Mass Spectrometry - Inti 24 Mayo 2013

Espectrometra de masas
Diapositiva 1
Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.
Agenda
Breve Introduccin a la espectrometra de Masas. Principios y fundamentos tericos Ionizacin a Presin Atmosfrica: Electrospray, Ionizacin Qumica, Fotoionizacin, APGC Analizadores: Cuadrupolo vs Tiempo de vuelo Instrumentacin disponible en el mercado Alcances de la tcnica Aplicaciones de inters
Diapositiva 2 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.
Espectrometra de Masas (MS) Es un mtodo utilizado para Medicin de pesos moleculares de sustancias en fase gaseosa, que permite su identificacin o estudio estructural
La espectrometra de masas trabaja con Iones en fase gaseosa Antes de obtener el espectro correspondiente, la sustancia debe ser ionizada (de no encontrarse en ese estado)
Las molculas pueden ser ionizadas por adicin o eliminacin de un electrn (e-) M + e(M + eM +. + 2 eM - . ) ---- raramente usado
En ambos casos, el ion obtenido posee una masa igual a su peso molecular
Alternativamente, las molculas pueden ser ionizadas por adicin (o substraccin) de un ion [M+X]+ or [M+X] I_____________________________I Ion quasi molecular La masa del ion difiere del peso molecular del fragmento que le dio origen Los iones son acelerados en el vaco a travs de un campo magntico y/o electrico para ser separados de acuerdo a su relacin masa / carga (m/z), donde m/z = m porque generalmente, z = 1
Los iones con la apropiada relacin m/z pasan a travs del analizador para impactar en el detector, generando la seal correspondiente
La seal obtenida se denomina espectro de masas, y en el se grafica la intensidad relativa de los iones vs. m/z
Pico Base (pico de mayor seal en el espectro, corresponde al fragmento principal o mas estable)
Todos los picos restantes, se reportan en relacin al pico base M+ Ion molecular
Generalmente se observa la presencia de pequeos picos adyacentes a los de mayor intensidad, debidos a la abundancia natural isotpica de los elementos (12C, 13C o 1H, 2H, etc.)
100
124.0
OH +H O HO
142.0 147.1
N O 142 - H2O 124
H H H
121.0
[M+H]+
400.0
21-Hidroxi Deflazacort
96.3 100.0 135.0 171.0 225.0
0 100
397.1
O +H O HO O OH - HF H 415 - H2O
415.1 [M+H] + 435.2
337.1 309.1
H F O
397
319.1 355.1 291.1 327.2
21-Aceto Dexametasona
147.1 237.1
379.1
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
m/z
Tres funciones bsicas:
transformacin de una muestra a iones en fase gaseosa (fuente de ionizacin)
separacin de estos iones segn su relacin masa/carga (analizador)
deteccin de los iones separados (detector)
Instrumentos para aplicaciones orgnicas y bioqumicas
Espectrmetros de masas para anlisis de relaciones isotpicas
sistemas para anlisis de elementos traza
Espectrometra de masas, Limitaciones
MS por si sola, puede no ser ideal para el anlisis de mezclas El espectro de masas de una mezcla, es la resultante de la superposicin de los espectros individuales de cada componente
LC - MS
Mobile phase carrying mixture of components
Identificacin de compuestos previamente separados

Fuente de Ionizacin
Impacto de electrones (EI)
Las molculas, en estado gaseoso, son bombardeadas por electrones energetizados para producir su ionizacin, esto causa disociaciones o fragmentaciones secundarias. Un exceso constante de energa (70 eV) asegura reproducibilidad en la fragmentacin
M + e-
. +2e M+
F1 F 2 F 3
Impacto de Electrones
Filamento
Repeller
Introduccin de muestra
Ion
Al Analizador
Colector
Sistema de enfoque de iones
Espectro de Ionizacin por Impacto de Electrones y de Biblioteca
Ionizacin Qumica (CI)
Consiste en hacer reaccionar las molculas de inters con un gas reactivo (previamente ionizado por EI y que halla reaccionado con una molcula neutra del mismo)
CH4 Metano
e- -----> CH4+. CH5+
2e-
Metano radical cationico + CH3. + CH4
CH4+. + CH4 -----> M Muestra

Diapositiva 18
Ion reactivo + CH5+ -----> MH+
Ion Quasi molecular

Electrospray (ESI)
Electrospray: Es una tecnica de ionizacion a presion atmosferica que permite el ingreso de la muestra desde el LC y su ionizacion en forma conjunta
Utiliza un campo elctrico para producir la nebulizacin de la muestra
La muestra ingresa a travs de un capilar, en cuyo extremo se aplica un potencial negativo o positivo
Este alto potencial sumado al pequeo radio de curvatura del capilar genera un fuerte campo elctrico que causa que el liquido emergente sea una mezcla de pequeas gotas y vapor (nebulizacin)
Electrospray (ESI): Overview
Contraelectrodo
Caudal LC
Capilar
Fuente de alto voltaje

Electrospray (ESI)
Mayor abundancia de iones negativos Mayor abundancia de iones positivos
Caudal LC
Cono de Taylor
Gotas cargadas positivamente
Capilar a alto voltaje

