplona (1998). Quere, F., Deschamps, A. and Urdaci, M.C. J.Appl.Microbiol. 82, 783-790 (1997). Senz, J., Torres, C., Gutirrez, A.R., Tenorio, C. y Sanz, S. Zubia 7, 119-126 (1995).

.132.

FM/13

INFLUENCIA DE DIVERSOS FACTORES EN EL CRECIMIENTO DE Penicillium AISLADO DE LA SUPERFICIE DEL CHORIZO DE CANTIMPALOS.
Lpez Daz, T.M., Encinas, J.P., Garca Lpez, M. L., Otero, A. Departamento de Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad de Len. 24071 - Len, Espaa. OBJETIVOS La escasa o nula toxicidad de cepas de una especie de Penicillium (presunto P. olsonii) dominante en la superficie del chorizo de Cantimpalos aisladas por nosotros, en contraste con otras cepas del mismo gnero (P. commune) que tambin hemos aislado de la superficie de estos productos, nos lleva a plantear la posibilidad de emplear estos cultivos en la elaboracin de esta variedad de embutido, para lo cual es necesario su evaluacin tecnolgica previa.En estudios anteriores se evalu la influencia de la sal, temperatura, pH y actividad de agua en las cepas no toxignicas. En este trabajo se exponen los resultados obtenidos en el estudio del crecimiento de tres cepas de presuntos Penicillium olsonii aisladas de la superficie de chorizo de Cantimpalos y una cepa de P. nalgiovense patrn (especie utilizada en la superficie de embutidos en otros pases europeos) frente a los nitratos, nitritos y especias empleados en la elaboracin de este producto en las concentraciones ms usuales. Asimismo, se ha estudiado el efecto conjunto de varios factores (temperatura, sal, nitratos, nitritos y especias) en su crecimiento. MTODOS Para ello, se determin la tasa de crecimiento (mm de dimetro de colonia/da) de las 4 cepas en las siguientes condiciones: con nitrito de sodio (50, 75 y 100 ppm), con nitrato de potasio (50, 100 y 180 ppm), con dos mezclas de especias (mezcla a: 2,4% pimentn + 0,01% organo + 0,01% ajo; mezcla b: 3% pimentn + 0,12% organo + 0,5% ajo), y con combinaciones de varios factores a dos concentraciones distintas: mezcla A, (ClNa 1%, NaNO2 50 ppm, KNO3 50 ppm, pimentn 2,4 %, ajo 0.01 %, organo 0.01 %) y mezcla B (ClNa 3 %, NaNO2 100 ppm, KNO3 180 ppm, pimentn 3 %, ajo 0.12 %, organo 0.5 %), a 15C y a 25C. El medio base empleado fue Agar Extracto de Malta. RESULTADOS Los resultados obtenidos muestran que ni el nitrito sdico, ni el nitrato potsico, ni las especias tienen un efecto significativo sobre el crecimiento de las cepas estudiadas ni en las mayores concentraciones investigadas. Finalmente, cuando se ha probado el efecto de combinaciones de varios factores en el crecimiento del Penicillium (mezclas A y B) se ha comprobado un efecto estimulante del crecimiento tanto a 25C como a 15C. Este efecto parece debido a la presencia de sal, ya que estudios anteriores han mostrado que el cloruro sdico tiene un efecto estimulante sobre el crecimiento de las cepas investigadas en todas las concentraciones ensayadas (1-3%). Por otra parte, la combinacin de varios factores parece tener un efecto diferente al de la suma de los efectos de cada factor por separado.Las cepas salvajes mostraron un comportamiento similar al de la cepa patrn de P. nalgiovense investigada. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos se puede concluir que, en los valores y concentraciones empleados en la elaboracin del chorizo de Cantimpalos, los factores ms influyentes en el crecimiento, tanto de las cepas de Penicillium aisladas de la superficie de este chorizo como de la cepa patrn de P. nalgiovense investigada, son la temperatura, la actividad de agua y el cloruro de sodio, y que el efecto de los nitratos, nitritos y especias apenas es perceptible.
Trabajo financiado por la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa. Proyecto CICYT ALI95-0132.

.133.

FM/14

INFLUENCIA DE Penicillium chrysogenum y Debaryomyces hansenii EN LA GENERACIN DE COMPUESTOS VOLTILES EN JAMN CURADO
A. Martn*, J.J. Crdoba, M.J. Benito*, M. Alonso y M.A. AsensioHigiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. UEX. 10071. Cceres(*) Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EUITA. UEX. 06071.Badajoz Correo electrnico: amartin@unex.es Las reacciones que conducen a la formacin de los compuestos responsables del sabor y del aroma del jamn curado son muy complejas. Los mohos y las levaduras, aislados frecuentemente durante la maduracin, poseen potentes equipos enzimticos capaz de contribuir a la proteolisis observada en jamn curado, pero no est clara su influencia en la formacin de compuestos voltiles. La utilizacin de cepas de mohos y levaduras con capacidad para generar compuestos voltiles como cultivos iniciadores en jamn curado, adems de excluir a especies toxignicas de mohos, sera de gran inters para el desarrollo de las caractersticas sensoriales del producto acabado. OBJETIVOS. Determinar la posible contribucin de cepas no toxignicas de Penicillium chrysogenum Pg 222 y Debaryomyces hansenii Dh344, seleccionadas por su actividad proteoltica, a la produccin de compuestos voltiles responsables del aroma en productos crnicos madurados. MTODOS. Se realizaron 2 ensayos: uno con un sistema crnico modelo constituido por lomos obtenidos en condiciones estriles, y otro con jamn curado. Para el primero se inocul P. chrysogenum y D. hansenii por separado y de forma conjunta, manteniendo un lomo estril como control. Cada lomo fue madurado en recipientes estriles y se tomaron muestras a los 59 y 106 das de maduracin. En el ensayo con jamn se inocularon ambos microorganismos conjuntamente al inicio y final de post-salado. Se tomaron muestras a los 6 y 12 meses de maduracin, en superficie y profundidad. Tanto en las muestras de lomos como de jamn curado se analizaron los compuestos voltiles obtenidos mediante fibra de carboxen-polidimetilsilosano. Los compuestos extrados con la fibra se analizaron mediante GC-MS. RESULTADOS. En lomos, P. chrysogenum disminuye los aldehdos y alcoholes lineales e incrementa las piracinas y los pirroles. D. hansenii genera en los lomos alcoholes especficos como benceno etanol o ciclohexanol y otros compuestos como furanos. El efecto de los microorganismos inoculados en jamn curado se traduce en una menor cantidad de aldehdos lineales en los jamones con 6 meses de maduracin, as como en las muestras superficiales en ambas tomas de muestras. A los 12 meses, los furanos y steres son ms abundantes en las muestras inoculadas. CONCLUSIN. La inoculacin de P. chrysogenum y D. hansenii en productos crnicos repercute en una menor formacin de compuestos voltiles asociados a procesos oxidativos y en una mayor concentracin de compuestos derivados de la actividad microbiana, pudiendo as contribuir en el sabor y aroma de los productos crnicos.

.134.

FM/15

M. Mas1 , R. Tabla2, J. Moriche2, I. Roa1, J. Gonzlez1, J.E. Rebollo2 y P. Cceres3 Instituto Tecnolgico Agroalimentario. Junta de Extremadura. Apto. 20107. 060071 Badajoz. 2 Dpto. de Bioqumica, Biologa Molecular y Gentica. Fac. de Ciencias. Univ. de Extremadura. 06071 Badajoz. 3Dpto. de Microbiologa. Fac. de Ciencias. Univ. de Extremadura. 060071 Badajoz.

EVOLUCION DE BACTERIAS ACIDO LACTICAS DURANTE LA MADURACION DEL QUESO DE IBORES

OBJETIVOS El queso de Ibores con D.O. se elabora tradicionalmente con leche cruda de cabra en el N.E. de Extremadura. Con el fin de mantener las caractersticas tpicas de este queso, se ha planteado la necesidad de la utilizacin de cultivos iniciadores autctonos, tanto para los quesos elaborados con leche pasterizada como exige la D.O., como para flora lctica de refuerzo en los de leche cruda. Dado que esos cultivos iniciadores autctonos no existen en la actualidad, el objeto de este trabajo ha sido estudiar las principales bacterias lcticas implicadas en la maduracin de estos quesos, como paso previo a la obtencin de cultivos iniciadores autctonos. METODOS En 4 elaboraciones distintas, se tomaron muestras de quesos a los 3, 15, 30 y 60 das de maduracin, realizndose en ellas anlisis microbiolgicos y fisicoqumicos. Los niveles totales de bacterias lcticas se determinaron en agar MRS a pH 5.7. A partir de este medio se realiz el aislamiento e identificacin de 20 colonias por muestra. La identificacin de bacterias cido lcticas se llev a cabo con los criterios morfolgicos y bioqumicos habituales para este grupo bacteriano. Paralelamente se determin en cada una de las muestras el pH, % de humedad y % de NaCI, segn las normas de la FIL. RESULTADOS Se han aislado e identificado 334 cepas de bacterias lcticas. Su adscripcin a los distintos gneros durante la maduracin se muestra en la siguiente Tabla. Gneros
Lactococcus Enterococcus Leuconostoc Lactobacillus

3
34 39 4 0

Das de 15
44 27 26 7

maduracin 30
26 16 33 3

60
26 18 12 19

Total
130 100 75 29

%Total
39 30 22 9

La mayora de las especies de Lactococcus fueron identificadas como L. lactis, las de Leuconostoc como Lc. mesenteroides y las de Lactobacillus como Lb. Plantarum y Lb. casei. Durante la maduracin, el contenido en NAC1 aument hasta un 2.5%, el % de humedad disminuy hasta un 41.11% y el pH que a los 3 das era de 5.8 baj a un pH algo inferior a 5.0 a los 15 y 30 d incrementndose a 5.17 a los 60 das. CONCLUSIONES Entre las bacterias lcticas aisladas, los lactococos y enterococos predominaron claramente durante toda la maduracin, constituyendo aproximadamente un 70% del total de los aislados. Por el contrario, los lactobacilos fueron claramente minoritarios, resultados que contrastan con lo observado en un estudio preliminar, realizado hace aproximadamente una dcada, en este mismo tipo de queso.

.135.

FM/16

RECUENTO DE LACTOBACILOS E IDENTIFICACION DE Lactobacillus casei EN QUESOS CON DENOMINACION DE ORIGEN RONCAL.
M. Oneca y P. Torre Area de Nutricin y Bromatologa. Dpto. Ciencias del Medio Natural. Universidad Pblica de Navarra, 31006 Pamplona, Espaa.
Tel.: 948 16 91 41, Fax.: 948 16 89 30

e-mail: lablac@unavarra.es OBJETIVOS Estudiar el recuento de lactobacilos y la distribucin de Lactobacillus casei en el queso con Denominacin de Origen Roncal elaborado con leche cruda de oveja en distintas queseras y en dos aos distintos. METODOS Para el recuento de lactobacilos, se prepararon diluciones decimales de los quesos a estudiar a partir de 10g de los mismos. El aislamiento se llev a cabo en medio MRS (Difco ) con agar y aadiendo cido actico para disminuir el pH. La identificacin de Lactobacillus casei se realiz a travs del mtodo de Biologa Molecular: Polymerase Chain Reaction (PCR). Dicha reaccin se llev a cabo con dos parejas de primers: Lb1 / Lb2 y CA1 / SS1. Los ciclos de amplificacin fueron los siguientes: Un primer ciclo a 94C durante 5 minutos seguidos de 35 ciclos que comprenden la fase de desnaturalizacin a 94C durante 15 segundos, anillamiento a 62C durante 1 minuto y la fase de elongacin a 72C durante 1 minuto y medio. El ciclo final es de 72C durante 7 minutos. RESULTADOS El recuento de lactobacilos llevado a cabo en las cinco queseras adscritas a la D.O. Roncal ha mostrado que el nmero de lactobacilos es igual en el primer y segundo ao de muestreo; no hay diferencias significativas en el recuento de lactobacilos de los dos aos analizados. En el primer ao el recuento promedio de lactobacilos de todas las queseras es de 7,075 unidades logartmicas y en el segundo ao 7,379. Respecto a la comparacin entre las queseras, no se aprecian diferencias significativas entre ellas en el recuento de lactobacilos; se puede considerar que el recuento de lactobacilos es el mismo en las cinco queseras analizadas. En cuanto al recuento de Lactobacillus casei llevado a cabo en cuatro de las cinco queseras estudiadas anteriormente, se ha comprobado que, globalmente, no existen diferencias significativas entre la quesera Q1 y la quesera Q3 y entre la Q1 y la Q4. Entre el resto de queseras no existen diferencias. As como no existen diferencias globales entre queseras, si las hay entre los dos aos de recogida de muestras, aprecindose las mayores diferencias en la quesera Q5. Adems se ha observado que existe una interaccin entre la distinta procedencia de las muestras, es decir, entre las distintas queseras y el ao de recogida de muestras. CONCLUSIONES El recuento de lactobacilos no presenta diferencias significativas entre queseras ni tampoco cuando se comparan los dos aos en los que se han recogido muestras. En cuanto al recuento de Lb. Casei parecen no existir diferencias globales entre queseras pero s que afecta al recuento el ao de recogida de las muestras de queso.

.136.

FM/17

EFECTO DE LA PASTERIZACION Y ADICION DE UN FERMENTO NATIVO SOBRE LOS COMPUESTOS VOLATILES EN EL QUESO RONCAL
M. Ortigosa, J. Izco y P. Torre Area de Nutricin y Bromatologa. Dpto. Ciencias del Medio Natural. Universidad Pblica de Navarra. 31006 Pamplona, Espaa. Tel: 948-168141, Fax: 948-168930 e-mail: lablac@unavarra.es OBJETIVOS Estudiar el efecto de la pasterizacin y de la utilizacin de un fermento nativo sobre los compuestos voltiles del queso Roncal, elaborado con leche cruda de oveja. METODOS Los quesos se elaboraron segn el mtodo permitido por el Consejo Regulador de Roncal (AOC). Se elaboraron tres lotes: uno con leche cruda (lote C), otro con leche pasterizada (lote P) y un tercer lote con leche pasterizada en la que adems del fermento comercial se aadi un fermento nativo compuesto por Lactobacillus casei (citrato +) (lote F). Se analizaron quesos con 1, 120 y 240 das de maduracin. El anlisis de voltiles fue realizado mediante la tcnica purga y trampa acoplada a un cromatgrafo de gases con espectrmetro de masas. RESULTADOS Se detectaron en total 76 compuestos voltiles: hidrocarburos, compuestos azufrados, alcoholes, cetonas, steres y cidos. La mayora de los compuestos se han encontrado tambin en otros tipos de quesos.El grupo mayoritario es el de los alcoholes, los cuales suponen el 21% de los compuestos voltiles identificados. Se ha observado un aumento significativo (P < 0.05) en la concentracin de estos compuestos a lo largo de la maduracin. Los quesos elaborados con leche cruda presentaron niveles superiores de la mayora de los alcoholes que en los dems lotes, especialmente a los 240 das de maduracin. Este hecho implica que la pasterizacin de la leche de partida tiene un efecto negativo en la produccin de alcoholes durante la maduracin.El etanol permanece constante a lo largo de la maduracin en el lote de queso elaborado con leche cruda, mientras que en los lotes elaborados con leche pasterizada disminuye significativamente (P < 0.05). No obstante, los lotes elaborados con leche pasterizada (lotes P y F) presentaban niveles claramente superiores con 1 da de maduracin.Slo se han detectado 7 aldehidos, de los cuales 3 son ramificados. Como se ha observado con otros compuestos derivados de aminocidos (alcoholes) sus niveles aumentan con la maduracin siendo mayores en el lote C. Lo mismo ocurre con los cidos isobutrico e isovalrico ya que derivan del metabolismo de la Valina y Leucina respectivamente.Los compuestos mayoritarios en los quesos de 1 da de maduracin de los tres lotes han sido 2,3-butanodiona (diacetilo) y 3-hidroxi, 2-butanona (acetona), y sus niveles son iguales en los tres lotes de quesos (P < 0.05) a lo largo de la maduracin. Estos compuestos aparecen como consecuencia del metabolismo de la lactosa y del citrato por los lactococos, especialmente por Lactococcus lactis ssp bio-variedad diacetylactis, presente en el fermento comercial aadido a los tres lotes de queso. Sin embargo, los niveles de 2-butanol y 2butanona derivados de la reduccin de diacetilo y acetona son claramente superiores en el lote de queso con leche cruda. Parece ser que la reduccin de que 2,3 butanodiol a 2-butanona es debida a los microorganismos presentes en la leche cruda que se ven afectados por la pasterizacin. A pesar de haber aadido el Lactobacillus casei (citrato positivo) al lote F, no se han apreciado diferencias con el lote P en los niveles de diacetilo, probablemente debido a que el metabolismo del citrato est dominado por los lactococos aadidos en el fermento comercial. CONCLUSIONES La pasterizacin disminuy los niveles de algunos compuestos voltiles, especialmente alchoholes, aldehidos y cetonas. No se han encontrado diferencias significativas entre los quesos elaborados con leche pasterizada (lotes P y F), con excepcin de algunos compuestos aislados que aparecieron en mayor o menor nivel; por lo tanto se puede concluir que el fermento nativo no afect a los compuestos voltiles.

.137.

FM/18

CONTROL MEDIANTE PCR DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA DEL MOSTO DE MANZANA

Rosa Pando Bedriana, Mnica Garca Castro, Norman Fernndez Tascn, Beln Surez Valles. Departamento de Sidras y Derivados del SERIDA. Principado de Asturias. OBJETIVOS Evaluar el grado de implantacin de la cepa inoculada de Saccharomyces cerevisiae durante la fermentacin del mosto de manzana, seleccionada de sidras naturales asturianas y perteneciente a la coleccin de cultivos tipo de levaduras de sidra del SERIDA. MTODOS Se realiza el seguimiento de la fermentacin alcohlica en dos toneles, de 1000 litros de capacidad, en la bodega experimental del SERIDA. Para determinar el grado de implantacin de la cepa inoculada sobre la flora salvaje del mosto, se realizaron anlisis de biologa molecular mediante PCR -Reaccin en Cadena de la Polimerasa- y posterior visualizacin por electroforesis en gel de agarosa. Paralelamente se hicieron anlisis de morfologa y divisin celular, mediante microscopa ptica y bateras de pruebas bioqumicas -API 20AC AUX-. El estudio consta de cuatro muestreos en funcin de las densidades: M0 (d=1046 g/l), M1 (d=1034 g/l), M2 (d=1020 g/l) y M3 (d=1000 g/l). RESULTADOS Los anlisis se realizaron aislando aleatoriamente 20 colonias en el mosto sin inocular y 10 colonias en los siguientes muestreos. El grado de implantacin se determin realizando estudios comparativos del patrn de bandas de amplificacin de la cepa inoculada, respecto a los patrones de bandas de las cepas aisladas al azar en los distintos muestreos. 1- Muestreo M0 -mosto sin inocularAl estudiar el patrn de bandas de cada una de las 20 colonias por unidad experimental, se observ que ninguna colonia posea el mismo patrn que la cepa inoculada como inductora. Al realizar las bateras de pruebas bioqumicas, las observaciones morfolgicas y las de divisin celular, se identificaron las siguientes especies: Torulopsis candida, Hansenula anmala, Metschnikowia pulcherrima, Pichia guillermondi, Clavispora lusitaneae y Kloeckera apiculata . El porcentaje de implantacin resultante en los siguientes muestreos fue: 2- M1 - mosto inoculado al 2% con el inductor-. Tonel 1: 30% Tonel 2: 30% 3- M2. Tonel 1: 70% Tonel 2: 100% 4- M3 -final de la fermentacin-. Tonel 1: 100% Tonel 2: 100% CONCLUSIONES La aplicacin de tcnicas moleculares -PCR- permiti realizar una adecuada caracterizacin de las cepas de levaduras, presentes durante el proceso de fermentacin de la sidra, concluyendo que dicho proceso fue dirigido mayoritariamente por la cepa inoculada como inductora.

.138.

FM/19

Manuel Ramrez1*, Jos A. Regodn2, Francisco Prez1, y Jos E. Rebollo3. Departamento de Microbiologa, 2Departamento de Biologa y Produccin de los Vegetales y 3 Departamento de Gentica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, 06071 Badajoz. Tel: 34-924-289426. Fax: 34-924-271304. E-mail: mramirez@unex.es

INCREMENTO DEL VIGOR FERMENTATIVO DE LAS LEVADURAS VNICAS MEDIANTE ELIMINACIN DE ALELOS RECESIVOS QUE RETARDAN EL CRECIMIENTO

OBJETIVOS Se pretende mejorar el vigor fermentativo de las levaduras vnicas. MTODOS Los mtodos utilizados se recogen en ( Ramrez, M., J. A. Regodn, F. Prez, and J. E. Rebollo. Wine yeast fermentation vigor may be improved by elimination of recessive growthretarding alleles. Biotechnol. Bioeng. 65(2):212-218 (1999)). RESULTADOS La presencia de alelos que provocan crecimiento lento puede reducir la eficacia biolgica de las levaduras vnicas industriales. En la naturaleza, estos alelos podran ser eliminados mediante el proceso conocido como "renovacin genmica (genome renewal)". En este trabajo mostramos la utilizacin de este proceso en el laboratorio para incrementar el vigor fermentativo de las levaduras vnicas. El procedimiento consiste simplemente en esporular las levaduras y seleccionar nuevos clones homozigticos procedentes de esporas aisladas. Encontramos que la mayora de los nuevos clones en los que se han eliminado los alelos deletreos recesivos son capaces de iniciar la fermentacin del mosto ms rpidamente. El incremento en el grado de homozigosidad no presenta ninguna relacin, directa o inversa, con el vigor fermentativo de las levaduras ni con la calidad de los vinos elaborados. Sin embargo, en algunas cepas en las que se eliminaron los alelos que provocan crecimiento lento, el vigor fermentativo y la calidad de los vinos incrementaron simultneamente. CONCLUSIONES Mediante un simple proceso de esporulacin y seleccin de hbridos homozigticos es posible eliminar los alelos recesivos que retardan el crecimiento, incrementar el grado de homozigosidad, incrementar el vigor fermentativo, y mejorar la calidad de los vinos simultneamente.

.139.

FM/20

I. Roa1 , J. Moriche2, R. Tabla2, M. Mas1, J. Gonzlez1, P. Cceres3 y J.E. Rebollo2. . Instituto Tecnolgico Agroalimentario. Junta de Extremadura. Apto. 20107. 06071 Badajoz. 2 . Dpto. de Bioqumica, Biologa Molecular y Gentica. Fac. de Ciencias. Univ. de Extremadura. 06071 Badajoz. 3. Dpto. de Microbiologa. Fac. de Ciencias. Univ. de Extremadura. 06071 Badajoz.

ACTIVIDAD PROTEOLTICA, APTITUD TECNOLGICA Y PERFILES PLASMDICOS DE LACTOCOCOS AISLADOS DE QUESOS DE IBORES.

OBJETIVOS El objetivo del presente trabajo ha consistido en la caracterizacin tecnolgica, bioqumica y gentica de lactococos aislados a partir de Queso de Ibores con DO, elaborado sin fermentos lcticos comerciales, con el fin de seleccionar las cepas ms aptas para la elaboracin de dicho queso. MTODOS. La produccin de cido, el contenido en diacetilo-acetoina y la actividad proteoltica mediante el mtodo de o-ftaldialdehido (OPA) se realizaron sobre cultivos de lactococos (130) en leche esterilizada, incubados a 30 C durante 6, 48 y 24 horas respectivamente. La degradacin de casenas por PAGE tanto de leche como de casenas purificadas. El perfil plasmdico se ha llevado a cabo mediante electroforesis en geles de agarosa. La aptitud tecnolgica se ha evaluado mediante la elaboracin de quesos en planta piloto, con leche de cabra cruda y pasterizada. RESULTADOS Se ha analizado la capacidad acidificante de las 130 cepas de Lactococcus aislados presentando el 76% valores comprendidos entre 15-20 D; el 12% entre 10-15 D y el 12% con una acidez entre 20-25 D. Asimismo, en las cepas seleccionadas, se han establecido las curvas de pH en leche de cabra (cruda y pasterizada) y leche reconstituida dando lugar a tiempos de latencia y de coagulacin muy similares entre s. Las cepas de lactococos estudiadas no produjeron cantidades apreciables de diacetilo-acetoina en leche despus de 48 horas de incubacin a 30 C. Sin embargo, la actividad proteoltica evaluada mediante el test OPA, permiti detectar en un 30% de las cepas, concentraciones de grupos amino comprendidas entre 1,15 y 0.50 mM glicina/l; un 40 % con valores entre 0,50 y 0,10 mM glicina/l y en el 30% restante se observaron valores entre 0,10 y 0,26 mM glicina/l. Las cepas ensayadas produjeron proteasas de los tipos PI y PIII en base a la degradacin de s1- y -casena segn el anlisis electrofortico mediante urea-PAGE. La caracterizacin gentica se ha iniciado sobre 33 cepas escogidas en base a sus caractersticas tecnolgicas. Hemos analizado el patrn de bandas electroforticas correspondientes a ADN plamdico, obteniendo 5 perfiles diferentes, de los que uno es mayoritario, presentndose en 28 de las cepas. En las cepas analizadas no se aprecia correlacin aparente entre perfiles plasmdicos y caractersticas tecnolgicas. Se ha emprendido el estudio de las caractersticas fsicas y funcionales de cada plsmido, as como de su estabilidad. Por ltimo, se han comenzado a elaborar quesos en la planta piloto con 20 cepas preseleccionadas segn su capacidad proteoltica y acidificante, a los cuales se les realiza un seguimiento microbiolgico, fisico-qumico y sensorial. CONCLUSIONES. Las cepas autctonas de lactococos seleccionadas parecen desempear un importante papel como cultivos iniciadores en la elaboracin y maduracin del Queso de Ibores con leche cruda dado que presentan una adecuada produccin de cido y actividad proteoltica. El 84% de las cepas ensayadas muestran un alto grado de uniformidad presentando un tipo de perfil plasmdico predominante.

.140.

FM/21

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA CINTICA DE ACIDIFICACIN Y COMPOSICIN MICROBIOLGICA ENTRE NUEVE LACTOSUEROS SELECCIONADOS Y UN FERMENTO COMERCIAL
1

M. Bayona1, H. Tormo2, Le Mens, P.3 y Romero del Castillo, R1 Dpto. Indstrias Agroalimentrias. Escola Superior d'Agricultura de Barcelona. UPC. C/Urgell 187 08036 Barcelona, 2 Centre Fromager de Carmejane Le Chteau 04510 Le Chaffaut Saint-Jurson, 3 Institut de l'Elevage 149, rue de Bercy 75 595 Pars CEDEX 12

OBJETIVOS Conocer la capacidad acidificante y la composicin microbiolgica de nueve lactosueros utilizados como fermentos en diferentes queseras artesanales y un fermento comercial que servir de referencia. MATERIAL Y MTODOS Los lactosueros se seleccionaron de queseras cercanas al Centre Fromager de Carmejane (Provence Alpes Cte Azur). El fermento comercial liofilizado fue "Smadl 957" de la marca MARSCHALL comercializado por TEXEL. Para estudiar la cintica de acidificacin se utiliz leche en polvo libre de inhibidores reconstituida con agua estril, se sembr con dosis del 1% y del 10% de cada uno de los lactosueros y el fermento comercial y se incub a dos temperaturas 17oC y 25oC, cada 15 minutos durante 23 h. se registraron en un ordenador la Temperatura y el pH. Para conocer los grupos de microorganismos presentes en los fermentos se realizaron recuentos en los medios de cultivo siguientes: Medio PCA para recuento de microorganismos aerobios mesfilos acidificantes segn la norma FIL 04-505, Elliker y Elliker modificado ms acetato de Talium, M-17 agar, MSE agar, MRS agar para los diferentes grupos de bacterias lcticas, D-Coccossel para enterococos, VRBLA para coliformes totales, CGA de SANOFIPASTEUR para hongos y levaduras. RESULTADOS La aptitud acidificante se evalu segn la velocidad mxima de acidificacin (Vmx=pH2pH1/t2-t1, donde t = tiempo), el tiempo necesario para llegar al pH de 4.8 y el valor de pH a las 22 h 30 min. Se demuestra que las cinticas de acidificacin de los lactosueros son comparables a la del fermento comercial. A 250C se dobla la velocidad de acidificacin respecto a 17oC. Al estudiar los valores de velocidad mxima en relacin a la dosis de fermento utilizada se deduce que el efecto dosis no presenta gran importancia ya que los resultados son casi iguales. La cuantificacin de los diferentes grupos de microorganismos presentes en el lactosuero demuestran que la flora dominante en todos los casos es la flora lctica que forma colonias en el medio M-17 (Lactococos). La flora subdominante de las 9 muestras de fermentos son las bacterias lcticas que crecen en el medio MSE ( Leuconostoc) y hongos y levaduras con proporciones variables segn la explotacin. Las bacterias lcticas que crecen en medio MRS, los enterococos y los coliformes totales representan la flora secundaria y muy variable segn las explotaciones. CONCLUSIONES La aptitud acidificante del fermento comercial Smadl es muy similar a la de los lactosueros y estos entre si, este hecho permite a los productores de queso de tecnologa lctica utilizar el lactosuero como fermento lctico, con la misma capacidad de acidificacin que el fermento comercial. La flora subdominante y secundaria influye poco en la capacidad de acidificacin de los lactosueros que es el resultado de la actividad de la flora lctica principal pero puede dar al queso matices de textura, gusto y olor diferenciados segn el perfil microbiolgico de cada explotacin, tanto en sentido positivo como negativo.

.141.

FM/22

ASPECTOS MICROBIOLOGICOS DE LA MACERACION PREFERMENTATIVA EN FRIO CON LA VARIEDAD TEMPRANILLO DE LA D.O.C. RIOJA.
P. Santamara, A.R. Gutirrez,R. Lpez, P. Garijo, S. Epifanio, F. Ruiz, J. Martnez, G. Alegra E. Centro de Investigacin y Desarrollo Agrario de La Rioja. Apdo.: 433. 26080 Logroo (La Rioja). OBJETIVOS Se pretende establecer las diferencias microbiolgicas existentes entre vinos tintos elaborados por el mtodo tradicional y mediante el empleo de la maceracin prefermentativa en fro, con la finalidad de obtener vinos ms afrutados y con mayor composicin antocinica. METODOS El estudio se llev a cabo en depsitos de acero inoxidable de 1200 l de capacidad. La maceracin en fro se realiz despus del estrujado, despalillado y sulfitado, manteniendo la vendimia en el depsito a 4C durante 10 das, mediante la adicin de nieve carbnica. El depsito testigo ferment directamente. El recuento de levaduras y bacterias se hizo mediante la tcnica de diluciones decimales y siembra en placa petri, con los medios cloranfenicol glucosa agar y MRS adicionado con nistatina, respectivamente. La identificacin clonal de levaduras se realiz mediante anlisis de restriccin del ADN mitocondrial. RESULTADOS Durante el proceso de maceracin en fro se observa una disminucin del nmero de levaduras viables presentes en la masa de vendimia. Sin embargo, el nivel mximo de levaduras que se alcanza durante la fase estacionaria de la fermentacin alcohlica es similar al del testigo. Los clones de levaduras, as como su fenotipo killer, que se desarrollan en ambos ensayos son muy distintos. De un total de 19 clones diferentes identificados, tan slo tres se encuentran presentes en ambos depsitos. La diversidad clonal en la maceracin fermentativa es mucho mayor que en el testigo. Cepas con perfil no-Sacharomyces, solo se han aislado en el ensayo de maceracin prefermentativa. Al inicio de la fase de maceracin en fro se observa un aumento de la poblacin de bacterias, que posteriormente se mantiene estable durante todo el tratamiento. Este desarrollo podra explicar el mayor nivel de acidez voltil que aparece en el vino macerado en fro. El vino elaborado con esta tcnica prefermentativa, presenta mayor concentracin de antocianos y valores superiores en el Indice de polimerizacin (mayor coloracin roja) CONCLUSIONES Desde el punto de vista microbiolgico, la tcnica de maceracin en fro marca diferencias con respecto a la vinificacin tradicional de vinos tintos modificando la flora levaduriforme y bacteriana presente.

.142.

FM/23

CARACTERIZACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LEVADURAS AISLADAS DE EMBUTIDOS MADURADOS.

M.D. Selgas, R. Domnguez, J. Ros y M.L. Garca. Dpto. Nutricin y Bromatologa III. Facultad de Veterinaria. Universidad Computense. 28040 Madrid. OBJETIVOS Se pretende caracterizar la actividad proteo y lipoltica de levaduras aisladas de productos crnicos madurados de forma natural, es decir, sin cultivo iniciador, con el fin de seleccionar aquellas cepas que posean mayor actividad e inocularlas intencionadamente para conocer su influencia en las caractersticas organolpticas de estos embutidos. METODOS Las cepas de levaduras se aislaron de embutidos utilizando gar Rosa de Bengala con cloranfenicol. Se hizo un estudio macro y microscpico de la morfologa de las colonias y se identificaron parcialmente mediante el sistema API 20C AUX. La caracterizacin de las levaduras se realiz mediante las siguientes pruebas: produccin de catalasa y nitrato reductasa, actividad aminopeptidasa (L-alanina, L-valina y L-metionina p-nitroanilida), actividad proteoltica sobre protenas crnicas (determinacin de la tiroxina liberada mediante el mtodo de Lowry) y lipoltica sobre grasa de cerdo y triglicridos de diferente longitud de cadena y grado de saturacin (tcnicas de difusin en placa). La seleccin de las cepas se realiz mediante un anlisis previo de componentes principales (PCA) sobre las variables estudiadas, seguido de un anlisis cluster realizado por las cinco PC que recogan la mxima variabilidad (programa SAS versin 6.12) RESULTADOS Se han aislado 166 cepas de levaduras, las cuales se agruparon segn la similitud del perfil numrico del sistema API en 54 categoras, escogiendo una cepa representante de cada una de ellas para su estudio posterior. De forma paralela se estudi la actividad enzimtica de una cepa de Yarrowia lipolytica 1357 de la CECT. Todas las cepas estudiadas fueron catalasa positiva. Veintitrs cepas (42%) fueron nitrato-reductasa positivas, actividad que se considera importante ya que estas levaduras podran participar en el color caracterstico de esos productos crnicos. En trminos generales todas las cepas presentaron actividad aminopeptidasa, sobre todo frente a la metionina. Todas las cepas estudiadas presentaron actividad frente a las dos protenas ensayadas, siendo preferentemente hidrolizadas las protenas miofibrales. Un total de un 27% de las cepas present una actividad relevante frente a las protenas sarcoplsmicas. Treinta y seis cepas (65%) presentaron actividad lipoltica frente a la grasa de cerdo. De ellas, el 11% (6 cepas) fueron activas frente a la tributirina, el 29% (16 cepas) frente a la tricaprina; el 22% (12 cepas) frente a la tripalmitina y el 7% (4 cepas) hidrolizaron la triolena. Es interesante destacar que hubo tres cepas que presentaron actividad frente a la tripalmitina y la triolena, triglicridos compuestos por los cidos grasos mayoritarios de la grasa de cerdo y de ellas, una present, adems, actividad frente a la tricaprina. Se obtuvieron 3 clusters caracterizados por alta actividad lipoltica (C-1) (2 cepas), alta actividad proteoltica (C-2) (8 cepas) y el tercero (C-3), con 6 cepas, con elevados valores en ambas actividades hidrolticas. CONCLUSIONES De las 16 cepas anteriormente citadas se seleccionaron las 6 que presentaron mayor actividad enzimtica pertenecientes 3 de ellas al C-2 y las otras 3 cepas al C-3.
Trabajo financiado por el Proyecto FEDER, ref.: FD97-1030.

.143.

FM/24

ESTUDIO DE LAS CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS DE LAS BERENJENAS DE ALMAGRO OBTENIDAS POR FERMENTACIN DIRIGIDA Y CON FRUTOS CONGELADOS
S. Sesea, I. Snchez-Hurtado y M.LL. Palop. Dpto. Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos. Univ. Castilla-La Mancha. Avda. Carlos III s/n, 45071 Toledo. OBJETIVOS Se estudia el efecto de la utilizacin de frutos congelados y de un cultivo iniciador previamente seleccionado, en las caractersticas organolpticas de las berenjenas de Almagro. MATERIAL Y MTODOS Se realizaron 4 ensayos a escala piloto utilizando berenjenas de Almagro (Solanum melongena L. var. esculentum depressum) frescas y congeladas, que se fermentaron con y sin la adicin de un cultivo iniciador. Las cepas utilizadas como starter, pertenecan a las especies Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum y Lactobacillus plantarum, y haban sido aisladas de la salmuera de un fermentador con fermentacin espontnea, e identificadas en nuestro laboratorio. El seguimiento de la fermentacin se realiz por medida de parmetros qumicos (concentracin de azcares reductores y de cido lctico, pH) y microbiolgicos (recuento de bacterias lcticas y de enterobacterias). Las berenjenas obtenidas y otras comerciales fueron sometidas a anlisis sensorial descriptivo y de preferencia. RESULTADOS La evolucin de la fermentacin fue similar en todos los casos. La adicin del inculo acortaba considerablemente el proceso, pudiendo darse por concluido 2 das despus de la adicin del mismo. En el anlisis sensorial, los catadores consultados no prefirieron de forma significativamente diferente las berenjenas elaboradas a partir de frutos frescos o congelados, si bien en el anlisis descriptivo aquellas que haban sido elaboradas con frutos congelados resultaron peor evaluadas en la textura. Las fermentadas con el cultivo iniciador resultaron muy similares a las espontneas, desapareciendo el sabor amargo que haba sido detectado en ensayos anteriores cuando se utilizaba un starter comercial para vegetales. CONCLUSIONES De los resultados anteriores puede concluirse que si bien la congelacin no afecta negativamente al proceso de fermentacin, si sera conveniente tratar de modificar las condiciones de la misma, con el fin de evitar daos excesivos en la textura. La posibilidad de utilizacin de frutos congelados unido a los buenos resultados obtenidos con la adicin del starter, permitir la elaboracin desestacionalizada del producto con el consiguiente beneficio industrial.

.144.

FM/25 MONITORIZACIN DE LEVADURAS COMERCIALES DURANTE EL PROCESO DE VINIFICACIN MEDIANTE RFLP Villa1 , M.; Belloch1, C.; Uruburu1, F.; Querol2, A. 1 Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universidad de Valencia. Edificio de Investigacin.. 46100 Burjassot. Valencia. Espaa. 2 Instituto de Agroqumica y Tecnologa de los alimentos (IATA-CSIC). Apartado de Correos 73, Burjassot. Valencia. Espaa. OBJETIVOS Tradicionalmente, el vino se elabora por fermentacin natural dirigida por el desarrollo de levaduras originales de los racimos y el propio ecosistema de la bodega. En Espaa como en muchos otros pases se intenta evolucionar hacia una fermentacin inducida de los mostos utilizando levaduras seleccionadas que, al proceder normalmente de otros ecosistemas pueden ocasionar problemas de aclimatacin y no llegan a desplazar a la flora autctona. As pues, es necesario realizar un estudio de implantacin de las cepas comerciales que se pretende utilizar en las bodegas, determinar que levadura es la ms adecuada y, en el caso de que las levaduras comerciales no lleven a cabo la fermentacin adecuadamente, ser necesario realizar una seleccin de cepas en base a las caractersticas enolgicas que determine la bodega, dependiendo de los vinos que se vayan a elaborar. METODOS Para diferenciar la levadura inoculada del resto de las levaduras presentes a lo largo de la fermentacin, las tcnicas de biologa molecular se presentan como una alternativa a la metodologa tradicional; como el mtodo desarrollado por el grupo de Querol, et. al., (1996), basado en el anlisis de restriccin del DNA mitocondrial (mt DNA), sin necesidad de purificar el mtDNA (Querol et. al., 1992b). Este mtodo se ha aplicado tanto a la caracterizacin de levaduras vnicas seleccionadas como al seguimiento de levaduras a lo largo de procesos industriales (Querol et. al., 1992c) a modo de mtodo rpido de identificacin de levaduras presentes en los mostos (Gillamn et. al., 1998). RESULTADOS En el presente trabajo, se realizaron fermentaciones controladas con levadura inoculada y fermentaciones espontneas, para distintas variedades de uva de vinos blancos y tintos. Despus se procedi al aislamiento de las levaduras a partir de los vinos elaborados, tomando distintas muestras a lo largo de la fermentacin. El siguiente paso fue la identificacin de las levaduras aisladas mediante RFLP de la zona ITS-5.8S rRNA. Despus, las levaduras identificadas como Saccharomyces cerevisiae, se caracterizaron molecularmente mediante RFLP del mtDNA. Utilizando la caracterizacin molecular a nivel de cepa se intent calcular el porcentaje de implantacin de levaduras comerciales en las condiciones de vinificacin utilizadas en las bodegas Torre Oria S.L. CONCLUSIONES La tcnica de RFLP rDNA nos ha permitido diferenciar entre las especies no Saccharomyces cerevisiae, de las que si lo son; pero no nos permite constatar que todas las especies Saccharomyces cerevisiae sean la misma cepa y que se correspondan con la levadura inoculada, por lo que recurrimos a la tcnica de mtDNA que permite diferenciar a nivel de cepa y as poder seguir el proceso de implantacin de las levaduras comerciales.

.145.

.146.

FISIOLOGA Y METABOLISMO

.147.

FYM/1

CONVERSION DE METIONINA Y AMINOACIDOS AROMATICOS EN BACTERIAS LACTICAS

F. Amrita1 , L. Parra1, G. Taborda2, T. Requena1, L. Amigo2 y C. Pelez1 1 Instituto del Fro (CSIC), Ciudad Universitaria, s/n 28040 Madrid 2 Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC), Juan de la Cierva, 3 28006 Madrid

OBJETIVOS La produccin de compuestos aromticos caractersticos del queso tiene lugar como consecuencia del catabolismo microbiano de aminocidos. El objetivo de este trabajo ha sido determinar la presencia de actividades aminotransferasa (AT), metionina liasa y descarboxilasa en lactobacilos y lactococos. METODOS Se han analizado las actividades aminotransferasa y metionina liasa en suspensiones de clulas recogidas en la fase estacionaria de crecimiento (D.O.650 5) de 30 cepas de bacterias lcticas. Lactococcus lactis IFPL359 y NCDO763 se emplearon como cepas de referencia. Las actividades AT analizadas fueron la correspondiente a aminocidos aromticos (ArAT), aminocidos de cadena ramificada (BcAT), as como la glutamina-piruvato AT (GlnPyAT) y metionina-glioxilato AT (MetGlyoxAT), utilizando metionina (3mM) como sustrato. Los ensayos se realizaron a pH 7,5, empleando a-cetoglutarato, oxaloacetato, piruvato y glioxilato como aceptores de grupo amino, en presencia y ausencia de glucosa (0,3%). Para el anlisis de actividad liasa se emple como sustrato Met (3mM). Tambin se analiz la actividad aminotransferasa con Phe y Tyr como sustratos en aquellas cepas que presentaron actividad AT frente A Met. Para la determinacin de la actividad AT se analizaron los correspondientes cetocidos y su transformacin en hidroxicidos en presencia de 0,3% de glucosa. Adems, en estas cepas se ensayaron las actividades Met, Glu, Asp y cetocido descarboxilasa. RESULTADOS En las condiciones de ensayo, no se detect actividad metionina liasa en las cepas estudiadas. Slo siete lactobacilos y tres lactococos presentaron actividad AT, siendo Lactococcus lactis NCDO763 quien present la mayor actividad. La transaminacin de la metionina y aminocidos aromticos fue superior cuando se aadi glucosa a la mezcla de reaccin, aunque parte se transform en el hidroxicido correspondiente. La presencia de glucosa supone un suplemento de energa que facilitara el transporte de aminocidos al interior celular. Ninguna de las cepas estudiadas present actividad descarboxilasa de aminocidos. Slo se detect actividad cetocido descarboxilasa en dos de las cepas estudiadas, producindose metional a partir de metionina. Este compuesto ha sido descrito como uno de los que contribuyen a la formacin del aroma en queso. CONCLUSIONES La presencia de enzimas convertidoras de aminocidos en bacterias lcticas es muy variable. Algunas cepas poseen actividades aminotransferasas y descarboxilasa de gran inters para la produccin de voltiles en queso.

.148.

FYM/2

EFECTO DEL SO2 Y OTROS COMPONENTES DEL VINO SOBRE LA ACTIVIDAD ATPasa Y LA SINTESIS DE PROTEINAS EN DIFERENTES CEPAS DE Oenococcus Oeni.
Carret, R., Bordons, A. y Constant, M Departament de Bioqumica i Biotecnologa. Centre de Referncia de Tecnologia dAliments. Universitat Rovira i Virgili. Tarragona. OBJETIVOS Oenococcus oeni es el principal responsable de la fermentacin malolctica del vino. En el trabajo que presentamos nos hemos propuesto estudiar el efecto de algunos componentes del vino (cidos grasos C10 y C12, cobre y, especialmente, SO2) sobre el metabolismo celular (sntesis de protenas de estrs y actividad ATPasa) de distintas cepas, continuando con una serie de estudios previos. La ATPasa de membrana de O. Oeni es una F1F0ATPasa, dependiente de Mg, inhibida por DCCD, cuya Km presenta un valor alrededor de 2 mM. METODOS En este trabajo se han utilizado tres cepas de O. oeni: una procedente de coleccin (CECT 4100), otra comercial (Vitilactic) y otra aislada por nuestro grupo de investigacin. Como medios de cultivo, se ha empleado MRS (medio de ensayo rico en nutrientes) y un vino sinttico. Las condiciones de estrs (etanol, cidos grasos C10 y C12, cobre, pH y SO2) son aplicadas, por un lado, sobre clulas en estado de reposo metablico (resting cells) y por otro, sobre clulas en crecimiento es su propio medio de cultivo y recogidas por centrifugacin. Posteriormente se asla la fraccin de membrana plasmtica celular sobre la cual se determina la actividad ATPasa por cuantificacin de fosfato liberado y se realizan los perfiles proteicos en electroforesis de SDSPAGE. RESULTADOS En primer lugar se ha analizado la actividad ATPasa a lo largo del crecimiento celular desde la fase exponencial inicial hasta bien entrada la fase estacionaria, as como los perfiles electroforticos de protenas, para determinar la fase de crecimiento idnea para estudiar los efectos de diferentes factores de estrs, siendo sta al final de la fase exponencial de crecimiento. Los resultados muestran la inhibicin de la actividad ATPasa en las diferentes condiciones de estrs estudiadas, especialmente en el caso del cido graso C12 (30% de inhibicin con 5 ppm de concentracin) y en presencia de sulfuroso (alrededor del 50% de inhibicin con concentraciones del 2.5-5% de SO2 en forma libre). Por otro lado, segn el perfil proteico, se observa la sobreexpresin de lagunas bandas de protenas en situaciones de estrs, especialmente una de 40 kDa en presencia de cobre, pH3 y SO2, e inhibicin de otras, especialmente en condiciones cidas. Estos resultados sugieren la posibilidad de caracterizar la protena asociada a la banda de 40 kDa mediante el estudio de su secuencia N-terminal, ya que su presencia es comn cuando las clulas se exponen a distintas condiciones de estrs. CONCLUSIONES As pues, podemos concluir que tanto la actividad ATPasa como la sntesis de protenas de estrs son buenos parmetros bioqumicos indicadores del estado del metabolismo celular.

.149.

