Bacteriologa

General








1
PRCTICA 1
Reconocimiento de los tres ambientes del laboratorio de Microbiologa y
Parasitologa.
Uso del microscopio. Bioseguridad



1.- Con qu finalidad se utiliza la solucin salina o suero fisiolgico?

La adicin del suero es para promover el crecimiento de
microorganismos menos resistentes. Los sueros ms empleados son: suero de
ternera, suero de bovino y algunas veces el suero humano.



2.- Qu es agar?

Es un coloide hidroflico obtenido de varias especies de algas rojas. Es utilizado
para el cultivo solido de bacterias y otros microorganismos emulsificadores y
como medio de soporte para inmunodifusin e inmunoelectroforesis.



3.- Diga en qu momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores?

Un amortiguador se usa cuando se necesita infundir algn cambio en la [H
+
]. El indicador
se usa para dar a conocer la aparicin y desaparicin de un compuesto qumico
por un cambio de color o logro de un determinado pH.
















2




Partes del Microscopio




















3
PRCTICA 2
Presencia de microorganismos en el medio ambiente. Tcnicas para el aislamiento de
microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicas aspticamente. Cultivo de
organismos anaerobios.

I. EXPERIMENTO N 1:


Presencia de microorganismos en el medio ambiente

Fundamentacin:
Confirmar la presencia de microorganismos en el medio ambiente, mediante
un
procedimiento llamado siembra que consiste en acondicionar el microorganismo
a un medio de cultivo frtil, para que en condiciones ptimas de temperatura
y tiempo de incubacin, pueda desarrollarse y multiplicarse.

Materiales
_ 1 placa petri con agar nutritivo, agar sangre.
_ Suero salino.
_ Asa de Kolle

Procedimiento
_ Tomar la placa con agar nutritivo y dividirlo en 4 cuadrantes con un
plumn
indeleble.
_ Dibujar estrias en medio de cultivo.
_ 1 cuadrante: agua de cao.
_ 2 cuadrante: Saliva.
_ 3 Cuadrante: Agua de piso.
_ 4 cuadrante: Agua de Piel.
_ Tomar la placa de agar sangre y tosa en el.
_ Incubar a 37C por 24h.

Resultados y conclusiones:
_ En el sector con agua de cao no se observa crecimiento de
microorganismo. El sector con saliva presenta
crecimiento pero no por la saliva porque no contiene
microorganismos; esto demuestra que nuestra boca
contiene gran cantidad de microorganismos como el
Estreptococo mutans.
_ El sector con agua de piso y de piel
tambin mostro crecimiento debido a la presencia de
microorganismos en el medio ambiente.
_ En el agar sangre se observo la presencia de
microorganismos pero ninguno realizo hemolisis, por lo cual
no era un Estreptococo B hemoltico.









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II. EXPERIMENTO N2:


Tcnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicas
spticamente.

Fundamento
En todos los ambientes habitan multiples microorganismos de diversos tipos y
actividd
fisiolgica. Para efectuar el estuio de un organismo en particular es necesario separarlo de
la poblacin mixta en la que se encuantra. Para tal fin se emplean tcnicas de aislamiento
que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro. Los mtodos usados son:
diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, siembra por agotamiento.

Material
1 Placa Petri Estril con Agar Nutritivo
1 Placa Petri No Estril con Agar Nutritivo.
2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo
1 Pipeta estril de 1 ml.
1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias
Procedimiento:
Aislamiento por mtodo de sembrado de estras.
Estra Simple
Estra por Agotamiento
Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con
el asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje,
estras sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estril con agar
nutritivo.
Marque la placa con lpiz de vidrio y lleve a la estufa a 37C por 24 h.
Tome la placa Petri no estril y mrquela en su parte posterior
colocando No estril, llvela a la estufa a 37C por 24h.
Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estril transfiera 1 ml de caldo
de un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos
y llvelos a la estufa a 37C por 24 a 48 h.

Resultados
En las placas con estras simples, se observa que hay crecimiento pero de un solo
tipo de colonia.
En las placas de agotamiento por estras, se trata de un mtodo rpido y simple
de agotamiento y continuo de inoculo sobre un medio solido contenido en una
placa petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un
nmero reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la
placa. Cada una de estas bacterias originara una colonia. Se obtiene diferentes
colonias.













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III. EXPERIMENTO N 3:


Cultivo de Organismos Anaerobios.

