EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO

Ed Cont Lab Clin 2005;8:49-62

CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA

Jos Mara Hernndez Prez Servicio de Bioqumica, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona

INTRODUCCIN La cromatografa es una antigua tcnica instrumental (Milhail Tswett, 1906) que ha evolucionado enormemente en los ltimos aos, principalmente a partir de la dcada de los setenta, con lo que, inicialmente concebida como mtodo de separacin, ha llegado a convertirse en una fuente inagotable de mtodos de anlisis. Pocos mtodos de anlisis qumico son tan especficos para un analito en particular, ya que tanto las fases previas de extraccin como los procedimientos cromatogrficos son llevados a cabo en funcin del tipo de molcula. El proceso cromatogrfico contempla la separacin de los componentes de una mezcla, para ello, una muestra de la mezcla (o el extracto de una muestra) ser disuelta en una fase mvil (en este caso un lquido). La fase mvil es impulsada a travs de una fase inmvil, que debe ser inmiscible con ella, a la que se conoce como fase estacionaria, y que puede ser slida o lquida (cromatografa lquido-slido o cromatografa lquido-lquido el lquido puede estar embebido o unido a partculas slidas-). Las fases son escogidas de tal forma que los componentes de las muestras presenten diferencias en cuanto a sus propiedades fsicoqumicas (solubilidad, tamao, fuerza inica, polaridad, afinidad, etc.) para cada fase. Las interacciones qumicas entre la fase mvil y la muestra, y entre la muestra y la fase estacionaria, determinan el grado de migracin y separacin de los compuestos contenidos en la muestra. Un componente que interacte ms con la fase estacionaria realizar un "viaje" ms largo a travs de ella que otro componente que tenga ms interaccin con la fase mvil. Como resultado de estas diferencias en la movilidad de los componentes de una muestra estos se separarn uno de otro. En la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) la muestra es inyectada en el seno de la fase mvil, donde es soluble, y es transportada a travs de una columna por el flujo continuo de fase mvil a alta presin. La fase estacionaria est formada por partculas de pequeo dimetro, por tanto, con una gran superficie de interaccin, contenidas en la columna. Este proceso cintico es conocido con el nombre de elucin. La velocidad a la que un analito se mueve a travs de la columna, con respecto a los dems presentes en la mezcla, est determinada por el tiempo que permanece en la fase mvil.

Aplicaciones La HPLC se puede utilizar como tcnica preparativa y como tcnica analtica, permitiendo la purificacin, identificacin y cuantificacin del analito deseado. La eleccin de la fase estacionaria y la fase mvil, del flujo al que se va a impulsar la fase mvil a travs de la fase estacionaria e incluso de la temperatura a la que se va a realizar la cromatografa, permitirn una correcta separacin del analito de otros compuestos. Cada componente de una solucin tiene unas caractersticas determinadas bajo ciertas condiciones cromatogrficas, y debe conseguirse que la migracin del componente y de los contaminantes a travs de la columna sea lo suficientemente distinta para que dicho compuesto sea separado de los dems del extracto, para permitir su posterior identificacin y cuantificacin. A este proceso se le denomina purificacin. La identificacin de compuestos es la parte ms importante de muchos trabajos en HPLC. Para identificar compuestos se debe seleccionar un sistema de deteccin que mida diferentes propiedades fsico-qumicas de la molcula. Entra en juego el tipo de separacin y la naturaleza de la deteccin, sea absorbancia, conductividad, fluorescencia, relacin masa/carga, etc. En la cromatografa lquida, la fase mvil eluye de la columna durante un tiempo determinado conteniendo cantidades muy diferentes de solutos que pasan a travs de un sistema de deteccin. El instrumento detecta la presencia del soluto que es convertida en una seal elctrica y sta puede ser tratada por un procesador de datos. Se representa la seal obtenida frente al tiempo o al volumen de elucin, y al grfico obtenido se le conoce como cromatograma. Los solutos se representan grficamente como una serie de picos que pueden

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identificarse por su anchura, altura o rea. Para la cuantificacin de compuestos se utiliza la seal del detector haciendo que sea proporcional a la cantidad o a la concentracin inyectada de analito. Es preciso confeccionar previamente una curva de calibracin para establecer el factor de respuesta como la pendiente de la medida del detector frente a las concentraciones de los calibradores. Para ello se realiza la inyeccin de una serie de soluciones del compuesto con concentraciones conocidas para su deteccin. Los cromatogramas obtenidos muestran una serie de picos cuyas reas se correlacionan con la concentracin del compuesto inyectado. Se puede tambin trabajar con estandarizacin interna donde, tanto a los compuestos con concentraciones conocidas como a las muestras a cuantificar, se les aade una cantidad conocida de un segundo compuesto conocido como estndar interno. El rea del estndar interno sirve para estandarizar puesto que las prdidas sufridas durante todo el proceso analtico (extraccin, cromatografa, etc.) son constantes para todos los compuestos. La representacin de la relacin del rea o la altura del analito respecto a la del estndar interno frente a la concentracin del analito proporciona una curva de calibracin que corrige las prdidas analticas.

donde (k') es el factor de retencin o factor de capacidad, que define la velocidad de migracin de un analito en una columna determinada, y () es la relacin de fases. El tiempo que tarda la fase mvil en pasar a travs de la columna se le conoce como (t0) y equivale al tiempo para una sustancia no retenida.

k' =

t R t 0 VR V0 = t0 V0

El volumen de elucin de la fase mvil en el que sale el compuesto de inters se conoce como volumen de retencin (VR), y el tiempo transcurrido desde que el compuesto es inyectado hasta que alcanza el detector es conocido como tiempo de retencin (tR). El volumen de retencin es caracterstico de cada compuesto y est relacionado con la constante de distribucin. Al volumen de fase mvil requerido para eluir una sustancia no retenida se le conoce como (Vm o Vo).