FYM/3

ACTIVIDAD ENZIMTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE TAPONES DE CORCHO PARA VINOS

S.Centeno y M.A. Calvo Unidad de Microbiologa. Facultad de Veterinaria. Universidad Autnoma de Barcelona. INTRODUCCIN La actividad enzimtica de microorganismos presentes en substratos vegetales y en especial la produccin de enzimas celulolticas y lignolticas ejercen una accin degradativa sobre la clula vegetal, en este caso particular sobre las clulas que conforman los tapones de corcho para vinos. Estos metabolitos microbianos tambin pueden afectar a las caractersticas organolpticas de los vinos en contacto con ellos. OBJETIVO El objetivo del presente estudio es determinar la actividad enzimtica de hongos filamentosos, levaduras y bacterias aislados de tapones de corcho natural para vinos tranquilos y vinos espumosos. MATERIAL Y MTODOS Todos los microorganismos utilizados en este estudio fueron previamente aislados de tapones de corcho para vinos. A partir de cultivos jvenes de cada microorganismo y de forma individual, se realizaron suspensiones de conidios fngicos o de clulas de levaduras que se prepararon a la de concentracin de 106 UFC/ml y suspensiones de bacterias hasta alcanzar una densidad ptica equivalente al tubo N 6 de la escala de Mc Farland. Se determin la actividad enzimtica de estos microorganismos mediante el sistema API ZYM con el cual se pueden estudiar 19 actividades enzimticas simultneamente. RESULTADOS Y DISCUSIN Las enzimas producidas por todas las especies de hongos filamentosos y levaduras aislados fueron: Esterasa (C1), Esterasa lipasa y Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa. La actividad enzimtica de las bacterias aisladas, se caracteriz por una moderada produccin de Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa. Estas enzimas juegan un papel primordial en la degradacin de la celulosa, la lignina y otros compuestos que garantizan la integridad de las paredes de las clulas que conforman el tejido suberoso. Entre los hongos filamentosos investigados los que presentaron mayor actividad enzimtica fueron: Alternaria alternata, Aspergillus niger y Monilia sitophila. As mismo, entre las bacterias estudiadas fue Aeromonas sp la que present mayor actividad enzimtica.

.150.

FYM/4

CARACTERIZACIN DE LA RESPUESTA AL ESTRS POR FRO EN CEPAS DE LEVADURA DE PANADERA

1

Rodrguez-Vargas, S.1,2; Randez-Gil, F.2 y Estruch, F.1,2 Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad de Valencia, Dr. Moliner s/n, 46100-Burjassot (Valencia). 2 Departamento de Biotecnologa, Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (C.S.I.C.), Apdo. de Correos 73, 46100-Burjassot (Valencia).

Los hbitos alimenticios de la poblacin estn cambiando y con ellos las exigencias del consumidor. En el campo de la panificacin este hecho se ha traducido en un aumento de la demanda de productos listos para su uso. Como consecuencia, la produccin de masas congeladas para la elaboracin de productos de panadera y bollera ha experimentado un fuerte crecimiento. Sin embargo el auge y expansin de este sector productivo se ha visto en parte limitado por los problemas tecnolgicos derivados de la no disponibilidad de cepas de levadura de panadera tolerantes a la congelacin. La respuesta de S. cerevisiae frente a estreses como el choque trmico, alta osmolaridad o agentes oxidantes ha sido ampliamente estudiada. Sin embargo, la respuesta al estrs por fro ha recibido escasa atencin. Recientemente, utilizando la tcnica del Diferential Display hemos identificado genes inducidos en el proceso de congelacin y descongelacin en cepas industriales y de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae. Anlisis mediante Northern del nivel de transcrito presente en varias cepas industriales de panadera con diferente grado de criorresistencia, nos ha permitido establecer una correlacin entre el nivel de expresin de varios genes inducidos por fro y tolerancia a la congelacin. Caracterizacin mediante alineamiento y bsqueda de similaridades de secuencias de cidos nucleicos de los promotores de genes inducidos por fro indica tambin la existencia de zonas consenso. En conclusin, nuestros resultados sugieren que S. cerevisiae exhibe una respuesta especfica al estrs por fro. La identificacin de secuencias consenso en promotores de genes inducidos bajo esta situacin fisiolgica abre la va para identificar posibles factores transcripcionales implicados en su regulacin, y por tanto para disear estrategias para mejorar la criorresistencia de cepas industriales de panadera.

.151.

.152.

GENTICA MICROBIANA

.153.

.154.

GM/1

DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA LA GENERACIN DE BACTERIAS DEL CIDO LCTICO RECOMBINANTES DE GRADO ALIMENTARIO
1

Miguel A. Alvarez1 , M. Cruz Martn1 y Juan E. Surez1,2 Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC), Ctra. de Infiesto s/n. 33300-Villaviciosa, Asturias. 2 Area de Microbiologa, Universidad de Oviedo. C/ Julin Clavera s/n, 33006-Oviedo.

OBJETIVOS. Las bacterias del cido lctico se utilizan como iniciadores en la fermentacin industrial de alimentos. La mayora de sus propiedades tecnolgicas estn codificadas por plsmidos y son, por tanto, inestables (Hill, 1993, FEMS Microbiol. Rev. 12:87-108). Debido a esto, nos planteamos desarrollar un sistema que permita la estabilizacin de ADN en el genoma de bacterias lcticas y que pueda ser utilizado en fermentaciones cuyo producto final est destinado al consumo humano. MTODOS. Mediante tcnicas de Biologa Molecular se ha construido un vector de clonacin integrativo y un sistema de depuracin basados en una integrasa (Int) y una resolvasa () as como en sus respectivos sitios de reconocimiento (attP/attB y six). El vector de clonacin, pEM76, tiene un origen de replicacin de E. coli (pUC19) y varios genes de resistencia a antibiticos (Ap y Em) flanqueados por dos sitios six, un sitio de multiclonado para insertar el ADN a estabilizar y la regin int-attP del fago A2 (Alvarez et al., 1998, Virology 250:185-193). El sistema depurativo consiste en un plsmido, pEM94, con un origen de replicacin sensible a la temperatura (pG+host9) y portador del gen que codifica la resolvasa (Rojo y Alonso, 1994, J. Mol. Biol. 238:159-172). RESULTADOS. Se transform Lactobacillus casei ATCC 393 con el vector integrativo pEM76 el cual mediante recombinacin sitio-especfica se integr en el sitio attB presente en el genoma del hospedador. La cepa as obtenida se co-transform con el plsmido portador del gen que codifica la resolvasa . La expresin de este gen permiti eliminar todo el ADN de grado no alimentario comprendido entre los sitios six. El ltimo paso consisti en incubar esta cepa a temperatura no permisiva, con el fin de curar el plsmido depurativo, cuyo origen de replicacin es sensible a la temperatura. Todo los pasos del proceso fueron comprobados mediante PCR e hibridacin Southern. Para validar el mtodo se clon en el vector integrativo pEM76 el gen cI, que codifica el represor del fago A2 (Alvarez et al., 1999, J. Appl. Microbiol. 86:812-816) y se sigui todo el procedimiento previamente descrito obtenindose una cepa de L. casei de grado alimentario y completamente resistente a la infeccin fgica. Para determinar el valor tecnolgico de este resultado se comprob que la cepa obtenida era capaz de producir leche fermentada en presencia del fago A2 y que adems el fenotipo era totalmente estable. CONCLUSIONES. Se ha construido un nuevo sistema para la integracin estable de ADN en el cromosoma bacteriano y un sistema depurativo que permite la eliminacin del ADN heterlogo necesario para las manipulaciones genticas llevadas a cabo. El sistema se valid mediante la construccin de una cepa de L. casei completamente resistente a la infeccin por el fago A2 durante la fermentacin de leche.

.155.

GM/2 CARACTERIZACIN GENOTPICA Y FENOTPICA DE CEPAS SALVAJES DE Lactococcus lactis AISLADAS DE QUESOS ARTESANOS. Susana Delgado y Baltasar Mayo. Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC), Carretera de Infiesto s/n, 33300-Villaviciosa, Asturias. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS. El desarrollo de nuevos cultivos iniciadores con diferentes propiedades para la elaboracin de productos lcteos fermentados conlleva la identificacin y caracterizacin de las bacterias lcticas presentes en los productos elaborados con leche cruda sin la adicin de cultivos comerciales. El gnero Lactococcus es el ms importante en quesera, y desde el punto de vista de su utilizacin, las diferencias fenotpicas entre cepas son altamente significativas para la industria. Los objetivos de este estudio fueron evaluar la diversidad de cepas de lactococos salvajes aisladas de distintos quesos artesanos usando mtodos clsicos de identificacin fenotpica (perfiles de fermentacin de carbohidratos, supceptibilidad a antimicrobianos) junto con tcnicas moleculares de diferenciacin gentica (anlisis de restriccin de productos de amplificacin del rRNA 16S, estudio del polimorfismo genmico mediante RFLP y electroforesis en campo pulsado, perfil electrofortico de protenas totales mediante SDS-PAGE). RESULTADOS Y DISCUSIN. La metodologa del anlisis de restriccin del rRNA 16S permiti la identificacin de lactococos a nivel de subespecie y la diferenciacin de 4 grupos de restriccin distintos. Los diferentes perfiles genmicos y de protenas obtenidos se sometieron a un anlisis de taxonoma numrica en el que se utiliz el ndice de semejanza de Sokal y Micher (SSM) y la tcnica de agrupacin UPGMA. Se obtienen as dendogramas que evalan las relaciones filogenticas entre las cepas. Estos estudios permiten estimar la diversidad genotpica y fenotpica de cepas procedentes de quesos de distintos orgenes y establecer posibles relaciones filogenticas entre los aislados.

.156.

GM/3

DESARROLLO DE NUEVOS SISTEMAS DE PROTECCION DE BACTERIAS DEL ACIDO LACTICO FRENTE A LA INFECCION POR BACTERIOFAGOS

Mara Fernndez1 , Mnica Herrero2, Jose L. Caso2, Miguel A. Alvarez1 y Juan E. Surez1,2 .1Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC) Crta de Infiesto s/n 33300 Villaviciosa, Asturias. 2 Area de Microbiologa, Universidad de Oviedo C/ Julin Claveria s/n 33006 Oviedo.

OBJETIVOS El xito en las fermentaciones industriales de alimentos depende del desarrollo de los cultivos iniciadores. La infeccin por bacteriofagos provoca la lisis de las bacterias del cido lctico usadas como iniciadores, lo que puede llevar a la perdida del producto final, constituyendo un problema de gran repercusin econmica. El desarrollo de la biotecnologa durante los ltimos aos ofrece nuevas herramientas de proteccin frente a fagos. En este trabajo se pretende desarrollar mecanismos que provoquen la lisis de las clulas infectadas e impidan la liberacin de una nueva progiene viral abortando as la infeccin fgica. METODOS Se estn utilizando distintas tcnicas de biologa molecular que permitan la expresin controlada de distintos genes letales. Inicialmente se seleccionaron los genes del sistema ltico, lisina y holina, del bacteriofago temperado A2 (nmero de acceso AJ51790) y el gen que codifica la nucleasa cromosmica de Lactobacillus plantarum ATCC10241. Estos genes se clonaron bajo el control de promotores inducibles. RESULTADOS El anlisis del genoma del bacteriofago temperado A2 de Lactobacillus casei ha permitido identificar una regin que codifica las protenas que constituyen el sistema ltico. Los genes adyacentes del fago, hol que codifica una protena que presenta similitud con otras holina fagicas y lys que codifica una protena similar a las lisinas fagicas se clonaron tanto individualmente como formando el cassette holina-lisina bajo el control del promotor inducible nisA. De igual forma, se clon el gen lpnC que codifica la nucleasa cromosmica de L. plantarum. Utilizando el sistema NICE (nisin controlled expression) (de Ruyter et al., 1996. AEM 3662-3667), que permite la expresin de los genes bajo su control, se pretende conocer el papel de cada una de las protenas que constituyen el sistema ltico en la lisis celular. Tambin se est comprobando, si el sistema ltico de A2 y la nucleasa de L. plantarum, son capaces de promover la lisis celular, tras la induccin de los genes, de forma rpida y eficaz. Posteriormente se situarn los genes letales bajo el control de promotores que se activen cuando la clula sea infectada por el fago. En ausencia de infeccin, el gel letal se mantiene silencioso y la clula no sufre sus efectos, mientras que tras la infeccin viral su expresin provocara la muerte del hospedador antes de que el fago pueda propagarse.

.157.

GM/4

EL LOCUS RESPONSABLE DE LA PRODUCCIN DE PLANTARICINA S, UNA BACTERIOCINA PRODUCIDA POR Lactobacillus plantarum LPCO10, EST AMPLIAMENTE DISTRIBUDO ENTRE CEPAS DE Lactobacillus plantarum AISLADAS DE FERMENTACIONES DE ACEITUNAS
A. Maldonado, J.L. Ruiz Barba, B. Floriano y R. Jimnez Daz. Dpto. de Biotecnologa de Alimentos, Instituto de la Grasa (CSIC), Avda. Padre Garca Tejero, 4, Aptdo. 1078, 41012 Sevilla OBJETIVOS Estudiar si existe correlacin entre la presencia del locus responsable de la produccin de plantaricina S (plS, una bacteriocina cuya actividad depende de la accin complementaria de dos pptidos, denominados y ) en cepas de Lactobacillus plantarum aisladas de fermentaciones de aceitunas y la produccin por dichas cepas de ambos pptidos, y si sto les confera alguna ventaja ecolgica . MATERIALES Y MTODOS Se determin el perfil plasmdico de 68 cepas de L. plantarum aisladas de fermentaciones de aceitunas, en diferentes aos (entre 1986 y 1999) en Espaa y Portugal y -por PCR- la presencia de los genes estructurales de plS (plsA y plsB). La actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de cultivo de las 68 cepas se cuantific en placas de microtitulacin. Los ensayos de sensibilidad/resistencia a las bacteriocinas de las cepas productoras entre s se realizaron depositando 10 l de dichos sobrenadantes sobre un csped de cada una de ellas. La purificacin de bacteriocinas se llev a cabo mediante el mismo protocolo que la purificacin de plS. Por SDS-PAGE se estim la pureza de las muestras, comprobndose -adems- que dichas muestras puras presentaban actividad biolgica en los geles. La secuenciacin de las bacteriocinas purificadas se realiz por el mtodo descrito previamente. La organizacin del locus responsable de la produccin de plS en las cepas productoras de bacteriocinas se determin mediante Southern blot, utilizando para ellos dos sondas obtenidas por PCR y marcadas con fluorescena: 1) genes estructurales de plS (plsA, plsB y la regin intergnica), y 2) gen de la histidina kinasa (plsK). RESULTADOS De las 68 cepas ensayadas, 13 producan bacteriocinas cuyos espectros de actividad eran similares entre s y al de plS producida por L. plantarum LPCO10, siendo sensibles a las mismas las restantes 55 cepas no productoras. Cuando se ensay la actividad de dichas bacteriocinas frente a cada una de las cepas productoras, muchas de ellas resultaron ser sensibles a alguna (o varias) de esas bacteriocinas. Se comprob que la potencia de dichas bacteriocinas era diferente cuando se ensayaban frente a una misma cepa sensible (entre 1.280 y 10.240 UA/ml, segn la cepa productora). Utilizando colonias aisladas de L. plantarum LPCO10, plS semipurificada (intercambio inico, plScat), plS purificada (fase reversa, + no separados) y el pptido purificado (fase reversa), se comprob que la mayora de las 13 cepas productoras eran sensibles a las colonias aisladas de LPCO10, a plScat y a plS (+), pero todas resistentes al pptido . La purificacin de las bacteriocinas producidas por algunas de esas 13 cepas y su posterior secuenciacin demostr que producan un nico pptido idntico al pptido de plS. Dicho pptido no inhiba a ninguna de las cepas productoras, pero s a las no productoras y otras cepas indicadoras. Por otro lado, todas las cepas productoras presentaban los genes estructurales de plS, as como una organizacin similar en su ADN del locus de produccin de dicha bacteriocina en LPCO10. Finalmente, se comprob que el perfil plasmdico de las 68 cepas no se poda relacionar con la caracterstica fenotpica de produccin de bacteriocinas. CONCLUSIONES La produccin del pptido de plS confiere a las cepas productoras una ventaja ecolgica sobre las cepas no productoras en el nicho ecolgico de las fermentaciones de vegetales.

.158.

GM/5

CARACTERIZACION PRELIMINAR DE pEF1, UN PLASMIDO DE Enterococcus faecium 6T1a QUE CODIFICA ENTEROCINA I
Ruiz Barba, J.L., B. Floriano, A. Maldonado, y R. Jimnez Daz. Dpto. Biotecnologa de Alimentos, Instituto de la Grasa, C.S.I.C., Av. Padre Garca Tejero, 4, 41012 Sevilla. OBJETIVOS Se quiere caracterizar genticamente un plsmido de E. faecium 6T1a que codifica para la bacteriocina enterocina I, con el fin de conocer, por una parte, los mecanismos implicados en su produccin, inmunidad y regulacin, y, por otra, utilizar el propio plsmido como vector de grado alimentario. METODOS Una vez conocido el mapa de restriccin del plsmido de 23 kb pEF1, se clonaron por separado fragmentos del mismo en pUC18 y se secuenciaron utilizando, primeramente, los cebadores universales para M13. A medida que se iban conociendo nuevos trozos de secuencia del plsmido, se sintetizaron oligonucletidos especficos que fueron sirviendo sucesivamente como cebadores en nuevas reacciones de secuenciacin. Las ORFs que iban apareciendo se fueron analizando con el paquete de programas GCG, asignndose sus posibles funciones en razn de sus respectivas homologas con protenas conocidas registradas en las bases de datos GenBank y SwissProt. RESULTADOS De la manera descrita ms arriba hemos logrado secuenciar hasta la fecha un 85% del total estimado, permitindonos identificar un total de 47 ORFs que pudieran codificar para protenas mayores de 40 aminocidos. Al buscar homologas al nivel de protenas en las bases de datos disponibles, hemos podido adscribir hasta 27 de estas ORFs a genes y/o protenas descritas anteriormente. Basndonos en estos resultados, podemos distinguir en pEF1 tres regiones genticas bien diferenciadas si atendemos a su funcin potencial: i) produccin/inmunidad de/a enterocina I y otras bacteriocinas (9.3 kb); ii) resistencia a antibiticos y a luz UV (6.6 kb); y iii) funciones de replicacin (6.6 kb). Adems, estas tres regiones aparecen separadas por secuencias que presentan gran homologa con genes relacionados con distintos elementos de insercin, como transposasas y elementos IS. Este hecho podra indicar que algunas de estas regiones fueran el resultado de un evento de transferencia ancestral desde una fuente exgena hacia pEF1. La regin de mayor inters para nosotros es la bacteriocinognica, flanqueada por dos elementos IS (IS904 y tnpR) y con un total de 22 ORFs. Entre stas hemos identificado los genes que codifican o estn relacionados con enterocina I (denominada tambin como enterocina L50 por otros autores) (entI y entJ, o entL50A y entL50B) y AS48, as como el transporte (tipo ABC) y la regulacin (histidina kinasas y protenas accesorias). CONCLUSIONES El conocimiento de la secuencia de ADN del plsmido pEF1 nos est permitiendo estudiar con ms detalle la organizacin, funcionamiento y regulacin de los operones de bacteriocinas de bacterias del cido lctico. Esta informacin la utilizaremos para tratar de expresar algunas bacteriocinas en hospedadores heterlogos de nuestro inters, tal como Lactobacillus plantarum. Asmismo, tambin nos va a permitir establecer el replicn mnimo de pEF1, de tal manera que podamos construir con l un vector de grado alimentario, utilizando como gen marcador el propio gen de immunidad para enterocina I.

.159.

GM/6

SECUENCIA Y ANLISIS DEL PLSMIDO BACTERIOCINOGNICO pBL1 DE Lactococcus lactis IPLA 972.
Claudia Snchez, Alma Hernndez de Rojas, Beatriz Martnez, Ana Rodrguez, y Baltasar Mayo. Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC), Carretera de Infiesto s/n, 33300-Villaviciosa, Asturias. OBJETIVOS Numerosas cepas de lactococos contienen varios plsmidos con un tamao molecular entre 2 y 70-80 kb. Asociadas a estos plsmidos, total o parcialmente, se encuentran caractersticas importantes para su aplicacin industrial como la utilizacin de la lactosa, la actividad proteinsica extracelular, el metabolismo del citrato, la resistencia a bacterifagos, la produccin de bacteriocinas y exopolisacridos, etc. La cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA 972 produce una bacteriocina activa frente a otros lactococos (lactococina 972) que est codificada en un plsmido de 10,9 kb denomidado pBL1. Las caractersticas bioqumicas y genticas de la lactococina 972 han sido estudiadas en detalle con anterioridad (Martnez et al., 1996; Martnez et al., 1999). En esta comunicacin presentamos la secuencia nucleotdica completa de pBL1 y el anlisis de la misma. RESULTADOS Y DISCUSIN Se han encontrado 13 pautas abiertas de lectura (ORFs), cinco de las cuales estn incompletas. El plsmido parece organizado en dos unidades funcionales: la regin de replicacin y la regin codificadora de la bacteriocina y la resistencia a la misma. Ambas regiones estn flanqueadas por secuencias de insercin. Ha aparecido una copia completa de la secuencia de insercin ISS1 y restos de otras tres copias de la misma o de secuencias relacionadas. La regin de la bacteriocina parece estar formada por tres ORFs organizadas en un opern. Las dos primeras ya se haba demostrado que se transcriban de forma conjunta (Martnez et al., 1999). La organizacin estructural de la regin de replicacin es similar a la de otros plsmidos de lactococos bien estudiados (pWV02, pNZ4000, etc.), tanto en lo que se refiere a las secuencias codificadoras (repB, OrfX) como a las no codificadoras (origen de replicacin). El plsmido tiene un rango de husped reducido y no replica en Bacillus subtilis ni en varias especies de Lactobacillus. El producto de OrfX, como sucede en otros plsmidos, no es necesario para la replicacin aunque est involucrado en su estabilidad. Por encima de la regin de replicacin se ha encontrado un sitio oriT funcional que participa en la movilizacin de las construcciones que lo incluyen.
REFERENCIAS
Martnez, B., J. E. Surez, and A. Rodrguez. 1996. Lactococcin 972: a homodimeric lactococcal bacteriocin whose primary target is not the plasma membrane. Microbiology 142:2393-2398. Martnez, B., M. Fernndez, J. E. Surez, and A. Rodrguez. 1999. Synthesis of lactococcin 972, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis IPLA 972, depends on the expression of a plasmid encoded bicistronic operon. Microbiology 145:3155-3161.

.160.

GM/7

CARACTERIZACIN GENTICA DE LEVADURAS VINICAS POR TGGE

J. beda, S. Hernangmez, J.C. Espinosa. Dpto. Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas, Univ. de Castilla La Mancha, Avda. Camilo Jos Cela s/n, 13071 Ciudad Real. OBJETIVOS Las levaduras son bien conocidas por sus actividades beneficiosas en la produccin de bebidas alcohlicas y otros productos fermentados, no obstante, algunas son perjudiciales causando prdidas econmicas. En uno u otro caso, su identificacin inter e intraespecfica es de gran inters para la industria de alimentos. El objetivo de este trabajo es la caracterizacin gentica de 74 cepas de levaduras mediante electroforesis en gradiente de temperatura (TGGE) de la regin 18S rDNA amplificada por PCR. Los fragmentos de DNA de la misma longitud y diferente secuencia se separan en geles de poliacrilamida por TGGE debido a su diferente movilidad electrofortica al ser parcialmente desnaturalizados en un gradiente lineal de temperatura. A igual tamao entre dos fragmentos, la migracin depende de la proporcin G+C y de la secuencia nucleotdica. Si las bandas de dos cepas exhiban la misma movilidad, se investigaba la formacin de los heteroduplex generados durante la reaccin de amplificacin conjunta del DNA. MTODOS Las cepas de levadura analizadas provenan de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT) y son tpicas de ecosistemas vnicos. Se amplific la regin 18S rRNA del DNA con los primers YUNIV1, rico en bases G+C para aumentar la sensibilidad del anlisis, y YUNIV3. La mezcla de reaccin fue calentada a 95C durante 5 min., seguido de 35 ciclos de amplificacin (1 min. a 95C; 1.5 min. a 52C y 2 min. a 72C) y una extensin final de 7 min. a 72C. Para llevar a cabo la TGGE, se emple un gel de poliacrilamida (8%) adicionado con urea (6M). Las condiciones elctricas fueron: 130 V durante 3 hr., y el gradiente de temperatura vari de 62 a 65 0C. RESULTADOS La amplificacin de la regin 18S rDNA de las 74 cepas dio lugar a fragmentos de igual tamao (aprox. 240pb). Al aplicar la TGGE, los resultados fueron variados oscilando entre el obtenido para las 4 especies de Pichia con una banda en la misma posicin, por lo que hubo que efectuar un anlisis posterior de heteroduplex, pasando por Kluyveromyces, en donde se apreciaron dos seales diferentes correspondientes a las 8 cepas de K. marxianus y K. thermotolerans, hasta llegar a Saccharomycodes ludwigii, en donde se logr una buena caracterizacin intraespecfica. Mediante un anlisis de heteroduplex, cuando los amplificados de igual tamao correspondientes a dos cepas distintas se desnaturalizan y a continuacin rehibridan, se obtienen tres bandas: una correspondiente a los dos homoduplex superpuestos y las otras dos a los heteroduplex formados, aprecindose una sola banda si la homologa es total. Este anlisis aplicado a Dekkera anomala y D. bruxelensis, ofreci dos bandas de intensidad baja y de poca migracin correspondientes a los heteroduplex y otra nica muy marcada. En algn caso, D. bruxelensis y K. thermotolerans, se visualizaron solo dos bandas: correspondiendo a los homo y heteroduplex superpuestos. Pichia fermentans y P. membranifaciens, se podran considerar como especie nica ya que se visualiz una sola seal. CONCLUSIONES El anlisis mediante TGGE, permite una discriminacin aceptable de levaduras vnicas a nivel de gnero en un periodo de tiempo razonable, por lo que es til para estudiar la biodiversidad en ambientes vnicos. En estudios taxonmicos, la discriminacin inter e intraespecfica no es fcil debido a la movilidad similar de los fragmentos, por lo que se requiere un anlisis de heteroduplex cuyos resultados ofrecen informacin valiosa para una posible reclasificacin de especies.

.161.

.162.

MICROORGANISMOS ALTERANTES

.163.

.164.

MA/1

CARACTERIZACION MOLECULAR DEL GENERO Pichia

1

Belloch, C.1 , Villa, M.1, Uruburu, F.1, Querol, A.2 CECT, Universitat de Valencia, 46100 Burjassot, Valncia. 2 IATA-CSIC, Apartado de Correos, 73, Burjassot, Valncia.

Las actividades beneficiosas de las levaduras son de gran importancia econmica y prueba de ello es el uso que se les ha dado durante milenios en la produccin de alimentos fermentados y bebidas alcohlicas (Deak y Beuchat, 1996). Sin embargo, estas levaduras tambin pueden causar tremendas prdidas econmicas, y algunas de sus actividades incluyen el deterioro de alimentos variados. Consecuentemente, la identificacin rpida, fcil y fiable de las especies de levaduras involucradas en el deterioro de alimentos es de gran importancia econmica (Carlie y Watkinson, 1994). Entre los gneros de levaduras de importancia como alterantes de alimentos est el gnero Pichia. Algunas de las especies ms relevantes son contaminantes habituales de procesos de fermentacin en plantas piloto, algunas han sido aisladas de frutas y zumos, conservas vegetales, mantequilla y queso, bebidas refrescantes y vino, entre otros. El gnero Pichia en la descripcin propuesta por Kurtzman y Fell (1998) incluye hasta 91 especies, siendo uno de los gneros ms complejos y heterogneos. Estas especies se han diferenciado atendiendo principalmente a sus caractersticas morfolgicas y fisiolgicas, sin embargo, debido a la gran variabilidad observada en estas caractersticas, no resulta fcil la identificacin de nuevos aislados. La dificultad en la identificacin de las levaduras pertenecientes al gnero Pichia ha ocasionado que se empiecen a utilizar nuevas tcnicas moleculares, que han permitido tanto la diferenciacin de especies, como la de cepas dentro de una especie. El presente trabajo tiene dos objetivos: por una parte, la diferenciacin de las especies del gnero Pichia, y por otra, la caracterizacin molecular de varias cepas de la especie Pichia anomala. Para diferenciar las especies del gnero Pichia se amplific por PCR la regin del complejo ribosomico que incluye las secuencias internas transcritas, ITS1 e ITS2 y el gen 5.8S rRNA (ITS-5.85 rRNA). Posteriormente, se procedi a la digestin del producto de amplificacin con las endonucleasas de restriccin Cfo I, Hae III y Hinf I. Tras un anlisis comparativo de los distintos patrones, el resultado obtenido revela diferencias entre las especies. La diferenciacin de las cepas de la especie Pichia anomala se ha realizado mediante el estudio de los RFLPs del DNA mitocondrial y del perfil cromosmico.

.165.

MA/2 ESTUDIO DEL ESTADO DE SALUD DE LAS UVAS Y DESARROLLO DE Botrytis cinerea EN ESTOS FRUTOS E. Bermejo, N. Luna, A.Snchez, J.L.Gonzlez y M. Dorado. Lab. Cayacea, S.A. OBJETIVOS Se estudia el desarrollo del hongo Botrytis cinerea en las superficies de uvas infectadas evalundose bajo condiciones controladas de temperatura y humedad. Se determina la cantidad de contaminacin que presenta a lo largo del crecimiento del hongo, as como el estado de salud de los frutos. Ya que conociendo el desarrollo de los microorganismos implicados se podran paliar las prdidas econmicas que causan. MTODOS Se crece en placas de patata dextrosa agar Botrytis cinerea 2100 perteneciente a la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo. Se incuba a 24C con elevada humedad y fotoperodo de 14 horas. Se realiza una suspensin de esporas hasta obtener una concentracin final 1x103 conidios ml-1. Se inoculan 5 ml por uva en un tampn de infeccin (0,11M glucosa, 67mM KH2 PO4 ). Las uvas se esterilizan antes de la inoculacin. En cada uva se realiza de forma asptica una pequea incisin con una aguja enmangada. Cada incisin se inocula slo con tampn en el GRUPO CONTROL, y tampn con conidios en el GRUPO INFECTADO. Posteriormente se incuban las uvas separadas unas de otras y a 15-23C, 80-85% de humedad relativa. Se examina el estado de las uvas durante el tiempo de incubacin, analizando los microorganimos viables totales. A partir de diluciones decimales y de la suspensin inicial se inoculan placas con distintos medios de cultivo(PCA, SDA, PDA) para contar el nmero de bacterias y hongos que se desarrollan. Se identifican algunos de ellos. RESULTADOS A partir del da 3 el crecimiento de Botrytis cinerea se visualiza como un poco de micelio blanco. En general el nmero de microoganismos aislados en este da es inferior a las 10 unidades formadoras de colonias/gramo de uva (ufc/g), en los dos grupos, control e infectado. El color de las uvas comienza a ser marrn claro en la zona del inculo, debido a la lesin originada. En el grupo infectado se desarrolla micelio areo y se incrementa la esporulacin desde el da 3 al 7, apareciendo las lesiones tpicas de Botrytis. El oscurecimiento de las uvas en general es progresivo. En los ltimos das del experimento se observa que el tamao de la lesin es superior al 50% de la uva. Y en algunas uvas el micelio y los conidioforos de Botrytis cinerea aparecien por encima de las clulas epidrmicas, llegando el micelio a colapsar la incisin realizada para la inoculacin. El nmero de microorganismos tiende a incrementarse con la edad de la lesin. El grupo infectado y no infectado en general muestra que el tejido de las uvas se va volviendo blando al tacto, pierde turgencia, y la piel se arruga durante el tiempo de incubacin. Otros microorganismos diferentes al inoculado se desarrollan en los dos grupos control e infectados. CONCLUSIONES Ocurre el deterioro de las uvas por el desarrollo de Botrytis y de otros microorganismos. Existe una correlacin entre los microorganismos viables contados y el deterioro con el incremento del tiempo de incubacin. El da 7 las lesiones muestran unos pocos conidiforos y la apariencia de las uvas es inaceptable para comrselas. Los microorganismos que causan el deterioro de las uvas pueden ser levaduras, bacterias y hongos imperfectos tales como Penicillium, Aspergillus, y Alternaria.

.166.

MA/3

EVOLUCION ESTACIONAL DE DIFERENTES GRUPOS MICROBIANOS ALTERANTES Y DE INTERES TECNOLOGICO EN LECHE DE OVEJA
V. M. Fernndez-Barata, S. Sanjun, M. L. Garca-Lpez, B. Moreno y M. R. Garca-Armesto. Departamento de Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. Campus Universitario s/n, 24071 Len. OBJETIVOS Investigar la evolucin estacional, en leche de oveja, de la flora aerobia mesfila viable y de determinados grupos microbianos alterantes (psicrotrofos, Pseudomonas spp., flora esporulada anaerobia) y de inters tecnolgico (flora acido-lctica, lactococos, lactobacilos y enterococos). METODOS Se tomaron mensualmente muestras de leche de oveja de silo en 4 industrias de la provincia de Len. En cada muestra de leche se realizaron las siguientes determinaciones: flora aerobia mesfila viable (1991, FIL, 100 B), psicrotrofos (APHA, 1993, Stand. Meth. Exam. of Dairy Prod.), Pseudomonas spp. (Mead G.C. and Adams B.W., 1977, B.R. Poult. Sci., 18, 661-667), flora esporulada anaerobia (Bergre, J.L. and Sivel, S., 1990, Bulletin of IDF, (251), 18-23), bacterias acido-lcticas y lactobacilos (Reuter, G., 1985, Int. J. Food Microbiol., 2, 5568), lactococos (Sharpe, 1978, en Streptococci, S.A.B., Symp. Series n 7, Academic Press), enterococos (Mossel et al, 1995, Essentials of the Microbiology of Foods, John Wiley & Sons); acidez titulable y pH (APHA, 1993, Stand. Meth. Exam. Dairy Prod.). RESULTADOS Se detectaron diferencias apreciables en los recuentos de flora aerobia mesfila viable, psicrotrofa y cido-lctica en leche de oveja dependiendo de la estacin del ao: los recuentos medios ms altos se obtuvieron en otoo (711, 645 y 645 log ufc/ml, respectivamente) y los ms bajos en primavera (626, 561 y 599 log ufc/ml respectivamente). Por lo que respecta al recuento de Pseudomonas spp. y flora esporulada anaerobia los valores ms altos se obtuvieron en invierno (543 log ufc/ml) y en verano (343 log NMP/100ml) respectivamente, mientras que los ms bajos se obtuvieron en ambos casos en primavera (444 y 242 log NMP/100 ml). Los recuentos ms bajos de lactobacilos y lactococos correspondieron a los meses de verano (399 y 564 log ufc/ml); mientras que en verano y en otoo se obtuvieron los recuentos ms altos de enterococos (aprox. 400 log ufc/ml). Por ltimo, los valores ms altos de acidez titulable (024 % de cido lctico) y ms bajos de pH (650) se obtuvieron tambin en los meses de otoo. En conjunto, slo un 13% de las muestras estudiadas, cumplan los requisitos microbiolgicos de flora mesofila exigidos para la leche de oveja destinada a la elaboracin de productos a base de leche cruda; y slo un 26% los exigidos para leche de oveja destinada a la elaboracin de productos tratados por el calor (R.D. 1679/1994). CONCLUSIONES En general, se aprecia una clara mejora de la calidad microbiolgica de la leche de oveja durante los meses de primavera, obtenindose en este periodo recuentos ms bajos de flora aerobia mesfila, psicrotrofa, cido-lctica, Pseudomonas spp. y flora esporulada anaerobia. Por el contrario, en los meses de octubre, noviembre y diciembre se obtuvo la leche con mayores recuentos de flora aerobia mesfila viable, psicrotrofa, cido-lctica y enterococos. Un descenso en la produccin de leche de oveja durante el otoo, unida a deficiencias en las prcticas de recogida de la leche (mayor tiempo de permanencia en tanque) pueden haber contribuido a estos resultados.

.167.

MA/4

IDENTIFICACIN DEL AGREGADO ASPERGILLUS NIGER POR TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

1

Lopez-Ocaa, L., 2Bueno, L., 1Lpez-Coronado, J.M. and 1Garca-Lpez, M.D. 1 Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universidad de Valencia. Edificio de Investigacin. 46100 Burjassot. Valencia. Espaa. 2 Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA). Va. Blanca 804. Esq. Ctra. Central. 46026 La Habana. Cuba. Fax.: (537) 338236. E-mail: icidca@ceniai.inf.cu

El gnero fngico Aspergillus se encuentra distribuido por prcticamente cualquier tipo de ambiente en todo el mundo. Especialmente importantes dentro de este gnero son los llamados aspergillus negros (gnero Aspergillus, Seccin Nigri) (Raper & Fennell, 1995, Gams et al., 1985). Muchas especies pertenecientes a este grupo son causantes del deterioro en algunos alimentos, y su capacidad para producir metabolitos como cidos orgnicos y enzimas extracelulares los hace muy interesantes para la industria alimenticia. Tambin son buenos candidatos para la manipulacin gentica en las industrias biotecnolgicas, puesto que A. niger ha sido designado con el estatus de GRAS (generalmente reconocido como seguro). Las caractersticas fenotpicas tales como el color, forma, tamao y ornamentacin de los conidios y la longitud del conidiforo se han utilizado histricamente, y an se siguen utilizando para su clasificacin. Sin embargo, el fenotipo de una cepa fngica puede variar considerablemente dependiendo de las condiciones de crecimiento (Samson, 1994). La utilizacin de tcnicas moleculares, rpidas, fiables y repetitivas, as como su aplicacin en la identificacin de nuevos aislados se ha convertido en uno de los objetivos de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, ya que a veces resultan necesarios para confirmar los resultados morfolgicos. En este trabajo identificamos aislados pertenecientes al gnero Aspergillus mediante estudios morfolgicos y tambin utilizando RFLPs del DNA mitocondrial y PCR-RFLP, ribotipando por amplificacin y restriccin de la regin ITS-5,8S rDNA.

.168.

MA/5

PERFILES DE ALTERACIN EN CONSERVAS VEGETALES. CAUSAS Y ACCIONES CORRECTORAS PROPUESTAS

J. Prez de Juan, M. Lana, C. Gonzlez, M. Lumbreras y J.I. Jauregui Centro Tcnico Nacional de Conservas Vegetales Laboratorio del Ebro C/ Santa Gema 56 Apdo. 21, 31570 SAN ADRIN (Navarra) ctncv@ctnv.es INTRODUCCIN Segn la Reglamentacin Tcnico - Sanitaria para la elaboracin y venta de conservas vegetales, se definen las conservas vegetales como Alimentos elaborados a base de productos de origen vegetal, con o sin adicin de otras sustancias alimenticias y alimentarias permitidas, sometidos a tratamientos autorizados que garanticen su conservacin y contenidos en envases apropiados. No obstante, se puede dar el caso de conservas que no sean microbiolgicamente estables por diversas causas: tratamiento trmico insuficiente, existencia de microfugas en el envase, retenciones de producto en caliente o alteraciones previas a la esterilizacin. OBJETIVOS Analizar conservas vegetales alteradas, de modo que identificando los grupos microbiolgicos alterantes, poder indicar la causa de la alteracin y, de este modo, recomendar las acciones correctoras pertinentes a la empresa fabricante. MTODOS Anlisis de alteracin de conservas (analizando un nmero suficiente de envases segn los disponibles) determinando: mesfilos y termfilos aerobios (caldo glucosa-prpura bromocresol, 48-96 h de incubacin a 37C y 55C respectivamente); mesfilos y termfilos anaerobios (caldo de hgado y 48-96 h de incubacin en anaerobiosis a 37C y 55C respectivamente). En paralelo se realizaron, pruebas de termorresistencia (10 minutos a 100C y 80C en conservas de pH>4,6 y pH<4,6, respectivamente). En conservas de pH< 4,6, se incluy anlisis de lactobacilos (caldo MRS y 48 h de incubacin a 37C) y de mohos y levaduras (medio glucosa sabouraud-cloranfenicol e incubacin durante 5 das a 22C). Asmismo, se registraron el estado del envase, pH, caractersticas del producto alterado y la flora microbiolgica observada al microscopio. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Los perfiles de alteracin observados y las acciones correctoras propuestas son los siguientes: - Alteracin debida a causas no microbiolgicas (formacin de H 2 por reaccin entre el producto y el envase): 2 envases de conserva de pimiento abombada con ausencia de flora microbiolgica y caractersticas del producto normales. Barniz del interior del envase levantado y alta concentracin de hierro y estao en el producto obtener suministro de envases con mejor recubrimiento de barniz. - Alteracin por tratamiento trmico insuficiente: 6 envases de conserva de naranja abombada, con mesfilos termorresistentes aerobios y anaerobios, y lactobacilos. Realizacin de curva de penetracin de calor que demostr tratamiento trmico insuficiente aumentar esterilizacin. - Alteracin por fugas: 2 envases de conservas de champin abombado, con flora mesfila aerobia y anaerobia no termorresistente. Realizados anlisis de cierres que mostraron valores inferiores a los recomendados revisar y ajustar la cerradora. - Alteracin por retencin de producto en caliente: 1 envase de conserva de esprrago abombada en la que slo se detect flora termfila evitar retenciones de producto en caliente, revisar lavado del producto y limpieza del escaldador. - Alteracin previa a la esterilizacin: 6 frascos de conserva de carne de pimiento con ausencia de crecimiento microbiolgico, pero elevada flora microbiolgica observada en tincin directa , aspecto gasificado del producto y olor no tpico esterilizar el producto envasado con menos de 90 minutos de retraso y evitar retenciones del producto durante su elaboracin.

.169.

MA/6

OPTIMIZACIN DE UN MTODO RPIDO DE CONCENTRACIN DE ZYGOSACCHAROMYCES ROUXII EN ALIMENTOS LQUIDOS

B. Prez-Villarreal y B. Alfaro. AZTI. Instituto Tecnolgico Pesquero y Alimentario. Isla de Txatxarramendi s/n. 48395-Sukarrieta .Vizcaya. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS La levadura Zygosaccharomyces rouxii es uno de los principales microorganismos alterantes presentes en alimentos con baja actividad de agua y alta concentracin de azcar tales como zumos de frutas, concentrados y cremogenados. En el presente estudio se puso a punto un mtodo rpido para la separacin y concentracin de Zygosaccharomyces rouxii de muestras inoculadas de leche de soja, pur de fresa y sirope de grosella basado en la centrifugacin por gradientes.Los objetivos del trabajo fueron la determinacin de la densidad flotante de Zygosaccharomyces rouxii y de los alimentos mencionados para determinar si era posible su separacin. MTODOS La cepa Zygosaccharomyces rouxii CECT N 1230 empleada en este estudio fue obtenida de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT).Las densidades de flotacin de Zygosaccharomyces rouxii y de las muestras de alimentos fueron determinadas mediante la centrifugacin en gradientes de densidad generados por un medio isotnico estndar de BactXtractor TM (QRAB, Uppsala, Suecia).Este mtodo implic colocar el homogenado del alimento en tubos Eppendorf sobre BacXtractor y centrifugar. Despus de la centrifugacin el homogenado del alimento permaneci en la parte superior del tubo, separado de las levaduras las cuales se concentraron por debajo de la capa ligera del BacXtractor. RESULTADOS La densidad flotante de Zygosaccharomyces rouxii y de los tres productos alimentarios, leche de avena, pur de fresa y sirope de grosella se determin mediante las curvas de calibrado realizadas con marcadores coloreados de densidad (Pharmacia Biotech, Suecia).Los resultados indicaron que la densidad de flotacin de Zygosaccharomyces rouxii fue >1.108 gr.ml-1 y la de los tres productos alimentarios < 1.092 gr.ml-1 en las condiciones de trabajo expuestas y con el medio generador de gradientes BactXtractor TM, por lo que fue posible su separacin debido a sus diferentes densidades de flotacin. Los recuentos obtenidos en placa sealaron altos porcentajes de recuperacin, lo cual demuestra que las levaduras se concentraron en la parte inferior del tubo de centrifuga. CONCLUSIONES El presente mtodo presenta la ventaja de no ser especifico por lo es posible aplicarlo a otras combinaciones de levaduras, bacterias y alimentos siempre y cuando se determinen las concentraciones de BactXtractorTM as como las condiciones ptimas de centrifugacin. Por otro lado, este mtodo de preparacin de muestras permite la combinacin con mtodos rpidos de deteccin de microorganismos patgenos y alterantes presentes en los alimentos.

.170.

MA/7

EFECTO DE LA COMPETICIN FNGICA EN LA COLONIZACIN DE GRANOS DE MAZ POR Fusarium moniliforme, F. proliferatum Y F. graminearum Y EN LA PRODUCCIN DE FUMONISINA B1 Y DE ZEARALENONA
A. Velluti, S. Marn, L. Bettucci, A. J. Ramos, V. Sanchis. Dpto. de Tecnologa de Alimentos. Univ. de Lleida. CeRTA. Av. Rovira Roure 177, 25198 Lleida. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es evaluar, bajo diferentes condiciones de laboratorio, el efecto de la interaccin en el crecimiento y la produccin de toxinas entre cepas productoras de fumonisinas de Fusarium moniliforme o de F. proliferatum y una cepa de F. graminearum productora de zearalenona (ZEA). MTODOS Los estudios se realizaron inoculando las cepas en granos de maz irradiados con diferentes aw (0.98, 0.95, 0.93) e incubados a diferentes temperaturas (15 y 25C), durante 4 semanas. Luego de este perodo, se analizaron las unidades formadoras de colonias (UFCs) y las toxinas, fumonisinas B1 (FB1) y zearalenona (ZEA). La cuantificacin de FB1 se realiz por HPLC segn una modificacin del mtodo de Shephard et al.(1990) y para la cuantificacin de ZEA se sigui el mtodo de la AOAC (AOAC, 1997). RESULTADOS Todos los factores simples, aw, temperatura y presencia de F. graminearum afectaron significativamente las UFCs de F. moniliforme y de F. proliferatum. Se observaron ms UFCs a 25C que a 15C y ms a 0.98 que a 0.95 y 0.93 de aw. En presencia de F. graminearum se observ una reduccin significativa en las UFCs de F. moniliforme y de F. proliferatum bajo todas las condiciones analizadas. Las UFCs de F. graminearum fueron afectadas significativamente por la aw, la temperatura y por la presencia de F. moniliforme y de F. proliferatum. Se observaron ms UFCs a 25C que a 15C y ms a 0.98 que a 0.95 y 0.93 de aw. En presencia de F. moniliforme, las UFCs de F. graminearum fueron significativamente reducidas a 15 y a 25C, mientras que en presencia de F. proliferatum las UFCs de F. graminearum mostraron una disminucin significativa a 25C. La produccin de FB1 por F. proliferatum fue afectada significativamente por todos los factores, observndose una mayor produccin a 15C que a 25C y a 0.98 que a 0.95 y a 0.93 aw. En presencia de F. graminearum se observ una reduccin en la produccin de esta toxina, siendo esta inhibicin mayor a 15C que a 25C y a 0.98 mayor que a 0.95 y a 0.93 de aw. La produccin de FB1 por F. moniliforme fue afectada significativamente por la aw y por la presencia de F. graminearum. La produccin se increment con el aumento de la aw de los granos y en presencia de F. graminearum se observ una inhibicin en la produccin de esta toxina a 15C, mientras que a 25C la produccin fue potenciada significativamente principalmente a 0.95 y a 0.98 de aw. La produccin de ZEA por F. graminearum fue mayor a 15C que a 25C y mayor a 0.98 que a 0.95 y 0.93 de aw, pero ni la presencia de F. moniliforme ni la de F. proliferatum afect significativamente a esta produccin. CONCLUSIONES Nuestros resultados sugieren que cuando las condiciones ambientales en los granos de maz son favorables y cepas potencialmente productoras de toxinas de F. proliferatum y de F. graminearum coexisten, podra esperarse una disminucin en la concentracin de FB 1 pero la produccin de ZEA permanecera sin ser afectada. En cambio, si coexistieran F. moniliforme y F. graminearum, la produccin de FB1 podra ser potenciada en ciertas condiciones, mientras que no se esperaran cambios en la concentracin de ZEA.

.171.

.172.

MICROORGANISMOS DE INTERS SANITARIO

.173.

.174.

