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Ingeniera en Biotecnologa.

8A Ingeniera de rutas metablicas. Proyecto Final Produccin de butanol por insercin de plsmidos de Clostridium acetobutylicum en Escherichia coli. Arroyo astro !iego de "es#s !a$ %odrgue$ &ric' &(r)n *ern &studillo ndida Pro(esora+ ,recia Fuentes. . -ni.ersidad Polit)cnica del &stado de /orelos. Boule.ard uau0n0uac 12334 ol. 5omas del *e6cal4 "iutepec4 /orelos .P. 37228

Produccin de butanol por insercin de plsmidos de Clostridium acetobutylicum en Escherichia coli. Arroyo Castro Diego de Jess.; Diaz Rodrguez ric! "r#n.; $ern studillo Cndida;
%ni&ersidad Polit#cnica del stado de 'orelos. (ngeniera en )iotecnologa. Asignatura* (ngeniera de rutas metablicas +rupo ,-A. Catedrtico +recia .uentes. )oule&ard Cuau/n/uac 01223 Col. 4omas de $e5cal3 Jiutepec3 'orelos. C. P. 26617. ACD899:;;2<upemor.edu.m5;DR 899:19:<upermor.edu.m5;$ C899;=11<upemor.edu.m 5
(ntroduccin. Debido al aumento continuo en el costo del petrleo crudo como "uente de energa principal3 la in&estigacin sostenible de alternati&as econmicas y ambientales a los combustibles "siles es cada &ez ms importante. %n con>unto de alternati&as prometedoras para combustibles deri&ados del petrleo son los biocombustibles3 especialmente los producidos mediante procesos de "ermentacin a partir de recursos reno&ables3 tales como butanol 4os biocombustibles se consideran generalmente como aditi&os de combustible en lugar de petrleo. )iocombustibles producidos por microorganismos a partir de biomasa. ? tanol3 biodiesel3 alco/oles@. Ain embargo3 estos metabolitos son generalmente t5icos para las c#lulas microbianas3 lo Bue ocasiona ba>os ni&eles de producti&idad en las "ermentaciones. ntre los biocombustibles3 el butanol se encuentra como una nue&a generacin biocombustibles3 ya Bue contiene ms energa ?931 &eces@. 4a produccin de butanol3 por medio de una cepa microbiana "ue reportado por primera &ez por 4ouis Pasteur en 9,29 y "ue industrializada utilizando Clostridium acetobutylicum aislado por C/aim Ceizmann en el siglo 67 A pesar de Bue butanol comercial se produce casi e5clusi&amente a partir de rutas petroBumicas /oy en da3 su produccin a tra&#s de la "ermentacin microbiana no es una cuestin reciente. 4a llamada acetona D butanol D etanol ?A) @ "ermentacin promo&ida por bacterias del g#nero Clostridium sp. 4a "ermentacin ?A) @ por Clostridium acetobutylicum es una de las "ermentaciones industriales ms antiguas . l butanol es un disol&ente industrial importante y es un me>or combustible para la sustitucin de la gasolina. 4os precios del butanol son de E :.77 por galn3 se &enden 11 galones por E 2.,73 con un mercado mundial de 93; mil millones de galones por aFo. Ae espera Bue la demanda del mercado de butanol aumente dramticamente3 debido a Bue a/ora puede ser producido a partir de biomasa de ba>o costo. 4a aplicacin de butanol como un reemplazo para la gasolina superar el etanol3 el biodiesel y el /idrgeno cuando su seguridad y la sencillez de uso se ele&en. 4a ingeniera gen#tica y la ingeniera metablica de C. acetobutylicum se /a utilizado para estudiar m#todos prometedores para superar los problemas mencionados anteriormente en "ermentaciones de )A. 4a inacti&acin del gen solR ?mediante recombinacin /omloga dio un mutante con aumento de :.6 &eces en la concentracin de butanol "inal. 8b>eti&os* +enerar una cepa estable de E.coli capaz de producir butanol mediante ingeniera recombinog#nica. .ormular un medio de culti&o en el cual la cepa generada se desarrolle de manera ptima. Determinar las condiciones de produccin en biorreactor Bue permita obtener buenos rendimientos. DiseFar una nue&a estrategia de puri"icacin de butanol. Justi"icacin 4a produccin de butanol /asta el momento se estaba lle&ando a cabo mediante la bacteria Clostridium acetobutylicum sin embargo posee muc/as des&enta>as* 4a presencia de butanol3 resulta ser t5ica. Concentraciones de alrededor de 7.9 ' de butanol generan un 17G de in/ibicin del crecimiento celular y consumo de azcares.

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l butanol es ms t5ico Bue otros sol&entes3 ya Bue #ste desestabiliza la membrana e interrumpe "unciones asociadas a la membrana3 tales como procesos de transporte3 incluyendo el transporte de azcares3 entre otras. 8casionando una ba>a producti&idad y ba>a concentracin de producto. introduccin de genes resulta limitante3 debido a un sistema de restriccin intrnseco en todas las especies de Clostridium Bue inacti&a la mayora de las secuencias trans"eridas de otras especies lo Bue /ace Bue sea di"cil la insercin de genes para me>orar la produccin del metabolito

.igura 6 ?plasmido p4o5+entrcmelA@

Hiptesis Al implementar la metodologa descrita en este artculo se obtendrn rendimientos superiores a los descritos en la literatura actual3 adems de una nue&a estrategia de puri"icacin ms rentable.