Fundamentos
Los microorganismos anaerobios constituyen la flora bacteriana predominante en el
ser humano y se hallan constantemente en el ser humano y en el tracto
intestinal, vas respiratorias y aparatos genitourinarios. Aun cuando
los anaerobios se encuentran en heridas y abcesos, hay que tener presente
que pueden participar en cualquier tipo de infeccin. Para trabajos de laboratorio
con estos microorganismos
es preciso obtener condiciones de anaerobiosis; esta atmosfera tiene doble finalidad:
eliminar o reducir la tensin de oxigeno y mantener el ambiente sin este o la menor
concentracin posible. Algunos procedimientos son ms sofisticados otros
ms sencillos.
La va metablica utilizada por estos grmenes permite la liberacin de sustancias
de metabolismo intermediario, como cidos grasos voltiles de cadena corta como
el acido butrico, valrico, etc., de olor desagradable y fcilmente detectable,
que facilitan el diagnostico.
Material :
2 Tubos con Agar Nutritivos vertical
2 Tubos con Agar Nutritivos inclinado
2 Tubos con Caldo de Tioglicolato o caldo carne
Campaa de Durham o Jarra Gaspack
Cepas de Clostridium sporgenos y Bacillus subtilis

Procedimiento:
Siembre cada cepa en uno de cada par de tubos, por puntura en el agar vertical, por
estra en el inclinado y asada en el caldo. Tapone los tubos y lleve a la Campaa de
Durham. Incube a 37C por 24 h.
Resultados
El Clostridium sporogenos es un microorganismo anaerobio, por lo tanto al obtener
los resultados no se observo crecimiento alguno en el AGAR VERTICAL (falla en
el cultivo) pero se debi observar en la base por ser zona anaerobia, en el AGAR
DIAGONAL se observo crecimiento en la zona anaerobia y
tambin hubo crecimiento en el caldo de TIOGLICOLATO.
El Bacillus subtilis es un microorganismo aerobio y presento
crecimiento en el AGAR DIAGONAL (zona aerobia), pero tambin hubo
crecimiento en el AGAR VERTICAL en la zona aerobia y en anaerobia
porque el Bacillus es un anaerobio facultativo. Tambin hubo crecimiento en el
caldo de TIOGLICOLATO.



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PRCTICA 3
Metabolismo Bacteriano. Enzimas de los microorganismos. Fermentacin bacteriana.

I. EXPERIMENTO N 1:


Hidrlisis del Almidn

Objetivo: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que
producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como Carbohidratos y Protenas.

El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de
reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. Tambin puede
ser hidrolizado por los Acidos Minerales.

ALFA AMILASA + ALMIDON = DEXTRINA + ALFA MALTOSA
BETA AMILASA + ALMIDON = ALFA MALTOSA

Las Amilasas son enzimas extracelulares

Materiales:
Solucin de Yodo (Lugol)
Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli.
1 Placa de Agar Almidn

Procedimiento:
Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn
Inocular en estras cada sector con las capas de B. subtilis y E. coli.
Incubarlo a 37C por 24 h.
Resultados

Organismo Crecimiento Hidrlisis
Bacillus subtilis De bueno a excelente +
Eschercihia coli De bueno a excelente -

Luego de agregar el lugol:





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II. EXPERIMENTO N 2:


Hidrlisis de la Gelatina

La gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar GEL cuando se disuelve
en agua caliente Por tratarse de una protena puede ser atacada por alguna
bacterias que la priven de su propiedad gelitificante.
La hidrlisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y se conoce por GELATINASA la
enzima causante de esta transformacin.

Materiales:
Cepas de S. Aureus, B. subtilis y E. coli.
Tres tubos de Gelatina Nutriente estril
Asa de Kolle en aguja



Procedimiento:
Inocule cada uno de los organismos en un tubo de Gelatina Nutriente por puntura
hasta el fondo del tubo, una sola vez.
Incube a temperatura ambiente por 2 a 7 das, no en incubadora porque derrite la
gelatina.



Resultados

Organismo Crecimiento Hidrlisis de Gelatina
S. aureus De bueno a excelente +
B. subtilis De bueno a excelente +
E. coli De bueno a excelente -



Interpretacin

Hidrlisis de la gelatina
Positivo (+): cuando el medio en el tubo no est gelificado.
Negativa (-): cuando el medio en el tubo esta gelificado.

















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III. EXPERIMENTO N 3:


Produccin de Hemolisinas

Objetivo: Conocer y estudiar las exoenzimas que tienen efectos destructivos
sobre los glbulos rojos.

Hemolisina Beta: Destruye y decolora la Hemoglobina. Esto se observa como reas
claras alrededor de la colonia.