MIS/1

EVALUACIN DEL SISTEMA ISO-GRID PARA LA DETERMINACIN DE Escherichia coli A PARTIR DE ALIMENTOS
C. Alonso-Calleja, R.M. Capita, R. Rodrguez-Prez, M.C. Garca Fernndez y B. Moreno. Departamento de Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. Campus Universitario de Vegazana, s/n. 24071-Len. E-mail: dhtac@unileon.es OBJETIVO El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la eficacia del carcter diferencial del medio Buffered MUG (4-metil-umbeliferil--D-glucurnido) Agar (BMA), empleado en la tcnica ISO-GRIDTM para el aislamiento de E. coli a partir de carne de pollo. MTODOS Para el estudio se utilizaron 40 canales de pollo evisceradas y refrigeradas adquiridas en polleras y supermercados de la ciudad de Len. El aislamiento de E. coli se llev a cabo mediante la tcnica de filtracin a travs de membrana con rejilla hidrofbica (ISO-GRIDTM Annimo, 1989-). Las membranas, una vez transferidas a las placas de BMA e incubadas 2 horas a 35C, eran observadas bajo una lmpara de luz ultravioleta a 365 nm, considerando presuntas E. coli aquellas colonias fluorescentes de tonalidad azul (por accin del enzima -Dglucuronidasa). A partir de cada una de las cuarenta canales estudiadas se aislaron cuatro colonias con estas caractersticas para su posterior identificacin. Todas las cepas aisladas se agruparon en perfiles bioqumicos atendiendo a los resultados de las siguientes pruebas de caracterizacin: tincin por el mtodo Gram, actividad catalasa, actividad citocromo oxidasa, oxidacin/fermentacin de la glucosa, movilidad, caractersticas de crecimiento en los medios SIM, TSI y LIA, utilizacin del citrato, desaminacin de la fenilalanina, reduccin de nitratos a nitritos, pruebas del rojo de metilo y de Voges-Proskauer, produccin de ureasa, descarboxilacin de ornitina, lisina y arginina, actividad -galactosidasa y crecimiento y produccin de gas en medio EC a 44.5C. La identificacin se llev a cabo siguiendo los esquemas de clasificacin de Brenner (1984) y Ewing (1986). Adems, para confirmar la identificacin, una cepa de cada perfil se someti a identificacin con el sistema miniaturizado API 20E (bioMrieux). RESULTADOS De las 160 cepas aisladas, 142 (88.75%) se correspondieron con la especie E. coli. Las 18 cepas restantes (11.25%) se adscribieron a otras especies bacterianas y fueron consideradas falsos positivos: 12 (7.5%) Salmonella arizonae, 4 (2.5%) Hafnia alvei y 2 (1.25%) Klebsiella ozaenae. Este porcentaje de falsos positivos es superior a la media de los encontrados en la bibliografa, si bien en todos los trabajos llevados a cabo por otros autores para comprobar la especificidad del enzima -glucuronidasa se pone de manifiesto que hay cepas de otros microorganismos (fundamentalmente Salmonella y Shigella) capaces de sintetizarlo. CONCLUSIN El sistema diferencial en que se basa el aislamiento de E. coli con el mtodo ISO-GRID (hidrlisis del MUG por accin del enzima -D-glucuronidasa y aparicin consiguiente de fluorescencia azulada bajo la luz ultravioleta a 365 nm) no es totalmente eficaz para la deteccin de esta especie microbiana a partir de carne de pollo, por la existencia de un porcentaje relativamente elevado de falsos positivos.
BIBLIOGRAFA
Annimo (1989). Iso-GridTM Methods Manual. Toronto. Brenner, D.J. (1984). Enterobacteriaceae. En: "Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol I", pp. 408-420. Eds. N.R. Krieg y J. G. Holt. Williams and Wilkins, Baltimore. Ewing, W. H. (1986). Edwards and Ewing's identification of Enterobacteriaceae. 4 ed. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York.

.175.

MIS/2

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE ESPECIES DE Aeromonas EN LECHE CRUDA.

Cermeo, L.; Pea, A.; Araque, J. y Andueza, F. Lab. de Microbiologa de los Alimentos. Dpto. de Microbiologa. Fac. de Farmacia. Universidad de los Andes. Sector Campo de Oro. Mrida. Venezuela. OBJETIVOS Considerando la ubicuidad del gnero Aeromonas en el medio ambiente y su importancia como patgeno emergente transmitido por los alimentos, se realiz el presente trabajo para conocer la incidencia de este grupo bacteriano en muestras de leche cruda producida en el Estado Mrida, Venezuela. MTODOS Se analizaron un total de 130 muestras de leche procedentes de 30 fincas ubicadas en los Municipios Libertador y Campo Elas del Estado Mrida. Cada muestra consisti de 250 ml de leche cruda recolectada en frascos estriles a partir de los tanques de enfriamiento, y mantenida bajo refrigeracin hasta su procesamiento en el laboratorio. El aislamiento de las colonias de Aeromonas se realiz en Agar Almidn Ampicilina (30 mg/ml) de acuerdo a lo recomendado por Palumbo y col. (1989), confirmndose el gnero de las colonias aisladas mediante la tincin de Gram, la prueba de la oxidasa y catalasa. La identificacin de las especies aisladas se realiz en base a los esquemas bioqumicos recomendados por Carnahan (1991) y Abbott y Col. (1992). RESULTADOS De las 130 muestras analizadas, 98 (75.38%) resultaron positivas a la presencia de Aeromonas spp, lograndose aislar 156 colonias, de las cuales 47 fueron identificadas como A. hydrophila; 43 como A. shubertti; 39 como A. caviae; 11 como A. trota; 8 como A. janday y 8 como A. veronii bv sobria.. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos son indicativos del peligro que representa el consumo de leche cruda o de derivados lcteos elaborados con este tipo de leche, para la transmisin de Aeromonas. En la actualidad se realizan pruebas de patogenicidad de las cepas aisladas.
BIBLIOGRAFIA
Palumbo, S.; Bencivego, M.; Del Corral, F. Williams, A.; Buchanan, R. Journal Clinical Microbiology.Vol.27: 854-859. 1989 Abbott, S.; Cheung, W.; Kroske, M.; Bystrom, S.; Malekzadeh, T.; Janda, M. Journal Clinical Microbiology. Vol. 30: 1262-1266. 1992 Carnahan, A.; Behran, S.; Joseph, S. Journal Clinical Microbiology. Vol. 29: 2843-2849. 1991

.176.

MIS/3

EVALUACIN Y CARACTERIZACIN DE LA SONDA SVR1 PARA LA DETECCIN SENSIBLE Y ESPECFICA DE Penicillium polonicum PRODUCTOR DE VERRUCOSIDINA EN PRODUCTOS CRNICOS
E. Aranda*, M. M. Rodrguez, M.G. Crdoba*, M.J. Sosa y J.J. Crdoba Higiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. UEX. 10071. Cceres. (*) Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EIA. UEX. 06071.Badajoz Correo electrnico: earanda@unex.es Durante la elaboracin de productos crnicos curados de larga maduracin, como el jamn curado, se desarrolla una poblacin microbiana compuesta fundamentalmente por mohos, entre los que se encuentran especies toxignicas. En este sentido en diferentes etapas de la maduracin de jamn curado se ha aislado Penicillium polonicum productor de verrucosidina, que es una potente neurotoxina. Es necesario disponer de mtodos rpidos y sensibles de deteccin de este y otros mohos toxignicos. A partir de genes relacionados con la sntesis de verrucosidina, se ha diseado una sonda de ADN (SVr1) para detectar P. polonicum productor de verrucosidina. OBJETIVOS Caracterizacin de la sonda SVr1 determinando su secuencia y comprobando su eficacia (sensibilidad y especificidad) en la deteccin de P. polonicum productor de verrucosidina. MTODOS Se ha determinado la especificidad y sensibilidad de la sonda marcada con fluorecenadUTP, con diferentes concentraciones de ADN de P. polonicum productor de verrucosidina y frente a distintas especies de los mohos ms frecuentemente aislados en industrias de productos crnicos. La sonda ha sido secuenciada obtenindose el porcentaje de Guanina ms Citosina (G+C). RESULTADOS La sonda SVr1 mostr una alta sensibilidad al detectar ADN de P. polonicum a concentraciones tan bajas como 100 ng. Adems la especificidad de esta sonda con ADN de otros mohos aislados en industrias crnicas como P. echinolatum, P. solitum, P. commune y P. aurantiogriseum fue muy alta, tanto en los ensayos sobre muestras individuales como en pruebas mixtas (ADN de P. polonicum junto con ADN de las especies anteriormente citadas). En este sentido, la sonda consigui detectar P. polonicum a concentraciones de 100 ng en presencia de concentraciones 1000 veces superiores de ADN de mohos muy relacionados filogenticamente, sin que se observasen reacciones cruzadas. La sonda SVr1 contiene un total de 599 bases y un porcentaje G+C del 48,7%. CONCLUSIONES La sonda SVr1 muestra una alta sensibilidad y especificidad en la deteccin de P. polonicum productor de verrucosidina. Por tanto, esta sonda con su secuencia completa (599 bases) o con fragmentos ms pequeos debe ser considerada para la deteccin sensible P. polonicum productor de verrucosidina en productos crnicos.

.177.

MIS/4

COMPARACIN DE LA EFICACIA DE LOS MEDIOS PALCAM Y OXFORD MODIFICADO (OM) PARA EL AISLAMIENTO DE Listeria spp. y de Listeria monocytogenes A PARTIR DE CARNE DE POLLO
R. Capita, C. Alonso-Calleja, M.T. Garca-Arias, B. Moreno y M.C. Garca-Fernndez. Departamento de Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. Campus Universitario de Vegazana, s/n. 24071-Len. E-mail: dhtrcg@unileon.es OBJETIVO El objetivo de este estudio ha sido comparar la eficacia (selectividad, sensibilidad y carcter diferencial) de los medios slidos selectivos PALCAM y Oxford modificado (OM) para el aislamiento de Listeria spp. y de Listeria monocytogenes a partir de carne de pollo. MATERIAL Y MTODOS Se estudiaron 100 canales de pollo evisceradas y refrigeradas adquiridas en establecimientos comerciales (polleras, supermercados e hipermercados) de la ciudad de Len. Las canales se transportaron al laboratorio en una nevera porttil, realizndose el anlisis microbiolgico en un periodo de tiempo no superior a 4 horas. Para el estudio se utiliz el mtodo desarrollado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-FSIS) para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de carne cruda de mamferos y aves (McClain y Lee, 1988). Los caldos de enriquecimiento utilizados fueron UVM I (primario), UVM II y Fraser (secundarios). Todos los medios de cultivo empleados eran de la firma Oxoid. RESULTADOS Los porcentajes de canales con Listeria spp. fueron mayores cuando para el aislamiento se utiliz el medio PALCAM. Al utilizar este medio se detectaron listerias en el 95% de las canales examinadas, frente a un 87% cuando se utiliz el medio OM. Por lo que se refiere a la especie L. monocytogenes, tambin el medio PALCAM fue ms eficaz, observndose, en este medio, una incidencia del 31% frente a un 27% con el medio OM. Con la utilizacin simultnea de ambos medios conseguimos aumentar hasta 32 el porcentaje de canales positivas a esta especie. El medio PALCAM demostr ser ms selectivo que el OM, ya que en el primero se encontraron nicamente un 1.56% de placas con cultivos mixtos (listerias y cepas de otros gneros microbianos), frente a un 16.67% de las placas de medio OM. El doble carcter diferencial del medio PALCAM posibilit el aislamiento de un menor nmero de falsos positivos (1.04%) que al usar el medio OM (11.46%). Todos los falsos positivos aislados a partir de medio PALCAM se adscribieron, tras su identificacin, al gnero Bacillus. La mayor parte de los falsos positivos (86.36%) encontrados en el medio OM se identificaron como Enterococcus spp., y nicamente tres cepas (13.64% ) se correspondan con Bacillus spp. CONCLUSIONES De los medios comparados, el PALCAM fue claramente superior al Oxford modificado, tanto por lo que se refiere al nmero de muestras con Listeria spp. y L. monocytogenes detectadas, como a su carcter selectivo y diferencial.
BIBLIOGRAFA
McClain, D. y Lee, W.H. (1988). Development of USDA-FSIS method for isolation of Listeria monocytogenes from raw meat and poultry. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 660-664.

.178.

MIS/5

SUPERVIVENCIA A LA ESTERILIZACION POR CALOR DE SALMONELLA SPP. Y LISTERIA MONOCYTOGENES ADHERIDAS A MATERIALES DE CONTACTO CON ALIMENTOS
C. Snchez, A.B. Araujo y J. Carballo. Area de Microbioloxa. Dpto. Bioloxa Funcional e Ciencias da Sade. Facultade de Ciencias. Universidade de Vigo. Campus de Ourense. As Lagoas, 32004-Ourense OBJETIVOS Salmonella spp. y Listeria monocytogenes son bacterias patgenas que se adhieren a superficies de contacto con alimentos. Su presencia puede comprometer la calidad sanitaria de los alimentos procesados en contacto con dichas superficies ya que se cree que la adherencia tiene un efecto protector frente a los mtodos de limpieza y desinfeccin empleados en la industria alimentaria. Puesto que muchos de estos mtodos de limpieza emplean calor, el objetivo del presente trabajo ha sido estudiar la supervivencia en condiciones de esterilizacin por calor de tres cepas de Salmonella spp. y tres de Listeria monocytogenes adheridas a acero inoxidable 304, a un material plstico (PTFE) y a una goma (copolmero de estireno-butadieno y goma natural). MTODOS Piezas de estos materiales con las bacterias adheridas se sometieron a esterilizacin por calor en autoclave (121C, 15 min) y el nmero de bacterias supervivientes se determin mediante recuentos en placa tras despegarlas mediante sonicacin (Sinde y Carballo, 2000). Los resultados se comparan con los obtenidos al esterilizar las bacterias suspendidas en PBS y con los resultados de adherencia en condiciones estndar. RESULTADOS Ninguna de las cepas sobrevivi a la esterilizacin por calor cuando el experimento se realiz con las bacterias en suspensin. Por el contrario, de la mayora de las cepas se obtuvieron recuentos en placa cuando el experimento se realiz con las bacterias adheridas a los materiales. En general, el plstico fue el material que proporcion mayor proteccin (se obtuvieron recuentos ms altos por lo que el nmero de supervivientes fue mayor) a las cepas del gnero Salmonella y la goma a las cepas de Listeria monocytogenes. El acero inoxidable fue el material menos protector ya que en la mayora de los casos los recuentos obtenidos de ambas especies bacterianas fueron muy bajos. El grado de supervivencia no est relacionado con el grado de adherencia puesto que algunas cepas que se adhirieron mucho sobrevivieron en porcentajes bajos y viceversa. CONCLUSIONES La adherencia de bacterias a superficies les proporciona proteccin frente a mtodos de desinfeccin por calor empleados en la industria alimentaria siendo esa proteccin ms o menos intensa dependiendo del material empleado. Este tipo de estudios son tiles para la seleccin de materiales para la fabricacin de superficies de la industria alimentaria, as como para la puesta a punto de mtodos para su limpieza y desinfeccin.
BIBLIOGRAFA
Sinde, E. y Carballo, J. (2000). Attachment of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes to stainless steel, rubber and polytetrafluorethylene: The influence of free energy and the effect of commercial sanitizers. Food Microbiology (en prensa).

.179.

MIS/6

COMPARACION DE DOS METODOS DE EXTRACCION DE RNA PARA LA DETECCION DEL RNA DE ENTEROVIRUS Y VHA EN MEJILLONES MEDIANTE RT-PCR.
Nerea Casas y Ester Suen. Dpto. Inmunologa, Microbiologa y Parasitologa. Univ. Pas Vasco. Apto. 460, 01080 Vitoria-Gasteiz. OBJETIVOS Desarrollo y evaluacin de un mtodo rpido, sensible y eficaz para la concentracin y purificacin de virus entricos en muestras de mejillones (Mytilus spp.) compatible con su deteccin por RT-PCR tras la extraccin de sus cidos nucleicos por distintos mtodos. METODOS 1. Virus y cultivos celulares. Poliovirus tipo 1 (PV1), cepa Lsc, se ha propagado y ensayado en clulas BGMK. La cepa citoptica HM175 del virus de la Hepatitis A (VHA) se propag y ensay en clulas FRhK. 2. Extraccin y concentracin de los virus en las muestras de mejillones. 50 gr. de mejillones han sido inoculados con concentraciones conocidas de PV1 y VHA y tras la absorcin de estos virus, la muestra fue procesada segn el esquema siguiente: elucin alcalina con buffer Glycina 0.2M-0.15M NaCI, pH 9.5, precipitacin con polietilenglicol (PEG-1), purificacin con cloroformo y concentracin con una segunda precipitacin con PEG (PEG-2). 3. Extraccin de RNA vrico a partir de concentrados de la muestra. Se han evaluado dos mtodos de extraccin: el mtodo de extraccin en un solo paso que emplea guanidinium isotiocianato (GIT) y un mtodo comercial, Purescript TM(Gentra, Minneapolis, USA). 4. RT-PCR e hibridacin con sondas oligonucleotdicas. RESULTADOS El mtodo de extraccin y concentracin de virus entricos permiti obtener un concentrado final de 3.1+ 0.8 ml a partir de 50 gr. de muestra tras introducir una segunda precipitacin con PEG. La recuperacin de VHA y PV1 fue evaluada por ensayo de infectividad en cultivo celular y por RT-PCR e hibridacin. Para PV1 la recuperacin fue de 90.8+ 11% tras PEG-1 y 25.2+ 18% tras PEG-2. Para VHA la recuperacin result menos efectiva obtenindose valores de 48.3+ 21% tras PEG-1 y 1.2+ 0.6% tras PEG-2 posiblemente debido a que la agregacin entre partculas vricas y/o asociacin a slidos en suspensin dificulta su infectividad en cultivos celulares. Mediante RT-PCR el RNA de los virus no pudo ser detectado en los concentrados finales o slo tras una dilucin de la muestra debido a la presencia de inhibidores de la reaccin de amplificacin. Con objeto de eliminar los inhibidores de RT-PCR y mejorar la deteccin se ensayaron y compararon dos mtodos de extraccin de RNA: el mtodo de extraccin en un solo paso y un kit comercial, PurescriptTM. Ambos mtodos permitieron la amplificacin del RNA de PV1 y VHA directamente en los concentrados finales. La sensibilidad de la reaccin de RT-PCR determinada por el lmite de deteccin o endpoint fue similar para ambos procesos de extraccin. <0.5 PFU para PV1 y 15 MPNCU para VHA. Para el proceso completo la deteccin fue posible a niveles de inculo tan bajos como 4PFU/gr. para PV1 y 1.8-18 MPNCU/gr. para VHA. CONCLUSIONES El mtodo de extraccin y concentracin de virus entricos a partir de muestras de mejillones desarrollado es rpido, sensible, especfico y compatible con su deteccin por RTPCR. Aunque los dos mtodos de extraccin de RNA evaluados son similares con respecto a su efectividad en la eliminacin de inhibidores de RT-PCR, el mtodo comercial Purescript es ms rpido y no utiliza compuestos txicos como fenol o cloroformo.

.180.

MIS/7

IDENTIFICACION DE LAS ENTEROBACTERIACEAS AISLADAS DEL CHORIZO DE CEBOLLA (EMBUTIDO TRADICIONAL GALLEGO)
Castao, A., Garca, M.C., Tornadijo, M.E. y Carballo, J. Area de Tecnologa de los Alimentos, Facultad de Ciencias de Orense, Universidad de Vigo, 32004 Orense OBJETIVOS Con este trabajo se pretende comparar la poblacin de enterobactericeas aisladas del chorizo de cebolla elaborado por procedimientos artesanales con la de los chorizos industriales. METODOS Se elabor una partida de chorizo de cebolla de modo artesanal y otras dos industrialmente. En los tres lotes se tomaron muestras de la masa antes de embutir y del chorizo a los 2, 7, 14, 21, 28 y 42 das de maduracin. El medio de cultivo empleado para el recuento y aislamiento de enterobactericeas fue el VRBGA. Una vez sembrado se incub a 37C durante 18 a 24 horas. De este medio se aislaron 10 cepas por cada lote y punto de muestreo. Con las 180 cepas, una vez purificadas, se llevaron a cabo las pruebas de identificacin a nivel de especie, siguiendo los criterios de Lapage y col. (1979) y Brenner (1984), as como con ayuda de las galeras API 20E system (BioMrieux). RESULTADOS De las 70 cepas de enterobactericeas aisladas de los chorizos artesanales, el 58,57% fue adscrito a la especie Escherichia coli 1, el 1,42% a Serratia odorifera 1 y el 1,42% a Enterobacter intermedius. De las 110 cepas aisladas de los chorizos industriales, el 24,54% se adscribi a la especie Hafnia alvei 1, el 22,72% a Escherichia coli 1, el 6,36% a Salmonella choleraesuis, el 6,36% a Serratia liquefaciens, el 4,54% a Buttiaus agrestis, el 2,72% a Klebsiella pneumoniae, el 2,72% a Serratia ficaria, el 1,81% a Enterobacter amnigenus 2, el =,90% a E. Amnigenus 1, el 0,90% a E. Agglomerans, el 0,90% a Serratia plymuthica, el 0,90% a Exherichia coli 2, el 0,90% a Hafnia alvei 2, el 0.90% a Klebsiella oxytoca y el 0,90% a Citrobacter freundii. CONCLUSIONES En los chorizos artesanales se aislaron nicamente 3 especies de enterobactericeas, con una marcada dominancia de E. Coli 1 en todos los puntos de muestreo. En los industriales la variedad de especies fue mucho mayor, siendo las dominantes H. alvei 1 (aislada sobre todo al inicio de la maduracin) y E. Coli 1 (preferentemente en las etapas finales). La alta proporcin con que se aislan estas especies guarda relacin con su mayor tolerancia a condiciones adversas del medio, si bien en los lotes industriales cabe destacar que no se aislaron enterobactericeas a los 42 das de la maduracin.
BIBLIOGRAFIA
Brenner, D.J. (1984) Family Enterobacteriaceae, p. 408-516. En N.R. Krieg, and J.G. Holt (eds.), Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1. Williams & Wilkins, Baltimore. Lapage, S.P., B. Rowe, B. Holmes, y R.J. Gross (1979). Biochemical identification of Enterobacteriaceae, p. 123-141. En F.A. Skinner, y D.W. Lovelock (eds.), Identification Methods for microbiologists. Academic Press, London.

.181.

MIS/8

VALORACIN MICROBIOLGICA DE DOS TRATAMIENTOS HIGIENIZANTES DE HORTALIZAS DE CONSUMO EN CRUDO

M.G. Castro, C.S. Gallardo, F.J. Garca y L.A. Rodrguez. rea de Microbiologa.Dpto. Biologa Funcional y Ciencias de la Salud. Facultad de Ciencias de Ourense.Universidad de Vigo. C/ As Lagoas, s/n. 32004. Ourense. OBJETIVOS Se pretende establecer si es posible plantearse una reduccin de los niveles de microorganismos presentes en un elevado porcentaje de unidades, tales como Salmonella y E. coli, que son microorganismos patgenos para el hombre. MTODOS Los tratamientos a evaluar fueron los siguientes: Lavado bajo un chorro de agua (agua potable de consumo pblico suministrada por las redes de abastecimiento pblico) durante 5 minutos y lavado por inmersin en agua (del mismo tipo) a la que se le adicion cloro (0,1 mL/L) durante un tiempo de 5 minutos. Recuento de aerobios mesfilos, anaerobios mesfilos, de psicrfilos, de mohos y de levaduras. Investigacin de Enterobacteriaceae totales, de coliformes fecales y de Escherichia coli, de Salmonella, de Shigella, de Streptococcus fecales. RESULTADOS Los microorganismos mesfilos presentan recuentos dentro de los lmites recomendados, sea cual sea el tratamiento higienizante utilizado. Los recuentos obtenidos en mohos y levaduras sobrepasan los lmites recomendados mientras que los obtenidos para Enterobacteriaceae, Salmonella y E. coli cumplen la legislacin. Las muestras lavadas y tratadas con agua clorada presentaron una reduccin en los recuentos de microorganismos no incluidos en la legislacin, a excepcin del grupo de los Streptococcus. Los niveles de mohos y levaduras no se reducen con ninguno de los dos tratamientos. Los niveles de Staphylococcus aureus disminuyen y en el caso del tratamiento con agua y cloro se llegan a eliminar. Ni los Streptococcus fecales ni las enterobacterias son eliminados con estos tratamientos pero en el caso de las enterobacterias, se produce una reduccin de ms del 90% de la poblacin inicial. No se ha detectado la presencia de Salmonella en ninguna de las muestras analizadas, por lo que, no debe existir riesgo de intoxicacin alimentaria. Los niveles de aerobios y anaerobios mesfilos y de psicrfilos se reducen en todas las muestras tratadas. En las muestras sin tratar, el recuento es excesivamente alto. CONCLUSIONES Los procesos higienizantes evaluados en este trabajo no ofrecen resultados ptimos, con lo que se puede concluir que no son lo suficientemente eficaces para eliminar las contaminaciones.

.182.

MIS/9

PRESENCIA DE L. monocytogenes EN ESPECIAS

A. Benezet, E. Pedregal, J.M. de La Osa, M. Botas, N. Olmo, F. Prez Flrez. LABORATORIOS ANVISA. Arganda del Rey (MADRID) INTRODUCCIN Listeria monocytogenes, bacteria de creciente inters sanitario en la industria alimentaria, es cada vez ms investigada en los laboratorios de alimentos y, poco a poco, su control va siendo obligatorio en las legislaciones microbiolgicas ms recientes. Dada su ubicuidad, que le confiere su capacidad de supervivencia en ambientes que son hostiles para la mayora de otros microorganismos patgenos vehiculados por los alimentos, y la dedicacin de nuestra empresa dentro del sector, hemos credo conveniente la realizacin de este trabajo para comprobar la incidencia de Listeria monocytogenes en especias. MATERIAL Y MTODOS A.- Enriquecimiento de 25 g de muestra en caldo Fraser durante 24 horas y posterior resiembra, tambin en caldo Fraser. B.- Identificacin presuntiva por procedimientos automatizados de inmunoensayo. C.- Aislamiento de positivos en agar Palcam. D.- Confirmacin bioqumica de cultivos puros resembrados en TSA, enriquecido con extracto de levadura. RESULTADOS Hasta la redaccin de este resumen, se han analizado un total de 80 muestras de especias, de las cuales un 50% aproximadamente corresponden a pimentones. En ninguna de las muestras, hasta ahora analizadas, ha sido confirmada la presencia de Listeria monocytogenes. CONCLUSIN De forma general, y con las muestras analizadas hasta ahora, se podra afirmar que las especias como ingredientes de los productos crnicos, no son un punto crtico de control importante en cuanto a la disminucin del riesgo que supone la presencia de L. monocytogenes en ellos.

.183.

MIS/10

CALIDAD MICROBIOLGICA DE POSTRES LCTEOS ELABORADOS EN ESTABLECIMIENTOS DE HOSTELERA DE LA C.A.P.V. EN 1999.

De Pablo, M Begoa. Tcnico de Salud Pblica. Direccin Territorial de Sanidad de Bizkaia. Departamento de Sanidad. Gobierno Vasco. OBJETIVOS Se ha realizado un estudio para determinar la calidad microbiolgica de postres lcteos elaborados en establecimientos de hostelera ubicados en diferentes municipios de los tres territorios de la C.A.P.V (Comunidad Autnoma del Pas Vasco). MATERIALES Y MTODOS Se recogieron un total de 85 muestras, de las cuales 35 fueron flanes, 17 arroz con leche, 11 cuajadas, 7 natillas, 4 cremas catalanas y otros 11 postres diferentes (leche frita, mousses). Cada una de las muestras se acompa de un protocolo que inclua datos como la T de conservacin de las muestras en los establecimientos de recogida, etc. Se determinaron los siguientes parmetros analticos: Salmonella (P/A en 25 g), Enterobacterias a 30C y 42C (recuentos de u.f.c./g), E.coli (P/A en 1 g), S. aureus (recuentos de u.f.c/g) y B. cereus (recuentos de u.f.c/g) en muestras de natillas y arroz con leche. Se establecieron los siguientes lmites aceptables por el Grupo de Seguridad Microbiolgica: Salmonella: ausencia en 25 g, Enterobacterias a 42C:< 103/g, Enterobacterias a 30C:< 104/g, E. coli: ausencia en 1 g y en caso de presencia:102/g, S. aureus:<102/g y B. cereus:< 102/g. RESULTADOS Datos del protocolo Excepto tres muestras (cuya T fue superior a 10 C), la temperatura media de las dems en el momento de su recogida fue de 4,6C (mnima: 0C, mxima: 10C). Resultados analticos En ninguna de las muestras analizadas se detect presencia de Salmonella. Los recuentos de S. aureus y B. cereus fueron, en todos los casos, inferiores a 102 u.f.c/g. Excepto tres muestras recogidas en Bizkaia, que presentaron recuento inferiores a102 u.f.c/g, y una procedente de Araba con recuentos de 2,4x103 u.f.c/g, en las dems no se detect la presencia de E. coli. Las cuatro muestras correspondieron a diferentes tipos de postres (cuajada, etc.). Slo el 10% de las muestras analizadas correspondientes a diferentes tipos de postres (cuajada, flan, etc.) alcanzaron recuentos de Enterobacterias a 30C y 42C superiores a 104/g y 103/g, respectivamente, establecidos previamente como aceptables por el Grupo de Seguridad Microbiolgica. CONCLUSIONES De los resultados analticos obtenidos se desprende que la calidad microbiolgica de las muestras analizadas en este estudio es, en lneas generales, aceptable. No se detectaron bacterias patgenas. Las consideradas como testigos de falta de higiene se detectaron en cuatro muestras de postres diferentes y, excepto una que present recuentos de 2,4x103 u.f.c/g, las restantes presentaron tasas inferiores a 102 u.f.c/g. Slo el 10% de las muestras analizadas super los recuentos de Enterobacterias fijados como aceptables.

.184.

MIS/11

PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE UNA BACTERIOCINA PRODUCIDA POR UNA CEPA DE E. faecium vanA.
1 1 2 3

R. del Campo , C. Tenorio , R Jimnez Daz , R. Gmez-Lus , C. Torres . 1 Area Bioqumica y Biologa Molecular, Univ. La Rioja. 2 Instituto de la Grasa (CSIC), Sevilla. 3 Dpt. Microbiologa, Univ. Zaragoza. OBJETIVOS Purificar y caracterizar la bacteriocina producida por la cepa de E. faecium vanA RC714 aislada a partir de una muestra clnica. MATERIAL Y MTODOS Se estudi la presencia de todos los genes del opern vanA que codifican para la resistencia a glicopptidos (vanA, vanR, vanS, vanH, vanY, vanX, vanZ) mediante PCR con cebadores especficos. Para la deteccin de la produccin de bacteriocinas se utilizaron 33 cepas indicadoras de diferentes gneros y especies (20 Enterococcus, 4 Listeria, 3 Staphyloccus, 1 Escherichia, 1 Bacillus, 1 Leuconostoc, 2 Lactobacillus y 1 Pediococcus). En los experimentos de conjugacin se utiliz E. faecalis JH2-2 como receptor, seleccionando los transconjugantes resistentes a vancomicina y analizando posteriormente en ellos la produccin de bacteriocinas. Se estudi la estabilidad de la bacteriocina producida por la cepa RC714 a distintas temperaturas (80, 90 y 100C) durante 10, 15 y 20 min; as como a distintos pHs en el rango de 2,3-12,3. Del mismo modo, dicha bacteriocina se someti a la accin de varias enzimas proteolticas (tripsina, -quimotripsina, papaina, proteasa alcalina, porteinasa K y lisozima). Para su purificacin se utiliz una estrategia previamente descrita (Jimnez-Daz et al. 1995) consistente en precipitacin de los sobrenadantes activos con sulfato de amonio, cromatografa de intercambio inico, cromatografa de interaccin hidrofbica y cromatografa de fase reversa C2/C18. Se comprob la actividad de la banda pura mediante la tcnica descrita por Bhunia (1987). RESULTADOS Se detect la presencia de todos los genes del opern vanA y la produccin de una bacteriocina en la cepa E. faecium RC714. Dicha bacteriocina mostr actividad frente a 27 de los 33 indicadores utilizados (19 Enterococcus, 4 Listeria, 1 Leuconostoc, 1 Pediococcus y 2 Lactobacillus), no presentando actividad frente a Staphylococcus ni Escherichia coli. Mediante conjugacin, se transfiri la resistencia a glicopptidos junto con la produccin de bacteriocina a la cepa receptora E. faecalis JH2-2. La actividad de la bacteriocina se mantuvo estable en todo el rango de pH estudiado y tras 20 min a 100 C. Por otro lado, dicha bacteriocina fue sensible a la accin de tripsina, -quimotripsina, papaina, proteasa alcalina y proteinasa K y resistente a la accin de lisozima. Tras la purificacin y posterior secuenciacin se comprob que su peso molecular es de aproximadamente 3.000 Da, se compone de 42 aminocidos y muestra una alta homologa con la bacteriocina 31 descrita por Tomita et al. (1996) en una cepa de E. faecalis, sin embargo ambos pptidos diferieren en 5 aminocidos. CONCLUSIONES 1) Se ha detectado una bacteriocina en una cepa de E. faecium vanA con alta homologa a otra previamente descrita en Japn en una cepa de E. faecalis sensible a glicopptidos. 2) La produccin de la bacteriocina se transfiere conjuntamente con la resistencia a glicopptidos. 3). La bacteriocina es estable al calor y el pH y es activa frente a diferentes gneros bacterianos, incluyendo patgenos como Listeria, por lo que presenta un gran potencial como aditivo alimentario.

.185.

MIS/12

EFECTO DE ANTIBIOSIS DE ALGUNOS MICROORGANISMOS, AISLADOS DEL QUESO DE CABRALES, SOBRE LISTERIAS
J. Espejo, S. Slik y E. Espejo. Dpto. Sanidad Animal. Universidad de Crdoba OBJETIVOS Contribuir al conocimiento de las posibilidades de pervivencia de listerias en el queso de Cabrales tras una posible contaminacin durante la elaboracin del mismo. METODOS Se realiza un screening primario, enfrentando microorganismos aislados, durante el proceso de elaboracin y maduracin, del queso de Cabrales, con diferentes especies y serotipos del gnero Listeria. Aquellos microorganismos, que producan inhibicin, se cultivaron en medios lquidos que, tras incubacin a 37C durante 48-72 horas, se filtraron (Millipore de 0,22 micras), para adicionar parte del filtrado a otros medios de cultivo. RESULTADOS Se observa claro fenmeno de antibiosis con: Penicilium citrinum, P chysogenum, Aspergillus flavus, Enterococcus faecium, Lactobacillus paracasei, L. plantarum y L. casei. Mientras que no se evidenci inhibicin alguna frente a: Penicilium meleagrinum, Aspergillus versicolor, Lactococcus lactis y L. cremoris. CONCLUSIONES Aunque consideramos como muy improbable la pervivencia de listerias en ese tipo de queso, interpretamos que la mejor garanta, de evitar dicha pervivencia, radica en favorecer el dominio de aquellos microorganismos que, participando activamente en la maduracin del queso, sean inhibidores activos de las citadas bacterias.

.186.

MIS/13

INCIDENCIA DE Salmonella spp. y Campylobacter spp. EN CARNE DE POLLO COMERCIALIZADA EN LAS PRINCIPALES POBLACIONES DE CASTILLA Y LEON
J. I. Gmez Campillo, J. Mateo, J. M. Zumalacrregui y M. C. Domnguez. Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos, Universidad de Len. C/ La Serna 56, 24071 Len. OBJETIVOS Durante el periodo de tiempo comprendido entre los meses de Febrero a Noviembre de 1999 se analizaron un total de 198 muestras de carne de pollo comercializada en distintos establecimientos de las nueve provincias que componen la Comunidad Autnoma de Castilla y Len, con el fn de estudiar la incidencia en este producto de Salmonella spp. y Campylobacter spp. MTODOS Las muestras fueron tomadas por los Servicios Veterinarios Oficiales de Salud Pblica de la Junta de Castilla y Len. La distribucin de muestras por provincias se realiz atendiendo al volumen de poblacin de las mismas, siendo cada una de ellas de un establecimiento diferente. Cada unidad de muestra estaba constituida por aproximadamente 500 gr de carne de pollo preferentemente de muslos y/o contramuslos-. El aislamiento e identificacin de Salmonella spp. se llev a cabo del siguiente modo: Preenriquecimiento en Agua de Peptona Tamponada homogeneizndose en un Stomacher durante 120 segundos. Enriquecimiento selectivo en caldo Rappaport-Vassiliadis. Aislamiento en placas de agar Rambach. Identificacin bioqumica en galeras Enterotube II. Identificacin serolgica realizada por el Centro Nacional de Microbiologa de Majadahonda. Para el aislamiento e identificacin de Campylobacter spp., se procedi del modo siguiente: Enriquecimiento selectivo en caldo selectivo de enriquecimiento Preston, homogeneizndose en un Stomacher durante 120 segundos. Aislamiento en placas de agar exento de sangre para Campylobacter CCDA con incubacin en microaerofilia. Identificacin por medio de pruebas bioqumicas (catalasa, oxidasa, asimilacin de sustratos, etc.) y observacin de su morfologa al microscopio. RESULTADOS Se detect la presencia de Salmonella spp. en el 35,83% de las muestras analizadas, siendo los tres serotipos ms abundantes: S. enteritidis (47,88%), S. hadar (25,35%) y el 4, 12; b- (19,71%). Tambin se aislaron e identificaron en menor porcentaje los serotipos mbandaka, derby, virchow y paratyphi B. No se aisl S. typhimurium. En cuanto a la presencia de especies termoflicas pertenecientes al gnero Campylobacter (C. jejuni/coli), stas fueron aisladas en un 49,40% de las muestras analizadas. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en el presente estudio ponen de manifiesto una importante contaminacin de la carne de pollo, comercializada en la Comunidad Autnoma de Castilla y Len, por Salmonella spp. y Campylobacter spp.; siendo por lo tanto un vehculo comn en la transmisin de estos dos grupos de bacterias patgenas para el hombre.

.187.

MIS/14

ACTIVIDAD HEMOLTICA DE CEPAS DE Plesiomonas shigelloides DE ORIGEN PISCCOLA.

M. N. Gonzlez-Rodrguez, J. J. Sanz, J. A. Santos y M. L. Garca-Lpez. Departamento de Higiene y Tecnologa de los Alimentos, Universidad de Len. Campus de Vegazana s/n, 24071 Len. OBJETIVOS Plesiomonas shigelloides es una bacteria Gram-negativa de origen acutico que ha sido involucrada en procesos gastrointestinales asociados al consumo de pescado, crustceos y moluscos bivalvos. Recientemente se ha puesto de manifiesto la importancia de esta bacteria como agente de procesos, especialmente severos, en individuos inmunodeprimidos. La informacin existente acerca de este microorganismo es escasa siendo controvertidos y confusos sus mecanismos de patogenicidad. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el comportamiento de cepas de esta especie durante su incubacin en medios de cultivo y extracto de pescado, investigndose, asimismo, la posible produccin de metabolitos asociados con su virulencia. MTODOS Se han utilizado dos cepas de Plesiomonas shigelloides aisladas a partir del contenido intestinal de lucio y de agua de ro obtenida en la zona donde los ejemplares fueron capturados durante los meses de verano. Las cepas se inocularon en Caldo Triptona de Soja (TSB, Oxoid) tratado con 5% de Chelex (Bio-Rad), una resina quelante utilizada para eliminar el hierro; en TSB sin tratar y en un extracto de pescado obtenido en nuestro laboratorio a partir de salmn. La incubacin se llev a cabo a 35C con y sin agitacin tomndose muestras a diferentes tiempos y determinando el pH y el recuento microbiano en Agar Triptona de Soja (TSA, Oxoid). Los extractos obtenidos tras centrifugar y filtrar las muestras de cultivo se congelaron para el posterior estudio de la actividad hemoltica. La actividad hemoltica se determin espectrofotomtricamente a 545 nm sobre una suspensin de eritrocitos de perro al 1%, tras su incubacin en agitacin durante una hora a 37C y a continuacin otra hora ms a 4C. Estudios preliminares con sangre de diferentes especies (caballo, cerdo, conejo, oveja, ratn, vaca y humana del grupo 0+) mostraron que la hemlisis era ms intensa con eritrocitos de perro. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las cepas pueden multiplicarse tanto en los medios de cultivo como en el extracto de pescado aunque slo se detect actividad hemoltica en los cultivos en caldo. Las dos cepas mostraron actividad hemoltica a partir de las 48 horas de incubacin en los cultivos aireados, cuando el nmero de clulas empezaba a disminuir. Para intentar localizar el compuesto responsable de dicha actividad se rompieron las clulas con un sonicador y se demostr que la actividad resida en las membranas celulares y no en el interior. Janda y Abbot (1993, J.Clin. Microbiol., 31, 1206) encontraron que la mayor parte de las cepas de P. shigelloides estudiadas producan una protena con actividad beta-hemoltica asociada a la clula en condiciones de cultivo normales que no era liberada extracelularmente en cantidades apreciables. A pesar de que algunos autores (Daskaleros et al., 1991, Infect. Inmun., 59, 2706, Gardner et al., 1990, J. Clin. Microbiol., 28, 811 y Santos et al., 1999, J. Food Prot., 62, 1475) sealan que la sntesis de factores de virulencia es regulada por el hierro siendo mxima la produccin de toxinas en medios con bajo contenido en hierro, en las cepas analizadas no se han encontrado diferencias en el medio TSB con y sin hierro.
Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (Proyecto ALI97-0604)

.188.

MIS/15

CARACTERIZACION MOLECULAR POR ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO DE CEPAS DE Salmonella SEROTIPO enteritidis PROCEDENTES DE TRES PAISES EUROPEOS
I. Laconcha, A. Rementeria, A. Vivanco, A. Arbeloa, N. Lpez-Molina y J. Garaizar. Dpto. Inmunologa, Microbiologa y Parasitologa. Univ. del Pas Vasco. C/ Paseo de la Universidad, 7, 1006 Vitoria-Gasteiz. OBJETIVOS Se pretende en este trabajo evaluar la aplicabilidad de la tcnica genotpoca de electroforesis en campo pulsado (PFGE) en el estudio epidemiolgico de cepas no relacionadas de Salmonella Enteritidis, de los fagotipos (PT) ms frecuentemente aislados en tres pases europeos,y determinar la expansin a nivel internacional de este microorganismo entre humanos y animales. METODOS Se analizaron un total de 101 cepas de Salmonella serotipo enteritidis fagotipos 1, 4, 6 y 8, procedentes de muestras humanas, animales y de alimentos, aisladas en Dinamarca (47 cepas), Inglaterra (22) y Espaa (32) durante el periodo comprendido entre 1983 y 1997. El proceso de extraccin del ADN y posterior digestin de las muestras con los enzimas Xba I, Bln I y Spe I se realiz segn describen Olsen et al (J. Med. Microbiol: 1994. 40,15-22). Las condiciones de electroforesis empleadas para los diferentes enzimas se llev a cabo segn describen Laconcha et al. (Veterninary Microbiology. En prensa). El anlisis de los geles fue visual y la asignacin de perfiles de PFGE perfiles se realiz siguiendo los criterios sealados por guas de consenso ya publicadas. El poder de discriminacin para cada enzima fue calculado segn el Indice de Diversidad de Simpson. RESULTADOS Con la enzima Xba I se determinaron tres perfiles (A, B y C) y el tipo A fue subdividido en 14 subtipos (A1-A14). El poder de discriminacin (D) de este enzima result ser de D= 0.615. El anlisis con la enzima Bln I permiti determinar 6 tipos (A-F) y dentro del tipo A se definieron 12 subtipos (A1-A12), mostrando un D= 0.611. Cuatro tipos (A-D) y 10 subtipos A (A1-A10) fueron determinados con la enzima Spe I, mostrando el ndice de discriminacin ms bajo (D= 0.391). El anlisis combinado con las tres enzimas permiti aumentar significativamente el poder de discriminacin de este mtodo (D= 0.802), permitiendo la divisin de las 101 cepas analizadas en 28 grupos genmicos o genotipos (Xba I-Bln I-Spe I). Muchas de las cepas PT1, PT4 y PT6 de los tres pases compartieron la misma combinacin de perfiles (A1-A1-A1), independientemente de su fuente y perodo de aislamiento, confirmando este resultado la estrecha relacin entre estos fagotipos y la probable extensin de un nico clon a lo largo de los diferentes eslabones de la cadena alimentaria en una gran rea geogrfica. En general, las cepas aisladas en Dinamarca, Espaa e Inglaterra. La enzima Spe I exhibi el mayor ndice de discriminacin entre las cepas PT6. Los datos claramente pusieron en evidencia que las cepas PT8 aisladas en los tres pases eran de un nico origen clonal, siendo la combinacin de perfiles de PFGE (A10-A10-A1) la ms predominante y especfica para este fagotipo. CONCLUSIONES El PFGE en combinacin con el fagotipo representa una herramienta de trabajo adecuada para el estudio epidemiolgico de cepas de Salmonella Enteritidis y su propagacin tanto a nivel local, nacional e internacional. Se confirma con esta tcnica la gran homogeneidad de este microorganismo tanto a nivel humano como animal.

.189.

MIS/16

COMPORTAMIENTO DE Escherichia coli O157:H7 EN LECHE UHT ENTERA, SEMIDESNATADA Y DESNATADA A 4C

Y. Mamani, E. J. Quinto y M. T. Mora. Higiene e Inspeccin de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Autnoma de Barcelona, 08193-Bellaterra (Barcelona). OBJETIVOS El presente estudio se ha realizado teniendo en cuenta la importancia de Escherichia coli O157:H7 en la higiene alimentaria, y a los numerosos brotes producidos por este microorganismo tras el consumo de alimentos (entre ellos la leche). Mediante el presente trabajo de investigacin se pretende estudiar el comportamiento (crecimiento y supervivencia) de Escherichia coli O157:H7 tras su inoculacin en leche UHT entera, semidesnatada y desnatada conservada a 4C. METODOS Se utilizaron dos cepas clnicas de Escherichia coli O157:H7 (CECT 4076 y 4267) y una no patgena (CECT 516). Fueron reconstitudas en caldo BHI (Difco, Detroit, MI, USA) durante 24 h a 37C. Se realizaron diluciones decimales en agua de peptona tamponada (Difco) estril, y alcuotas de 1 ml se inocularon en 500 ml de leche UHT (entera, semidesnatada y desnatada). Se obtuvieron unas concentraciones bacterianas de aproximadamente 2 x 104 ufc/ml en el caso de E. coli no patgeno y de 4 x 104 ufc/ml en el caso de los E. coli patgenos. Los cultivos fueron almacenados a 4C. Se tomaron muestras (1 ml) a lo largo del tiempo. Se diluyeron en agua de peptona tamponada estril y se sembraron en agar MacConkey Sorbitol (Difco), incubndose a 37C durante 18-24 h. El pH se determin mediante la extraccin de 3 ml en cada toma, y utilizando un pH-metro Crison micropH 2001 con electrodo. RESULTADOS Los recuentos de E. coli patgeno en leche entera aumentaron ligeramente desde una poblacin inicial de 4,57 log ufc/ml a 4,91 log ufc/ml a las 24 h. A partir de ese momento, la poblacin mostr un descenso progresivo hasta alcanzar 1 log ufc/ml a los 33 das, para dejar de detectarse a los 34 das. Los valores de pH fueron estables durante todo el perodo (6,99-6,54). La evolucin de E. coli O157:H7 en leche semidesnatada muestr una disminucin desde una poblacin inicial de 4,5 log ufc/ml, hasta 1,3 ufc/ml en el da 13 y dejar de detectarse en el da 15. Con relacin al pH, se observa un descenso a lo largo del estudio contando con un valor mximo de 6,72 y un mnimo de 6,52. El recuento inicial de la poblacin de E. coli patgeno en leche desnatada fue de 3,64 log ufc/ml para luego descender a 1,38 log ufc/ml el da 9. A partir de ese momento el microorganismo mostr ligeros aumentos y disminuciones en sus recuentos, para descender definitivamente a 1 log ufc/ml el da 17, y no detectarse en el da 18. El pH mostr unos valores estables durante todo el ensayo (6,95-5,59). CONCLUSIONES Escherichia coli O157:H7 inoculado en leche UHT entera, semidesnatada y desnatada mostr menor capacidad de supervivencia a 4C que la cepa no patgena. Por otro lado, E. coli O157:H7 pudo sobrevivir pero no crecer durante un corto periodo de tiempo a 4C en las muestras de leche utilizadas.

.190.

MIS/17

INFLUENCIA DE DIVERSOS PARMETROS SOBRE LA ACTIVIDAD DE AS-48 FRENTE A LA CEPA ENTEROTXICA CECT 976 DE Staphylococcus aureus.

