PIRITV

POR

MI

RAZA HA

ES

FACULTAD DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS LABORATORIO DE INMUNOLOGA GENERAL

Saturnino de Len Chapa Patricia Elvira Berrn Ruz Rosana Pelayo Camacho

RA

SECCIN DE BIOLOGA

Magdalena Acosta Segura Rodolfo Pasteln Palacios Fernando Garca Tamayo

Junio de 2003

PRLOGO Inmunologa General representa una de las asignaturas terico-prcticas que resultan trascendentales para los estudiantes de la carrera de Qumica Farmacutico-Biolgica, por cuanto que sienta las bases de una formacin slida que permite el adecuado desempeo en el campo de la salud, a travs del uso y/o el diseo de metodologas diagnsticas, preventivas y teraputicas que incluyen elevados ndices de confiabilidad, sensibilidad y especificidad. Si bien se trata de una disciplina en la que los avances cientficos progresan a ritmos especialmente acelerados, el curso prctico de esta materia cubre con evidente eficacia su objetivo general de ensear las tcnicas y fundamentos claves. Esto ltimo se refleja claramente en el hecho de que los alumnos mantienen un creciente inters por conocer y profundizar en relacin con los nuevos hallazgos, aspecto esencial para lograr su permanente actualizacin. El presente manual contiene los principales fundamentos y tcnicas asociados a los ejercicios que se realizan hoy en da en el laboratorio de Inmunologa General, lo que sin duda representar un gran apoyo para los estudiantes. Lgicamente, como cualquier texto sobre Inmunologa, ste es perfectible y deber ser modificado y ajustado continuamente, tal como lo han afirmado en forma reiterada los docentes del curso. Expreso mi mayor reconocimiento a los autores de esta gran obra, los profesores Saturnino de Len Chapa, Patricia E. Barrn Ruiz, Rosana Pelayo Camacho, Magdalena Acosta Segura, Fernando Garca Tamayo y Rodolfo Pasteln Palacios, y dicha manifestacin de respeto acadmico tambin la hago extensiva a los profesores Ma. Guadalupe Reyes Garca, Luisa Constanza del R. Cervantes Barragn, Marco Velasco Velzquez y Constantino III R. Lpez Macas quienes, mostrando un ejemplar espritu de equipo, contribuyeron con los autores realizando diversas y muy valiosas aportaciones.

Ral Garza Velasco Jefe del Departamento de Biologa

 N D I C E UNIDAD 1. INMUNGENOS, ANTGENOS E INDUCCIN DE LA RESPUESTA INMUNE 1. Preparacin de inmungenos y antgenos. I. Extracto de tejido muscular o protenas plasmticas de origen humano, equino, bovino, porcino, de pollo, de perro, etc. II. Protenas purificadas. Albmina y !-globulina humana III. Preparacin de antgenos e inmungenos celulares. Glbulos rojos de carnero. IV. Preparacin de antgenos e inmungenos bacterianos. Antgenos OK-L de Escherichia coli. Antgenos de Shigella dysenteriae. Antgenos totales de B. abortus. Antgeno somtico (O) de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). Antgeno flagelar (H) de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). Inmunizacin de animales de laboratorio. Sueros antiespecie. Sueros anti-protenas purificadas. Suero anti-eritrocitos de carnero (Amboceptor hemoltico anti-carnero). Sueros antibacterianos. 4 6 9 11 13

2.

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UNIDAD 2. INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO (Ag-Ac) INMUNOPRECIPITACION 3. 4. Curva de precipitacin cuantitativa en capilar. Mezcla de antgeno y anticuerpo. Prueba de Identidad a sueros de uso teraputico. Determinacin del origen de manchas de sangre. Doble difusin en placa (Ouchterlony) Identificacin de fracciones antignicas presentes en suero humano.

28 33 36

5. 6. 7.

38

Inmunodifusin radial simple (RID). (Mancini, Carbonara y Hermans) 41 Cuantificacin de albmina srica humana (ASH). Inmunoelectroforesis (IEF). (Grabar y Williams) Anlisis de protenas en Suero Humano. 44

UNIDAD 3. REACCIONES DE AGLUTINACIN AGLUTINACIN DIRECTA E INDIRECTA

47

8. 9.

Aglutinacin en placa. Titulacin de sueros anti-bacterianos Aglutinacin en tubo. Tipificacin de grupo sanguneo ABO y Rh.

49 52 55

10. Hemaglutinacin Indirecta. Titulacin de anticuerpos frente a tiroglobulina. UNIDAD 4. CITLISIS INMUNE REACCIONES DE CITLISIS 11. Titulacin de Amboceptor Hemoltico Anticarnero. UNIDAD 5. TCNICAS CON ANTICUERPOS MARCADOS INMUNOFLUORESCENCIA, RADIOINMUNOANLISIS, INMUNOENZIMTICOS 12. Ensayo inmunoenzimtico UNIDAD 6. PURIFICACIN DE ANTICUERPOS MTODOS DE PURIFICACION DE ANTICUERPOS 13. Purificacin fraccionada con sales neutras. Purificacin de !-globulinas a partir de plasma humano. ANEXO I. TCNICAS DE APOYO A. B. C. D. E. Coagulacin de plasma Determinacin de protenas. Mtodo de Biuret Curva de Mc Farland Preparacin de suspensiones de eritrocitos de carnero Manejo y desecho de material biolgico potencialmente infeccioso

60 62

65 67

70 73

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ANEXO II. PREPARACIN DE REACTIVOS BIBLIOGRAFA

82 86

UNIDAD 1
PRCTICA No. 1

PREPARACIN DE INMUNGENOS Y ANTGENOS.

GENERALIDADES Anteriormente el trmino antgeno era utilizado para denominar a todos aquellos agentes capaces de estimular una respuesta inmune y adems de interaccionar con los productos de sta (anticuerpos y linfocitos T sensibilizados). Actualmente, se ha establecido que una sustancia puede o no tener dos propiedades diferentes, una la inmunogenicidad y otra la antigenicidad. Por tanto, se considera inmungeno a toda sustancia capaz de inducir respuesta inmune al ser introducido a un individuo inmunocompetente. Estas sustancias deben reunir ciertos requisitos para actuar como tales, entre estas caractersticas se pueden mencionar: - Ser reconocidas como extraas por el animal inmunizado, - Su peso molecular, que generalmente es mayor a 10 kDa, - De naturaleza qumica proteica o polisacrida, - La rigidez estructural, - La complejidad molecular, - El volumen molecular, - El contenido de grupos cargados y configuracin - Su difusibilidad El concepto antgeno designa nicamente a aquella sustancia que reacciona con sus anticuerpos especficos. Existen ciertas sustancias llamadas haptenos, que no renen todas las condiciones de inmunogenicidad, que por s solas no inducen la respuesta inmune, pero si lo hacen cuando son conjugadas a una protena acarreadora (complejo haptnico). La respuesta inmune de un animal a un inmungeno puede ser un fenmeno totalmente natural, como sucede en el caso de infecciones causadas por microorganismos, en estados de hipersensibilidad a distintos elementos del medio ambiente, en las enfermedades autoinmunes o en aquellas ocasiones en que son generadas para rechazar a una neoplasia. Pero tambin la respuesta inmune puede ser inducida artificialmente en un individuo mediante la aplicacin del inmungeno, como sucede en las vacunaciones, en la hipersensibilidad a frmacos, en transplantes o a nivel laboratorio en animales de experimentacin con diferentes fines tanto de investigacin como de produccin de sueros inmunes.

En muchos de estos casos se requiere contar con los inmungenos preparados adecuadamente y un esquema de inmunizacin ideal para lograr inducir la respuesta inmune. Entre los inmungenos y antgenos de mayor inters estn: Bacterias Virus Hongos Parsitos Protenas u otros componentes purificados a partir de estos organismos como las toxinas (toxoides). Sueros heterlogos Protenas animales heterlogas purificadas Extractos vegetales Protenas vegetales purificadas. Clulas animales o vegetales Componentes de clulas animales o vegetales purificadas Complejos haptnicos Las aplicaciones que tiene el conocimiento de la preparacin de estos productos biolgicos es muy variada, de las cuales podemos mencionar: Como antgenos: " Antgenos de bacterias, hongos, parsitos y virus para la determinacin de anticuerpos en suero, lquido cefalorraqudeo, etc.; para el diagnstico de enfermedades causadas por estos organismos. " Para el estudio de la composicin antignica de microorganismos. " En la investigacin de reacciones cruzadas entre individuos de diferente especie. " En la determinacin de estructura, localizacin de determinantes antignicos (eptopos), etc. Como inmungenos: " Produccin de vacunas, ya sea constituidas por microorganismos completos o por fracciones de estos, tanto para uso humano o veterinario. " Obtencin de sueros inmunes para uso diagnstico. " Preparacin de sueros inmunes para uso teraputico. " Produccin de sueros inmunes utilizados en control de alimentos y bebidas. " Obtencin de sueros inmunes de uso en Qumica Legal. " En investigacin para el estudio de la respuesta inmune El objetivo de esta unidad es que el alumno vea ejemplificada la preparacin de antgenos e inmungenos de diferente naturaleza.

I.

EXTRACTO DE TEJIDO MUSCULAR O PROTEINAS PLASMTICAS DE ORIGEN HUMANO, EQUINO, BOVINO, PORCINO, DE POLLO, DE PERRO, ETC.

MARCO TERICO Los extractos de tejidos o las protenas plasmticas de animales son excelentes inmungenos cuando son inyectados en otro individuo taxonmicamente alejado, por lo que son utilizados en la inmunizacin de animales de laboratorio para obtener sueros inmunes denominados antiespecie que pueden ser aplicados en el campo del control de alimentos para determinar de que especie proceden las carnes y sus derivados, en Qumica Forense para establecer el origen de una mancha de sangre, en diagnstico para el anlisis de protenas o bien en las pruebas de identidad de sueros de uso teraputico. En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o bien suero, estriles que posteriormente sern utilizados en la inmunizacin de conejos para obtener el correspondiente suero antiespecie. I.1.1 PREPARACIN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO MATERIAL 1 Embudo de 6 cm de dimetro con tres capas de gasa. 2 Pipetas de 10 mL (1/10) 1 Disco de papel filtro de poro grueso (10 cm dim.) 1 Tijeras de punta recta. 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL. 1 Bistur. 1 Balanza granataria. 1 Licuadora con vaso de 250-500 mL. 40 g 60 mL Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc. Solucin salina isotnica (SSI).

TCNICA 1. Eliminar toda la grasa y aponeurosis del trozo de tejido muscular y cortarlo en fragmentos de 0.5 a 1.0 cm. 2. Pesar el tejido y pasarlo al vaso de la licuadora. Agregar SSI a tener una proporcin de 1:2 (p/v) y triturar hasta que el tejido est perfectamente homogeneizado. 3. Pasar el tejido triturado al matraz Erlenmeyer y dejarlo en refrigeracin durante toda la noche para extraer la mayor cantidad de protenas. 4. Filtrar a travs de tres capas de gasa para eliminar las partculas gruesas y en seguida por papel de poro grueso. 5. Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret. 6. Esterilizar por filtracin. (Ver I.2, pag. 4).

I.1.2 PREPARACIN DE UN SUERO HETERLOGO MATERIAL 1 Jeringa de 20 mL estril. 1 Aguja hipodrmica del No. 17 de 3 estril. 1 Aplicador de madera 2 Tubos de centrfuga de 50 mL de plstico. 1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL. 1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo (propipeta). 40 mL 60 mL Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc. Solucin salina isotnica (SSI).

TCNICA 1. Tomar por puncin venosa 40 mL de sangre ya sea de perro, caballo, burro, cerdo, etc. y colocar 20 mL en cada uno de los tubos de centrfuga. 2. Dejar coagular la sangre y con un aplicador de madera separar el cogulo de las paredes del tubo. Centrifugar 30 minutos a 3000 r.p.m. 3. Mediante la pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el sobrenadante y pasarlo al matraz Erlenmeyer. 4. Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret. 5. Esterilizar por filtracin. (Ver I.2, pag. 7). NOTA: Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo con CaCl2 como se describe en el anexo I.A, para evitar la formacin de redes de fibrina que interfieran durante la filtracin. I.2 ESTERILIZACIN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO

MATERIAL 1 Equipo para filtracin estril. Constituido por: Filtro Seitz, matraz Kitasato de 500 mL, manguera para vaco de 50 cm, material filtrante EKS-1 y manguera de ltex de 10 cm. 2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido. 2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados. 2 Pipetas de 10 mL (1/10) estriles. 2 Pipetas de 1.0 mL (1/10) estriles. 2 Frascos tipo vial de 10 mL con tapn estriles. 2 Mecheros 9 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril.

TCNICA 1. Esterilizar el extracto de tejido o el suero por filtracin en filtro Seitz, aplicando vaco ligero para que no se forme espuma. 2. En condiciones de esterilidad, pasar 1.0 mL del filtrado a uno de los frascos vial y el resto en el segundo frasco. 3. Adicionar al primer frasco 9.0 mL de SSI estril y mezclar (dilucin 1:10).
7

4.

5.

Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana a cada producto sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Etiquetar y guardar el extracto o suero diluido y el concentrado en refrigeracin hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

II.

PREPARACIN DE PROTEINAS PURIFICADAS ALBMINA SRICA HUMANA ! GLOBULINA HUMANA

MARCO TERICO La mayora de las protenas animales y vegetales cumplen con los requisitos de inmunogenicidad y por tanto se pueden utilizar como inmungenos en su forma nativa, pero si se desea tener mayor especificidad en la respuesta inmunolgica, es necesario purificarlas. Los mtodos de purificacin dependen de las propiedades fisicoqumicas de cada una de las protenas tales como su solubilidad, peso molecular, tamao, carga elctrica, pI, etc., en la siguiente tabla se ejemplifican algunos de ellos: BASADOS EN: Diferencias de solubilidad: MTODO Precipitacin con sales neutras Precipitacin con metales pesados Precipitacin con solventes orgnicos Precipitacin con cidos o bases (pI) Electroforesis Cromatografa de intercambio inico Permeacin molecular Ultracentrifugacin en gradiente

Diferencias en carga elctrica: Diferencias en PM y tamao:

Estas prcticas se llevarn a cabo a partir de protenas purificadas comerciales y el ejercicio consistir en la preparacin de soluciones estriles de stas con la concentracin necesaria para la inmunizacin de conejos, para obtener los correspondientes anticuerpos. MATERIAL 2 Tubos de 16 X 150 estriles 2 Pipetas de 10 mL (1/10) estriles 4 Pipetas de 1 mL (1/10) estriles 2 Frascos tipo vial de 12 mL c/tapn estriles 2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido. 2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados. 0.3 mL 25 mL Albmina srica humana (ASH) comercial de 25% ! globulina humana al 1% estriles. Solucin salina isotnica (SSI) estril

TCNICA TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD 1. A partir de una solucin comercial estril de albmina srica humana (ASH) de ! globulina humana purificadas cuya concentracin es de 25 g/100 mL 1 g/100 mL preparar dos diluciones con solucin salina isotnica estril:
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2. 3.

4.

Para ASH: 1:50 para tener una concentracin de 5 mg/mL 1:250 para tener una concentracin de 1 mg/mL Para ! globulina humana: 1:2 para tener una concentracin de 5 mg/mL 1:10 para tener una concentracin de 1 mg/mL Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Biuret. Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 3235C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Etiquetar y guardar en refrigeracin hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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III.

PREPARACIN DE ANTGENOS E INMUNGENOS CELULARES GLBULOS ROJOS DE CARNERO

MARCO TERICO Las clulas de origen animal o vegetal constituyen verdaderos mosaicos antignicos debido a la compleja composicin de sus organelos. La preparacin de antgenos e inmungenos celulares tiene varias aplicaciones, entre las que se puede mencionar la produccin de anticuerpos especficos usados como reactivos para la identificacin de alguna poblacin especfica de clulas como en el caso de la tipificacin sangunea y la determinacin de molculas de histocompatibilidad HLA (antgenos de los leucocitos humanos), pero tambin se han utilizado para la investigacin de marcadores y receptores celulares. Para estas aplicaciones, la elaboracin de anticuerpos monoclonales ha cobrado mayor importancia. En esta seccin se ejemplifica la preparacin de antgenos celulares con la obtencin de eritrocitos de carnero lavados para su utilizacin inmediata en la inmunizacin de conejos para as obtener el correspondiente suero inmune. MATERIAL 1 Jeringa de 10 mL con aguja No. 20 estril 2 Tubos de centrfuga cnicos de 15 mL c/tapn estriles 1 Pipeta de 1 mL (1/10) estril 1 Pipeta de 5 mL (1/10) estril 2 Pipeta de 10 mL (1/10) estril 1 Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vaco de 30 cm. 1 Bulbo para pipeta 1 Frasco tipo vial de 10 mL con tapn estriles 2 Mecheros Centrfuga con cabezal para tubos de 15 mL 3 mL Solucin de Alsever estril 100 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril TCNICA TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD 1. Llenar la jeringa con 3 mL de la solucin de Alsever estril y puncionar la vena yugular de un carnero y tomar 3 mL de sangre. 2. Quitar la aguja de la jeringa y vaciar la mezcla sangre-Alsever a un tubo de centrfuga cnico de 15 mL estril dejndola resbalar por las paredes. Tapar el tubo. 3. Centrifugar durante 15 min a 2500 rpm. 4. Eliminar el sobrenadante utilizando el equipo de succin y la pipeta de 10 mL estril.

11

5.

6. 7. 8.

Lavar el paquete de eritrocitos 5 veces de la siguiente manera: Agregar 10 mL de SSI estril, resuspender los glbulos rojos perfectamente con una pipeta estril adaptada con un bulbo. Tapar y centrifugar 10 min a 2500 rpm. Eliminar completamente el sobrenadante mediante el equipo de succin. Al trmino de los lavados, tomar 1.5 mL de paquete de eritrocitos con una pipeta estril y pasarlos al frasco vial estril. Agregar 13.5 mL de SSI estril para tener una suspensin al 10%, que es como se va a utilizar para la inmunizacin del conejo. Tapar el frasco. Esta suspensin deber conservarse en refrigeracin, entre 4 y 6 C hasta el momento de emplearse y solo puede usarse durante 4 das, ya que el envejecimiento desnaturaliza a los antgenos presentes en los eritrocitos.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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IV.

