DICOSINO, R.; MCAULIFFE, J.; POULOSE, A. J.; BOHLMANN, G. Uso Industrial de Enzimas Imobilizadas, Chem. Soc. Rev.

, 42, 6437-6474, 2013.

Embora muitos mtodos para a imobilizao de enzimas tm sido descritos em patentes e publicaes, relativamente poucos processos que empregam enzimas imobilizadas foram comercializados com sucesso. O custo da maioria das enzimas industriais , muitas vezes, apenas um componente menor na economia global do processo, e, nestes casos, os custos adicionais associados imobilizao de enzimas, muitas vezes no se justificam. Mais comumente, o benefcio obtido da imobilizao da enzima relaciona-se com as vantagens do processo que um catalisador imobilizado oferece, por exemplo, permitindo a produo contnua, estabilidade melhorada e ausncia do biocatalisador na corrente de produto. O desenvolvimento e os atributos de vrias aplicaes industriais estabelecidas e emergentes para enzimas imobilizadas, incluindo a produo de xarope de alto teor de frutose de milho, a hidrlise da pectina, reduo do sabor amargo de sucos de frutas, interesterificao de leos e gorduras alimentares, produo de biodiesel, e captura de dixido de carbono so aqui revisados, destacando-se os fatores que definem as vantagens da imobilizao de enzimas.

Abaixo, resumo do artigo redigido por Keren Hapuque Pinheiro.

1) Introduo Embora existam vrios mtodos de imobilizao de enzimas e aplicaes patenteadas e descritas na literatura acadmica, apenas alguns procedimentos foram comercializados com sucesso em larga escala. O artigo traz as motivaes para a aceitao comercial das enzimas imobilizadas a partir da anlise do desenvolvimento e caractersticas de vrias aplicaes industriais, ou processos emergentes, destacando os fatores que permitem o sucesso comercial dessas enzimas. Entre as inmeras vantagens das enzimas imobilizadas esto o aproveitamento da atividade cataltica da enzima, operao de forma contnua, separao facilitada do produto, e alta seletividade das reaes. Entretanto, devem-se citar as limitaes de tais aplicaes, como as dificuldades difusionais das mesmas tanto para ligar-se aos substratos, como para a sada dos produtos do interior do biocatalisador. No geral, em relao ao mercado enzimtico, as enzimas imobilizadas possuem uma fatia muito modesta do total, devido s perspectivas diferentes entre produtores e clientes. A reutilizao das enzimas imobilizadas nos processos que as utilizam, segundo os produtores, no os beneficia, apesar de haver meios para agregar valor como a seguridade da propriedade intelectual do processo de imobilizao e aplicao. J para os clientes, estes podem adquirir a enzima de forma solubilizada e promover a imobilizao em suas prprias empresas no causando assim um aumento do setor econmico. Dentro desse contexto entende-se que o desenvolvimento e aplicao de produtos

de enzimas imobilizadas requer um bom entendimento dos fatores tcnicos e econmicos, bem como bom senso das diretrizes que movem o mercado. 2) Glicose Isomerase imobilizada A Glicose Isomerase (GI) uma das principais enzimas industriais comercializadas atualmente por converter eficientemente D-glicose para D-frutose, e os produtos dessa reao serem utilizados como edulcorantes em bebidas e alimentos. A forma imobilizada da Glicose Isomerase (IGI) utilizada em vrias aplicaes comerciais e considerada um paradigma para um produto de enzima imobilizada. A primeira caracterizao da isomerizao da D-glicose por essa enzima foi feita em 1957 por Marshall e Kooi, que a obteve a partir do microrganismo Pseudomonas hydrophila. As variaes de obteno e produo dessa enzima dependem do substrato e seus cofatores, dentre os vrios estudos j realizados e patentes publicadas, ainda esto sendo realizados pesquisas de isomerases de glicose com maior estabilidade trmica, reduzindo a dependncia de ons metlicos para a atividade, menor pH timo e maior resistncia aos ons Ca2+ e outros inibidores. As propriedades bioqumicas da glicose isomerase variam de acordo com o substrato (monossacardeos anmeros), temperatura (favorecimento da frutose em temperaturas maiores de isomerizao), ons (estabilidade e atividade cataltica da enzima), inibidores (xilitol, sorbitol, o manitol e arabitol), entre outros. A atividade da glicose isomerase definida pela Unidade de Glicose Isomerase (GIU), sendo a quantidade de enzima necessria para isomerizar 1 mol de glicose em frutose por minuto, sob condies de ensaio definidas. O mecanismo dessa isomerizao pode ser classificado de vrias formas, entretanto, vrios estudos ainda esto sendo feitos que utilizam uma combinao de nutrons e difrao de raios-X para a compreenso do mecanismo cataltico, porm aspectos essenciais, tais como a rota exata pelo qual o tomo de hidrognio move-se entre os carbonos do substrato, permanecem a ser elucidados. 2.1) Mtodos para imobilizao da Glicose Isomerase (GI) Muitos mtodos para a imobilizao da GI tm sido desenvolvidos e comercializados ao longo dos anos. A imobilizao de GI foi considerada uma tecnologia madura ao final dos anos 1970, quando mais de seis produtos distintos de glicose isomerase foram lanados no mercado. Nos ltimos anos, tem havido uma consolidao dessa tcnica impulsionada pelo processo econmico de imobilizao dessa