Hemolisina Alfa: No decolora la Hemoglobina, pero la cambia a un color verdoso.
(Biliverdina)

Materiales:
Cepa de Staphylococcus aureus (o B. subtilis) y Streptococcus
pneumonias o
Streptococo Lact.
Agar sangre (1 2)

Procedimiento:
Dividir en dos placas petri.
Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados.
Incubar a 37 C por 24-48 h.
Observar si ha habido hemlisis

Resultados:
En el Estafilicoco aureus se pudo observar pqueos halos en los bordes, pero solo
en un lado (hubo hemolisis pero poca), posible fallo en la siembra.
En el de E. coli debido a que produce hemolisina alfa por ello produce hemolisis
incompleta no decolora totalmente la hemoglobina.













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IV. EXPERIMENTO N 4:


Demostracin de la Produccin de Coagulasa N.

La Coagulasa es una exoenzima elaborada por el Staphylococcus aureus y que coagula el
plasma humano o de cobayo.

Materiales:
Cepa de S. Aureus
Plasma humano o de cobayo citratados en tubo.

Procedimiento:
Tomar una azada de la cepa e inocular en el tubo que contiene el plasma citratado.
Incubar por 2-3 horas. Revisar cada 30 el tubo para ver si han empezado a formar
cogulos. Para esto incline el tubo para ver que tan lquido est el plasma.
Resultados
Se produjo coagulacin del debido a la coagulasas del Estafilococo aureus.



Plasma citratado formacin de cogulos, (+) turbio



























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V. EXPERIMENTO N 5:


Fermentacin de Carbohidratos

Fermentacin se refiere a la degradacin anaerbica de los carbohidratos. La capacidad
para fermentar los carbohidratos depende de las enzimas que contenga cada bacteria. La
degradacin de los carbohidratos conduce a la formacin de productos lcteos, por lo tanto
se utilizar un indicador de ph: Rojo Fenol.

En la prctica se utilizar el medio TSI en tubo. Si la bacteria no tiene las
enzimas necesarias para atacar los carbohidratos, no cambiar el ph.

La prueba contendr lo siguiente:
Agar TSI (3 azcares y hierro) favorece el desarrollo de la mayora de bacterias.
Azcares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa.
Un indicador de ph.

NC no cambio de ph
A cido
AG cido y gas
b bsico

Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria la
obtiene la bacteria de protenas y su producto final es gas amoniaco.

Materiales:
Cultivo de Escherichia coli , Alcaligenes faecalis y Staphylococcus aureus
3 tubos con TSI en plano inclinado

Procedimiento:
Sembrar por estra y puntura:
a) E. Coli - TSI
b) Alcaligenes - TSI
c) Staphylococcus - TSI
Incubar por 24 h. A 37C

Resultados:
El tubo correspondiente a la E. coli evidenciamos un cambio de color de rojo a amarillo (un
medio acido); y esto evidencia la existencia de una fermentacin. En funcin a la posicin
de los azucares observamos una prueba de lactosa + sacarosa + glucosa.












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Hubo fermentacin en E. coli

En el tubo correspondiente a la siembra con alcaligenes se mantiene la
coloracin roja
(medio bsico), no hubo fermentacin.

Alcaligenes, no hay fermentacin


En el tubo con siembra de S. aureus, se observ una fermentacin casi completa. Se
muestra que este organismo es ayudado por el oxgeno.

Fermentacion en siembra de Staphylococcus






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Conclusiones:
La capacidad de fermentar al CHO depende de la presencia
enzimtica del microorganismo
El cambio de pH est en relacin a la capacidad fermentativa
Los alcaligenes al no poder fermentar; esto se debe a la no presencia del material
enzimtico correspondiente.


VI. EXPERIMENTO N 6:


Reduccin de Nitratos a Nitritos

En la respiracin anaerbica, las bacterias utilizan al nitrato como aceptor final de H +, este
fenmeno lo pueden realizar algunos grmenes aerobios, anaerobios, y
anaerobios facultativos.
Se observa al final de la reaccin la presencia de gas nitrgeno libre.




Nitrato de Potasio KNO3 Nitrato de Potasio
2H + NO3 H2O + NO2

Materiales:
Cultivo de E. coli, Pseudomona areuginosa
Caldo nutritivo con nitrato 6cc.
Sol. Dimetil - alfa - naftilamina
Sol. de cido sulfanlico
Tubos de pruebas estriles (3)

Procedimiento:


Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

2cc caldo de 2cc caldo de 2cc de caldo
nitrato + E. coli nitrato + Pseudomona nitrato + Bacillus

Incubar por 24 hrs. a 37C.
Agregar a cada tubo 3 gotas de cido Sulfanilico y 2 gotas de alfanaftilamina
Observa cambio de color, color rosado o rojo: Prueba positiva.