PREPARACIN DE ANTGENOS E INMUNGENOS BACTERIANOS Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Brucella abortus, Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).

MARCO TERICO Las bacterias estn constituidas por un gran nmero de fracciones antignicas diferentes, de aqu que se pueda utilizar como antgenos o inmungenos tanto las clulas ntegras o sus fracciones aisladas; ya sea componentes somticos, flagelares o capsulares, dependiendo del tipo de bacterias. Otras veces se utilizan los productos del metabolismo de estos microorganismos como son las toxinas. No todas las bacterias tienen una estructura antignica similar. En algunas hay predominio de componentes proteicos, en otras los carbohidratos constituyen los Ag que permiten su diferenciacin; y en algunos casos particulares son fosfoglucolpidos complejos. Para ejemplificar la complejidad del mosaico antignico de las bacterias se mencionarn las caractersticas de los principales antgenos de las enterobacterias: Antgenos somticos u O: Son lipopolisacridos que se encuentran formando parte de la pared celular bacteriana, resisten temperaturas de 100C por tiempos prolongados y no se destruyen con alcohol, ni con cidos diluidos. Corresponden a la endotoxina de muchas enterobacterias entre ellas Salmonella y su especificidad antignica reside en la parte oligosacrida. Antgenos flagelares o H: Son componentes de naturaleza proteica localizados en los flagelos de las bacterias, lbiles a temperaturas mayores de 60C y al tratamiento con alcohol o cido. Antgeno de virulencia o Vi: Es tambin superficial, de naturaleza glucolipdica y difiere qumicamente del antgeno somtico O, se encuentra en algunas especies del gnero Salmonella y en otras enterobacterias, es termolbil. Antgenos capsulares o K: Se encuentran en las envolturas o cpsulas de algunas bacterias, generalmente de naturaleza polisacrida que tienen secuencias repetidas de dos o tres azcares, son termorresistentes. Dentro de las aplicaciones ms importantes de los antgenos bacterianos est la determinacin cuali y semicuantitativa de anticuerpos en muestras de suero humano en el diagnstico de infecciones bacterianas y la titulacin de sueros hiperinmunes de animales inmunizados, mediante reacciones antgeno-anticuerpo. Como inmungenos, estas preparaciones son utilizadas en la formulacin de vacunas tanto de uso humano como veterinario, as como en la inoculacin de animales de laboratorio para la obtencin de sueros inmunes cuya aplicacin es
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amplia en la identificacin de bacterias, tanto en muestras biolgicas de origen humano para diagnstico, como en el control microbiolgico de alimentos y productos farmacuticos. Durante la preparacin de antgenos bacterianos es importante conocer el fenmeno llamado variacin antignica el cual implica la prdida de antgenos o cambios en la especificidad debido a envejecimiento del cultivo, infeccin por bacterifagos o a otros factores que son lesivos para las bacterias. Adems, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos se debe tener en cuenta que existe antigenicidad cruzada entre especies diferentes, hecho que cobra importancia cuando se hace tipificacin bacteriana o cuando se obtienen sueros antibacterianos que obliga a someterlos a procesos de purificacin para aumentar su especificidad. Brevemente, los procedimientos ms relevantes para la obtencin de estos preparados bacterianos involucran: Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivo adecuados, que permitan la expresin de los componentes antignicos de inters, atenuarla (disminucin de la virulencia) o inactivarla (perdida de viabilidad) segn sea el caso, mediante mtodos que eviten la desnaturalizacin de los componentes antignicos y, finalmente ajustar a una concentracin determinada, que est en relacin a su uso. La atenuacin de las bacterias puede llevarse a cabo mediante resiembras sucesivas en condiciones poco favorables, aislamiento de los microorganismos de casos de infecciones leves, etc.; mientras que para la inactivacin se cuenta con mtodos fsicos (exposicin al calor), qumicos (tratamiento con formol o timerosal) o combinaciones de estos; en el caso de las toxinas, son convertidas a toxoides (pierden toxicidad pero no su composicin antignica tratndolas con formaldehdo). Durante la produccin de un antgeno o inmungeno bacteriano se deben llevar a cabo una serie de controles que son ms o menos rigurosos segn sea el destino del biolgico preparado, as una vacuna (principalmente de uso humano) requiere de un mayor nmero y ms estrictas pruebas de control, muchas de ellas reglamentadas o bien definidas en las farmacopeas. Estas pruebas de control pueden ser biolgicas en donde se incluye: identidad, pureza, inactivacin, toxicidad, atoxicidad, esterilidad bacteriana y mictica, inocuidad, potencia, etc.; o bien qumicas como: pH, determinacin de adyuvantes y conservadores, protenas totales, cloruros, slidos totales, humedad residual, solubilidad, etc. En los siguientes ejercicios se describe la preparacin de inmungenos a partir de cepas de, E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y S. typhi que sern utilizados en la inoculacin de conejos para la obtencin de sueros inmunes antibacterianos.
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E. coli: Tiene Ag O que han servido para identificar ms de 150 serotipos, adems presenta Ag K que de acuerdo con su termorresistencia han sido clasificados en: Ag A (estables a ms de 120C), Ag B (a 100C pierden su inmunogenicidad pero no su antigenicidad) y Ag L (son destruidos a 100 C). Sh. dysenteriae: No presenta flagelos, por lo tanto no tiene antgenos H, sin embargo sus antgenos somticos O tienen un alto poder antignico y en base a ellos se han descrito varios serotipos de los 4 grupos de Shigella. Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inicialmente el gnero Salmonella fue clasificado por Kauffman-White en 5 grupos en base a sus antgenos somticos O, que difieren qumicamente en cuanto a su composicin de azcares, presencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosdicos alfa y beta. Actualmente esta clasificacin se ha completado y se describen 9 grupos denominados A, B, C, D, E, F ,G, H e I en donde se encuentran incluidos ms de 1020 serotipos diferentes. Adems, algunas cepas de Salmonella son mviles y presentan flagelos y en base a sus antgenos flagelares o H se puede hacer una clasificacin ms precisa de estos microorganismos. B. abortus: Las seis especies del gnero Brucella son antignicamente similares, siendo su lipopolisacrido y sus protenas de membrana externa (PME) los antgenos ms importantes. Las PME estn clasificadas en tres grupos, considerndose a las del grupo II como porinas.

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IV.1 PROPAGACIN DE LAS CEPAS CEPAS: B. abortus E. coli Sh. dysenteriae Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) de gran movilidad para obtencin de Ag H MEDIOS DE CULTIVO: 1 Medio para el desarrollo de la cepa: Tubo de 16 x 150 mm con 7 mL de medio. 1 Medio de propagacin: matraz Erlenmeyer de 1000 mL conteniendo 350 mL de medio. CEPA B. abortus E. coli Sh. dysenteriae Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag O Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag H MEDIO PARA EL DESARROLLO DE LA CEPA Caldo triptosa Agar BHI inclinado Agar BHI inclinado Veal-infusion Veal-infusion MEDIO DE PROPAGACION Agar triptosa Agar BHI Agar BHI Agar Veal-infusion Veal-infusion

MATERIAL 1 Asa bacteriolgica 2 Mecheros 1 Juego de colorantes para Gram. 2 Portaobjetos. Microscopio. 15 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril (Exclusivo para E. coli y Sh. dysenteriae). 500 mL Solucin salina isotnica (SSI) formolada al 0.6% estril. (Exclusivo para Ag H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)). TCNICA IV.1.1 ANTIGENOS OK-L DE Escherichia coli. IV.1.2 ANTIGENOS DE Shigella dysenteriae. 1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un cultivo puro de E. coli o de Sh. dysenteriae e incubar 24-48 h a 37C.

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2. 3. 4. 5. 6. 7.

Con la pipeta adaptada con un bulbo de hule agregar 8 mL de SSI estril al cultivo anterior y levantar el desarrollo, expeliendo y absorbiendo varias veces. Verificar la pureza del cultivo mediante tincin de Gram. Debe observarse slo bacilos Gram negativos. Si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No.4, de lo contrario desechar el cultivo. Pasar la suspensin bacteriana al matraz que contiene el medio de propagacin, extender el inculo por toda la superficie e incubar el matraz 18-24 horas a 37C. Adicionar 15 mL de SSI estril y desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de rotacin suaves. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tincin de Gram. Si hay algn tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMN PARA LA PREPARACIN DE ANTGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag. 18).

IV.1.3 ANTGENOS TOTALES DE B. abortus. IV.1.4 ANTGENO SOMATICO (O) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). IV.1.5 ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). 1. 2. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un inculo abundante de la cepa de B. abortus o Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) e incubar 24-48 h 18-24 h, respectivamente a 37C. Verificar la pureza del cultivo mediante una tincin de Gram. Debern observarse nicamente cocos Gram negativos en el caso de Brucella y bacilos Gram negativos en el caso de Salmonella. Si hay algn tipo de contaminante desechar la cepa y si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No. 3. Pasar 8-10 mL del cultivo al matraz del medio de propagacin, extender el inculo en toda la superficie en el caso de tratarse de medio slido, o agitar el matraz para incorporar perfectamente si el medio es lquido. Incubar el matraz 18-24 h a 37C. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tincin de Gram. Para los cultivos en medio slido primero adicionar 15 mL de SSI estril y desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de rotacin suaves. Si hay algn tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es satisfactoria continuar en el caso de B. abortus y Ag O de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) desde el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMN PARA LA PREPARACIN DE ANTGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag. 18) y para el Ag H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) a partir del paso 1b.

3.

4.

5.

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IV.2 PROCEDIMIENTO BACTERIANOS.

COMUN

PARA

TODOS

LOS

ANTIGENOS

MEDIOS DE CULTIVO: 1 Medios para prueba de esterilidad bacteriana: Tubos de 16 x 150 mm con 12 mL de tioglicolato fluido. 1 Medios para prueba de esterilidad mictica: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de agar Sabouraud inclinados. 1 Medios para prueba de viabilidad: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de medio. ANTIGENO B. abortus E. coli Sh. dysenteriae Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag O Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag H MEDIO PARA PRUEBA DE VIABILIDAD Agar triptosa inclinado Agar BHI inclinado Agar BHI inclinado Agar Veal-infusion inclinado Agar Veal-infusion inclinado

MATERIAL 1 Equipo de succin estril. Constituido por: Frasco de centrfuga de 250 mL, tapn del No. 6 bihoradado, tubo de vidrio de 10 cm con filtro de gasa, tubo de vidrio de 12 cm en ngulo de 90 con trampa de aire, tubo de vidrio de 35 cm con un extremo angosto, tres perlas de vidrio y tramo de manguera para vaco de 50 cm. 2 Frascos tipo vial de 50 mL con tapn estriles. 2 Pipetas de 1 mL (1/10) estriles. 3 Pipetas de 10 mL (1/10) estriles. 1 Bulbo de hule para pipetas de 10 mL (propipeta). 1 Tapn de hule del No. 6 estril. 1 Asa bacteriolgica. 2 Mecheros. 1 Juego de colorantes para Gram. 1 Termmetro de 0 a 100C. 1 Charola de peltre para desechar material contaminado. 4 Portaobjetos. Microscopio. Centrfuga con cabezal para frascos de 250 mL. Nefelmetro Klett Summerson con filtro verde y celdas. Incubadora a 37 C. Bao de agua de temperatura controlada. 25 mL Solucin salina isotnica (SSI) estril.

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100 mL SSI fenolada o SSI formolada: Es SSI estril, adicionada de fenol al 0.5% de formol al 0.3%. TCNICA 1a. Antgenos de E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y Ag O de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Cosecha: Por medio del equipo de succin y empleando un vaco leve extraer la suspensin bacteriana. Sustituir el sistema de succin por un tapn de hule sin horadar y proceder a llevar a cabo la inactivacin. Inactivacin: Colocar el frasco de centrfuga en el bao de agua a: 5556C, 2 h para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae y bao de agua hirviente, 2.5 h para el antgeno O de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi); agitando de vez en cuando. Prueba de viabilidad: Sembrar 0.2 mL de la suspensin calentada en el medio de cultivo indicado para cada bacteria, extendiendo el inculo perfectamente en toda la superficie e incubar a 37C, 48-72 h. Al cabo de este tiempo no debe haber desarrollo de colonias, en caso contrario deber hacerse un tincin de Gram y observar si no se trata de contaminacin y si no es as , calentar por 1 hora ms ya que los microorganismos estn todava vivos. Despus del segundo calentamiento repetir la prueba de viabilidad. Continuar con el paso No. 2. 1b. Antgeno H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inactivacin: Adicionar un volumen igual al que ocupa el cultivo de SSI formolada al 0.6% y dejar a temperatura ambiente durante varios das. Prueba de viabilidad: Para el 4 5 da probar si ya se destruy la viabilidad de los microorganismos, sembrando 0.2 mL de la suspensin perfectamente agitada en un tubo con agar Veal-infusion inclinado, extendiendo el inculo perfectamente en toda la superficie del medio e incubar a 37C, 24-48 h. Si todava hay crecimiento deber hacerse un tincin de Gram y observar si no se trata de contaminacin, y si no es as, se dejar transcurrir 3 a 4 das ms y se repite la prueba de viabilidad. La prueba es satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo. Cosecha: dejar reposar la mezcla de un da para otro y evitando que se resuspenda, eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante utilizando un sifn estril y decantar el sedimento a 1 2 frascos de centrfuga de 250 mL, estriles. 2. Centrifugar la suspensin 30 min a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en aproximadamente. 20-25 mL de SSI fenolada al 0.5% estril (para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae) SSI

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3.

4.

formolada al 0.3% estril (para los antgenos O y H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)). Preparar una dilucin 1:10 de la suspensin directamente en la celda del nefelmetro y determinar las unidades Klett en el aparato, leyendo contra SSI fenolada o formolada como blanco. Tomando en cuenta el factor de dilucin e interpolando en la curva de Mc Farland (ver anexo I.C) determinar la concentracin de bacterias/mL. La lectura tambin se puede realizar en un colormetro, leyendo a 540 nm, en donde 0.3 unidades de absorbancia equivalen a 1 X 109 microorganismos/mL. Ajustar la concentracin de una alcuota de la suspensin a 109 microorganismos/mL adicionando la cantidad necesaria de SSI fenolada o formolada, para obtener el volumen suficiente para realizar el esquema de inmunizacin (15 mL aprox.). Aplicar la siguiente frmula: Concentracin que se tiene - 1 = Volumen de diluyente que se debe agregar Concentracin que se desea por cada mL de la suspensin concentrada

5. 6.

Envasar en frascos vial tanto la suspensin concentrada como la diluida y rotular adecuadamente. Realizar la prueba de esterilidad mictica y bacteriana a cada producto sembrando 0.1 mL de las suspensiones en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Si el resultado de la prueba es satisfactorio, las suspensiones se conservan en refrigeracin hasta su uso.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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PRCTICA No. 2

INMUNIZACIN DE ANIMALES DE LABORATORIO

GENERALIDADES Se entiende por inmunizacin al mecanismo por el cual se estimula a un individuo inmunocompetente para que genere la respuesta inmune, la cual se caracteriza por la formacin de anticuerpos (respuesta humoral) y linfocitos T sensibilizados (respuesta celular) especficos para el agente inductor. La respuesta inmune celular es mediada por la actividad de los linfocitos T sensibilizados, que mediante la produccin de muchos factores llamados citocinas concertan las actividades de otros tipos celulares como los macrfagos y los polimorfonucleares. La respuesta inmune humoral es mediada por los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Igs), los cuales son glucoprotenas presentes principalmente en el plasma y en menor cantidad en los dems lquidos corporales tales como saliva, lgrimas, sudor, lquido seminal, leche, lquido cefalorraqudeo, jugo intestinal, secreciones respiratorias y genitourinarias. Los anticuerpos son producidos y secretados por las clulas plasmticas, las cuales son el resultado de la maduracin y diferenciacin de los linfocitos B que han sido estimulados por el antgeno. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, las cuales tienen diferentes funciones efectoras durante la respuesta inmune. Su estructura bsica est constituida por cuatro cadenas polipeptdicas unidas por puentes disulfuro (Fig. 1). Dos de las cadenas se denominan ligeras o L y las otras dos pesadas o H. Las inmunoglobulinas se unen especficamente al Ag que estimul su formacin. Una unidad bsica de inmunoglobulina tiene 2 sitios de unin al Ag o paratopo, que son conformados por ambas cadenas (H y L).
L
S

Sitios de unin al Ag
(Paratopo)