V R = Vm (1 + k)
Cuando el factor de retencin del analito es inferior a 1, la elucin es tan rpida que la determinacin del tiempo de retencin es muy difcil. Factores de retencin muy grandes (superiores a 20) significan que la elucin transcurre durante mucho tiempo. Se considera que un factor de retencin ideal est entre 2 y 6. Para llegar a una separacin ptima entre compuestos, deben obtenerse picos agudos y simtricos. En general, picos con bajo factor de retencin son mejores porque se evita su ensanchamiento cumpliendo mejor las caractersticas deseables (Figura 1). Si se observa la Figura 2, puede verse que para un pico perfectamente simtrico, los segmentos A y B medidos al 10 % de la altura del pico son iguales, por tanto el valor de asimetra (Af) segn la frmula sera de 1:

CONCEPTOS CROMATOGRFICOS Dentro del proceso de elucin se pueden distinguir procesos termodinmicos, relacionados con la capacidad de retencin o la diferente migracin de los componentes de la mezcla, y procesos cinticos, relacionados con la anchura de banda cromatogrfica y, por tanto, de pico cromatogrfico producido por el sistema de procesamiento del detector.

Factor de retencin Considerando un solo analito que se encuentra en equilibrio entre la fase estacionaria y la fase mvil, se define el llamado coeficiente de reparto o constante de distribucin (KD) como la concentracin molar de analito en la fase estacionaria (Cs) dividida por la concentracin molar del analito en la fase mvil (Cm):

Af =

B(10%h ) A(10%h )

KD =

Cs Cm

Para la no existencia de colas, la suma de los segmentos A y B partido por el doble de uno de ellos debera ser 1, siendo (Tf) el factor de cola.

sustituyendo (C) por el nmero de molculas por unidad de volumen:

(10%h )

Tf

A+ B 2A

KD =

Ns Vm Nm Vs

KD = k

k=

KD

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Figura 1. Ensanchamiento de los picos de una cromatografa en funcin del factor de capacidad.

Figura 2. Elementos de un pico cromatogrfico (tR: tiempo de retencin, h: altura del pico, w: anchura del pico, t0: tiempo de un compuesto no retenido).

Eficiencia El modelo del plato terico supone que la columna cromatogrfica contiene gran nmero de capas separadas, llamadas platos tericos. Los equilibrios para la separacin de la muestra entre la fase estacionaria y la fase mvil tienen lugar en estos supuestos platos. El analito se mueve en la

columna por transferencia de fase equilibrada desde un plato hasta otro.

mvil

Los platos son un concepto imaginario que ayuda a entender como funcionan los procesos de separacin en la columna. El modelo proporciona una medida de la eficiencia de la columna, que se puede expresar como el nmero de platos tericos

52 de una columna (N), cuntos ms platos la columna ser ms eficiente. O como lo que mide cada plato (HEPT, altura equivalente del plato terico), cunto ms pequeo mayor eficiencia. Siendo (L) la longitud de la columna, estos conceptos quedan relacionados de la siguiente forma: HEPT = L / N El nmero de platos tericos que posee una columna real se puede calcular a travs del pico cromatogrfico de un compuesto dado despus de su elucin. El compuesto es, generalmente, un compuesto de prueba con buena separacin que producir un buen pico cromatogrfico. (N) se definido como:

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2 sigma (inflexin del pico) (menos sensible para colas o frentes). Hay que escoger el mtodo que mejor se ajuste a los requerimientos del trabajo y siempre debe utilizarse el mismo a fin de conseguir la mejor reproducibilidad en las medidas para que sean comparables. -

donde (s) es la desviacin estndar del tiempo de retencin. El clculo se realiza sobre la representacin grfica del pico prolongando las tangentes a las curvas descendentes del pico gausiano hasta llegar a cortar el eje de las x en dos puntos (Figura 3). Estadsticamente, la distancia entre los puntos donde las tangentes cortan la lnea de base corresponde a 4 desviaciones estndar (s o sigma). Tericamente, la anchura de un pico gausiano (Wh) a la mitad de su altura corresponde a 2,354 desviaciones estndar y, por tanto, s2 = [w1/2 / 2,354] 2 que conducir a la frmula ms conocida para calcular (N) a la mitad de la altura del pico:
2 5,54 t R N= w12/ 2

Figura 3. Mtodos basados en la simetra gausiana para la medida y el clculo de la eficiencia de una columna.