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(+) (-) (+)

VII. EXPERIMIENTO N 7:


Reduccin de cido Sulfhdrico

Cuando se realiza la fermentacin de las protenas se obtiene como producto
el cido Sulfhdrico, ya que las protenas contienen aminocidos sulfurados.
Algunas bacterias tienen enzimas que desprenden al cido de azufre de estos
aminocidos, el cual es reducido con hidrgeno del substrato para formar cido
sulfhdrico. Por lo tanto el azufre funciona como aceptor de H +.

H2S + FeSO4 FeS + H2SO4
(negro)

Materiales:
Cultivo de E. coli y Proteus vulgaris
Tubos con TSI, con superficie inclinada (2)

Procedimiento:
Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. coli y Proteus
respectivamente, por
estra y puntura.
Incubar a 37C por 24 hrs. Observar la formacin de FeS color negro.



















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Resultado:
El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.


Conclusin

El tomo de azufre liberada por los organismo atreves de la accin con los H+ para
formar cido sulfhdrico.
Para detectar la formacin del gas cido sulfhdrico se requiere la incorporacin de
aditivos al medio, tales como hierro ya que reacciona con el ac. Sulfhdrico
formando sulfuro insoluble (color negro).

La presencia de cido Sulfhdrico se evidencia por el ennegrecimiento de los tubos de TSI.



















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VIII. EXPERIMENTO N 8:


Demostracin de la produccin de Indol

Algunas bacterias degradan el aminocido triptfano formando INDOL.

Materiales:
Cultivo de E. coli y Bucillus subtilis
Caldo Triptona 2 tubos con 3cc cada uno)
Solucin de Kovacs
Pipetas de 1cc

Procedimiento:
Inocular un tubo de caldo Triptona con E. coli y otro con Bacillus, Incubar a 37C
por 24 horas.
Agregar a cada tubo y en zona el reactivo de Kovacs. Si el Indol est presente, al
agregar el reactivo de Kovac aparecer un color rojo cereza.

Resultados:
El tubo con E. coli se evidencia la presencia de indol. (1)
El tubo de Bacillus subtilis no hubo presencia de indol. (2)

1 2
























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IX. EXPERIMENTO N 9:


Deteccin de la Catalasa

La Catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una
bacteria para utilizar el oxgeno. La falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la
causa de que
el O2 les sea perjudicial. Cuando hay Oxgeno estos organismos lo emplean como aceptor
final de Hidrgeno para formar Agua Oxigenada, pero sta no puede desdoblarse en H2O y
O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria.

Catalasa
2H2O2 2H2O + O2
(gas) Agua Oxigenada

Materiales:
Cultivo de E. coli y Stafilococo aureus.
Tubos con Triptosa Caldo (2)
Agua Oxigenada 3.0%

Procedimiento:
Inocular en cada tubo una de las cepas
Incubar a 37C por 24 hrs.
Cubrir la superficie del caldo con Agua Oxigenada y observar la presencia de
burbujas en el tubo donde hay catalasa.
Resultados:

Funcion de catalasa (Efervescencia)
Estafilococo aureus +
Clostridium -


En la prueba de E. coli (gram -) con perxido de hidrogeno, no
observamos las
burbujas de oxgeno. Esto nos indica que la E. coli es CATALASA NEGATIVA; es
decir, no presenta la enzima catalasa. (1)
En el caso de la bacteria Estafilococo aureus (gram +) con el H
2
O
2
se observar
la formacin de burbujas por presentar la enzima catalasa que actu con
H
2
O
2
para liberar oxgeno. El Estafilococo es CATALASA POSITIVA (2)

(1) (2)

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4cc cultivo 2.5 cultivo 1cc. cultivo
cc de caldo 2.5 caldo 4cc de caldo

X. EXPERIMENTO N 10:


Reduccin de Azul de Metileno

Se trata de demostrar la oxidacin en los procesos fermentativos, realizada
por los grmenes anaerbicos, llamada oxidacin anaerbica, donde el sustrato cede un H
+, para
lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno acta como aceptor.

Azul de Metileno + 2H Azul de etileno - 2 H
(azul) (Incoloro)
Reduccin del azul de Metileno.

Materiales:
Cultivo de E. coli 7.5cc.
Tubo de Prueba (3)
Pipetas estriles
Azul de Metileno de Loeffer
Caldo nutritivo 7.5cc

Procedimiento:
Rotular los tubos con 1,2,3.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo3

1

Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo.
Incubar a 37C. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y
anotar los cambios de color.
Resultados
El azul de metileno es un aceptor de H, posee la propiedad de cambiar de color al pasar de
oxidado (azul) a reducido (incoloro). La E. coli reduce el azul de metileno por
eso es observa que se muestra incoloro. Por eso el tubo 1 se ve ms incoloro.


