Microbiologa General Ingeniera Ambiental Universidad de la Salle

Morfologa microscpica y Desarrollo bacteriano Tcnicas de tincin - medios de cultivo, siembra y morfologa de colonias. Resumen
Introduccin: Un medio de cultivo tiene de un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para lograr el crecimiento de las bacterias y hongos. Los cuales al ser estudiados por medios microscpicos necesitan una tincin, entre los mtodos de tincin encontramos la tincin Gram que logra diferenciar las bacterias en Gram positivas (rosados o rojos) o Gram negativas(morado) dependiendo de la coloracin. Los colorantes utilizados para esta tcnica resaltan las estructuras en los tejidos biolgicos que van a ser observados en el microscopio. Objetivo: Realizar los diferentes tipos de cultivo y tincin para distintas clases de bacterias (Gram positiva o Gram negativa) y observar la morfologa de los microorganismos que se presentan en ellas. Metodologa: Para la realizacin del cultivo se utilizo una bacteria y un hongo (E- coli y rhizopus) esta tcnica de siembra se hizo en un medio diferencial a un medio enriquecido, para llevar a una incubacin a (37C 2) de 24 a 48 horas despus del crecimiento de estas bacterias se hace una caracterizacin macroscpicamente , para la caracterizacin se utilizo la coloracin de gram manejando los siguientes reactivos el azul violeta, lugol, alcohol cetona y por ultimo fushina en caso de ser necesario se utiliza aceite de inmersin para que en el microscopio se observe ntidamente. Resultados: Al realizar los frotis de los medios que se cultivaron y realizar la tincin gram observamos en el microscopio en el cultivo de agua bacilos gram negativos, que tenan un color rosado. Conclusiones: La tincin de Gram proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea y por ende permite diferenciar varios tipos morfolgicos.

Palabras claves: Tincin Gram, Medio de cultivo, Tcnicas de siembra, morfologa bacteria.

INTRODUCCIN Medio de cultivo Un medio de cultivo es un gel o una solucin el cual nos permite el desarrollo de los microorganismos (1). Este puede ser inoculado, es decir se le aaden organismos y este debe ser incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. Los medios de cultivo deben contener carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. El agar es el principal agente solidifcate utilizado en medios bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C. De acuerdo a su consistencia: Lquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Semislidos: Contienen 0.5% de agar en su formulacin. Slidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulacin.
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Facultad de ingeniera ambiental y sanitaria. Sexto semestre. Microbiologa. Grupo 15. Facultad de ingeniera ambiental y sanitaria. Sptimo semestre. Microbiologa. Grupo 15. 3 Facultad de ingeniera ambiental y sanitaria. Sexto semestre. Microbiologa. Grupo 15.

De acuerdo a su composicin: Definidos: es aqul medio de cultivo del cual se conoce su composicin exacta. Complejos: es aqul del cual no se conoce la composicin exacta del medio. Medios diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias con base en alguna caracterstica observable en su patrn de crecimiento en el medio. Medios de enriquecimiento: Contienen algn componente que permite el crecimiento de cierto tipo especfico de bacteria, pero no contienen sustancias inhibidoras.

Figura 1 Procedimiento para realizar un cultivo Coloracin: la tensin de Gram es una tcnica diferencial comnmente empleada en el diagnostico microbiolgico (2). La mayor parte de las muestras sometidas a examen cuando se sospecha infeccin bacteriana deben ser extendidas en frotis sobre lminas de vidrio, teidas y examinadas en el microscopio. Los reactivos empleados en la tensin de Gram son el cristal violeta (colorante bsico), lugol (mordiente), alcohol cetona (decolorante) y fushina (colorante de contraste). El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular bacteriana con ayuda del lugol que rompe la unin del colorante (2). Las bacterias Gram positivas su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol, entre tanto las bacterias Gram negativas pierden su colorante bsico cuando son tratadas con al alcohol cetona ya que este disuelve el contenido lipdico de su pared celular.