Electrospray (ESI)
Las gotas producidas en la nebulizacin tienen carga superficial
Al evaporarse el solvente estas gotas reducen su tamao, incrementando la repulsin de cargas
Cuando la repulsin de cargas es mayor que la tensin superficial se produce una fisin generando gotas muy pequeas cargadas elctricamente.
+ + +
+ +
+ + +
Evaporacin de solvente
+ + +
+ + + +
+ + +
Fisin Coulombica
+ +
+ + +
+ +
Diapositiva 22
+ + + + +
Electrospray (ESI)
Mecanismo de desorcin inica
+ + +
+ +
+ + +
+ ++ + + + + +++
+ ++ + + ++ + + + +
+ + + +
+ +
Mecanismo de carga residual
+ + +
+ +
+ + +
+ ++ + + + + +++ +
+ + +
+ +
Diapositiva 23
Electrospray (ESI): Formacin de iones
Iones positivos - ESI

Lidocaina H
H N
N O
C H3 CH 3
+ H+ O
C H3 CH 3
Iones negativos - ESI C H3

Ibuprofen
C H3 O CH3 O H 3C
CH3 OH H 3C
Diapositiva 24
+ H+
Electrospray (ESI): Fuente de ionizacin

Presin atmosfrica
ESI Probe
Vacio moderado Alto vacio
Venteo Muestra Gas de cono Cono de muestra Vlvula de aislamiento Gas de nebulizacin Lentes RF (Hexpolo) Cuadrupolo
Gas de desolvatacin
Diapositiva 25
Cono extractor
Bomba rotativa
Bomba turbomolecular
Electrospray (ESI)
Fragmentos Multi-cargados
Electrospray tiene tendencia a producir iones multi-cargados, permitiendo la determinacin de pesos moleculares elevados que estaran fuera del rango de trabajo del sistema.
Cuando se forman iones multi-cargados m/z m debido a que z 1
Para z > 1 resulta m/z < m, la masa aparente del ion es mucho menor que la verdadera
Hemoglobina
A +9
100
1681.6
A chain (+10, +9, +8) A chain + Heme (+10, +9, +8) B chain (+10, +9, +8) B chain + Heme (+10, +9, +8)
B +10
1587.6
A +10
%
B +9
1764.0
1513.6
A +8
1891.7
A +9 heme A +10 heme

1575.2 1515.8 1589.9 1750.1
B +10 heme
1649.3
1684.1 1766.4
B +9 heme
1832.4
A +8 heme
1968.8 1984.3
B +8
0 1475
m/z 1500 1525 1550 1575 1600 1625 1650 1675 1700 1725 1750 1775 1800 1825 1850 1875 1900 1925 1950 1975 2000 2025
Electrospray (ESI)
Ventajas Confirmacin de pesos moleculares Indicada para analitos inicos, muy polares y proticos Buena sensibilidad Molculas de alto peso molecular pueden ser determinadas a travs de la formacin de fragmentos multicargados Acoplable a cromatografa liquida, cromatografa capilar y electroforesis capilar
Diapositiva 28
Desventajas Fragmentacin limitada Limitada a bajos caudales de trabajo Si bien las interfaces (ZSpray) permiten el trabajo con buffer no voltiles, altas concentraciones de modificadores inicos reducen la sensibilidad
APcI Overview
El liquido es forzado a pasar por un capilar de dimetro pequeo a efectos de proporcionarle una gran velocidad lineal La calefaccin de la sonda combinada con el gas de nebulizacin vaporiza el liquido Los vapores del solvente y del analito pasan a travs de la zona de descarga elctrica para producir los iones en fase gaseosa
Corona de descarga Caudal LC APcI Calefactor (400-650 C) Vaporizacion
Aguja de descarga
Vapores de solvente y analito Gas de nebulizacin

Diapositiva 29
Cono de muestra
APcI Ionizacion en fase gaseosa
Cono de muestra
H2O H3O+ eN2+ H3O+ eN2 H2O N2+ + + + + eH2O+ N2+ N2
H2O
N2
H2O+ N2+
Region de descarga (Plasma)
Corona de descarga 2-5 A
Iones positivos APcI: Mecanismos de formacin

Ms probable 1. Protn, transferencia: H3O+ CH3OH2+ CH3CNH+ NH4+ + + + + + + + + M M M M M M M M (M+H)+ (M+H)+ (M+H)+ (M+H)+ + + + + H2O CH3OH CH3CN NH3+
2. Formacin de aductos: NH4+ CH3CNH+ CH3OH2+ H3O+ 3. Intercambio de cargas: N2+. H2O+.
(M+ NH4)+ (M+ CH3CNH)+ (M+ CH3OH2)+ (M+ H3O)+ M+. M+. + + N2 H2O
+ +
M M
Diapositiva 31
Menos probable
Iones negativos APcI: Mecanismos de formacin

Ms probable 1. Protn, extraccin: HOCH3OCH2CN+ + + M M M (M-H)(M-H)(M-H)+ + + H2O CH3OH CH3CN
2. Formacin de aductos: ClCH3COO-
+ +
M M
(M+ Cl)(M+ CH3COO)-
3. Intercambio de cargas: O2-.
M-.
O2
4. Captura de electrones: eDiapositiva 32
M-. Menos probable