H
S S S S

S S

Figura No. 1.1 Estructura de la Unidad Bsica de las Inmunoglobulinas Los inmunoglobulinas existen como monmeros (IgG, IgA, IgD e IgE) o como polmeros (IgA secretoria e IgM) de la unidad bsica.
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Como se mencion anteriormente, la respuesta inmune de un animal puede ser totalmente un fenmeno natural o puede ser inducida artificialmente mediante la inoculacin del inmungeno. Los factores que hay que tomar en cuenta para lograr con xito una inmunizacin son: Dosis Frecuencia de dosis Va de inoculacin Condiciones generales del animal inmunizado: edad, sexo, alimentacin, estado de salud, etc. Uso de adyuvantes Estos factores se conjugan e interrelacionan, y en conjunto determinan un esquema de inmunizacin. La dosis y la frecuencia de dosis son factores que hay que tomar en cuenta para evitar caer en el fenmeno de tolerancia inmunolgica. Este se refiere al hecho de que a dosis subptimas y supraptimas del inmungeno, el animal puede ya no responder a la estimulacin por el inmungeno aplicado. La va de inoculacin es determinante para el tipo de respuesta que se obtiene. Aunque la mayora de las veces ambos tipos de respuesta (humoral y celular) se presentan, nosotros podemos favorecer una u otra de las respuestas segn la va de administracin que utilicemos. As, la va endovenosa es excelente para obtener respuesta humoral y psima para obtener respuesta celular. Y por el contrario, la va intradrmica es excelente para obtener respuesta celular y mala para obtener respuesta de anticuerpos. Dentro de estos extremos, las otras vas pueden favorecer a una u otra de las respuestas en menor o mayor grado. Tambin la va de inmunizacin utilizada puede influir en la velocidad con la que se de la respuesta. Existen diferentes va de administracin de inmungenos, entre ellas se pueden mencionar: endovenosa o intravenosa, intradrmica, intramuscular, subcutnea, intraperitoneal, que son de las ms frecuentes en la inmunizacin de animales de laboratorio, aunque en estudios especiales tambin se han usado otras como la intranasal, intraganglionar, intracerebral, etc. En el caso de inmunizacin a humanos solo se utilizan las vas: intramuscular, intradrmica, subcutnea y oral. En cuanto a la especie que se inmuniza es importante debido a que un esquema de inmunizacin se disea para una especie dada, no existe un esquema universal para todas las especies, debido principalmente a que cada una responde de diferente forma e intensidad, por tanto los factores dosis, frecuencia de dosis, va de administracin y uso o no de adyuvantes dependern del animal que se inmuniza.
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La edad, sexo, alimentacin y estado de salud del animal inmunizado, tambin son factores determinantes para lograr la inmunizacin, debido a que estos influyen ya sea en la madurez, interrelaciones hormonales, capacidad y competencia del sistema inmune. Los adyuvantes se consideran potenciadores de la respuesta inmune, existen los de uso veterinario como el adyuvante completo e incompleto de Freund, los liposomas, los lipopolisacridos bacterianos (LPS), el alumbre, el alginato de calcio, la tapioca, entre otros. Tambin los hay que se utilizan en la inmunizacin de humanos (en las vacunas) como el AlPO4, Al(OH)3, Mg(OH)2. La induccin artificial de la respuesta inmune tiene muchas aplicaciones, entre ellas se pueden mencionar: Las vacunaciones, que se practican tanto en el ser humano como en animales. Preparacin de sueros hiperinmunes de uso teraputico. Preparacin de sueros inmunes utilizados como reactivos biolgicos para uso diagnstico. Preparacin de sueros inmunes utilizados como reactivos en Qumica Legal. Preparacin de sueros inmunes utilizados como reactivos en anlisis de alimentos. Preparacin de sueros inmunes utilizados en diferentes campos de la investigacin. En esta unidad se describen los esquemas de inmunizacin para obtener los sueros inmunes en conejos:

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ESQUEMAS DE INMUNIZACIN MATERIAL COMUN PARA TODOS LOS ESQUEMAS DE INMUNIZACIN 1 Jeringa hipodrmica de 3 mL con aguja No. 22 estril 1 Jeringa hipodrmica de 5 mL con aguja No. 20 estril 1 Jeringa hipodrmica de 20 mL con aguja No. 18 estril 1 Tubo de ensayo de 12 X 100 mm 2 Tubos de centrfuga de 50 mL de plstico 1 Pipeta de 1 mL (1/10) 1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Frasco tipo vial de 30 mL 1 Bulbo de hule 1 Aplicador de madera Centrfuga con cabezal para tubos de 50 mL Tabla para sujetar conejos 1 0.3 mL Conejo de por lo menos 2.5 Kg de peso Solucin al 10% de etilmercuritiosalicilato de sodio (timerosal) o azida al 10%.

2.1 SUEROS ANTIESPECIE Antihumano, anticaballo, antibovino, antiperro, antipollo, etc. MATERIAL ESPECFICO Extracto de tejido muscular o suero estril 2 mL Adyuvante completo de Freund DA 1 INCULO VA DE ADMINISTRACIN intramuscular intramuscular endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso

0.5 mL de suero o extracto 0.5 mL de adyuvante completo de Freund 8 1.0 mL de suero o extracto 1.0 mL de adyuvante completo de Freund 15 0.2 mL de suero o extracto diluido 1:10 16 0.5 mL de suero o extracto diluido 1:10 17 1.0 mL de suero o extracto diluido 1:10 18 0.2 mL de suero o extracto concentrado 19 0.5 mL de suero o extracto concentrado 20 1.0 mL de suero o extracto concentrado 25 a 27 SANGRIA DE PRUEBA

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2.2 SUEROS ANTI-PROTEINAS PURIFICADAS Anti-albmina srica humana y anti-! globulina humana. MATERIAL ESPECFICO Soluciones de protenas purificadas estriles 1 mL Adyuvante completo de Freund 1 mL Adyuvante incompleto de Freund DA 1 15 30 31 32 37 INCULO VA DE ADMINISTRACIN

Intradrmica o subcutnea 1.0 mL de protena de 5 mg/mL en sitios mltiples. 1.0 mL de adyuvante completo de Freund Intradrmica o subcutnea 1.0 mL de protena de 5 mg/mL en sitios mltiples. 1.0 mL de adyuvante incompleto de Freund 0.25 mL de protena (1 mg/mL) endovenoso 0.50 mL de protena (1 mg/mL) endovenoso 1.0 mL de protena (1 mg/mL) endovenoso SANGRIA DE PRUEBA

2.3 SUERO ANTI-ERITROCITOS DE CARNERO (Amboceptor hemoltico anti-carnero): MATERIAL ESPECFICO 10 mL Suspensiones de eritrocitos de carnero al 10%. DA 1 2 3 4 6 8 10 13 15 17 20 INCULO 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso SANGRIA DE PRUEBA VA DE ADMINISTRACIN endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso

2.4 SUEROS ANTIBACTERIANOS:

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Anti-B. abortus, anti-E. coli, anti-Sh. dysenteriae y anti-Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) (O y H). MATERIAL ESPECFICO 6.5 mL Antgenos bacterianos de concentracin 1 X 109 os/mL DA 1 5 9 14 20 INCULO 0.5 mL de suspensin bacteriana 1 X 109 os/mL 1.0 mL de suspensin bacteriana 1 X 109 os/mL 2.0 mL de suspensin bacteriana 1 X 109 os/mL 3.0 mL de suspensin bacteriana 1 X 109 os/mL SANGRIA DE PRUEBA VA DE ADMINISTRACIN endovenoso endovenoso endovenoso endovenoso

Las inyecciones intramusculares se hacen en el cojincillo plantar o en el msculo y las endovenosas en las venas marginales de las orejas, comenzando a inyectar por la punta de las orejas y avanzando hacia la base. SANGRA DE PRUEBA 1. Al trmino del esquema de inmunizacin, dejar descansar al animal durante 5 a 7 das y proceder a realizar la sangra de prueba. 2. Tomar unos 2 mL de sangre por puncin de una de las venas marginales de la oreja. 3. Colocar la sangre en un tubo de ensayo de 12 X 100 mm y dejar coagular. 4. Separar el suero y en l se investiga la presencia de anticuerpos. Sueros anti-especie y anti-protenas purificadas: Por el mtodo de la doble difusin de Ouchterlony. Ttulo deseado # 1:8. Sueros antibacterianos: Por el mtodo de aglutinacin en placa. Ttulo deseado: # 1:3200. Sueros anti-eritrocitos de carnero (hemolisina): Por el mtodo de citlisis. Ttulo deseado: # 5 000 Unidades hemolticas /mL. SANGRA DE COSECHA 1. Si el resultado de la prueba es satisfactorio, proceder a la sangra de cosecha, para ello se extraer de 50 a 60 mL de sangre por puncin cardiaca. 2. Colocar la sangre en tubos de centrfuga de 50 mL y dejar coagular. 3. Separar el coagulo de las paredes del tubo mediante un aplicador de madera y centrifugara 300 rpm durante 30 min. 4. Mediante una pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el suero y colocar en una probeta para determinar el volumen obtenido. NOTA: Si es necesario, volver a centrifugar para clarificar completamente el suero.
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5.

6.

Adicionar el conservador: Para sueros antiespecie, anti-protenas purificadas y antibacterianos: Solucin de timerosal al 10%, a tener una concentracin final de 1:10,000 (0.1 mL por cada 100 mL de suero) o azida de sodio al 10% (1.0 mL por cada 100 mL de suero). Para sueros anti-eritrocitos de carnero: Glicerina Q.P. vol/vol. (Considerar que el ttulo final queda diluido 1:2). Envasar en frasco tipo vial y rotular con: Nombre del producto Fecha de obtencin Ttulo de Ac obtenido Volumen Conservador utilizado

REFUERZOS 1. Si los resultados de la titulacin de Ac son negativos o no satisfactorios, es necesario aplicar refuerzos. Para sueros anti-especie: Administrar 2 dosis ms de suero o extracto concentrado, de 3 mL cada uno, por va intraperitoneal a intervalos de 1 semana entre la primera y la segunda. Para sueros anti-protenas purificadas: Inocular 2 dosis de 1.0 mL de la solucin de protena de 1 mg/mL va intraperitoneal a intervalos de 1 semana entre la primera y la segunda. Para sueros antibacterianos: Aplicar 1 dosis de 3.0 mL de antgeno por va endovenosa. Para sueros anti-eritrocitos de carnero: Aplicar 2 dosis ms de 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso con intervalo de 3 das, o bien dos dosis de 1.0 mL de una suspensin de Pasteurella cuniculicida de 1 X 109 microorganismos/mL inactivados por calentamiento a 56 C durante 60 min o mejor an en autoclave a vapor fluyente ya que se trata de una antgeno termoresistente. 2. Dejar transcurrir de 4 a 5 das y se repite la sangra de prueba. 3. Si el ttulo de anticuerpos ya es satisfactorio se procede a la sangra de cosecha, pero si no se observa ningn aumento en el ttulo el animal se desecha.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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UNIDAD 2 INTERACCIONES ANTGENO - ANTICUERPO (Ag-Ac). INMUNOPRECIPITACIN

GENERALIDADES Los antgenos (Ag) pueden reaccionar tanto in vivo como in vitro con los anticuerpos (Ac) especficos. No toda la molcula de antgeno reacciona con toda la molcula de anticuerpo, sino que estas interacciones se dan entre los sitios activos de ambas molculas. Para el antgeno, estos sitios activos se denominan determinantes antignicos o eptopos y para el anticuerpo se llaman sitios activos de anticuerpo o paratopos. Por tanto, una reaccin Ag-Ac implica la interaccin eptopos-paratopos. El nmero de eptopos presentes en los antgenos es variable, y ste determina la valencia del Ag. Generalmente una molcula de Ag tiene varios eptopos por lo que es multivalente. En el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tienen solo 2 paratopos (bivalentes) y la IgM e IgAs (IgA secretoria) tienen 10 y 4 paratopos respectivamente (deca y tetravalentes). Debido a la multivalencia del Ag y a la por lo menos bivalencia del Ac, cuando se da la reaccin Ag-Ac se forman agregados moleculares. El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unin de los eptopos y paratopos son dbiles no covalentes y entre ellas estn: Puentes de hidrgeno, electrostticas dbiles (no inicas), de van der Waals e hidrofbicas. Por tanto la reaccin es reversible y por tanto es fcil disociar un complejo ya formado. En la interaccin in vitro de un antgeno con un anticuerpo se distinguen dos etapas: la reaccin primaria, no observable, y la reaccin secundaria, caracterizada por la aparicin de un fenmeno visible. In vivo la reaccin Ag-Ac puede generar reacciones terciarias, como es el caso de la necrosis en la reaccin de Arthus, los fenmenos vasgenos de la anafilaxia por la liberacin de histamina, etc, los cuales son fenmenos biolgicos colaterales. En la reaccin primaria se unen el Ag y el Ac dando lugar a la formacin de complejos iniciales que posteriormente, en la reaccin secundaria, se agregan para dar lugar a fenmenos visibles cuyas caractersticas dependen en gran parte de las caractersticas fsicas del antgeno, pero tambin de la clase de inmunoglobulina que participa en la reaccin y de la concentracin de Ag y Ac. De acuerdo a la naturaleza de los diferentes fenmenos que se pueden presentar como consecuencia de la reaccin permite clasificar a las interacciones Ag-Ac en:
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Reacciones de precipitacin. Reacciones de aglutinacin. Reacciones de floculacin. Reacciones de neutralizacin. Reacciones de opsonizacin. Reacciones de citlisis. Reacciones de fijacin de complemento. Reacciones con reactivos marcados.

En este bloque de prcticas nos referiremos a las reacciones de precipitacin y a las metodologas que se han diseado para llevarlas a cabo. REACCIONES DE PRECIPITACIN Cuando se utiliza un antgeno en solucin, como lisados bacterianos, toxinas, extractos de tejidos heterlogos, extractos vegetales, etc, al estar en presencia de sus Ac especficos forman complejos Ag-Ac que posteriormente se insolubilizan, dando como resultado una reaccin de PRECIPITACIN. Esta propiedad tiene muchas aplicaciones para la investigacin y valoracin de Ag y Ac.

Ag

Ac

Ag - Ac (PRECIPITADO)

Figura 2.1

Formacin del inmunoprecipitado.

DEFINICIN: Cuando se mezclan en cantidades adecuadas un Ag soluble con su Ac correspondiente (principalmente de clase IgG) se forma un inmunoprecipitado. MECANISMO: La formacin del inmunoprecipitado se lleva a cabo en dos etapas: 1. ETAPA: Reconocimiento y recombinacin de Ag y Ac.- en ella los Ag y Ac se unen rpidamente (casi instantneamente) formando complejos primarios, que an siguen siendo solubles. Dentro de ciertos lmites, esta 1. etapa casi no se ve influenciada por factores tales como la temperatura, pH, fuerza inica y la concentracin de los reactantes.

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COMPLEJOS PRIMARIOS Figura 2.2 1. Etapa: Reconocimiento y recombinacin

2. Etapa: AGREGACIN: Los complejos primarios se van agregando, aumenta el peso molecular y entonces precipitan, formndose un enrejado tipo cristal en donde cada molcula de Ag y Ac ocupa un lugar determinado. Esta 2 etapa es mas tardada puede durar de minutos a horas y es muy dependiente de la temperatura, pH, fuerza inica y concentracin de Ag y Ac.

COMPLEJOS PRIMARIOS Figura 2.3

PRECIPITADO 2. Etapa: Agregacin

Puede ocurrir solo la fase 1 y no la 2, debido a variaciones cuantitativas. La fase 2 solo se presenta cuando la concentracin de Ag y Ac son equivalentes. FACTORES QUE AFECTAN LA REACCIN: TEMPERATURA: Acelera la reaccin debido a un incremento de la difusin y el movimiento de las molculas. Se considera que esto es vlido hasta los 56C, ya que a mayor temperatura comienza a haber desnaturalizacin. La mayora de las reacciones Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, pero tambin se tienen algunas tcnicas que usan 37C para igualar condiciones fisiolgicas y otras a 45C o 56C como es el caso de la titulacin de toxinas. Las temperaturas fras (4-6C) se han utilizado en investigacin en estudios inmunoqumicos, cuando se requiere minimizar lo ms posible la desnaturalizacin y que los resultados sean ms estequiomtricos y cuantitativos. pH: De este factor depende el estado inico de grupos importantes que participan en la interaccin, como son los radicales amino (-NH3) y carboxilo (-COO). Aunque la reaccin Ag-Ac la podemos observar en un intervalo amplio de pH, se considera que el ptimo est entre 6.8 a 8.6. Fuerza inica ( ): Corresponde a la concentracin de iones presentes en el medio de reaccin (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir las cargas de repulsin que impiden que se formen los agregados. Se requieren bajas (intervalo ptimo 0.01 0.1) para que el mximo nmero de grupos
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inicos se aprovechen para el enlace del Ag y el Ac, a altas los grupos inicos son neutralizados y por tanto se reduce la afinidad. Concentracin de Ag y Ac: La concentracin de Ag y Ac deben ser equivalentes para que la precipitacin pueda llevarse a cabo. Si hay exceso de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENMENO DE ZONA:

Exceso de Ac: En ambos casos solo se forman complejos primarios No hay precipitacin Exceso de Ag:

Concentracin equivalente de Ag y Ac

Formacin de precipitado

Figura 2.4

Fenmeno de Zona: Inhibicin de la formacin del precipitado por efecto de la concentracin de Ag y Ac.