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PRCTICA 4
Determinacin de los requerimientos mnimos para el crecimiento bacteriano. Medios
de cultivos selectivos y diferenciales.
I. EXPERIMENTO N 1
Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.

Materiales:

Ingredientes necesarios para la preparacin de diferentes medios de cultivo.
a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo)
b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl)
c) Agar + Minerales + Glucosa
d) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrgeno Orgnico (Peptona)
4 placas Petri estriles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d.
Cultivo Escherichia coli. (Sector1), Stafilococcus aureus (Sector2) y
candida
Albicans (Sector 3).

Procedimiento:

Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa
petri para
dividirlo en cuatro sectores y enumera cada sector. Inocule los
sectores correspondientes de cada placa con uno de los tres organismos.
Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incbelas a
38C por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los
sectores inoculados.

Resultado:

No hay crecimiento en las 3 primeras placas petri debido a que los requerimientos de las
bacterias son importantes para su crecimiento y estas 3 placas no cumplen con ello. En la
cuarta placa petri si hay presencia de crecimiento porque si cumple con los requerimiento
nutricionales bacterianos permitiendo su desarrollo.









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II. EXPERIMIENTO N 2:


Medios selectivos y diferenciales

Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento e
identificacin de bacterias.

Materiales:

[ Agar nutriente
[ Porcin de Agar-Cloruro de sodio
[ Porcin de rojo fenol-Agar
[ Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes (Pseudomona).

Procedimiento:

[ Con el lpiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primero etiqutelo
Alcaligenes faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero djelo sin rotular.
[ Use el asa de Kolle para sembrar en estras cada sector de la placa con el cultivo
correspondiente. Invierta las placas Petri e incbelas por 24 horas a 37C.

Resultados:

En el AGAR NUTRIENTE la seudomona crece y libera tiocianina.
En el AGAR CLORURO DE SODIO la gran concentracin de sal limita el
crecimiento bacteriano.
En AGAR FENOL-AGAR toma un color rojizo.

















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PRCTICA 5
Citologa de los microorganismos. Preparacin del frotis y fijado. Tincin simple.
Tincin diferencial: coloracin gram, cido alcohol resistentes. Tincin negativa.
Demostracin de los grnulos metacromticos.

III. TINCIN DIFERENCIAL

Se denomina Coloracin Diferencial cuando se emplean dos o ms reactivos.
La ms
empleada en la bacteriologa es la coloracin Gram y la coloracin para bacilos
cido alcohol resistentes.



Coloracin Gram

La tincin Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta
que es el colorante bsico inicial que tie todas las bacterias, el segundo
reactivo es el lugol que acta como mordiente (sustancia que aumenta la unin
del colorante y el substrato). El tercer reactivo es el alcohol-acetona que acta como
decolorante. Mucho microorganismos retienen el cristal violeta permaneciendo teidos y
tomando el nombre de bacterias Gram positivas; otro grupo de mircroorganismos
pierde el color fcilmente por accin del decolorante, al aadirse la safranina
que es de color rojo, toman este segundo colorante, denominndose
microorganismos Gram negativos.

Materiales:
Solucin Cristal Violeta de Genciana
Solucin de Lugol
Alcohol Acetona
Fucciana bsica o Safranina
Lmina portaobjeto, Asa de Kolle, Solucin salina.
Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli.

Procedimiento:
Frotis y fijado de la muestra
Cubrir la muestra con solucin de cristal violeta durante 1 minuto
Lavar ligeramente con agua de cao
Cubrir la muestra con solucin de lugol durante 1 minuto
Lavar con agua de cao
Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre color.
Lavar con agua de cao.
Colorear con safranina por 30 segundos
Lavar, secar y observar

Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersin
(aceite). Las bacterias Gram positivas se tien de azul oscuro; las bacterias
Gram negativas aparecen rojo rosadas.





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Resultados:
Se realizo la prueba de acuerdo al procedimiento indicado. Luego se hizo una toma
de muestra del agar sangre y del agar simple y se los tio con Gram: Estafilococo
aureus y E. coli.


Microscpicamente


E. coli


S. aureus

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PRCTICA 6
Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin.

I. EXPERIMENTO N1:


Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin.

Materiales:
Cultivo de S. aureus, E. coli.
Disco de antibiograma para gram + y gram -.
Placas petri con agar nutritivo TSA.

Mechero, asa de kolle, hisopo estril.

Procedimiento:
Sembrar con hisopo estril en la superficie de las placas cada sp.
Aspticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa.
Incubar por 24 hrs. a 37C y dibujar los resultados.