APcI: Fuente de ionizacin

APcI calefactor APCI Probe Corona de descarga
Presin atmosfrica Vacio moderado Alto vacio
Venteo Muestra Gas de cono Cono de muestra Vlvula de aislamiento Gas de nebulizacin Gas de desolvatacin RF Lentes (Hexpolo)
Cuadrupolo
Diapositiva 33
Cono extractor
Bomba rotativa
Bomba Turbomolecular
Ionizacin Qumica a Presin atmosfrica (APcI)
Ventajas Confirmacin moleculares de pesos
Desventajas Fragmentacin limitada Valores de ruido qumico muy intensos para bajos valores de masas No es adecuada para molculas muy poco voltiles
Indicada para analitos neutros y polares Buena sensibilidad Robustez, la posicin del capilar y el pin corona no es critica Permite trabajar con caudales de hasta 2 mL/min.
Diapositiva 34
Fotoionizacin (APPI)
APPI utiliza la misma punta de ionizacion que APcI con el agregado de una fuente de luz UV en lugar de la corona de descarga Al igual que en APcI: El liquido es forzado a pasar a traves de un capilar para obtener una alta velocidad lineal La calefaccion y el gas de nebulizacion vaporizan el caudal del liquido La ionizacion se produce en forma directa o quimica en la region de la luz UV Fuente UV Caudal LC Calefactor h Vaporizacin Electrodo Repeller
Vapores de Solvente y analito

Diapositiva 35
Cono de muestra
Fotoionizacin (APPI) Direct APPI

M + hv M+
El analito M es ionizado a su ion molecular M+. (Esto ocurre si el potencial de ionizacin del analito esta por debajo de la energa del fotn)
M+ + S MH+ + S[-H]
En presencia de solventes proteicos M+ puede extraer un tomo de hidrogeno para formar MH+.
Dopant APPI
D + hv D+ D+ + M MH+ + D[-H] D+ + M M+ + D
Un dopante fotoionizable es agregado en alta concentracin para generar iones D+ D+ provoca la ionizacin de M por transferencia de un protn o electrn
Fotoionizacin (APPI)
PhotoMateTM Kripton 10.0 eV, 10.6 eV Potenciales de Ionizacin (IP) Antraceno Fluorantreno Cafeina 4-Nitrotolueno
10. eV
IP Dopantes (solventes) Tolueno Acetona 8.82 eV 9.70 eV
7.4 eV 7.8 eV 8.0 eV 9.5 eV
Metanol Acetonitrilo Agua

Diapositiva 37
10.85 eV 12.19 eV 12.61 eV
APPI: Fuente de ionizacin

Calefactor APCI Probe Venteo Muestra Gas de cono Cono de muestra Valvula de aislamiento RF Lentes (Hexpolo) Repeller Electrodo Luz UV
Cuadrupolo
Gas de nebulizacin
Gas de desolvatacin
Diapositiva 38
Cono extractor
Bomba rotativa
Bomba Turbomolecular
Modo de Ionizacin vs Polaridad
ESI
APPI
APcI
API: Interface ZSpray
API: Interface ZSpray
Z-Spray
API Interface
Puntas de Ionizacin
CID: Interface ZSpray
Fragmentacin: Informacin Estructural
Los iones pueden ser inducidos a fragmentarse, incrementando el potencial elctrico (voltaje de cono). La aceleracin de estos iones ocasiona que colisionen con mayor fuerza con las molculas neutras, causando una mayor fragmentacin. (Collision induced decomposition CID) El estudio de estos fragmento permite el estudio desde el punto de vista estructural, posibilitando la confirmacin de la presencia de una sustancia

CH 3 O NH 2 S O NH N CH 3 N
Sulfamethazine
12,000
Extraction Cone
12,000 10,000
Parent Ion Region MW 278

Positive ion mode, ESI, 2 ul/min, 50% MeOH:49% H2O:1% HOAc
[M+H]+
10,000 Intensity 8,000 6,000 4,000

Hexapole ionion -bridge
8,000 6,000 4,000 2,000
Sample Cone 30V
277 278 279 280 281 282
m/z
2,000 0 100
150
200 m/z
250
300
156 92
NH 2 O S O NH N N
CH 3
186
CH 3
Sulfamethazine
Extraction Cone
Fragment Ion Region

10,000
10,000 Intensity 8,000 6,000 4,000
8,000 6,000 4,000 2,000
MW 186
C6H8N3O2S
Sample Cone 70V
183 184 185 186 187 188
m/z
[M+H]+
Collision induced molecular ion dissociation prior to mass analysis
Hexapole ionion -bridge
2,000 0 100
150
200 m/z
250
300
LC/MS y CID Generacin de fragmentos y libreras

[MH]+
100 Cl N
Ion molecular
356
[M[M-H]N
+15 Volts +30 Volts +45 Volts +60 Volts +75 Volts
50
-15 Volts -30 Volts -45 Volts -60 Volts -75 Volts
HN
179 199
OH
0 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 MW: 355 CAS# 86-42-0 C20H22ClN3O (toxm l180804) Am odiaquine [ESI+ @ 15V]
Informacin estructural
100
219 283 Cl 255 163 N HN 177 205 240 228 118 136 268 356 OH N
+90 Volts F+
Diapositiva 48
50
128
-90 Volts F-
0 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 MW: 355 CAS# 86-42-0 C20H22ClN3O (toxm l180804) Am odiaquine [ESI+ @ 90V]
Fragmentacin total
LC/MS y CID Generacin de fragmentos y libreras