El efecto de la concentracin puede ser observado si se hacen reaccionar cantidades variables del Ag con una concentracin constante de Ac y graficando: [Ac = cte]

pp

Exceso de Ac PREZONA

Zona de EQUIVALENCIA 31

Exceso de Ag POSTZONA

Figura 2.5

Curva de precipitacin cuantitativa

Debe considerarse que la formacin de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los Ac y de la multivalencia de los Ag, por lo tanto, los Ag o haptenos simples que slo tengan un determinante antignico NO dan reacciones de precipitacin; as mismo, el Ag y el Ac deben estar en proporciones adecuadas, ya que el exceso de cualquiera de ellos lleva a la solubilidad del agregado y la no formacin del precipitado. El efecto de no precipitacin producido por falta de concentraciones equivalentes de antgeno o anticuerpo (fenmeno de zona) puede ser disminuido o evitado haciendo diluciones seriadas del reactivo desconocido (generalmente el Ag), o realizando la reaccin en el seno de un gel de agar por difusin del Ag y/o el Ac. Las reacciones de precipitacin pueden ser cualitativas, semicuantitativas o cuantitativas y se pueden realizar en medio lquido y semislido. Hay varias tcnicas para realizar este tipo de reacciones: La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar La formacin de capas estratificadas (tcnica del anillo de interfase o Ascoli) La difusin simple unidimensional en gel de agar (tcnica de Oudin) La doble difusin unidimensional en agar (modificacin a la tcnica de Oudin) La difusin radial simple en agar (RID) (tcnica de Mancini, Carbonara y Hermans) La doble difusin radial en gel de agar (DDR) (tcnica de Ouchterlony) Y las tcnicas que combinan difusin en geles de agar con procedimientos electroforticos como: La inmunoelectroforesis (IEF) (tcnica de Grabar y Williams) La electroinmunodifusin (EID) (tcnica de Laurell). La electroforesis bidimensional

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PRCTICA No. 3

CURVA DE PRECIPITACIN CUANTITATIVA EN CAPILAR

MARCO TERICO La precipitacin en medio lquido se puede realizar en tubos de ensayo o capilares, mezclando el Ag soluble con su Ac especfico y la cantidad de precipitado formado vara segn la proporcin de los reactivos. Si se dispone una serie de tubos conteniendo una cantidad constante de anticuerpo y cantidades crecientes del Ag soluble, se puede observarse que al ir aumentando la cantidad de ste el precipitado formado alcanza un mximo y posteriormente comienza a disminuir aunque la cantidad de Ag aumente. De manera semicuantitativa se puede estimar la cantidad de precipitado formado expresndolo en milmetros lineales. Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de Ag agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado (en mm), se obtiene una curva, generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres zonas: A. B. C. Zona de exceso de anticuerpo: Las molculas de Ag estn saturadas y no hay agregacin, en esta zona el sobrenadante contiene Ac libre. Zona de equivalencia: el precipitado es mximo, el sobrenadante no contiene ni Ag ni Ac libres. Zona de exceso de antgeno: Solo hay formacin de complejos primarios pero no agregados por falta de Ac; el sobrenadante contiene Ag libre.
pp [Ac] = cte

A. PREZONA (Exceso de Ac) B. ZONA DE EQUIVALENCIA C. POSTZONA (Exceso de Ag) A B C

[Ag]

Un anlisis cuantitativo se puede realizar determinando el N proteico en el precipitado cuando el Ag es un polisacrido. Si el antgeno es proteico pero tiene un grupo qumico que sirve como marca, como el DNP-ASB (dinitrofenol-albmina srica bovina) se puede determinar la cantidad de Ac en el precipitado por lectura espectrofotomtrica a 360 nm para el Ag y a 280 nm para la cantidad total de protena. La cantidad de Ac se obtiene mediante la siguiente operacin: Cant. de protena Cant. de Ag = Cant. de Ac. S el Ag es proteico y no tiene alguna marca, por ejemplo ovoalbmina, la cantidad de Ac en el precipitado se puede determinar haciendo los clculos con valores obtenidos en la zona de equivalencia: Protena en pp Ag aadido = Ac en pp. MATERIAL 12 Tubos capilares de 100 x 1.6 mm
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10 2 3 1 1

Tubos de ensayo de 12 x 75 mm Tubos de ensayo de 13 x 100 mm Pipetas de 1 mL (1/10) Gradilla par tubos de ensaye Gradilla de plastilina para capilares Papel absorbente Lpiz graso o marcador indeleble Solucin de Ag de concentracin conocida: Albmina srica humana (ASH) 1 000 mg/dl Ac especfico: Suero anti-ASH Solucin salina isotnica (SSI)

1 mL 0.6 mL 5 mL

TCNICA 1. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador. 2. En los tubos de ensayo debidamente rotulados (2 a 10), realizar diluciones seriadas (2X) de la solucin de antgeno (ASH) con SSI: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 y 1:512. Para ello: Colocar 0.5 mL de SSI en cada uno de los tubos Al tubo 2 agregar 0.5 mL de la solucin de ASH, mezclar con la misma pipeta (dilucin 1:2). Pasar 0.5 mL del tubo al tubo 3. Mezclar. (dilucin 1:4). Repetir el procedimiento hasta el tubo 10 (diluciones 1:8 a 1:512) 3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de antisuero (anti-ASH) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y manteniendo el dedo ndice en el extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente. 4. Quitando el dedo ndice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad la solucin de antgeno sin diluir (1:1) de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente. 5. Tapando con el dedo ndice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las soluciones por inversiones repetidas o moviendo el lquido de un lado al otro y rotando el capilar simultneamente varias veces. 6. Con el dedo ndice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el lquido dentro del capilar, colocando el dedo ndice en un extremo. 7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalizacin de los reactivos por contacto con sta. 8. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para cada uno de los capilares correspondientes a las otras diluciones de Ag (de 1:2 a 1:512). 9. Incluir los siguientes testigos: a) Un capilar llenado hasta la segunda marca con solucin de Ag sin diluir. b) Un capilar llenado hasta la segunda marca con antisuero. 10. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente 48 h en refrigeracin. 11. Medir la cantidad de precipitado en milmetros en cada capilar. Si el precipitado es difuso o est fraccionado, centrifugar los capilares 1 min a
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1000 rpm colocndolos dentro de los tubos de ensayo de 13 X 100 mm o en una centrfuga para hematocrito. NOTA: Cuidar que al sacar cada uno de los capilares de la plastilina queden tapados con la misma en su parte inferior. RESULTADOS Con los datos obtenidos complementar la siguiente tabla y construir la curva de precipitacin, graficando concentracin de Ag (abscisas) contra la cantidad de precipitado formado, expresado en mm (ordenadas).
CAPILAR DILUCION DEL Ag [Ag] mg/dl PRECIPITACIN (mm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Control de Ag 12 Control de Ac [ASH] = 1000 mg/dl

1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1.1 0

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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PRCTICA No. 4

MEZCLA DE ANTGENO Y ANTICUERPO

Prueba de Identidad a Sueros de Uso Teraputico Determinacin del Origen de Manchas de Sangre MARCO TERICO La precipitacin por simple mezcla de Ag y Ac puede llevarse a cabo en capilar o en tubos de ensayo, cuando se utilizan estos ltimos suele acelerarse la reaccin con temperatura (50 55 C). Las ventajas que ofrece la metodologa es la economa, la facilidad de interpretacin y el poco equipo requerido, y la desventaja principal es el riesgo de caer fcilmente en fenmeno de zona cuando no se prueban diluciones. Entre las aplicaciones de esta tcnica se pueden mencionar las pruebas de peritaje para la identificacin de manchas de sangre y de semen, as como en alimentos en la determinacin de la especie de que proceden las carnes y derivados, as como en la investigacin del origen de sueros inmunes y para estudiar las relaciones filogenticas de las especies y la zoofilia y antropofilia de vectores. Esta tcnica ser ejemplificada con la investigacin del origen de muestras de antitoxinas, determinacin que se realiza como prueba de identidad a sueros inmunes, o con la identificacin del origen de manchas de sangre. MATERIAL: 24 Tubos capilares 1 x 9 mm 1 Gradilla de plastilina Papel absorbente 100 l 50 l Muestras de antitoxina tetnica o papel filtro con manchas de sangre. De cada suero antiespecie: anti-equino, anti-humano, anti-bovino, etc.

TCNICA: Para la prueba de identidad de sueros de uso teraputico llevar a cabo todos los pasos incluyendo los incisos (a) del paso 1 y 8. Para la identificacin de manchas de sangre tambin realizar todos los pasos pero ahora incluir los incisos (b) del paso 1 y 8. 1a. Si es necesario, eliminar partculas en suspensin de los sueros y las muestras por centrifugacin a 2000 rpm, 2 min. 1b. Colocar pequeos fragmentos de la mancha de sangre en un tubo de ensayo y extraer con 2 mL de solucin salina isotnica. 2. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador. 3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de suero (anti-humano) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y manteniendo el dedo ndice en el extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente para no contaminar la muestra problema.
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4.

5. 6. 7. 8a. 8b. 9.

Quitando el dedo ndice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad un volumen igual de la muestra de antitoxina problema o del extracto de la mancha de sangre, de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente. Tapando con el dedo ndice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las soluciones por inversiones repetidas o moviendo el lquido de un lado al otro y rotando el capilar simultneamente varias veces. Con el dedo ndice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el lquido dentro del capilar y, colocando el dedo ndice en un extremo. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalizacin de los reactivos por contacto con sta. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para el otro capilar pero ahora utilizar como Ac el suero anti-equino. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para los otros capilares pero ahora utilizando los otros sueros antiespecie. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente 48 h en refrigeracin.

RESULTADOS Leer los resultados observando en cual de los capilares se observa precipitacin. Determinar el origen de la muestra de antitoxina utilizada o la especie de donde procede la mancha de sangre.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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PRCTICA No. 5

DOBLE DIFUSIN EN PLACA (OUCHTERLONY)

Identificacin de fracciones antignicas presentes en suero humano MARCO TERICO Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles. Esta difusin est limitada por la concentracin del gel, as como por el peso molecular y tamao de las molculas de Ag y Ac. Empleando soportes que tienen como base agar disuelto en una solucin amortiguadora, los antgenos y/o anticuerpos pueden migrar y al encontrarse en concentraciones equivalentes, formar el inmunoprecipitado, evitando as el efecto indeseable del fenmeno de zona. La velocidad de la difusin de ambas molculas es directamente proporcional a la concentracin e inversamente proporcional al peso molecular (Ley de Fick). Otros soportes que pueden ser utilizados son: pectinas, alginatos, poliacrilamida y tiras de acetato de celulosa gelatinizado. En la tcnica de Ouchterlony, el Ag y el Ac se colocan en pozos hechos en una placa de gel de agar, a partir de ellos ambos reactivos difunden radialmente y al encontrase en concentraciones equivalentes forman una o varias bandas de precipitacin dependiendo del nmero de sistemas Ag-Ac presentes. Cuando se prueba un Ag constituido por una mezcla de fracciones antignicas frente a una mezcla de Ac, se forman varias bandas y cada una corresponde a una fraccin antignica diferente. Aumentando el nmero de perforaciones se pueden probar varios sistemas simultneamente y segn las formas de las bandas obtenidas se puede determinar si los antgenos analizados son idnticos (cuando las lneas de precipitacin confluyen), diferentes (cuando las lneas se cruzan) relacionados (cuando las lneas se unen parcialmente) (ver esquema).
Ag Ag Ag Ag Ag Ac Ag

Ac

Ac

IDENTIDAD Figura 2.6

IDENTIDAD PARCIAL

NO IDENTIDAD

Patrones de bandas obtenidos en el Ouchterlony

Esta tcnica es muy til para determinar la homogeneidad de antgenos y anticuerpos purificados, as como para buscar impurezas en un sistema. MATERIAL 1 Portaobjetos
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1 1 1 1 1 1 1 1 1 5

Hisopo Nivelador de gota Placa de vidrio Cmara hmeda (caja Petri con papel filtro hmedo) Vaso de precipitado de 250 mL Tripi con tela de alambre Mechero Horadador de 2 mm de dimetro Plantilla de una horadacin central y seis perifricas. Capilares Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vaco de 30 cm. Solucin de agar noble al 1.5% en PBS 0.075 M, pH 7.2 Solucin de agar noble al 0.3% en PBS 0.075 M, pH 7.2, para sellar Antgenos: Anticuerpo: Suero humano (SH), Albmina srica humana (ASH), IgG humana purificada, suero bovino (SB), suero murino. Suero antihumano,

3.5 mL 2 mL 5 L 5 L

TCNICA 1. Barnizar los portaobjetos lavados y desengrasados con agar al 0.3% fundido con ayuda del hisopo. 2. Colocar los portaobjetos barnizados sobre una superficie perfectamente nivelada y verter sobre cada uno el contenido del tubo con agar al 1.5% fundido (3 mL). 3. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente. 4. Con el horadador practicar 7 cortes en forma de roseta: uno central y 6 perifricos, usando la plantilla o un papel con el esquema de las perforaciones debajo del portaobjetos. (ver Fig. 2.7)
1 6 5 4 2 3

Figura 2.7 5. 6. 7.

Disposicin de pozos para el Ouchterlony

Extraer el gel de agar de los cortes mediante el equipo de succin haciendo un ligero vaco o con la aguja de una jeringa. Colocar con un capilar en la horadacin central suero antihumano hasta llenar el pocito, sin derramar su contenido. Con capilares individuales tomar cada reactivo biolgico, colocar en los pozos de la periferia ordenados en el sentido de las manecillas del reloj: en los pozos 1 y 6 suero humano; en el 2 ASH, en el 3 suero bovino, en el 4 suero murino, en el 5 IgG humana purificada.
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8.

Introducir el portaobjetos en la cmara hmeda, cerrarla e incubar de 18 a 24 h a temperatura ambiente 48 h a 4 C.

RESULTADOS Leer los resultados, identificando bandas de identidad, no identidad e identidad parcial.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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PRCTICA No. 6

INMUNODIFUSIN RADIAL SIMPLE (RID)

(Mancini, Carbonara y Hermans) Cuantificacin de Albmina Srica Humana MARCO TERICO Este mtodo se aplica rutinariamente en Inmunologa Clnica para la cuantificacin de antgenos, fundamentalmente de las fracciones plasmticas humanas, como son la albmina srica humana (ASH), las inmunoglobulinas G, A y M, los componentes C3 Y C4 del complemento, factores de coagulacin, etc. Para llevarlo a cabo se emplea una placa de gel de agar purificado al que se incorpora el suero especfico monovalente para la fraccin que se desea cuantificar. En esta placa se practican horadaciones y en ellas se coloca un volumen medido con exactitud tanto de un estndar en tres diluciones de concentracin conocida, como de los sueros problema. Al difundirse de manera radial el Ag en el seno del agar que contiene el anticuerpo se va formando un halo de precipitacin alrededor del pozo donde se coloc el Ag. El dimetro de la zona de precipitacin es directamente proporcional a la concentracin del Ag y por lo tanto los datos obtenidos en las reacciones de precipitacin de los estndares sirven para trazar la curva de calibracin de la placa de donde se obtiene la concentracin del Ag presente en los sueros problema. El anticuerpo incorporado determina la sensibilidad de la placa. Esta tcnica ofrece las ventajas de utilizar poca cantidad de reactivos, sencillez de manipulacin e interpretacin, alta sensibilidad y la opcin de usar placas disponibles comercialmente; aunque tiene como desventaja que el tiempo para dar por terminada la prueba es largo. MATERIAL 1 Gradilla 1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL 1 Tubo de 16 x 100 mm con tapn de hule 1 Pipeta graduada de 1 mL 1 Nivelador de gota 1 Placa de vidrio de 20 x 20 cm 1 Placa de plstico con tapa para RID 1 Horadador de 2 mm de dimetro 1 Micropipeta de 20 l o capilares calibrados de 5 l 1 Plantilla de 12 horadaciones para RID 1 Regleta para medicin de halos para RID Puntas para micropipeta Platina calentadora con agitacin Bao de agua a 56 C. Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vaco de 30 cm
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5.0 mL 1.0 mL 0.2 mL 10 l

Solucin de agar noble al 2.0 % en PBS 0.075 M, pH 7.2 Suero anti-ASH Suero problema diluido 1:10 Soluciones estndares de ASH

TCNICA 1. Preparar una solucin de agar noble al 2% en amortiguador PBS pH 7.2, fuerza inica 0.075. Fundir a ebullicin en la platina de calentamiento. 2. Pipetear 5 mL de la solucin anterior en un tubo de ensayo previamente calentado en bao de agua a 56 C y mantener el tubo con gel a esa temperatura un tiempo, hasta que se estabilice. 3. Manteniendo el tubo dentro del bao de agua a 56 C, incorporar al gel de agar 1.0 mL de suero anti-ASH. 4. Tapar el tubo, sacarlo del bao y mezclar por inversin rpida, pero suavemente para evitar que se forme espuma. 5. Secar el tubo y verter el agar sobre la placa de plstico para RID, la cual ha sido previamente calentada al vapor sobre la platina caliente cubierta con un trapo hmedo (para no daar la placa). 6. Homogeneizar con movimientos de rotacin suave y en seguida dejar solidificar sobre la placa de vidrio perfectamente nivelada. 7. Haciendo uso de una plantilla, practicar 12 horadaciones en el gel con un perforador de 2 mm de dimetro interno. 8. Depositar en cada pozo 5 l de las soluciones estndares y problemas. Es conveniente que los 3 primeros pozos se ocupen con estndares y los dems con problemas (ver fig. 2.8).

11 10 9 8 7

12

1 2 3 4

Figura 2.8 Disposicin de pozos en la placa de RID

9. 10.

Permitir que difunda el antgeno 48 h. Medir con la regleta para RID el dimetro del halo formado, esta regleta tiene marcadas lneas convergentes-divergentes, las cuales deben quedar dispuestas en forma tangente al halo y las marcas en lneas en cruz al centro. La lnea vertical del centro del pozo da la medida del dimetro elevado al cuadrado (ver figura 2.9). Lectura: 54.75 mm2

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42

64

Figura 2.9 Medicin de los dimetros de los halos de precipitacin. RESULTADOS Construir una curva de calibracin con los resultados de los estndares de concentracin conocida, graficando concentracin (abscisas) vs dimetro al cuadrado (ordenadas), e interpolar los valores de dimetro al cuadrado de las muestras problemas. La recta formada no tiene origen en cero. Y el punto en que corta al eje de las ordenadas es una constante para la placa y depende de tres factores: el dimetro del pozo en que se colocaron los reactivos, la concentracin del Ac incorporado y la altura del gel. Obtener la concentracin de albmina de las muestras problema. Es importante considerar el factor de dilucin de los sueros problema al momento de calcular la concentracin de stos. Comparar los cantidades obtenidos con los valores de referencia para albmina en suero y determinar si se encuentran alterados.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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Prctica No. 7

INMUNOELECTROFORESIS
Anlisis de Protenas en Suero Humano. MARCO TERICO Este mtodo combina la precipitacin antgeno-anticuerpo por difusin en gel con la electroforesis o separacin de los antgenos de acuerdo a su carga. En un primer paso se hace la electroforesis del antgeno en un gel de agarosa purificada sometindolo al paso de una corriente elctrica, en un pH en el que las protenas cargadas positivamente migran hacia el polo negativo y las negativas hacia el electrodo positivo. Una vez hecha la separacin, se corta un canal a lo largo del gel y se llena con el anticuerpo, dejndolo difundir. En la zona de equivalencia de cada antgeno se forman lneas de precipitacin que aparecen como un patrn de bandas que permiten analizar cualitativamente las protenas presentes. En la clnica, este procedimiento es de gran valor diagnstico en la identificacin de paraproteinemias, de inmunoglobulinas monoclonales que aparecen en el mieloma y algunos linfomas, de complejos Ag-Ac, etc. La IEF se usa bsicamente como un mtodo cualitativo, pero puede ser cuantitativo si se corre paralelamente un suero estndar, o cuantitativo si en estas mismas condiciones se lee en un integrador. Para tener un grado de resolucin mayor de las lneas de precipitacin es muy recomendable teirlas con cualquier colorante para protenas. Es trascendente conocer que el efecto electroendosmtico influye de manera importante en un corrimiento inmunoelectrofortico: como el agar no es una sustancia absolutamente neutra, el fenmeno secundario de electroendsmosis acompaa a la electroforesis, y consiste en un movimiento regular de cargas del lquido que embebe el gel en el sentido opuesto a la corriente elctrica. Si estas dos migraciones son iguales la impresin dada es que la sustancia no se ha movido, en cambio su movilidad ser en sentido de la corriente, aunque ms reducida, si sus molculas estn fuertemente cargadas. Las sustancias poco cargadas son desplazadas por electroendsmosis en sentido contrario al de sus migracin electrofortica real. Este efecto es minimizado en un corrimiento electrofortico si se iguala la fuerza inica del amortiguador del gel y de la cmara electrofortica. MATERIAL 4 Portaobjetos 2 Caja Petri 1 Hisopo 8 Tiras de papel filtro 1 Horadador de 3 mm 1 Bistur Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vaco de 30 cm Cmara de electroforesis Fuente de poder
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10 l 10 l 10 l 100 l 100 l 100 l 3.5 mL 2.0 mL