Teora cromatogrfica de las relaciones Una descripcin ms real del proceso dentro de la columna debe tener en cuenta el tiempo transcurrido para equilibrar el soluto entre la fase estacionaria y la fase mvil (en contra del modelo del plato, que asume que el equilibrio es infinitamente rpido). La forma resultante de un pico cromatogrfico se ve afectada por la velocidad de elucin, que es consecuencia de las posibles diferentes vas que las molculas de soluto toman en su camino entre las partculas de la fase estacionaria. Si se consideran los distintos mecanismos que contribuyen al ensanchamiento de los picos, se llega a la ecuacin de Van Deemter para la altura del plato:

donde (w1/2) es la anchura del pico a la mitad de su altura. Hay una serie de mtodos usados para la medida y el clculo de la eficiencia de una columna mediante la medida de la anchura y la simetra del pico a diferentes niveles. Referimos en orden de sensibilidad son (Figura 3): Medida basada en la asimetra (ms sensible para colas o frentes), 5 sigma (altura al 4,4 % de la columna), 4 sigma (altura al 13,4 % de la columna), tangente del pico respeto a la lnea base, 3 sigma (altura al 32,4 % de la columna), 1/2 altura,

H = ( A + B) /(u + Cu )

Altura del pico (%)

N=

2 tR s2

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Donde (u) es la media de la velocidad de la fase mvil, y (A), (B) y (C) son distintos factores que contribuyen al ensanchamiento de la banda: Difusin de Eddy (A). Las molculas de soluto (fase mvil) toman diferentes caminos al azar a travs de la fase estacionaria. Esto puede causar el ensanchamiento del pico porque los diferentes caminos son de longitudes distintas. Difusin longitudinal (B). La concentracin de analito es menor en los extremos de la columna que en el centro. Esto causa un cierto ensanchamiento del pico. Si la velocidad de la fase mvil es alta entonces el analito pasa menos tiempo en la columna, lo que disminuye el efecto de la difusin longitudinal. Resistencia a la transferencia de masa (C). El analito requiere una determinada cantidad de tiempo para conseguir el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase mvil. Si la velocidad de la fase mvil es alta, y el analito tiene una gran afinidad por la fase estacionaria, entonces el analito en la fase mvil se mover por delante del analito que queda en la fase estacionaria. El pico del analito se ensanchar. Cunto mayor sea la velocidad de la fase mvil, mayor ser el ensanchamiento producido.

Normalmente, se puede controlar la selectividad variando las caractersticas del sistema, tales como la composicin de la fase mvil (pH, fuerza inica, solvente orgnico modificador), la forma de elucin (constante o en gradiente) o el tipo de columna. La resolucin (RS) es el parmetro que indica la calidad de una separacin, como una medida numrica de la separacin entre dos compuestos, y se define como:

RS =

V2 V1 1 2(W1 + W2 )

Donde (Vi) es el volumen de retencin de cada compuesto y (Wi) la anchura de cada pico (Figura 5). Hay tres parmetros fundamentales que influyen en la resolucin de una separacin cromatogrfica: la eficiencia de la columna (expresada en nmero de platos tericos), la selectividad y el factor de retencin:

N 1 k' RS = 4 1+ k'
En general, es recomendable intentar maximizar estos tres parmetros, existiendo varias estrategias para ello: Aumentar el nmero de platos tericos reduciendo el tamao de las partculas de la fase estacionaria. Los picos se estrecharn (menor ancho de banda) y los tiempos de retencin no variarn pero se resolvern. Aumentar el factor de retencin modificando la composicin de la fase mvil o la superficie de interaccin de la fase estacionaria o la temperatura de elucin. Los tiempos de retencin cambiarn y los picos sern tambin ms anchos. Aumentar la selectividad modificando la fase mvil o la fase estacionaria, modificando la temperatura de la columna, o aadiendo sustancias qumicas que se unen con alguno de los solutos en la fase estacionaria. La selectividad puede ser manipulada de modo muy similar al factor de retencin porque depende de l, la diferencia es que mientras ste contempla las caractersticas termodinmicas de un pico la selectividad lo hace de los dos a separar.

En la Figura 4 se representa grficamente la ecuacin de Van Deemter. La expresin de la relacin entre la velocidad de la fase mvil y la altura del plato es til para establecer el flujo ptimo de la fase mvil. Para calcular la eficiencia de la columna tambin puede usarse la ecuacin de Knox:

h=

2 1/ 3 v +v + 10 v

donde (h) es la altura reducida del plato y es igual a (H / dp), siendo (H) la altura del plato terico y (dp) el dimetro medio de las partculas, y (v) velocidad reducida de la fase mvil.

Selectividad y resolucin Se define como selectividad () a la capacidad de separacin de dos analitos en la columna, considerando el tiempo de retencin (o volumen de retencin) de los mximos de los picos para cada analito.

k2 t 2 t 0 V2 V0 = = k1 t1 t 0 V1 V0

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Figura 4. Representacin de Van Deemter para establecer el flujo ptimo de la fase mvil.

Figura 5. Definicin de la resolucin de una separacin entre dos picos cromatogrficos.

TIPOS DE CROMATOGRAFA El tipo de cromatografa en HPLC viene determinado por la fase mvil y, fundamentalmente, por la fase estacionaria. Existen diferentes tipos de fase estacionaria disponibles en forma de soportes de distintos materiales (polmeros, carbn, hidroxiapatita, agarosa o slica) contenidos en una columna. Pueden ser de diferentes tamaos, dimetros, tamaos de poro, o que tengan unidos diferentes

compuestos activos (antgenos, grupos qumicos, grupos polares).

anticuerpos,

Lquido-Slido, se basa en la polaridad. Los compuestos que poseen grupos funcionales capaces de producir enlaces fuertes de hidrgeno se unirn ms fuertemente a la fase estacionaria que los compuestos menos polares. As, los compuestos menos polares eluirn de la columna ms rpidamente que los altamente polares.