enzima e pela utilizao da GI pelos produtores de HFCS (Xarope de milho com alto teor de frutose). 2.1.1 Preparao de clulas inteiras com ligaes cruzadas Imobilizao de clulas inteiras para a produo de IGI foi inicialmente demonstrada por Takasaki e Kamibayshi usando uma tcnica de heat-fixation (fixao por temperatura). As clulas de Streptomyces sp foram submetidas a elevadas temperaturas (60 a 80 C) durante curtos perodos de tempo, levando a uma matriz com ligaes cruzadas de protena celular desnaturada e outros componentes. Uma Companhia de Processamento de Milho denominada Clinton introduziu um processo descontnuo para isomerizao de glicose com base no mtodo de Takasaki em 1967. Este processo converteu o xarope de glicose de milho em uma mistura contendo 42% de frutose. Tcnicas qumicas de fixao tambm foram utilizadas ao mesmo tempo dos mtodos heat-fixation. Tanto cidos orgnicos ou inorgnicos foram utilizados, o Glutaraldedo (soluo 50%) foi determinado como sendo um reagente de fixao muito eficaz, descrita pela primeira vez em 1973, utilizando clulas de Streptomyces olivaceus. Os agentes de floculao tambm foram utilizados em algumas variaes deste mtodo. O Glutaraldedo continua a ser um componente importante dos atuais produtos comerciais incluindo de glicose isomerase Sweetzyme e GenSweet IGI, comercializado pela Novozymes A/S e Genencor (agora DuPont industrial Biosciences). A incorporao de polietilenoamina e carreadores inorgnicos, como a argila bentonitica e terra diatomcea, levou a melhorias na qualidade e no desempenho do produto, e este processo ainda est em uso hoje. O processo de obteno de imobilizao de glicose isomerase em clulas inteiras por ligaes cruzadas segue um processo onde o composto desidratado, extrusado e seco em um secador de leito fluidizado. A IG imobilizada resultante extremamente estvel, com uma meia-vida de mais de 1 ano, quando utilizado num reator de leito fixo, a 60 C. 2.1.2 Mtodos baseados na adsoro Os mtodos de imobilizao de adsoro inica com a imobilizao de IG em resinas foram desenvolvidos em paralelo com os mtodos de clulas inteiras. Embora os procedimentos para liberar e purificar a enzima livre provindas de clulas hospedeiras gerasse uma despesa adicional, existiam vantagens operacionais considerveis associados com as formas fsicas desses produtos.

A adsoro do GI isolado a partir de Streptomyces phaechromogenes a DEAESephadex foi descrita pela primeira vez por Tsmura e colaboradores em 1967. O mtodo foi posteriormente melhorado na medida em que ela tornou-se comercialmente vivel. Os autores tambm descreveram a adsoro de GI em resinas polimricas aninicas, tais como, Amberlite IRA-938. Apesar da elevada densidade cataltica destes produtos, eles apenas podem ser utilizados em reatores de leito raso, devido sua compressibilidade inerente. O processo de carregamento pode ser realizado tanto em modo descontnuo ou coluna. A enzima imobilizada mostrou-se muito estvel, com uma meia-vida de mais de 1800 horas sob as condies de operao da instalao. Uma inovao chave neste mtodo foi a capacidade de regenerar a resina atravs da adio de GI solvel para compensar a perda de atividade da enzima ao longo do tempo. Isto permitiu que o processo possa ser executado sob as condies de fluxo constante, em contraste com os processos alternativos, onde as taxas de fluxo atravs de uma dado leito era necessrio ser reduzido ao longo do tempo, a fim de manter um grau constante de isomerizao de frutose. O modelo de negcio para este produto, atualmente vendido sob o nome comercial GENSWEET SGI da DuPont industrial Biocincias (anteriormente Genencor), tambm foi complicado, com os clientes dando apoio e comprando GI solvel quando necessrio para manter o nvel desejado de atividade enzimtica. Este produto tem sido quase sempre substitudo por GENSWEET IGI, descrito acima. 2.1.3 Ligao covalente para suportes inorgnicos. Mtodos para a ligao covalente da glicose isomerase e de outras enzimas para transportadores inorgnicos, tais como alumina e titnia foram desenvolvidas na Corning Glass Works, no final dos anos 1960 e incio dos anos 1970. A modificao da superfcie do suporte inorgnico atravs de um aminosil foi feita por uma ligao covalente de enzimas, mediada por um reagente de acoplamento, como a carbodiimida. Os materiais resultantes tinham atividades catalticas diferentes e verificou-se uma melhor estabilidade microbiana, em relao a outras formas de Glicose Isomerase Imobilizadas. Muitas patentes foram depositadas sobre variaes neste processo. 2.1.4 Mtodos de Aprisionamento em Matriz O aprisionamento de enzimas livres ou clulas com ligaes cruzadas representa outra abordagem geral para a imobilizao de enzimas. Os primeiros esforos incluram