Suero humano ASH IgG purificada Suero anti-humano polivalente Suero anti-ASH Suero anti-IgG humana Solucin de agarosa al 1.5% en amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 Solucin de agar noble al 0.3% en amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 para sellar 500 mL Amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 2 l Solucin de azul de bromofenol TCNICA 1. Barnizar los portaobjetos limpios y libres de grasa con la solucin de agar al 0.3% caliente y dejar secar. 2. Colocar los portaobjetos en una superficie completamente horizontal y vaciar sobre ella con un movimiento rpido aproximadamente 3.5 mL de agar al 1.5% fundido y caliente, a quedar una capa de agar homognea de 3 mm de espesor. 3. Dejar solidificar perfectamente el gel de agar sobre la superficie nivelada. Colocar en el refrigerador 15 min para facilitar la ejecucin de los cortes. 4. Perforar el agar de las placas (cortes circulares y canales) utilizando las plantillas adecuadas al sistema que se va aprobar (ver esquema). 5. Extraer NICAMENTE el agar de las perforaciones circulares mediante un aplicador con punta rota o una aguja. NO RETIRAR EL AGAR DE LOS CANALES. 6. Llenar con una micropipeta los pozos circulares de los portaobjetos con 5 l de los reactivos biolgicos correspondientes, segn el sistema de estudio (ver fig. 2.10), evitando derramamientos. Colocar en los pozos en donde se coloco suero humano 1 a 2 l de solucin de azul de bromofenol para que sirva como indicador del desplazamiento. 7. Vaciar a los reservorios de la cmara de electroforesis una cantidad de amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 que no llegue a tocar el soporte en donde se colocarn los portaobjetos. 8. Colocar la placa en la cmara de electroforesis con los pozos hacia le polo negativo. El contacto con el amortiguador se establece mediante tiras de papel filtro colocadas de manera que quede aproximadamente 1 cm sobre el gel de agar y 1 cm dentro del amortiguador, evitando las burbujas entre el papel y el gel, ya que afectara al paso de la corriente. 9. Conectar la cmara de electroforesis a la fuente de poder y ajustar la corriente a 90 volts. Cuando la muestra teida haya avanzado 3 cm aproximadamente se desconecta la cmara. 10. Retirar los portaobjetos, remover cuidadosamente el agar de los canales y colocar ah 80 l del Ac correspondiente, segn el sistema trabajado (ver fig. 2.10).

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SISTEMA 1 Pozo 1: Suero humano Canal: Suero anti-humano polivalente Pozo 2: ASH SISTEMA 2 Pozo 1: Suero humano. Canal: Suero anti-humano polivalente Pozo 2: IgG purificada SISTEMA 3 Canal A: Suero anti-humano polivalente Pozo: Suero humano Canal B: Suero anti-ASH SISTEMA 4 Canal A: Suero anti-humano polivalente Pozo: Suero humano Canal B: Suero anti-IgG
A A 1 1

Figura 2.10 11.

Sistemas utilizados para la IEF

Colocar el portaobjetos dentro de una cmara hmeda (caja de Petri con algodn mojado), taparla e incubar a temperatura ambiente de 18 a 24 h para que se lleve a cabo la difusin e inmunoprecipitacin.

RESULTADOS Interpretar y reportar los resultados obtenidos, basndose en los patrones de precipitacin reportados en la literatura. NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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UNIDAD 3

REACCIONES DE AGLUTINACIN.
GENERALIDADES Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antgeno especifico y este se encuentra en estado particulado o forme (p.ej. bacterias, eritrocitos, levaduras, clulas) reaccionan formando grumos o aglutinados. Los principios que regulan esta reaccin son los mismos de la reaccin de precipitacin. Por lo tanto la aglutinacin ocurre en dos fases: La primera fase es conocida como sensibilizacin. Proceso mediante el cual el anticuerpo se une al antgeno de la superficie de la partcula. En esta fase puede haber activacin del complemento, donde se observa lisis. Esta unin del anticuerpo y el antgeno se logra por la formacin de mltiples uniones no covalentes, como puentes de hidrogeno, electrostticas, van der Waals e hidrofbicas. La segunda fase es el resultado de la unin de las partculas mediante puentes de anticuerpo, formando grumos o aglutinados que pueden ser visibles a simple vista o en microscopio. Para que tenga lugar este fenmeno visible, se deben vencer las fuerzas de repulsin que mantienen normalmente separadas a las partculas, lo que se denomina potencial zeta. Por lo tanto se requieren un numero razonable de enlaces con el anticuerpo entre las clulas antes de superar la repulsin mutua. La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente, superando la distancia entre partculas, en un medio salino. Mientras que la IgG requiere de medios proteicos como albmina, o la utilizacin de enzimas proteolticas como la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la segunda fase de la reaccin. Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilizacin de una antigammaglobulina humana denominada suero de Coombs, la cual se une a la IgG unida al Ag formando puentes para poder vencer la distancia entre dos partculas y aglutinarlas. Esta reaccin se ha utilizado ampliamente debido a la facilidad con que se lleva a cabo y su alta sensibilidad, comparada con las reacciones de precipitacin. Sin embargo no permite la cuantificacin exacta de anticuerpos y los resultados solo pueden expresarse en funcin de la dilucin mayor del suero donde se observa el aglutinado, que corresponde al ttulo de anticuerpos en el suero. Las reacciones de aglutinacin pueden ser: Aglutinacin directa o activa, donde los antgenos que intervienen son componentes naturales de la partcula.
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Y la aglutinacin indirecta o pasiva, en donde los antgenos solubles se adsorben en forma artificial a partculas que funcionan como soporte, por ejemplo eritrocitos de carnero, eritrocitos humanos tipo O, bacterias como M. tuberculosis, levaduras como S. cervicieae, S. marcenses o partculas inertes como ltex. , Esto les da la caracterstica de ser particulados y poder aglutinar. Las reacciones de aglutinacin en el laboratorio se pueden realizar de tres formas: en placa, tubo y en placa de microtitulacin. En la reaccin en placa se utiliza un portaobjetos o vidrio plano donde una gota del anticuerpo y otra del antgeno se mezclan y se observa aglutinacin en los 3 minutos siguientes. En la tcnica en tubo tambin se ponen una gota de anticuerpo y una de antgeno, se mezclan y centrifugan alrededor de 15-20 segundos y se lee aglutinacin. En la de placa de microtitulacin se utiliza una placa con pozas en las que se depositan de 25 a 50 l de Ag y Ac, se mezclan y se requiere hasta de dos horas para leer los resultados.

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PRCTICA No. 8

AGLUTINACIN EN PLACA
Titulacin de sueros anti-bacterianos MARCO TERICO La aglutinacin de una bacteria por un suero inmune especfico resulta de la presencia de anticuerpos dirigidos contra los antgenos de la superficie bacteriana, presentes en la cpsula, flagelos o pared . Estas reacciones son usadas para estudios de composicin de antgenos bacterianos, para diagnosticar enfermedades infecciosas buscando al agente causal, y para taxonoma en la clasificacin de microorganismos aislados de diversas fuentes, como exudados, heridas, alimentos, aguas negras, etc. Tambin el diagnstico de cuadros infecciosos se puede realizar mediante el hallazgo de anticuerpos especficos en el suero de los pacientes contra una determinada bacteria, as como seguir la evolucin del proceso en casos en que tenga correlacin el ttulo de anticuerpos con el cuadro clnico; las mejores aplicaciones de este caso son las reacciones febriles, utilizadas para el diagnstico y pronstico de enfermedades causadas por bacterias de diversas especies en donde el proceso infeccioso cursa con una elevacin marcada en la temperatura, entre otros sntomas inespecficos. Estos grmenes inducen una respuesta humoral con la produccin de anticuerpos que fcilmente se identifican en el laboratorio utilizando los antgenos especficos, como sucede en la fiebre tifoidea causada por Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) O y H (reaccin de Widal), la fiebre paratifoidea causada por S. paratyphi A y B, la fiebre de malta causada por B. melitensis (reaccin de Huddlesson) y la fiebre de tifo causada por Rickettsia prowaseki (reaccin de Weil-Flix), en esta ltima se utiliza como Ag a Proteus OX-19, OX-2 u OX-K ya que poseen determinantes antignicos glucolpidos comunes con Rickettsia. Otra aplicacin es la titulacin de anticuerpos en el suero de animales inmunizados con antgenos de bacterias (sueros antibacterianos). Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de titular sueros inmunes obtenidos de conejos inmunizados contra antgenos bacterianos como O y H de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi), antgenos totales de E. coli, B. abortus o Sh. dysenteriae. MATERIAL 4 Tubos de 12 por 100 mm 1 Pipeta de 0.2 mL 1 Pipeta de 1 mL 1 Placa de vidrio de 25 por 20 cm 1 Lmpara de iluminacin indirecta Aplicadores de madera o plstico Solucin salina isotnica
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1 mL 0.3 mL

Suero de conejos inmunizados Suspensiones bacterianas de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) O y H, E. coli, B. abortus o Sh. dysenteriae, ajustadas a 15 x 109 /mL

TCNICA 1. Dividir la placa de vidrio en cuadros de 4 columnas por 5 filas, con un lpiz de cera para evitar que las reacciones se mezclen (ver fig. 31). 2. Utilizando la pipeta de 0.2 mL en la primera columna de 5 cuadros adicionar 0.08 mL en el primer cuadro, en el segundo 0.04 mL, en el tercero 0.02 mL, en el cuarto 0.01 mL y en el quinto 0.005 mL del suero problema. 3. Agregar inmediatamente para evitar desecacin, una gota de la suspensin bacteriana previamente homogeneizada a cada cuadro donde se puso antisuero y mezclar utilizando un aplicador de madera o plstico perfectamente formando un crculo. 4. Dar a las reacciones movimientos de rotacin suave durante 2 minutos y leer el resultado con iluminacin indirecta y sobre fondo obscuro. Las reacciones positivas dan acmulos gruesos de bacterias sobre un fondo claro, mientras que las negativas quedan homogneas. Trabajando con los volmenes anteriores se tienen las siguientes ttulos: 0.08 mL de 1:20, 0.04 mL de 1:40, 0.02 mL de 1:80, 0.01 mL de 1:160 y de 0.005 mL de 1:320. 5. Si con las diluciones anteriores se obtuvieron reacciones positivas significa que el ttulo de anticuerpos es igual o mayor de 1:320, por lo que se procede a diluir el suero 1:10 con SSI (0.1 mL de antisuero y 0.9 de SSI) y en la segunda columna se agregan los volmenes 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 mL en los cuadros correspondientes, y se repiten los pasos 3 y 4. Los ttulos correspondientes seran: 0.04 de 1:400, 0.02 de 1:800, 0.01 de 1:1600 y 0.005 de 1:3200. Si todas las reacciones son positivas tendremos que el ttulo es igual o mayor a1:3200. 7. Se procede a realizar una dilucin 1:50 del suero (0.1 mL de antisuero diludo 1:10 y 0.4 mL de SSI) y se agregan a los cuadros de la tercera columna 0.02 mL, 0.01 mL y 0.005 mL; dando ttulos de 1:4000, 1:8000 y 1:16000 respectivamente, si dan reacciones positivas con la suspensin bacteriana repitiendo los pasos 3 y 4. 8. Si todas las reacciones anteriores fueron positivas significa que el ttulo de anticuerpos es igual o mayor de 1:16000 y por tanto procedemos a realizar la ltima dilucin del suero 1:100 (haciendo una dilucin 1:2 de la dilucin 1:50 o si se prefiere hacer una dilucin 1:10 de la de 1:10 para obtener en cualquier caso 1:100). Agregando de esta solamente en un cuadro de la cuarta columna la cantidad de 0.005 que corresponde a un ttulo # 1:32,0000, si despus de repetir los pasas 3 y 4 da positiva. 9. El ttulo del antisuero ser la mxima dilucin del suero en donde se observe aglutinacin franca (ver fig. 3.1)
SUERO CONC. SUERO 1:10 50 SUERO 1:50 SUERO 1:100

0.08

1:20

0.04

1:40 0.04

1:400

0.02

1:80 0.02

1:800 0.02

1:4000

0.01

1:160 0.01

1:1600 0.01

1:8000

0.005

1:320 0.005

1:3200 0.005

1:16000 0.005

1:32000

Figura 3.1 Interpretacin de la reaccin de aglutinacin en placa. Ttulo: Mxima dilucin del suero que presenta reaccin de aglutinacin visible.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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Prctica No. 9

AGLUTINACIN EN TUBO
Tipificacin de Grupo Sanguneo ABO Y Rh. MARCO TERICO Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antignicas determinadas genticamente las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos especficos. SISTEMA ABO: El primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, que se conoce como sistema ABO, el cual consta de tres antgenos denominados A, B y H que dan los cuatro diferentes grupos de este sistema : A , B, AB y O. Estos antgenos son glucoprotenas que se forman por accin de diferentes enzimas codificadas por los genes A, B y H y modifican una sustancia precursora. La sustancia precursora es una cadena de N-acetilglucosamina, D-galactosa, Nacetilglucosamina y D-galactosa, que es modificada por la enzima 1,2 fucosiltransferasa codificada por el gen H y que adiciona una fucosa en la parte terminal de la sustancia precursora que es la D-galactosa terminal con lo que se convierte en la sustancia H. La sustancia H es modificada por las enzimas codificadas por el gen A y/o el gen B que son una 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa y 1-3 galactosidil-transferasa respectivamente. Si la sustancia H es modificada por 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa esta le adiciona una N-acetilgalatosamina en su parte terminal donde esta la D-galactosa dando lugar a la sustancia A. Si lo que modifica la sustancia H es la 1-3 galacosidiltransferasa esta le adiciona una galactosa en la parte terminal donde esta la D-galactosa dando lugar a la sustancia B. El denominado grupo O, no es otra cosa que la sustancia H, por lo tanto no heredo los genes A y B , y su sustancia H no es modificada. Si se heredan los dos genes A y B estos son codominantes por lo tanto tendrn sustancia A y sustancia B en sus eritrocitos y se les denomina grupos AB. Como las sustancias del sistema ABO son qumicamente similares a antgenos bacterianos y de alimentos, los que estimulan al sistema inmune a producir anticuerpos a partir del nacimiento y siendo detectables a los 6 meses de vida, a estos anticuerpos as formados se les denomina naturales. Por tanto, la tipificacin del sistema ABO se realiza de dos maneras:

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Tipificacin directa: Se pone de manifiesto los antgenos presentes en la membrana del eritrocito, cuando se les hace reaccionar con anticuerpos especficos. Tipificacin inversa: Se ponen de manifiesto los anticuerpos presentes en el suero del individuo cuando se les hace reaccionar con eritrocitos tipificados para el sistema ABO. SISTEMA Rh: Por otro lado el sistema Rh esta constituido por mas de 40 antgenos proteicos distintos, cinco de los cuales son importantes por su inmunogenicidad y frecuencia. Los genes que codifican a este sistema se designan con smbolos: D y d, C y c , E y e, cada gen (con excepcin de d) codifica para un antgeno especfico, que puede ser detectado en la membrana del hematie. La presencia o ausencia del antgeno D es lo que determina que un individuo sea Rh positivo o negativo. Los anticuerpos del sistema Rh son de clase IgG, siendo estimulados por transfusin o por embarazo, ya que el individuo Rh negativo esta recibiendo hemates Rh positivos, no son naturales. Los anticuerpos que se forman despus de recibir sangre o sus derivados se denominas aloanticuerpos inmunes o adquiridos. En esta prctica se llevar a cabo la tipificacin directa e inversa del sistema ABO, as como la determinacin del Rh, logrando la identificacin de estos grupos sanguneos y se analizar la importancia de esta tcnica en la prctica transfusional y mdico-legal. MATERIAL 2 Pipetas Pasteur con bulbo 1 Gradilla 8 Tubos de 12 x 75 mm 3 mL 3 mL 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 1 gota 1 gota Sangre total Solucin salina isotnica (SSI) Suero anti-A Suero anti-B Suero anti-AB Suero anti-D Suspensin de GR A al 5% Suspensin de GR B al 5%

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TCNICA 1. Centrifugar la muestra sangunea 5 min a 2000 rpm y separar el plasma (para la prueba inversa) y el paquete celular (para la prueba directa) en diferentes tubos, previamente marcados. 2. Preparar una suspensin al 5% del paquete celular de la muestra, adicionando a un tubo una gota de pipeta Pasteur del paquete celular y adicionando 19 gotas de SSI. 3. Rotular cuatro tubos con A, B, AB y D respectivamente, a los cuales se les agrega una gota de suspensin al 5% del paquete celular a cada tubo. 4. Adicionar al tubo A dos gotas de suero anti-A, al tubo B dos gotas de suero anti-B, al tubo AB dos gotas de suero anti-AB y por ltimo al tubo rotulado D agregar dos gotas de suero anti-D. 5. Mezclar el contenido de los tubos y centrifugar 30 seg a 2000 rpm. 6. Realizar la lectura agitando suavemente el tubo para resuspender el botn formado. La presencia de cmulos celulares indica la presencia del antgeno en la superficie del eritrocito. 7. Para la prueba inversa se toma el plasma de la muestra y se agregan dos gotas a cada tubo rotulado previamente con anti-A y anti-B, mas una gota de suspensin de G.R. A al 5% al tubo rotulado anti-A y una gota de suspensin de G.R. B al 5% al tubo marcado anti-B. 8. Centrifugar 30 seg a 2000 rpm. 9. Resuspender el botn agitando suavemente, la reaccin de aglutinacin positiva indicara la presencia de los anticuerpos contra los antgenos de los G.R. utilizados como reactivo. RESULTADOS Con las observaciones realizadas complete el siguiente cuadro y determine el grupo sanguneo de la muestra problema TIPIFICACION DIRECTA A B AB D TIPIFICACION INVERSA ANTI-A ANTI-B GRUPO SANGUINEO ABO D

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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PRCTICA No. 10

HEMAGLUTINACIN INDIRECTA
Titulacin de Anticuerpos frente a Tiroglobulina MARCO TERICO En la hemaglutinacin indirecta o pasiva, los eritrocitos de carnero o humano tipo O, se utilizan como soporte de antgenos debido a que son fciles de obtener y de conservar en el laboratorio bajo ciertas condiciones durante 15 a 30 das. Fijan espontneamente a su superficie casi todos los polisacridos y ciertas protenas, cualidad que se incrementa cuando los eritrocitos son tratados con sustancias tales como el cido tnico que favorece la unin por atraccin electrosttica. Tambin se les puede unir covalentemente el antgeno proteico, usando reactivos como el glutaraldehdo. Una vez que los eritrocitos han sido sensibilizados (recubiertos) con el antgeno producen aglutinacin cuando se ponen en contacto con anticuerpos especficos. La tcnica de Boyden es altamente sensible y fcil de realizar, por lo que se emplea para la cuantificacin de anticuerpos presentes an en cantidades pequeas en el diagnstico de un gran nmero de enfermedades. Para conocer la cantidad de Ac presentes, se hacen reaccionar dilaciones seriadas del suero, con cantidades constantes de una suspensin de eritrocitos sensibilizados con un Ag especfico, la dilucin ms alta del suero que determina una clara hemaglutinacin, se considera como punto final de la reaccin y representa el ttulo de anticuerpos. La prueba puede realizarse mediante una macrotcnica (en tubo) o una microtcnica (placa). As, por ejemplo protenas tales como la tiroglobulina son adsorbidas rpidamente a la superficie de glbulos rojos tratados previamente con cido tnico. La tiroglobulina, extrada de glndula tiroides humana por las tcnicas de precipitacin con sales neutras y adsorbida a eritrocitos de carnero tanados, proveen una prueba de hemaglutinacin indirecta para la deteccin de anticuerpos frente a tiroglobulina. La estabilidad durante el almacenamiento de las clulas tanadas y recubiertas con el antgeno (sensibilizadas), se logra por tratamiento de la suspensin final con formalina. Como algunos sueros humanos contienen anticuerpos heterfilos capaces de aglutinar eritrocitos de carnero, se debe incluir un control de eritrocitos tanados sin sensibilizar (testigo negativo). Si en ste existe aglutinacin, la prueba se repite con el suero previamente adsorbido con eritrocitos de carnero tanados. La prueba de hemaglutinacin fue inicialmente usada por Witebsky y Rose para la cuantificacin de autoanticuerpos frente a tiroglobulina.