Resultados:
Se pudo observar mediante el tamao del halo:
E. coli resistente a ciprofloxacina, gentamicina. Parcialmente
resistente a amikacina.
S. aureus resistente a oxacilina, ampicilina. Sensible a nitrofurantoina.


















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PRCTICA 7
Destruccin e inhibicin de microorganismos. Efecto de la concentracin de iones H+,
PH. Efecto del calor. Accin oligodinmica de metales pesados.

I. EXPERIMENTO N 1:


Efecto de la Concentracin de iones H+
El pH de una solucin es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentracin de
iones hidrgeno en mol x lt.

pH = - log H +

Segn Bronsted y Lowry (1923), un cido se caracteriza por su tendencia a
perder H+, mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por
lo tanto, los cidos aportan con una concentracin determinada de H+.
Aplicando la frmula encontraremos que a mayor concentracin de H +, menor pH (mayor
acidez).

El pH puede ejercer una accin bactericida segn la concentracin de hidrgenos
y la especie de la bacteria sometida a dicho pH.

Materiales:
Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensin
Reactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ON
Medio de Cultivo: Caldo Peptonado.
Procedimiento:
Es tres tubos con caldo de cultivo estriles, realizar la siembra de E. coli en asadas.
A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en los
tubos se obtengan los siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tubo servir de
control.
Volver a taponar los tubos e incubar a 37C por 24 hrs. Despus de este tiempo, leer
por turbidez.
Resultados:
Tubo1: sin crecimiento de E. coli en medio cido. Caldo peptonado trasparente.
Tubo2: crecimiento de E. coli en medio alcalino. Caldo peptonado turbio.
Tubo3: por fallas de procedimiento tambin se observo crecimiento de E.
coli. Debi haber sido trasparente el caldo peptonado.




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II. EXPERIMENTO 2:


Efecto del calor

Materiales:

Cepas de E.coli o Estafilococo
Equipo: Bao Mara y estufa
Medios de cultivo: caldo peptonado

Procedimiento:

Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli.
Someter a dos de los tubos a la accin del calor por bao Mara, graduando en 40C
y 100C por 10 minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la accin del
calor para que sirva de control.
Retirar los tubos del bao Mara e incubar los tres tubos a 37C por
24 horas. Realizar la lectura por turbidez.

Resultados:

Tubo 1 (Experimental) 40C Tubo 2 (Experimental) 100C Tubo 3 (Control)
Turbidez Si ++ No. Trasparencia Si +


La E. coli presenta temperatura optima de crecimiento 40C pero puede
presentar
crecimiento a temperatura ambiente porque su lmite de temperatura va de 8-47C














A mayor turbidez, indica que hubo mayor
proliferacin bacteriana, es decir, que el
medio acido es el adecuado para estas bacterias.












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III. EXPERIMENTO N 3:


Accin oligodinmica de los metales pesados.

Las sales solubles de mercurio, arsnico, plata, cobre y otros metales pesados,
alteran la actividad enzimtica formando mercptidos con grupos sulfhidrilo de residuos de
cistena.
La reaccin inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraos en forma de glutation
o tioglicolato de na, muchas de las clulas se recuperan. La capacidad de
unin de los mercuriales se extiende en un amplio rango de ligandos a
dems de los grupos que contienen SH, por ejemplo carboxilados, fosfatos y aminas.

Materiales:

Cepas de E. coli Estafilococo
Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1%
Medios de cultivo: caldo peptonado
Equipo: Estufa

Procedimiento:

Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos placas con
Agar nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar.
A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de plata. El
otro constituye el control.
Incubar a 37C por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembra en caldo
y por halo de inhibicin en agar.

Resultados:

Tubo Problema Tubo Control
AgNO3 1% Si No
Crecimiento (Turbidez) No Si
Precipitacin Si No

Tubo problema: no hay crecimiento bacteriano = accin oligodinamica
de los
metales.
Tubo control: si hay crecimiento bacteriano.
















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PRCTICA 8
Limpieza de la piel y antisepsia cutnea.
I. EXPERIMENTO N 1:
Materiales (Observacin del crecimiento):

Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada uno
Isopos de algodn estril (3)
Solucin antisptica, alcohol yodado
Un tubo con caldo nutritivo estril

Procedimiento:

En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabn
squese y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el
sector 3 lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4.
En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre
esta zona humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo
estril en la zona 5. Aplique el desinfectante por dos minutos ms y repita lo
anterior para sembrar en el sector 6.
Incube a 37C por 24 hrs. observe y comente los resultados.