'ateriales y '#todos. $abla 9 Cepas bacterianas y plsmidos utilizados Cepa o plsmido Caractersticas .uente o rele&antes re"erencia E.coli JM109 recA9 endA9 $a!ara gyrA=2 t/i /sdR9I sup ;; relA9 J?lacD proA)@K.LMtraD:2 proA)Nlac(B lacOJ'91P C.acetobutylicu Cepa tipo A$CC m ATCC824 p)%$6 Cmr; pCR)9D 'asayu!i Ptac)CADPtac $H( Qit/ a :.:D!b Aal(RS/o( DTA "ragment containing t/e PtacDad/e gene

.igura :?plasmido p)%$6@


Medio de culti o .uentes de nitrgeno comple>as tales como e5tracto de le&adura generalmente se reBuieren para un buen crecimiento y produccin de butanol. Ae utiliz medio 4) ?4uria )ertani@ Bue es un medio des/idratado utilizado para mantener y culti&ar cepas de Escherichia coli recombinantes. Para la preparacin de 94 de medio se aFaden* 97 g triptona 1 g de e5tracto de le&adura

97 g de TaCl : g de .eCl:

strategia +en#tica Ae tom como re"erencia el plsmido p)%$6 para generar un plsmido ms estable gracias a la metodologa propuesta por Aabido et al ?679:@3 lo cual nos asegura la integracin de nuestro plsmido

Ua metablica +enerada

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9.Dincrementar la con&ersin de piru&ato R acetil coa con la adicin al medio de /ierro. 6.D (n/ibir &as competiti&as de acetil CoA as como disminuir la e5presin de genes Bue con&ierten el acetil coa D etanol ?ad/ y bd/A)3 ed/@ as como los genes Bue con&ierten el acetil coa D acetato ?pta y a!@ de este modo se espera incrementar la cantidad de butanol producido. Produccin de butanol 4a produccin de butanol se lle&ara a cabo en un reactor agitado mecnicamente en condiciones anaerobias en culti&o tipo continuo multietapa acoplado a un molino de perlas y a un per&aporador. Recuperacin de butanol 4a recuperacin del butanol se lle&ara a cabo en dos "ases* 9. Disrupcin de la membrana mediante la t#cnica de molino de perlas 6. l molino de perlas a su &ez estar acoplado a un sistema de per&aporacion con una membrana de silicn silicato D9 la cual presenta una alta especi"icidad por el butanol.

.igura 9 ? representa un incremento en la con&ersin de piru&ato a acetil coa por la adicin al medio de /ierro3 representa una disminucin en la e5presin de los genes Bue con&ierten el acetil coa en etanol y acetato@ 4a estrategia implementada en la sobreproduccin de butanol en al &a generada por la insercin del plsmido VW

)ibliogra"a

9. D 4aili +/olizade/ n/anced )utanol Production by .ree and (mmobilized Clostridium s!. Cells %sing )utyric Acid as CoDAubstrate. 6. D Aang yup lee; Jin HQan Par!; A/e Hee Jang; 4ars X. Tielsel; Jac/yun Xim; XQang A. Jung .ermentati&e butanol production by clostridia. :.D$ina 4ut!eD &erslo/;Hubert )a/l 'etabolic engineering o" clostridium* recent ad&ances to impro&e butanol production.

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;.D 'asayu!i (nui Y 'asa!o Auda Y Aa!ura!o Ximura Y Xaori Zasuda Y Hiroa!i Auzu!i Y Hiros/i $oda Y A/ogo Zamamoto Y A/o/ei 8!ino Y Tobua!i Auzu!i Y Hidea!i Zu!aQa 5pression o" Clostridium acetobutylicum butanol synt/etic genes in Escherichia coli. 1.DAndrea Aabido; 4uz 'aria 'artinez; Ramon de Anda; Al"redo 'artinez; .rancisco )oli&ar; +uillermo +osset A no&el plasmid &ector designed "or c/romosomal gene integration and e5pression; use "or de&eloping a genetically stable Escherichia coli melanin production strain. 2. D Da&id Ramey; A/angD$ian ZangProduction o" )utyric Acid and )utanol "rom )iomass I. D James C/iD Zung 4eung Production o" acetone and butanol by clostridium acetobutilycum usin" #ree and immobilized cells 8. $ Peter Du [rre\3 'ic/ael )o [/ringer3 Atep/an Ta!otte93 Ate""en Ac/a""er63 Xai $/ormann3 and )rigitte Oic!ner $ranscriptional Regulation o" Aol&entogenesis in Clostridium acetobutylicum 9.$4in>iang O/u; Hong>un Dong; Zanping O/ang; Zin 4i ngineering t/e robustness o" clostridium acetobutilycum by introducing glut/atione biosynt/etic capability.

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