aprisionamento de isomerase de glicose solvel dentro de fibras de triacetato de celulose e de filmes de colgeno. Gist-Brocades comercializava em 1976 um processo na qual as clulas de Actinoplanes missouriensis com expressivo nmero de GI foram aprisionados dentro de uma matriz de gelatina reticulada com glutaraldedo. O processo comeou com a mistura contendo miclios celular de GI com uma soluo de gelatina em temperatura acima de 40 C, seguido pela adio de um solvente, com agitao, resultando em partculas coaguladas com um dimetro de cerca de um milmetro imiscvel em gua. As partculas foram lavadas com o etanol miscvel em gua e, em seguida, tratada com uma soluo a 2,5% de glutaraldedo em gua fria. Aps lavagem com gua e etanol ou acetona, as partculas foram secas e/ou armazenadas em uma soluo de NaCl contendo 0,3% de formaldedo. O produto foi vendido sob a designao comercial Maxazyme Immob-GI e poderia ser utilizado numa variedade de formatos, incluindo em batelada, reatores de leito fixo e de leito expandido. Foram observadas as meias-vidas de cerca de 500 horas, quando o produto foi utilizado no formato de coluna usando xarope de glicose derivado do milho. 2.1.5 Desenvolvimentos recentes na Imobilizao de Enzimas H vrios estudos sobre a imobilizao da glicose isomerase na literatura, dentre eles, est a imobilizao da GI dentro de redes de polmeros interpenetrantes (IPN) (Demirel e colaboradores). Redes de polmeros interpenetrantes um tipo de hidrogel que compreende uma mistura de dois ou mais polmeros reticulados. Estes polmeros tm sido utilizados em aplicaes biomdicas devido s suas propriedades mecnicas e a alta biocompatibilidade. Isomerase de glicose j foi retido dentro de poli (acrilamida), Oly (acrilamida)--carragena e matrizes de poli (acrilamida)-alginato por polimerizao radical in situ na presena da enzima. As estabilidades das enzimas imobilizadas foram de 82%, 33% e 32% em relao atividade inicial, observadas aps 42 dias de armazenagem a 4 C, respectivamente. Os pHs timos e as temperaturas de processo foram semelhantes enzima livre, mas as resistncias difusionais do processo foram observadas como responsveis pelas propriedades cinticas alteradas nas formas imobilizadas. Modificao de polmeros por superfcies de plasma tem sido utilizada para introduzir funcionalidades reativas para polmeros de outra forma inertes, para permitir posterior imobilizao de enzimas covalente. Alm das modificaes por este gs tambm

foi utilizado tcnicas de sol-gel em slica, vidros de silicato de sol-gel, xerogis de slica, entre outros. Estudos tambm foram feitos com microrganismos do tipo Arthrobacter nicotianea e recombinante de E. coli BL21 (DE3) de estirpe selvagem que produz naturalmente GI e estirpe que expressa o gene A. nicotianea xylA, respectivamente. Os materiais derivados da estirpe de E. coli recombinante exibiu atividade e estabilidade mais elevada, em relao estirpe de A. nicotianea. Nesse estudo os autores notaram que a carga tima da biomassa celular foi de 40-60% (w/w) de E. coli, mas apenas 15% para A. nicotianea, com base na carga mxima para ainda produzir grnulos biocatalisadores com propriedades mecnicas aceitveis. Tambm existem estudos que imobilizam GI e outras enzimas dentro de suportes nanoporosos como a slica mesoporosa (MPS) que tem recebido muita ateno nos ltimos anos. A vantagem de MPS sobre suportes tradicionais refere-se ao tamanho e uniformidade de poro, as reas de superfcie total mais elevada e a organizao hierrquica do material, permitindo a melhoria do transporte de massa entre os poros e a soluo. Ao adaptar o tamanho dos poros e seleo de grupo funcional, Ackerman e seus colaboradores afirmam que possvel induzir mudanas conformacionais favorveis em enzimas imobilizadas. Nos exemplos explicitados so utilizadas para tal imobilizao a adsoro e tcnicas de ligao covalentes, e quando adicionados compostos como uria. O grau de melhoria da atividade especfica foi pronunciada para GI adsorvida em FMS (Amino-functionalized SBA-15), onde um aumento de 128% na atividade foi observada em relao GI solvel no tratada. O material covalentemente imobilizado mostrou um menor grau de reforo, em 90% em relao ao controle. Dentre os fatores observados no processo de imobilizao da GI tambm esto o pr-tratamento de substratos, termoestabilidade e a co-imobilizao com outras enzimas. O pr-tratamento de substrato trabalha com a hiptese de que a ligao do substrato ao local ativo protege a conformao nativa da enzima durante o processo de imobilizao, e estudos mostraram o aumento da atividade enzimtica quando essas enzimas eram prtratadas. O melhoramento da estabilidade trmica tambm foi pesquisado tanto por meio de engenharia proteica quando a partir do descobrimento de novas enzimas. A busca por essas enzimas inovadoras impulsionada pelo fato de que a 90 C possvel produzir do HFCS (High Fructose Corn Syrup) contendo 55% de D-frutose, sem a necessidade de enriquecimento cromatogrfico. Para conseguir tal processo, necessita-se de um pH em

