CROMATOGRAFA

La palabra cromatografa significa grfica de colores y fue diseada por

Michael Tswett en el 1903. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de
pigmentos de hojas verdes y luego pas este extracto a travs de un tubo de vidrio
empacado con carbonato de calcio; de esta forma logr separar los pigmentos
presentes en las hojas.
Actualmente cromatografa es el nombre que se le da a un grupo de tcnicas
utilizadas en la determinacin de la identidad de sustancias, en la separacin de
componentes de las mezclas y en la purificacin de compuestos. Esta tcnica es muy
efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigacin como a nivel industrial.
Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el
mismo principio: Todos los sistemas de cromatografa contienen una fase estacionaria
y una fase mvil.
La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido que se queda fijo en la misma
posicin. La fase mvil puede ser un lquido o un gas que corre a travs de una
superficie y de la fase estacionaria. Las sustancias que estn en un sistema de
cromatografa interaccionan tanto con la fase estacionaria como con la fase mvil. La
naturaleza de estas interacciones depende de las propiedades de las sustancias as
como tambin de la composicin de la fase estacionaria.
La rapidez con que viaja una sustancia a travs del sistema de cromatografa depende
directamente de la interaccin relativa entre las sustancias y las fases mvil y
estacionaria. En el caso de una mezcla, si cada componente interacciona diferente con
la fase mvil y la fase estacionaria, cada uno de ellos se mover diferente.
En la siguiente tabla se observan diferentes fases mviles y fases estacionarias
en diferentes tcnicas de cromatografa:
Tcnica Fase mvil Fase estacionaria
Cromatografa de gases Gas Slido o lquido
Cromatografa lquida
en fase inversa
Lquido (polar)
Slido o lquido
(menos polar)
Cromatografa lquida
en fase normal
Lquido
(menos polar)
Slido o lquido
(polar)
Cromatografa lquida
de intercambio inico
Lquido (polar) Slido
Cromatografa lquida
de exclusin
Lquido Slido
Cromatografa lquida
de adsorcin
Lquido Slido
Cromatografa de
fluidos supercrticos
Lquido Slido
En la cromatografa se tiene en cuenta la velocidad del soluto y la del eluente para
poder determinar la siguiente relacin.

A continuacin se describirn las diferentes tcnicas de cromatografa:
Cromatografa de papel: es un proceso donde el absorbente lo constituye un papel
de Filtro. Una vez corrido el disolvente se retira el papel y se deja secar, se trata con
un reactivo qumico con el fin de poder revelar las manchas.
Cromatografa de capa fina: basa en el principio del reparto entre dos fases. En
general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se
desea separar (muestra) interaccione con un medio que se denomina fase
estacionaria. Un segundo medio la fase mvil que es inmiscible con la fase
estacionaria se hace fluir a travs de sta para elur a las molculas en la muestra.
Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente, la
fase mvil a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos
que en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente
solubles en la fase estacionaria.
Cromatografa de columna: Los elementos bsicos en la cromatografa de columna
son una son la fase estacionaria y la fase mvil. La fase estacionaria la forma un slido
poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada
en plstico o vidri.
La fase mvil se encuentra formada por la solucin que lentamente va atravesando la
fase estacionaria. La solucin que sale al final de la columna se reemplaza
constantemente por nueva solucin que se suministra desde un contenedor por la
parte superior de la columna.
La Cromatografa en columna se emplea para la separacin de sustancias en escala
preparativa.
Cromatografa gaseosa: La muestra es vaporizada e introducida en un flujo de un
gas apropiado denominado de fase mvil o gas de arrastre. Este flujo de gas con la
muestra vaporizada pasa por un tubo conteniendo la fase estacionaria, donde ocurre
la separacin de la mezcla. La fase estacionaria puede ser un slido adsorbente o,
ms comnmente, una pelcula de un lquido poco voltil, soportado sobre un slido
inerte o sobre la propia pared del tubo. Las sustancias separadas salen de la columna
disueltas en el gas de arrastre y pasan por un detector; dispositivo que genera una
seal elctrica proporcional a la cantidad del material eluido.
La Cromatografa Gaseosa es una tcnica utilizada para la separacin y anlisis de
mezclas de sustancias voltiles.


Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase
mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la
muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado
en un slido.

Introduccin

Significa "Escribir en Colores.
Los componentes de una mezcla pueden presentar una tendencia diferente a
permanecer en cualquiera de las fases involucradas.
Es la separacin de dos o ms compuestos qumicos en un medio




Conceptos generales

La cromatografa se basa en un conjunto de tcnicas asociadas al principio de
retencin selectiva.
Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Posee:
Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico).
Fase estacionaria: se trata de un slido o un lquido fijado en un slido.
Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase
estacionaria y con la fase mvil.
Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se
van separando.

Tipos de cromatografa

Cromatografa plana: La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre
un papel.
Las principales tcnicas son:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna: La fase estacionaria se sita dentro de una columna.
Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
Cromatografa de fluidos supercrticos

Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa

Cromatografa en papel

Tiene como soporte un papel de celulosa.
Es una tcnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeas
de muestra (miligramos y microgramos).