M. Maqueda1 , S. Ananou2, A. Glvez3 y E. Valdivia2 1) Instituto de Biotecnologa, 2) Dpto. Microbiologa, Fac. de Ciencias Univ. Granada. Fuentenueva, s/n 18071 Granada, 3) Dpto. Microbiologa, Univ. Jan.

OBJETIVOS La gastroenteritis estafiloccica es uno de los casos ms frecuentes de intoxicacin alimentaria en la poblacin mundial y es debida a la ingestin de una o ms enterotoxinas (Ses) producidas en alimentos contaminados por Staphylococcus aureus. En este estudio se ha establecido la eficiacia de la bacteriocina AS-48 frente a la cepa CECT976 de Staphylococcus aureus productora de enterotoxina A, en diversas condiciones ambientales (pH, temperatura y densidad de la poblacion inicial). MTODOS La concentracin mnima bactericida (CMB) frente a esta bacteria, se define como la mnima cantidad de bacteriocina que produce la muerte del 99,9% de la poblacin inicial, tras 24 h de incubacin. La accion bactericida de AS-48 ha sido establecida adicionando concentraciones crecientes de la bacteriocina a cultivos de estafilococos en fase exponencial de crecimiento y variando los parmetros objetos de estudio. Los resultados se expresan como reduccin de la viabilidad celular (UFC/ml) o bien en funcin del factor de reduccin logartmica (FRL) expresados como el log UFC/ml del control a T1 menos el log UFC/ml de la muestra tratada a T1 RESULTADOS La concentracin mnima bactericida (CMB) de AS-48 frente a S. aureus (1,3x106 cel /ml) en medio BHI a 37C fu de 15 g/ml. Para determinar la influencia de la temperatura de incubacin sobre la sensibilidad de la cepa CECT 976 se ensayaron concentraciones de AS-48 prximas a la MCB en cultivos en fase exponencial, incubados durante 48 h a temperatura ptima (37C), subptima (15C) y de refrigeracin (4C), sin adaptacin previa a las mismas. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que a la temperatura subptima de incubacin la MCB se reduce de 15 a 10 g/ml de AS-48 y determina una disminucin progresiva de la viabilidad celular hasta las 48 h. La actividad bactericida de AS-48 requiere, sin embargo, actividad metablica ya que carece de afecto (incluso a concentraciones 3 veces superiores) cuando se ensaya a 4C, temperatura en la que no hay crecimiento bacteriano. El efecto del pH (4-8) ha sido estudiado a temperatura ptima de crecimiento y en todos los casos se han obtenido reducciones logartmicas superiores a dos ciclos tras slo una hora de tratamiento con AS-48, obtenindose FRLs de 3,88 a pH 4 y de 2,6 a 2,9 en el intervalo de pH de 5 a 8. Finalmente, el efecto de AS-48 parece dependiente de la concentracin de clulas en el cultivo, habindose observado el fenmeno paradjico de Eagle en el cual el aumento de la concentracin del inhibidor o la dilucin del cultivo disminuyen la actividad de AS-48 en lugar del efecto esperado del incremento en la actividad bactericida. CONCLUSIONES AS-48 muestra actividad bactericida frente a la cepa enterotxica CECT 976 de Staphylococcus aureus (Se A) cuando es ensayada a temperaturas que permiten el crecimiento bacteriano (37 y 15 C) y en un amplio rango de pHs (mxima a pH 4).

.191.

MIS/18

DETECCIN, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE CEPAS ENTEROTOXIGNICAS DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Y PORTADORES. RELACIONES ENTRE TIPOS GENTICOS Y ENTEROTOXINAS.
M.C. Martn, J.M. Fueyo. M.A. Gonzlez-Hevia, y M.C. Mendoza. rea de Microbiologa. Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo. c/ Julin Clavera s/n. 33006-Oviedo. OBJETIVOS Determinar la frecuencia de Staphylococcus aureus enterotoxignicos (ETs) entre aislamientos procedentes de alimentos manipulados y portadores. Identificar los tipos de enterotoxinas y genes ent. Tipificar las cepas de S. aureus para adscribirlas a tipos genticos. Relacionar tipos de enterotoxinas (y genes-ent) con tipos genticos. MTODOS Se analizaron 210 aislamientos de S. aureus procedentes de alimentos y portadores, as como cepas de referencia productores de enterotoxinas (SE) A, B, C, D y E. La produccin de SEs se analiz mediante aglutinacin pasiva reversa en latex (SET-RPLA. Oxoid) y se confirm mediante PCR utilizando iniciadores gen-especficos. La adscripcin de aislamientos a tipos genticos se realiz mediante amplificacin de secuencias de DNA aleatorias (RAPD) utilizando independientemente dos iniciadores designados S y B. RESULTADOS La correlacin entre tipos de SEs excretadas al medio y la presencia de tipos de genes-ent fue total. La distribucin de aislamientos de S. aureus ETs segn muestras de origen y tipo de SEs producidas fue la siguiente: SEA SEB SEC SED SEAC SECD Quesos (n=49 ) 8 (16,3%) 1 2 5 PRODUCTOS PASTELERA (N= 43) 16 (37,2%) 3 1 3 9 Otros alimentos (n= 19) 5 (26,3%) 1 4 Exudados nasales (n=78) 25 (32,0%) 11 2 6 1 1 4 HERIDAS (n=21) 5 (23,8%) 2 2 1 Total (n= 210) 59 (28,0%) 18 5 20 11 1 4 Mediante el anlisis del polimorfismo en los fragmentos de DNA generados por RAPD los 59 aislamientos ETs se adscribieron a 9 tipos genticos (TGs), que aparecan en muy distinta frecuencia, dos tipos claramente prevalentes, TG:S1-B1 (30 aislamientos, 50,8%) y TG:S4-B3 (19 aislamientos, 30,5%), los dems representados entre 1 y 3 aislamientos (1,7 y 5,1%). Se registr diferente grado de relacin entre tipo gentico y produccin de enterotoxinas/presencia de genes (ent), as el TG:S1-B1 inclua aislamientos de alimentos y humanos, productores de SEA, SEB, SEC, SED, y SEAC, junto a las cepas de referencia CECT 4459 (SEB), 4465 (SEC) y 59 (SE-negativa); mientras que el TG:S4-B3 inclua solamente aislamientos de alimentos y humanos productores de SEC y humanos SECD. Las otras tres cepas de referencia CECT 976 (SEA), 4466 (SED) y ATCC 27664 (SEE) representaban a tres tipos genticos nicos. CONCLUSIONES Entre los S. aureus analizados el 28% eran ETs, produciendo SEs de los tipos C, A, D y B (42,4; 32,2; 18,6; y 8,5%, respectivamente). SEA y SEC eran mas frecuentes entre aislamientos de portadores y SEC y SED de alimentos. En portadores se encontraron aislamientos que producan simultneamente dos tipos de SEs (AC y CD). Los S. aureus ETs presentaban diferente grado de relacin gentica entre ellos y respecto a cepas no enterotoxignicas. Los dos TGs mas frecuentes aparecan en los niveles extremos de relacin.

.192.

MIS/19

APLICACIN DE TCNICAS BASADAS EN PCR A LA DETECCIN DE CEPAS DE Salmonella enterica EN ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL Y ADSCRIPCIN A GRUPOS GENTICOS.
E. Landeras, A. del Cerro, S. Soto, B. Guerra , J.M. Fueyo y M.C. Mendoza rea de Microbiologa. Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo. c/ Julin Clavera s/n. 33006-Oviedo. OBJETIVOS Evaluar protocolos desarrollados en nuestro laboratorio y basados en amplificacin mediante PCR: 1) a la deteccin de genes especficos de Salmonella enterica para determinar presencia de esta especie en alimentos y 2) a la adscripcin de organismos a tipos genticos mediante el anlisis de secuencias aleatorias de DNA (RAPD-tipificacin). Relacionar los tipos genticos encontrados con los previamente definidos entre aislamientos clnicos. MTODOS Se analizaron 26 muestras de alimentos crnicos (18 de carne de ternera y 8 de salchicha fresca), 27 de pollo y 32 de huevos (cada muestra inclua 6 huevos), 18 de gallinaza y 22 de hisopos rectales de gallinas. La deteccin de Salmonella mediante PCR y se realiz a partir de cultivos de enriquecimiento de caldo Rapapport-Vasiliadis-soja sometidos a separacin inmunomagntica con Dynabeads anti-Salmonella, y se utilizaron iniciadores especficos para el gen ent (enterotoxina). Paralelamente parte de estos cultivos era sembrada en placas de agar Entrico Hektoen para aislamiento de Salmonella. La caracterizacin de los aislamientos de Salmonella se realiz mediante serotipificacin, resistencia a antimicrobianos y RAPDtipificacin . RESULTADOS Dieciseis muestras de productos crnicos (61,5%), 4 de pollo (14,8%), 16 de huevos (50%), 7 de gallinaza (38,9%), y 4 de hisopos (18,2%) fueron positivas para Salmonella mediante PCR. Se aislaron e identificaron salmonelas de todas ellas. Los aislamientos se adscribieron a 9 serotipos: Enteritidis (10 cepas), Panama (12), Typhimuriun (6) Hadar (6), Inmvil (2), Derby (3), Tennessee (6), Muenchen y Wien (1); a 17 perfiles de resistencia, siendo los ms frecuentes: cido nalidxico y espectinomicina (6 cepas); ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol y estreptomicina-espectinomicina (3 cepas). Mediante RAPD con el cebador S se adscribieron a 15 genotipos: 02 (9 cepas); 06 (11 cepas); 015 (7); 013 (5); 01, 07, 08 y 014 (2); y el resto de tipos con una sla cepa. Se pudo establecer una relacin entre los serotipos-genotipos mas frecuentes, y alimentos de procedencia-animales reservorio: i) Enteritidis 02 y las gallinaceas (se encontraron en huevos, pollo fresco y heces de pollo). Este tipo tambin se ha encontrado en muestras clnicas, ii) Typhimurium y ganado vacuno y/o cerda, ya que de las 6 cepas de Typhimurium aisladas 4 se encontraron en carne picada, 1 en pollo, y otra en salchicha fresca, iii) Panama y gallinceas (de las 12 cepas aisladas, 7 se encontraron en huevos y 1 en heces de pollo). CONCLUSIONES La tcnica basada en reduccin de los tiempos de preenriquecimiento y enriquecimiento, separacin inmunomagntica y amplificacin del gen-ent mediante PCR, permite la deteccin de Salmonella en 24-36h y se puede considerar como sensible y especifica. El anlisis de amplicones de secuencias aleatorias de DNA (RAPD-tipificacin), es tambin una tcnica sencilla, rpida y precisa. Esta tcnica permite tipificar a nivel gentico organismos del gnero Salmonella.

.193.

MIS/20

SENSIBILIDAD A ANTIBITICOS EN CEPAS DE Enterococcus AISLADAS DE CERDOS Y ANIMALES DE COMPAA.

C. Tenorio, C. Martnez, M. Zarazaga, F. Ruiz-Larrea y C. Torres Dpto. de Agricultura y Alimentacin. Universidad de La Rioja. Avda de la Paz, 105. 26004 Logroo. La Rioja. OBJETIVOS 1) Determinar la tasa de sensibilidad/resistencia a antibiticos de cepas de Enterococcus aisladas a partir de muestras intestinales de cerdos y de animales de compaa. 2) Estudio de la colonizacin por cepas resistentes a vancomicina de la flora intestinal de cerdos y de animales de compaa. MATERIAL Y MTODOS La toma de muestras se realiz durante el periodo 1997-1999. Se recogieron 69 muestras intestinales de cerdos sacrificados en el matadero y se sembraron en m-Enterococcus agar (Difco). Trs incubacin de 24h a 37C, se tomaron al azar 1 2 colonias de Enterococcus por placa y fueron identificadas por mtodos microbiolgicos, bioqumicos y moleculares. Siguiendo la misma metodologa, se recogieron muestras fecales de animales de compaa (28 perros y 5 gatos). Todas las muestras fecales recogidas fueron tambin sembradas en medio selectivo m-Enterococcus suplementado con vancomicina (VAN 4mg/ml) para determinar la tasa de colonizacin por cepas VANR Se determin la sensibilidad a diez antibiticos de las cepas aisladas por determinacin de las CMIs (NCCLS). Los antibiticos estudiados fueron: VAN, teicoplanina (TEC), penicilina (PEN), ampicilina (AMP), ciprofloxacina (CIP), eritromicina (ERY) y tilosina (TIL). Para los antibiticos aminoglicsidos streptomicina (STR), gentamicina (GEN), kanamicina (KAN), se determin la resistencia de alto nivel (RAN). RESULTADOS A partir de las 69 muestras intestinales de cerdos se aislaron 111 cepas de enterococos de las especies E. faecalis (46), E. faecium (13), E. durans (29), y Enterococcus sp (23). El 5 y 7% de los enterococos aislados de cerdos fueron resistentes a PEN y AMP respectivamente. La CMI50 para ambos antibiticos fue 2mg/ml, la CMI90 fue 4 mg/ml para PEN y 8 mg/ml para AMP. La especie E. durans fue la que mayor tasa de resistencia present a -lactmicos. Se observ una elevada tasa de resistencia a macrlidos, 80% de los aislados fueron resistentes a ERY, alcanzando la CMI50 un valor de 128 mg/ml. La especie E. faecalis fue la que mayor tasa de resistencia present (CMI50 128 mg/ml). El 19% de las cepas fueron resistentes a CIP, siendo la CMI50 para este antibitico de 1 mg/ml y la CMI90 de 8 mg/ml. La especie E. faecalis fue la ms resistente (CMI50: 16 mg/ml) y E. durans la ms sensible (CMI50:1 mg/ml) El 37, 44 y 5% de las cepas presentaron una RAN a KAN, STR y GEN respectivamente. Se aislaron 19 E. faecium, 4 E. faecalis, y 10 Enterococcus sp. a partir de las 33 muestras fecales de animales de compaa estudiadas. La tasa de resistencia a todos los antibiticos testados fue mucho menor que en las cepas aisladas de cerdos. 6 de los 69 cerdos (8,7%) y 5 de los 33 animales de compaa (15,1%) estudiados estaban colonizadas por cepas VANR. CONCLUSIONES Se ha detectado una elevada tasa de resistencia en las cepas aisladas de muestras intestinales de cerdos, la flora intestinal saproftica puede representar un importante reservorio de genes de resistencia a antibiticos.

.194.

MIS/21

SENSIBILIDAD A ANTIBITICOS -LACTMICOS Y QUINOLONAS EN CEPAS DE E .coli DE ORIGEN ALIMENTARIO, ANIMAL Y HUMANO.
Y. Senz, L. Brias, M. Lantero, I. Olarte, M. Zarazaga Y C. Torres. Dpto. de Agricultura Y Alimentacin. Universidad de La Rioja. Avda de la Paz, 105. 26004 Logroo. La Rioja. OBJETIVO Determinar la sensibilidad a -lactmicos y quinolonas en cepas de E. coli de origen alimentario, animal y humano. MATERIAL Y MTODOS Durante el perodo 1997-99, se recogieron 69 muestras de alimentos (derivados de pollo), muestras fecales de animales sanos obtenidos en matadero (40 pollos, 74 cerdos) y muestras fecales de otros animales (28 perros, 5 gatos, 39 toros y 5 caballos); as como de humanos sanos (47) o pacientes intra o extrahospitalarios (289). Las muestras se sembraron en medios especficos (sin suplemento a antibiticos). Se seleccion al azar e identific por tcnicas bioqumicas una cepa de E. coli por muestra. Se determin la sensibilidad a antibiticos mediante el sistema de difusin en agar a -lactmicos (ampicilina, AMP, amoxicilina-clavulnico, AMC, imipenem, IPM, cefoxitina, FOX, ceftazidima, CAZ, cefotaxima, CTX) y quinolonas (cido nalidxico, NAL y ciprofloxacina, CIP) En los aislados resistentes a NAL y CIP se determin su CMI. Mediante PCR se detect la presencia de -lactamasas (tipo TEM y SHV) implicadas en la resistencia a -lactmicos y mediante secuenciacin se detectaron las mutaciones del gen gyrA en aislados resistentes a quinolonas. RESULTADOS Se aislaron un total de 474 cepas de E. coli de las 596 muestras analizadas. Los porcentajes de resistencia detectados mediante difusin en agar se reflejan en la siguiente tabla Origen de muestras Pacientes Humanos sanos Pollos Cerdos An.domsticos Toros/caballos Alimentos E.coli No. 214 36 40 73 28 36 47 Resistencia (%) a NAL CIP AMP 11 1 39 6 0 31 88 38 58 14 3 29 18 0 39 0 0 25 53 13 47 AMC 6 11 5 6 7 6 13 IPM 0 0 0 0 0 0 0 FOX 1 0 2 0 0 0 6 CAZ 0 0 0 0 0 0 0 CTX 0 0 0 0 0 0 0

fenotipo ms comn fue NALS/CIPS (289 aislados). De los 86 aislados resistentes a NAL, 5 presentaron el fenotipo NALR/CIPI (CMI de NAL: 1024 mg/ml) y en 23 se observ resistencia cruzada a ambas quinolonas (rango de CMI de CIP: de 4 a 32 mg/ml). En los 4 aislados NALR/CIPR en los que se determin la secuencia del gen gyrA, se detectaron mutaciones en 2 aminocidos (S83L, D87N). -LACTMICOS: Se ha detectado una alta resistencia a AMP. Los aislados de origen alimentario presentaron la mayor tasa de resistencia a AMC. Tres de los 5 aislados FOXR se obtuvieron de alimentos. Se detect presencia de -lactamasas de tipo SHV y TEM en 49 de las 76 cepas estudiadas (1 tipo SHV y 48 tipo TEM)
QUINOLONAS: El

CONCLUSIONES Existe una distinta distribucin de los fenotipos de resistencia segn el origen de las cepas. Las cepas aisladas de pollos y alimentos presentaron las mayores tasas de resistencia a quinolonas y -lactmicos. Deteccin de doble mutacin en la secuencia del gen gyrA en aislados de alta resistencia a quinolonas. Deteccin de -lactamasas de tipo SHV y TEM en 49 aislados. La flora intestinal saproftica puede representar un importante reservorio de genes de resistencia a antibiticos.

.195.

MIS/22

RECUPERACIN DE Staphylococcus aureus EN BAIRD-PARKER+RPF Y CONFIRMACIN POR PCR.

I. Sols1, A. Arnau1, B. Alarcn2 y R. Aznar2. IPROMA, S.L. Apartado de correos 126, 12550 Almazora, Castelln. 2 Dpto. Microbiologa, Universitat de Valncia. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA)(CSIC). Apartado de correos 73, Burjassot 46100, Valencia.
1

OBJETIVOS Disear un procedimiento para la determinacin rpida de Staphylococcus aureus en alimentos combinando la utilizacin del medio Baird-Parker+RPF (BioMerieux) y la confirmacin de los aislamientos mediante PCR. MTODOS Se ha comparado la eficiencia de los medios Baird-Parker, tradicionalmente utilizado en la recuperacin de S. aureus, y Baird-Parker+RPF, medio recientemente comercializado que incorpora en su frmula el RPF (Rabbit Plasma Fibrinogen) permitiendo detectar simultneamente la actividad coagulasa. Se utilizaron 21 cepas de referencia suministradas por la CECT de las cuales 12 pertenecen a la especie S. aureus y 9 a otras especies del gnero. As mismo, se incluyeron 28 cepas obtenidas de muestras reales. Todas ellas se inocularon en ambos medios de cultivo para observar su aspecto colonial y se sometieron a las pruebas de confirmacin: termonucleasa estable (DNasa) y coagulasa (coagulacin del plasma sanguneo). Adems, se sometieron a identificacin bioqumica utilizando el sistema miniaturizado API Staph (BioMrieux) y se confirmaron por PCR. Para la PCR se utilizaron los iniciadores Pri1 y Pri2 (Brakstad et al.,1992) que amplifican un fragmento de 270 pares de bases del gen nuc que codifica para la termonucleasa estable, especfico de S. aureus. RESULTADOS Los cultivos de referencia de la especie S. aureus presentaron la morfologa colonial caracterstica en los dos medios permitiendo su diferenciacin de los de las otras especies de Staphylococcus. La cepa tipo de la especie S. epidermidis result DNasa positiva. Slo se obtuvo el fragmento de amplificacin por PCR del gen nuc en las cepas pertenecientes a la especie S. aureus. De las 28 cepas procedentes de muestras reales, 25 presentaban halo caracterstico en agar Baird-Parker. Las 25 cepas dieron un resultado positivo en la prueba de confirmacin de la coagulasa. De ellas, 21 fueron positivas para la prueba de la termonucleasa estable, y 4 presentaron un resultado dudoso. Sin embargo, slo 11 se confirmaron como S. aureus tras identificacin en API y PCR. En agar Baird-Parker+RPF, de estas 28 cepas slo 13 presentaban halo y de ellas, slo dos no se confirmaron como S. aureus mediante API y PCR. Las 4 cepas de resultado dudoso en DNAsa, no presentaron halo en Baird-Parker+RPF. CONCLUSIONES El medio de Baird-Parker+RPF permite una recuperacin ms selectiva de S. aureus que el Baird-Parker tradicional lo que reduce el nmero de colonias positivas a confirmar. La confirmacin de los aislamientos por PCR, permite una identificacin rpida (en menos de 8 h) e inequvoca, eliminando la presencia indeterminaciones en los resultados, frecuentes en API y en la prueba de DNasa. Se propone la combinacin del medio Baird-Parker+RPF y la confirmacin por PCR como procedimiento para la recuperacin de S. aureus de alimentos.
Brakstad, O.G., K. Aasbakk & J.A. Maeland (1992) Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J. Clin. Microbiol. 30: 1654-1660.

.196.

MIS/23

CONDICIONES DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIN DE CIDO CICLOPIAZNICO POR Penicillium commune AISLADO DE JAMN CURADO
M. J. Sosa, E. Aranda*, M. Jurado, M.E. Bermdez, F. Nez. Higiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. UEX. 10071. Cceres. Correo electrnico: fnunez@unex.es (*)Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EIA. UEX. 06071. (Badajoz). Las condiciones ecolgicas alcanzadas durante la elaboracin del jamn curado favorecen el desarrollo en su superficie de una abundante poblacin fngica. Una de las especies aisladas con mayor frecuencia, tanto en diferentes industrias, como en las distintas etapas de fabricacin es Penicillium commune. Este moho ha demostrado un elevado potencial toxignico tanto en el test de la Artemia salina como en cultivos de clulas de mamfero. P. commune sintetiza cido ciclopiaznico, aunque no se conoce su capacidad para producir esta toxina en substratos crnicos ni cmo pueden afectar los factores ecolgicos a dicha produccin. OBJETIVOS. Estudiar la influencia de los principales factores ecolgicos (temperatura y actividad del agua) en el crecimiento y la capacidad de produccin de cido ciclopiaznico de P. commune aislado de jamn ibrico y cultivado en un substrato crnico. MTODO. Una cepa toxignica de P. commune aislada de jamn ibrico se inocul en agar extracto de carne (AEC) (2,5% de extracto de carne; 0,25% de peptona, 2% de agar), incubndose durante 14 das en distintas condiciones de temperatura (12, 20, 25 y 30C) y aw (0,90, 0,96, 0,97 y 0,99). Los distintos niveles de aw se obtuvieron aadiendo al medio AEC un 5% de cloruro sdico y diferentes concentraciones de extracto de carne y/o glicerol. El crecimiento se determin midiendo el dimetro de las colonias. La produccin de cido ciclopiaznico se determin tras la obtencin de los extractos clorofrmicos de los cultivos, y su anlisis mediante HPLC acoplado a un detector de masas de ionizacin qumica (APCI). RESULTADOS. La cepa de P. commune utilizada creci en todas las condiciones de temperatura y aw probadas. Generalmente, el crecimiento fue mayor a las temperaturas intermedias (20 y 25C), mientras que los dimetros menores se obtuvieron a temperatura de 30C, a todos los valores de aw. P. commune tuvo un crecimiento mayor a valores de aw de 0,96 y 0,97, observndose una disminucin del tamao de las colonias cuando se cultiv a 0,99, y especialmente a 0,90, donde el crecimiento tambin fue el ms bajo. Se detect cido ciclopiaznico en todos las condiciones probadas. Al contrario de lo que sucedi con el crecimiento, los valores de mxima produccin se obtuvieron cuando la temperatura de incubacin fue de 30C, y los valores menores a 20C. En todas las temperaturas probadas la produccin mayor se observ cuando la aw era de 0,96. CONCLUSIONES. P. commune puede crecer y producir cido ciclopiaznico en un substrato crnico, sin fuente apreciable de azcares en un amplio rango de temperaturas y aw. La produccin de cido ciclopiaznico es mayor en condiciones de crecimiento subptimo del moho productor. Con los resultados obtenidos no se puede excluir el riesgo de que P. commune produzca micotoxinas en productos crnicos, especialmente en los de largo perodo de maduracin, por lo que es aconsejable la utilizacin de cultivos iniciadores de mohos no toxignicos que pudieran excluirle por competicin.

.197.

MIS/24

CARACTERIZACIN GENTICA Y SEGUIMIENTO EPIDEMIOLGICO DE AISLAMIENTOS DE Salmonella SEROTIPO PANAMA IMPLICADOS EN TRES BROTES REGISTRADOS EN ASTURIAS EN AGOSTO DE 1998.

S.M. Soto1 , B. Guerra1 , A. del Cerro1 , P. Fernndez Fuentes2 , M.A. Gonzlez-Hevia1 , M.C. Mendoza1 . 1 rea de Microbiologa. Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo. c/ Julin Clavera s/n. 33006-Oviedo. 2 Hospital de Jarrio, Coaa, Principado de Asturias.

OBJETIVOS Caracterizacin gentica de los aislamientos de Salmonella serotipo Panama implicados en tres brotes de gastroenteritis registrados en agosto-1998 en el Principado de Asturias (P.A). Asignar los aislamientos a cepas, clones y linajes genticos, y establecer la dispersin espacial, el mantenimiento temporal, la fuente de transmisin y el posible reservorio. MTODOS Se analizaron tres grupos de aislamientos del serotipo Panama: i) 57 clnicos recogidos en el P.A. (1990-99); ii) 7 clnicos recogidos en otras regiones durante 1998; y iii) 11 recogidos de alimentos, 6 de aguas, 1 de heces de pollo, y las cepas de referencia CECT 702 y ALM 41. Las tcnicas de tipificacin gentica utilizadas fueron: H-ribotipificacin, PCR-ribotipificacin, ERIC, RAPD a tres vas, anlisis del contenido en plsmidos, presencia de integrones y genes de virulencia. Adems, se analiz la resistencia a antimicrobianos. RESULTADOS El estudio realizado ha permitido trazar la epidemiologa molecular del serotipo Panama en el P.A. (1990-99). Se ha constatado la existencia de un linaje prevalente y endmico (definido por H1-RE1, ERIC-1, RAPD-S1 B1 C1) representado, adems, por aislamientos de otras regiones, procedentes de muestras clnicas as como de heces de pollo, huevos, carnes y aguas. Los organismos de este linaje se pueden diferenciar en 19 clones (mediante perfil de resistencia, perfil de plsmidos, e integrones). En los tres brotes por Panama registrados en agosto de 1998 estuvieron implicados organismos con caracteres idnticos que fueron adscritos al linaje prevalente y endmico y a un clon emergente y epidmico (caracterizado por ser resistente al cido nalidxico, ausencia de plsmidos e integrones), que se dispers por diferentes reas (Jarrio, Oviedo, Gijn, Villaviciosa) durante agosto-septiembre de 1998. Por el tipo de alimento asociado en los brotes y ante el aislamiento de organismos en huevos y heces de pollos, se podra asociar este clon a las gallinceas como reservorio. El estudio de la resistencia a antimicrobianos revel: a) todos los aislamientos eran sensibles a cefalotina, ceftacidina, imipenem, amikacina y ciprofloxacina; y el 27,4% a todos los antimicrobianos ensayados; b) se encontraron 15 perfiles de resistencia, 8 de ellos con 5-7 determinantes de resistencia; c) durante el bienio 1995-96 dominaron organismos multirresistentes que portaban un integrn de clase 1-sulI con una regin variable de 1600 pb que contena los genes de resistencia a estreptomicina-espectinomicina (aadA1a) y a trimetoprim (dfrA1); d) durante 1998-99 se produjo un fuerte incremento de aislamientos resistentes al cido nalidxico pertenecientes o prximos al clon epidmico, y un descenso de aislamientos resistentes a otros antibiticos de amplio uso en medicina y/o veterinaria. CONCLUSIN Los tres brotes bajo estudio fueron producidos por organismos pertenecientes a una misma cepa o clon, emergente en agosto de 1998, que caus episodios de salmonelosis humana durante los meses de agosto-septiembre y se ha mantenido en las gallinceas, al menos, hasta mayo de 1999.

.198.

MIS/25

ACCIN DE LA BACTERIOCINA AS-48 SOBRE LA PRODUCCIN DE ENTEROTOXINA POR Bacillus cereus LWL1
1)

E. Valdivia1 , H. Abriouel 1, A. Glvez2 y M. Maqueda3 Dpto. Microbiologa, Fac. de Ciencias, 3)Instituto de Biotecnologa, Univ. Granada. Fuentenueva, s/n 18071 Granada. 2) Dpto. Microbiologa, Univ. Jan.

OBJETIVOS Bacillus cereus es un microorganismo saprofito aislado con frecuencia en alimentos. Su capacidad para producir endosporas, la existencia de cepas psicrtrofas y la produccin de toxinas (emtica y diarrica), suponen un grave problema en la conservacin y seguridad de los alimentos. En este trabajo se ha estudiado el efecto de la bacteriocina AS-48 sobre la produccin de enterotoxina por una cepa psicrtrofa de B. cereus. MTODOS La bacteriocina AS-48 fue purificada a homogeneidad mediante cromatografa de intercambio catinico (CM-25) y HPLC de fase reversa (C18). La produccin de enterotoxina se valor mediante aglutinacin forzada con ltex (Kit BCET-RPLA, Oxoid). RESULTADOS En primer lugar se ha determinado la relacin entre el crecimiento de la bacteria y la produccin de enterotoxina por la cepa psicrtrofa LWL1 de B. cereus. Esta bacteria produce altos niveles de enterotoxina durante su crecimiento a 28 C en medio lquido BHI desde las 6 h de incubacin, alcanzando ttulos mximos a las 24 h. La concentracin mnima bactericida (CMB) frente a esta bacteria, definida como la mnima cantidad de bacteriocina que produce la muerte del 99,9% de la poblacin inicial, tras 24 h de incubacin a 28 C, fu de 10 g/ml de AS-48. La adicin de concentraciones crecientes de AS-48 al comienzo de la fase logartmica redujo, de forma proporcional a la cantidad de bacteriocina adicionada, el crecimiento bacteriano y los niveles de enterotoxina alcanzados con posterioridad por el cultivo. Cuando se emplearon concentraciones subinhibidoras para el crecimiento de la bacteria (2,5 y 5 g/ml) se produjo un retardo del crecimiento exponencial y a la vez una marcada inhibicin en la produccin de enterotoxina, obtenindose niveles cuatro veces inferiores a los del control, a pesar de que los cultivos -despus de un periodo de retraso- alcanzaron la fase estacionaria. Adems, los niveles de enterotoxina disminuyeron progresivamente a lo largo del tiempo de incubacin, hasta llegar a valores mnimos a las 72 h. Para comprobar que el decenso en los niveles de la enterotoxina no era debido a interacciones de esta protena con la bacteriocina, se estudi el efecto de AS-48 sobre cultivos en fase estacionaria con altos ttulos de la misma. La adicin de AS-48 (5 g/ml) no modific los ttulos de enterotoxina detectados en el sobrenadante. CONCLUSIONES AS-48 inhibe la capacidad enterotoxicognica de B. cereus LWL1, incluso cuando se emplea a concentraciones 3 veces inferiores a la CMB previamente establecida. La desaparicin de la enterotoxina detectada no se debe a la existencia de interacciones entre ambas protenas.

.199.

MIS/26

VALIDACION DE UN METODO INMUNOENZIMATICO PARA LA DETERMINACION DE Listeria monocytogenes

M. Zamorano, R., de Luna, M.A. Garcia, MJ. Rex. Dpto. Microbiologa. Centro Tecnolgico Nacional de la Conserva C/ Concordia s/n, 30500-Molina de Segura, Murcia. OBJETIVOS Las enfermedades transmitidas por alimentos son uno de los mayores problemas de salud pblica y entre los agentes etiolgicos ms importantes ltimamente destaca Listeria monocytogenes. Los mtodos clsicos para detectar L monocytogenes se basan en preenriquecimiento con diferentes caldos y posterior siembra en agar selectivo, para finalmente confirmar mediante pruebas bioqumicas las colonias tpicas. La utilizacin de tcnicas inmunoenzimticas aporta una especificidad a la deteccin que no tienen los mtodos clsicos, es por lo que en una primera fase validamos el test inmunoenzimtico miniVidas de la casa bioMerieux, realizando la identificacin de L. monocytogenes mediante dos preenriquecimientos con caldo Fraser, deteccin con equipo inmunoenzimtico, y confirmacin de las colonias tpicas de Oxford o Palcam mediante API-Listeria. MTODOS Para realizar esta validacin, se utilizaron cepas de L. monocytogenes e innocua de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT), as como cpsulas de concentracin conocida 5 pfc/cpsulas de L. monocytogenes procedentes del Laboratorio de Microbiologa de Aguas y Alimentos, Instituto de Salud Pblica de Holanda (RIVM). En una segunda fase de la validacin, partiendo de cepas procedentes de la CECT de Listeria monocytogenes, innocua, welshimeri, seeligeri, ivanovii y grayi se estudi Especificidad mediante mezclas de varias especies, Precisin repitiendo al menos siete veces la determinacin, Lmite de Deteccin mediante diluciones de la cepa y Ensayos en Blanco. RESULTADOS Los resultados indicaron que la nica especie de Listeria que da resultados positivos con el equipo inmunoenzimtico es L. monocytogenes, mientras que el resto de especies no son identificadas como L. monocytogenes, al tiempo que concentraciones de unos 5 ufc/ml son detectadas por el equipo. CONCLUSIN Esta validacion nos supondr un ahorro de tiempo al realizar el ensayo, as como evitar falsos negativos, debidos a la identificacin con API de muestras que contengan ms de una especie de Listeria.

.200.

OTROS

.201.

.202.

O/1

PRODUCCIN DE AMINAS BIGENAS DURANTE Y DESPUS DE LA FERMENTACIN MALOLCTICA EN VINO

Carb R. (1), Centelles E. (1), Hurtado E. (1), Casero M. (1), Castro J.J. (1), Sancho J. (2) (1) Escola Superior dAgricultura de Barcelona. Urgell, 187, 08036 Barcelona (2) Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad de Barcelona. Trabajo realizado con la financiacin del proyecto CICYT nALI96-0682

OBJETIVOS Se evala la produccin de aminas bigenas por parte de bacterias lcticas durante y despus de la fermentacin malo-lctica (FML) en un vino. MTODOS La experiencia se realiza con 8 bacterias lcticas seleccionadas e inoculndolas en concentraciones superiores a 107 ufc/ml en un vino tinto de pH 3.2, 10% de etanol, 30 mg/L de sulfuroso total y 4 g/L de cido mlico. Se determina la poblacin viable realizando recuentos en placa a los 0, 1, 2 , 7 y 20 das. Adems se comprueba la realizacin de la FML efectuando determinaciones enzimticas de los cidos L(-)mlico y L(+)lctico a los 0, 2 y 20 das. Por ltimo y paralelamente, se cuantifica la produccin de histamina, metilamina, etilamina, tiramina, feniletilamina, cadaverina y putrescina, en el vino a las 0 horas y al cabo de 1, 2, 20, 30 y 60 das. Esta determinacin se realiza por cromatografa lquida de alta resolucin con derivatizacin automtica en la pre-columna con OPA y detector de fluorescencia. El mtodo de cuantificacin utilizado es la adicin de patrn. RESULTADOS La supervivencia de bacterias en vino vara en funcin de la cepa. La mayor parte de degradacin de mlico y formacin de lctico se produce en las primeras 48 horas de fermentacin, a partir de aqu la transformacin continua aunque a un ritmo menor. En ningn caso se consigue la degradacin total, hecho que coincide con otras experiencias realizadas. El porcentaje de degradacin del cido mlico oscila entre un 52 y un 60,5% . La mayor eficiencia la consiguen las cepas Lactobacillus plantarum (R3) y Leuconostoc oenos (R7), bacterias que presentan una mejor viabilidad en el vino. Se han obtenido pocas diferencias entre las aminas analizadas, y en la mayora de los casos las concentraciones se encuentran en el lmite de deteccin del mtodo. Durante la realizacin de la FML no se detecta un incremento en la produccin de las aminas estudiadas. A los 20 das, finalizada la FML, se cuantifican ligeros aumentos de concentracin de 4 de las aminas estudiadas y que son: histamina, tiramina, cadaverina, y sobre todo putrescina. Esta ltima, es de todas las aminas analizadas la que sufre un aumento superior y se corresponde tambin con valores iniciales superiores. Los valores concuerdan con los encontrados en la bibliografa y en todos los casos estn por debajo de los pocos valores fijados por la legislacin de los pases que la tienen. A los 30 y 60 das no se produce incremento de aminas e incluso parece que a los 60 das se produce una ligera disminucin respecto a los 20 das. Referente a las cepas, destaca Pediococcus pentosaceus (P5) que es la que sintetiza mayor cantidad de putrescina y tambin de cadaverina. Le sigue la cepa Leuconostoc oenos (6) sintetizadora de putrescina e histamina. Y finalmente la cepa Lactobacillus brevis (3) productora de histamina y tiramina. CONCLUSIONES Las bacterias lcticas seleccionadas producen bajas concentraciones de aminas bigenas en vino, y nunca durante la FML. La produccin es posterior a la FML, aunque no se han detectado las condiciones precisas en las que se producen.

.203.

O/2

COMPARACIN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE PRODUCTOS DE USO DOMSTICO

Galn Alejo, L.C.; Herrador Crdenas, F.; Hernndez Herrero, M.M. y Rodrguez Jerez, J.J. Higiene e Inspeccin de los alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Autnoma de Barcelona, 08193. Bellaterra (Barcelona). ESPAA OBJETIVOS Los datos epidemiolgicos que poseemos en nuestro pas sealan que la mayor parte de los brotes de toxiinfecciones alimentaria se desencadenan en el mbito domstico. Debido a ello, cada vez ms se estn desarrollando formulaciones qumicas con actividad desinfectante para ser utilizadas en el hogar. La mayora de los productos desarrollados tienen como objetivo el actuar como bactericidas. Sin embargo, poco se estudia respecto a su posible actividad fungicida (tanto destruccin de mohos como levaduras). Hay que destacar que en este grupo nos encontramos a microorganismos patgenos, como Candida albicans y otros alterantes, que pueden crecer en superficies como paredes, suelos y lugares de difcil acceso. Por este motivo, nuestro trabajo pretende comparar la actividad fungicida de los desinfectantes utilizados en el mbito domstico, para conocer su eficacia real y su aplicabilidad. MTODOS Para el desarrollo de nuestro estudio se ha aplicado la norma de referencia EN-1275, de aplicacin internacional, para la evaluacin de la actividad fungicida bsica, bajo condiciones limpias. En esta norma se utilizan dos microorganismos de referencia: Candida albicans, como levadura, y Aspergillus niger, como moho. Se han utilizado productos comerciales (6 en total), de uso domstico, a concentraciones y temperaturas habituales de uso. Al mismo tiempo, se ha adaptado la metodologa a una tcnica impedanciomtrica, para poder automatizarla y permitir una deteccin de la actividad desinfectante en un menor tiempo. RESULTADOS Nuestros resultados sealan que la leja es el producto que presenta una mayor actividad fungicida, tanto para levaduras como para esporas de mohos. Con este producto se consigue una reduccin de ms de 5 unidades logartmicas de recuento en menos de 5 minutos de contacto. De los diferentes productos estudiados, el que manifestaba una menor actividad contra Candida albicans, fue el perxido de hidrgeno, probablemente debido a su potente actividad catalsica. El resto de productos poseen una actividad desigual, dependiendo de la concentracin, el tiempo de exposicin y el microorganismo utilizado. Al mismo tiempo, hemos constatado la aplicabilidad de la impedancia como sistema para evaluar el recuento de estos microorganismos y poder evaluar la eficacia fungicida de diferentes sustancias en un menor tiempo y con una mayor eficacia. CONCLUSIONES - El producto con un ms amplio espectro fungicida es la leja, con gran diferencia respecto al resto. - El perxido de hidrgeno no debera ser empleado para la desinfeccin de elementos contaminados con Candida. Otros productos poseen una actividad desigual dependiendo de las condiciones del ensayo. - Es posible la adaptacin de la metodologa estndar a otra rpida, con una reduccin del tiempo de incubacin y una simplificacin de las pruebas a realizar.

.204.

O/3

A. Hernndez1 , B. Martnez1, J.A. Ayala2, A. Rodrguez1 y J.E. Surez1,3. Instituto de Productos Lcteos de Asturias-CSIC. Ctra. Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa (Asturias). 2 Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa, Univ. Autnoma de Madrid. Canto Blanco, 28049 Madrid. 3 Dpto. de Biologa Funcional, Univ. de Oviedo. C/ Julian Clavera s/n, 33006 Oviedo (Asturias).
1

MODO DE ACCIN DE LA LACTOCOCINA 972, BACTERIOCINA PRODUCIDA POR Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA972.

OBJETIVOS El presente trabajo tiene como finalidad profundizar en el modo de accin de la bacteriocina Lactococina 972 (Lcn 972) secretada por Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA972, cepa aislada y caracterizada en nuestro laboratorio. El efecto bactericida de esta bacteriocina es debido a un mecanismo diferente al de aquellas bacteriocinas formadoras de poros, ya que los primeros estudios realizados sobre el modo de accin de la lactococina 972 sugeran una actividad bactericida de la misma que pareca afectar a la sntesis de la pared celular de las bacterias sensibles a la misma1. MTODOS Para el ensayo de marcaje y deteccin de PBPs (penicillin binding proteins) se utiliz como agente de deteccin Bocillin FL (penicilina fluorescente). Se aislaron las membranas y se marcaron con dicho compuesto, sometindose las muestras a electroforesis SDS-PAGE. Para visualizar las PBPs se escanearon directamente los geles con un Storm (Molecular Dynamics). Para conocer si Lcn 972 tena afinidad por alguna PBP se realizaron experimentos de competicin indirecta entre el compuesto Bocillin FL y la lactococina. Para determinar si el modo de accin de Lcn 972 es similar al del antibitico vancomicina se utiliz el tripptido antagonista de la misma N-N-diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala [(Ac)2KAA]. Para ello se incubaron las clulas en presencia de diferentes concentraciones de bacteriocina que haba sido incubada con un exceso molar del tripptido. Se midi la OD600 tres horas despus de la adicin de la mezcla a una suspensin de clulas sensibles (L. lactis MG1614). RESULTADOS El patrn de PBPs de L. lactis subsp. lactis IPLA972, as como el de L. lactis subsp. lactis MG1614 y R2 (L. lactis MG1614 con el plsmido pBL1 que codifica para la produccin e inmunidad de Lcn 972) eran similares, encontrndose para el compuesto Bocillin FL: PBP1, PBP2a, 2b y 2c, PBP3, PBP4 y PBP5, cuyos pesos moleculares oscilan entre 99 y 43 KDa. Al realizar el ensayo de competicin indirecta se observ una inhibicin en la unin del compuesto Bocillin FL a PBP4 (51,9 KDa). El ensayo con el tripptido revel que ste antagonizaba parcialmente la accin de la Lcn 972 sobre las clulas sensibles, no encontrndose en ningn caso una inhibicin total de dicha accin. CONCLUSIONES El presente estudio parece reforzar la hiptesis del efecto de la bacteriocina sobre la sntesis de la pared celular, en el que las protenas de unin a penicilina podran estar implicadas. Tambin podemos concluir que el mecanismo de accin de Lcn 972 difiere a nivel molecular del de la vancomicina.
1

B. Martnez, J.E. Surez y A. Rodrguez. Lactococcin 972: a homodimeric lactococcal bacteriocin whose primary target is not the plasma membrane. Microbiology. 1996, 142: 2393-2398.

.205.

O/4

DESARROLLO DE UNA TCNICA RPIDA PARA LA EVALUACIN DE PRODUCTOS CON ACTIVIDAD DESINFECTANTE.
Herrador Crdenas, F.; Hernndez Herrero, M.M.; Galn Alejo, L.C y Rodrguez Jerez, J.J. Higiene e Inspeccin de los alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Autnoma de Barcelona, 08193. Bellaterra (Barcelona). ESPAA OBJETIVOS Debido a la creciente demanda de productos de alta efectividad en la limpieza y desinfeccin a nivel industrial y de productos antibacterias por parte del consumidor de a pie, hace necesaria la obtencin de una metodologa rpida, sencilla y barata para la evaluacin de la eficacia desinfectante, en suspensin y en condiciones de alta suciedad, de productos desinfectantes dirigidos al mbito industrial y domstico. Dicha metodologa debe permitir un mayor grado de conocimiento de los productos ya existentes, de las nuevas formulaciones, y un rpido desarrollo de las mismas. MTODOS Esta metodologa se basa en la combinacin de tcnicas impedanciomtricas (Bactometer) y las tcnicas referenciadas en las Normas internacionales (norma EN-1276, bajo condiciones sucias), utilizando Staphylococcus aureus, como microorganismo de eleccin. Se han utilizado productos comerciales (dieciocho de mbito domstico y nueve de mbito industrial), a concentraciones y temperaturas habituales de uso. RESULTADOS Esta metodologa permite obtener resultados en 12-14 horas, como mximo, desde el inicio del ensayo, con lo que se reduce a menos de la mitad, el tiempo necesario para la evaluacin de la eficacia de los desinfectantes. Adems se ha comprobado que los productos basados en hipoclorito son los ms eficaces, seguidos de los basados en amonios cuaternarios y glutaraldehido respectivamente. CONCLUSIONES La metodologa desarrollada es rpida, sencilla y barata, en comparacin con mtodos tradicionales de evaluacin de desinfectantes. Esta metodologa a diferencia de los mtodos tradicionales de evaluacin de la eficacia desinfectante, permite la evaluacin, no slo de destruccin, sino tambin de lesin celular; profundizando en el conocimiento de los productos. Al aplicarse a todos los productos desinfectantes la misma metodologa permite comparar diferentes productos basados en distintas formulaciones.

.206.

O/5

DESARROLLO DE UNA TCNICA IMPEDANCIOMTRICA PARA LA DETECCIN DE RESIDUOS DE ANTIBITICOS EN CARNES

Lpez-Cabanillas Lomel, M.; Roig Sagus, A.X. y Rodrguez Jerez, J.J. Higiene e Inspeccin de los alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Autnoma de Barcelona, 08193. Bellaterra (Barcelona). ESPAA OBJETIVOS La influencia de los residuos de antibiticos en los alimentos es cada vez ms importante como factor desencadenante de antibioresistencias bacterianas. El principal problema reside en el empleo de antibiticos en la alimentacin animal, para su engorde, o para el tratamiento de diferentes problemas patolgicos, sin aplicar los preceptivos tiempos de espera. Quizs un problema ser el disponer de tcnicas, lo suficientemente precisas, que nos permitan hacer un examen previo para poder discriminar inicialmente entre muestras positivas y negativas. Para ello, una opcin es el empleo de microorganismos sensibles a los antibiticos, que permitan un anlisis sencillo y discriminante. En este caso, el principal problema es el encontrar un microorganismo, lo suficientemente sensible, para poder utilizarse independientemente del residuo de antibitico presente en la carne. Al mismo tiempo, sera interesante el poder desarrollar una tcnica sencilla, que adems nos pueda permitir obtener resultados de una forma rpida, en menos de 4 horas. Por estos motivos, con nuestro estudio hemos pretendido desarrollar una tcnica rpida, de tipo microbiolgico, que en menos de 4 horas nos permita determinar la presencia de residuos de antibiticos en carnes de consumo. MTODOS Para el desarrollo de nuestro estudio se ha empleado una cepa de referencia de Bacillus stearothermophilus CECT 47. Esta cepa se ha calibrado por espectrofotometra e impedancia para la estimacin rpida de su recuento. Una vez calibrada, se inocul una concentracin constante del microorganismo (1 x 107 ufc/ml), procedindose al calculo de la concentracin de antibitico en base a la inhibicin o retardo que se produce en el tiempo de deteccin esperado. RESULTADOS Nuestros resultados sealan que Bacillus stearothermophilus puede ser calibrado con una excelente correlacin a una temperatura de 48C. Al mismo tiempo nuestros resultados indican que la mnima concentracin de penicilina que puede ser detectada es de 1 ng/g de carne. Si consideramos que la normativa actualmente vigente seala 5 ng/g como concentracin mxima aceptable en la carne, podemos ver que con nuestro mtodo, podramos estar en condiciones de detectar la presencia de concentraciones de este antibitico por debajo y por encima de los niveles aceptables. CONCLUSIONES - Nuestros resultados confirman algunos estudios previos en el sentido que es posible el desarrollo de una tcnica de discriminacin para la deteccin de residuos de antibiticos en carnes en menos de 4 horas. - La bacteria de referencia para la penicilina debera ser Bacillus stearothermophilus, incubando a 48C, debindose comprobar si este microorganismo puede ser empleado para la deteccin de otros antibiticos como bacteria de referencia. - La determinacin sera eficaz, de acuerdo con la normativa vigente, y se podra obtener un resultado fiable en menos de 4 horas, para penicilina, con una mnima manipulacin.