ESI+@90V
NITRAZEPAM
C15H11N3O3 MW 281.27 (Nominal 281) CAS# 146146-2222-5
H N O
100 % 0 100 % 0 100 176 208 158 207 180 179 181 190196 208
236 235 237
282
ESI+@70V
282 236 235 237 254 283
ESI+@50V
282 283 %
ESI-@90V
100 222 194 % 0 100 % 252 253 222 166 195 206 223 253 280 281 252
ESI-@70V
280
Algunas molculas presentan una adecuada respuesta en ESI para iones positivos y negativos facilitando su inequvoca identificacin
Diapositiva 49
0 100 % 0 160 180 200
ESI-@50V
280 281 280 300 m/z
252 220 240 260
Waters APGC/MS Interface
APGC Atmospheric pressure GC interface Mayor rango de compuestos LC & GC en un solo instrumento Rpido intercambio de la fuente de ionizacin Espectro APCI APGC no es un reemplazo de los modos tradicionales de ionizacin EI o CI en GC/MS

Transferencia de carga
N2+ y N4+ se forma en la region del plasma
SOURCE ENCLOSURE
Ion Chamber Corona Discharge
N2++M > M+. + N2 N4++M > M+. + 2N2

Protonacin
En presencia de trazas de agua.
Cone Modifier
Transfer Line Tip Column Reference
H3O+
H3O+ + M > MH+ + H20

modificadores (H2O o MeOH) pueden ser aadidos a efectos de favorecer la protonacin
Ionizacin mas blanda que EI, siendo el ion molecular generalmente predominante y la fragmentacin reducida significativamente.
La fragmentacin para anlisis estructural se obtiene a travs de CID o MSMS.

Ionizacin APGC: Protonacin

Biblioteca NIST
100 30 168 75 O N O
1,4 Dinitrobenzene
50 50
92 64
122 N O O
28 0 12 16 32 10 20 30 (ma inlib ) Benzene, 1,4-d initro-
38 43 46 40 50 53 60 70 79 82 86 80 90 100 106 110 120 130 138 140 152 150 160 170 180
Espectro Obtenido M+
13:28:17
APGC160408RUN007_8270 1358 (6.105) Cm (1356:1362-1300:1353) 100
169.0248
1,4-Dinitrobenzene
TOF MS AP+ 464
122.0252 75.0228 64.0296 76.028694.0407 123.0290 152.0225 170.0253

TOF MS AP+ 9.20e12
Teorico M+.
APGC160408RUN007_8270 (0.021) Is (1.00,0.10) C6H4N2O4 100
168.0171
169.0199
0 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z
Ionizacin APGC: Transferencia de cargas

Biblioteca NIST
100 107 122
2,4-Dimetilfenol
OH
50 77
39 27 51 41 50 38 40 43 42 45 47 49 40 50 53 55 65 63 60 62 64 66 60 68 70 74 76
79 78
91
103 93 80 82 80 86 89 90 95 98 100 110 120 130
0 10 20 (ma inlib ) Phenol, 2,6-d imethyl-
15 18
26 29 31 30
Espectro Obtenido M+
13:28:17
APGC160408RUN007_8270 998 (4.491) Cm (995:1001-(965:986+1007:1053)) 100
122.0723
2,4-Dimethylphenol
TOF MS AP+ 2.98e3
107.0498 121.0658
0
123.0782
Teorico M+.
APGC160408RUN007_8270 (0.021) Is (1.00,0.10) C8H10O 100
122.0732
TOF MS AP+ 9.12e12
123.0766
0 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 m/z
Waters APGC/MS Interface: Performance

Mayor de 4 ordenes Ejemplo para benzo(g,h,i)perileno 2 pg to 10000 pg
Compound name: Benzo(g,h,i)perylene Correlation coefficient: r = 0.998814, r^2 = 0.997629 Calibration curve: 0.104709 * x + 0.228912 Response type: External Std, Area Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: Null, Axis trans: None 5.0
Compound name: Benzo(g,h,i)perylene Correlation coefficient: r = 0.992916, r^2 = 0.985883 Calibration curve: 0.167382 * x + -82.0944 Response type: External Std, Area Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: Null, Axis trans: None
5.0
0.0
0.0
-5.0
Residual
Residual
-5.0
-10.0
-10.0
-15.0
-15.0
-20.0 -25.0
-20.0
pg
pg
100
1500 1250 1000 750 500 250 0
80
Response
Response
60
40
20
0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
pg 1000
pg 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Waters APGC/MS Interface Tipo de Compuestos