torno de 6, por isso no houve a comercializao das enzimas GI termoestveis. A imobilizao da GI com outras enzimas de atividades enzimticas diferentes oferece a possibilidade de produo direta de xaropes de frutose a partir da glicose ( amido, celulose, etc). Foram feitas a co imobilizao da isomerase de glicose e glicoamilase usando uma tcnica de camada por camada, em que as duas enzimas foram absorvidos sequencialmente ao poliestireno tri metilamina modificado. Verificou se um aumento da cintica da reao e uma diminuio em sua velocidade, isso se d pela atividade em relao ao pH do processo, bem como a possibilidade favorveis efeitos de proximidade no sistema co imobilizao. 3. O processo para obteno da Glicose Isomerase O maior processo que envolve a glicose isomerase imobilizada (IGI) para a produo de HFCS, tanto em termos da quantidade de enzima vendida, bem como o volume de produto produzido. O primeiro processo para a produo enzimtica de HFCS utilizando isomerase de glicose foi desenvolvido em um processo em batelada por Takasaki Tanabe em meados da dcada de 1960. No espao de 10 anos vrias formas imobilizadas do GI tm sido desenvolvidas e comercializadas, assim como diversos formatos de reatores, incluindo tanque agitado, de leito fluidizado, rasos e de leito fixo com profundidade, a escolha dos quais era muitas vezes ditada pela forma da enzima disponvel. O Xarope de D-glicose derivado do milho convertido em uma mistura contendo aproximadamente 42% de D-frutose, 50% de D-glucose, 6% de maltose, 2% de maltotriose e vestgios de outros acares. Maiores concentraes de frutose, tal como o grau de 55% encontrado no HFCS, so derivados de enriquecimento cromatogrfica do grau de 42% a 90% de D-frutose (HFCS-90), que normalmente misturada com HFC-42 para produzir HFCS-55. Em contraste com a produo de etanol, HFCS derivado de operaes de moagem de milho molhado. O processo de obteno resume-se no amido sendo convertido em D-glicose por de liquefao, clarificao (-amilases e glicoamilase), evaporado um teor de slidos secos de 45 a 55% (w/w), assim a glicose encaminhada para uma srie de reatores de leito fixo dispostos de forma paralela e mantida a cerca de 60 C e o grau desejado de isomerizao controlado pela taxa de fluxo e atividade cataltica da IGI. Alm da escala industrial, tambm inmero formatos alternativos para reatores de isomerizao da glicose foram estudados em escala pequena. Foram verificados reatores two impinging jets reactor (TIJR) que tem como princpio a criao de uma regio

turbulenta de fluxo misto (isto , a regio de impacto), trazendo dois fluxos (gs, lquido, slido e as suas misturas) em conjunto dentro de um reator que permitem a reciclagem contnua das correntes. A glicose isomerase imobilizado comercial (SweetzymeT) foi estudada usando um TIJR. A vantagem desta modificao que ela permite que a suspenso de partculas slidas, mesmo baixas taxas de fluxo de massa, aumente o grau de turbulncia e o tempo de residncia das partculas no interior do reator. Resultados comparados a downflow jet loop (DJR) mostrou que a configurao TIJR alcanou converses fracionrios dramaticamente mais elevados tanto para curto (60 s) e maior (120 s) tempo mdio de residncia. O melhor desempenho deste formato TIJR foi atribudo eliminao da resistncia de transferncia de massa externa em torno das partculas de IGI, bem como a mistura de alta intensidade dentro da zona de impacto e do prprio reator. Outros modelos de reatores, combinados ou individualmente, tambm foram estudados como: simulated moving bed (SMB) (combina a reao e a separao do produto), assim como, seios alternativos para a remoo do produto in situ (ISPR- in situ product removal) de frutose a partir de fluxos de HFCS tm tambm sido propostos. Tambm so sugeridos nesse trabalho estudos cinticos da glicose isomerase imobilizada. Apesar da enzima imobilizada ser considerada biocatalisadores robustos tanto de um ponto de vista da produtividade e da estabilidade, a atividade cataltica diminui ao longo do tempo, bem como as propriedades intrnsecas do biocatalisador, tanto fsicos quanto bioqumicos. As propriedades cinticas da IGI foram estudadas por vrios grupos de pesquisa que buscam caracterizar uma srie de propriedades cinticas, incluindo a produtividade e estabilidade do processo, as taxas de inativao trmica, a natureza e os efeitos das restries difusionais, preferncias de substrato e os efeitos de proteo do substrato sobre as taxas de inativao. Sobre as restries difusionais, Dadvar e Sahimi construram um modelo de rede de poros 3D multiescalar, a fim de determinar o grau em que o bloqueio de microporos dentro de granulados de enzima, contribui para a perda de atividade ao longo do tempo. O modelo sugerido revelou que o bloqueio dos poros um fator significativo na perda de atividade, provavelmente atuando em conjunto com outros mecanismos de desnaturao de enzimas. 4 Aplicaes da Glicose Isomerase Imobilizada 4.1 A produo de xarope de milho com alta frutose