Resultados:

1 placa petri: en el 1 sector hay crecimiento bacteriano debido a que no hubo una
buena asepsia, en el sector 2 gracias al lavado de manos hubo
disminucin del crecimiento bacteriano.
2 placa petri: sector 3 y 4 gracias al lavado de manos varias veces hubo un menor
crecimiento bacteriano.
3 placa petri: no hubo crecimiento bacteriano porque se hizo una
asepsia con desinfectante y alcohol yodado.







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CUESTI ONARI O


Qu es SIEMBRA POR ESTRA?
Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, all se
extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada
con el material a sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas.
Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la
parte ms cerca de la boca del tubo.
Medio de cultivo: agar base inclinado.
Instrumento: asa o aguja bacteriolgica.

Qu es SIEMBRA POR AGOTAMIENTO?
Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las
colonias y
aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se
deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de
un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando
estras. Esto puede realizarse de varias formas:
a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando se quiere
obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se
repite la operacin sin tomar con el asa nuevo material.
b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en
el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estra
luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el
ltimo cuadrante aparecern las colonias aisladas
c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde, se esteriliza
el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri.
Instrumento: Asa Kolle.
Finalidad: Obtener colonias aisladas

Qu es AGAR NUTRITIVO?
Es un medio para fines generales utilizado en el examen de agua y productos
lcteos;
tambin para el cultivo de la mayora de microorganismos menos fastidiosos; de la misma
manera para el transporte de cepas; para el cultivo preliminar de muestras
sometidas a exmenes bacteriolgicos y para aislar organismos en cultivos puros.
Composicin
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Agar 15g
pH final 6.8












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Qu es AGAR SANGRE?
Se prepara a partir de un medio base al cual se le aade sangre, lo que permite
aislar y
cultivar organismos fastidiosos y exigentes. El pH ligeramente cido, del medio
base favoreces reacciones hemolticas precisas.
Composicin
Infusin de corazn vacuno 500g.
Triptosa 10g
pH 6.8
Cloruro sdico 5g
Agar 15g

Qu es AGAR ALMIDN?
Es un medio para cultivos de organismos que se analizan para determinacin de hidrlisis
del almidn o para estudios comparativos.
Composicin
Extracto de carne 3g
Almidn soluble 10g
Bacto Agar 12g
pH final 7.5 +/- a.2 a 25C

Qu es AGAR GELATINA?
Se utiliza para determinar la licuefaccin de la gelatina por organismos
proteolticos,
facilitando el recuento directo en la placa, para la determinacin de poblaciones bacterianas
y para el aislamiento de cultivos puros. Sin embargo su uso es limitado en procedimientos
de siembra y aislamiento, ya que, la incubacin tiene que realizarse a 20C (temperatura
ms baja que la optima para mucho microorganismos), adems muchos organismos tienen
la capacidad de licuar y atacar a la gelatina.
Composicin
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Gelatina 120g
pH final 6.8 +/- 0.2 a 25C.

Qu es AGAR TSI?
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base
a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido
sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de
carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de
cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+
, los cuales
se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo
de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por
medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El
tiosulfato de sodio se reduce



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a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de carne 3.0

Suspender 62,5 g del polvo por litro de
agua destilada. Mezclar bien y calentar
con agitacin frecuente, hervir 1 o 2
minutos hasta disolucin total. Llenar
hasta la tercera parte de los tubos de
ensayo. Esterilizar a 121C por 15
minutos. Enfriar en pico de flauta
profundo.
Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Glucosa 1.0
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2


Qu es CALDO TRIPTONA?
Es un medio de cultivo microbiolgico que presenta abundante triptfano, se utiliza para la
reaccin del indol (liberacin de triptfano). Dicha liberacin se debe a la degradacin del
aminocido triptfano mediante la enzima triptofanasa.

Qu significa CALDO MIXTO?
Es decir tiene como finalidad ser un medio selectivo y un medio diferencial.

Qu significa CALDO TIOGLICOLATO?
Se utiliza para pruebas de esterilidad para ciertos productos biolgicos que estn turbios.
Contienen tioglicolato para neutralizar el efecto bacteriosttico de preservantes mercuriales.
No contiene agar, lo que le hace adecuado para probar materiales viscosos y aparatos que
tengan tubos con pequeas aberturas.
Composicin
Extracto de levadura 5g
Casitona 10g
L-cistina 12g
Tioglicolato sdico 0.5g
Cloruro sdico 2.5g
Dextrosa 5.5g

Qu es un MEDIO SELECTIVO?
El medio de cultivo selectivo favorece el crecimiento de organismos pero tambin inhibe el
crecimiento de otros. Este medio contiene compuestos qumicos que favorece e inhibe el
crecimiento de ciertos microorganismos, este medio tambin tiene ciertos
tintes que provoca que ciertas bacterias fermentadoras de lactosa crezcan y se
tie de dicho color caracterstico del tinte.