Los compuestos indicados exhiben LOD en el rango de fg a pg PAHs Anilina y compuestos relacionados Halo aromticos Halo carbonados Ftalatos Nitroso-benzenos y productos relacionados Fenoles y clorofenoles Eteres fenilicos Dibenzofuranos Isophorone Azobenzenos
Analizador
Luego que los iones son producidos, son separados de acuerdo a su relacin masa / carga (m/z) por un analizador
Analizador
Tipos de Analizadores: - Magneticos - Electrostaticos - Tiempo de Vuelo (ToF) - Cuadrupolos (Q) - Trampa Inica (IT)
Analizador
Principales caractersticas - Rango de trabajo: Rango de m/z que pueden separarse - Transmisin: relacin entre el numero de iones producidos por la fuente de ionizacin y los que llegan al detector - Resolucin: capacidad para separar la seal de dos iones con pequeas diferencias de masa.
Cuadrupolo
Un cuadrupolo consiste de dos pares de barras de molibdeno exactamente paralelas entres si, controladas por la combinacin de potenciales de radio frecuencia (rf) y corriente continua (dc).
Solo un ion de una masa especifica puede pasar a travs del cuadrupolo cuando se aplica un campo oscilatorio de rf y dc, llegando al detector (generalmente un multiplicador de electrones o un foto multiplicador). El tiempo de vida de un ion desde su formacin hasta su deteccin es de 50 a 100 microsegundos.
Cuadrupolo
Cuadrupolo
Trampa de Iones
El principio es muy similar al cuadrupolo
Los iones son atrapados por campos RF & DC
Barrido de un campo puede eyectar iones de un m/z especfico
Trampa de Iones
Por aplicacin de una rampa del voltaje de RF, o por la aplicacin de un voltaje suplementario sobre los electrodos, o por combinacin de ambos, es posible: Desestabilizar los iones y eyectarlos en forma progresiva de la trampa Retener solo un ion con un determinado valor m/z en la trampa y luego eyectarlo para observarlo especficamente Retener solo un ion con un determinado valor m/z en la trampa, fragmentarlo por vibraciones inducidas y observar sus fragmentos (MS/MS in time) Repetir esta ultima operacin varias veces en forma progresiva. Esto se denomina MS/MSn
ToF: Resolucin
RESOLUTION: 500 m/z 130
Muestra Standard interno
RESOLUTION: 5000 m/z 130.083
Masas exactas: Introduccin
Todos los elementos encontrados en la naturaleza tienen una nica masa. Los elementos se combinan entre si para producir compuestos con distintas masas y propiedades fisicoqumicas. Estos compuestos pueden se detectados a travs de la espectrometra de masas y sus masas medidas Si la masa de un compuesto puede ser medida con suficiente exactitud, una nica composicin elemental puede ser deducida.
Carbono Hidrogeno Oxigeno Nitrgeno
Tiene una masa igual a 12 Tiene una masa igual a 1 Tiene una masa igual a 16 Tiene una masa igual a 14
Estas son masas nominales, que no son exactas
Carbono Hidrogeno Oxigeno Nitrgeno
Tiene una masa de 12.0000 Tiene una masa de 1.0078 Tiene una masa de 15.9949 Tiene una masa de 14.0031
Es posible la existencia de diferentes combinaciones de tomos con igual masa nominal y diferente masa exacta
CO N2 C 2H 4
= = =
27.9949 28.0061 28.0313
Todas las molculas tienen igual masa nominal y diferentes masas exactas Por medicin de masas nominales no es posible distinguirlas Si un compuesto difiere en su composicin elemental en algunas de estas molculas, para su determinacin estructural es necesario recurrir a la medicin de masas exactas.
Masas exactas: ppm

En los instrumentos la exactitud de masas que poseen, es medida como la diferencia (error) entre el valor determinado y la masa verdadera calculada La exactitud es medida en milliDaltons (1mDa = 0.001 unidades de masa) ppm = partes por millon = m/m x 106 Masa verdadera Masa medida Diferencia = 400.0000 = 400.0020 = 0.0020
( 2 mDa)
ppm error
Diapositiva 70
0.002 400
x 106
= 5 ppm
Masas exactas: Resolucin espectral
100%
Masa Ancho de pico 50%
= 500 = 0.05Da 0.05
50% 0.05 Da
Resolucin (FWHM) = 500 = 10000

m/z
499.9
500.0
500.1
FWHM = Full Width Half Maximum
Resolucin - Cuadrupolo y ToF
100 % 80 60 40 20 0 319.8
319.8965 Resolution = 10,000
319.9329
319.9
320.0
320.1
Mass
100 % 80 60 40 20 0
Resolution = 1,000
319.8
319.9
320.0
320.1
Mass
Tiempo de vuelo (ToF)
Iones P u s h e r V2 V1 V1 > V2
Espejo W MCP
LockSpray Integrado
LockSpray Integrado
Detectores
Una vez que los iones de inters son separados, estos deben ser convertidos en una seal fcilmente interpretable por el sistema de adquisicin de datos. Esta funcin la cumplen los detectores
Tipos de detectores: - Multiplicador de electrones (Dynodos) - Multicanales - Fotomultiplicadores
Fotomultiplicador Dynolite
Los iones provenientes del analizador son convertidos en electrones (conversion dynode) Estos electrones colisionan con una placa de fsforo que al ser excitada emite fotones Los fotones colisionan con un foto ctodo, ubicado en el frente del fotomultiplicador, donde se liberan electrones y se amplifica la seal producida. El fotomultiplicador se encuentra encerrado en un ambiente de vaco a efectos de prevenir posibles contaminaciones e incrementar su tiempo de vida.
Adquisicin y procesamiento de datos
El software es el corazn del sistema