.207.

O/6

LA PGINA WEB DE LA CECT. BSQUEDAS EN LNEA

Lpez-Coronado, J.M. and Uruburu, F. Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universidad de Valencia. Edificio de Investigacin. 46100 Burjassot (Valencia). Espaa. Una de las caractersticas ms importantes de Internet y el World Wide Web es la inmediata accesibilidad a documentos situados en cualquier parte el mundo. Este hecho facilita la transferencia de informacin entre investigadores, industrias, universidades, etc. Puesto que una de las principales funciones de las colecciones de cultivos es, adems de mantener y enviar cepas microbianas, el dar informacin acerca de las misma, la WWW es una herramienta muy til y potente para este objetivo. Durante el ltimo ao hemos estado desarrollando la pgina web de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). En una primera etapa publicamos informacin acerca de nuestras instalaciones, plantilla, una breve historia y los servicios ofrecidos por la CECT. Ahora hemos acabado la herramienta de software necesaria para consultar nuestros catlogos, y desde el pasado uno de Marzo, la gente de los centros de investigacin, universidades e industrias de todo el mundo tienen la posibilidad de hojear nuestros catlogos en lnea y de llevar a cabo bsquedas en los mismos. La pgina web de la CECT se puede consultar en la siguiente direccin de Internet: http://www.uv.es.cet

.208.

O/7

SELECCIN DE UNA CEPA SILVESTRE DE Lactococcus lactis PARA SU UTILIZACIN COMO CULTIVO INICIADOR INDUSTRIAL.
1

C. Madera1,2, P. Garca1, A. Rodrguez1 y J. E. Surez2. Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC). Ctra. de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa. 2 Dpto. Biologa Funcional. Universidad de Oviedo. C/ Julin Clavera s/n, 33006 Oviedo.

OBJETIVOS Se llev a cabo la caracterizacin tecnolgica y gentica de 32 cepas de Lactococcus lactis resistentes a la infeccin por bacteriofagos, y en ellas se determin el tipo de mecanismo de resistencia que poseen. Se pretende as seleccionar una cepa silvestre de L. lactis resistente a la infeccin por bacteriofagos y que posea, a la vez, buenas cualidades tecnolgicas para ser utilizada como un cultivo iniciador industrial en fermentaciones lcteas. MTODOS La caracterizacin gentica de las cepas anteriormente seleccionadas por su resistencia a fagos se realiz mediante el estudio de sus perfiles plasmdicos y el anlisis de los perfiles de restriccin cromosmica por PFGE. La determinacin de los mecanismos de resistencia que poseen las cepas se realiz mediante PCR e hibridaciones con oligonucletidos y sondas diseadas para localizar 6 mecanismos de infeccin abortiva y otro ms de restriccinmodificacin. Se llevaron a cabo fermentaciones paralelas con y sin adicin de bacteriofago en leche pasterizada, y en ellas se midi la evolucin del pH, de la acidez y se hizo el recuento de viables (ufc/ml) y de fagos (ufp/ml) durante 8 horas de incubacin. RESULTADOS Tras la caracterizacin tecnolgica de una coleccin de 32 cepas de L. lactis resistentes a bacteriofagos, se procedi a su caracterizacin gentica agrupando las cepas en 14 grupos respecto a su perfil plasmdico y en 9 grupos de restriccin cromosmica diferentes. La bsqueda de mecanismos de resistencia revel la inhibicin de la adsorcin de fago como forma de proteccin a la infeccin de la mayor parte de las cepas. Adems, 19 de ellas posean un mecanismo de resistencia complementario del tipo infeccin abortiva: AbiB (17), AbiI (1) y AbiG (1). Con estos datos, junto con los obtenidos anteriormente respecto a la aptitud tecnolgica de las cepas, se seleccion la cepa L. lactis IPLA 731 para ser utilizada como cultivo iniciador de cepa nica en fermentaciones paralelas en leche con adicin de fago y sin l. Los cultivos a los que se aadi bacteriofago (104 pfu/ml) no mostraron diferencias en cuanto a la evolucin de pH, la acidez y nmero de viables (ufc/ml) respecto a un cultivo control sin fago. Adems, el nmero de fagos (ufp/ml) se mantuvo constante a lo largo de la incubacin. Al contrario, la cepa sensible a la infeccin por bacteriofago, L. lactis MG1614, no es capaz de crecer en presencia de ste, como muestran los valores invariables de pH y acidez en el cultivo con fago durante las 8 horas de incubacin. Adems, el nmero de viables disminuye ya a las 2 h ms de tres rdenes de magnitud, a la vez que el nmero de fagos aumenta de 104 a 1010 ufp/ml en ese mismo tiempo. CONCLUSIONES Se confirm el fenotipo de resistencia a bacteriofagos en condiciones de fermentacin de la cepa L. lactis IPLA 731, seleccionada por sus aptitudes tecnolgicas y por poseer valores nulos de adsorcin y un mecanismo complementario de resistencia (AbiB). Las fermentaciones en leche de cultivos resistentes infectados con fago no mostraron diferencias respecto a un cultivo control sin fago, mientras que una cepa sensible a la infeccin es incapaz de dar lugar a un producto fermentado de la calidad deseada.

.209.

O/8

PURIFICACIN, RECONSTITUCIN Y CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE LmrA, UNA PROTENA DE MEMBRANA DE Lactococcus lactis IMPLICADA EN LA RESISTENCIA A ANTIBITICOS Y COMPUESTOS CITOTXICOS.
Abelardo Margolles*, Monique Putman, Hendrik W. van Veen y Wil Konings. Departamento de Microbiologa, Universidad de Groningen, Kerklaan 30, Haren, 9750AA, Holanda. URI: http://www.biol.rug.nl * Direccin actual: Instituto de Productos Lcteos de Asturias, (CSIC) Carretera de Infiesto s/n, 33300, Villaviciosa, Asturias. OBJETIVOS Lactococcus lactis posee un sistema de transporte dependiente de ATP denominado LmrA (Lactococcus multidrug resistant ATP-dependent protein) que est implicado en la resistencia a diferentes compuestos citotxicos, incluidos algunos antibiticos. Este transportador est formado por 590 aminocidos organizados en dos dominios: (i) un dominio hidrofbico en el extremo amino terminal formado por 6 segmentos transmembrana y (ii) un dominio hidroflico que contiene el sitio de unin a ATP. Su estructura primaria indica una elevada homologa con numerosas protenas, tanto de eucariotas como de procariotas, implicadas en "multidrug resistance (MDR)". El objetivo de este trabajo es el estudio funcional de LmrA en una forma aislada, sin la influencia de otras protenas de membrana o compuestos citoplasmticos que puedan influir sobre la actividad del transportador. MTODOS Se introdujo una cola de histidinas en el extremo amino terminal con el objeto de facilitar la purificacin de LmrA por cromatografa de afinidad. La protena resultante se expres en Lactococcus lactis utilizando el sistema NICE (NIsin-Controlled gene Expression system), en el que el gen estructural se localiza bajo el control del promotor de la nisina. Para reconstituir LmrA en una membrana lipdica la protena se solubiliz con el detergente dodecil maltsido (DDM), se purific utilizando cromatografa de afinidad de nquel y se reconstituy en liposomas preparados con fosfolpidos de Lactococcus lactis. El detergente se elimin por adsorcin utilizando Bio-Beads SM2. Para los ensayos de transporte se emplearon sustratos fluorescentes (Hoechst-33342, C6-NBD-PE y C6-NBD-PC), los cuales permiten un seguimiento continuo del proceso de transporte. RESULTADOS El sistema NICE permiti obtener niveles de expresin de LmrA del orden de 30-35% de la protena total de membrana. La protena es expresa en forma funcional, como demuestran los ensayos de actividad realizados en clulas y en vesculas de membrana de Lactococcus lactis. La purificacin por cromatografa de afinidad de nquel nos permiti obtener aproximadamente 1,2 mg de LmrA partiendo de 15 mg de protena total de membrana. Para la reconstitucin de la protena, los liposomas se desestabilizaron y titularon utilizando como detergente DDM, mezclndose posteriormente con una solucin de LmrA en proporciones adecuadas. La protena incorporada en los liposomas es funcional y es capaz de transportar diferentes sustratos tpicos de MDR transportadores, tales como drogas anticancergenas (Hoechst-33342 y vinblastina), as como derivados fluorescentes de lpidos (C6-NBD-PE). CONCLUSIONES LmrA puede sobreexpresarse en Lactococcus lactis y purificarse utilizando DDM como detergente. La protena es activa cuando se encuentra reconstituida en liposomas preparados con fosfolpidos de Lactococcus lactis.

.210.

O/9

EFECTO DEL pH DEL MEDIO EN EL COMPORTAMIENTO DE LOS TEST BIOLGICOS (B. stearothermophilus var. calidolactis) DE DETECCIN DE ANTIBITICOS.
M. Martnez, D. Sanz, R. Pagn y S. Condn. Dpto. Produccin Animal y Ciencia de los Alimentos. Univ. de Zaragoza. C/ Miguel Servet 177, 50013, Zaragoza. OBJETIVOS La deteccin de residuos de medicamentos en la leche tiene extraordinaria importancia dadas sus repercusiones en la Salud Pblica y sus efectos sobre algunos procesos tecnolgicos de transformacin. Los mtodos de deteccin ms usados se basan en la inhibicin del crecimiento de B. stearothermophilus var. calidolactis, estimado a partir de halos de inhibicin o de cambios fisico-qumicos (potencial redox, pH) del medio de cultivo. El pH del medio determina la sensibilidad frente a los diferentes antibiticos y sulfamidas, pero tambin la actividad metablica del microorganismo y, por tanto, el tiempo de lectura del test. ste ltimo aspecto ha sido muy escasamente estudiado. El objetivo de esta investigacin fue determinar la influencia del pH inicial del medio de deteccin sobre el tiempo de anlisis y la sensibilidad de los esporos de B. stearotermophilus var. calidolactis frente penicilina G, oxitetraciclina y sulfonamida. MTODOS La suspensin de esporos de B. stearothermophilus 10149 (var. calidolactis) se prepar a partir de placas de agar nutritivo (AN) suplementado con 3 mg/l de sulfato de manganeso incubadas a 55C durante 24 h. El nmero de esporos viables se estim mediante recuentos en placa de muestras pasterizadas (100C/5 min) de la suspensin. La sensibilidad a la penicilina, oxitetraciclina y sulfonamida se determin utilizando el mtodo del disco en placa. La velocidad de acidificacin se evalu en tubos de caldo nutritivo suplementado con 500 ppm de glucosa y 75 mg/l de prpura de bromocresol, inoculados con 2 x 106 esporos/ml, alcalinizados o acidificados a diferentes pHs con ClH o NaOH (O.1 N), e incubados a 65C durante distintos tiempos. RESULTADOS El pH del medio de deteccin determina la sensibilidad de B. stearothermophilus var. calidolactis, tanto a la presencia de penicilina como la de oxitetraciclina y sulfonamida. El dimetro del halo de inhibicin (DHI) de los discos impregnados de penicilina G fue aproximadamente un 30% superiores a pH 7,6 que a pH 6. Los DHI producidos por los discos con sulfonamida a pH 8 prcticamente duplicaron a los observados a pH 6. Por el contrario, los DHI producidos por los discos con oxitetraciclina resultaron ser un 30% aproximadamente superiores en el medio de pH 6 que en el de pH 8. La velocidad de acidificacin aumentaba con el pH inicial del medio. En consecuencia, cuando se utiliza como indicador del crecimiento el cambio del color, de prpura a amarillo, el tiempo de anlisis resultaba ser prcticamente el mismo en medios de pHs iniciales de 6,5 y 7 (3 horas). A pHs inferiores, el ritmo de acidificacin era progresivamente menor y, por tanto, los tiempos de anlisis se alargaron hasta 3,5 horas para unpH inicial de 6,25 y 4 horas para pH 6. A pHs de 5,75 e inferiores el esporo fue incapaz de germinar y, por tanto, de acidificar el medio. CONCLUSIONES El pH del medio de deteccin modifica la sensibilidad de los esporos de B. stearothermophilus var. calidolactis frente a los residuos de antibiticos y el tiempo de anlisis. Aquellas pruebas desarrolladas en medios de deteccin con pHs iguales o superiores a 7 sern ms rpidos y presentarn una mayor sensibilidad a las sulfamidas. Por el contrario, la sensibilidad frente a la oxitetraciclina aumentar con la acidificacin del medio aunque prolongar el tiempo de anlisis. La utilizacin de pHs iniciales inferiores a 6 puede dar lugar a la aparicin de falsos positivos.

.211.

O/10

CRECIMIENTO DE Aeromonas hydrophila EN ATMOSFERAS MODIFICADAS

C. Pin, C.L. Quintero, R. Velasco de Diego y G. Garca de Fernando. Dpto. Higiene y Tecnologa de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense. 28040. Madrid OBJETIVOS Estudiar la seguridad de alimentos envasados en atmsferas modificadas y susceptibles de estar contaminados con A. hydrophila. METODOS El comportamiento de A. Hydrophila CECT 398 se estudi en el intervalo de temperatura 1.5-11C, bajo atmsferas que contenan entre 0-80% de dixido de carbono y 0-60% de oxgeno y un porcentaje variable de nitrgeno para completar el 100% del volumen de gas. Los experimentos se realizaron inoculando A. hydrophila en caldo triptona soja contenido en botellas hermticas en las que previamente la atmsfera haba sido modificada. Tanto la inoculacin como la toma de muestras se realiz, aspticamente, a travs de un disco de silicona situado en el tapn de la botella. Los parmetros de crecimiento se estimaron utilizando el modelo de Baranyi y Roberts (1994, Int. J. Food Microbiol. 23:277-294). La relacin entre el logaritmo natural de la tasa mxima especfica de crecimiento y los factores ambientales (temperatura, oxgeno y dixido de carbono) se model empleando un polinomio de segundo grado en el que los coeficientes de los trminos (O2)2 y (CO2)2 eran iguales a cero. Las tasas de crecimiento predichas por el modelo se compararon con las tasas de crecimiento observadas en diferentes tipos de pescados envasados en atmsferas modificadas. RESULTADOS El crecimiento de A. hydrophila a 1.5C se detect nicamente bajo atmsferas con 100% de nitrgeno. En el resto de temperaturas, el crecimiento se detect en todas las atmsferas empleadas. Cuanto mayor fue la concentracin de CO2 en la atmsfera, ms lento fue el crecimiento de A. hydrophila. El oxgeno inhibi significativamente el crecimiento de A. hydrophila en las condiciones estudiadas. El modelo matemtico incluy, por tanto, las tres variables en estudio, temperatura, dixido de carbono y oxgeno. En el pescado la velocidad de crecimiento de este microorganismo fue siempre inferior a la velocidad de crecimiento de la flora alterante. La discrepancia entre las predicciones y las observaciones en pescado fue del 55%, mientras el porcentaje de sesgo fue del 39%, es decir, las predicciones dadas por el modelo fueron, en media, un 39% ms altas que las tasas de crecimiento observadas en pescado. Eliminando el sesgo del modelo, es decir, corrigiendo el modelo para insesgadez en pescado, la discrepancia se reduce al 33% que se acerca al 25% de error tpico estimado para la tasa mxima especfica de crecimiento con las observaciones empleadas para ajustar el modelo. CONCLUSIONES Los modelos matemticos de crecimiento desarrollados para A. hydrophila en sistemas controlados reflejan con precisin el comportamiento de este microorganismo en alimentos. A. hydrophila crece a temperaturas de refrigeracin bajo atmsferas enriquecidas en CO 2 y O2 pero ms lentamente que en atmsferas no modificadas.
AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen la financiacin de la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa (CICYT, Project ALI99-0405) y la Comunidad Autnoma de Madrid (CAM, Project 6703).

.212.

O/11

EVALUACION DEL NUEVO TEST ECLIPSE PARA DETECCION DE ANTIBIOTICOS EN LECHE.

D. Sanz, M. Martnez, R. Pagn y S. Condn. Dpto. Produccin Animal y Ciencia de los Alimentos. Univ. de Zaragoza. C/ Miguel Servet 177, 50013 Zaragoza. OBJETIVOS Es posible detectar la presencia de diversos inhibidores en leche por tcnicas inmunoqumicas, enzimticas, etc., pero por su simplicidad, bajo coste y amplio espectro, las basadas en la inhibicin del crecimiento microbiano siguen siendo las ms ampliamente utilizadas en nuestros das. Las tcnicas del disco en placa presentan el inconveniente de su laboriosidad que impide su uso sistemtico para la realizacin de pruebas rutinarias tanto en centros oficiales de control como en los propios laboratorios de las industrias lcteas. Para subsanar esta limitacin se han lanzado al mercado diversos mtodos basados en detectar los cambios inducidos por la actividad microbiana (potencial redox, pH) en diversos medios, en presencia de la muestra de leche. Estos mtodos utilizan normalmente microplacas lo que posibilita la automatizacin de los anlisis y ha generalizado su uso. Recientemente ha sido comercializado un nuevo test de este tipo (Eclipse) fabricado ntegramente en nuestro pas. El objeto de esta investigacin ha sido evaluar el umbral de sensibilidad del test Eclipse frente a penicilina G y oxitetraciclina. METODOS Las placas de anlisis Eclipse 100 fueron suministradas directamente por el fabricante (ZEU-Inmunotec; Zaragoza). Las soluciones de penicilina G (Sigma) y oxitetraciclina (Sigma) se prepararon diluyendo en agua destilada hasta alcanzar concentraciones de 1, 2, 3, 4 g/l y 50, 150, 200 g/l respectivamente. Se inocularon 88 pocillos de cada microplaca para cada concentracin, utilizndose los 8 restantes como referencia. Las placas se incubaron en baos termostatados a 65C en las condiciones establecidas por el fabricante y las lecturas se realizaron visualmente cada 10-15 minutos a partir de las dos primeras horas de incubacin. RESULTADOS El umbral de sensibilidad del test est determinado por el tiempo de incubacin. En todos los casos, los pocillos de referencia alcanzaron un color amarillo intenso (Abs a 570m 0,3) transcurridas 2,5 horas de incubacin, momento en que el 100% de las muestras conteniendo 1 g/l y el 25% de las que contenan 2 g/l de penicilina G dieron resultados negativos a la presencia de antibiticos. Transcurridos 15 minutos, el 97 % de las muestras conteniendo 2 g/l y el 3% de las que contenan 3 g/l de penicilina G haban virado a amarillo (muestra negativa a la presencia de antibiticos). Una incubacin adicional de otros 15 minutos aument el porcentaje de muestras negativas correspondientes a la concentracin 3 g/l de penicilina G hasta el 9% aproximadamente. En todos los casos el 100% de las muestras conteniendo 4 g/l de penicilina fueron detectadas. De forma similar, tras 2,5 horas de incubacin el 100% de las muestras de referencia y el 6% de las que contenan 50g/l de oxitetraciclina viraron a amarillo. Para esta concentracin del antibitico el porcentaje de muestras negativas aument tras 10 minutos adicionales de incubacin hasta el 43%, tras 20 minutos al 80% y tras 30 minutos hasta el 100%. En todos los casos e independientemente del tiempo de incubacin se detect la presencia de 150 y 200 g/l de oxitetraciclina. CONCLUSION El test Eclipse resulta adecuado para la deteccin de penicilina G y oxitetraciclina. El umbral de sensibilidad se sita entre 3 y 4 g/l para la penicilina G y en 150 g/l para la oxitetraciclina. Hemos estimado que el tiempo ptimo de incubacin, previo a la lectura, se sita entre las 3 h y 3h 15 minutos.

.213.

.214.

PROBITICOS

.215.

.216.

PRO/1

INHIBICIN DE ENTEROPATGENOS POR CEPAS DE Lactobacillus DE ORIGEN HUMANO

M Fernanda Fernndez, S. Boris y C. Barbs. rea de Microbiologa, Dpto. de Biologa Funcional, Univ. de Oviedo. C/ Julin Clavera, 33006 Oviedo. OBJETIVOS Se pretende estudiar la capacidad de inhibicin del crecimiento in vitro de microorganismos potencialmente patgenos por parte de tres cepas de Lactobacillus de origen humano con propiedades probiticas. MTODOS La interaccin entre los lactobacilos y los diferentes patgenos intestinales se estudi mediante cultivo mixto y tcnicas de inhibicin en placa. Adems, algunos de los resultados fueron comprobados mediante microscopa electrnica. RESULTADOS Se evalu la capacidad antibacteriana de tres cepas de Lactobacillus de origen humano, Lactobacillus acidophilus UO 001, Lactobacillus gasseri UO 002 y Lactobacillus jensenii UO 003, aisladas a partir de mujeres premenopasicas sanas (Hospital Monte Naranco, Oviedo) y caracterizadas en nuestro laboratorio como microorganismos potencialmente probiticos. Los enteropatgenos elegidos fueron Escherichia coli O111, Salmonella choleraesuis serotipo Enteritidis, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens. El crecimiento de las tres enterobacterias estudiadas era inhibido totalmente llegando a tener un recuento de viables nulo en presencia de cualquiera de los tres lactobacilos. Sin embargo Staph. aureus slo es inhibido parcialmente, descendiendo el nmero de viables en presencia de los lactobacilos varias unidades logartmicas. Cl. perfringens tambin es inhibido por las tres cepas de Lactobacillus. En el caso de las enterobacterias se comprob por mtodos qumicos y se confirm por microscopa electrnica que la sustancia inhibidora era el cido lctico, pero no ocurre lo mismo con Cl. perfringens, por lo que se est estudiando la naturaleza bioqumica de este inhibidor. Por otra parte, actualmente se estn evaluando las aptitudes tecnolgicas de dichas cepas para su potencial utilizacin en alimentos funcionales (leches fermentadas y quesos). CONCLUSIONES Las cepas de Lactobacillus estudiadas adems de las propiedades probiticas que presentan, como resistencia al cido, sales biliares, jugo pancretico, gran capacidad de adherencia a lneas celulares Caco-2 y ausencia de inhibicin de miembros de la microbiota intestinal: Bacteroides fragilis, E. coli no enteropatgeno y Bifidobacterium bifidum, son capaces de inhibir el crecimiento in vitro de enteropatgenos habituales por medio del cido lctico y de alguna sustancia que se est caracterizando actualmente. Una vez realizados los estudios pertinentes in vivo y demostradas sus aptitudes tecnolgicas podran ser unos buenos candidatos para su uso en alimentos funcionales.

.217.

PRO/2

VIABILIDAD DE MICROORGANISMOS PROBIOTICOS DE LOS GENEROS Lactobacillus y Bifidobacterium EN LECHES FERMENTADAS COMERCIALES: TOLERANCIA A ACIDO Y SALES BILIARES.
M. Gueimonde Fernndez y C. Gonzlez de los Reyes-Gaviln. Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC). Ctra. de Infiesto s/n. 33300 Villaviciosa, Asturias. OBJETIVOS Se analiz la viabilidad durante el almacenamiento en refrigeracin de los microorganismos probiticos de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium incluidos en leches fermentadas comerciales. Se estudiaron asimismo in vitro dos propiedades estrechamente relacionadas con la tolerancia al trnsito gastrointestinal de estos microorganismos: la resistencia a pH cido y a sales biliares. METODOS Se llev a cabo un seguimiento a lo largo del almacenamiento en refrigeracin a 4C durante 25 das de microorganismos de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium en 7 tipos diferentes de leches fermentadas comerciales. Con las cepas probiticas aisladas de estos productos se realizaron curvas de resistencia a cido clorhdrico (pH 2,0) y a sales biliares (0,5% Ox Gall). RESULTADOS Tras los 25 das de almacenamiento en refrigeracin las poblaciones de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y del grupo de Lactobacillus acidophilus descendieron ms de un 90% en la mayora de las leches fermentadas que contenan alguno de estos microorganismos, mientras que no hubo una prdida apreciable de viabilidad de Lactobacillus casei en el nico producto analizado en el que se encontraba presente esta especie. El descenso de viabilidad de Streptococcus thermophilus y bifidobacterias oscil entre 0 y 50%. No obstante, los recuentos de lactobacilos probiticos y bifidobacterias en los productos comerciales analizados se mantuvieron por encima de 105 ufc/ml, nivel considerado como mnimo para que los microorganismos probiticos puedan ejercer su efecto beneficioso en el organismo. Aunque la tolerancia a sales biliares fue en general mayor que al pH cido, se detect una amplia variabilidad entre las cepas analizadas. No obstante, las bifidobacterias mostraron en general mayor tolerancia que los lactobacilos tanto al pH cido como a las sales biliares. CONCLUSIONES El nivel de los microorganismos probiticos de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium presentes en las leches fermentadas comerciales analizadas se mantuvo en todos los casos por encima de 105 ufc/ml a lo largo del almacenamiento en refrigeracin del producto. Los lactobacilos del grupo de L. acidophilus mostraron una prdida de viabilidad mayor que las bifidobacterias, siendo tambin las bifidobacterias ms tolerantes que los lactobacilos al pH cido y a las sales biliares.

.218.

PRO/3

D. Prez-Conesa, G. Ros, M.J. Periago, C. Martnez, P. Abelln. Dpto Nutricin y Bromatologa, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia. Campus de Espinardo, 30071 Murcia. Hero Espaa, S.A. Departamento de Investigacin y Desarrollo. Av. Murcia 30820 Alcantarilla, Murcia, Spain OBJETIVOS Determinar el grado de crecimiento y acidificacin del medio de cultivo de diferentes especies de Bifidobacterium mediante la adicin de oligosacridos no digestibles como substratos. Evaluar la viabilidad de la(s) especie(s) de Bifidobacterium seleccionada(s) como la(s) ms adecuada(s), segn el anterior estudio, e incorporada(s) como probiticos en frmulas infantiles a lo largo de su vida comercial. MTODOS Fueron incubadas por separado en anaerobiosis a 37C cuatro especies de Bifidobacterium en el medio de cultivo lquido Triptose Peptone Yeast (TPY), al que se le aadieron diferentes fructooligosacridos (FOS) y galactooligosacridos (GOS) a la concentracin de 1.2%. Cada 24 horas se evalu el crecimiento bacteriano mediante el grado de turbidez del medio a 600nm y la produccin de cidos grasos de cadena corta a travs del descenso de pH del medio de cultivo. El crecimiento de las bifidobacterias (B. bifidum y B. longum) aadidas a la frmula infantil se determin en agar TPY cada 24 horas, as como la humedad de la muestra segn las pautas de administracin recomendadas en el envase. RESULTADOS Con la utilizacin de FOS de cadena corta, inulina (substrato con el que menos crecieron las bifidobacterias, con valores entorno a 108 u.f.c./ml) y oligofructosa, las bacterias que mejor se desarrollaron y ms acidificaron el medio fueron B. breve (la que ms creci con cualquiera de los substratos, 2,6x109 u.f.c./ml) y B. infantis (1,8x109 u.f.c./ml y pH 4.3). Mientras que con GOS todas las bifidobacterias utilizadas alcanzaron su mayor crecimiento (2x109 u.f.c./ml) y la mayor acidificacin del medio (pH<4) la obtuvo con B. longum y B. bifidum. El recuento de bifidobacterias (B. bifidum y B. longum) aadidas a la frmula infantil, durante los das de vida comercial til segn la pauta de administracin referida en el envase (en funcin de la edad del nio) estuvo entre 1,0x107 y 4,3 x109 u.f.c./g para el 4o mes de edad (6 das), 1,0x107 y 2,8x1010 u.f.c./g para el 5o -6o mes de edad (7 dias), 4,0x107 y 4,3x109 u.f.c./g para el 7to -9to mes de edad. (9 das), 3,0x105 y 7,0 x109 u.f.c./g para el 10o -9o mes y 1-3 aos de edad (14 das). Los valores de humedad oscilaron de 8,68 a 13,11% en todas las muestras. CONCLUSIONES El oligosacrido ms adecuado para el desarrollo las bifidobacterias evaluadas fue GOS (4-galactosil lactosa) y por lo tanto es el que recomendamos como prebitico o bien como sinbitico a incorporar junto con bifidobacterias. Las ms destacadas tanto por su crecimiento como por el descenso del pH provocado con la utilizacin de GOS como substrato fueron B. Bifidum y B. Longum, que previamente fueron elegidas para ser aadidas a las frmulas infantiles, debido a que son de origen humano y predominantes en nios alimentados a pecho (Ballongue, 98), presentar una mayor resistencia al cido del estmago y buena fijacin a la mucosa (Bezkorovainy y col, 97) y que tras la evaluacin de sus niveles a lo largo del tiempo, stos se mantuvieron por encima del nivel recomendado (1x107 ufc/gr.) si bien con algunas fluctuaciones ms acusadas en el estudio con el envase abierto durante ms tiempo (14 das).

COMPARACIN DEL CRECIMIENTO DE Bifidobacterium sp. CON DIFERENTES OLIGOSACRIDOS NO DIGESTIBLES Y SU VIABILIDAD COMO PROBITICOS EN FORMULA INFANTIL.

.219.

PRO/4

SELECCIN Y VIABILIDAD IN VITRO DE BACTERIAS PROBITICAS PARA SU POSIBLE IMPLANTACIN EN PRODUCTOS CRNICOS
J. I. Reguera, J. C. Nieto, J. Sez y V. Segura. Area de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Universidad de Burgos. Pza. Misael Bauelos s/n, 09001 Burgos. OBJETIVOS Seleccionar cepas probiticas y desarrollar un medio base de laboratorio, similar al sustrato crnico, as como estudiar la viabilidad de estas bacterias probiticas en presencia de los principales constituyentes qumicos de los embutidos crudos curados. MTODOS Las cepas utilizadas fueron: Lactobacillus casei (SKW Biosystems, TEXEL y CHR Hansen), Lactobacillus acidophilus (SKW Biosystems), Bifidobacterium longum (TEXEL) y Bifidobacterium sp. (SKW Biosystems), todas ellas comerciales. Se pusieron a punto medios base de enrriquecimiento y aislamiento, as como el medio de Fadda (Fadda et al., 1998) modificado y otros medios con neomicina, paromomicina, dicloxacilina, cido nalidxico o cloruro de litio (Sigma). Se realizaron pruebas de caracterizacin morfolgico-microscpicas y bioqumicas, estudios de crecimiento a diferentes temperaturas (8, 15, 20 y 30 C), pH (4.5, 5.0, 5.5 y 6.0), concentraciones de cloruro sdico (p/v) (2, 3, 4 y 5 %), de lactosa, glucosa y sacarosa (p/v) (1 y 2 %), de nitrito (50, 100 y 200 ppm) y nitrato (100 y 200 ppm). Las incubaciones correspondientes se llevaron a cabo durante 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas. Finalmente, se estudi la posible produccin de sustancia antimicrobianas frente a Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes. RESULTADOS La temperatura de 8 C se mostr claramente inhibitoria con todas las cepas ensayadas en los siete dias de incubacin, obtenindose durante los mismos recuentos similares al del inculo inicial (103 ufc/ml). Slo a 20 y 30 C se obtuvieron crecimientos significativos en ese mismo perodo (Bifidobacerium sp. 3.106 ufc/ml, Lb. acidophilus 4.107 ufc/ml y Lb. casei 2.108 ufc/ml). Valores de pH mayores o iguales que 5.5 permitieron el crecimiento de bifidobacterias (2.106 ufc/ml) y que 4.5 de lactobacilos (Lb. casei 108 ufc/ml y Lb. acidophilus 107 ufc/ml). Concentraciones de cloruro sdico del 4 % o superiores tuvieron un efecto inhibidor en todas las cepas estudiadas, especialmente con las bifidobacterias, siendo dicha concentracin inhibidora para los lactobacilos a temperaturas iguales o inferiores a 20 C, mientras que a temperaturas superiores a 20 C Lb. casei alcanz 8,2.105 ufc/ml. Las concentraciones de nitrito de 50 ppm impidieron el crecimiento de Bifidobacterium sp. (4.103 ufc/ml) , de 100 ppm tuvieron un efecto bacteriosttico frente a Lb. acidophilus (7.103 ufc/ml) y de 200 ppm mostraron este efecto para Lb. casei (8.103 ufc/ml). Se obtuvieron fenmenos bacteriostticos frente a Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. CONCLUSIONES Temperaturas inferiores a 20 C, habituales en la fabricacin de embutidos, inhiben el crecimiento de bifidobacterias y en menor grado de Lb. acidophilus, permitiendo un crecimiento moderado de Lb. casei. La implantacin de estos microorganismos requiere una formulacin especfica de aquellos productos crudos curados a los que se aadan, con valores de pH mayores de 5.0, concentraciones de cloruro sdico inferiores al 4 % y de nitrito no superiores a 50 ppm para las bifidobacterias.
BIBLIOGRAFA
Fadda S, Vignolo G, Holgado APR, Oliver G. (1998). Proteolytic activity of Lactobacillus strains isolated from dry-fermented sausages on muscle sarcoplasmatic proteins. Meat Science 49, 11-18.

.220.

PRO/5

EMPLEO DE LA HIBRIDACIN DE DNA PARA LA DETECCIN ESPECFICA DE Streptococcus thermophilus Y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Y PARA SU DIFERENCIACIN DE OTRAS ESPECIES DE BACTERIAS LCTICAS PROBITICAS
Fernndez, L., M. Lagatie, R. Martn, A. Zabala, A. Haza, M. Marn, P. Morales y J. M. Rodrguez. Dpto. Nutricin y Bromatologa III, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense. Ciudad Universitaria, 28040 Madrid. OBJETIVOS Se pretende adaptar la tcnica de hibridacin DNA-DNA para la deteccin especfica de cepas de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. De esta manera, se dispondra de un mtodo para diferenciarlas de otras bacterias lcticas probiticas que se empleen, conjuntamente con los cultivos iniciadores caractersticos del yogur, en la elaboracin de productos lcteos probiticos. MTODOS Inicialmente, se utilizaron cebadores diseados de las secuencias intergnicas del RNAr 16S-23S para amplificar, mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), fragmentos especficos a partir de colonias y DNA cromosmico de cepas de Str. thermophilus y Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (Tilsala-Timisjrvi, A. y col. 1997. Int. J. Food Microbiol. 35: 4956), as como de Lb. pentosus, Lb. salivarius, Lb. sakei, Lb. casei y Enterococcus faecium. Los fragmentos generados se purificaron empleando los kits QIAquick PCR purification y QIAquick gel extraction (Qiagen), se marcaron con quimioluminiscencia (sistema ECL Direct nucleic acid labelling, Amersham Pharmacia Biotech) y se emplearon como sondas. Paralelamente, se depositaron alcuotas del DNA cromosmico aislado de las cepas citadas anteriormente en membranas de nailon. Las reacciones de hibridacin se realizaron de la forma descrita por Martnez y col. (1998) (J. Appl. Microbiol. 84: 1099-1103). RESULTADOS Tras las reacciones de hibridacin se observ que las sondas derivadas de Str. thermophilus y Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus reaccionaban exclusivamente con las muestras de DNA cromosmico pertenecientes a cepas de las respectivas especies. Las muestras de DNA de cepas de otras especies slo daban seal de hibridacin con las mismas sondas cuando los perodos de exposicin eran muy prolongados y, adems, dada su pequea intensidad, se distinguan fcilmente de los resultados positivos. CONCLUSIONES Las sondas desarrolladas para la deteccin especfica de Str. thermophilus y Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus reconocen especficamente las muestras de DNA cromosmico de las respectivas especies y permiten su diferenciacin de muestras cromosmicas pertenecientes a otras especies de bacterias lcticas con potencial probitico. Actualmente se estn desarrollando mtodos para la deteccin especfica de las especies citadas en formatos de hibridacin en colonia, de tal manera que se puedan identificar las colonias pertenecientes a una especie en cultivos mixtos y sin necesidad de aislar previamente su DNA genmico.

.221.

PRO/6

ESTUDIO PRELIMINAR DE LA COMPOSICIN DE LA FLORA INTESTINAL INFANTIL Y EL EFECTO QUE LA ALIMENTACIN TIENE SOBRE LA MISMA. D. Prez-Conesa, G. Ros, M.J. Periago, C. Martnez, P. Abelln.
Dpto Nutricin y Bromatologa, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia. Campus de Espinardo, 30071 Murcia. Hero Espaa, S.A. Departamento de Investigacin y Desarrollo. Av. Murcia 30820 Alcantarilla, Murcia, Spain OBJETIVOS de la evolucin de la composicin de la flora aerobia y anaerobia intestinal infantil durante los primeros meses de vida, teniendo en cuenta la introduccin de frmula infantil suplementada con probiticos a la edad de 9 meses. METODOS Se tomaron muestras de heces de nios a diferentes edades, tanto alimentados con leche materna, con alimentacin complementaria como con frmula infantil (con y sin Bifidobacterium). stas se conservaron a 20C hasta su anlisis. Un gramo de muestra se diluy y homogeneiz en 9ml de solucin tampn fosfato sdico. Se sembr un volumen de 0.1ml de cada dilucin (10-3-10-8) en una serie de medios selectivos y no selectivos. RESULTADOS Valores medios de los recuentos (u.f.c./g) de las bacterias aerobias intestinales: Mesfilos Enterobacterias Coliformes Estreptococos Estafilococos aerobios totales 10 das 1,19x109 5,86x107 6,27x107 6,05x107 1,80x107 1 mes 1,20x109 3,09x106 3,32x105 1,02x109 4,00x108 7 3 4 6 3 meses 1,02x10 4,13x10 1,88x10 6,70x10 1,51x106 8 5 5 8 6 meses 2,87x10 7,03x10 4,13x10 2,28x10 2,77x107 5 5 5 5 8 meses 6,77x10 4,77x10 5,50x10 1,67x10 1,47x105 10 meses 2,31x107 1,97x107 2,04x106 3,95x106 6,67x105 Valores medios de los recuentos (u.f.c./g) de las bacterias anaerobias intestinales: Mesfilos Bifidobacterias Lactobacilos Bacilos anaerobios anaerobios total 10 das 1,69x109 1,11x109 5,90x108 5,07x108 9 9 8 1 mes 1,93x10 1,63x10 4,10x10 2,09x108 6 7 6 3 meses 5,13x10 2,23x10 5,27x10 2,94x106 6 meses 3,11x108 3,14x108 1,49x108 2,10x108 6 6 5 8 meses 3,12x10 1,90x10 1,35x10 1,65x105 8 8 5 10 meses 3,41x10 1,79x10 4,33x10 1,34x107 La alimentacin durante los primeros meses de vida ha ido cambiando de tal manera que hasta la edad de 1 mes la alimentacin fue a base de leche materna, para pasar a leche de continuacin, a los 5 meses se introdujo fruta (manzana y pltano) y a los 6 meses y medio harina de cereales y potito de carne, para introducir a los 9 meses la leche infantil con bifidus. CONCLUSIONES La evolucin de las bifidobacterias a lo largo del tiempo nos indica que hasta el mes de edad los recuentos se mantienen en valores por encima de 1x109 u.f.c./g, para posteriormente ir descendiendo hasta los 8 meses de edad y a partir de la introduccin de la leche infantil con bifidus (9 meses) se observa un incremento en el recuento de bifidobacterias (1,79x108 u.f.c./g). Por el contrario el recuento de lactobacilos que al principio estaban por encima de 1x108 u.f.c./g, con el tiempo han ido descendiendo hasta valores entorno a 1x105 u.f.c./g. Lo mismo ocurre con el resto de bacteria, sin embargo parece que los valores de enterobacterias y bacilos anaerobios se incrementan a los 10 meses, mientras que el resto de bacterias aerobias reducen sus recuentos.

.222.

PRO/7

EL ACIDO DEOXICOLICO AFECTA LA INTEGRIDAD Y FUNCIONALIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR EN Lactobacillus reuteri

a

Mara Pa Tarantoa, Graciela Font de Valdeza and Gaspar Perez-Martinezb, Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA), CONICET. Chacabuco 145, San Miguel de Tucumn, 4000-Tucumn, Argentina b Departamento de Biotecnologa, Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (CSIC), Polgono de la Coma s/n, Apartado de correos (P.O Box) 73, Burjasot, 46100-Valencia, Spain

En los ltimos aos se ha incrementado notablemente el consumo de leches fermentadas con bacterias lcticas debido al efecto benfico que estos microorganismos ejercen en el husped al mejorar el estado general del organismo. Este fenmeno ha dado lugar a una nueva lnea de alimentos llamados probiticos. Las dos primeras barreras fisiolgicas que regulan la entrada de la microbiota exgena al tracto gastrointestinal son: el bajo pH y la bilis, cuyo efecto antimicrobiano es conocido. De all que la tolerancia a cidos biliares es un criterio importante en la seleccin de cepas probiticas como suplemento dietario. OBJETIVO Se determin la resistencia de lactobacilos probiticos a los cidos biliares deoxiclico y taurodeoxiclico evalundose los cambios estructurales y funcionales de la membrana celular. METODOS Las cepas usadas fueron: L. casei BL 23, L. acidophilus BL 17, L. bulgaricus BL 33 y L. reuteri CRL 1098. La viabilidad celular se determin en presencia de 1, 3, 5 y 10 mM de deoxicolato (DCA) y taurodeoxicolato (TDCA). Se determin la actividad -galactosidasa, lpidos polares y transporte de D-[14C] glucosa con y sin el agregado de ambos acidos biliares en sistemas de clulas no proliferantes. La morfologa de las clulas tratadas y sin tratar se evalu por microscopa electrnica de transmisin. RESULTADOS En general, todas las cepas ensayadas mostraron mayor sensibilidad frente a DCA que a TDCA siendo L. reuteri CRL 1098 el microorganismo ms resistente a ambas especies biliares. El tratamiento con DCA afect la permeabilidad y funcionalidad de la membrana celular de L. reuteri CRL 1098 observndose un aumento en la actividad -galactosidasa y la disminucin en la captacin de D-[14C] glucosa. En presencia de TDCA, las clulas permanecen enteras y su estructura celular intacta, evidencindose perfectamente tanto la membrana como la pared celular, mientras que la presencia de DCA modifica la estructura celular, observndose la desaparicin parcial de la pared y membrana celular. La permeabilidad tambin se evidenci por la disminucin de fosfolpidos en la membrana celular luego del tratamiento En las clulas tratadas con DCA se observ un aumento de 3.8 veces en la relacin glicolpidos/fosfolpidos respecto a TDCA. Estos resultados indicaran un aumento en la permeabilidad de la membrana. CONCLUSION Los resultados obtenidos muestran que los cambios producidos por el cido biliar deconjugado en la estructura y composicin lipdica de la membrana celular afectan tanto la permeabilidad como la funcionalidad de la misma.

.223.

PRO/8

EFECTO ANTIPROLIFERATIVO DE TRES CEPAS DE Enterococcus faecium EN UNA LNEA CELULAR DE MIELOMA
Zabala, A., R. Martn, A. Haza, L. Fernndez, J. M. Rodrguez y P. Morales. Dpto. Nutricin y Bromatologa III, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense. Ciudad Universitaria, 28040 Madrid. OBJETIVOS Se pretende establecer el efecto de tres cepas de Enterococcus faecium (E. faecium CH3, aislada de un embutido crudo madurado; E. faecium HN1 y E. faecium HA1, aisladas de muestras de heces de lactante y de adulto, respectivamente) sobre la proliferacin de una lnea celular de mieloma (clulas tumorales) y de la lnea celular Vero (clulas fisiolgicas). MTODOS Las tres cepas de E. faecium se seleccionaron al azar entre las colonias que crecieron al sembrar los homogeneizados de las respectivas muestras en placas de agar MRS y se sometieron a diversas pruebas microbiolgicas y bioqumicas bsicas. Posteriormente, se estudi su capacidad para sobrevivir y/o crecer en diferentes medios (incluyendo leche UHT) en diversas condiciones (pH, temperatura, NaCl). La identificacin de las cepas se realiz mediante anlisis de los perfiles de protenas totales obtenidos por electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS en la Coleccin de Cultivos BCCM/LMG (Universidad de Gante, Gante, Blgica). Las identificaciones se confirmaron mediante secuenciacin de productos de PCR que contenan secuencias de los genes de la fraccin RNAr 16S en el NIZO Food Research (Ede, Holanda). Las clulas Vero se cultivaron en el medio Dulbeccos Modified Eagle complementado con un 10% de suero fetal bovino, 50 IU ml-1 de penicilina, 50 mg ml-1 de estreptomicina y un 1% de L-glutamina. La lnea celular de mieloma P3X63-Ag8.653 se cultiv en medio RPMI-1640 complementado con un 15% de suero fetal bovin, 50 IU ml-1 de penicilina, 50 mg ml-1 de estreptomicina y un 1% de L-glutamina. Los cultivos celulares se incubaron a 37C y 100% de humedad en una atmsfera con un 5% de CO2. Para estudiar el efecto de las tres cepas de E. faecium (106, 107 y 108 ufc ml-1) en la proliferacin de las clulas Vero y de mieloma se utiliz el kit I de proliferacin celular (Roche Molecular Biochemicals). El ensayo MTT se efectu en placas microtituladoras de 48 pocillos y la densidad ptica de cada pocillo se midi a 620 y 690 nm en un lector iEMS Reader MF (Labsystems). Los resultados obtenidos se sometieron a un anlisis estadstico exhaustivo en la Unidad de Clculo de la UCM. RESULTADOS Las tres cepas fueron capaces de crecer en leche a diversas temperaturas de incubacin y durante tiempos prolongados. Los anlisis de los perfiles de protenas totales y de las secuencias nucleotdicas de los productos de PCR (RNAr 16S) coincidieron en la identificacin de las tres cepas como E. faecium. Los resultados de los ensayos MTT mostraron que, independientemente de la dosis empleada, ninguna de las cepas influa significativamente en la proliferacin de las clulas Vero. Sin embargo, las tres cepas inhibieron la proliferacin de las clulas de mieloma. La inhibicin fue de hasta un 35% en el caso de la cepa CH3, de hasta un 20% en el caso de la cepa HA1 y de hasta un 75% en el caso de la cepa HN1. El porcentaje de inhibicin de la proliferacin de las clulas de mieloma aumentaba con la dosis de bacterias utilizada en el ensayo MTT. CONCLUSIONES Ninguna de las cepas de E. faecium afectaron a la proliferacin de clulas fisiolgicas de mamfero (Vero) pero s a la de clulas tumorales (mieloma). Por lo tanto, mostraron un potencial probitico que puede ser aprovechado para la elaboracin de productos lcteos probiticos y que est siendo investigado en la actualidad.

.224.

TECNOLOGAS DE LA PRODUCCIN Y CONSERVACIN DE ALIMENTOS

.225.

.226.