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Lquido-Lquido, tambin se basa en la polaridad. Sin embargo, esta tcnica es ms apropiada para muestras de mediana polaridad que son solubles en disolventes de dbil polaridad a polares orgnicos. La separacin de noelectrolitos se consigue teniendo en cuenta las polaridades de muestra y fase estacionaria y usando una fase mvil que posea una polaridad marcadamente diferente. Filtracin en gel, se basa en el tamao molecular de los compuestos que van a ser analizados. La fase estacionaria est formada por partculas porosas (slica, no-slica). Los componentes de mayor tamao sern excluidos del interior de las bolas y as eluirn primero. Los compuestos ms pequeos podrn entrar en las partculas y eluirn de acuerdo con su capacidad para salir de los poros en los que fueron internados. Fase normal, se basa en la hidrofilia y la lipofilia usando una fase estacionaria polar y una fase mvil menos polar. As, los compuestos hidrofbicos eluyen ms rpidamente que los hidroflicos. La fase est constituida por una matriz de slica a la que se unen grupos silanol, amino y nitrilo que le confieren polaridad relativa respecto a la fase mvil. Fase reversa, tambin se basa en la hidrofilia y la lipofilia. La fase estacionaria consiste en una matriz de slica empacada que lleva unida covalentemente una cadena alqulica de ncarbonos (por ejemplo, C-8 significa que se incorpora una cadena octil y C-18 una octadecil). La ms hidrofbica es, en este caso, la fase estacionaria, eluyendo los compuestos hidroflicos ms rpidamente que los hidrofbicos, que interaccionan con la fase estacionaria. Tambin hay empaquetamientos polimricos alternativos a la slice que ofrecen similares caractersticas con mayor resistencia dinmica y ms amplio rango de estabilidad de pH. Existen dos variantes de la cromatografa en fase reversa: Supresin inica, se utiliza modificando el pH de la fase mvil para cidos y bases dbiles, de forma que el analito pasa a ser ms lipfilo y se mejora la separacin porque se establece ms interaccin con la columna. Formacin de pares inicos, se utiliza para compuestos que tienen grupos funcionales biolgicos que sern unidos a un contrain. El contrain se asocia al analito y lo desplaza del par inico normal (corrientemente Na+ o Cl-) mejorando su hidrofobicidad. Para analitos catinicos se utilizan grupos alquil o aril sulfonatos y para analitos aninicos aminas cuaternarias.

Intercambio inico, se basa en el intercambio selectivo de iones de la muestra por sus diferencias en signo y magnitud de carga inica frente a los contraiones de la fase estacionaria. Se trata de columnas que contienen grupos funcionales que soportan cargas unidos a una matriz polimrica. Los iones funcionales estn permanentemente unidos a la columna y cada uno tiene su contrain unido. La muestra es retenida porque reemplaza los contraiones de la fase estacionaria con sus propios iones. La muestra es eluida de la columna por cambio en las propiedades (pH, fuerza inica) de la fase mvil, haciendo que esta desplace los iones de la muestra de la fase estacionaria. Afinidad, usa biomolculas inmovilizadas que tienen una afinidad especfica hacia el compuesto de inters. La separacin ocurre cuando la fase mvil y la muestra pasan a travs de la fase estacionaria. El compuesto o compuestos de inters de la muestra son retenidos mientras el resto de las impurezas y la fase mvil pasa a travs. Los compuestos son luego eluidos cambiando las condiciones de la fase mvil (fuerza inica, pH, sustancis caotrpicas).

ELUCIN En funcin de la composicin de la fase mvil inyectada a la columna, la elucin de molculas puede ser de dos tipos: isocrtica y en gradiente. Tambin existen casos en los que se cambia totalmente la fase mvil en el transcurso de la cromatografa y se conoce como elucin politptica.

Elucin isocrtica Los compuestos eluyen usando una fase mvil de composicin constante durante toda la cromatografa. Todos los compuestos acaban migrando a travs de la columna hasta el final. Sin embargo, cada uno migra con una velocidad diferente, resultando en una relacin de elucin ms rpida o ms lenta. Este tipo de elucin es bastante simple y barato, pero la resolucin de algunos compuestos es cuestionable y el eluido puede no ser obtenido en un plazo de tiempo adecuado.

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La separacin de los compuestos mediante elucin isocrtica puede describirse utilizando las siguientes ecuaciones: Tiempo de retencin Factor de capacidad

descrita por la pendiente del gradiente como ( / tG) dnde (G) simboliza la progresin del gradiente

Resolucin Rs = (1 / 4) (( 1) )N 1 / 2 [k ' / (1 + k ')]

t R = t 0 k '+t 0 k ' = (t R t 0 ) / t 0

G=

t 0 .S tG

Elucin en gradiente Los diferentes compuestos son eluidos modificando gradualmente la composicin de la fase mvil durante el transcurso de la cromatografa (aumentando la fuerza inica, modificando la polaridad, etc.). El resultado sobre la elucin es un acortamiento de los tiempos de retencin, el factor de retencin disminuye conforme aumenta la variacin de flujo del gradiente y el compuesto eluye. Este gradiente puede llevarse a cabo de forma lineal o escalonada o linealmente escalonada. La prediccin mediante ecuaciones que describan la separacin de componentes por elucin en gradiente es muy compleja, por lo que se parte de las ecuaciones empleadas para la isocrtica y se adaptan casi empricamente. La relacin del cambio de la composicin de la fase mvil durante el transcurso de la elucin en gradiente puede ser

siendo () el volumen de fase del modificador, (tG) el tiempo del gradiente, (S) la pendiente del (ln k') frente a () (o la relacin lineal de fuerza del solvente). Tiempo de retencin

tg = t 0 k log 2,3 k 0 / k

Factor de capacidad k = t G / St 0 = t G F / SVm Resolucin R = (1 / 4) ( 1) ( ) N 1 / 2 k / 1 + k

][ (

)]

En el caso de que converjan diferentes solutos, los valores de gradientes (G) para los diferentes solutos no sern idnticos, ya que (G) es proporcional a (S). Cuando la concentracin de gradiente es lineal, el gradiente (G) es constante durante toda la elucin.