Cromatografa en capa fina

Lograron separar mezclas de tinturas farmacuticas.
En este tipo de cromatografa la fase estacionaria se extiende sobre un soporte
inerte (silica).
Stahl estandariz el mtodo para elaborar capas finas por mtodos mecnicos.

Cromatografa de columna

Consiste en la aplicacin de una muestra compleja a una columna de cristal.
Contiene una matriz slida porosa que est inmersa en el solvente.
Se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna.
Las diferentes mezclas se van retrasando de manera distinta segn sus
interacciones con la matriz.
Se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamao o su
capacidad de unirse a grupos qumicos particulares.
La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la
electroforesis en geles de poliacrilamida.
.
Trminos relacionados con el proceso
Matriz de la columna
Longitud de la columna
Volumen de la columna: volumen total de gel.
Run Throught: volumen de muestra mas solvente.








Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa
Cromatografa de intercambio inico
Esta tcnica apareci durante la II Guerra Mundial.
Tena la finalidad de separar los elementos alcalinotrreos y los elementos de
transicin.
En 1938 Taylor y Urey utilizan este mtodo para separar istopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.
Se usa en la separacin de molculas grandes (protenas y cidos nucleicos).
Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas fuertes se emplean
intercambiadores inicos inorgnico


Funcionamiento

En unas condiciones determinadas sern retenidas en la columna las muestras
que tengan una carga complementaria a la de la matriz de la gel, siendo eluidas
las restantes.
Para eluir las muestras retenidas se puede variar la carga inica del solvente o su
pH de forma que se alcance el punto isoelctrico de la muestra de inters o el de la
matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a la muestra en la
columna.

















Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa

Cromatografa de gel-filtracin
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles
se puede separar polmeros sintticos de alto peso molecular.
Cromatografa de afinidad.
Porath en 1967 utiliza un pptido o protena unida covalentemente a un ligando
y la utiliza para la separacin de molculas proteicas.
Cromatografa de gas.
Es una de las tcnicas ms utilizadas e importantes.
Ha revolucionado el campo de la qumica analtica.
Cromatografa de exclusin
o La cromatografa de exclusin molecular o de filtracin en gel, separa las
muestras en base a su tamao.
o La matriz de la columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros
de tamaos determinados.
o Las muestras de mayor tamao migran a lo largo de la columna con mayor
velocidad que las de tamao pequeo.
o Las muestras de menor tamao, entran en los poros y se mueven a lo largo de
la columna lentamente porque tienen que atravesar los laberintos que se
encuentran en el interior de las bolas de polmero en su marcha a lo largo de la
columna.
o Hay diferentes tamaos de partcula para un gel:
a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna.
o Esta tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos,
determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

Caractersticas de las matrices

Deben ser estables.
Tener bajo contenido en grupos inicos.
Uniformidad de poro y tamao.
Los compuestos utilizados pueden ser derivados de:
Dextranos (Sephadex)
Agarosa (Sepharosa)
Acrilamidas (Biogel P)
Esferas de vidrio






Cromatografa de afinidad

Permite la separacin de mezclas por su afinidad o capacidad de unin a un
determinado ligando.
Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unen
especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la
matriz de la columna.
Despus de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eludas a
travs de la columna, la muestra de inters que ha quedado retenida en la
columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solucin que contiene bien
ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la
protena ligandos de afinidad
Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente sobre el
soporte slido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica de los
solutos-analitos.
Se clasifican segn su:
o Naturaleza -pueden ser macromolculas biolgicas o bien molculas de bajo
peso molecular.
o Actuacin -se fundamenta en la selectividad de la retencin que condiciona
las caractersticas de la cromatografa de afinidad. Se distinguen dos grandes
grupos:
Ligandos especficos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente
a un solo soluto.
Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos
bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.
























Trminos empleados en cromatografa
5

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa.
Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y
posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra.
Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las
partculas de soporte o a las paredes internas de la columa.
Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de
separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.


En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal
(obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un
espectrmetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores)
correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos
existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es
proporcional a la concentracin del analito especfico separado.
Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por
ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.
Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los
componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una
de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase
mvil) se mueve en una direccin definida.
Efluente es la fase mvil que atraviesa la columna.
Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su poder de
dilucin.
Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre
partculas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.


Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase reversa para compuestos fenlicos
Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un
lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o
un fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil
consiste en la muestra que est siendo separada/analizada y el disolvente, que
se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida
de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como el
hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase
reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil se mueve a travs
de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra
interacciona con la fase estacionaria y se separa.
Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de
sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis.
Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular
en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector)
bajo las condiciones fijadas.
Muestra es la materia que va a hacer analizada en la cromatografa. Puede
consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla
es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases que contienen los analitos de
inters es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya
separacin no resulta de inters es llamada residuo.
Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la
fase lquidamvil en cromatografa de lquidos.
Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en el
procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa de silica en la
cromatografa en capa fina.