TPC/1

INACTIVACIN DE Yersinia enterocolitica POR PULSOS ELCTRICOS DE ALTO VOLTAJE

I. lvarez, J. Raso, R. Pagn y F. J. Sala. Dpto. Produccin Animal y Ciencia de los Alimentos. Ftad. Veterinaria. Univ. de Zaragoza. C/Miguel Servet, 177, 50013. Zaragoza. OBJETIVOS La demanda creciente por parte del consumidor de alimentos mnimamente procesados y a la vez, sanitariamente seguros ha estimulado la bsqueda de nuevos sistemas de conservacin que puedan constituir una alternativa frente a los actuales tratamientos trmicos. Los campos elctricos de alto voltaje podran ser una de estas alternativas ya que permiten la inactivacin microbiana sin provocar cambios apreciables en las propiedades sensoriales de los alimentos. El objetivo de esta investigacin fue estudiar la influencia de la intensidad del campo elctrico, del tiempo de tratamiento y del pH del medio de tratamiento en la inactivacin por pulsos elctricos de alto voltaje de Yersinia enterocolitica, uno de los patgenos emergentes responsables, en las ltimas dcadas, de numerosas toxiinfecciones alimentarias. MTODOS La cepa de Y. enterocolitica objeto de estudio (ATCC 9610, CECT 4315) fue cultivada en caldo tripticasa soja suplementado con un 0,6% de extracto de levadura a 30C durante 24 horas, con objeto de obtener una suspensin homognea de clulas en fase estacionaria de crecimiento. Las clulas, lavadas y resuspendidas en el propio medio de tratamiento (tampn McIlvaine de pH 7,1, 5,4 y 3,8), se sometieron a campos elctricos de distinta intensidad (12, 15, 19, 22, 25 y 28 kV/cm) en una instalacin desarrollada al efecto. Los campos se generaron mediante descargas elctricas de onda cuadrada de 2 s de duracin con una frecuencia de 2 Hz. La conductividad del medio se ajust en todos los casos a 2 mS/cm. RESULTADOS La eficacia letal de los pulsos elctricos de alto voltaje aument con el tiempo efectivo de tratamiento, aunque no exista una relacin exponencial entre ambas variables. La velocidad de inactivacin se redujo con el tiempo de tratamiento y como consecuencia se observaron colas en las grficas de supervivencia. La intensidad del campo umbral para la inactivacin de esta especie, result sensiblemente inferior a la observada para otras especies previamente investigadas. Un tratamiento de 2000 s a 12 kV/cm, que apenas inactiv a Salmonella senftenberg y a Listeria monocytogenes, redujo aproximadamente el 99,9% de la poblacin de Y. enterocolitica. Por el contrario, esta especie result relativamente poco afectada por el aumento de la intensidad del campo elctrico. Un tratamiento de 2000 s a 28 kV/cm redujo el recuento 6 ciclos logartmicos. Al contrario de lo observado en otras especies, el pH de medio de tratamiento no afect a la resistencia frente a los pulsos elctricos de alto voltaje de Y. enterocolitica. CONCLUSIONES Los campos elctricos, incluso de baja intensidad (12 kV/cm), son efectivos para la inactivacin de Y. enterocolitica, si bien el ritmo de inactivacin no sigue una cintica de primer orden, lo que en la actualidad podra limitar su aplicacin industrial. Por este motivo, sera conveniente llevar a cabo una investigacin ms profunda que permita establecer un modelo matemtico que describa la inactivacin microbiana por pulsos elctricos de alto voltaje.

.227.

TPC/2

EFECTO DEL pH Y LA ADICIN DE CLORURO SDICO SOBRE LA RESISTENCIA AL CALOR DE Bacillus stearothermophilus.

Bernardo, A.1, Feitosa, J.G.2, Lpez, M.1, Martnez, S.1 1 Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. 2 Microbiologa. Universidad Federal de Sergipe (Brasil).

Bacillus stearothermophilus es el microorganismo responsable de la alteracin conocida como agriado o fermentacin simple en las conservas. Adems, por su gran termorresistencia, es utilizado con frecuencia como indicador biolgico en los procesos de esterilizacin. Dadas las modificaciones que sobre la inactivacin trmica de los microorganismos provocan la naturaleza y/o propiedades fisicoqumicas del medio de calentamiento, parece conveniente determinar los parmetros de termorresistencia en condiciones que puedan ser extrapoladas a la prctica industrial. OBJETIVOS Este estudio se ha planteado con el objetivo de conocer los efectos combinados del pH y la sal en una conserva de garbanzos para poder establecer los parmetros bsicos de termorresistencia que deberan ser aplicados a la tecnologa de la esterilizacin de este producto. METODOS Este trabajo se ha realizado empleando como medio de calentamiento tampn McIlvaine 180mM pH 7 como referencia y extracto de garbanzos sin y con adicin de cloruro sdico a las concentraciones de 1, 2 y 3% y a diferentes pHs (4,0 ; 4,5 ; 5,0 ; 5,5 y el que presenta de forma natural (5,8)). Se utilizaron las cepas ATCC 12980 y 7953 obtenindose las suspensiones de esporos a 53C en agar nutritivo (AN) suplementado con 1 ppm de Mn++. Las determinaciones de los valores D120 se llevaron a cabo en un termorresistmetro TR-SC. Las placas se incubaron a 50C y los recuentos se realizaron empleando un contador automtico de colonias. En todos los casos los valores de pH se determinaron tambin a la temperatura de tratamiento. RESULTADOS El pH no sufri apenas modificaciones durante el calentamiento, excepto a los valores de pH mas bajos en los que descendi del orden de 0,1 0,2 unidades. Los valores D 120 obtenidos van disminuyendo a medida que lo hace el pH del medio, alcanzndose valores del orden de 3 veces inferiores al descender el pH de 6 a 4. En todo el rango de pH estudiado el NaCl, a concentracin del 1%, no provoc ningn efecto sobre la termorresistencia. Sin embargo, concentraciones del 2 y 3% protegieron a los esporos frente a la accin del calor, sobre todo a valores de pH 6,0 y 5,5 y a las concentraciones ms altas llegando en este ltimo caso a duplicarse los valores D120 obtenidos.

.228.

TPC/3

EVALUACIN DEL RIESGO DERIVADO DE LA PRESENCIA DE MOHOS EN PIMENTN DE LA VERA

P. Calvo, A. Martn, E. Aranda, T. Bartolom y M.G. Crdoba Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EIA. UEX. 06071.Badajoz Correo electrnico: patybadajoz@hotmail.com El pimentn de la Vera es un producto deshidratado obtenido tras la molienda de pimientos rojos secados en secaderos naturales mediante la combustin de lea. Debido al proceso especial de secado que sufre el pimentn se contamina con mohos, que pueden permanecer en el producto acabado. Dado que en ocasiones el pimentn se almacena en la industria sin envasar, un aumento de la actividad del agua puede suponer un riesgo tanto por el desarrollo de mohos micotoxignicos como de especies de mohos alterantes. OBJETIVOS. El objetivo del presente trabajo es determinar el nivel de mohos en el pimentn de la Vera de las industrias ms representativas de la zona y evaluar la capacidad de proliferacin de estos mohos en el producto expuesto a diferentes ambientes de humedad relativa. MTODOS. Se tom producto acabado de 5 de las industrias ms representativas en la produccin de pimentn de la Comarca de La Vera. Se determin la poblacin de mohos utilizando tres medios: Potato Dextrosa Agar (PDA), Rosa de Bengala y DG18. El pimentn de referencia, con recuentos de mohos conocidos, se introdujo en recipientes estriles divididos en 2 compartimentos comunicados. En el inferior se coloc una solucin saturada de actividad de agua conocida y en el superior la muestra de pimentn. Los ensayos se realizaron en seis actividades de agua diferentes alcanzadas con las sales: sulfato amnico (aw 0,79), cloruro potsico (aw 0,84), cloruro de bario (aw 0,91), nitrato potsico (aw 0,94), sulfato potsico (aw 0,97) y agua pura (aw 1,0). Al realizarse la incubacin en recipientes hermticos, cada una de las soluciones gener las correspondientes humedades relativas. La incubacin se realiz a 20C durante 3 meses, evalundose el nivel de mohos cada 7 das durante el primer mes y cada 15 das los meses siguientes. RESULTADOS. Los recuentos medios de mohos obtenidos en el pimentn de la Vera fueron 1,6x103 ufc/g con el medio de cultivo PDA, 6,5x102 ufc/g con el Rosa de Bengala y 4,4x102 ufc/g con el DG18. Dado que con el medio PDA se obtuvieron recuentos fngicos superiores al resto de medios de cultivos ensayados, fue el seleccionado para la evaluacin del nivel de mohos en el pimentn incubado en las distintas humedades relativas. Durante el perodo de incubacin slo se han detectado ligeros incrementos en los recuentos de mohos, a pesar de la humedad captada por el pimentn, especialmente en las muestras expuestas a humedades relativas ms elevadas. Es posible que la presencia de compuestos derivados del humo en este tipo de pimentn inhiban el desarrollo fngico aunque se alcancen humedades relativas elevadas durante el almacenamiento CONCLUSIONES. Los niveles de mohos detectados en el pimentn de la Vera son bajos. El medio de cultivo PDA es el ms adecuado para la recuperacin de mohos en este producto. En perodos de almacenamiento no muy prolongados y partiendo de niveles de mohos no superiores a 1x103 ufc/g, no hay incrementos relevantes en los niveles de mohos aunque la humedad relativa del ambiente sea elevada. Las caractersticas especiales de este tipo de producto secado con humo pudieran ser la causa de los bajos recuentos obtenidos.

.229.

TPC/4

NUEVAS FORMAS DE CONSERVACIN PARA VIEIRA (Pecten maximus).

Fidalgo, P.1, Diguez, F.1, 2, Torres, E.2, Prez-Rama, M.2, Garca, J.2, Abalde, J.2 1 Tanfresco, S.L. Polgono de Bergondo, B-20. 15165 Bergondo (A Corua). 2 Laboratorio de Microbioloxa, Facultad de Ciencias, Universidade da Corua, Campus da Zapateira s/n, 15170 A Corua.

INTRODUCCIN Las nuevas tecnologas de procesado permiten prolongar el tiempo que se puede conservar un alimento en condiciones ptimas de frescura. En el caso de los alimentos de origen marino, resulta de particular inters la adaptacin de las nuevas tcnicas de conservacin debido a la rapidez con que aparecen los primeros signos de deterioro. OBJETIVOS Encontrar una tecnologa de proceso que incremente la vida til de la carne de vieira (Pecten maximus) manteniendo sus cualidades organolpticas. Para ello se probaron procesos de conservacin trmica y de envasado en atmsferas modificadas. METODOLOGA Las vieiras se obtuvieron vivas (origen: Galicia, Irlanda) o congeladas enteras (Irlanda). Se procesaron eliminando los rganos no comestibles, dejando slo las gnadas y el msculo aductor. Se lavaron con agua dulce y se envasaron en bolsas de polipropileno/poliamida de 150 m de espesor. Las vieiras envasadas se sometieron a los siguientes procesos de conservacin: 1) envasado a vaco simple (vaco: 90%); 2) envasado a vaco seguido de tratamiento trmico de pasteurizacin (temperatura final entre 90 y 95 C); 3) envasado en atmsfera modificada (N2:CO2 80:20, 50:50, 0:100). Las muestras se conservaron a 0 C hasta anlisis, con incubacin paralela en algunos ensayos a 71 C. En perodos de tiempo previamente establecidos, se procedi al anlisis microbiolgico de las muestras, estudiando los recuentos exigidos por la Reglamentacin Tcnico-Sanitaria (RTS). Se estudi adems la presencia de Clostridium spp. debido a la termorresistencia de sus formas esporuladas y su metabolismo anaerobio que favorece su crecimiento en ambientes anxicos. La vida til se estableci como el tiempo en alcanzar los lmites mximos establecidos por la RTS. RESULTADOS La carga bacteriana inicial de P. maximus fue muy variable en funcin de la procedencia, con valores de mesfilos entre 4x103 y 5x105 ufc/g, y 20 a 150 ufc/g para Clostridium spp. El procesado inicial permiti una reduccin en una unidad logartmica de los recuentos de mesfilos y enterobacterias y, principalmente, una reduccin de Clostridium spp. a menos de 2 ufc/g. La vida til mxima obtenida mediante conservacin en microaerofilia a 0 C fue de 10 das, con una reduccin a 3 das a 7 C. La vida til en atmsferas modificadas mostr una correlacin positivamente con la proporcin de CO2, alcanzando en CO2 puro 20 das a 0 C, con valores de Clostridium spp. por debajo del lmite de deteccin.El proceso de pasteurizacin proporcion una reduccin adicional de una a dos unidades logartmicas de la carga bacteriana, obtenindose valores finales de mesfilos menores a 100 ufc/g, ausencia de enterobacterias y menos de 1.5 ufc de Clostridium por gramo. Esta fuerte reduccin en la poblacin bacteriana permiti obtener vidas tiles de 90 das a 0 C, manteniendo unas cualidades organolpticas aceptables. Con el incremento de la temperatura a 7 C, la reduccin en la vida til se acompa de un deterioro de las cualidades organolpticas (desarrollo de rancidez, pardeamiento) y niveles muy variables de Clostridium spp. CONCLUSIONES Un procesado de la materia prima ptimo, unido al envasado en CO2 puro a bajas temperaturas de conservacin, o la combinacin de vaco y pasteurizacin, permiten aumentar notablemente la vida til de la carne de vieira.
Proyecto FEDER 97-2038-C02-01

.230.

TPC/5

EFECTO DEL ALMACENAMIENTO EN REFRIGERACIN SOBRE LA ACTIVIDAD COAGULANTE Y LA CALIDAD MICROBIOLGICA DE EXTRACTOS ACUOSOS CRUDOS DEL CARDO CYNARA L., UTILIZADOS EN LA ELABORACIN DE QUESOS TRADICIONALES.
L. Tejada, R. Gmez, J. Ferreira, M. Vioque y J. Fernndez-Salguero, Dpto. Bromatologa y Tecnologa de los Alimentos. Univ. de Crdoba. Campus Rabanales. Ed. C1 anexo. OBJETIVOS Determinar el efecto del almacenamiento en refrigeracin sobre la actividad coagulante de las proteinasas presentes en los extractos acuosos crudos de flores del cardo del gnero Cynara. L. y sobre su calidad microbiolgica. MTODOS. A partir de 8 muestras de cardos diferentes se prepararon extractos acuosos como describe Fernndez-Salguero et al. (1999) y se almacenaron en refrigeracin a 4 C. La actividad coagulante se determin mediante la tcnica de Berridge (NOVO, Severinsen, 1979). Para el

anlisis microbiolgico se procedi como en Vioque et al., (2000).

RESULTADOS El pH aument significativamente durante los 360 das de almacenamiento en refrigeracin (p < 0,001). La actividad coagulante aumenta significativamente (p < 0,01) hasta los 140 das de conservacin, vindose mermada drsticamente (p < 0,001) a partir de este momento. Se produce un incremento altamente significativo (p < 0,001) del nmero de msofilos totales, lactobacilos, levaduras y mohos durante el almacenamiento en refrigeracin, observndose una evolucin ms irregular en el caso de enterobacterias y coliformes. A partir de los 60 das de almacenamiento el deterioro de las caractersticas organolpticas se hizo evidente, detectndose numerosos grumos y un olor desagradable. Das de almacenamiento en refrigeracin
0 30 5,01 0,34 4,68 0,72 6,31 0,83 6,84 0,40 6,48 0,28 4,81 0,49 6,77 0,44 1,60 0,31 60 4,69 0,33 4,11 0,80 6,89 0,95 6,51 0,88 6,05 0,69 5,30 0,63 6,85 0,41 2,22 0,51 90 4,80 0,37 3,97 0,67 7,30 0,77 5,24 1,32 4,99 1,26 5,89 0,70 6,87 0,33 2,68 0,37 140 5,12 0,46 3,97 0,58 7,45 0,72 4,35 1,48 3,32 2,20 6,19 0,83 7,01 0,38 3,22 0,45 200 5,28 0,57 6,54 1,72 7,76 0,34 5,04 1,78 4,81 1,83 7,34 0,49 7,10 0,21 3,02 0,54 270 5,93 0,58 7,02 1,46 7,75 0,51 5,74 1,82 5,82 1,60 7,40 0,47 7,18 0,32 2,99 0,69 360 6,24 0,53 8,31 1,53 7,64 0,49 5,74 1,86 5,90 1,53 7,28 0,34 7,15 0,33 3,06 0,71

pH Tiempo coagulacin 1 Recuent total 2 Enterobacteria s2 Coliformes2 Lactobacilos2 Levaduras2 Mohos2

1

4,94 0,27 4,80 0,49 5,51 0,79 5,39 0,54 5,33 0,56 4,56 0,46 5,38 0,45 1,22 0,10

Minutos,

log ufc/ ml.

CONCLUSIONES La refrigeracin prolongada de extractos acuosos crudos de las flores de los cardos Cynara, L mantiene e incluso potencia la actividad coagulante hasta los 140 das. No obstante se observa un deterioro de la calidad microbiolgica desde los 30 das de almacenamiento, y una alteracin de las caractersticas organolpticas a partir de los 60 das de conservacin.
BIBLIOGRAFIA .
Fernndez-Salguero, J., Snchez, E., Gmez, R., Mata, C., Vioque, M. y Tejada, L. (1999). Michwissenschaft, 54, 688-690. Severinsen, S. G. (1979). Sci. e Tech. Lattiero-Casearia, 30, 109-112. Vioque, M., Gmez, R., Snchez, E., Mata, C., Tejada, L. y Fernndez-Salguero, J. (2000). J. Agric. and Food Chem., 48, 451-456.

.231.

TPC/6

EVOLUCION DE DIFERENTES GRUPOS MICROBIANOS DE INTERES TECNOLGICO EN LECHE DE OVEJA REFRIGERADA A 6 C.

S. Sanjuan**, V.M. Fernndez-Barata**, I. Caro*, A. Alonso-Llamazares** y M.R. Garca-Armesto**. *Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo, Mxico; **Dpto. Higiene y Tecnologa de los Alimentos, Universidad de Len. Campus Universitario s/n, 24071 Len. OBJETIVOS Investigar en leche de oveja (recuento inicial: <1.000.000 ufc/ml a 30C) la evolucin de la flora aerobia mesfila viable, y de otros grupos microbianos de inters tecnolgico, durante su almacenamiento a 6 C (temperatura mxima permitida para la leche refrigerada en granja; RD 1679/1994). MTODOS Se estudiaron un total de 12 muestras de leche de tanque (1 ordeo) de tres explotaciones de ovino (4 muestras/explotacin). Las muestras se analizaron inmediatamente despus de su llegada al laboratorio (0 h) y a las 48 y 96 h de su almacenamiento a 6 C. En cada una de las muestras de leche y tiempos de muestreo se determin: flora mesfila, Pseudomonas spp. termodricos, lactococos, lactobacilos, enterococos, coliformes/E. coli, acidez titulable y pH. El muestreo y el recuento de mesfilos, termodricos, acidez titulable y pH se realizaron segn la APHA (1993, Stand. Meth. Exam. Dairy Prod.). Los recuentos de lactococos, lactobacillus, enterococos y Pseudomonas spp. segn Sharpe (1978, en Streptococci, S.A.B., Symp. Series n 7; Academic Press); Reuter (1985, Int. J. Food Microbiol., 2, 55-68); Mossel et al. (1995, Essentials of the Microbiology of Foods, John Wiley & Sons) y Mead & Adams (1977, B.R. Poult. Sci., 18, 661-667), respectivamente. Para los coliformes/E. coli se us Petrifilm (AOAC Official Method 991.14). RESULTADOS No se detectaron diferencias apreciables en el recuento de flora aerobia mesfila viable obtenido en tiempo 0 h y al cabo de 48 h a 6 C (valores medios, respectivamente, de: 552 y 573 log ufc/ml). Por el contrario, a las 96 h, se produjo un incremento sobre el valor inicial de 15 log ufc/ml. Por lo que respecta al recuento de Pseudomonas spp., se observ un incremento acusado del mismo (x 2042), desde el recuento inicial (399 log ufc/ml) hasta el obtenido al cabo de 96 h. de almacenamiento a 6C (aproximadamente, 630 log ufc/ml). La evolucin de la flora acido-lctica (lactococos, lactobacilos y enterococos) fue diferente dependiendo del grupo microbiano estudiado. As, por ejemplo, en el caso de los lactococos y los lactobacilos los recuentos fueron similares a las 0 h y a las 48 h de almacenamiento a 6C (valores medios en torno a 51 y 38 log ufc/ml, respectivamente); sin embargo, a las 96 h, se observo un incremento de 15 y 1 log ufc/ml, aproximadamente. En el caso de los enterococos, as como en el de termodricos y coliformes, practicamente no se observ variacin en los recuentos durante el almacenamiento a 6C (valores medios iniciales de: 340, 254 y 227 log ufc/ml; y valores medios finales de: 397, 271 y 235 log ufc/ml, respectivamente). CONCLUSIONES A las 48 h de incubacin a 6C no se aprecian diferencias en los recuentos de flora aerobia mesfila viable, lactococos, lactobacilos, termoduricos y coliformes, con respecto a los valores iniciales. Por el contrario, a las 96 h de almacenamiento a 6C se aprecian incrementos de 1 log ufc/ml, en los recuentos de flora aerobia mesfila viable, lactococos y lactobacilos; y de > 2 log ufc/ml en los de Pseudomonas spp. A las 96 h de incubacin, nicamente los recuentos de enterococos, coliformes y termodricos permanecen sin variacin.

.232.

TPC/7

E. Gonzlez-Fandos1, M. Gimnez1, C. Olarte1, S. Sanz1 y A. Simn2. Area de Tecnologa de los Alimentos. Univ. de La Rioja. Avda. La Paz 105. 26004 Logroo. 2 Centro de Investigacin y Desarrollo Agrario (Logroo).

CALIDAD MICROBIOLGICA DEL CHAMPIN FRESCO (Agaricus bisporus) ENVASADO Y ALMACENADO A TEMPERATURAS INADECUADAS

OBJETIVOS Los championes son uno de los productos ms perecederos de entre todas las frutas y hortalizas. El champin tiene una tasa respiratoria y metablica muy alta y pierde su calidad en un perodo de tiempo muy corto. El mtodo de conservacin ms extendido en este producto es la refrigeracin. La refrigeracin retrasa el proceso de senescencia y el crecimiento microbiano que son las dos causas de deterioro en el champin. Sin embargo, la distribucin y venta de este producto se realiza con frecuencia a temperaturas inadecuadas. Por otro lado, hoy en da en gran nmero de productos se ha comenzado a utilizar el envasado en atmsferas modificadas como mtodo de conservacin. El objetivo de este trabajo es evaluar la vida til, la calidad microbiolgica y las caractersticas de calidad de championes frescos envasados en dos films de PVC y almacenados a 17 y 25C. Por otro lado, se pretende evaluar el crecimiento potencial de Staphylococcus aureus y la produccin de enterotoxinas en las condiciones indicadas. MTODOS Los championes se envasaron en films polimricos (PVC perforado y no perforado) y se almacenaron a 17 y 25C. La mitad de los envases se inocularon con una cepa de Staphylococcus aureus productora de enterotoxina A. Se tomaron muestras los das 0, 1, 2, 3 y 5, analizndose los siguientes grupos microbianos: aerobios mesfilos (PCA), Pseudomonas spp (King B), coliformes fecales (BGBL), Escherichia coli (agar Levine), anaerobios esporulados (PCA). Tambin se determin el contenido de oxgeno y anhdrido carbnico en el interior de los envases, as como diversos factores de calidad (color, textura, estado de desarrollo y presencia de mohos). RESULTADOS Los envases no perforados mostraron los contenidos ms altos de CO2 (6-7 %) y los ms bajos de O 2 (0.013-0.17 %) as como los parmetros de calidad ms deseables (textura, estado de desarrollo y ausencia de mohos). Los recuentos de Pseudomonas spp fueron una unidad logaritmica inferior en los championes envasados en films no perforados, ya que las concentraciones de O 2 fueron menores que en los films perforados. Staphylococcus aureus no creci en las muestras almacenadas a 17C. Slo se observ un ligero crecimiento de S. aureus en los championes envasados en film no perforado despus de 1 da a 25C. No se detect enterotoxina en ninguno de los envases inoculados. Los recuentos de coliformes fecales estuvieron por debajo de 2 log ufc/g. No se aisl E. coli en ninguna de las muestras analizadas. Los recuentos de anaerobios esporulados alcanzaron niveles de 2 log ufc/g en los championes almacenados a 25C. CONCLUSIONES Los championes envasados en film no perforado mostraron mejores parmetros de calidad. S. aureus no alcanz poblaciones consideradas peligrosas (> 6 log ufc/g) asociadas con la produccin de enterotoxinas en niguna de las condiciones estudiadas.

.233.

TPC/8

CONTROL DE LA ALTERACIN FNGICA EN ANLOGOS DE MAGDALENAS MEDIANTE LA ACCIN COMBINADA DE CONSERVANTES, pH Y ACTIVIDAD DE AGUA
M. E. Guynot, S. Marn, D. Sala, J. Arbons, V. Sanchis, y A. J. Ramos. Dpto. Tecnologa de Alimentos. Univ. de Lleida. CeRTA. Av. Rovira Roure 177, 25198 Lleida OBJETIVOS Se pretende estimar la eficacia de conservantes del grupo de los propionatos, sorbatos y benzoatos en la conservacin de productos de bollera a partir de ensayos in situ sobre especies de Eurotium, Aspergillus y Penicillium. MTODOS Se sigui un diseo experimental factorial cruzado, en el cual los factores ensayados fueron: conservantes (propionato clcico, sorbato potsico y benzoato sdico), concentraciones de conservantes (0, 0.03 y 0.3%), pH (6 y 7.5) y actividad de agua (aw, 0.80, 0.85 y 0.90). La base para dichos tratamientos fueron anlogos de magdalenas. Las variables que se midieron fueron los radios de las colonias frente al tiempo y los recuentos fngicos despus de 4 semanas. RESULTADOS Todos los factores ensayados, asi como sus interacciones, ejercieron una influencia significativa sobre el desarrollo de dichas especies fngicas en anlogos de magdalenas. El crecimiento fngico se vio dificultado a aw baja, siendo en general las cepas de Aspergillus y Penicillium incapaces de crecer a 0.80 aw. Entre los conservantes ensayados, el sorbato potsico tuvo un mayor efecto inhibitorio que el resto. El efecto de los conservantes ensayados se vio potenciado a aw y pH bajos, tal y como caba esperar. Los factores ensayados interaccionaron significativamente entre ellos, de forma que la eficacia de los conservantes qued supeditada al resto de factores abiticos. Los conservantes, en general, mostraron ser ms efectivos a una concentracin de 0.3%, a un pH de 6 y a baja disponibilidad de agua, aunque el efecto dependi de la cepa utilizada. Por el contrario una concentracin de 0.03% llev en determinados casos a un mayor deterioro de los anlogos, lo cual implicara que el uso de dosis subptimas de conservantes en este tipo de productos podra ser perjudicial. El sorbato potsico ejerci en general un control eficaz de la alteracin a una concentracin de 0.3% a pH 6 y 0.80-0.85 aw y, a pH 7.5 y 0.80 aw. En cuanto a las dos variables analizadas, se observ ms claramente el efecto inhibitorio de los conservantes sobre el crecimiento radial que sobre los recuentos fngicos. Hay que tener en cuenta que el primero recoge basicamente el desarrollo micelial, mientras que los segundos hacen ms referencia a la esporulacin. CONCLUSIONES Dado el pH bsico de las magdalenas y otros productos de bollera, el uso de cidos orgnicos como los estudiados para su conservacin no es del todo eficaz. Para este tipo de productos sera necesaria la bsqueda de otro tipo de conservantes diferentes de los tradicionalmente utilizados.

.234.

TPC/9

APLICACIN DE ALTAS PRESIONES EN COMBINACIN CON BACTERIOCINAS COMO TECNOLOGA EMERGENTE PARA LA SEGURIDAD DE PRODUCTOS CRNICOS
Garriga, M., Aymerich, T., Costa, S., Monfort, J.M. y Hugas, M. IRTA-Centro de Tecnologa de la Carne. Granja Camps i Armet. 17121 Monells. Las investigaciones sobre la utilizacin de nuevas tecnologas complementarias o alternativas a las trmicas tradicionales en la produccin de productos crnicos cocidos contribuirn, en un futuro, a satisfacer la demanda creciente de los consumidores hacia productos de aspecto fresco y natural y con una vida media ms larga. OBJETIVOS El objetivo de este estudio fue valorar, en un modelo crnico, el efecto de la aplicacin de altas presiones en combinacin con bacteriocinas sobre la viabilidad de diversas especies bacterianas de inters en productos crnicos. METODOS El modelo crnico consisti en un homogeneizado de jamn cocido en agua destilada (1:3), que fue distribuido en tubos de polipropileno o bolsas de vaco a las que se adicionaron bacteriocinas (Enterocinas A, B; Sakacina K; Pediocina AcH; Nisina). Las cepas bacterianas utilizadas, de origen crnico, fueron: Listeria, Salmonella, E.coli, Staphylococcus, Carnobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc y se inocularon independientemente a razn de 108 ufc/g. Las muestras fueron presurizadas a 500 MPa, durante 5 minutos a 40C en un sistema piloto (ACB, Nantes, Fr) y/o a 400 MPa, durante 10 minutos a 17C en un piloto industrial (Alstom, Nantes, Fr). Despus del tratamiento se almacenaron a 4C, determinndose peridicamente el recuento de viables en medio selectivo. RESULTADOS Los resultados obtenidos demostraron, en general, una reduccin de 6-7 ciclos logartmicos despus de ambos tratamientos, excepto para el gnero Staphylococcus. Durante el almacenamiento en refrigeracin se observ una recuperacin de clulas supervivientes, que fue ms rpido a la presin menor, hasta los niveles de inicio en el caso de las bacteria G+ o hasta 103-104 uf/g en Salmonella y E.coli. Lactobacillus, Leuconostoc, Salmonella y E.coli supervivientes al tratamiento de presin a 400 MPa se mantuvieron, en presencia de nisina y hasta los 61 das de almacenamiento en refrigeracin, por debajo del nivel de deteccin (102 ufc/g). Las bacteriocinas sakacina K, enterocinas A,B y pediocina AcH fueron ms efectivas que la nisina cuando la cepa inoculada fue Listeria monocytogenes. CONCLUSIONES La adicin de determinadas bacteriocinas incrementa el efecto letal de las altas presiones moderadas.

.235.

TPC/10

TERMORRESISTENCIA DE Enterococcus faecium: EFECTO DE LA TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACIN

M. Lpez1 , S. Martnez1, J.G. Feitosa2 y A. Bernardo1. 1 Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. 2 Microbiologa. Universidad F. Sergipe (Brasil).

La importancia de Enterococcus faecium radica en su uso como indicador de la higiene del procesado y la calidad de los alimentos sometidos a tratamientos trmicos suaves, a temperaturas de pasterizacin. Debido a su capacidad para desarrollarse a temperaturas bajas, puede sobrevivir y crecer bajo condiciones inadecuadas de refrigeracin, que provocarn adems de un aumento en la carga microbiana, modificaciones en su termorresistencia. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo fue el estudio de la influencia de la temperatura y tiempo de incubacin sobre los recuentos y la resistencia al calor de este microorganismo, ya que los datos existentes al respecto son muy escasos. Se emple la cepa ATCC 49624 de Enterococcus faecium. METODOS Se parti de un cultivo de 24 horas en BHI a 37C, sembrando alcuotas en el mismo medio e incubando a distintas temperaturas de cultivo (5, 10, 20, 30, 37, 40 y 45C). Se elaboraron las correspondientes curvas de crecimiento, mediante recuentos en placas de BHI incubadas a 37C 1C durante 48 horas. El nmero de unidades formadoras de colonias se estim a partir de la media de los recuentos de las placas correspondientes a cada dilucin, de al menos dos diluciones decimales consecutivas. Los tratamientos trmicos se realizaron a 70C en un termorresistmetro TR-SC. Como medio de calentamiento se utiliz tampn Sorensen pH 7. El recuento de supervivientes se realiz en BHI, utilizando un contador automtico de colonias (AMS-PROTOS). RESULTADOS Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que los mximos recuentos se alcanzaron al cabo de 24-36 horas a temperaturas superiores a 30C y a los 3, 6 y 12 das para las temperaturas de 20, 10 y 5C, respectivamente. Los valores D70 ms altos coincidieron con los mximos recuentos, siendo prcticamente el doble que los obtenidos en los tiempos iniciales y finales de la curvas de crecimiento a las distintas temperaturas, excepto a 45C, donde prcticamente no sufrieron variacin. La mxima termorresistencia se alcanz a temperaturas entre 30 y 37C alcanzando valores en torno a 1 minuto. CONCLUSIONES Estos datos ponen de manifiesto la importancia de sealar la temperatura de cultivo, la fase de crecimiento y las condiciones en las que se ha llevado a cabo la investigacin, resultando esenciales para la interpretacin y la comparacin de los distintos resultados de termorresistencia.

.236.

TPC/11

CONTROL IN VITRO DE LA ALTERACIN FNGICA EN PRODUCTOS DE BOLLERA MEDIANTE LA ACCIN COMBINADA DE CONSERVANTES, pH Y ACTIVIDAD DE AGUA
S. Marn, A. J. Ramos, P. Neira, M. Bernad, y V. Sanchis. Dpto. Tecnologa de Alimentos. Univ. de Lleida. CeRTA. Av. Rovira Roure 177, 25198 Lleida OBJETIVOS Se pretende estimar la eficacia de conservantes del grupo de los propionatos, sorbatos y benzoatos en la conservacin de productos de bollera a partir de ensayos in vitro sobre especies de Eurotium, Aspergillus y Penicillium. MTODOS Se sigui un diseo experimental factorial cruzado, en el cual los factores ensayados fueron: conservantes (propionato clcico, sorbato potsico y benzoato sdico), concentraciones de conservantes (0, 0.003, 0.03 y 0.3%), pH (4.5, 6 y 7.5) y actividad de agua (aw, 0.80, 0.85, 0.90 y 0.95). La base para dichos tratamientos fue un medio agar con un 2% de harina de trigo. Las variables que se midieron fueron el tiempo necesario hasta un crecimiento fngico visible y los radios de las colonias frente al tiempo. RESULTADOS En una fase previa, se determin la micoflora propia de productos de bollera, observndose que Eurotium era el gnero predominante, seguido de Aspergillus y Penicillium. Las especies escogidas para el estudio fueron Eurotium repens, E. rubrum, E. amstelodami, E. herbariorum, Aspergillus flavus, A. niger y Penicillium corylophilum. Todos los factores ensayados ejercieron una influencia significativa sobre el desarrollo de dichas especies fngicas. De forma general, las cepas se desarrollaron con ms dificultad a pH alto y a aw baja, siendo las cepas de Aspergillus y Penicillium incapaces de crecer a 0.80 y 0.85 aw. Sin embargo, el efecto de los conservantes ensayados se vio potenciado a aw y pH bajos, tal y como caba esperar. Los factores ensayados interaccionaron significativamente entre ellos, de forma que la eficacia de los conservantes qued supeditada al resto de factores abiticos. Ninguno de los tres conservantes mostr una efectividad global por encima de los dems. Respecto a las concentraciones ensayadas, la nica que mostr ser til en el control del crecimiento fngico fue 0.3%, aunque solamente a los niveles de pH 4.5 y 6. Cabe destacar que la dosis 0.003% provoc una aceleracin del crecimiento bajo la mayora de condiciones ensayadas, lo cual implicara que el uso de dosis subptimas de conservantes en este tipo de productos podra ser perjudicial. Por ltimo, la dosis 0.03% solamente control de forma clara el crecimiento fngico a pH 4.5. A la vista de los resultados se apunta que la aw baja de los productos de bollera, ms que cualquier otro factor, es la clave para su conservacin. De las especies ensayadas, las que mostraron ser con ms probabilidad potenciales alterantes de productos de bollera fueron E. amstelodami y E. rubrum dada su capacidad para crecer a pH 6 y 7.5, en condiciones de baja disponibilidad de agua, 0.85-0.80 aw, y en presencia de concentraciones de conservantes de 0.03 y 0.3%. CONCLUSIONES El pH de los productos de bollera oscila entre 4.5 y 8.5, aunque muchos de los productos ms habitualmente consumidos, como las magdalenas, tienen pH superior a 7.5. A estos valores los conservantes estudiados han demostrado ser ineficaces, por lo que sera conveniente buscar otros mecanismos combinados de conservacin o la utilizacin de otros tipos de conservantes diferentes a los tradicionalmente empleados.

.237.

TPC/12

INACTIVACIN DE Staphylococcus aureus Y Bacillus cereus EN LECHE MEDIANTE LA COMBINACIN DE PULSOS ELCTRICOS DE ALTA INTENSIDAD DE CAMPO Y CALENTAMIENTO A TEMPERATURAS MODERADAS
Sobrino, A.; Arntegui, J.; Allaert, C.; Martn, O. UTPV-CeRTA, Departamento de Tecnologa de Alimentos, ETSEA Universidad de Lleida, Rovira Roure 177, 25198 Lleida La leche es el alimento ms completo en la dieta del ser humano por lo que conseguir su estabilizacin microbiolgica y enzimtica sin afectar a sus componentes nutritivos es uno de los retos del sector lcteo. Entre los principales microorganismos que producen alteraciones en la leche se encuentran Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la aplicacin de pulsos elctricos de alta intensidad de campo sobre leche inoculada con S. aureus CECT 240 y con B. cereus CECT 193. METODOS Previa multiplicacin de las cepas, se inocularon muestras de leche desnatada hasta que la concentracin de la cepa en estudio alcanz una concentracin de 107 ufc/ml. La leche inoculada se someti a la accin de hasta 25 pulsos elctricos a intensidades de campo elctrico de 31 kV/cm como mximo a temperatura ambiente. Para evaluar la interaccin entre este tratamiento y el calor, la leche inoculada y tratada con 20 pulsos a 31 kV/cm se calent a 60C hasta 40 minutos en el estudio de S. aureus y a 75C hasta 10 minutos en el caso de B. cereus. La supervivencia de los microorganismos a los tratamientos se obtuvo mediante la relacin entre el recuento a partir de las muestras tratadas y las muestras control sin tratar. RESULTADOS Se buscaron modelos cinticos que explicaran la destruccin de estos microorganismos por el efecto de los pulsos elctricos y se observ que el ajuste exponencial era el ms adecuado tanto en el caso de S. aureus como en B. cereus. As, la tasa de supervivencia, s, de B. cereus en un tratamiento de pulsos elctricos a 31 kV/cm se encuentra relacionada con el nmero de pulsos aplicados, n, mediante la ecuacin siguiente: s= 1.0631exp(-0.0785n) con R 2 = 0.85. Se observa que un aumento del campo elctrico y el nmero de pulsos aplicados disminuye la tasa de supervivencia del microorganismo, si bien, la aplicacin combinada de pulsos elctricos y tratamiento trmico produce una disminucin mayor de dicha tasa. CONCLUSIONES Por tanto, se ha demostrado que se produce un mayor efecto en la destruccin de microorganismos cuando se aplican pulsos elctricos de alta intensidad de campo seguidos de un tratamiento trmico que mediante cada tcnica por separado, siendo el efecto de dicha combinacin por lo menos aditivo.

.238.

TPC/13

ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS CAMBIOS ESTRUCTURALES Y ULTRAESTRUCTURALES QUE SE PRODUCEN DURANTE LA AUTOLISIS DE LAS LEVADURAS EN UN MEDIO VNICO MODELO Y EN VINOS ESPUMOSOS ELABORADOS POR EL MTODO TRADICIONAL.
A.J. Martnez-Rodrguez; A.V. Carrascosa; M.C. Polo. Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC). C/ Juan de la Cierva 3, 28006, Madrid. OBJETIVO Observar y comparar los cambios morfolgicos que se producen en las levaduras despus de 24 horas de incubacin en un medio vnico modelo y despus de 12 meses de envejecimiento en un vino espumoso. MTODOS Se utilizaron 2 cepas diferentes de levadura, Saccharomyces cerevisiae EC1118, una cepa comercial suministrada por Lallemand (Madrid, Espaa), y Saccharomyces oviformis IFI-473, una cepa perteneciente a la Coleccin del Instituto de Fermentaciones Industriales (Madrid, Espaa). Las observaciones microscpicas se realizaron por Microscopa de Campo Claro con ptica de Nomarsky y por Microscopa Electrnica de Barrido a Bajas Temperaturas (LTSEM). RESULTADOS Utilizando Microscopa de Campo Claro con ptica de Nomarsky se puede apreciar que despus de 24 horas de autolisis inducida en medio vnico modelo el volmen de las clulas es mucho menor, debido fundamentalmente a la solubilizacin del contenido citoplasmtico que tiene lugar durante la autolisis inducida en el sistema vnico modelo. En numerosas clulas se observa un aumento de tamao de la vacuola, que ocupa prcticamente todo el citoplasma. Despus de 12 meses de envejecimiento en el vino, las levaduras tienen un tamao mucho menor que durante la fermentacin y presentan muchos ms cuerpos esfricos distribuidos por toda la vacuola que en las clulas procedentes de la autolisis inducida en medio vnico. Por LTSEM se puede observar que las clulas en fermentacin presentan la pared celular gruesa y lisa, perfectamente diferenciada de la membrana citoplasmtica. Despus de 24 horas de autolisis inducida en un medio vnico se observan en la pared celular numerosas arrugas o pliegues, en su mayor parte longitudinales. Estas arrugas se deben probablemente a la plasmolisis y no aparecen en levaduras aisladas durante la fermentacin. El empleo de esta tcnica nos ha permitido obtener, por primera vez, imgenes tridimensionales de clulas de levadura vacas, que han perdido la mayor parte del contenido citoplasmtico producto de la autolisis. Las levaduras que han permanecido 12 meses en el vino tienen un tamao menor que el que tenan durante la fermentacin y se puede observar en la superficie de las clulas una gran cantidad de pliegues y arrugas, en mayor nmero que las que presentan las levaduras autolisadas en el medio vnico modelo. CONCLUSIONES Despus de 12 meses de envejecimiento, las levaduras procedentes de la autolisis natural que tiene lugar en los vinos espumosos presentan mayores cambios morfolgicos, tanto estructurales como ultraestructurales, que las levaduras despus de 24 horas de autolisis inducida. Sin embargo, la solubilizacin del contenido citoplasmtico es menor en las levaduras procedentes de los vinos de 12 meses de envejecimiento que en las levaduras despus de 24 horas de autolisis en el medio vnico modelo. Estos resultados son una evidencia de que la autolisis natural que tiene lugar durante el envejecimiento de los vinos espumosos es un proceso lento, que puede prolongarse incluso durante aos.

.239.

TPC/14

INFLUENCIA DEL pH DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTOY LA TERMORRESISTENCIA DE Enterococcus faecium.

S. Martnez1 , J.G. Feitosa2, F.C. Herrera3 y M. Lpez1. 1 Tecnologa de los Alimentos. Universidad de Len. 2 Microbiologa. Universidad F. Sergipe (Brasil). 3 Universidad de Pamplona (Colombia).

Enterococcus faecium se utiliza como microorganismo indicador de referencia para elegir el tratamiento trmico aplicado a determinados productos, sobre todo en alimentos procesados sous vide, una tecnologa que se est incrementando de forma notable.Es bastante resistente en las concentraciones de sal y nitritos utilizadas normalmente y pueden crecer en un margen muy amplio de pH (4-10). OBJETIVOS Este trabajo se plante para conocer los efectos que el pH ejerce sobre el crecimiento y la resistencia al calor de este microorganismo, aspecto ste hasta ahora desconocido. METODOS Se utiliz la cepa ATCC 49624 de Enterococcus faecium que se incub a 37C en BHI durante 24 horas, tras las cuales se sembraron alcuotas en el mismo medio ajustado a diferentes pHs (5, 6, 7, 7,4, 8, 9) utilizando HCl 1N y NaCl 1N para regularlo. Con el fin de elaborar las curvas de crecimiento a los distintos pHs, se extrajeron a intervalos predeterminados de tiempo muestras de 1 ml de cada suspensin, a partir de las cuales y tras la correspondiente dilucin en agua de peptona al 0,1% se sembraron por duplicado placas de BHI, incubndolas a 37C1C durante 48 horas. El nmero de unidades formadoras de colonias se estim a partir de la media de los recuentos de las placas correspondientes a cada dilucin, de al menos dos diluciones decimales consecutivas. Los tratamientos trmicos se realizaron a 70C en un termorresistmetro TR-SC. Como medio de calentamiento se utiliz tampn Sorensen pH 7. El recuento de supervivientes se realiz en BHI, utilizando un contador automtico de colonias. RESULTADOS En todos los casos se produjo un descenso pronunciado del pH en las primeras horas, del orden de 1,5 unidades, excepto a pH 5 que descendi 0,75 unidades de pH, mantenindose posteriormente estable. Los mximos recuentos se obtuvieron en los medios de pHs entre 7 y 8, tras 24-36 horas de incubacin. Los valores D 70 ms altos se obtuvieron en los cultivos obtenidos a las 24 horas en el medio de pH 7,4 (D70 1 min) disminuyendo la termorresistencia a medida que el pH se alejaba de este valor, de forma ms acusada a pHs ms altos, presentando valores a pH 8 similares a los obtenidos a pH 5 ( 0,45 min)

.240.

TPC/15

PRESENCIA DE MICROORGANISMOS TERMORRESISTENTES EN UNA MEZCLA DE ESPECIAS UTILIZADA EN LA CONDIMENTACIN DE CONSERVAS DE CHAMPIN.
C. Olarte, J. Portu, S. Sanz y E. Gonzlez-Fandos Dpto. de Agricultura y Alimentacin. rea de Tecnologa de los Alimentos. Univ. de La Rioja. Avda. de la Paz, 105. 26004-Logroo. OBJETIVOS Las especias utilizadas en la condimentacin de alimentos son en muchos casos origen de contaminacin microbiana. La alteracin de las conservas durante su almacenamiento o comercializacin puede ser debida a la presencia de microorganismos termorresistentes que puedan sobrevivir al tratamiento de esterilizacin. En este trabajo se estudia el posible origen de este tipo de microorganismos desde la mezcla de especias empleada en la condimentacin de un tipo de conserva de champin que contiene aceite en su composicin. MTODOS Muestras constituidas por lquido de gobierno (solucin de NaCl 13% en agua con 1.5 % de c. ctrico y 0.5 % de c. ascrbico) y aceite de girasol en proporcin 3:1, conteniendo un 1% de la mezcla de especias (ajo en polvo, pimienta negra molida y organo a partes iguales) fueron sometidas a distintas temperaturas (90, 100 y 121 C) durante 3, 5, 10, 20 y 30 minutos. Tras el tratamiento se realizaron recuentos de microorganismos termfilos aerobios y anaerobios (PCA, Oxoid) y clostridios (DCA, Merck) RESULTADOS En las muestras control (sin tratamiento trmico) analizadas no fue posible detectar la presencia de microorganismos termfilos anaerobios ni de clostridios por lo que, tanto especias como lquido de gobierno, fueron descartados como posible causa de la aparicin de microorganismos alterantes en las conservas estudiadas dado el carcter anaerobio del interior de los botes. S se encontraron termfilos aerobios que, en las muestras sin tratamiento trmico, alcanzaron niveles de 2.6 x 104 ufc/ml. Estos microorganismos presentaron resistencia a tratamientos trmicos, sobreviviendo a temperaturas de 90 y 100 C durante 60 minutos. Sin embargo, temperaturas superiores consiguieron la destruccin de estos microorganismos, no pudiendo ser detectados en las muestras que sufrieron un calentamiento a 121 C durante 3 o ms minutos. Este tratamiento trmico resulta muy inferior al que reciben las conservas de champin condimentadas con estas especias por lo que las alteraciones microbianas observadas en este producto no tienen su origen en los microorganismos presentes en las especias. CONCLUSIONES Aunque el tratamiento trmico aplicado a la esterilizacin de champin condimentado es suficiente para la eliminacin de los microorganismos aportados por las especias, la termorresistencia de la microflora naturalmente presente en las mismas resulta un evidente riesgo de alteracin microbiana. Este hecho puede ser la causa de problemas en elaboraciones en las que el tratamiento trmico a aplicar sea menor que el utilizado en el producto estudiado en este trabajo y exista posibilidad de crecimiento aerobio.

.241.

TPC/16

PERSISTENCIA DE MICROORGANISMOS TERMFILOS EN LA ESTERILIZACIN DE CHAMPIN CONDIMENTADO.