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La glndula tiroides tiene ciertas propiedades funcionales y estructurales exclusivas que la predisponen para el desarrollo de respuestas autoinmunes. El constituyente principal de los folculos tiroideos es la tiroglobulina (glucoprotena de PM 660 Kd), que representa la forma de almacenamiento de las hormonas tiroideas, tiroxina y triyodotironina, que afectan la velocidad del metabolismo en todas las clulas del cuerpo. El diagnstico de patologa autoinmune de la glndula tiroides, consiste principalmente en la demostracin de autoanticuerpos contra la tiroglobulina, y en menor grado frente al antgeno microsomal. Se pueden encontrar autoanticuerpos frente a estos constituyentes en: tiroiditis aguda, subaguda, fibrtica, crnica (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo primario (mixedema en el adulto), hipertiroidismo (tirotoxicosis o enfermedad de Graves), y en carcinoma de tiroides; la diferencia de estos padecimientos se hace de acuerdo a su manifestacin clnica, el estudio histolgico y algunas otras pruebas de laboratorio. Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina tambin pueden presentarse en otros padecimientos como: anemia perniciosa, gastroenteritis atrfica, insuficiencia suprarrenal idioptica, insuficiencia paratiroidea y en el sndrome de Sjogren. Adems de la hemaglutinacin pasiva, se han utilizado otras pruebas para la deteccin de estos autoanticuerpos como la fijacin de complemento, la inmunofluorescencia y el radioinmunoensayo. PRIMERA PARTE TANADO Y SENSIBILIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS MATERIAL 2 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 3 Pipetas de 5 mL (1/10) 2 Pipetas de 1 mL (1/100) 1 Gradilla 2 Pipetas capilares con bulbo Bao de agua a 370c Bao de agua a 560c Centrifuga clnica Papel Parafilm 4 mL 6 mL 15 mL 4 mL 0.4 mL 2 mL 4 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, = 0.15 Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH= 6.4 = 0.15 Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, = 0.15, adicionado de suero normal de conejo al 1%. Acido tnico diluido 1:20 000 Formaldehdo al 40% Antgeno: Solucin de tiroglobulina humana purificada (HTG) (dil. ptima) Suspensin de G.R. de carnero al 2.5% en PBS 7.2 0.15 M, pH 7.2.

TCNICA TANADO DE LOS GLBULOS ROJOS:

56

1. 2. 3. 4. 5.

6.

Rotular 2 tubos de ensayo, uno S (sensibilizados) y otro NS (no sensibilizados). En cada tubo, pipetear 2 mL de la suspensin de eritrocitos de carnero al 2.5% (procurando que la suspensin este perfectamente homogeneizada). Agregar un volumen igual de cido tnico 1:20 000 a cada tubo. Inmediatamente tapar con papel parafilm y mezclar por inversin. Incubar ambos tubos en bao Mara a 37 C durante 15 min. Agitar eventualmente. Centrifugar los dos tubos a 2 000 rpm durante 5 min, retirarles el sobrenadante con pipeta Pasteur o por decantacin cuidadosa y resuspender los paquetes de G.R. en 2 mL de PBS pH = 7.2 y volver a centrifugar 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el paquete de G.R. de cada tubo en 2 mL de PBS pH= 6.4 para tener nuevamente la suspensin al 2.5%.

SENSIBILIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS CON ANTGENO: 1. Los G.R. tanados se sensibilizan agregando un volumen igual de la dilucin ptima de antgeno en PBS pH= 6.4. Para ello al tubo rotulado S agregarle 2 mL de la dilucin ptima de antgeno (tiroglobulina humana). 2. Tapar con papel parafilm e incubar la mezcla en bao de agua a 37 C durante 15 min. Agitar eventualmente. 4. Retirar las clulas del bao de agua y centrifugar 5 min a 2000 rpm. 5. Decantar el sobrenadante y lavar las clulas dos veces por centrifugacin a 2000 rpm por 5 min con PBS pH = 7.2, adicionado de suero normal de conejo al 1%. 6. Ajustar el paquete de clulas al 1.5% resuspendiendo en 3.3 mL de PBS pH= 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%. 7. Al tubo rotulado NS que contiene los 2 mL de eritrocitos tanados sin sensibilizar, ajustarlos al 1.5% en el mismo amortiguador. Para ello centrifugar, retirar el sobrenadante y agregar 3.3 mL de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%. FORMALINIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS: Este procedimiento se realiza para preservar los GR cuando se preparan grandes cantidades, para utilizarse durante mucho tiempo (duran hasta 6 meses sin disminuir su actividad antignica). 1. A los G.R. sensibilizados y sin sensibilizar se les adiciona lentamente 1 mL gota a gota de formaldehdo al 40% por cada 10 mL de suspensin (a cada tubo agregar 0.2 mL de formaldehdo al 40%). 2. Dejar reposar 18 h a 4 C. 3. Agregar otros 0.2 mL de formaldehdo al 40% a cada uno de los tubos. 4. Cuando las clulas han sedimentado (despus de 2 3 das) se retira el sobrenadante y se resuspenden las clulas en su volumen original de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%. 5. Se agitan nuevamente las clulas y se aade 1 gota (0.05 mL) de formaldehdo al 4%. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN PTIMA DE ANTGENO:
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1. 2. 3.

Preparar 4 diluciones del antgeno HTG en PBS pH= 6.4: por ejemplo 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160. Sensibilizar los G.R. con cada dilucin de antgeno como se indic anteriormente. Probar con un suero positivo y otro negativo, cada una de las diluciones. La mas baja dilucin de antgeno, que de el ttulo ms elevado con el suero inmune y no reaccione con el suero negativo se considerar el ptimo. SEGUNDA PARTE: DESARROLLO DE LA PRUEBA

MATERIAL 1 Micropipeta de 25 l 1 Placa de microtitulacin fondo en U 1 Microdilutor Bao de agua a 56oc. Rotor 3.3 mL 3.3 mL 25 L 25 L 50 L 3 mL Suspensin de G.R. al 1.5% sensibilizados con el Ag Suspensin de G.R. al 1.5% no sensibilizados Suero control positivo Suero control negativo Suero problema diludo 1:8 Amortiguador de fosfatos PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.

TCNICA 1. Inactivar los sueros problema a 56 C durante 30 min o a 63 C por 3 min. 2. A todas los pozos de las filas A, B, C, D y E de la placa de microtitulacin agregar con una micropipeta 25 l de suero normal de conejo al 1% diluido en PBS pH= 7.2. 3. Cargar el microdilutor con 25 l de suero problema y colocarlos en la primera poza de la fila A; mezclar completamente y transferir 25 l a la poza siguiente, repitiendo este proceso hasta la ultima poza de la hilera de donde se descartan 25 l. 4. A cada dilacin del suero, agregar con una micropipeta 25 l de la suspensin de glbulos rojos al 1.5% sensibilizados. 5. Colocar la placa en el rotor y agitar de 1 min. 6. Dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas cubrindola; hacer la lectura. Al mismo tiempo se corren los siguientes controles: Control para Ac heterfilos: Probar las mismas diluciones del suero problema con eritrocitos sin sensibilizar (fila B).

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Control positivo: Hacer las mismas diluciones del suero control positivo y agregar 25 l de eritrocitos sensibilizados a cada una de las pozas (fila C). Control negativo: Realizar la misma operacin con un suero negativo conocido (fila D). Control del diluyente: Depositar 25 l de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1% en una hilera de pozas (fila E) y agregar 25 l de la suspensin de clulas sensibilizadas al 1.5%. Esta reaccin deber ser negativa.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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UNIDAD 4

REACCIONES DE CITLISIS
GENERALIDADES Una de las funciones efectoras de los anticuerpos producidos en la respuesta inmune humoral, es la activacin del sistema complemento. El complemento es un complejo multienzimtico presente en el suero de todos los vertebrados, cuyos componentes que en su mayora son glucoprotenas se encuentran como precursores inactivos (zimgenos), y por tanto requieren de ser activados. Tambin participan de forma importante ines Ca++ y Mg++ durante la activacin. La activacin del sistema complemento se lleva a cabo en forma de cascada, es decir, los componentes se van activando secuencialmente uno a uno y derivado de su activacin se generan varas actividades, entre ellas: quimiotaxis, opsonizacin, degranulacin de basfilos y clulas cebadas (con la consecuente vasodilatacin y contraccin de msculo liso) y la lsis celular. La activacin del complemento se puede llevar a cabo por dos vas principales, la clsica y la alterna. La va clsica es activada por una reaccin Ag-Ac, en la cual el Ac participante es de clase IgG o IgM, mientras que la va alterna se activa por factores no inmunolgicos como son los lipopolisacridos bacterianos (LPS), el zimosan, la inulina y algunos policationes y polianiones. Recientemente se ha descrito una tercera va de activacin denominada va de la lectina que involucra a la protena que une manosa (MBL) que se une a residuos de manosa, y otros azcares (N-acetilgalactosamina, manosamina, fucosa, galactosa y galactosamina), presentes en protenas y polisacridos microbianos. Cuando la activacin del complemento se lleva a cabo sobre una superficie celular por cualquiera de estas vas, en las ltimas etapas se forma el complejo de ataque a la membrana (MAC), que causa la lisis de dicha clula. En la figura 4.1 se describe la va clsica de activacin del complemento. Debido a que las actividades que se generan durante la activacin del complemento pueden causar dao a los propias clulas y tejidos del husped, existen factores que acta en la regulacin del sistema. En las reacciones de citlisis, en donde se utiliza el Complemento como reactivo (titulacin de hemolisinas, y reaccin de fijacin de complemento) en donde se utiliza el suero de algn animal como fuente de complemento (cobayo), o cuando se cuantifica el complemento en el suero de un paciente, debe tomarse en cuenta que algunos de los componentes son termolbiles, y pierden rpidamente su actividad, por lo que se debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado en refrigeracin o en su caso usar productos comerciales liofilizados.

C1q,r,s Ag - Ac

VIA CLASICA
C4 Ag-Ac-C1 60 Ag-Ac-C1; C4b C2
Mg
2+

Ca

2+

Ag-Ac-C1; C4b2b C3

C3 CONVERTASA

Fig. 41 Activacin del Complemento por la Va Clsica.

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PRCTICA No. 11

TITULACIN DE AMBOCEPTOR HEMOLTICO ANTICARNERO

MARCO TERICO Las hemolisinas son anticuerpos producidos frente a los antgenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos. Estos anticuerpos, tambin llamados amboceptores hemolticos, al estar en presencia del antgeno que estimul su formacin y del complemento desencadenan una reaccin que causa la lisis de los eritrocitos. Este fenmeno es el resultado de la accin enzimtica del complemento, el cual es activado por la va clsica, formndose el complejo de ataque a la membrana (MAC) el cual causa dao a la membrana del eritrocito que a su vez va a producir cambios en su permeabilidad y al cambiar las propiedades osmticas de sta, penetran lquidos y se produce el estallamiento de los eritrocitos. Para medir la actividad del amboceptor hemoltico se prueban diferentes diluciones del suero de conejo inmunizado con G.R. de carnero, frente a una cantidad constante de complemento (suero de cobayo) y de G.R. de carnero lavados y ajustados a una suspensin del 2%. La mxima dilucin del suero de conejo que produce hemlisis total indica el ttulo del amboceptor hemoltico anticarnero. Para algunas tcnicas no se toma como punto final la hemlisis total, sino el 50% de hemlisis y para esto se hace la medicin colorimtrica de la hemoglobina liberada. MATERIAL 21 Tubos de ensayo de 12 x 75 mm 3 Pipeta de 1 mL (1/10) 1 Pipetas de 2 mL (1/10) 1 Pipeta de 10 mL (1/100) 1 Gradilla Bao de agua a 370c Centrifuga clnica Papel Parafilm 0.2 mL 2.0 mL 4.0 mL Amboceptor hemoltico anticarnero obtenido en la prctica No. 1.V Suspensin de G.R. de carnero lavados y ajustados al 2%. Suero de cobayo diludo 1:30 (fuente de complemento). Nota: El suero debe ser de cobayo macho, de ms de 500 g de peso, recientemente obtenido o liofilizado

TCNICA 1. Preparar en 10 tubos de 12 X 75 mm las diluciones del amboceptor hemoltico anticarnero en amortiguador de de acuerdo al siguiente esquema: Tubo Amortiguador Amboceptor Hemoltico anticarnero
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Dilucin

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2. 3. 4. 5.

Veronal (mL) 0.9 0.9 2.7 0.5 1.0 1.5 2.0 0.5 0.5 0.5

(o sus diluciones) (mL) 0.1 Mezclar 0.1 (del tubo 1) Mezclar 0.3 (del tubo 2) Mezclar 0.5 (del tubo 3) Mezclar 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 8 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 9 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 10 Mezclar Mezclar Mezclar

Final 1:10 1:100 1:1 000 1:2 000 1:3 000 1:4 000 1:5 000 1:6 000 1:8 000 1:10 000

En otros 9 tubos de ensayo transferir 0.2 mL de cada una de las diluciones a partir de la de 1:1 000, en el ltimo tubo no se coloca hemolisina. Adicionar a los tubos del 1 al 8 un volumen de 0.4 mL de complemento diludo 1:30 y mezclar perfectamente. Agregar a todos los tubos, incluyendo el No. 9, 0.2 mL de la suspensin de glbulos rojos al 2% y mezclar perfectamente. Agregar a los tubos del 1 al 8 un volumen de 0.4 mL de amortiguador de veronal y al No. 9 un volumen de 1.0 mL. Mezclar perfectamente. (Ver esquema de la reaccin) Complemento diludo 1:30 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 ------Suspensin de G.R. carnero 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Amortiguador Veronal 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 1.0

ESQUEMA DE LA REACCIN: Tubo mL de dilucin de No. amboceptor 1 0.2 (1:1 000) 2 0.2 (1:2 000) 3 0.2 (1:3 000) 4 0.2 (1:4 000) 5 0.2 (1:5 000) 6 0.2 (1:6 000) 7 0.2 (1:8 000) 8 0.2 (1:10 000) 9 ------(Control)

6. 7.

Colocar la gradilla con los tubos en un bao de agua a 37C y observar despus de transcurrida una hora. Al trmino del periodo de incubacin, centrifugar los tubos a 3 000 rpm durante 5 minutos para facilitar la lectura, ya que los eritrocitos que no fuero lisados se acumulan en el fondo y se puede apreciar perfectamente en que tubos no hay hemlisis o en su caso hemlisis parcial o total.

RESULTADOS La unidad de amboceptor hemoltico est dada por la mxima dilucin del suero que es capaz de causar hemlisis total.