Figura 2 tcnica tincin de gram. Escherichia coli Se denomina bacteria Gram negativa a aquellas bacterias que NO se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ah el nombre de "Gram-negativas" o tambin "Gram negativas" (4). Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular (el tipo de pared bacteriana), por lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. , Esta bacteria pertenece a la entera bacteria, una familia de bacterias compuestas por numerosas especies Gram negativas y morfolgicamente, son bacilos rectos, generalmente flagelados periticos, y por tanto mviles. Pueden multiplicarse tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas y son fcilmente cultivables en medios de nutritivos sencillos. Esta bacteria puede causar infecciones intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vas urinarias, cistitis, peritonitis, etc. Rhizopus : Es un hongo cosmopolita encuentra en el suelo, la decadencia de las frutas y hortalizas, las heces de los animales, y el pan viejo. Mientras Rhizopus spp. Son contaminantes comunes, que tambin son causas ocasionales de graves (y muchas veces fatales) infecciones en seres humanos. Algunas especies son patgenas de las plantas (5). Algunas de las caractersticas morfolgicas, tales como la longitud de rizoides y esporangiforos, el dimetro de los esporangios, la forma de columellae, y el tamao, forma y textura de la superficie de esporangiosporas ayuda en la diferenciacin de especies de Rhizopus entre s. Temperatura mxima de crecimiento tambin vara de una especie a otra [5]. Patogenicidad : Rhizopus spp. Son algunos de los hongos causantes de las infecciones por el grupo denominado zigomicosis. Aunque la mucormicosis trmino ha sido usada a
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menudo para este sndrome, zigomicosis ahora es el trmino preferido para este angioenfermedad invasiva. Rhizopus arrhizus es la causa ms comn de zigomicosis y es seguido por Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis.

Metodologa Tensin de Gram Se tomo con el aza una colonia aislada de la bacteria E. Coli despus de haber sido esterilizada y se puso en una lmina, se aplica una gota de la misma disolucin, se dejo secar alrededor de la flama y se paso tres veces rpido la placa por el fuego para que se adhieran las bacterias y no se caigan con la tincin. Luego se le aplico una gtica de cristal violeta en la lmina y se dejo por un minuto luego se lavo con un chorrito de agua, se le aplico lugol a un minuto, luego vuelve y se lava enseguida se le aplico alcohol acetona una gtica se dejo por 30s, finalmente se le aplico Fuscina se dejo por 15 seg, se enjuago y se dejo secar, despus se aplico aceite de inmersin (no se le coloca laminilla). Por ltimo se llevo al microscopio y se observo en 10 x y en 40x. Se anoto lo observado. Frotis (Hongo) En una lamina portaobjetos limpia y desengrasada se coloco una gota de azul de Lactofenol, en la gota se suspendi una muestra del hongo Rizhopus tomado con el aza previamente esterilizada, luego se tapo con una lamina cubreobjetos cuidadosamente soltndola a 45, se llevo al microscopio y se miro a 10x y 40x. Se anoto lo observado.

Falta colocar lo del aire

Resultados Al realizar los frotis de los medios que se cultivaron y realizar la tincin gram observamos en el microscopio en el cultivo de agua bacilos gram negativos, que tenan un color rosado.

Figura 3 E-coli Fuente: autores 4

Observacin del hongo Rizhopus en el microscopio a 40x.

Figura 4 Hongo Rizhopus Fuente: autores

Discusin resultados En el microscopio se logro observar las laminillas del proceso de tincin de gramteniendo como resultado en la bacteria E. Coli bacterias gran negativas en forma de bacilos de color fucsia, a medida que se aumentaba el objetivo se observaba mejor la forma, el color despus de la tincin y en la forma que estaban agrupados. En cuanto a la observacin del hongo Rizhopus en 40x, se vio que es un hongo filamentoso que presenta esporangiforos sin ramificar, de color verde pardo, son redondas con bases de planos, se observaron solitarios y formando agrupaciones, con Esporangiosporas negras, con baja densidad de hifas. Conclusiones Al culminar la prctica de laboratorio nmero dos logramos cumplir con los objetivos propuestos al empezarla puesto que en primer lugar aprendimos el mtodo de tincin de gran y a diferenciar las diferentes clases de tincin, al igual realizamos toma de muestras y cultivos de microorganismos; aprendimos que es un microscopio ptico, sus partes e importancia en el laboratorio de microbiologa, finalmente realizamos la practica permitindonos observar E-Coli y Rizhopus. La tincin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnostico medico siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes celulares tendrn o no propiedades patolgicas diferentes
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La tincin de Gram proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea y por ende permite diferenciar varios tipos morfolgicos. Bibliografa 1. Tcnicas de tincin y cultivos PDF
http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf

2. Universidad del cauca , gua elaborada por Docente Liliana crdenas PDF http://facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Tencion_de_ gram.pdf 3. Microbiologa e inmunologa TINCION GRAM http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm 4. BLOG DE CIENCIAS (E-COLI) http://blog.ciencias-medicas.com/archives/1373 5. Universidad de Antioquia. Escuela de microbiologa. Vernica Tangarife C.
SSO Docente 2011

http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/mod/resource/view.php?inpopup= true&id=100895