Adquisicin de datos Procesamiento Identificacin de espectros Control absoluto del sistema
Opciones orientadas a diferentes aplicaciones: QuanLynx (Cuantificacin) ProteinLynx (Identificacin y secuenciacin de Protenas MetaboLynx (Identificacin de metabolitos) NeoLynx (screenig de neonatos) TargetLynx (Cuantificacin, confirmacin y limites permitidos)
API, Simple cuadrupolo MS
Cono de muestra
Enfoque de iones
Prefiltro
Posfiltro
Conversion Dynode
Cono de Extraccin
DETECTOR
Fsforo Fotomultiplicador
Fuente de iones Z-Spray
Cuadrupolo
ACQUITY UPLC + SQD 2
LC-ToF MS
LC-MS: Aplicaciones
Anlisis de Carbamatos
Monitoreo de residuos en aguas y suelos
Carbamatos: EPA M531.1
Carbamatos, derivatizacin
Derivatizacin postcolumna
Bomba Columna
Camara mezcladora
Detector
Inyector
Reactor
Bomba reactivo
Carbamatos
LC MS Condiciones
Cromatogramas, TIC y PDA
Methomyl, linealidad
Methomyl en diferentes matrices
m/z 233
Carbamatos, resumen
LC LC-MS/MS Sistemas Tandem

LC-MS/MS vs LC-MS
MS/MS Modos de trabajo
Full Scan (Barrido) Mayor Selectividad Reduce o elimina las interferencias debidas a la matriz de trabajo Mayor Sensibilidad Determinaciones a nivel de trazas, permite alcanzar menores limites de deteccin y confirmacin Exactitud en anlisis cuantitativos Reproducibilidad, estabilidad y rango dinmico Cuantificacin precisa a muy bajos niveles de deteccin sobre matrices complejas Robustez Reduccin del Clean Up de muestras, aun en matrices complejas
Single Ion Recording (SIR) Product Ion Scan Precursor Scan Constant Neutral Loss Multiple Reaction Monitoring (MRM)
API, Cuadrupolo Tandem MS/MS
XEVO TQ-S: Cuadrupolo tandem
API, Cuadrupolo Tiempo de vuelo QToF
XEVO G2-S QToF
Cuadrupolo Tandem: Usos
Confirmacin
- Compara los tiempos de retencin con el Standard - Relacin entre iones especficos SIR/MRM vs Standard - Cuantificacin - trazas
Targets
Impurezas, sustancias de degradacin Confirmacin de estructuras

Compara los tiempos de Retencin con el Standard - Screening de rutina - Espectros MS de sustancias conocidas (Biblioteca)
Interpretacin Sustancias desconocidas

Peso Molecular Composicin elemental Elucidacin de estructuras Secuenciacin
Rutina: Cuantificacin
QQ
Cuadrupolo Tandem
Rutina: Screening dirigidos
TOF
Tiempo de vuelo
Q TOF
Anlisis de investigacin
Cuadrupolo Tandem:
Full Scan Mode
Q1 Modo RF
Q2 Scan
Celda de colisin (sin gas)
306 321 380 200 250 300 350 400 500 Q2 Scan 200 - 500
306 321 380 200 250 300 350 400 500
El sistema esta operando como un sistema LC-MS de simple cuadrupolo Realiza un barrido dentro de un rango especificado m/z
Cuadrupolo Tandem: Single Ion Recording (SIR)
Q1 Modo RF
Q2 Esttico
Celda de colisin (sin gas)
306 321 380 Q2 selecciona 306 m/z
306
250 300
350
400
El sistema esta operando como un sistema LC-MS de simple cuadrupolo Se monitorean iones de relacin m/z seleccionada
Cuadrupolo Tandem: Multiple Reaction Monitoring (MRM)
Q1 Esttico
Q2 Esttico
Celda de Colisin (Ar gas)
Fragmentacin
306 321 380 Q1 selecciona 306 m/z 306 Q2 selecciona 158 m/z 158 158
250 300
350
400
150
300
158
El sistema esta trabajando en modo selectivo, permite que solamente un ion determinado llegue a la celda de colisin para su fragmentacin y un fragmento especifico sea detectado. Esto modo de trabajo se utiliza principalmente con fines cuantitativos Mltiples MRM pueden ser usados, tambin, como confirmatorios de la presencia de una sustancia.
Multiple Reaction Monitoring: Selectividad

MS/MS reduce o elimina las interferencias de matriz
MRM
SIR
Celda de colisin: Cambios de energa
100
275
(M + H)+
% 0 100
275
Energa de colisin = 5 eV
% 0 100
230
230
% 0 100
230
275
% 0 150 Diapositiva 106
160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 m/z 290
Celda de colisin: Cambios de energa

230
100
Energa celda de colisin = 17 eV

%
(M + H)+
0 100

167 180 201 202 230
0 100
167

180 194 201 230
0 150 160 Diapositiva 107
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
270
280
m/z 290
Product Ion Spectrum: Pirimiphos-methyl
Transicin de cuantificacin 305 290 Transicin de confirmacin 305 180
TargetLynx: Relacin de iones