63

Ttulo obtenido: _____________________

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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Unidad 5 TCNICAS CON ANTICUERPOS O ANTGENOS MARCADOS

GENERALIDADES Las reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u otro de estos reactantes. Es decir, se pueden utilizar Ac para demostrar la presencia de Ag en una muestra problema y, viceversa, se pueden utilizar Ag para revelar la presencia de Ac. La especificidad de la reaccin Ag-Ac le da a estas reacciones in vitro una elevada confiabilidad. La sensibilidad de estas pruebas ha sido aumentada significativamente al utilizar marcas que al estar unidas a los Ag o a los Ac, segn sea el caso, permiten demostrar la presencia de cantidades sumamente pequeas de los reactantes. Las principales sustancias utilizadas como marcas son: istopos, enzimas y fluorocromos. Los istopos se comenzaron a usar en 1966 por la Dra. Yallow , cuando realiz el primer Radioinmunoanlisis (RIA), que se trataba de un ensayo competitivo en donde se permita la competencia entre molculas de Ag no-marcadas y marcadas con radiostopo por los sitios de unin con anticuerpos especficos. La marca en este caso se denomina trazador y tiene el objeto de permitir la identificacin y la cuantificacin del analito en la fraccin libre y unida de la reaccin. Al trmino de la reaccin se separan las molculas de Ag que quedan unidas al Ac de las que no lo estn, mediante mtodos de separacin que pueden ser fisicoqumicos como adsorcin, intercambio inico, filtracin molecular, o bien, inmunolgicos utilizando un segundo Ac anti-gammaglobulina para precipitar al complejo Ag-Ac previamente formado, a este mtodo se la conoce como mtodo del segundo anticuerpo. Actualmente este segundo Ac anti-gammaglobulina se adsorbe a una fase slida para capturar a los complejos Ag-Ac, que despus de un periodo de incubacin y procesos de lavado se separa el sobrenadante. Finalmente mediante un contador de centelleo se determina la radioactividad presente. Generalmente basta con contar solo una de las fracciones (unida o libre), pero preferentemente se determina la fraccin unida, que estar en relacin a la cantidad de Ag marcado, con lo cual: La cantidad de radioactividad es inversamente proporcional a la cantidad de antgeno no marcado. Para 1971 Engall y Perlman, desarrollan el RIST (radio immunosorbent assay), en donde las molculas de Ag marcado radioactivamente interaccionan con Ac inmovilizados en celulosa o sephadex. Posteriormente estos autores describen la aplicabilidad de conjugar a los Ac a enzimas en lugar de radioistopos, con lo que nacen los inmunoensayos enzimticos (EIA); de estos existen dos variedades, los homogneos y los heterogneos. En un EIA homogneo la reaccin se lleva a cabo en fase lquida y no se requieren de etapas o medios para separar los complejos Ag-Ac formados de los Ac o Ag (segn sea el caso) que permanecen libres en el sistema y que no han
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intervenido en la reaccin. Estos EIA se basan en la inhibicin o activacin de la funcin de la enzima por la interaccin Ag-Ac. Generalmente las enzimas que se utilizan son de bajo peso molecular que puedan ser conjugadas a un hapteno, como ejemplo esta la lisozima. En los sistemas heterogneos se utiliza una fase lquida en donde se encuentran inicialmente disueltos algunos de los reactivos y una fase slida en donde se lleva a cabo la reaccin. A diferencia de los homogneos, la actividad enzimtica del conjugado no se ve influida por la reaccin inmunolgica y adems requieren medios fsicos para separar las fracciones libres de las unidas, ya que despus de que se lleva a cabo la reaccin Ag-Ac, los complejos se retienen en la fase slida, y mediante lavados se eliminan los Ac o Ag que no intervienen en la reaccin. El EIA heterogneo por excelencia es el ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay). En ambos casos, el paso final es la adicin del sustrato especfico para demostrar cualitativa o cuantitativamente la actividad enzimtica, que estar en relacin a la presencia o ausencia del Ag o Ac buscado. La lectura del resultado puede ser visual (cualitativa) o mediante un colormetro o fluormetro (cuantitativa). La tercera marca utilizada son los fluorocromos como el isotiocianato de fluorecena y la rodamina que se conjugan a los Ac, para identificar o localizar Ag en la superficie y dentro de la clula lo que da origen a los mtodos de inmunofluorescencia, de los cuales existen dos principales modalidades la directa y la indirecta. En la inmunofluoresencia directa, los Ac marcados con el fluorocromo estn dirigidos al Ag buscado y la demostracin se hace en un solo paso, mientras que en la indirecta se lleva a cabo en dos pasos, en el primero se utiliza un Ac no marcado que se une al Ag celular el cual es demostrado en el segundo paso mediante una antiglobulina marcada con el fluorocromo. La fluorescencia se har visible amarilla verde o roja segn sea el caso, cuando se examina en un microscopio de fluorescencia. Cabe mencionar que adicional a estos tres principales marcadores (radioistopos, enzimas y fluorocromos) se han utilizado otros como la ferritina, compuestos quimioluminiscentes y existen diferentes modalidades que utilizan amplificadores como en el sistema avidina-biotina que tambin es utilizado ampliamente.

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Prctica No.12

ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA)

MARCO TERICO Se trata de un EIA heretogneo que utiliza como marca enzimas, es una prueba cuantitativa o cualitativa.. En el primer caso sirve para medir la concentracin (nanogramos o picogramos/mL) de antgenos o anticuerpos presentes en una muestra. En el segundo caso solo revela la presencia de ellos en una muestra problema y la reaccin resulta simplemente positiva o negativa. Los reactivos de ELISA cuentan con una vida media larga, pueden automatizarse y no hay contaminacin radiactiva, dndole con esto ventajas sobre el RIA. Para realizar una tcnica de ELISA se requiere contar con: Fase slida: Es donde el Ag o Ac pueden estar adsorbidos en su superficie mediante interacciones hidrofbicas. Los materiales ms usados son: poliestireno, cloruro de polivinilo (PVC), nylon, polipropileno, nitrocelulosa, goma de silicona y vidrio; que pueden encontrarse comercialmente como microplacas de fondo plano, tubos o perlas. Cuando a una fase slida se le adsorben los Ac, se esta buscando al Ag en la muestra problema, por ejemplo en la deteccin del Ag de superficie de hepatitis B (HBsAg), en cambio cuando se han adherido los Ag a la fase slida se va ha detectar la presencia de Ac en la muestra problema, por ejemplo en la bsqueda de Ac contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Bloqueador: Se utiliza para bloquear los sitios libres de la fase slida para evitar que durante la reaccin algunas molculas de reactivo se unan inespecficamente a la fase slida, en lugar de hacerlo por medio de la reaccin Ag-Ac, dando lugar a resultados falsos y se observe un exceso de actividad enzimtica que no es real. Para ello, se puede usar un exceso (0.1 al 1%) de una protena inerte. Entre los bloqueadores ms usados esta la casena, seroalbmina bovina, gelatina, suero entero y leche entera (sveltex). Conjugado: Es la unin de una enzima a un Ac o Ag en forma covalente, dando como resultado complejos Ag-enzima o Ac-enzima sin que se pierda la actividad inmunolgica o enzimtica. La tcnica ms usada para conjugar es la de Avrameas o del gluteraldehdo. Enzima y sustrato: Son los indicadores de que la reaccin Ag-Ac ha ocurrido, de ellos depende la sensibilidad total del ensayo, logrando esta cuando se conocen todos los requerimientos de la enzima. La enzima debe conservar toda su actividad enzimtica al ser conjugada y tener un alto nmero de recambio (las moles de sustrato convertido en producto por unidad de tiempo). Las enzimas ms usadas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina. El sustrato generalmente es incoloro y el producto de la reaccin enzimtica debe ser fcil y sensiblemente detectable., debido a que desarrolle color, sea fluorescente o que emita luz.

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La presencia del producto indica la prueba positiva desde el punto de vista cualitativo. Para hacer el ensayo cuantitativo, se determina la cantidad de enzima adsorbida (por su actividad sobre el sustrato para dar un producto colorido, fluorescente o luminoso) la cual es proporcional a la cantidad de Ag o Ac en la muestra, entonces su concentracin se puede medir mediante una curva de calibracin utilizando estndares de concentracin conocida. Las tcnicas de ELISA se pueden realizar de 4 maneras diferentes: (1) directo, (2) indirecto, (3) sandwich y (4) por competencia. ELISA directo consiste en la adsorcin pasiva de un Ag (o un Ac) sobre la superficie de la placa y luego la adicin de un Ac (o Ag) que lleva conjugada la enzima. ELISA indirecto (para deteccin de Ac) consiste en adsorber pasivamente el Ag sobre la placa, adicionar el suero donde se buscan los Ac especficos contra el Ag y posteriormente aadir un segundo anticuerpo anti-gamma globulina que lleva conjugada la enzima. ELISA tipo sandwich (para deteccin de Ag) puede ser directo o indirecto. El primero consiste en adsorber los Ac especficos a la placa, despus aadir la muestra que contiene el Ag y finalmente un segundo Ac (dirigido contra el mismo Ag) que tiene la enzima conjugada. El indirecto, utiliza un segundo Ac (contra el mismo Ag) no conjugado y en un paso siguiente un tercer Ac anti-gamma globulina conjugado a la enzima. ELISA por competencia puede ser directo o indirecto. La prueba se basa en que se tratan de unir dos reactivos a un tercero. La competencia apropiada exige la adicin simultnea de los dos reactivos que van ha competir, uno de ellos marcado y el otro sin marca. En esta prctica se utilizar un juego de reactivos comercial, y el sistema utilizado y su aplicacin variar de acuerdo a su disponibilidad, pero de cualquier forma a continuacin se describen los pasos generales para la realizacin de un ELISA. PROCEDIMIENTO GENERAL DE UN ELISA: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Adsorber los Ag o Ac, segn sea el caso a una fase slida. Bloquear la fase slida. Proceder a la captura, del Ag o Ac presente en la muestra problema a la fase slida (al reaccionar con el Ac o Ag) e incubar. Lavar la placa para separar lo que reacciono de lo que NO reacciono. Adicionar el conjugado e incubar. Lavar la placa para separar lo que reacciono de lo que NO reacciono. Adicionar el sustrato especfico de la enzima usada. Para revelar la reaccin. Detener la reaccin enzimtica por un cambio drstico de pH.

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9.

Interpretar los resultados visualmente si es un estudio cualitativo o en caso de ser cuantitativo leer el desarrollo de color en un colormetro.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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UNIDAD 6

PURIFICACIN DE ANTICUERPOS
GENERALIDADES Los anticuerpos (Ac) son glicoprotenas que pertenecen a la parte efectora de la respuesta inmune humoral. Se sintetizan por las clulas plasmticas y se localizan en la mayora de los fluidos biolgicos. La purificacin de los Ac ha sido una prctica muy importante, debido a que los productos purificados son utilizados como herramientas de uso teraputico, preventivo, diagnstico y de investigacin. Como uso teraputico o preventivo en humanos, se utilizan sueros homlogos (de la misma especie) y heterlogos (de especie diferente) cuyo grado de pureza y efectividad deben de ser factores importantes que considerar. En el caso de su uso como reactivos para diagnstico e investigacin se requieren anticuerpos purificados que presenten gran especificidad. Existe una gran variedad de mtodos usados para purificar anticuerpos. La eleccin correcta del mtodo de purificacin depende de una serie de variables, como son el uso que se les dar a los anticuerpos, las especies filogenticas en las cuales se generaron, la clase o subclase si es un anticuerpo monoclonal, etc. A menudo es necesario combinar varias tcnicas para llevar a cabo la purificacin con xito. Los mtodos de separacin y purificacin de anticuerpos pueden ser inespecficos, cuando se desea separar la fraccin de las !-globulinas del resto de las protenas que constituyen el plasma, o especficos cuando se desea separar del suero o plasma anticuerpos con una especificidad determinada. Purificacin Inespecfica Los mtodos de purificacin inespecfica de los anticuerpos se basan en aprovechar algunas de las propiedades fisicoqumicas de protenas como son: diferencias en solubilidad, carga elctrica neta, tamao y peso molecular (PM); pero tambin aqu se incluye un mtodo basado en una propiedad biolgica de las bacterias Staphylococcus aureus y Streptococcus sp. que unen a travs de su protena A y G respectivamente, la regin Fc de los anticuerpos de clase IgG. Algunas consideraciones sobre estas propiedades son: Solubilidad: la solubilidad de las protenas depende no solo de la variedad de grupos residuales de aminocidos y de la manera en que se pliega la cadena peptdica, sino tambin de las propiedades del sistema en el cul se encuentra la protena. Los cuatro factores que afectan la solubilidad son: fuerza inica, pH, temperatura y la constante dielctrica del disolvente. As, los siguientes mtodos se basan en diferencias de la solubilidad de los anticuerpos con respecto a las dems protenas: Precipitacin fraccionada con sales neutras.
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Precipitacin fraccionada con sales neutras combinada con hidrlisis enzimtica con pepsina. Mtodo de Cohn o precipitacin fraccionada con disolventes orgnicos miscibles con el agua (etanol, rivanol, acetona).

Carga: la carga neta de las protenas la determina en general los grupos de aminocidos presentes y el pH del medio en que se encuentre. Los mtodos basados en esta propiedad son: Electroforesis Cromatografa de Intercambio inico PM-Tamao: bajo el principio de que una molcula de mayor peso molecular tiende a ocupar mayor espacio y por lo tanto la resistencia que le ponga el medio va a ser fundamental para determinar s fluye o sedimenta con mayor o menor rapidez. Esto sucede en mtodos como: Exclusin molecular. Ultracentrifugacin en gradiente de densidad. Electroforesis-SDS-Poliacrilamida. Afinidad por protenas A y G: la regin Fc de los anticuerpos IgG tiene una gran afinidad por la protena A de Staphylococcus aureus y la protena G de Streptococcus sp., siendo esto de utilidad para separar a los anticuerpos de esta clase. El mtodo basado en esta propiedad es: Purificacin de Ac de clase IgG por cromatografa de afinidad. Purificacin especfica Como se mencion anteriormente la purificacin especfica tiene como finalidad separar del suero o plasma Ac con una especificidad determinada y para ello es necesario utilizar reacciones Ag-Ac, es decir se basa en las propiedades inmunolgicas de estas molculas. Bsicamente pueden ser llevados a cabo por: Adsorcin: consiste en hacer interaccionar a los Ac indeseables con sus correspondientes antgenos y separar de la mezcla los complejos Ag-Ac. Eliminar los Ac indeseables. Adsorcin-Elucin: se basa en utilizar antgenos puros que al interaccionar con el suero inmune se combinan especficamente con sus anticuerpos especficos, se separa el complejo Ag-Ac de la mezcla, y bajo el principio de que la reaccin es reversible modificando el pH, la fuerza inica, la temperatura o la concentracin del Ag, se disocia el complejo para obtener el Ac deseado. Obtener los anticuerpos que se desean. Cromatografa de Afinidad: es una tcnica que conjunta el principio de adsorcin-elucin y la cromatografa. Se basa en hacer pasar la mezcla de Ac a travs de una columna cromatogrfica empacada con un soporte (Sepharosa), el cual tiene unido covalentemente (utilizando bromuro de ciangeno) un Ag puro. Los Ac especficos se unirn al Ag. Posteriormente, se lava la columna para
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separar las protenas no enlazadas y el Ac deseado es separado de la columna por elucin, disociando la reaccin Ag-Ac modificando el pH y/o la fuerza inica. Tambin esta disociacin se puede lograr agregando una concentracin elevada de antgeno en forma soluble. Adems de la reaccin Ag-Ac, este mtodo aplica a otros sistemas en donde se encuentre un ligando bioespecfico como enzimasustrato, carbohidratos-lectinas, etc.

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PRCTICA No. 13

PURIFICACIN FRACCIONADA CON SALES NEUTRAS

Purificacin de ! -globulinas a partir de plasma humano MARCO TERICO La precipitacin con sulfato de amonio es uno de los mtodos ms comnmente usados para extraer protenas de una solucin. Las protenas en solucin forman uniones de hidrgeno con el agua a travs de sus grupos polares y inicos expuestos. Cuando se adicionan altas concentraciones de pequeos iones muy cargados, estos hacen que disminuya la solubilidad de las protenas y precipiten. Los factores que pueden afectar la concentracin a la cual una protena particular precipite incluyen el nmero y posicin de los grupos polares, el peso molecular de la protena, el pH de la solucin y la temperatura a la cual se lleva a cabo el proceso. En este mtodo se precipita a la !-globulina mediante la adicin de solucin saturada a temperatura ambiente de sulfato de amonio a tener una concentracin en la mezcla de 1/3 de saturacin. Esta precipitacin se realiza varias veces. El sulfato de amonio que queda atrapado en el precipitado se elimina mediante dilisis contra solucin salina amortiguada con boratos. El producto resultante de este mtodo no se encuentra totalmente puro, estar contaminado con otras protenas de alto peso molecular y con protenas que quedan atrapadas en el precipitado. Por esta razn, la tcnica se usa para concentrar y purificar parcialmente Acs de todas las fuentes y especies y se recomienda combinarla con otra como cromatografa de intercambio inico o exclusin molecular, para mayor eficiencia en la purificacin; es barata, fcil y conveniente para grandes volmenes. MATERIAL 1 Vaso de precipitado de 100 mL 1 Agitador magntico 1 Magneto 1 Pipeta de 10 mL 2 Tubos para centrfuga de plstico de 50 mL 1 Pipeta Pasteur 1 Bulbo. 1 Propipeta. 1 Centrfuga con cabezal para tubos de 50 mL 1 Frasco de 500 mL. 1 Probeta de 100 mL 10 cm Bolsa de dilisis. Hilo camo. Papel tornasol, papel pH o potencimetro. 30 mL 45 mL 90 mL Plasma o suero humano Sulfato de amonio saturado Solucin salina isotnica (SSI) 0.85%
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0.5 mL NaOH al 2N 0.2 mL BaCl2 al 10% 750 mL Solucin salina isotnica amortiguada con boratos pH 7.8 TCNICA 1. En un vaso de precipitado de 100 mL con un magneto, colocar un volumen medido de plasma o suero humano. Poner en agitacin constante a baja velocidad, evitando la formacin de espuma. 2. Adicionar gota a gota la cantidad adecuada de solucin saturada de sulfato de amonio al plasma para tener 1/3 de saturacin de la sal neutra (para 30 mL de plasma, adicionar 15 mL de solucin saturada de sulfato de amonio). La adicin debe de ser lenta para evitar que precipiten protenas indeseables. Al principio el precipitado se redisuelve inmediatamente y no se debe agregar otra gota hasta que esto haya sucedido, de lo contrario quedan englobadas en el precipitado otras protenas. 3. Una vez que se ha adicionado todo el sulfato de amonio, ajustar el pH a 7.8 con NaOH 2N. Si se trabaja con volmenes menores de suero, usar NaOH 0.5 1 N, y si se trabaja con un volumen mayor usar NaOH 45 N. 4. Continuar con la agitacin durante 2 a 3 h a temperatura ambiente para eliminar mecnicamente las protenas que hayan quedado englobadas en el precipitado de !-globulina. 5. Adicionar toda la solucin y precipitado obtenido en una tubo para centrfuga. 6. Centrifugar durante 30 min a 3000 rpm. Este precipitado contiene toda la !-globulina, pero impurificada con trazas de albmina. 7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido con SSI hasta tener el volumen inicial de plasma (si se inici con 50 mL de plasma, aforar el precipitado a 50 mL con SSI). 8. Despus de haber resuspendido la protena, repetir la precipitacin dos veces ms: para la segunda repetir los pasos 1-7 y para la tercera del 1-6. En total se debe precipitar la protena 3 veces. 9. Despus de la 3 precipitacin y una vez centrifugado, resuspender el precipitado con amortiguador salino de boratos en cantidad igual a la mitad del volumen inicial de plasma (si se inici con 30 mL, se aforar a 15 mL). 10. Eliminar el sulfato de amonio mediante dilisis contra amortiguador salino de boratos, cambiando esta solucin cada 12 a 24 h y manteniendo a 4 C durante este proceso. 11. Continuar con el proceso de dilisis hasta que el dializado de negativa la reaccin para sulfatos, la cual consiste en agregar unas gotas de BaCl2 Ba(OH)2 al 10% a una muestra del dializado, si se forma un precipitado blanco de BaSO4 la dilisis an no ha terminado. 12. Recuperar la solucin de !-globulinas purificadas de la bolsa de dilisis cuando ya no contenga sulfato de amonio, y pasarla a un tubo de centrfuga de 50 mL.