J. Portu, C. Olarte, S. Sanz y C. Lomas. Dpto. de Agricultura y Alimentacin. rea de Tecnologa de los Alimentos. Univ. de La Rioja. Avda. de la Paz, 105. 26004-Logroo. OBJETIVOS La alteracin de las conservas durante su almacenamiento o comercializacin puede ser debida a la presencia de microorganismos termorresistentes que puedan sobrevivir al tratamiento de esterilizacin. La termorresistencia de algunos microorganismos que forman parte de la microflora natural de productos vegetales puede verse incrementada dependiendo de la composicin y caractersticas de la conserva de la que forman parte. En este trabajo se estudi el problema real de una conserva de champin laminado condimentado en el que las latas presentaban fuertes hinchamientos cuando eran almacenadas o transportadas bajo temperaturas elevadas. MTODOS Se analizaron muestras del producto en distintos momentos de la elaboracin: recepcin de la materia prima, despus del lavado, tras escaldado y despus del tratamiento trmico. Las latas fueron analizadas tanto de manera inmediata tras su esterilizacin como a los 7 das de incubacin a 37 y a 55 C respectivamente. El agua de escaldado y enfriado as como el lquido de gobierno, el aceite y las especias empleadas en su condimentacin fueron igualmente analizadas. En todas las muestras se realizaron recuentos de microorganismos mesfilos y termfilos aerobios y anaerobios (ICMSF,1978) y clostridios (DCA, Merck) RESULTADOS Los championes de partida presentaron una calidad microbiolgica aceptable, con recuentos inferiores a 104 ufc/g. Estos valores se redujeron durante el lavado y el escaldado, si bien en esta ltima operacin se produjo un cierto incremento de microorganismos termfilos debido a su proliferacin en el agua del escaldador a medida que nos distancibamos del momento de la limpieza qumica del equipo. Ni el lquido de gobierno ni el aceite presentaron niveles microbianos detectables. Entre los microorganismos encontrados en las especias (mezcla de ajo, pimienta y organo), slo se detectaron niveles apreciables de microorganimos aerobios. La esterilizacin aplicada (de hasta 50 F) result ineficaz para le eliminacin de Clostridium thermosaccharolyticum. Este microorganismo esporulado anaerobio ha sido descrito como responsable de la alteracin de conservas vegetales en las que produce un fuerte desprendimiento de gas. La gran termorresistencia de este microorganismo puede verse incrementada en el caso en estudio por la presencia de aceite en la composicin de la conserva. La etapa del enfriado tras la esterilizacin result ser crtica para su control dado su carcter termfilo (temperatura ptima de crecimiento 55C). De hecho, slo los botes que permanecieron un tiempo excesivo a temperaturas en las que C. thermosaccharolyticum puede desarrollarse (43-71C) presentaron problemas de hinchamiento. CONCLUSIONES La etapa de enfriado tras esterilizacin resulta de enorme importancia para el control de microorganismos termfilos termorresistentes. Es sta una etapa a la que no suele prestarse demasiada atencin en la industria conservera pero que puede ser origen de problemas cuando, como ocurre en el caso estudiado, el tamao y composicin de la conserva dificulta el enfriamiento posibilitando la proliferacin de microorganismos termfilos que han sobrevivido a la esterilizacin.

.242.

TPC/17

EVOLUCIN MICROBIOLGICA DE LA PASTA DE CUAJO DE CORDERO PARA LA ELABORACIN DE QUESO D.O. IDIAZABAL
1

Salmern, J., 1Aramburu, M., 1Prez-Elortondo, F.J., 1Albisu, M., 2de Renobales, M. 1 rea de Nutricin y Bromatologa. 2 Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Farmacia. Universidad del Pas Vasco/ Euskal Herriko Unibertsitatea. Paseo de la Universidad 7. Vitoria-Gasteiz

OBJETIVOS El objetivo del presente estudio es la caracterizacin microbiana de la pasta de cuajo de cordero utilizada en quesera, lo cual constituye el primer paso para la consecucin de un tipo de cuajo que permita la elaboracin de un producto de calidad ms homognea y sanitariamente ms seguro(a). A tal fin, se han investigado los niveles de ciertos grupos microbianos durante el proceso de conservacin de 84 muestras de pasta de cuajo, destinadas a la elaboracin de queso con Denominacin de Origen Idiazbal, procedentes de corderos lechales agrupados segn los siguientes parmetros: granja de origen, mes de sacrificio, momento de la ltima lactacin y tipo de alimentacin. METODOS Los abomasos de los corderos, tras un periodo de secado de 45 das(b), se sometieron a limpieza, picado, salado a diferentes concentraciones (30% y 50%), envasado y conservacin a temperatura de refrigeracin (3 C). Durante el periodo de conservacin de la pasta de cuajo, con una periodicidad bimensual, se estudiaron los siguientes grupos microbianos: aerobios mesfilos, anaerobios mesfilos, coliformes, bacterias lcticas, micrococos, enterococos, mohos y levaduras. RESULTADOS Los resultados muestran que, en todos los casos, los recuentos obtenidos eran mximos el primer da, disminuyendo o mantenindose durante el periodo de conservacin. La mayor cada se observ en las bacterias lcticas que haban desaparecido despus de dos meses de conservacin. Las muestras de pasta de cuajo procedentes de corderos que se haban alimentado poco tiempo antes del sacrificio presentaban recuentos iniciales significativamente menores y una mayor tendencia a la disminucin de su carga microbiana durante el periodo de conservacin, que aquellos procedentes de corderos sacrificados en ayunas. Esto se puede explicar por el hecho de la acidificacin del contenido gstrico, como primer paso en el proceso digestivo de los animales. CONCLUSIONES Como principal conclusin encontramos que el parmetro de agrupamiento de los corderos ms influyente en la carga microbiana inicial de la pasta de cuajo y en su evolucin en el tiempo corresponda al del momento de la ltima lactacin.
BIBLIOGRAFIA (a)
(b)

Cosentino, S., Matza, O., Fadda, M.E., Palmas, F. (1989). Qualita igienica e microbiologica di cagli e innesti utilizzati nella produzione di formaggio di pecora. Anali di Igiene, Medicina Preventiva e di Comunit, I, 1521-1528. Prez-Elortondo, F.J., Aramburu, M., Barrn, L.J.R., Albisu, M., de Renobales, M., Salmern, J. (2000). Standarization of lambs rennet manufacture by monitor of abomasum drying. 6e Journees Europeennes Agro-Industrie et Methodes Statistiques. Pau, 19 au 21 Janvier.

.243.

TPC/18

PROBLEMAS HIGINICOS EN EL PROCESADO DE SUBPRODUCTOS VEGETALES: ELABORACIN DE ESPRRAGO DESHIDRATADO.

S. Sanz, C. Olarte, C. Lomas y S. Ibez de Opaca. Dpto. de Agricultura y Alimentacin. rea de Tecnologa de los Alimentos. Univ. de La Rioja. Avda. de la Paz, 105. 26004-Logroo. OBJETIVOS Las peladuras y partes fuertemente lignificadas de los esprragos constituyen los principales subproductos de la industria conservera. Su recogida y posterior deshidratacin permiten la elaboracin de un polvo de esprrago muy apreciado en la elaboracin de sopas y caldos deshidratados. En este trabajo se estudi la carga microbiana de la materia prima de la que parte la industria elaboradora, la higiene del proceso y la calidad microbiolgica del producto final. MTODOS Se analizaron muestras en distintos momentos de la elaboracin: recepcin de la materia prima, despus del lavado, producto deshidratado y tras 16 semanas de almacenamiento a temperatura ambiente. Las muestras fueron recogidas desde la industria dedicada a la deshidratacin de subproductos y mantenidas en refrigeracin durante su traslado al laboratorio y hasta el momento del anlisis (en ningn caso transcurrieron ms de 12 horas). Se determin la humedad y actividad de agua de las muestras y se realizaron recuentos de microorganismos mesfilos, enterobacterias, coliformes, enterococos, bacterias formadoras de esporas, mohos y levaduras y Clostridium perfringens as como presencia de Salmonella y S. aureus (ICMSF,1978). RESULTADOS Las muestras de esprrago en polvo presentaron unos valores de aw en torno a 0.3, con lo que el producto se muestra estable desde el punto de vista bioqumico y microbiolgico. No se detect la presencia de Salmonella ni S. aureus en ninguna muestra. Sin embargo, atendiendo a los valores obtenidos en los recuentos de grupos microbianos considerados de origen fecal, el 75% de las muestras resultaron rechazables. Los altos recuentos encontrados son el resultado de la baja calidad microbiolgica de la materia prima: considerada como un subproducto a desechar por la industria conservera de origen, es manipulada sin la ms mnima medida higinicosanitaria. Tampoco en la industria donde el subproducto es deshidratado se sigue una metodologa acorde con las prcticas higinicas necesarias en una industria elaboradora de un ingrediente alimentario para el consumo humano. De hecho, no se observ reduccin para la mayora de los grupos microbianos antes y despus del lavado. S fue posible observar una reduccin en los recuentos de Enterobacterias y coliformes tras el periodo de almacenamiento, disminucin que no se observ entre Enterococos. Este descenso supuso una reduccin en el porcentaje de muestras rechazables desde el punto de vista microbiano hasta el 40% del total. CONCLUSIONES El alto porcentaje de muestras inaceptables incluso despus del almacenamiento, implican que es necesario un mejora en las prcticas higinicas. El procesado de subproductos, por muy baratos que puedan ser, no debe suponer una disminucin del rigor de aplicacin de las prcticas higinicas de elaboracin. Es ms, dadas las caractersticas de la materia prima, resultara necesario una aplicacin de estas prcticas an ms estricta.

.244.

TPC/19

EFECTOS DE LA ALTA PRESIN HIDROSTTICA SOBRE LA FRACCIN CELULAR DE LA SANGRE DE CERDO.

Toldr, M.; Busquets, A.; Saguer, E.; Pars, D. y Carretero, C. Institut de Tecnologia Agroalimentria, CeRTA, Universitat de Girona, Campus Montilivi, Avda. Llus Santal, s/n, 17071 Girona. Tel: 972 418941. E-mail: mtoldra@intea.udg.es. OBJETIVOS El objetivo del presente trabajo fue investigar los efectos de la aplicacin de altas presiones sobre la calidad microbiolgica y algunas caractersticas fsicas y funcionales de la fraccin celular de la sangre de cerdo procedente de mataderos industriales, para determinar las condiciones ptimas de aplicacin del proceso tecnolgico. METODOS Con esta finalidad, las muestras de fraccin celular hemolizada se sometieron a tratamientos de presurizacin a 400 MPa, a temperaturas de 5, 20 y 40 C, durante periodos de 5 y 15 minutos. La reduccin de la microbiota contaminante producida por el tratamiento se determin mediante el recuento de microorganismos aerobios mesfilos totales. Los daos producidos sobre los microorganismos supervivientes a las altas presiones se evaluaron mediante las velocidades de crecimiento y los tiempos de generacin obtenidos a partir de las curvas de crecimiento de los microorganismos. RESULTADOS Todas las combinaciones de tiempo y temperatura producan una reduccin significativa de la contaminacin microbiolgica respecto de las muestras control. Los tratamientos ms efectivos, con una reduccin de 3 unidades logartmicas, fueron los de 15 minutos a temperaturas de 20 y 40 C. Para evaluar los efectos de las altas presiones sobre la hemoglobina, la protena mayoritaria de la fraccin celular, se determinaron los cambios producidos sobre los parmetros CIE L* a* b* del color, la viscosidad y la solubilidad proteica (a pH 7 y 4,5). Las altas presiones producan un aumento significativo de la luminosidad (L*) y de las coordenadas rojoverde (+a*) y amarillo-azul (+b*) del color de hemoglobina. Tambin se observ un incremento significativo de la viscosidad directamente relacionado con el tiempo de presurizacin y la temperatura de trabajo. Los tratamientos de 15 minutos a 5 y 40 C producan un mayor aumento de la viscosidad (obtencin de pastas espesas casi slidas) que los realizados a 20 C, y esto hace que disminuyan las posibilidades de utilizacin del producto. Las altas presiones producan cierta desnaturalizacin de la hemoglobina, puesto que se observ una disminucin significativa de la solubilidad proteica. La disminucin de la solubilidad era mayor a pH 7 que a pH cido. El tiempo y la temperatura aplicados tenan un efecto significativo sobre el descenso de la solubilidad, siendo mxima esta reduccin en los tratamientos realizados a 5 y 40 C durante 15 minutos. CONCLUSIONES A partir de los resultados obtenidos, se escogi el tratamiento de 400 MPa a 20 C durante 15 minutos porque produca una reduccin significativa de la microbiota contaminante, el producto permaneca fluido despus del tratamiento y no comprometa demasiado la solubilidad y, por tanto, la funcionalidad de la hemoglobina.

.245.

TPC/20

ESTUDIO DE TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LA DESINFECCIN DE ALIMENTOS MNIMAMENTE PROCESADOS

R. Virto, I. lvarez y J. Raso. Dpto. Produccin Animal y Ciencia de los Alimentos. Ftad. Veterinaria. Univ. de Zaragoza. C/Miguel Servet, 177, 50013. Zaragoza. OBJETIVOS Tradicionalmente, los tratamientos de desinfeccin de frutas y hortalizas mnimamente procesadas (productos de IV gama) se realizan mediante su inmersin o duchado con agua clorada (100-200 ppm hipoclorito sdico). Sin embargo, en ocasiones, el efecto inactivador de estos tratamientos no es suficiente para garantizar la seguridad de estos alimentos. Adems, existe una creciente preocupacin por la posible presencia de residuos en los alimentos en los que se utiliza el hipoclorito sdico como agente desinfectante. El objetivo de esta investigacin consisti en el estudio de tratamientos alternativos al hipoclorito sdico para la desinfeccin de alimentos mnimamente procesados. MTODOS Se ha comparado el efecto inactivador sobre Escherichia coli y Pseudomonas auroginosa del hipoclorito sdico, y del DMC (biocida de origen natural) (DOMCA, Alhendin, Granada) y de tratamientos combinados de ambos desinfectantes con tratamientos trmicos, ultrasnicos y ultrasnicos bajo presin. RESULTADOS A 25C, el hipoclorito sdico (30 ppm) y el DMC (50 ppm) inactivaron la poblacin de ambos microorganismos ms de cuatro ciclos logartmicos tras dos minutos de tratamiento. Cuando el hipoclorito sdico (20 ppm) y el DMC (25 ppm) se aplicaron a 50 C, la poblacin de ambos microorganismos disminuy ms de cuatro ciclos logartmicos tras menos de un minuto de tratamiento. El efecto de los tratamientos combinados de ambos desinfectantes con los ultrasonidos y con los ultrasonidos bajo presin fue aditivo. CONCLUSIONES El DMC podra ser una alternativa al empleo de hipoclorito sdico como agente desinfectante en los productos mnimamente procesados. La concentracin de ambos desinfectantes necesaria para conseguir un mismo efecto inactivador es menor cuando se aplican en combinacin con el calor o los ultrasonidos. En posteriores investigaciones, se estudiar el efecto inactivador de estos tratamientos en diferentes alimentos de origen vegetal.

.246.

PRESENTACIONES ORALES

.247.

.248.

BIO-RAD LABORATORIES, S.A. Y PSTERS SELECCIONADOS I

Moderador: Dr. Federico Uruburu Fernndez

.249.

.250.

PROBELIATM: DETECCION RAPIDA Y FIABLE DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS MEDIANTE TECNICAS DE PCR

Bio-Rad Laboratories, S.A. Life Science Group. C/ Lpez de Hoyos, 245-247. 28043 Madrid OBJETIVOS Se persigue el desarrollo de un sistema rpido y sensible para la deteccin de Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7 y Campylobacter en alimentos. METODOS Tras un perodo de enriquecimiento de la muestra en un medio de cultivo, se extrae el DNA y se realiza la amplificacin de secuencias gnicas por PCR utilizando oligonucletidos especficos dependiendo del microorganismo a detectar. Posteriormente se lleva a cabo una hibridacin de los fragmentos de DNA amplificados con sondas especficas que se encuentran inmovilizadas a una placa multipocillo. Tras un lavado de los fragmentos no hibridados, la reaccin se revela mediantes tcnicas colorimtricas utilizando un oligonucletido marcado con peroxidasa. La fiabilidad de los resultados se garantiza mediante una solucin enzimtica que evita la contaminacin por DNA previamente amplificado y un control interno que revela factores inhibitorios en la muestra. RESULTADOS La combinacin de oligonucletidos y sondas especficas patentadas junto con el uso de tcnicas de amplificacin y deteccin utilizados en PROBELIATM permite la determinacin de microorganismos en alimentos en 24 h. Asimismo, se aumenta la sensibilidad en 103-105 veces sobre los mtodos clsicos a la vez que se produce un incremento en la especificidad evitando la reactividad cruzada. Una ventaja aadida es que los resultados positivos no requieren posterior confirmacin, lo que de nuevo supone un ahorro de tiempo y costes con respecto a otros mtodos. CONCLUSIONES Comparado con los mtodos bacteriolgicos convencionales, generalmente ms lentos y caros, PROBELIATM ha demostrado ser un mtodo altamente sensible y especfico para la deteccin de Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7 y Campylobacter en alimentos.

.251.

DETECCION DE Listeria monocytogenes EN CARNE MEDIANTE PCR

R. Aznar y B. Alarcn. Dpto. Microbiologa, Universitat de Valncia. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA)(CSIC). Apartado de correos 73, Burjassot 46100, Valencia. OBJETIVOS Disear un mtodo, rpido y sensible para la deteccin de Listeria monocytogenes en carne, basado en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que permita su aplicacin rutinaria en el anlisis microbiolgico, reduciendo el tiempo de deteccin a 1-2 das en lugar de los 7 das que se requieren con los mtodos tradicionales. MTODOS La deteccin de L. monocytogenes por PCR se realiz utilizando dos iniciadores especficos que amplifican 234 pares de bases del gen que codifica para la listeriolisina O (Ericsson & Stalhandske, 1997). Previamente se comprob su especificidad sobre una coleccin de 26 cepas, 13 L. monocytogenes, cinco de otras especies de Listeria, dos Staphylococcus aureus, cuatro Salmonella spp y dos Escherichia coli. Se ensayaron diferentes tiempos de incubacin y mtodos de tratamiento de la muestra para conseguir la mayor sensibilidad de deteccin en el menor de tiempo. Las muestras de carne se procesaron utilizando bolsas de plstico estriles con filtro lateral, diludas 1/10 en caldo Fraser y se homogeneizaron mediante Stomacher durante un minuto. La mezcla resultante tomada del lado del filtro, se reparti en alicuotas de 40 ml que se inocularon en proporcin 1:100 a partir de diluciones decimales seriadas de un cultivo de 18 h de L. monocytogenes CECT 4031T, cubriendo el rango de 1 a 107 cel/ml. Se tomaron muestras de 1 y 10 ml, a tiempo 0 y tras incubacin a 37C durante 2, 6, y 22 horas. Las muestras de 1 ml se sometieron a un gradiente de densidad BactXtractor (QRAB) o bien directamente a PCR, tras calentamiento a 100 C 10 min. Las de 10 ml se sometieron a extraccin de DNA utilizando el mtodo de Pitcher et al. (1989). Se ensayaron, adems, tres mtodos comerciales de extraccin y purificacin de ADN que se aplicaron a las muestras de 10 ml: DNeasy Tissue Kit (Qiagen), Wizard DNA Clean-up (Promega), Generation (Gentra). RESULTADOS Los iniciadores utilizados resultaron especficos amplificndose el fragmento esperado slo en las cepas de L. monocytogenes y no en el resto de cepas ensayadas. Se realizaron cinco experimentos independientes de deteccin a partir de carne de vacuno inoculada artificialmente. A partir de las muestras de 1 ml se obtuvieron niveles de deteccin de 9x105 cel/ml a tiempo 0, 9x104 cel/ml tras 2 h de incubacin, entre 5x102 y 9x103 tras 6 h y de 5x10-1 cel/ml tras 22 h utilizando el gradiente de densidad BactXtractor. Utilizando 10 ml y el mtodo de Pitcher et al. (1989) aumentaba la sensibilidad del mtodo alcanzndose niveles de deteccin de un orden logartmico inferior. Los valores obtenidos a partir de la muestra sin incubar (tiempo 0) fueron muy variables oscilando entre 540 y 9x104 cel/ml. Tras incubacin, dichos valores se normalizaron resultando de 9x103 cel/ml tras 2 h, 5x102 cel/ml tras 6 h y de 5x10-1 tras 22 h. De los cuatro mtodos de extraccin de DNA utilizados, el de DNeasy Tissue Kit permiti el nivel de deteccin ms bajo, siendo adems el ms rpido y de ms fcil manejo. El de Wizard Clean-up no result apropiado dado que las muestras colapsaron las columnas. Con el Generation no se observ amplificado. CONCLUSIONES Dada la variabilidad encontrada en los resultados de deteccin directa a tiempo 0, se propone someter la muestra a un perodo de incubacin de al menos 6 h, realizar la extraccin de DNA a partir de 10 ml para aumentar la sensibilidad, y utilizar las columnas de DNeasy Tissue Kit. Como alternativa, se propone incubar 22 h y tomar 1 ml para procesar bien con Dneasy Tissue Kit o bien someterlo a gradiente de densidad en BactXtractor.
BIBLIOGRAFIA
Ericsson, H. & P. Stalhandske (1997) PCR detection of Listeria monocytogenes in gravad rainbow trout. Int. J. Food Microbiol. 35: 281-285. Pitcher, D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiumthiocyanate. Letts. Appl. Microbiol. 8: 151-156.

.252.

ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS CAMBIOS ESTRUCTURALES Y ULTRAESTRUCTURALES QUE SE PRODUCEN DURANTE LA AUTOLISIS DE LAS LEVADURAS EN UN MEDIO VNICO MODELO Y EN VINOS ESPUMOSOS ELABORADOS POR EL MTODO TRADICIONAL.
A.J. Martnez-Rodrguez; A.V. Carrascosa; M.C. Polo. Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC). C/ Juan de la Cierva 3, 28006, Madrid. OBJETIVO Observar y comparar los cambios morfolgicos que se producen en las levaduras despus de 24 horas de incubacin en un medio vnico modelo y despus de 12 meses de envejecimiento en un vino espumoso. MTODOS Se utilizaron 2 cepas diferentes de levadura, Saccharomyces cerevisiae EC1118, una cepa comercial suministrada por Lallemand (Madrid, Espaa), y Saccharomyces oviformis IFI-473, una cepa perteneciente a la Coleccin del Instituto de Fermentaciones Industriales (Madrid, Espaa). Las observaciones microscpicas se realizaron por Microscopa de Campo Claro con ptica de Nomarsky y por Microscopa Electrnica de Barrido a Bajas Temperaturas (LTSEM). RESULTADOS Utilizando microscopa de campo claro con ptica de nomarsky se puede apreciar que despus de 24 horas de autolisis inducida en medio vnico modelo el volmen de las clulas es mucho menor, debido fundamentalmente a la solubilizacin del contenido citoplasmtico que tiene lugar durante la autolisis inducida en el sistema vnico modelo. en numerosas clulas se observa un aumento de tamao de la vacuola, que ocupa prcticamente todo el citoplasma. despus de 12 meses de envejecimiento en el vino, las levaduras tienen un tamao mucho menor que durante la fermentacin y presentan muchos ms cuerpos esfricos distribuidos por toda la vacuola que en las clulas procedentes de la autolisis inducida en medio vnico. Por LTSEM se puede observar que las clulas en fermentacin presentan la pared celular gruesa y lisa, perfectamente diferenciada de la membrana citoplasmtica. Despus de 24 horas de autolisis inducida en un medio vnico se observan en la pared celular numerosas arrugas o pliegues, en su mayor parte longitudinales. Estas arrugas se deben probablemente a la plasmolisis y no aparecen en levaduras aisladas durante la fermentacin.El empleo de esta tcnica nos ha permitido obtener, por primera vez, imgenes tridimensionales de clulas de levadura vacas, que han perdido la mayor parte del contenido citoplasmtico producto de la autolisis. Las levaduras que han permanecido 12 meses en el vino tienen un tamao menor que el que tenan durante la fermentacin y se puede observar en la superficie de las clulas una gran cantidad de pliegues y arrugas, en mayor nmero que las que presentan las levaduras autolisadas en el medio vnico modelo. CONCLUSIONES Despus de 12 meses de envejecimiento, las levaduras procedentes de la autolisis natural que tiene lugar en los vinos espumosos presentan mayores cambios morfolgicos, tanto estructurales como ultraestructurales, que las levaduras despus de 24 horas de autolisis inducida. Sin embargo, la solubilizacin del contenido citoplasmtico es menor en las levaduras procedentes de los vinos de 12 meses de envejecimiento que en las levaduras despus de 24 horas de autolisis en el medio vnico modelo. Estos resultados son una evidencia de que la autolisis natural que tiene lugar durante el envejecimiento de los vinos espumosos es un proceso lento, que puede prolongarse incluso durante aos.

.253.

COMPARACION DE DOS METODOS DE EXTRACCION DE RNA PARA LA DETECCION DEL RNA DE ENTEROVIRUS Y VHA EN MEJILLONES MEDIANTE RT-PCR.
Nerea Casas y Ester Suen. Dpto. Inmunologa, Microbiologa y Parasitologa. Univ. Pas Vasco. Apto. 460, 01080 Vitoria-Gasteiz. OBJETIVOS Desarrollo y evaluacin de un mtodo rpido, sensible y eficaz para la concentracin y purificacin de virus entricos en muestras de mejillones (Mytilus spp.) compatible con su deteccin por RT-PCR tras la extraccin de sus cidos nucleicos por distintos mtodos. METODOS 1. Virus y cultivos celulares. Poliovirus tipo 1 (PV1), cepa Lsc, se ha propagado y ensayado en clulas BGMK. La cepa citoptica HM175 del virus de la Hepatitis A (VHA) se propag y ensay en clulas FRhK. 2. Extraccin y concentracin de los virus en las muestras de mejillones. 50 gr. de mejillones han sido inoculados con concentraciones conocidas de PV1 y VHA y tras la absorcin de estos virus, la muestra fue procesada segn el esquema siguiente: elucin alcalina con buffer Glycina 0.2M-0.15M NaCI, pH 9.5, precipitacin con polietilenglicol (PEG-1), purificacin con cloroformo y concentracin con una segunda precipitacin con PEG (PEG-2). 3. Extraccin de RNA vrico a partir de concentrados de la muestra. Se han evaluado dos mtodos de extraccin: el mtodo de extraccin en un solo paso que emplea guanidinium isotiocianato (GIT) y un mtodo comercial, Purescript TM(Gentra, Minneapolis, USA). 4. RT-PCR e hibridacin con sondas oligonucleotdicas. RESULTADOS El mtodo de extraccin y concentracin de virus entricos permiti obtener un concentrado final de 3.1+ 0.8 ml a partir de 50 gr. de muestra tras introducir una segunda precipitacin con PEG. La recuperacin de VHA y PV1 fue evaluada por ensayo de infectividad en cultivo celular y por RT-PCR e hibridacin. Para PV1 la recuperacin fue de 90.8+ 11% tras PEG-1 y 25.2+ 18% tras PEG-2. Para VHA la recuperacin result menos efectiva obtenindose valores de 48.3+ 21% tras PEG-1 y 1.2+ 0.6% tras PEG-2 posiblemente debido a que la agregacin entre partculas vricas y/o asociacin a slidos en suspensin dificulta su infectividad en cultivos celulares. Mediante RT-PCR el RNA de los virus no pudo ser detectado en los concentrados finales o slo tras una dilucin de la muestra debido a la presencia de inhibidores de la reaccin de amplificacin. Con objeto de eliminar los inhibidores de RT-PCR y mejorar la deteccin se ensayaron y compararon dos mtodos de extraccin de RNA: el mtodo de extraccin en un solo paso y un kit comercial, PurescriptTM. Ambos mtodos permitieron la amplificacin del RNA de PV1 y VHA directamente en los concentrados finales. La sensibilidad de la reaccin de RT-PCR determinada por el lmite de deteccin o endpoint fue similar para ambos procesos de extraccin. <0.5 PFU para PV1 y 15 MPNCU para VHA. Para el proceso completo la deteccin fue posible a niveles de inculo tan bajos como 4PFU/gr. para PV1 y 1.8-18 MPNCU/gr. para VHA. CONCLUSIONES El mtodo de extraccin y concentracin de virus entricos a partir de muestras de mejillones desarrollado es rpido, sensible, especfico y compatible con su deteccin por RTPCR. Aunque los dos mtodos de extraccin de RNA evaluados son similares con respecto a su efectividad en la eliminacin de inhibidores de RT-PCR, el mtodo comercial Purescript es ms rpido y no utiliza compuestos txicos como fenol o cloroformo.

.254.

EFECTO ANTIPROLIFERATIVO DE TRES CEPAS DE Enterococcus faecium EN UNA LNEA CELULAR DE MIELOMA
Zabala, A., R. Martn, A. Haza, L. Fernndez, J. M. Rodrguez y P. Morales. Dpto. Nutricin y Bromatologa III, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense. Ciudad Universitaria, 28040 Madrid. OBJETIVOS Se pretende establecer el efecto de tres cepas de Enterococcus faecium (E. faecium CH3, aislada de un embutido crudo madurado; E. faecium HN1 y E. faecium HA1, aisladas de muestras de heces de lactante y de adulto, respectivamente) sobre la proliferacin de una lnea celular de mieloma (clulas tumorales) y de la lnea celular Vero (clulas fisiolgicas). MTODOS Las tres cepas de E. faecium se seleccionaron al azar entre las colonias que crecieron al sembrar los homogeneizados de las respectivas muestras en placas de agar MRS y se sometieron a diversas pruebas microbiolgicas y bioqumicas bsicas. Posteriormente, se estudi su capacidad para sobrevivir y/o crecer en diferentes medios (incluyendo leche UHT) en diversas condiciones (pH, temperatura, NaCl). La identificacin de las cepas se realiz mediante anlisis de los perfiles de protenas totales obtenidos por electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS en la Coleccin de Cultivos BCCM/LMG (Universidad de Gante, Gante, Blgica). Las identificaciones se confirmaron mediante secuenciacin de productos de PCR que contenan secuencias de los genes de la fraccin RNAr 16S en el NIZO Food Research (Ede, Holanda). Las clulas Vero se cultivaron en el medio Dulbeccos Modified Eagle complementado con un 10% de suero fetal bovino, 50 IU ml-1 de penicilina, 50 mg ml-1 de estreptomicina y un 1% de L-glutamina. La lnea celular de mieloma P3X63-Ag8.653 se cultiv en medio RPMI-1640 complementado con un 15% de suero fetal bovin, 50 IU ml-1 de penicilina, 50 mg ml-1 de estreptomicina y un 1% de L-glutamina. Los cultivos celulares se incubaron a 37C y 100% de humedad en una atmsfera con un 5% de CO2. Para estudiar el efecto de las tres cepas de E. faecium (106, 107 y 108 ufc ml-1) en la proliferacin de las clulas Vero y de mieloma se utiliz el kit I de proliferacin celular (Roche Molecular Biochemicals). El ensayo MTT se efectu en placas microtituladoras de 48 pocillos y la densidad ptica de cada pocillo se midi a 620 y 690 nm en un lector iEMS Reader MF (Labsystems). Los resultados obtenidos se sometieron a un anlisis estadstico exhaustivo en la Unidad de Clculo de la UCM. RESULTADOS Las tres cepas fueron capaces de crecer en leche a diversas temperaturas de incubacin y durante tiempos prolongados. Los anlisis de los perfiles de protenas totales y de las secuencias nucleotdicas de los productos de PCR (RNAr 16S) coincidieron en la identificacin de las tres cepas como E. faecium. Los resultados de los ensayos MTT mostraron que, independientemente de la dosis empleada, ninguna de las cepas influa significativamente en la proliferacin de las clulas Vero. Sin embargo, las tres cepas inhibieron la proliferacin de las clulas de mieloma. La inhibicin fue de hasta un 35% en el caso de la cepa CH3, de hasta un 20% en el caso de la cepa HA1 y de hasta un 75% en el caso de la cepa HN1. El porcentaje de inhibicin de la proliferacin de las clulas de mieloma aumentaba con la dosis de bacterias utilizada en el ensayo MTT. CONCLUSIONES Ninguna de las cepas de E. faecium afectaron a la proliferacin de clulas fisiolgicas de mamfero (Vero) pero s a la de clulas tumorales (mieloma). Por lo tanto, mostraron un potencial probitico que puede ser aprovechado para la elaboracin de productos lcteos probiticos y que est siendo investigado en la actualidad.

.255.

EFECTO DEL SO2 Y OTROS COMPONENTES DEL VINO SOBRE LA ACTIVIDAD ATPasa Y LA SINTESIS DE PROTEINAS EN DIFERENTES CEPAS DE Oenococcus oeni.
Carret, R., Bordons, A. y Constant, M Departament de Bioqumica i Biotecnologa. Centre de Referncia de Tecnologia dAliments. Universitat Rovira i Virgili. Tarragona. OBJETIVOS Oenococcus oeni es el principal responsable de la fermentacin malolctica del vino. En el trabajo que presentamos nos hemos propuesto estudiar el efecto de algunos componentes del vino (cidos grasos C10 y C12, cobre y, especialmente, SO2) sobre el metabolismo celular (sntesis de protenas de estrs y actividad ATPasa) de distintas cepas, continuando con una serie de estudios previos. La ATPasa de membrana de O. oeni es una F1F0ATPasa, dependiente de Mg, inhibida por DCCD, cuya Km presenta un valor alrededor de 2 mM. METODOS En este trabajo se han utilizado tres cepas de O. oeni: una procedente de coleccin (CECT 4100), otra comercial (Vitilactic) y otra aislada por nuestro grupo de investigacin. Como medios de cultivo, se ha empleado MRS (medio de ensayo rico en nutrientes) y un vino sinttico. Las condiciones de estrs (etanol, cidos grasos C10 y C12, cobre, pH y SO2) son aplicadas, por un lado, sobre clulas en estado de reposo metablico (resting cells) y por otro, sobre clulas en crecimiento es su propio medio de cultivo y recogidas por centrifugacin. Posteriormente se asla la fraccin de membrana plasmtica celular sobre la cual se determina la actividad ATPasa por cuantificacin de fosfato liberado y se realizan los perfiles proteicos en electroforesis de SDSPAGE. RESULTADOS En primer lugar se ha analizado la actividad ATPasa a lo largo del crecimiento celular desde la fase exponencial inicial hasta bien entrada la fase estacionaria, as como los perfiles electroforticos de protenas, para determinar la fase de crecimiento idnea para estudiar los efectos de diferentes factores de estrs, siendo sta al final de la fase exponencial de crecimiento. Los resultados muestran la inhibicin de la actividad ATPasa en las diferentes condiciones de estrs estudiadas, especialmente en el caso del cido graso C12 (30% de inhibicin con 5 ppm de concentracin) y en presencia de sulfuroso (alrededor del 50% de inhibicin con concentraciones del 2.5-5% de SO2 en forma libre). Por otro lado, segn el perfil proteico, se observa la sobreexpresin de lagunas bandas de protenas en situaciones de estrs, especialmente una de 40 kDa en presencia de cobre, pH3 y SO2, e inhibicin de otras, especialmente en condiciones cidas. Estos resultados sugieren la posibilidad de caracterizar la protena asociada a la banda de 40 kDa mediante el estudio de su secuencia N-terminal, ya que su presencia es comn cuando las clulas se exponen a distintas condiciones de estrs. CONCLUSIONES As pues, podemos concluir que tanto la actividad ATPasa como la sntesis de protenas de estrs son buenos parmetros bioqumicos indicadores del estado del metabolismo celular.

.256.

PURIFICACIN, RECONSTITUCIN Y CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE LmrA, UNA PROTENA DE MEMBRANA DE Lactococcus lactis IMPLICADA EN LA RESISTENCIA A ANTIBITICOS Y COMPUESTOS CITOTXICOS.
Abelardo Margolles*, Monique Putman, Hendrik W. van Veen y Wil Konings. Departamento de Microbiologa, Universidad de Groningen, Kerklaan 30, Haren, 9750AA, Holanda. URI:http://www.biol.rug.nl * Direccin actual: Instituto de Productos Lcteos de Asturias, (CSIC) Carretera de Infiesto s/n, 33300, Villaviciosa, Asturias. OBJETIVOS Lactococcus lactis posee un sistema de transporte dependiente de ATP denominado LmrA (Lactococcus multidrug resistant ATP-dependent protein) que est implicado en la resistencia a diferentes compuestos citotxicos, incluidos algunos antibiticos. Este transportador est formado por 590 aminocidos organizados en dos dominios: (i) un dominio hidrofbico en el extremo amino terminal formado por 6 segmentos transmembrana y (ii) un dominio hidroflico que contiene el sitio de unin a ATP. Su estructura primaria indica una elevada homologa con numerosas protenas, tanto de eucariotas como de procariotas, implicadas en "multidrug resistance (MDR)". El objetivo de este trabajo es el estudio funcional de LmrA en una forma aislada, sin la influencia de otras protenas de membrana o compuestos citoplasmticos que puedan influir sobre la actividad del transportador. MTODOS Se introdujo una cola de histidinas en el extremo amino terminal con el objeto de facilitar la purificacin de LmrA por cromatografa de afinidad. La protena resultante se expres en Lactococcus lactis utilizando el sistema NICE (NIsin-Controlled gene Expression system), en el que el gen estructural se localiza bajo el control del promotor de la nisina. Para reconstituir LmrA en una membrana lipdica la protena se solubiliz con el detergente dodecil maltsido (DDM), se purific utilizando cromatografa de afinidad de nquel y se reconstituy en liposomas preparados con fosfolpidos de Lactococcus lactis. El detergente se elimin por adsorcin utilizando Bio-Beads SM2. Para los ensayos de transporte se emplearon sustratos fluorescentes (Hoechst-33342, C6-NBD-PE y C6-NBD-PC), los cuales permiten un seguimiento continuo del proceso de transporte. RESULTADOS El sistema NICE permiti obtener niveles de expresin de LmrA del orden de 30-35% de la protena total de membrana. La protena es expresa en forma funcional, como demuestran los ensayos de actividad realizados en clulas y en vesculas de membrana de Lactococcus lactis. La purificacin por cromatografa de afinidad de nquel nos permiti obtener aproximadamente 1,2 mg de LmrA partiendo de 15 mg de protena total de membrana. Para la reconstitucin de la protena, los liposomas se desestabilizaron y titularon utilizando como detergente DDM, mezclndose posteriormente con una solucin de LmrA en proporciones adecuadas. La protena incorporada en los liposomas es funcional y es capaz de transportar diferentes sustratos tpicos de MDR transportadores, tales como drogas anticancergenas (Hoechst-33342 y vinblastina), as como derivados fluorescentes de lpidos (C6-NBD-PE). CONCLUSIONES LmrA puede sobreexpresarse en Lactococcus lactis y purificarse utilizando DDM como detergente. La protena es activa cuando se encuentra reconstituida en liposomas preparados con fosfolpidos de Lactococcus lactis.

.257.

.258.

PSTERS SELECCIONADOS II
Moderador: Dr. Juan A. Ordez Pereda

.259.

.260.

INFLUENCIA DE Penicillium chrysogenum y Debaryomyces hansenii EN LA GENERACIN DE COMPUESTOS VOLTILES EN JAMN CURADO
A. Martn*, J.J. Crdoba, M.J. Benito*, M. Alonso y M.A. Asensio Higiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. UEX. 10071. Cceres (*) Nutricin y Bromatologa. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. EUITA. UEX. 06071.Badajoz Correo electrnico: amartin@unex.es Las reacciones que conducen a la formacin de los compuestos responsables del sabor y del aroma del jamn curado son muy complejas. Los mohos y las levaduras, aislados frecuentemente durante la maduracin, poseen potentes equipos enzimticos capaz de contribuir a la proteolisis observada en jamn curado, pero no est clara su influencia en la formacin de compuestos voltiles. La utilizacin de cepas de mohos y levaduras con capacidad para generar compuestos voltiles como cultivos iniciadores en jamn curado, adems de excluir a especies toxignicas de mohos, sera de gran inters para el desarrollo de las caractersticas sensoriales del producto acabado. OBJETIVOS. Determinar la posible contribucin de cepas no toxignicas de Penicillium chrysogenum Pg 222 y Debaryomyces hansenii Dh344, seleccionadas por su actividad proteoltica, a la produccin de compuestos voltiles responsables del aroma en productos crnicos madurados. MTODOS. Se realizaron 2 ensayos: uno con un sistema crnico modelo constituido por lomos obtenidos en condiciones estriles, y otro con jamn curado. Para el primero se inocul P. chrysogenum y D. hansenii por separado y de forma conjunta, manteniendo un lomo estril como control. Cada lomo fue madurado en recipientes estriles y se tomaron muestras a los 59 y 106 das de maduracin. En el ensayo con jamn se inocularon ambos microorganismos conjuntamente al inicio y final de post-salado. Se tomaron muestras a los 6 y 12 meses de maduracin, en superficie y profundidad. Tanto en las muestras de lomos como de jamn curado se analizaron los compuestos voltiles obtenidos mediante fibra de carboxen-polidimetilsilosano. Los compuestos extrados con la fibra se analizaron mediante GC-MS. RESULTADOS. En lomos, P. chrysogenum disminuye los aldehdos y alcoholes lineales e incrementa las piracinas y los pirroles. D. hansenii genera en los lomos alcoholes especficos como benceno etanol o ciclohexanol y otros compuestos como furanos. El efecto de los microorganismos inoculados en jamn curado se traduce en una menor cantidad de aldehdos lineales en los jamones con 6 meses de maduracin, as como en las muestras superficiales en ambas tomas de muestras. A los 12 meses, los furanos y steres son ms abundantes en las muestras inoculadas. CONCLUSIN La inoculacin de P. chrysogenum y D. hansenii en productos crnicos repercute en una menor formacin de compuestos voltiles asociados a procesos oxidativos y en una mayor concentracin de compuestos derivados de la actividad microbiana, pudiendo as contribuir en el sabor y aroma de los productos crnicos.

.261.

EFECTO DE LA COMPETICIN FNGICA EN LA COLONIZACIN DE GRANOS DE MAZ POR Fusarium moniliforme, F. proliferatum Y F. graminearum Y EN LA PRODUCCIN DE FUMONISINA B1 Y DE ZEARALENONA
A. Velluti, S. Marn, L. Bettucci, A. J. Ramos, V. Sanchis. Dpto. de Tecnologa de Alimentos. Univ. de Lleida. CeRTA. Av. Rovira Roure 177, 25198 Lleida. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es evaluar, bajo diferentes condiciones de laboratorio, el efecto de la interaccin en el crecimiento y la produccin de toxinas entre cepas productoras de fumonisinas de Fusarium moniliforme o de F. proliferatum y una cepa de F. graminearum productora de zearalenona (ZEA). MTODOS Los estudios se realizaron inoculando las cepas en granos de maz irradiados con diferentes aw (0.98, 0.95, 0.93) e incubados a diferentes temperaturas (15 y 25C), durante 4 semanas. Luego de este perodo, se analizaron las unidades formadoras de colonias (UFCs) y las toxinas, fumonisinas B1 (FB1) y zearalenona (ZEA). La cuantificacin de FB1 se realiz por HPLC segn una modificacin del mtodo de Shephard et al.(1990) y para la cuantificacin de ZEA se sigui el mtodo de la AOAC (AOAC, 1997). RESULTADOS Todos los factores simples, aw, temperatura y presencia de F. graminearum afectaron significativamente las UFCs de F. moniliforme y de F. proliferatum. Se observaron ms UFCs a 25C que a 15C y ms a 0.98 que a 0.95 y 0.93 de aw. En presencia de F. graminearum se observ una reduccin significativa en las UFCs de F. moniliforme y de F. proliferatum bajo todas las condiciones analizadas. Las UFCs de F. graminearum fueron afectadas significativamente por la aw, la temperatura y por la presencia de F. moniliforme y de F. proliferatum. Se observaron ms UFCs a 25C que a 15C y ms a 0.98 que a 0.95 y 0.93 de aw. En presencia de F. moniliforme, las UFCs de F. graminearum fueron significativamente reducidas a 15 y a 25C, mientras que en presencia de F. proliferatum las UFCs de F. graminearum mostraron una disminucin significativa a 25C. La produccin de FB1 por F. proliferatum fue afectada significativamente por todos los factores, observndose una mayor produccin a 15C que a 25C y a 0.98 que a 0.95 y a 0.93 aw. En presencia de F. graminearum se observ una reduccin en la produccin de esta toxina, siendo esta inhibicin mayor a 15C que a 25C y a 0.98 mayor que a 0.95 y a 0.93 de aw. La produccin de FB1 por F. moniliforme fue afectada significativamente por la aw y por la presencia de F. graminearum. La produccin se increment con el aumento de la aw de los granos y en presencia de F. graminearum se observ una inhibicin en la produccin de esta toxina a 15C, mientras que a 25C la produccin fue potenciada significativamente principalmente a 0.95 y a 0.98 de aw. La produccin de ZEA por F. graminearum fue mayor a 15C que a 25C y mayor a 0.98 que a 0.95 y 0.93 de aw, pero ni la presencia de F. moniliforme ni la de F. proliferatum afect significativamente a esta produccin. CONCLUSIONES Nuestros resultados sugieren que cuando las condiciones ambientales en los granos de maz son favorables y cepas potencialmente productoras de toxinas de F. proliferatum y de F. graminearum coexisten, podra esperarse una disminucin en la concentracin de FB1 pero la produccin de ZEA permanecera sin ser afectada. En cambio, si coexistieran F. moniliforme y F. graminearum, la produccin de FB1 podra ser potenciada en ciertas condiciones, mientras que no se esperaran cambios en la concentracin de ZEA.

.262.

COMBINACIN DE BACTERIOCINAS Y CEPAS DE Lactobacillus plantarum PRODUCTORAS DE BACTERIOCINAS EN LA FERMENTACIN Y CONSERVACIN DE ZANAHORIAS
R. Jimnez Daz, B. Floriano, A. Maldonado, L. Rejano, A.H. Snchez y J.L. Ruiz Barba. Dpto. de Biotecnologa de Alimentos, Instituto de la Grasa (CSIC), Avda. Padre Garca Tejero, 4, Aptdo. 1078, 41012 Sevilla. OBJETIVOS Estudiar si la utilizacin de cepas de L. plantarum productoras de bacteriocinas en la fermentacin de zanahorias y la adicin posterior de bacteriocinas al producto envasado supone una ventaja en la conservacin a largo plazo de dichos productos vegetales. MATERIALES Y METODOS Como cultivos iniciadores se utilizaron L. plantarum LPCO10 SmR [productora de plantaricina S (plS+) y resistente a la misma (plSR), 105 UFC/ml], L. plantarum LP128/2 RifR (plS-, plSS, 104 UFC/ml) y L. plantarum LP55-1 SmR (plS-, plSR, 105 UFC/ml). Las zanahorias se sumergan en agua a 80C durante 5 min., se cortaban a rodajas y se colocaban en salmuera (7%NaC1) en fermentadores de 5 kg. Los ensayos de fermentacin se realizaron de la siguiente forma: los fermentadores por parejas- se inocularon con las cepas LPCO10, y LP55-1, LP128/2 en cultivos simples, y con las cepas LP128/2 y LP55-1, LPCO10 y LP128/2 en cultivos mixtos, incubndose durante 15 das a 30C. Peridicamente se realizaban anlisis microbiolgicos y fsico-qumicos de las salmueras. Para los ensayos de conservacin, las zanahorias se trataron como se describe anteriormente, inoculndose dos fermentadores con L. plantarum LPCO10 SmR (plS+, plSR) y otros dos con L. plantarum LP55-1 SmR (plS-, plSR). A los 2 das de fermentacin (fermentacin incompleta) las zanahorias pertenecientes a cada grupo de fermentacin se envasaron enfrascos de cristal (140 g. de zanahorias/100 ml de salmuera), dividindolos a su vez en tres series: una, de envasados a acidez alta (0,5%), otra, a acidez media (0,3%), y una tercera, a acidez baja (0,03%). A la serie correspondiente a acidez baja se le aadi tambin sorbato (0,12 g/frasco). Los frascos se pasteurizaron (6 min. a 80C) y a cada uno de ellos se les aadi aprx. 102 UFC/ml de la cepa L. plantarum 128/2 y dos niveles diferentes de enterocina I (ENTI, una bacteriocina producida por Enterococcus faecium 6T1a) semipurificada: 6 x 105 y 6 x 104 unidades de ENTI por ml (UENTI/ml), respectivamente. Los frascos se incubaron a 25C y se tomaron muestras a t = 0, t = 30 das, t = 120 das y t = 180 das, determinndose en cada caso los parmetros fsico-qumicos y microbiolgicos de las muestras. RESULTADOS Las fermentaciones de zanahorias utilizando cultivos iniciadores de cepa nica evolucionaron de manera similar, tanto desde el punto de vista microbiolgico como desde el punto de vista fsico-qumico. Sin embargo, en las fermentaciones donde se utilizaron cultivos mixtos, la cepa LP128/2 predomin sobre la cepa LP55-1, mientras que la cepa LPCO10 lo hizo sobre la cepa LP128/2. En cuanto a la conservacin, en todos los casos hubo desarrollo de la cepa inoculada (LP128/2) a t = 30 das(aprox. 107 UFC/ml). Sin embargo, a t = 120 y 180 das, la cepa inoculada se mantuvo en valores comprendidos entre 104 y 106 UFC/ml en el caso de las zanahorias fermentadas con el cultivo iniciador L. plantarum LP55-1, mientras que prcticamente no se detect en ninguno de los frascos que contenan las zanahorias fermentadas con la cepa bacteriocinognica L. plantarum LPCO10, ms cualquiera de los niveles de ENTI. CONCLUSIONES 1) De los cultivos iniciadores utilizados, la cepa LPCO10 result ser el mejor para la fermentacin de zanahorias. 2) Existe un efecto sinrgico entre la bacteriocina exgena (ENTI) y la producida in situ por la cepa LPCO10 (plS), lo que demuestra la conveniencia de dicha combinacin para una conservacin adecuada del producto.