A aplicao predominante da glicose isomerase para a isomerizao de D- glicose derivado do milho para D-frutose, sob a forma de xarope de milho com alto teor de frutose (HFCS). HFCS inteiramente produzido utilizando biocatalisadores de glicose isomerase imobilizados em larga escala, superior a 107 toneladas por ano HFCS. Os principais produtores atuais de IGI so DuPont industrial Biocincias (anteriormente Genencor) e a Novozymes A/S. Outro fator-chave foi a alta do preo da sacarose na de dcada de 70 sendo substitudo pela D-frutose, sob a forma de xarope de milho rico em frutose 42% (HFCS), ultrapassando em 1978 a utilizao da sacarose como adoante. A tecnologia para a produo de HFCS havia melhorado a ponto de fabricao de 55% HFCS levando a adoo pela maioria das empresas de bebidas, incluindo Coca-Cola e Pepsi Co em 1984. Em anlise de peso de D-frutose esta 160% mais doce do que a sacarose e mais de duas vezes mais doce do que a D-glicose. Nos ltimos anos, os produtos base de frutose, coletivamente denominados como xarope de milho de alta frutose (HFCS), renunciaram alguma quota de mercado, em parte devido a preocupaes sobre os nveis de consumo e uma associao percebida com a obesidade. Outros apontam as vantagens de adoantes HFC, por exemplo, D-frutose ter um maior efeito adoante em relao sacarose e ter o menor ndice glicmico dos acares simples. A IGI no so utilizadas somente separadas nos processos, estudos tem sido feitos utilizando a Glicose Isomerase em conjunto com a lactase para adoar D-lactose. Outras aplicaes da glicose isomerase imobilizada tem sido utilizada para aumentar a converso de acares derivados da biomassa celulsica para etanol. Na produo de etanol, a despolimerizao de hemiceluloses gera acares pentoses incluindo D-xilose, que no so facilmente fermentados em etanol pela levedura utilizada. Por isso, vrios estudos tm sido feitos e constatado que a glicose isomerase solvel, foi mais eficaz em termos da quantidade de etanol produzido a partir de uma soluo de xilose a 5%, no entanto, apenas com a presena de albumina srica bovina (BSA) nos meios de fermentao. Outros estudos relataram e gerou patente pelos pesquisadores Gong, Flickinger Tsao retrata em um processo para a converso de D-xilulose de etanol por fermentao utilizando leveduras selecionadas a partir de espcies de Saccharomyces, Candida, Torula, Schizosacchromyces, Pichia e Hansenula. Nesse estudo um dos principais obstculos que as condies timas para a fermentao em etanol, geralmente so valores de pH abaixo de 5, e em temperaturas de 30 a 35 C o que no se encaixam com o processo das enzimas

imobilizadas (GI tipicamente pH 7 a 8 e 60 C). Para esses fatores do processo, vrios grupos tm incidido sobre a melhoria do rendimento de etanol a partir de D-xilose utilizando formas de GI imobilizadas. Existem estudos que promovem uma fermentao de isomerizao simultnea, imobilizando as isomerases em esferas de quitosana mediante glutaraldedo. Tambm h a co imobilizao em clulas de S. cerecisiae em gel de alginato de clcio. Nesse estudo, a enzima/levedura biocatalisadas foi capaz de converter uma mistura de glucose-xilose em etanol com uma produtividade de 0,25 g de etanol por l h-1 e um consumo total de 75,4% de xilose. Dentre os vrios melhoramentos realizados, notou-se que o melhor rendimento foi obtido com as estirpes recombinantes de S. cerevisiae. 4.2 Produo Fructooligosaccharide (fruto oligossacardeo) e sntese de

hidroximetilfurfural (HMF). O Fruto oligossacardeo (FOS) uma classe de oligossacardeos no digestveis (NDO) utilizados como prebiticos nos gneros alimentcios. Estruturalmente, so definidos como contendo um resduo de D-glucose e 2 ou mais resduos de -D-frutosil, essencialmente -1,2-frutofuranosil derivados de sacarose. As enzimas que catalisam a formao de FOS a partir de sacarose so chamados -frutosiltransferases (FTase; EC 2.4.1.9) e so encontrados em vrios microrganismos. Os produtos da reao incluem oligossacardeos FOS alm de D-glucose, que age como um inibidor competitivo e pode limitar a extenso de converso. Por conseguinte, vrios grupos tm utilizado as enzimas, tais como glicose isomerase e glicoseoxidase para reduzir a quantidade de glicose na mistura reacional. Hendersen e colaboradores apresentou um pedido de patente de um sistema atravs do qual a sacarose convertido in situ com uma FOS fructosytransferase e enzimas adicionais (glicose oxidase, glicose isomerase) so usadas para converter o derivado de D-glicose para outros acares. Tambm foram realizados a produo de frutooligossacardeos por Aspergillus oryzae N74, a partir da IGI que ocasionou um aumento de 4,7% em relao a um controle sem IGI, dando um rendimento total de 58,3% gg -1 em sacarose. Tambm foram feitos estudos para a converso de D-glicose que desidratada por cido gera o hidroximetilfurfural-HMF, produto este que pode ser utilizado em qumicos e combustveis. Estudos foram feitos para esta transformao com a utilizao da IGI A converso de D-glicose para HMF pela IGI usando gua do mar foram testadas. O estudo mostrou que a IGI (Sweetzyme TI) foi capaz de isomerizar uma corrente de