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13. 14.

15.

Centrifugar en fro (colocar hielo en la camisa de la centrfuga) durante 30 min a 3000 rpm para eliminar partculas insolubles que se forman durante la dilisis. La solucin final debe presentar slo una ligera opalescencia. Envasar la !-globulina purificada en un frasco vial. Para su conservacin puede filtrarse por Seitz, liofilizarse o adicionarle un conservador como timerosal a concentracin final de 1:10 000, glicerina a concentracin final de 50% azida de sodio 1 mg/mL. Etiquetar con los siguientes datos: Nombre del producto, fecha de obtencin, volumen, conservador empleado y nombre de quien(es) elaboraron.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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ANEXO I TCNICAS DE APOYO

A. COAGULACION DE PLASMA

Se utiliza para eliminar los factores de la coagulacin del plasma y as evitar que interfieran en algunas tcnicas, por ejemplo durante los pasos de esterilizacin por filtracin. MATERIAL 1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL 1 Pipeta de 1 mL (1/10) 1 Pipeta de 5 mL (1/10) Congelador de 20C Bao de temperatura controlada a 37 C 50 mL 1.0 mL 0.1 mL Plasma humano CaCl2 1M Trombina bovina

TCNICA 1. Congelar el plasma a 20C durante 3 das. 2. Descongelar en bao Mara a 37C. 3. Agregar 2 mL de CaCl2 1M por cada 100 mL de plasma y se deja en el bao Mara por 1 hora con agitacin. 4. Si no coagula agregar 1 gota de trombina bovina. Se contina agregando gotas de trombina hasta lograr la coagulacin. 5. Una vez ocurrida la coagulacin, mantener el plasma coagulado 24 horas a 4C. 6. Se separa el coagulo y se exprime para obtener la mayor cantidad de suero. 7. Si el suero se va a guardar, se conserva en congelacin. NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E. B. DETERMINACIN DE PROTENAS. MTODO DE BIURET

Se utiliza para la cuantificacin de protenas en preparados biolgicos que van a ser empleados como inmungenos, para poder ajustar a la concentracin deseada para la inmunizacin. La tcnica descrita es til en un intervalo de 0.1 a 2.5 mg de protena. MATERIAL 10 Tubos de 13 X 100 mm
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1 2 1 3.5 mL 10 mL 15 mL

Gradilla Pipeta de 1.0 mL (1/10) Pipeta de 5.0 mL (1/10) Colormetro Estndar de protenas de 2.5 mg/mL Solucin salina isotnica 0.85% Reactivo de Biuret Muestra Problema

TCNICA 1. En una serie de tubos preparar la curva estndar de acuerdo al siguiente cuadro:
Tubo Estndar de protena (2.5mg/ml) Muestra SSI (ml) Reactivo de Biuret (ml) Concentracin (mg/dl)

1 2 3 4 5 6 7 8
9 10

----0.05 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 ---------

--------------------------------0.10 1.00

1.0 0.95 0.90 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0.90 0.00

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

0.00 0.125 0.25 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

2. 3. 4. 5. 6.

Agitar los tubos. Reposar 30 min a temperatura ambiente. Leer la D.O. a 555 nm contra blanco de agua destilada. Restar la D.O. del blanco de reactivo (tubo 1). Graficar D.O. contra Concentracin de protenas.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E. C. CURVA DE Mc FARLAND

Se utiliza para determinar la concentracin de suspensiones de bacterias. Para ello se compara la turbidez de la suspensin problema con la de suspensiones estndar de sulfato de bario (resultado de la mezcla de BaCl2 al 1% y H2SO4 al 1%), que equivalen a cierto nmero de microorganismos. La construccin de la escala de Mc Farland y su equivalencia se d en la siguiente tabla: Escala de BaCl2 al 1%
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H2SO4 al 1%

Bacterias X 106

Mc Farland 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

ML 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

La suspensiones se pueden guardar de manera permanente en tubos con cierre hermtico, para utilizarse cada vez que se desee previa agitacin. La escala se puede utilizar de manera visual por simple comparacin de la suspensin de bacterias problema y obtener as un estimado de su concentracin. Pero tambin se puede hacer la lectura de la turbidez en un nefelmetro Klett Summerson y determinar la concentracin exacta, interpolando el valor en una curva estndar construida a partir de los siguientes datos: Unidades Klett 53 97 150 195 228 262 Micoorganismos X 106/mL 300 600 900 1200 1500 1800

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E. D. PREPARACION DE SUSPENSIONES DE ERITROCITOS DE CARNERO

Se describe la preparacin de las suspensiones de eritrocitos de carnero que son utilizadas en las tcnicas de hemaglutinacin indirecta y en la titulacin de amboceptor hemoltico anticarnero. MATERIAL 1 Jeringa hipodrmica de 20 mL con aguja No. 18 estril 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL con tapn de rosca. 2 Tubos de centrfuga de plstico de 50 mL. 1 Probeta graduada de 100 mL. 1 Pipeta de 5.0 mL (1/10).
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1 1 1 23 mL 27 mL 100 mL 150 mL

Pipeta de 10.0 mL (1/10). Bulbo o propipeta. Frasco tipo Vial de 100 mL Refrigerador Sangre de carnero. Solucin de Alsever estril. Solucin salina isotnica 0.85% Amortiguador: Fosfatos 0.15 M pH = 7.2, para hemaglutinacin indirecta Veronal pH = 7.3-7.4, para titulacin de amboceptor hemoltico anticarnero Tomar 23 mL de la sangre del carnero por puncin de la yugular. Recibir la sangre en un matraz Erlenmeyer conteniendo 27 mL de solucin de Alsever estril y agitar suavemente. Para preparar una suspensin de eritrocitos de carnero para hemaglutinacin indirecta dejar que la sangre se estabilice en el Alsever durante 3 4 das, conservando el matraz en refrigeracin a 4C. Para preparar una suspensin de eritrocitos de carnero para titulacin de hemolisina (amboceptor hemoltico anticarnero), la sangre debe ser fresca, cuando mucho de un da de tomados, de lo contrario las reacciones pueden verse falseadas por la desnaturalizacin de los Ag de los G.R. Pasar la mezcla sangre-Alsever a tubos de centrfuga de 50 mL y centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Quitar el plasma sobrenadante por succin, evitando que el paquete de G.R. se resuspenda. Lavar los G.R. agregando 2 3 veces su volumen de SSI, resuspender el paquete perfectamente pero gentilmente con una pipeta con bulbo y centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Eliminar el sobrenadante por succin. Repetir el paso 6 dos veces ms, pero en el ltimo lavado utilizar el amortiguador indicado para cada tcnica, fosfatos 0.15 M pH = 7.2 para hemaglutinacin indirecta o veronal pH = 7.3-7.4 para titulacin de amboceptor hemoltico. Para hemaglutinacin indirecta, preparar la suspensin de G.R. al 2.5%, para ello, tomar 2.5 mL del paquete de G.R. lavados y llevar a un volumen final de 100 mL con amortiguador de fosfatos 0.15 M pH = 7.2. Para titulacin de amboceptor hemoltico , preparar la suspensin de G.R. al 2%, para ello, tomar 2.0 mL del paquete de G.R. lavados y llevar a un volumen final de 100 mL con amortiguador de veronal pH = 7.3-7.4.

1. 2. 3a. 3b.

4. 5. 6.

7.

8a. 8b.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

79

E.

MANEJO Y DESECHO DE MATERIAL BIOLGICO POTENCIALMENTE INFECCIOSO

Se consideran materiales biolgicos potencialmente infecciosos a aquellos que puedan contener microorganismos o sus productos que sean capaces de causar efectos nocivos a la salud y al ambiente. Entre ellos tenemos: Sangre y sus fracciones (plasma, suero y paquete globular) Cepas y cultivos de agentes infecciosos (bacterias, virus, parsitos, hongos) Productos biolgicos: vacunas, sueros, reactivos biolgicos de diagnstico. Cadveres, tejidos, rganos y fluidos corporales de origen animal. Equipo, material y objetos contaminados durante las prcticas. Equipos y dispositivos desechables utilizados en las prcticas: vendas, gasas, algodones, guantes, cubre-bocas, hisopos, abate-lenguas, etc. Objetos punzo cortantes y materiales con sangre, as como recipientes de muestras biolgicas para anlisis. Aqu se incluye: agujas hipodrmicas, navajas, jeringas, bisturs, pipetas Pasteur, cubreobjetos y portaobjetos, cajas Petri, tubos de ensaye y otro tipo de cristalera. Para evitar que este tipo de materiales constituyan un riesgo para la salud y el ambiente, se debern tener las siguientes precauciones durante el desarrollo de las prcticas. 1. Al iniciar la prctica limpiar la mesa de trabajo con una solucin de hipoclorito de sodio al 0.1%. 2. Utilizar bata, guantes y cubre-boca siempre que se maneje material potencialmente infeccioso. 3. No comer, beber o fumar en el laboratorio. 4. No colocar mochilas, ropa, tiles escolares y otros artculos personales sobre las mesas de trabajo cuando se est utilizando material potencialmente infeccioso. 5. No pipetear con la boca. 6. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min todo material no desechable y equipo que haya estado en contacto con material potencialmente infeccioso. 7. Cuando se trate de material o equipo que no sea esterilizable, aplicar hipoclorito de sodio al 2% por lo menos durante 10 min. 8. Cuando sucedan derrames de material infeccioso sobre mesas de trabajo u otras superficies aplicar hipoclorito de sodio al 2% durante 10 min. 9. Cuando se trate de material desechable contaminado desechar en los recipientes destinados para tal efecto (ver tabla). 10. En el caso de desechos biolgicos como tejidos, sangre, sueros, orina y cualquier otro lquido corporal de origen animal, desechar en los contenedores destinados para dicho fin (ver tabla). No tirar en las tarjas. 11. No almacenar por mucho tiempo en la gaveta material biolgico potencialmente infeccioso como cepas, cultivos, sangre, suero, etc. 12. Al finalizar la prctica limpiar la mesa de trabajo con la solucin de hipoclorito de sodio al 0.1%.
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13. Lavarse las manos perfectamente con jabn y desinfectrselas al trmino del ejercicio de laboratorio. TIPO DE RESIDUO
Sangre y sus derivados Cultivos y cepas de agentes infecciosos Patolgicos

EJEMPLOS

ESTADO FSICO
Lquido Slido

ENVASADO
Recipientes Hermticos Bolsas de Polietileno Bolsas de polietileno Recipientes Hermticos Bolsas de Polietileno Recipientes Hermticos Recipientes rgidos de polipropileno

COLOR
Rojo Rojo

Tejidos, rganos, muestras biolgicas, cadveres y partes animales

Slido Lquido

Amarillo Rojo Rojo Rojo Rojo

Residuos Recipientes con sangre, no anatmicos materiales de curacin materiales deshechables, materiales absorbentes utilizados en jaulas Objetos Tubos capilares, navajas, punzocortantes lancetas, agujas de jeringa deshechable e hipodrmica, de sutura, acupuntura, tatuaje, bisturs, estiletes de catter

Slido

Slido

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ANEXO II PREPARACION DE REACTIVOS

1. SOLUCIN SALINA ISOTNICA (SSI) 0.85%: NaCl 8.5 g Agua destilada 1 000 mL SOLUCIN SALINA ISOTNICA FORMOLADA AL 0.3% ESTRIL: Solucin salina isotnica 0.85% 992.5 mL Formaldehdo al 40% 7.5 mL Esterilizar la SSI a 121C durante 15 min. En condiciones de esterilidad agregar el formaldehdo. 3. SOLUCIN SALINA ISOTNICA FORMOLADA AL 0.6% ESTRIL: Solucin salina isotnica 0.85% estril 985 mL Formaldehdo al 40% 15 mL Esterilizar la SSI a 121C durante 15 min. En condiciones de esterilidad agregar el formaldehdo. 4. SOLUCION SALINA ISOTNICA FENOLDA AL 0.5 % ESTRIL: Solucin salina isotnica 0.85% estril 995 mL Fenol fundido 5 mL Esterilizar la SSI a 121C durante 15 min. En condiciones de esterilidad agregar el fenol fundido. 5. ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND: Aceite mineral (Nujol) 8.5 mL Arlacel A 1.5 mL Esterilizar la mezcla en autoclave 15 min a 15 lb de presin. 6. ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND: Aceite mineral (Nujol) 8.5 mL Arlacel A 1.5 mL M. smegmatis 5.0 mg Esterilizar la mezcla de aceite mineral y Arlacel A en autoclave 15 min a 15 lb de presin. Agregar la micobacteria en condiciones de esterilidad.
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2.

7.

SOLUCIN DE ALSEVER: Glucosa Citrato de sodio cido ctrico Cloruro de sodio Agua destilada

20.5 g 8.0 g 0.55 g 4.2 g 1000 mL

Esterilizar a 10 lb de presin a temperatura de 121 C por 10 min o por filtracin. Se utiliza como anticoagulante y estabilizador de sangre de carnero. 8. SOLUCIN DE TIMEROSAL AL 10%: Etilmercuritiosalicilato de sodio 10 g Agua destilada 100 mL Se usa como conservador en proporcin de 0.1 mL por cada 100 mL de suero. 9. SOLUCIN DE AZIDA DE SODIO AL 10%: Azida de sodio 10 g Agua destilada 100 mL Se usa como conservador en proporcin de 1.0 mL por cada 100 mL de suero. 10. AMORTIGUADORES DE FOSFATOS (PBS): SOLUCIONES STOCK: Solucin I: Fosfato de sodio dibsico (Na2HPO4) 0.15 M: Na2HPO4 21.3 g Agua destilada c.b.p. 1000 mL Solucin II: Fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) 0.15 M: KH2PO4 20.4 g Agua destilada c.b.p. 1000 mL Solucin III: Cloruro de sodio (NaCl) 0.15 M: NaCl 8.8 g Agua destilada c.b.p. 1000 mL 10.1 AMORTIGUADOR DE FOSFATOS SALINO (PBS) pH = 7.2, 0.15 M: Solucin I 76.0 mL Solucin II 24.0 mL Solucin III 100.0 mL

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Se utiliza para la tcnica de hemaglutinacin indirecta, pero tambin puede ser utilizado en las tcnicas de inmunoprecipitacin como el Ouchterlony y el RID diludo 1:2 con agua destilada. 10.2 AMORTIGUADOR DE FOSFATOS SALINO (PBS) pH = 6.4, 0.15 M: Solucin I 32.3 mL Solucin II 67.7 mL Solucin III 100.0 mL Se utiliza en la tcnica de hemaglutinacin indirecta. 11. AMORTIGUADOR DE VERONAL-ACETATO pH = 8.2 (MICHAELIS): SOLUCIN CONCENTRADA = 0.15 pH = 8.2: Barbital sdico 88.26 g . Acetato de sodio 3H2O 58.26 g ( Acetato de sodio anhidro 35.21 g) Solucin de timerosal al 10% 3.0 mL Agua desionizada c.b.p 3 000 mL Mezclar 800 mL de la solucin de barbital-acetato con 960 mL de agua destilada y ajustar el pH a 8.2 con solucin 0.1N de HCl. La final es 0.15. Solucin de trabajo: Para tener una fuerza inica de 0.05 y pH = 8.2 diluir una parte de la solucin concentrada con 2 partes de agua desionizada. Se utiliza en la tcnica de inmunoelectroforesis. 12. AMORTIGUADOR PARA COMPLEMENTO (VERONAL pH = 7.3-7.4): SOLUCIN CONCENTRADA 5X: NaCl 41.5 g Barbiturato de sodio 5.095 g Agua destilada 250 mL HCl 17.29 mL 2+ 2+ * Solucin de Mg y Ca 2.5 mL Agua destilada c.b.p. 1000 mL * Solucin de MgCl2 y CaCl2: MgCl2.6H20 1.0 M 20.3 g CaCl2.2H20 0.3 M 4.4 g Agua destilada 100 mL Para preparar la solucin de trabajo diluir 1:5 y el pH debe ser 7.3-7.4 SOLUCIN SALINA ISOTNICA AMORTIGUADA CON BORATOS: Amortiguador de boratos pH 8.4-8.5 cido brico 6.184 g . Brax (Na2B407 10H2O) 9.536 g NaCl 4.384 g Agua destilada c.b.p 1000 mL

13.

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Para preparar la solucin salina isotnica amortiguada, mezclar 400 mL de este amortiguador de boratos con 8,000 mL de solucin salina isotnica. 14. REACTIVO DE BIURET: . Tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 4H2O) . Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O) Yoduro de potasio (KI) Hidrxido de sodio (NaOH) 0.2 N libre de carbonato c.b.p.

9.0 g 3.0 g 5.0 g 1000 mL

Colocar el tartrato en un matraz volumtrico de 1000 mL y disolver en aproximadamente 400 mL de NaOH 0.2 N. Posteriormente disolver sucesivamente el sulfato de cobre y el yoduro de potasio. Aforar con NaOH 0.2 N y almacenar en una botella de polipropileno. El reactivo es estable por un periodo indefinido de tiempo.

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BIBLIOGRAFA
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