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Qu es un MEDIO DIFERENCIAL?
El medio de cultivo diferencial es el que facilita la deteccin de diferentes
clases de
bacterias a base de cambios visibles en el medio de cultivo o diferencias en la apariencia de
las colonias, este medio tambin utiliza ciertos tipos de tintes que tien ciertos
tipos de bacterias.

DIFERENCIAS ENTRE MEDIO SELECTIVO Y DIFERENCIAL.
La diferencia de este medio con el medio selectivo es que el selectivo solo
provoca que
algunas bacterias en especfico se tian mientras que el diferencial tie todas las bacterias
para as poder diferencias una de otras.

Qu es el ANTIBIOGRAMA?
Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los
antibiticos. Por extensin, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y
otros quimioterpicos.
Utilidad: La razn por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria
determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibiticos de las distintas
especies bacterianas y, ms an, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes
diferencias de sensibilidad a un determinado antibitico entre unas y otras cepas.
El antibiograma es un mtodo de diagnstico rpido y preciso
Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibitico ms adecuado
para el tratamiento de una enfermedad.

Mtodo de la difusin en medio slido
Se siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la
superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el
antibitico o quimioterpico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco
se observar
un halo, en el cual no hay proliferacin de bacterias. Si el germen es
resistente al antibitico, crecer uniformemente y no habr ningn halo de inhibicin en
torno al disco
de papel.









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Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:
Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso
de un tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de
esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir
efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o
aumento de la posologa).

TIPOS DE HEMLISIS
Fundamento
Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo
hacen
responden de diferente manera segn realicen o no la lisis de los glbulos
rojos
(hemlisis) producida por la accin de una enzima llamada hemolisina
Podemos diferenciar tres tipos de hemlisis:

Hemlisis alfa: es una hemlisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un
halo de color verdoso.


Hemlisis beta: en este caso la hemlisis es total y el halo que rodea a las
colonias es totalmente transparente.










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Hemlisis gamma (no hemlisis): el microorganismo en cuestin no es capaz de realizar
la hemlisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.



EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN TINCIN GRAM
Alcohol - acido en la coloracin de Ziehl Neelsen.
El alcohol-acido se usa para decolorar la muestra en una tincin de Ziehl Neelsen, la
cual es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares
de ciertos paracitos y bacterias contienen cidos grasos de cadena larga que les
confiere la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus
de la tincin con colorantes bsicos.

S o l u c i n de Lugol y alcohol acetona en la coloracin Gram.


Solucin de Lugol: El Lugol se aplica como mordiente, el lugol est formado
por
yodo (I
2
) en equilibrio con yoduro de potasio (KI), el cual est
presente para solubilizar el yodo. El yodo entra en las clulas y forma un
complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.

Poe eso se le llama mordiente porque como es estable esta interaccin (con el cristal
violeta) quedan e n a m b o s t i p o s d e bacteria.
De no ponerlo, este complemento no se formara y el cristal violeta saldra del medio
ante el lavado con agua. Tindose todo Gram (-).


Alcohol acetona: Sirve para decolorar, ya que en la misma es soluble el
complejo
yodo/cristal violeta. Los organismos GRAM + no se decoloran mientras los GRAM - si
lo hacen.


Entonces permite que el complemento cristal violeta lugol salga de la
clula al debilitar la pared de los GRAM (-).




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Por qu se emple la tincin negativa o de contraste?


Porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo,
aumentando de este modo su contraste, mostrando la imagen exacta de los
microorganismos, nos permite apreciar el tamao real de estos.
Se usa tambin para la tincin de capsulas, la presencia de estos indica patogenecidad.


EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN LA TINCIN DIFERENCIAL
Alcohol-cido en la coloracin de Ziehl-Neelsen.
El uso de este alcohol sirve para intentar decolorar la muestra de bacterias fijadas con
calor en la muestra, si este alcohol q es m uy fuerte no llega a decolorar a las bacterias
pero si a los espacios, y seguido a esto la aplicacin del color
contraste azul de metileno, se podra deducir la estructura de l a
pared bacteriana compuesta por cido miclico lo cual le confiere
una propiedad hidrofbica y cerosa por eso su resistencia a este acido alcohol.

Solucin de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloracin Gram.

El lugol acta como un fijador entre el primer colorante bsico aplicado y la muestra de
bacterias, mientras que el alcohol acetona funciona como el decolorante, casi similar
al acido alcohol, pero con menor potencia.

RESULTADO ESQUEMATIZADO






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