glicose a 50% em gua do mar contendo 2-MeTHF sem perda de atividade ao longo de vrias etapas de reciclagem. 4.3 Perspectivas para Glicose Isomerase Imobilizada A IGI permanece como um produto enzimtico com maior sucesso j desenvolvido tanto em termos de vendas da enzima, como de volume total de produto produzido. As melhorias desse processo ainda esto sendo estudadas como a aplicao em temperaturas mais elevadas e pHs mais baixos, assim como, processos que gerem 55% de D-frutose sem a necessidade do enriquecimento cromatogrfico. Alm desses processos ainda h um variado nmero de alternativas a serem apresentadas, como melhoramento de mtodos j pesquisados. Por exemplo, Moliner e colaboradores descreveram recentemente como os zelitos Ti e Sn so catalisadores eficazes na a isomerizao de glicose em frutose em um grande intervalo de vrias temperaturas. Em suma, a indstria ir beneficiar o processo que lhe traga maior benefcio econmico, seja ele qumico ou biolgico, por isso a necessidade de pesquisa que analise as vantagens desses dois meios em uma base de aplicao. Por exemplo, a anlise do ciclo de vida (ACV) de um biocatalizador imobilizado comparado a um catalisador qumico uma maneira de quantificar os mritos relativos sobre o impacto econmico e ambiental global de um determinado processo. 5. Emergentes aplicaes de enzimas imobilizadas Apesar de no existir muitas aplicaes industriais de enzimas imobilizadas, devido aos custos de processo, percebe-se uma atividade significativa para o desenvolvimento de processos que empregam tais enzimas imobilizadas em alimentos, como: a hidrlise de pectina e a reduo de componentes amargos na produo de sumos de fruta, a interesterificao de leos e gorduras, sendo a ltima colocada em prtica comercialmente. 5.1 A hidrlise da pectina A pectina constituda por uma mistura complexa de polissacardeos, que o principal componente da parede celular da maioria das plantas. Quimicamente, a pectina composta por heteropolissacardeos ramificados contendo de um at cerca de algumas centenas de cidos galacturnicos. Vrias enzimas so responsveis pela despolimerizao da pectina, endo pectina liase, endo poligalacturonase, pectina esterase, entre outros. A pectina produz turbidez e slidos suspensos em sucos de fruta sendo que este

problema tecnolgico degradado a partir de pectinase, o que resulta em rendimentos mais elevados, melhorando a liquefao, clarificao e filtrao de sucos reduzindo a viscosidade. Embora o uso de uma enzima imobilizada para a hidrlise de um substrato macromolecular pode ser problemtica devido a possveis limitaes difusionais ou estrutural de contatar a enzima imobilizada com o substrato, a pectinase pode ser imobilizada sobre uma variedade de suportes e ainda permanecer ativa para a hidrlise da pectina. A pectato liase foi imobilizada em vrias suportes, incluindo gel de alginato, 144 EUDRAGIT L100-55, 145 de bentonite, 143 -alumina, 146 nylon ,147-150 quitina, 149 de vidro poroso e DEAE celulose activada com titnio sal, 151 e Eupergit C 0,152. Foi feita uma comparao da capacidade cataltica de alginato imobilizada pectina liase presente em diversas misturas enzimticas comerciais (C80 Rapidase (Gist Brocades), Biopectinase CCM (Quest International), GrindamylTM 3PA (Danisco) e Pectinex 3XL (Novozymes)) 0,144. A enzima Rapidase C80 Imobilizada foi reciclado em quatro bateladas consecutivas sem perda mensurvel de atividade, em que uma reduo de viscosidade de uma soluo de pectina de ma, a 40 C foi de cerca de 35% aps 30 min de tratamento. Tambm foram imobilizadas em resinas, atravs de adsroo eletrosttica e o pH foi mantido constante em 4,5, durante os ensaios e processos de imobilizao. A pectato liase oriunda do Penicillium italicum foi imobilizada em nylon 6, e a enzima imobilizada resultante demonstrou uma maior estabilidade trmica. Essa enzima foi imobilizada por ligao covalente e seu efeito na viscosidade de trs diferentes sucos de frutas (melo, alperce, pssego e), foi avaliado, e uma reduo de viscosidade de pelo menos 25% foi observado aps 60 minutos de incubao para cada suco de fruta. Outros estudos relataram a imobilizao de outras enzimas como pectinase, pectina esterase e pectato liase. Esta formulao de enzimas imobilizadas produziu uma reduo da viscosidade que foi de 80% em comparao ao suco que utilizou a enzima solvel, o menor grau de reduo de viscosidade foi atribudo ao efeito negativo das partculas coloidais insolveis presentes no suco natural sobre a atividade da enzima imobilizada. 5.1.1 Impacto do projeto do reator na eficincia da pectinase imobilizada. Tambm foram utilizadas para a reduo de partculas coloidais em sucos de fruta enzimas imobilizadas em processos de reatores. Um reator de fluxo cruzado com