.263.

CARACTERIZACIN DE LA RESPUESTA AL ESTRS POR FRO EN CEPAS DE LEVADURA DE PANADERA

1

Rodrguez-Vargas, S.1,2; Randez-Gil, F.2 y Estruch, F.1,2 Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad de Valencia, Dr. Moliner s/n, 46100-Burjassot (Valencia). 2 Departamento de Biotecnologa, Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (C.S.I.C.), Apdo. de Correos 73, 46100-Burjassot (Valencia).

Los hbitos alimenticios de la poblacin estn cambiando y con ellos las exigencias del consumidor. En el campo de la panificacin este hecho se ha traducido en un aumento de la demanda de productos listos para su uso. Como consecuencia, la produccin de masas congeladas para la elaboracin de productos de panadera y bollera ha experimentado un fuerte crecimiento. Sin embargo el auge y expansin de este sector productivo se ha visto en parte limitado por los problemas tecnolgicos derivados de la no disponibilidad de cepas de levadura de panadera tolerantes a la congelacin. La respuesta de S. cerevisiae frente a estreses como el choque trmico, alta osmolaridad o agentes oxidantes ha sido ampliamente estudiada. Sin embargo, la respuesta al estrs por fro ha recibido escasa atencin. Recientemente, utilizando la tcnica del Diferential Display hemos identificado genes inducidos en el proceso de congelacin y descongelacin en cepas industriales y de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae. Anlisis mediante Northern del nivel de transcrito presente en varias cepas industriales de panadera con diferente grado de criorresistencia, nos ha permitido establecer una correlacin entre el nivel de expresin de varios genes inducidos por fro y tolerancia a la congelacin. Caracterizacin mediante alineamiento y bsqueda de similaridades de secuencias de cidos nucleicos de los promotores de genes inducidos por fro indica tambin la existencia de zonas consenso. En conclusin, nuestros resultados sugieren que S. cerevisiae exhibe una respuesta especfica al estrs por fro. La identificacin de secuencias consenso en promotores de genes inducidos bajo esta situacin fisiolgica abre la va para identificar posibles factores transcripcionales implicados en su regulacin, y por tanto para disear estrategias para mejorar la crioresistencia de cepas industriales de panadera.

.264.

DESARROLLO DE UNA TCNICA IMPEDANCIOMTRICA PARA LA DETECCIN DE RESIDUOS DE ANTIBITICOS EN CARNES

Lpez-Cabanillas Lomel, M.; Roig Sagus, A.X. y Rodrguez Jerez, J.J. Higiene e Inspeccin de los alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Autnoma de Barcelona, 08193. Bellaterra (Barcelona). ESPAA OBJETIVOS La influencia de los residuos de antibiticos en los alimentos es cada vez ms importante como factor desencadenante de antibioresistencias bacterianas. El principal problema reside en el empleo de antibiticos en la alimentacin animal, para su engorde, o para el tratamiento de diferentes problemas patolgicos, sin aplicar los preceptivos tiempos de espera. Quizs un problema ser el disponer de tcnicas, lo suficientemente precisas, que nos permitan hacer un examen previo para poder discriminar inicialmente entre muestras positivas y negativas. Para ello, una opcin es el empleo de microorganismos sensibles a los antibiticos, que permitan un anlisis sencillo y discriminante. En este caso, el principal problema es el encontrar un microorganismo, lo suficientemente sensible, para poder utilizarse independientemente del residuo de antibitico presente en la carne. Al mismo tiempo, sera interesante el poder desarrollar una tcnica sencilla, que adems nos pueda permitir obtener resultados de una forma rpida, en menos de 4 horas. Por estos motivos, con nuestro estudio hemos pretendido desarrollar una tcnica rpida, de tipo microbiolgico, que en menos de 4 horas nos permita determinar la presencia de residuos de antibiticos en carnes de consumo. MTODOS Para el desarrollo de nuestro estudio se ha empleado una cepa de referencia de Bacillus stearothermophilus CECT 47. Esta cepa se ha calibrado por espectrofotometra e impedancia para la estimacin rpida de su recuento. Una vez calibrada, se inocul una concentracin constante del microorganismo (1 x 107 ufc/ml), procedindose al calculo de la concentracin de antibitico en base a la inhibicin o retardo que se produce en el tiempo de deteccin esperado. RESULTADOS Nuestros resultados sealan que Bacillus stearothermophilus puede ser calibrado con una excelente correlacin a una temperatura de 48C. Al mismo tiempo nuestros resultados indican que la mnima concentracin de penicilina que puede ser detectada es de 1 ng/g de carne. Si consideramos que la normativa actualmente vigente seala 5 ng/g como concentracin mxima aceptable en la carne, podemos ver que con nuestro mtodo, podramos estar en condiciones de detectar la presencia de concentraciones de este antibitico por debajo y por encima de los niveles aceptables. CONCLUSIONES - Nuestros resultados confirman algunos estudios previos en el sentido que es posible el desarrollo de una tcnica de discriminacin para la deteccin de residuos de antibiticos en carnes en menos de 4 horas. - La bacteria de referencia para la penicilina debera ser Bacillus stearothermophilus, incubando a 48C, debindose comprobar si este microorganismo puede ser empleado para la deteccin de otros antibiticos como bacteria de referencia. - La determinacin sera eficaz, de acuerdo con la normativa vigente, y se podra obtener un resultado fiable en menos de 4 horas, para penicilina, con una mnima manipulacin.

.265.

DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA LA GENERACIN DE BACTERIAS DEL CIDO LCTICO RECOMBINANTES DE GRADO ALIMENTARIO
1

Miguel A. Alvarez1 , M. Cruz Martn1 y Juan E. Surez1,2 Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC), Ctra. de Infiesto s/n. 33300-Villaviciosa, Asturias. 2 Area de Microbiologa, Universidad de Oviedo. C/ Julin Clavera s/n, 33006-Oviedo.

OBJETIVOS. Las bacterias del cido lctico se utilizan como iniciadores en la fermentacin industrial de alimentos. La mayora de sus propiedades tecnolgicas estn codificadas por plsmidos y son, por tanto, inestables (Hill, 1993, FEMS Microbiol. Rev. 12:87-108). Debido a esto, nos planteamos desarrollar un sistema que permita la estabilizacin de ADN en el genoma de bacterias lcticas y que pueda ser utilizado en fermentaciones cuyo producto final est destinado al consumo humano. MTODOS. Mediante tcnicas de Biologa Molecular se ha construido un vector de clonacin integrativo y un sistema de depuracin basados en una integrasa (Int) y una resolvasa () as como en sus respectivos sitios de reconocimiento (attP/attB y six). El vector de clonacin, pEM76, tiene un origen de replicacin de E. coli (pUC19) y varios genes de resistencia a antibiticos (Ap y Em) flanqueados por dos sitios six, un sitio de multiclonado para insertar el ADN a estabilizar y la regin int-attP del fago A2 (Alvarez et al., 1998, Virology 250:185-193). El sistema depurativo consiste en un plsmido, pEM94, con un origen de replicacin sensible a la temperatura (pG+host9) y portador del gen que codifica la resolvasa (Rojo y Alonso, 1994, J. Mol. Biol. 238:159-172). RESULTADOS. Se transform Lactobacillus casei ATCC 393 con el vector integrativo pEM76 el cual mediante recombinacin sitio-especfica se integr en el sitio attB presente en el genoma del hospedador. La cepa as obtenida se co-transform con el plsmido portador del gen que codifica la resolvasa . La expresin de este gen permiti eliminar todo el ADN de grado no alimentario comprendido entre los sitios six. El ltimo paso consisti en incubar esta cepa a temperatura no permisiva, con el fin de curar el plsmido depurativo, cuyo origen de replicacin es sensible a la temperatura. Todo los pasos del proceso fueron comprobados mediante PCR e hibridacin Southern. Para validar el mtodo se clon en el vector integrativo pEM76 el gen cI, que codifica el represor del fago A2 (Alvarez et al., 1999, J. Appl. Microbiol. 86:812-816) y se sigui todo el procedimiento previamente descrito obtenindose una cepa de L. casei de grado alimentario y completamente resistente a la infeccin fgica. Para determinar el valor tecnolgico de este resultado se comprob que la cepa obtenida era capaz de producir leche fermentada en presencia del fago A2 y que adems el fenotipo era totalmente estable. CONCLUSIONES. Se ha construido un nuevo sistema para la integracin estable de ADN en el cromosoma bacteriano y un sistema depurativo que permite la eliminacin del ADN heterlogo necesario para las manipulaciones genticas llevadas a cabo. El sistema se valid mediante la construccin de una cepa de L. casei completamente resistente a la infeccin por el fago A2 durante la fermentacin de leche.

.266.

RELACIN DE PSTERS POR REAS TEMTICAS

.267.

.268.

Ttulo Efecto de distintas bacteriocinas y sus combinaciones frente a microorganismos patgenos.

Autores Arqus, J.L. Medina, M. Nez, M Rodrguez, E. Caracterizacin de una bacteriocina producida por Enterococcus Fernndez, J. faecalis TAB52. Medina, M. Nez, M. Rodrguez, E. Aislamiento y seleccin de lactobacilos productores de reuterina a Arqus, J.L. partir de heces de cerdo. Fernndez, J. Gaya, P. Medina, M. Nez, M. Rodrguez, E. Combinacin de bacteriocinas y cepas de Lactobacillus plantarum Floriano, B. productoras de bacteriocinas en la fermentacin y conservacin de Jimnez Daz, R. zanahorias. Maldonado, A. Rejano, L. Ruiz Barba, J.L. Presencia del opern plnABCD, precursor de la plantaricina A, en Dizy, M. bacterias lcticas de vinos de D.O.C. Rioja. Navarro, L. Ruiz-Larrea, F. Torres, C. Zarazaga, M. Control del desarrollo de microorganismos patgenos Martnez, B. (Staphylococcus aureus) y alterantes (Clostridium tyrobutyricum) Rilla, N. en quesos mediante cepas productoras de nisina Z. Rodrguez, A. Produccin de bacteriocinas por bacterias lcticas de origen animal. Robredo, B Tenorio, C. Torres, C. Inhibicin de bacterias patgenas por bacteriocinas y/o blis Caro-Canales, I. producidos por la microbiota del chorizo de Cantimpalos Fernndez-Barata, V.M. (Segovia). Garca-Lpez, M.L. Gonzlez-Rodrguez, M.N. Otero, A. Sanz-Gmez, J.J. Anlisis microbilgico de yogures y leches fermentadas Aguiar, J.M. comercializados en Espaa. Gonzlez, M.P. Marcos, S. Nicols, P. Deteccin de Listeria monocytogenes en carne mediante PCR. Alarcn, B. Aznar, R. PROBELIATM: Deteccin rpida y fiable de microorganismos en Bio-Rad Laboratories, S.A. alimentos mediante tcnicas de PCR. Deteccin directa de Arcobacter en aguas por PCR. Aguirre, G. Botella, M.S. Ferrs, M.A. Hernndez, J. Jimnez, A. Soriano, A.

Cdigo ABA/1

ABA/2

ABA/3

ABA/4

ABA/5

ABA/6

ABA/7

ABA/8

CC/1

CC/2 CC/3 CC/4

.269.

Ttulo Incidencia de Campylobacter en productos crnicos.

Caracterizacin de Petrifilm Series 2000 como un posible mtodo rpido para el recuento de coliformes en alimentos. Elaboracin de suspensiones estandarizadas de Staphylococcus aureus para el control de calidad analtica en alimentos.

Influencia del tiempo de almacenamiento en temperaturas de congelacin sobre la carga microbiana en helados. Validacin interlaboratorio del mtodo Presencia/Ausencia para anlisis microbiolgico de aguas. Estudio de la actividad proteoltica de Debaryomyces hansenii Dh345 aislada de jamn curado.

Autores Esteban, J.R. Hernndez, J. Hernndez, M. Moreno, Y. Sez, R. Vanoostende, A. Jordano, R. Medina, L.M. Priego, R. de Simn, M. Ferrer, M.D. Peir, E. Razqun, E. Castillo Lpez, R. S nchez Hernndez, F.C. Serrano Vera, A. Sanchs Solera, J. Alonso, M. Asensio, M.A. Benito, M.J. Bermdez, M.E. Nez, F. Benito, M.J. Crdoba, J.J. Martn, A. Nez, F. Rodrguez, M.M. Alonso-Calleja, C. Alonso-Llamazares, A. Caro, I. Garca-Armesto, M.R. Mateo, J. Bruna, J.M. de la Hoz, L. Fernndez, M. Ordez, J.A. Fajardo, M.C. Fernndez, K. Hidalgo, P. Luna, N. Simn, B. Briones, A.I. Espinosa, J.C. Fernndez, M. Hernndez, L.F. Carballo, J. Castao, A. Garca, M.C. Tornadijo, M.E.

Cdigo CC/5

CC/6

CC/7

CC/8

CC/9 FM/1

Actividad hidroltica sobre protenas miofibrilares de Penicillium chrysogenum aislado de jamn curado.

FM/2

Caracterizacin taxonmica y tecnolgica de bacterias cidolcticas aisladas de queso tipo castellano.

FM/3

Mejora de las propiedades sensoriales de los embutidos crudos curados mediante la adicin de una proteasa (Pronasa E) y/o un extracto intracelular de Penicillium camemberti. Presencia y estudio del carcter floculante en cepas vnicas de Saccharomyces cerevisiae.

FM/4

FM/5

Evaluacin de la actividad -glucosidsica en Saccharomyces cerevisiae.

FM/6

Identificacin de las bacterias lcticas aisladas del chorizo de cebolla (embutido tradicional gallego)

FM/7

.270.

Ttulo Estudio de la microbiologa del zumo de meln y su idoneidad como sustrato de la fermentacin alcohlica.

Autores Briones, A.I. Fernndez, M. Hernndez, L.F. Rodrguez, G. beda, J. Aplicacin de nuevas cepas de levadura de panadera de Torulaspora Hernndez-Lpez, M.J. delbrueckii con mayor tolerancia a la congelacin. Prieto, J.A. Randez-Gil, F. Potenciacin de las caractersticas sensoriales de embutidos crudos Bruna, J. curados mediante la adicin de un extracto enzimtico crudo de De la Hoz, L. Bacillus pumilus y/o Papana. Fernndez, M. Herranz, B. Ordez, J.A. Identificacin, tipificacin y comportamiento fermentativo de Fajardo, M.C. levaduras autctonas de la D.O. de vinos de Madrid con capacidad Gallego, F.J. floculante. Hidalgo, P. Luna, N. Martnez, I. Simn, B. Estudio clonal de cepas de bacterias lcticas endgenas de vinos de Dizy, M. D.O.C. Rioja. Fernndez, E. G. Alegra, E. Lpez, I. Ruiz-Larrea, F. Torres, M. Influencia de diversos factores en el crecimiento de Penicillium Encinas, J.P. aislado de la superficie del chorizo de Cantimpalos. Garca Lpez, M.L. Lpez Daz, T.M. Otero, A. Influencia de Penicillium chrysogenum y Debatyomyces hansenii Alonso, M. en la generacin de compuestos voltiles en jamn curado. Asensio, M.A. Benito, M.J. Crdoba, J.J. Martn, A. Evolucin de bacterias cido lcticas durante la maduracin del Cceres, P. queso de Ibores. Gonzlez, J. Mas, M Moriche, J. Rebollo, J.E. Roa, I. Tabla, R. Recuento de lactobacilos e identificacin de Lactobacillus casei en Oneca, M. quesos con Denominacin de Origen Roncal. Torre, P. Efecto de la pasterizacin y adicin de un fermento nativo sobre Izco, J. los compuestos voltiles den el queso Roncal. Ortigosa, M. Torre, P. Control mediante PCR de la fermentacin alcohlica del mosto de Fernndez Tascn, N. manzana. Garca Castro, M. Pando Bedriana, R. Surez Valles, B.

Cdigo FM/8

FM/9

FM/10

FM/11

FM/12

FM/13

FM/14

FM/15

FM/16 FM/17

FM/18

.271.

Ttulo Incremento del vigor fermentativo de las levaduras vnicas mediante eliminacin de alelos recesivos que retardan el crecimiento.

Autores Prez, F. Ramrez, M. Rebollo, J.E. Regodn, J.A. Actividad proteoltica, aptitud tecnolgica y perfiles plasmdicos de Cceres, P. lactococos aislados de quesos de Ibores. Gonzlez, J. Mas, M. Moriche, J. Rebollo, J.E. Roa, I. Tabla, R. Estudio comparativo de la cintica de acidificacin y composicin Bayona, M. microbiolgica entre nueve lactosueros seleccionados y un Le Mens, P. fermento comercial. Romero del Castillo, R. Tormo, H. Aspectos microbiolgicos de la maceracin prefermentativa en fro Epifanio, S. con la variedad tempranillo de la D.O.C. Rioja. G. Alegra, E. Garijo, P. Gutirrez, A.R. Lpez, R. Martnez, J. Ruiz, F. Santamara, P. Caracterizacin de la actividad enzimtica de levaduras aisladas de Domnguez, R. embutidos madurados. Garca, M.L. Ros, J. Selgas, M.D. Estudio de las caractersticas organolpticas de las berenjenas de L.L., M. Almagro obtenidas por fermentacin dirigida y con frutos Snchez-Hurtado, I. congelados. Sesea, S. Monitorizacin de levaduras comerciales durante el proceso de Belloch, C. vinificacin mediante RFLP. Querol, A. Uruburu, F. Villa, M. Conversin de metionina y animocidos aromticos en bacterias Amrita, F. lcticas. Amigo, L. Parra, L. Pelez, C. Requena, T. Taborda, G. Efecto del SO2 y otros componentes del vino sobre la actividad Bordons, A. ATPasa y la sntesis de protenas en diferentes cepas de Carret, R. Oenococcus oeni. Constant, M. Actividad enzimtica de microorganismos aislados de tapones de Calvo, M.A. corcho para vinos. Centeno, S. Caracterizacin de la respuesta al estrs por fro en cepas de Estruch, F. levadura de panadera. Randez-Gil, F. Rodrguez-Vargas, S. Desarrollo de un sistema para la generacin de bacterias del cido lvarez, M.A. lctico recombinantes de grado alimentario. Martn, M.C. Surez, J.E.

Cdigo FM/19

FM/20

FM/21

FM/22

FM/23

FM/24

FM/25

FYM/1

FYM/2

FYM/3 FYM/4

GM/1

.272.

Autores Delgado, S. Mayo, B. lvarez, M.A. Caso, J.L. Fernndez, M. Herrero, M. Surez, J.E. El locus responsable de la produccin de plantaricina S, una Floriano, B. bacteriocina producida por Lactobacillus plantarum LPCO10, est Jimnez Daz, R. ampliamente distribuido entre cepas de Lactobacillus plantarum Maldonado, A. aisladas de fermentaciones de aceitunas. Ruiz Barba, J.L. Caracterizacin preliminar de pEF1, un plsmido de Enterococcus Floriano, B. faecium 6T1a que codifica enterocina I. Jimnez Daz, R. Maldonado, A. Ruiz Barba, J.L. Secuencia y anlisis del plsmido bacteriocinognico pBL1 de Hernndez de Rojas, A. Lactococcus lactis IPLA 972. Martnez, B. Mayo, B. Rodrguez, A. S nchez, C. Caracterizacin gentica de levaduras vnicas por TGGE. Espinosa, J.C. Hernangmez, S. beda, J. Caracterizacin molecular del gnero Pichia. Belloch, C. Querol, A. Uruburu, F. Villa, M. Estudio del estado de salud de las uvas y desarrollo de Botrytis Bermejo, E. cinerea en estos frutos. Dorado, M. Gonzlez, J.L. Luna, N. Snchez, A. Evolucin estacional de diferentes grupos microbianos alterantes y Fernndez-Barata, V.M. de inters tecnolgico en leche de oveja. Garca-Armesto, M.R. Garca-Lpez, M.L. Moreno, B. Sanjun, S. Identificacin del agregado Aspergillus niger por tcnicas de Bueno, L. biologa molecular. Garca-Lpez, M.D. Lpez-Coronado, J.M. Lpez-Ocaa, L. Perfiles de alteracin en conservas vegetales. Causas y acciones correctoras propuestas. Gonzlez, C. Juregui, J.I. Lana, M. Lumbreras, M. P rez de Juan, J. Alfaro, B. P rez-Villareal, B.

Ttulo Caracterizacin genotpica y fenotpica de cepas salvajes de Lactococcus lactis aisladas de quesos artesanos. Desarrollo de nuevos sistemas de proteccin de bacterias del cido lctico frente a la infeccin por bacterifagos.

Cdigo GM/2 GM/3

GM/4

GM/5

GM/6

GM/7

MA/1

MA/2

MA/3

MA/4

MA/5

Optimizacin de un mtodo rpido de concentracin de Zygosaccharomyces rouxii en alimentos lquidos.

MA/6

.273.

Ttulo Efecto de la competicin fngica en la colonizacin de granos de maz por Fusarium moniliforme, F. proliferatum y F. graminearum y en la produccin de fumonisina B1 y de zearelenona. Evaluacin del sistema ISO-GRID para la determinacin de Escherichia coli a partir de alimentos.

Autores Bettucci, L. Marn, S. Ramos, A.J. Sanchis, V. Velluti, A. Alonso-Calleja, C. Capita, R.M. Garca Fernndez, M.C. Moreno, B Rodrguez Prez, R. Andueza, F. Araque, J. Cermeo, L Pea, A Aranda, E. Crdoba, J.J. Crdoba, M.G. Rodrguez, M.M. Sosa, M.J. Alonso-Calleja, C. Capita, R. Garca-Arias, M.T. Garca-Fernndez, M.C. Moreno, B. Araujo, A.B. Carballo, J. Snchez, C. Casas, N. Suen, E.

Cdigo MA/7

MIS/1

Aislamiento e identificacin de especies de Aeromonas en leche cruda.

MIS/2

Evaluacin y caracterizacin de la sonda SVR1 para la deteccin sensible y especfica de Penicillium polonicum productor de verrucosidina en productos crnicos.

MIS/3

Comparacin de la eficacia de los medios PALCAM y OXFORD modificado (OM) para el aislamiento de Listeria spp. y de Listeria monocytogenes a partir de carne de pollo.

MIS/4

Supervivencia a la esterilizacin por calor de Salmonella spp. y Listeria monocytogenes adheridas a materiales de contacto con alimentos. Comparacin de dos mtodos de extraccin de RNA para la deteccin del RNA de enterovirus y VHA en mejillones mediante RT-PCR. Identificacin de las enterobactericeas aisladas del chorizo de cebolla (embutido tradicional gallego).

MIS/5

MIS/6

Valoracin microbiolgica de dos tratamientos higienizantes de hortalizas de consumo en crudo.

Presencia de L. monocytogenes en especias.

Calidad microbiolgica de postres lcteos elaborados en establecimientos de hostelera de la C.A.P.V. en 1999.

Carballo, J. Castao, A Garca, M.C. Tornadijo, M.E. Castro, M.G. Gallardo, C.S. Garca, F.J. Rodrguez, L.A. Benezet, A. Botas, M. de la Osa, J.M. Olmo, N. Pedregal, E. Prez Flrez, F. de Pablo, M.B.

MIS/7

MIS/8

MIS/9

MIS/10

.274.

Ttulo Autores Purificacin y caracterizacin de una bacteriocina producida por una del Campo, R. cepa de E. faecium vanA. Gmez-Lus, R. Jimnez Daz, R. Tenorio, C. Torres, C. Efectos de antibiosis de algunos microorganismos, aislados del Espejo, E. queso de Cabrales sobre listerias. Espejo, J. Slik, S. Incidencia de Salmonella spp. y Campylobacter spp. en carne de Domnguez, M.C. pollo comercializada en las principales poblaciones de Castilla y Gmez Campillo, J.I. Len. Mateo, J. Zumalacrregui, J.M. Actividad hemoltica de cepas de Plesiomonas shigelloides de Garca-Lpez, M.L. origen pisccola. Gonzlez-Rodrguez, M.N. Santos, J.A. Sanz, J.J. Caracterizacin molecular por electroforesis en campo pulsado de Arbeloa, A. cepas de Salmonella serotipo enteritidis procedentes de tres pases Garaizar, J. europeos. Laconcha, I. Lpez-Molina, N. Rementeria, A. Vivanco, A. Comportamiento de Escherichia coli O157:H7 en leche UHT Mamani, Y. entera, semidesnatada y desnatada a 4C. Mora, M.T. Quinto, E.J. Influencia de diversos parmetros sobre la actividad de AS-48 frente Ananou, S. a la cepa enterotxica CECT 976 de Staphylococcus aureus. Glvez, A. Maqueda, M. Valdivia, E. Deteccin, aislamiento y caracterizacin de cepas enterotoxignicas Fueyo, J.M. de Staphylococcus aureus en alimentos y portadores. Relaciones Gonzlez-Hevia, M.A. entre tipos genticos y enterotoxinas. Martn, M.C. Mendoza, M.C. Aplicacin de tcnicas basadas en PCR a la deteccin de cepas de del Cerro, A. Salmonella enterica en alimentos de origen animal y adscripcin a Fueyo, J.M. grupos genticos. Guerra, B. Landeras, E. Mendoza, M.C. Soto, S. Sensibilidad a antibiticos en cepas de Enterococcus aisladas de cerdos y animales de compaa. Martnez, C. Ruiz-Larrea, F. Tenorio, C. Torres, C. Zarazaga, M. Brias, L. Lantero, M. Olarte, I. S enz, Y. Torres, C. Zarazaga, M.

Cdigo MIS/11

MIS/12

MIS/13

MIS/14

MIS/15

MIS/16

MIS/17

MIS/18

MIS/19

MIS/20

Sensibilidad a antibiticos -lactmicos y quinolonas en cepas de E. coli de origen alimentario, animal y humano.

MIS/21

.275.

Ttulo Recuperacin de Staphylococcus aureus en BAIRDPARKER+RPF y confirmacin por PCR.

Condiciones de crecimiento y produccin de cido ciclopiaznico por Penicillium commune aislado de jamn curado.

Caracterizacin gentica y seguimiento epidemiolgico de aislamientos de Salmonella serotipo Panama implicados en tres brotes registrados en Asturias en agosto de 1998.

Accin de la bacteriocina AS-48 sobre la produccin de enterotoxina por Bacillus cereus LWL1.

Validacin de un mtodo inmunoenzimtico para la determinacin de Listeria monocytogenes.

Produccin de aminas bigenas durante y despus de la fermentacin malolctica en vino.

Comparacin de la actividad fungicida de productos de uso domstico.

Modo de accin de la lactococina 972, bacteriocina producida por Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA 972.

Desarrollo de una tcnica rpida para la evaluacin de productos con actividad desinfectante.

Desarrollo de una tcnica impedanciomtrica para la deteccin de residuos de antibiticos en carnes. La pgina web de la CECT. Bsquedas en lnea.

Autores Alarcn, B. Arnau, A. Aznar, R. Sols, I. Aranda, E. Bermdez, M.E. Jurado, M. Nez, F. Sosa, M.J. del Cerro, A. Fernndez Fuentes, P. Gonzlez-Hevia, M.A. Guerra, B. Mendoza, M.C. Soto, S.M. Abriouel, H. Glvez, A. Maqueda, M. Valdivia, E. de Luna, R. Garca, MA. Rex, MJ. Zamorano, M. Carb, R. Casero, M. Castro, J.J. Centelles, E. Hurtado, E. Sancho, J. Galn Alejo, L.C. Hernndez Herrero, M.M. Herrador Crdenas, F. Rodrguez Jerz, J.J. Ayala, J.A. Hernndez, A. Martnez, B. Rodrguez, A. Surez, J.E. Galn Alejo, L.C. Hernndez Herrero, M.M. Herrador Crdenas, F. Rodrguez Jerz, J.J. Lpez-Cabanillas, M. Rodrguez Jerz, J.J. Roig Sagus, A.X. Lpez-Coronado, J.M. Uruburu, F. Garca, P. Madera, C. Rodrguez, A. Surez, J.E.

Cdigo MIS/22

MIS/23

MIS/24

MIS/25

MIS/26

O/1

O/2

O/3

O/4

O/5

O/6

Seleccin de una cepa silvestre de Lactococcus lactis para su utilizacin como cultivo iniciador industrial.

O/7

.276.

Autores Konings, W. Margolles, A. Putman, M. van Veen, H.W. Efecto del pH del medio en el comportamiento de los test Condn, S. biolgicos (B. estearothermophilus var. calidolactis) de deteccin Martnez, M. de antibiticos. Pagn, R. Sanz, D. Crecimiento de Aeromonas hydrophila en atmsferas modificadas. Garca de Fernando, G. Pin, C. Quintero, C.L. Velasco de Diego, R. Evaluacin del nuevo TEST ECLIPSE para deteccin de Condn, S. antibiticos en leche. Martnez, M. Pagn, R. Sanz, D. Inhibicin de enteropatgenos por cepas de Lactobacillus de origen Barbs, C. humano. Boris, S. Fernndez, M.F. Viabilidad de microorganismos probiticos de los gneros Gonzlez de los ReyesLactobacillus y Bifidobacterium en leches fermentadas comerciales: Gaviln, C. Tolerancia a cido y sales biliares. Gueimonde-Fernndez, M. Comparacin del crecimiento de Bifidobacterium sp. Con diferentes oligosacridos no digestibles y su viabilidad como probiticos en frmula infantil. Abelln, P. Martnez, C. P rez-Conesa, D. Periago, M.J. Ros, G. Nieto, J.C. Reguera, J.I. Sez, J. Segura, V. Fernndez, L. Haza, A. Lagatie, M. Marn, M. Martn, R. Morales, P. Rodrguez, J.M. Zabala, A. Abelln, P. Martnez, C. Prez-Conesa, D. Periago, M.J. Ros, G. Font de Valdez, G. Prez Martnez, G. Taranto, M Pa

Ttulo Purificacin, reconstitucin y caracterizacin funcional de LmrA, una protena de membrana de Lactococcus lactis implicada en la resistencia a antibiticos y compuestos citotxicos.

Cdigo O/8

O/9

O/10

O/11

PRO/1

PRO/2

PRO/3

Seleccin y viabilidad in vitro de bacterias probiticas para su posible implantacin en productos crnicos.

PRO/4

Empleo de la hibridacin de DNA para la deteccin especfica de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus y para su diferenciacin de otras especies de bacterias lcticas probiticas.

PRO/5

Estudio preliminar de la composicin de la flora intestinal infantil y el efecto que la alimentacin tiene sobre la misma.

PRO/6

El cido de deoxiclico afecta la integridad y funcionalidad de la membrana celular en Lactobacillus reuteri.

PRO/7

.277.

Autores Fernndez, L. Haza, A. Martn, R. Morales, P. Rodrguez, J.M Zabala, A. Inactivacin de Yersinia enterocoltica por pulsos elctricos de alto lvarez, I. voltaje. Pagn, R. Raso, J. Sala, F.J. Efecto del pH y la adicin del cloruro sdico sobre la resistencia al Bernardo, A. calor de Bacillus stearothermophilus. Feitosa, J.G. Lpez, M. Martnez, S. Evaluacin del riesgo derivado de la presencia de mohos en Aranda, E. pimentn de la Vera. Bartolom, T. Calvo, P. Crdoba, M.G. Martn, A. Nuevas formas de conservacin para Vieira (Pecten maximus) Abalde, J. Diguez, F. Fidalgo, P. Garca, J. Prez-Rama, M. Torres, E. Efecto del almacenamiento en refrigeracin sobre la actividad Fernndez-Salguero, J. coagulante y la calidad microbiolgica de extractos acuosos crudos Ferreira, J. del cardo Cynara L., utilizados en la elaboracin de quesos Gmez, R. tradicionales. Tejada, L. Vioque, M. Evolucin de diferentes grupos microbianos de inters tecnolgico Alonso-Llamazares, A. en leche de oveja refrigerada a 6C. Caro, I. Fernndez-Barata, V.M. Garca-Armesto, M.R. Sanjun, S. Calidad microbiolgica del champin (Agaricus bisporus) Gimnez, M. envasado y almacenado a temperaturas inadecuadas. Gonzlez-Fandos, E. Olarte, C. Sanz, S. Simn, A. Control de la alteracin fngica en anlogos de magdalenas Arbons, J. mediante la accin combinada de conservantes, pH y actividad de Guynot, M.E. agua. Marn, S. Ramos, A.J. Sala, D. Aplicacin de altas presiones en combinacin con bacteriocinas Aymerich, T. como tecnologa emergente para la seguridad de productos crnicos. Costa, S. Garriga, M. Hugas, M. Monfort, J.M.

Ttulo Efecto antiproliferativo de tres cepas de Enterococcus faecium en una lnea celular de mieloma.

Cdigo PRO/8

TPC/1

TPC/2

TPC/3

TPC/4

TPC/5

TPC/6

TPC/7

TPC/8

TPC/9

.278.

Ttulo Termorresistencia de Enterococcus faecium: Efecto de la temperatura y tiempo de incubacin.

Autores Bernardo, A. Feitosa, J.G. Lpez, M. Martnez, S.

Cdigo TPC/10

Control in vitro de la alteracin fngica en productos de bollera mediante la accin combinada de conservantes, pH y actividad de agua.

Inactivacin de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus en leche mediante la combinacin de pulsos elctricos de alta intensidad de campo y calentamiento a temperaturas moderadas. Estudio comparativo de los cambios estructurales y ultraestructurales que se producen durante la autolisis de las levaduras en un medio vnico modelo y en vinos espumosos elaborados por el mtodo tradicional. Influencia del pH del medio de cultivo sobre el crecimiento y la termorresistencia de Enterococcus faecium.

Bernad, M. Marn, S. Neira, P. Ramos, A.J. Sanchs, V. Allaert, C. Arntegui, J. Martn, O. Sobrino, A. Carrascosa, A.V. Martnez-Rodrguez, A.J. Polo, M.C.

TPC/11

TPC/12

TPC/13

Feitosa, J.G. Herrera, F.C. Lpez, M. Martnez, S. Presencia de microorganismos termorresistentes en una mezcla de Gonzlez-Fandos, E. especias utilizada en la condimentacin de conservas de Olarte, C. champin. Portu, J. Sanz, S. Persistencia de microorganismos termfilos en la esterilizacin de Lomas, C. champin condimentado. Olarte, C. Portu, J. Sanz, S. Evolucin microbiolgica de la pasta de cuajo de cordero para la Albisu, M. elaboracin de queso D.O. Idiazabal Aramburu, M. de Renovales, M. Prez-Elortondo, F.J. Salmern, J. Problemas higinicos en el procesado de subproductos vegetales: Ibez de Opaca, S. Elaboracin de esprrago deshidratado. Lomas, C. Olarte, C. Sanz, S. Efectos de la alta presin hidrosttica sobre la fraccin celular de la Busquets, A. sangre de cerdo. Carretero, C. Pars, D. Saguer, E. Toldr, M. Estudio de tratamientos alternativos a la desinfeccin de alimentos lvarez, I. mnimamente procesados. Raso, J. Virto, R.

TPC/14

TPC/15

TPC/16

TPC/17

TPC/18

TPC/19

TPC/20

.279.

.280.

RELACIN DE CONGRESISTAS

.281.

.282.

APELLIDOS Aguiar Merino Aguilera Entrena Alonso Calleja Alonso Candela Alvarez Gonzlez Alvarez Lanzarote Alvarez Martnez Amrita Vega Andueza Leal Antn Barrero Aparicio Rodrguez Aranda Medina Arqus Orobn Asensio Prez Aznar Novella Azuara de Pablo Bada Gancedo Barbs Miguel Barbosa Canovas Bascarn Rodrguez Belloch Trinidad Benezet Casarrubios Benito Bernldez Bermejo Remn Bernardo Alvarez Bilbao Sevillano Bio-Rad Laboratories, S.A. Botella Grau Briones Prez Cabranes Benduero Cceres Arribas Caldern Calvo Magro Capita Gonzlez Carballo Rodrguez Carb Moliner Crcoba Ruiz Caro Canales Carret Aixal Carretero Francisco Casas Maeso Caso Machicado Castao Ramos Castro Garca Ceballos Rivero Centeno Briceo Corbaln

NOMBRE Juan Manuel Jaime Carlos Mercedes Miguel Angel Ignacio Fernando Flix Flix Daniel M Teresa M Beln Emilio Juan M. Angel Rosa Pilar Juan Carlos Covadonga Gustavo V. Victoria Carmen Andrs M Jos Esther Ana Ainhoa M Salud Ana Isabel Carmen M Pilar Vicente Patricia Rosa Julia Rosa Roberto Irma Ramn Joaquin E. Nerea Jos Luis Andrs Mercedes Ana Cristina Sara Luis F.

*Tipo de Participacin CC/1 FM/3, MIS/1, MIS/4 FM/1, FM/14 C.Organizador - GM/1,GM/3 TPC/1, TPC/20 FYM/1 MIS/2

MIS/3, MIS/23,TPC/3 ABA/1, ABA/3 FM/1, FM/14 CC/2, MIS/22 C.Organizador C. Organizador - Mesa Redonda III PRO/1 Mesa Redonda IV C.Organizador FM/25, MA/1 MIS/9 FM/1, FM/2, FM/14 MA/2 TPC/2,TPC/10 CC/3 CC/4 FM/6, FM/8 Mesa Redonda I FM/15, FM/20 Mesa Redonda II TPC/3 MIS/1, MIS/4 FM/7,MIS/5 ,MIS/7 O/1 C.Organizador ABA/8, FM/3,TPC/6 FYM/2 MIS/6 C.Organizador Moderador Mesa Redonda III GM/3 FM/7, MIS/7 MIS/8 FYM/3 Mesa Redonda II

.283.

APELLIDOS Corbera Martnez Cordero Gmez Costa Plana de la Hoz Perales de la Osa de Pablo Busto de Simn Serra del Campo Moreno del Hoyo Gonzlez Delgado Hervs Delgado Palacio Diguez Garza Echenagusia Capalastegui Eguiarte Legarreta Espejo Serrano Extebarria Lanborena Fajardo Adn Fernndez Barata Fernndez Garca Fernndez Gonzlez Fernndez Gutirrez Fernndez- Salguero Ferrer Escobar Galn Alejo Garca Alegra Garca Armesto Garca Fontn Garca Lpez Garca Lpez Garca Surez Garriga Gaya Sicilia Gimnez Martnez Gmez Campillo Gonzlez Cienfuegos Gonzlez de los ReyesGonzlez Fandos Gonzlez Fernndez Gonzlez Rodrguez Gonzlez Surez Guamis Gueimonde Fernndez Guynot de Boismenu Hernndez de Rojas Hernndez Gmez Hernndez Jimnez Hernndez Lpez Herrador Crdenas

NOMBRE Meritxell M Rosario Sonia Lorenzo Jos M M Begoa Mercedes Rosa Mara Gregorio Teresa Susana Fernanda Susana Josune Jos Argizka M Carmen Victor Manuel Mara Mnica M Fernanda Jos M Dolores Luis C. Eva M Rosario Mara del Camino Mara Dolores M Luisa Pilar Margarita Pilar Mercedes J. Ignacio Silvia Clara M Elena M Jos M Nieves Mara Angeles Buenaventura Miguel M Elena Alma Luis Fernando Enrique M Jos Francisco

*Tipo de Participacin

TPC/9 FM/4, FM/10 MIS/9 MIS/10 CC/7 MIS/11 C.Organizador C.Organizador - GM/2 TPC/4

MIS/12 FM/5, FM/11 ABA/8, MA/3,TPC/6 C. Organizador - GM/3 FM/4, FM/6, FM/8, FM/10 C.Organizador - PRO/1 TPC/5 CC/7 O/2, O/4 FM/12, FM/22 MA/3, TPC/6 FM/7, MIS/7 MA/4 Moderadora Mesa Redonda II ABA/8, FM/13, MA/3, MIS/14 C.Organizador - O/7 Mesa Redonda III ABA/3 TPC/7 MIS/13 Conferencia de Clausura C.Organizador PRO/2 TPC/7, TPC/15 C.Organizador ABA/8, MIS/14 Mesa Redonda IV C.Organizador - PRO/2 TPC/8 C. Organizador - GM/6, O/3 FM/6, FM/8 FM/9 O/2, O/4

.284.

APELLIDOS Herranz Hernndez Hidalgo Togores Hugas Maurici Jimnez Daz Laconcha Loyo Ladero Losada Llaneza Llaneza Lpez Alfaro Lpez Coronado Lpez Daz Lpez Fernndez Lpez Ocaa Lpez-Cabanillas Lomeli Luna Estarreado Madera Gonzlez Maldonado Barragn Mamani Cuno Maqueda Abreu Margolles Barros Marn Sillu Martn Belloso Martn Gonzlez Martn Martn Martnez Agustn Martnez Fernndez Martnez Gmez Martnez Peinado Martnez Rodrguez Martnez Surez Mas Mayoral Mata Vallespn Mayo Prez Medina Canalejo Medina Fdez-Regatillo Mendoza Fernndez Mercenier Mohino Snchez Mollet Montiel Viao Moreno Trigos Moriche Campa Muoz Agius Navarro Len Noriega Prez Nez Gutirrez Nuo Prado Olarte Martnez

NOMBRE Beatriz Pilar Marta Rufino Idoia Vctor Juan Isabel Jos Miguel Teresa Mara Mercedes Laura Manuel Nuria Carmen Antonio Yeny Mercedes Abelardo Sonia Olga Alberto M Cruz Marta Beatriz Flix Jos Adolfo Sidonia Matilde Luis Baltasar Luis Manuel Margarita M Carmen Annick Antonio Beat Elisa Yolanda Vicente Marta Laura Luis Manuel Isabel M Carmen

*Tipo de Participacin FM/10 FM/5, FM/11 TPC/9 ABA/4, GM/4, GM/5, MIS/11 MIS/15 C.Organizador C. Cientfico FM/12 MA/4, O/6 FM/13 TPC/2, TPC/10, TPC/14 MA/4 O/5 FM/5, FM/11,MA/2 C.Organizador - O/7 ABA/4, GM/4, GM/5 MIS/16 MIS/17, MIS/25 C. Organizador - O/8 MA/7, TPC/8, TPC/11 TPC/12 FM/2, FM/14, TPC/3 C.Organizador - GM/1, MIS/18 O/9, O/11 C.Organizador ABA/6, GM/6, O/3, Moderador Mesa Redonda IV Conferenciante: Normalizacin, Mtodos y Tcnicas - FM/22 TPC/13 TPC/2,TPC/10, TPC/14 FM/15, FM/20 C. Organizador GM/2, GM/6 CC/6 ABA/1, ABA/2, ABA/3 C. Cientfico - MIS/18, MIS/19, MIS/24 Mesa Redonda III Mesa Redonda I CC/5

ABA/5 C.Organizador C. Cientfico ABA/1, ABA/2, ABA/3 C.Organizador TPC/7,TPC/15, TPC/16,TPC/18

.285.

APELLIDOS Oneca Agurruza Ordez Pereda Ortigosa Ocn Pando Bedriana Parrilla Santos Peir Caravaca Prez Conesa Prez de Juan Prez Villarreal Prez-Trallero Pesce de Ruiz Holgado Pin Arias Portu Reinares Prieto Alamn Ramrez Fernndez Ramn Vidal Randez Gil Raso Pueyo Razquin Megias Rebollo Feria Reguera Useros Rilla Villar Roa Ojalvo Robredo Valgan Rodrguez Alvrez Rodrguez Fernndez Rodrguez Gmez Rodrguez Gonzlez Rodrguez Vargas Romero del Castillo Shelly Ros Berruezo Rbies Mallol Ruiz Barba Ruiz Larrea Senz Domnguez Saez Cacho Sala Rovira Salmern Egea Snchez Hernndez Snchez Lara Sanchs Solera Santamara Aquilu Sanz Cervera Sanz Gmez Sanz Prez Selgas Cortecero

NOMBRE Mara Juan A. Mara Rosa Mara Elisa Eduardo Daro Javier Begoa Emilio Aida Carmen Jorge Jos Antonio Manuel Daniel Francisca Javier Efrn J. Emilio Juan Ignacio Natalia Isidro Beatriz Ins Concepcin Juan Miguel Ana Sonia Roser Gaspar Teresa Jose Luis M Fernanda Yolanda Damiana Montserrat Jess Fabin Celso Claudia Jorge Pilar Susana Alejandra Jos Javier David M Dolores

*Tipo de Participacin FM/16 C. Cientfico Acto de Clausura FM/4, FM/10 Moderador Sesin Comunicaciones OralesII FM/17 FM/18 CC/7 PRO/3, PRO/6 MA/5 MA/6 Mesa Redonda II Moderadora Mesa Redonda I O/10 TPC/15, TPC/16 Mesa Redonda I FM/19 C. Cientfico Conferencia Inaugural FM/9, FYM/4 Mesa Redonda IV TPC/1, TPC/20 CC/7 FM/15, FM/19, FM/20 PRO/4 C.Organizador - ABA/6 FM/15, FM/20 ABA/7

PRO/5, PRO/8 C. Organizador Coordinadora ABA/6, GM/6, O/3, O/7 FYM/4 FM/21 PRO/3, PRO/6 ABA/4, GM/4, GM/5 ABA/5, FM/12, MIS/20 MIS/21

TPC/17 CC/8 C.Organizador - GM/6, MIS/5 CC/9 FM/22 TPC/7,TPC/15, TPC/16 TPC/18 ABA/8, MIS/14 O/9, O/11 FM/23

.286.

APELLIDOS Serrano Rodrguez Sesea Prieto Sesma Vea Sikora Sols Andrs Sosa Zuil Soto Gonzlez Surez Fernndez Tabla Sevillano Tamargo Miguel Taranto Toldr Alegret Ubeda Iranzo Urdiales Garmn Uruburu Fernndez Valdivia Martnez Velluti Perrou Villa Carvajal Virto Resano Zabala Arriaga Zabala Barboza Zamorano Caldern

NOMBRE Juan E. Susana Begoa Tonny Inmaculada M Jos Sara M Juan E. Rafael Carolina M Pa Mnica Juan M Rosa Federico Eva Andrea Mercedes Raquel Nieves Adriana Manuel

*Tipo de Participacin FM/24 C. Cientfico MIS/22 MIS/3, MIS/23 MIS/19, MIS/24 C.Organizador - C. Cientfico - GM/1, GM/3, O/3, O/7 FM/15, FM/20 PRO/7 TPC/19 FM/8, GM/7 C. Cientfico Moderador Sesin Comunicaciones Orales I - FM/25, O/6 MIS/17, MIS/25 MA/7 FM/25, MA/1 TPC/20 PRO/5, PRO/8 MIS/26

*Tipo de Participacin: Cdigo de Pster , Conferenciante, Comit Cientfico, Comit Organizador

.287.