INSTRUMENTACIN En la Figura 6 se representan los elementos esenciales que forman parte de un equipo de HPLC.

Figura 6. Elementos de un equipo de HPLC.

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Columna En HPLC se usan diversos tipos de columnas secundarias que se asocian a la columna de separacin con otros fines especficos: Precolumnas: se colocan antes de la columna de separacin y sirven como factor de proteccin que prolonga la vida y el uso de la columna separativa. Estn diseadas para filtrar y retirar: 1) partculas que obstruyan la columna de separacin; 2) compuestos e iones que pudieran aumentar el ruido de fondo, disminuyendo la resolucin y la sensibilidad, y creando falsos picos; 3) compuestos que podran causar precipitacin en contacto con la fase estacionaria o la fase mvil y 4) compuestos que podran co-eluir y causar picos extraos e interferir con la deteccin y cuantificacin. Este tipo de columnas deben ser cambiadas regularmente con el fin de optimizar sus funciones protectoras. Columnas para derivatizar (pre- o postcolumna separativa): son columnas que modifican qumicamente el compuesto a una molcula con el que se van a obtener datos potencialmente tangibles que pueden complementar a otros resultados analizados anteriormente. Acetilacin, sililacin o hidrlisis cida son algunas tcnicas de derivatizacin.

Columnas de microcalibre y de calibre estrecho: se usan para pequeos volmenes de muestra. El dimetro tpico es de 1-2 mm. Como en las columnas capilares, los instrumentos deben ser modificados para acomodarse a la pequea capacidad de estas columnas. Sin embargo, excepto la ventaja de la pequea cantidad de muestra y de volumen de la fase mvil, no se ha notado un incremento en la sensibilidad a la cantidad de materia inyectada sin prdida significativa en la resolucin. Columnas estndar: son las que se usan comnmente. Su tamao ms habitual es de 2,4 mm de dimetro y 250 mm de largo, con un tamao de partcula de 5 m de dimetro (Figura 7-a). Las partculas pueden ser de slica o de otros polmeros especiales que les confiere resistencia a determinadas condiciones (pH extremos) y a su vez pueden ser de forma esfrica o irregular (Figura 7-a y 7-b). Las partculas son de naturaleza porosa a fin de aumentar mucho la superficie de interaccin con los analitos, y dado que tambin influye en la separacin, se tiene en cuenta el dimetro de poro. Hay variaciones, pero los poros de las partculas suelen ser de entre 100 y 300 (Figura 7-c). Columnas rpidas: la razn principal para usar estas columnas es aumentar el nmero de muestras que se pueden procesar en un tiempo dado. Para muchas columnas, incrementando el flujo o la relacin de migracin a travs de la fase estacionaria se afectar adversamente la resolucin y la separacin. As pues, las columnas rpidas se disean para rebajar el tiempo sin llegar a significativas desviaciones en los resultados. Estas columnas tienen el mismo dimetro interno pero son mucho ms cortas que la mayora de las columnas, y estn empacadas con pequeas partculas que son tpicamente de 3 m de dimetro. Las ventajas incluyen incremento de la sensibilidad, descenso en el tiempo de anlisis, descenso en la fase mvil usada, e incremento en la reproducibilidad. Columnas preparativas: son columnas utilizadas con el objeto de permitir purificar grandes cantidades de muestra (mg). Una columna preparativa normalmente tiene un gran dimetro porque est diseada para facilitar grandes volmenes de inyeccin.

En las columnas analticas es en las que realmente se lleva a cabo la separacin. En la Tabla 1 se citan los distintos tipos. Columnas capilares: los avances en HPLC han llevado a estas pequeas columnas analticas, tambin conocidas como microcolumnas. Las columnas capilares tienen un dimetro menor a 1 mm, y hay de tres tipos: tubular abierto, parcialmente empacadas, y fuertemente empacadas. Estas columnas permiten trabajar con volmenes de muestra de nL, disminuyendo el flujo y el volumen de solvente usado lo que puede llevar a una disminucin de los costes. Sin embargo, la mayora de las condiciones y la instrumentacin deben ser miniaturizados, la relacin de flujo puede ser difcil de reproducir, el gradiente de elucin no es tan eficiente, y se debe tener mucho cuidado cuando se cargan volmenes de muestra tan pequeos.

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Tipo Capilar

Dimetro (mm) 0,075 0,15 0,30 0,50

Relacin de flujo (L/min) 0,25 1,0 5,0 10 25 - 50 100 - 300 500 - 1.500 2.500 - 7.500 10.000 - 30.000

Capacidad de muestra (g) 0,05 0,2 1,0 2,0 0,05 - 10 0,2 - 50 1 - 200 1.000 5.000

Mxima carga de muestra (mg) 10 50 200

Microcalibre Calibre estrecho Analtica Semi-preparativa Preparativa

1,0 2,1 4,6 10 22

Tabla 1. Caractersticas de los distintos tipos de columnas.

Figura 7. Distintos tipos de partculas de las columnas estndar (a) forma esfrica, (b) forma irregular y (c) tamao de poro entre 100 y 300 .