enzimas imobilizadas sobre uma superfcie de membrana tem sido demonstrado que oferecem vrias vantagens para a soluo viscosa de processamento de substrato, uma vez que as limitaes difusionais externas so reduzidas pelo fluxo de reciclagem alto. Este tipo de biorreator foi utilizado para a hidrlise de protenas de soro de leite e de produtos hortcolas para o desenvolvimento de um modelo matemtico de difuso e de reao em um nico fluxo de reciclagem. As cinticas e o comportamento operacional da enzima imobilizada pectoltica num reator de membrana de fluxo cruzado foi determinado, e o efeito da velocidade do fluxo de reciclagem, a taxa de fluxo de filtrado, o volume da reao, e quantidade de enzima imobilizada, sobre os perfis de converso foi reportado. Nesse processamento contnuo de pectina ctrica pelo imobilizada Pectinol D em qualquer um fluxo cruzado ou reator de leito compactado produziu uma queda de viscosidade superior a 50%, suficientemente elevada para o produto ser considerado como clarificado. No reator de fluxo cruzado, o imobilizada Pectinol D demonstrou uma converso mxima de substrato pctico, o que era devido ao aumento da taxa de transferncia de massa produzida pelo fluxo de reciclagem que aproxima os parmetros cinticos observados para os valores relatados intrnsecos, que foram previamente trabalhados em um reator de batelada (e onde os parmetros cinticos foram severamente afetadas por limitaes difusionais externas). A utilizao do sistema de fluxo cruzado foi retratado como um mtodo eficiente para processar solues de pectina de alta viscosidade, em que a desativao da enzima devido tenso de corte produzida por fluxo tangencial foi largamente compensada por uma capacidade de converso elevada. 5.2 Reduo de componentes amargos em sucos de fruta A naringina (4',5,7-trihidroxiflavanona-7--L-ramnoglucosdeo-(1,2)--D-

glucopiransido), o principal glicosideo flavanona amargo e componente primrio nos sucos de frutos, tais como sumo de toranja. Para retirada de tais compostos so utilizadas tecnologias de nutron ou resina de troca inica, onde naringina absorvida do suco clarificado, passando por um polmero de divinilbenzeno aprovado para a utilizao em alimentos. Como uma alternativa s tcnicas de adsoro fsica, a retirada do amargo do suco pode ser conseguida pelo tratamento com naringinase, um complexo de enzima obtida a partir de fungos, tais como Penicillium decumbens, Aspergillus sp., Aspergillus niger,

Aspergillus oryzae ou Rhizopus nigricans. A naringinase foi imobilizada por esmagamento ou por adsoro ou ligao covalente a veculos insolveis, bem como em cartuchos de fibra oca. O pH timo (4,5) para a enzima encapsulada foi o mesmo que para a enzima livre; a elevada atividade nete pH foi constatado timo para o processamento de sucos de fruta pois a maioria desses processos muitas vezes inferior a 5, visto que um pH operacional baixo tambm limita a contaminao microbiana da mistura de reao. Os tipos de encapsulao da naringinase foram alginato de clcio 2% reticulado, entretanto nesse processo a estabilidade foi baixa devido as partculas a partir do suco entupir os poros das prolas de alginato de lixiviao da enzima a partir das drageias de alginato que no foram detectada. Tambm foram utilizadas lascas de madeira de cedro para a imobilizao covalente, nesse processo a enzima no migrou a partir do suporte, e sem perda de atividade. Tambm esto sendo feitas embalagens ativas, um estudo imobilizou a naringinase em filmes de acetato de celulose, com at 23% de eficincia, filmes de acetato de celulose. A naringinase imobilizada sobre slica mesoporosa MCM-41 por meio de adsoro com glutaraldedo foi usada para a retirada do amargor de toranja branca, sendo que o catalisador imobilizado demonstrou uma excelente estabilidade trmica e estabilidade armazenagem, e reteve cerca de 45% da sua atividade inicial aps seis reaes em batelada com catalisador de reciclagem. Em suma, tambm foram feitas a naringinase em sol-gel de tetrametoxissilano (TMOS) e glicerol, em lquido inico (IL), com base em matrizes de gel de slica, por adsoro em terra de diatomceas (Celite , de Hyflo supercel), e outros, como copolmeros de estireno e anidrido maleico, celulose tanino-aminohexilo, bagao quitina (ligao covalente utilizando glutaraldedo e boro-hidreto de sdio), de vidro de poro controlado, glycophase revestido de vidro de poro controlado, -carrageenan e silicato, para sucos de frutas e vegetais debittering. A utilizao de reactores de fibras ocas para a hidrlise de naringina em sumo de toranja tambm tem sido desenvolvida 5.2.2 Melhorar aroma no vinho. Os componentes volteis responsveis pelo aroma dos vinhos, tais como linalol, geraniol, nerol, citronelol e -terpeniol, esto presentes na pele de uva, o qual aps a hidrlise se torna voltil. A aplicao enzimtica nesses processos so para o realce de aroma ou a criao de aromas especficos. As enzimas provenientes de A. niger continha