(Heptachlor)
Criterios de confirmacin Dependiendo de la abundancia relativa de dos transiciones
272 237 Transicin de cuantificacin
Peak Area Ratio 0.616
> 0.5 > 0.2 < 0.5 > 0.1 < 0.2
10% 15% 20%

274 239 Transicin de confirmacin
Esta relacin es usada para confirmar o rechazar resultados positivos

Relacin : 0.554 0.678 (0.616 10%)
Ciclos de tiempo en MRM

El tiempo de una transicin MRM esta compuesto por dos parmetros principales: 1. Dwell time: Tiempo durante el cual una transicin es monitoreada 2. Inter-channel delay: periodo que transcurre entre el monitoreo de transiciones MRM sucesivas, su funcin es permitir eliminar todos los iones de la celda de colisin Despus del inter-channel delay, la celda debe ser llenada rpidamente con los iones de la siguiente transicin. Si esto no ocurre con la suficiente rapidez (por ejemplo cuando el dwell time es demasiado corto) la seal puede disminuir en intensidad
100 ms Dwell Time, 10 ms Delay

0.63 Convert the x axis to scan number % % 0.63 Peak Width = 1.8 s Points Across Peak = 7
0.25
0.75
1.25
1.75
Time
100
105
110
115
120
125
130
Scan
5 ms Dwell Time, 5 ms Delay

0.63 Convert the x axis to scan number % % Peak Width 1.8 s 0.63 Points Across Peak = 60
0.25
0.75
1.25
1.75
Time
1100
1200
1300
1400
Scan
Cross Talk
Cuando el dwell times y el inter-channel delay son demasiados cortos, puede ocurrir que no todos los iones sean eliminados de la celda de colisin. Fragmentos de una transicin estn en la celda de colisin cuando la prxima transicin empieza a ingresar. Cuando esto ocurre y las sucesivas transiciones tienen fragmentos (hijas) similares pueden generarse falsos positivos en la identificacin de compuestos estructuralmente relacionados o patrones de fragmentacin diferentes a los reales.
Seal y Ciclos MRM: Celda T-Wave
Mtodos MS/MS: MRM

Funciones MRM
Mayor flexibilidad en el uso de dwell time Mayor cantidad de transiciones por funcin Mayor definicin del pico e incremento de la relacin Seal / Ruido
Porque, a veces, son necesarias tcnicas full scan ?
Cuadrupolo Tandem: Product Ion Scanning
Q1 Esttico
Q2 Scan
Celda de colisin (Ar gas)
Fragmentacin
158 158
306 321 380 Q1 selecciona 306 m/z
306
Q2 Scan 100 -310
306
250 300
350
400
150
300
150
300
El sistema permite seleccionar un ion de m/z definida, el cual es fragmentado en la celda de colisin y se detectan todos los fragmentos (product ions). Se utiliza principalmente con fines cualitativos
Product ion scan

Espectro de fragmentacin de la reserpina 609m/z Puede ser usado en el desarrollo de mtodos para identificar los fragmentos de cuantificacin y confirmacin en el modo MRM
Parent Ion
Fragmentos: Pptidos
R
100
Y
286.12
Y"
MAX
340.17
802.36
% 389.21 215.08 160.08 417.21 689.29
800.39
86.09 803.36 157.13 542.24 487.07 418.22 455.22 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 609.29 608.77 668.32 785.36
986.48 915.43
(M+2H)2+
690.28
913.44 804.39
916.47
987.48
1087.55 1088.52 m/z
1000
1100
1200
Figure 2.
Diapositiva 120
MS/MS of m/z 608.8/609.8 (M+2H)2+ peptide annotated with y" ion sequence
Que es MSE ??
Baja energa de colisin produce el ion precursor
%
MS
m/z %
time
MSE
%
Alta energa de colisin Produce fragmentacin

Diapositiva 121
m/z
Cuadrupolo Tandem: Precursor Ion Scan
Q1 Scan
Q2 Esttico
Se ven todos los Iones que producen El fragmento m/z 79
El primer cuadrupolo permite pasar todos los iones (dentro de un rango de barrido especificado) para su fragmentacin y luego se detecta un ion de m/z determinada (product ions). Se utiliza principalmente con fines cualitativos o screening de sustancias estructuralmente relacionadas
Precursor Ion Scan

Iones de m/z = 116 producido por la ruptura del enlace indicado por
+ H2N
HO HO
H2N
+
HO
H2N
N H
Pindolol MW=248
Diapositiva 123
Metoprolol MW=267
Propranolol MW=259
Precursor Ion Scan

MS Scan de la mezcla
MIX_MS 1 (1.025) 100
235 268 249 260 267 295 280
Scan ES+ 1.56e9
0 MIX_PAR 1 (2.070) 100