Inyector El inyector para HPLC consiste normalmente en una vlvula de inyeccin y un bucle. Un pequeo volumen de muestra (previamente disuelta) se carga en una jeringa y es inyectada en el bucle por la vlvula de inyeccin. Un giro del rotor de la vlvula cierra la vlvula y pone en comunicacin el bucle que contiene la muestra con la corriente de fase mvil que va de la bomba a la columna. El volumen del bucle determina la cantidad inyectada y puede ir desde 5 L hasta 500 L. La inyeccin a flujo parado es un mtodo especial por el cual la bomba se detiene para realizar la inyeccin a presin atmosfrica, este sistema se utiliza cuando se trabaja a muy alta presin.

separacin con la columna est cerrada, y el pistn aspira el solvente del reservorio de la fase mvil. En la carrera hacia delante, la bomba empuja el solvente hacia la columna desde el reservorio. Se puede conseguir un amplio rango de flujos alterando el volumen de la carrera del pistn durante cada ciclo, o alterando la frecuencia con que ste realiza una carrera. La presencia de dobles y triples cabezas de bomba constante en idnticas unidades de cmara de pistn que operan a 180 o 120 grados fuera de fase, permiten un bombeo significativamente suave porque se llena una bomba mientras la otra est en el ciclo de expulsin. Bombas tipo jeringa: son ms adecuadas para pequeas columnas porque expulsan solo un volumen finito de fase mvil antes de rellenarse. Estas bombas tienen un volumen de 250 a 500 mL. Operan mediante un tornillo conductor motorizado que bombea fase mvil a la columna a flujo constante. La velocidad de flujo de expulsin se controla cambiando el voltaje del motor.

Bomba Bombas de pistn recproco: constan de un pistn conducido por una leva unida a un pequeo motor que se mueve rpidamente atrs y adelante en una cmara hidrulica variando su volumen entre 35-400 L. En la carrera atrs, la vlvula de

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Bombas de presin constante: la fase mvil es conducida a travs de la columna mediante la presin de un cilindro de gas. Una fuente de gas a baja presin se necesita para generar altas presiones en el lquido. La disposicin de las vlvulas permite rellenar rpidamente la cmara del solvente cuya capacidad est sobre los 70 mL, proporcionando relaciones de flujo de fase mvil continuas.

Detector Los detectores utilizados para HPLC siempre trabajan bajo condiciones de flujo continuo, la muestra disuelta en la fase mvil atraviesa una celda de flujo en la que es detectada. Normalmente, las muestras llegan en cantidades de ng al detector, pero en anlisis de trazas, esta cantidad puede llegar a ser de fg e incluso de muy pocas molculas. La respuesta del detector al paso de la sustancia est basada en un amplio rango de caractersticas fsicas y qumicas de las sustancias. Es por esto que no existe un detector universal, sino que cada sustancia, en principio, debe analizarse con el detector ms adecuado dependiendo de su naturaleza fsico-qumica, del tipo de anlisis que se lleve a cabo y del tipo de instrumentacin de la que se disponga. Los detectores ms ampliamente utilizados se basan en: ndice de refraccin. El ndice de refraccin de la fase mvil vara cuando eluye la sustancia, es en principio universal, pero de pobre sensibilidad. Viscosidad. Absorcin molecular en ultravioleta y visible. Pueden ser de (a) longitud de onda fija, slo se detectan analitos que absorban a unas determinadas longitudes de onda, en el caso de que no absorban deben derivatizarse para cambiar su espectro de absorcin molecular a esas longitudes; (b) de longitud de onda variable, se puede seleccionar cualquier longitud de onda; y (c) de dispositivo de diodos (diode array), proporcionan un espectro completo por unidad de tiempo. La luz policromtica pasa a travs de la celda de flujo y la luz trasmitida es dispersada por una red y dirigida al dispositivo de fotodiodos. Permite la cuantificacin por supresin espectral, aunque el pico de inters no este bien resuelto, y la identificacin de sustancias por su espectro caracterstico. Fluorescencia. Ocurre cuando una molcula absorbe luz excitndose y emitindola a otra longitud de onda mayor que puede ser detectada especficamente. Es muy sensible -

pero muchas sustancias tienen que ser derivatizadas para convertirse en fluorescentes mediante modificaciones qumicas. Conductividad (electroqumicos). La muestra es oxidada o reducida en la superficie de un electrodo a potencial constante, y pueden ser potenciados por coulometra. Radioactividad. Luz dispersada tras evaporacin. Funciona midiendo la luz dispersada por partculas slidas del soluto despus de la nebulizacin y evaporacin de la fase mvil. Espectrometra de masas. Se utiliza la relacin masa/carga de las sustancias eludas y es aplicable a cualquier analito. Es el detector ms sensible, selectivo y universal, pero de coste todava elevado. Para cromatografa lquida se utilizan detectores cuadrupolares o detectores hbridos con acoplamientos a presin atmosfrica como son fuentes APCI (ionizacin qumica a presin atmosfrica) o fuentes ESI (electroespray)

Cualquiera que sea el principio de operacin, un detector ideal debe ser altamente sensible, de respuesta rpida y debe asegurar un bajo nivel de ruido y suciedad (particularmente crucial en el anlisis de trazas). La sensibilidad es una de las propiedades ms importantes del detector de cromatografa lquida. Es una medida de su capacidad para discriminar entre pequeas diferencias en la concentracin del analito y viene representado por la pendiente de la lnea de calibracin. Tambin es dependiente de la imprecisin de las medidas. El aumento de la pendiente de la curva de calibracin es el aumento de sensibilidad del detector para un componente en particular, pero altas fluctuaciones de las medidas rebajarn la sensibilidad. Los picos que eluyen ms temprano normalmente son ms agudos, mientras que los que tienen tiempos de retencin ms largos son ms anchos y algunas veces es difcil discernirlos del ruido. La definicin de respuesta del detector depende de s es sensible a la masa o sensible a la concentracin. Para los detectores sensibles a la masa, la respuesta (R) viene dada por la siguiente relacin:

R=

hw sM

donde (h) es la altura del pico, en mV; (w) la anchura del pico a 0,607 cm de la altura, en cm;

60 (s) la velocidad de registro, en cm/min; y (M) la masa de soluto inyectada, en ng (puede ir de g a pg). Para los detectores sensibles a la concentracin, la respuesta puede ser calculada usando la frmula siguiente:

JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia

cuantificacin de las cantidades de las trazas con menos de un 2 % de variacin. Otro parmetro relacionado con la fluctuacin de la seal es la deriva. La lnea de base debera desviarse tan poco como sea posible de una lnea horizontal. Se mide normalmente durante un tiempo especfico (30 min o 1 h). La deriva, por lo general, esta asociada al calentamiento del detector en la primera hora despus de la puesta en marcha. En la Figura 8 se ilustra un ejemplo de lo comentado, indicando el nivel de ruido de una lnea de base (medida a la ms alta sensibilidad del detector) y los picos ms pequeos que pueden ser inequvocamente detectados, as como la deriva de la seal. El diseo de la clula de flujo tambin es un factor importante. Las lentes proveen un enfoque del haz de luz en el centro de la celda. Unas lentes colectoras post-celda enfocan la totalidad de la luz desde la celda en el fotodetector. Tambin se debe considerar la resolucin del detector o nmero de medidas por unidad de tiempo que produce, en los sistemas modernos se provee una alta resolucin en un corto espacio de tiempo. Si se considera una columna con 10.000 platos tericos y 15 cm de longitud, los componentes eluidos en 2 min (2 mL a 1 mL/min de flujo) podran contenerse idealmente en picos de 80 L de ancho. De esta forma, teniendo una celda de flujo de 20 L de volumen slo se podran hacer 4 medidas independientes para este pico. Definitivamente, esto no es bastante para describir correctamente la forma del pico y se debera aumentar el nmero de medidas. Otra caracterstica importante de la celda de flujo es compensar el efecto de la refraccin. Cuando los componentes de la mezcla pasan a travs de la celda de flujo pueden modificar la composicin del eluyente con lo que se puede llegar a cambiar el coeficiente de refraccin. Si el haz de luz no es paralelo, el cambio en la refraccin cambiar la luz y contribuir en lecturas de absorcin aparentes. Si el volumen de la celda de flujo es > 1/10 del volumen del pico, o si la geometra de la celda no ha sido optimizada, se puede apreciar un ensanchamiento aparente de los picos. Como el rea del pico es proporcional a la cantidad de analito inyectada, el ensanchamiento del pico causa la reduccin de su altura. En caso de ensanchamiento aparente del pico por volumen de la celda excesivo, si la geometra de la celda se optimiza no se debera observar una reduccin significativa de la altura.

R=

h w F sM

donde (F) es el flujo, en mL/min. Se considera que la respuesta del detector es lineal cuando la diferencia en la respuesta para dos concentraciones de un determinado compuesto es proporcional a la diferencia de concentracin en las dos muestras. La regresin lineal de las respuestas de los calibradores frente a las concentraciones da un buen ajuste con (r2) cercano a 1 apareciendo como una curva de calibracin en lnea recta. El rango dinmico del detector es la mxima respuesta lineal dividida por el ruido del detector. La mayora de los detectores se convierten en nolineales cuando el tamao de la muestra se incrementa y este lmite de linealidad debe estar bien definido. En HPLC el proceso es dependiente del tiempo. La aparicin del componente eluido de la columna en el detector es representada por el punto de inflexin en la lnea de base del cromatograma. Es un problema distinguir entre el componente y artefactos causados por la fluctuacin de la presin o de la composicin, burbujas, etc. Si los picos son bastante grandes, no hay problema para distinguirlos. Sin embargo, para los picos ms pequeos, es muy importante que la lnea de base no presente altibajos, est libre de ruido y de deriva. El ruido de la lnea de base son pequeas variaciones de la lnea en tiempos muy cortos, sobre una lnea de base recta, causada por fluctuaciones de la seal elctrica, por inestabilidad de la lmpara, por fluctuaciones de temperatura u otros factores. El ruido es un factor que limita la sensibilidad del detector. En el anlisis de trazas, se debe distinguir ente los picos del ruido y los picos de los componentes. Un lmite prctico para ello es 3 x relacin seal-ruido, pero slo con fines cualitativos. En la prctica el lmite de deteccin cuantitativo puede se escogido como 10 x relacin seal-ruido. Esto asegura la correcta

JM. Hernndez. Cromatografa lquida de alta eficacia

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Figura 8. Esquematizacin de los fenmeno de ruido y deriva.

Regulador de contrapresin El regulador de contrapresin se sita inmediatamente despus del detector. Se disea para aplicar una presin constante a la salida del detector que previene la formacin de burbujas de aire en el sistema. Esto mejora la estabilidad de la lnea de base cromatogrfica. Se proyecta para operar sin tener en cuenta el flujo, la fase mvil o la viscosidad.

Colector de fracciones El colector de fracciones es un dispositivo automtico que recoge uniformemente los eludos a la salida del HPLC. Los viales o tubos son colocados en un carrusel o en una gradilla y el usuario programa el intervalo de tiempo en el que se recolecta cada fraccin. Cada vial contiene fase mvil y fracciones de la muestra en el correspondiente tiempo de elucin.

2. Afinidad. Su poder radica en su selectividad, es profusamente utilizada para separar protenas y anticuerpos con fines preparativos. Incluso clulas con distinta composicin en hidratos de carbono son separadas en columnas de lectinas. Lipoprotenas, como LDLs y VLDLs, tambin pueden separarse mediante columnas de heparina, y glicohemoglobinas mediante columnas de boronato. En general, es aplicable a cualquier aislamiento de una sustancia especfica que pueda llevarse a cabo mediante una reaccin antgeno-anticuerpo, enzima-substrato o metalsustancia. 3. Intercambio inico. Separacin de hemoglobinas, isoenzimas de la creatina-cinasa o la L-lactato-deshidrogenasa y anlisis de aminocidos. Otras aplicaciones van dirigidas a retirar interferencias inicas de otras sustancias para su posterior anlisis por otros mtodos. Un ejemplo es el porfobilingeno en orina que queda retenido en la columna eluyendo las sustancias interferentes, posteriormente se eluye selectivamente y se cuantifica. 4. Filtracin en gel. En la determinacin de las masas molares de macromolculas o como paso previo para evitar interferencias en algn procedimiento de medida enzimtico. 5. Fase reversa (supresin inica y formacin de pares inicos). La cromatografa lquido-lquido es la ms potente en cuanto a aplicaciones clnicas y la ms utilizada en el laboratorio toxicolgico para drogas de abuso (cocana, benzoilegconina, cocaetieleno), anfetaminas, metaanfetaminas y antagonistas o narcticos (naloxona, naltrexona); y en el laboratorio clnico o alimentario para

APLICACIONES CLNICO

EN

EL

LABORATORIO

La HPLC es utilizada en laboratorios clnicos de referencia, muchas veces como tcnica definitiva. Sus aplicaciones son mltiples, algunas de ellas, clasificadas en funcin del tipo de separacin, son: 1. Lquido-slido. Separacin de monoglicridos, diglicridos y triglicridos, y como mtodo preparativo para esteroides o vitaminas antes del posterior radioinmunoanlisis.

Educacin Continuada en el Laboratorio Clnico

Casos Clnicos 2004-05 (8)

vitaminas liposolubles, carotenos, licopenos, etc., y pptidos y protenas para su posterior anlisis por espectrometra de masas. Para la deteccin y monitorizacin de una amplsima variedad de frmacos: - Analgsicos (acetaminofeno), analgsicos narcticos (oxicodona) y analgsicos antiinflamatorios (naproxeno, ibuprofeno, diclofenaco). - Antagonistas (ranitidina, omeprazol). - Antiagregantes (warfarina). - Antiarrtmicos (procainamida, propanolol metoprelol, oxoprenol). - Antibacterianos (sulfadiazina, sulfamerazina, trimetroprim, sulfametoxazol, tetraciclina, minocliclina, demeclociclina). - Antidepresivos tricclicos (doxepina, nordoxepina, nortriptilina, amitriptilina, imipramina, trimipramina, verapamil, norverapamil).

Antirretrovirales (aciclovir, delfinavir, saquinavir). Barbitricos (fenobarbital, butabarbital, butabital, secobarbital). Broncodilatadores (albuterol, teofilina, teobromina, paraxantina, cafena). Frmacos glucocorticoides (prednisolona, betametasona). Hormonas (dosificacin de testosteronas: acetato, propionato y benzoato de testosterona). Pptidos teraputicos (oxitocina, angiotensinas I y II). Queratolticos (cido saliclico, cido benzico). Sedativos (nordiazepam, clordiacepxido, oxacepam, norclordiacepxido) y opiceos (morfina y sus glucornidos, metadona).

BIBLIOGRAFA Armstrong DW. Optical isomer separation by liquid chromatography. Anal Chem 1987;59:84A91A. Bidlingmeyer BA, Warren FV. Column efficiency measurement. Anal Chem 1984;56: 1583-1596. Bright FV. Bioanalytical applications of fluorescence spectroscopy. Anal Chem 1988;60:1031A-1039A. Brown PR, Hartwick RA. High Performance Liquid Chromatography. New York: Wiley Interscience, 1989;1-688. Gelp E. Biomedical and biochemical applications of liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromat 1995;59:59-82. Mant CT, Hodges RS, eds. High-Performance Liquid Chromatography of peptides and proteins: Separations, analysis, and conformation. Boston: CRC Press, 1991;1-960. Synder LR, Stadalius MA, Quarry MA. Gradient elution in reversed-phase HPLC separation of macromolecules. Anal Chem 1983;55:1412-1430. Ullman D, Larry D, Bowers L, Burtis C. Chromatograpy / Mass Spectrometry. En: Tiez Texbook of Clinical Chemistry. W.B. Saunders Company, 3er edition, 1999; 164-204. Waters. Guide to successful operation of your LC system. Waters Corporation Revision 1991;1-214. Willard H, Merritt L, Dean JA, Settle JrFA. Instrumental methods of analysis. Wadsworth Publishing Co, 7th ed., 1988;1-895.

EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO COMIT DE EDUCACIN D. Balsells (presidenta), F. Canalias, R. Ferragut, P. Munujos, M. Rodriguez, MC. Vill