Pindolol
249
Metoprolol Propranolol
Parents of 116ES+ 5.63e7
260
268
Iones precursores del ion m/z=116
0 230
Diapositiva 124
240
250
260
270
280
290
m/z 300
Cuadrupolo Tandem: Constant Neutral Loss
Q1 Scan
Q2 Scan
El primer y segundo cuadrupolo trabajan en el modo de barrido dentro de un rango determinado de masas, pero el segundo cuadrupolo permite que nicamente los iones que difieren en una determinada masa (equivalente a la perdida de un fragmento neutro) respecto de Q1 sean transmitidos hacia el detector. Se utiliza principalmente para el screening de familias de compuestos Los cidos carboxlicos se fragmentan perdiendo una molcula neutra de dixido de carbono CO2 equivalente a una variacin de masa de 44 Da o unidades de masa atmica.
Constant Neutral Loss

Glutathione 307.33 daltons
N O N O O S O N O
Principalmente utilizado con fines cualitativos Se utiliza estratgicamente en trabajos de screening
Glu
Cys
Gly
N O O
OH O
O N S N O O
Perdida de una molcula de Acido piroglutmico: 129.0426
O N N O O
O O
N O
OH
NCOCH3
NCOCH3
Constant Neutral Loss

Perdida de acido piroglutmico 129.0426
Interferencias isobricas
GSH Adduct
Movilidad Inica Cuadrupolo / IMS / ToF

SYNAPT HDMS Cuadrupolo / Movilidad Ionica IMS / ToF
DriftScope
DriftScope Superposicin de datos
Retention Retention Time Time
Mass Mass Drift Drift
Gua de Iones: TriWave
Triwave esta constituida por tres T-Wave

TRAP Separacin por Movilidad Inica(IMS) TRANSFER
TRAP T-Wave IMS T-Wave TRANSFER T-Wave
TRAP y TRANSFER pueden ser utilizadas para CID

CID/IMS IMS/CID CID/IMS/CID (TAP fragmentation) CID
Experimento IMS MS
m/z
m/z
Drift time Iones separados por IMS

Diapositiva 133
Drift time oa-ToF

Transfer: Fragmentacin
m/z
m/z
Drift time Iones precursores

Diapositiva 134
Drift time Precursores y fragmentos

Iones precursores
Trap: fragmentacin
m/z
m/z
Drift time Iones Precursores y fragmentos Iones separados por IMS
Drift time oa-ToF

Diapositiva 135
Time Aligned Parallel Fragmentation (TAP)
Q1 Precursores
m/z
m/z
Drift time Iones precursores fragmentados
Drift time
Diapositiva 136
Fragmentos separados Precursores y fragmentos, igual drift time por IMS

SYNAPT HDMS y MS
Consultas ???
DAmico Sistemas S.A Daniel Pomies dpomies@damicosistemas.com

Mass Spectrometry - Inti 24 Mayo 2013

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Espectrometra de masas

Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Diapositiva 2 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Diapositiva 3 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Diapositiva 5 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Diapositiva 6 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Diapositiva 7 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

N O 142 - H2O 124

415.1 [M+H] + 435.2

Diapositiva 9 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

transformacin de una muestra a iones en fase gaseosa (fuente de ionizacin)

separacin de estos iones segn su relacin masa/carga (analizador)

deteccin de los iones separados (detector)

Diapositiva 10 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Instrumentos para aplicaciones orgnicas y bioqumicas

Espectrmetros de masas para anlisis de relaciones isotpicas

sistemas para anlisis de elementos traza

Diapositiva 11 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Espectrometra de masas, Limitaciones

Diapositiva 12 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Identificacin de compuestos previamente separados

Diapositiva 14 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Impacto de electrones (EI)

Sistema de enfoque de iones

Diapositiva 16 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Espectro de Ionizacin por Impacto de Electrones y de Biblioteca

Diapositiva 17 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Ionizacin Qumica (CI)

e- -----> CH4+. CH5+

Metano radical cationico + CH3. + CH4

CH4+. + CH4 -----> M Muestra

Ion reactivo + CH5+ -----> MH+

Ion Quasi molecular

Utiliza un campo elctrico para producir la nebulizacin de la muestra

Diapositiva 19 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Electrospray (ESI): Overview

Fuente de alto voltaje

Gotas cargadas positivamente

Capilar a alto voltaje

Al evaporarse el solvente estas gotas reducen su tamao, incrementando la repulsin de cargas

Electrospray (ESI): Formacin de iones

Iones positivos - ESI

Iones negativos - ESI C H3

Electrospray (ESI): Fuente de ionizacin

Vacio moderado Alto vacio

Cuando se forman iones multi-cargados m/z m debido a que z 1

Diapositiva 26 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

A +9 heme A +10 heme

Diapositiva 27 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Corona de descarga Caudal LC APcI Calefactor (400-650 C) Vaporizacion

Vapores de solvente y analito Gas de nebulizacin

APcI Ionizacion en fase gaseosa

Region de descarga (Plasma)

Corona de descarga 2-5 A

Diapositiva 30 Mayo 2013 - DAmico Sistemas S.A.

Iones positivos APcI: Mecanismos de formacin

Iones negativos APcI: Mecanismos de formacin

2. Formacin de aductos: ClCH3COO-

(M+ Cl)(M+ CH3COO)-

3. Intercambio de cargas: O2-.

4. Captura de electrones: eDiapositiva 32

M-. Menos probable

APcI: Fuente de ionizacin