-glicosidase, -arabinosidase e atividades de -ramnosidase em uma razo considerada adequada para o realce do aroma para a vinificao. As trs enzimas foram imobilizadas em um veculo slido de bentonita com glutaraldedo com o objetivo de desenvolver um processo contnuo para a melhoria do aroma do vinho. 5.3 Interesterificao de leos e gorduras alimentares As propriedades fsicas dos leos e gorduras utilizados pelos fabricantes de produtos alimentcios, em geral, so especficos para a sua origem, pois cada um deles podem ter diferentes distribuies e grupos em suas estrutura de triacilgliceris. Essas caractersticas intrnsecas de leos e gorduras podem ser alteradas pelo fracionamento, hidrogenao e interesterificao para a modificao das propriedades e cristalizao. A utilizao de hidrogenao parcial das gorduras pode produzir leos e gorduras com as propriedades de fuso desejadas, mas tambm pode resultar na produo de nveis elevados de gordura trans, o que aumenta substancialmente o risco de doenas cardacas. A interesterificao enzimtica (EIE) de alimentos leos e gorduras permite a melhoria do controle da composio do produto final, quando comparado com interesterificao qumica (CIE). As reaes de EIE, em triacilgliceris de cadeia longa (triglicerdeos) normalmente realizada utilizando uma lipase como catalisador. Na gua, lipases catalisam a hidrlise de ligaes de steres de cidos carboxlicos presentes nos triglicridos, mas sob condies de reao em que a atividade da gua baixa, a lipase pode catalisar a esterificao de cidos carboxlicos ou lcoois, por transesterificao de steres de cidos carboxlicos. Apesar da EIE ser uma reao que interesterifica grupos especficos, em alguns casos, ao utilizar uma lipase que so sn-1,3 especfico (Mucor miehei, Rhizopus arhizus, Aspergillus niger, e Thermomyces lanuginosus (ex Humicola lanuginosa)) normalmente no trocam grupos acilo na posio sn-2, devido ao impedimento estrico. Essa questo por conseguinte mais limitada do que a produzida pela CIE. 5.3.1 Desenvolvimento inicial do comrcio EIE. EIE foi avaliada em primeiro lugar para a produo de um equivalente de manteiga de cacau (CBE), que empregue a posio sn-1,3 a especificidade de uma variedade de lipases fngicas. Esses estudos foram feitos por enzimas imobilizadas por adsoro em terra de diatomceas e biocatalisadores. A companhia Fuji Oil desenvolveu um processo de EIE utilizando uma lipase especfica 1,3 de Rhizopus niveus adsorvido em terra

diatomcea para catalisar a transesterificao entre 1,3-dipalmitoil-2-olena (a partir de leo de palma frao mdia) e estearato de etilo. Esse processo foi desenvolvido para criar um substituto de manteiga de cacau que fosse adequado para o fabrico de chocolate. Geralmente, para a engenharia de processo de obteno da esterificao existe a necessidade de adicionar gua para manter a atividade da enzima em um processo contnuo, entretanto, pode existir problemas nessa adio por a gua pode resultar em hidrlise de triglicerdeos em vez de interesterificao. Em 2009, Alimentos Polar Comercial CA, na Venezuela, informou o incio de funcionamento de sua planta De Smet Ballestra Interzym Interesterification, com uma capacidade de 80 tpd e, em 2011, Industrias ALES em Manta - Equador anunciou seus planos para a construo de uma planta de eesterificao com capacidade de 40 tpd, tambm a ser construdo pela de Smet Ballestra. O processo resume-se com a utilizao de Interzym Smet Lipozyme TL IM como alternativa tanto para a interesterificao qumica e de hidrogenao, onde so bombeadas a reatores de leito fixo contendo uma mistura de leos recm desodorizada como alimentao. Nesse processo 2,5-4,0 toneladas de petrleo foram interesterificadas com 1 kg de enzima imobilizada, onde a enzima permaneceu ativa por 2500-4000 h. Na Holanda, em Rotterdam, existe uma instalao para interesterificao com capacidade de produo de 100 000 toneladas por ano, alm de exigir menos etapas de processo do que CIE, a produo usando interesterificao enzimtica economiza 23 kg de CO2 por tonelada de produto final quando comparado com o processo quimicamente catalisado. Atualmente, o desenvolvimento do EIE feito a partir de vrios estudos, como a interesterificao de gordura a partir da fonte de outros leos. Foi feita em 2008 uma interesterificao enzimtica de estearina de palma com leo de coco utilizando uma combinao de duas lpases. Lipases 1,3-especficas de diferentes fontes, livres (Pseudomonas fluorescens lipase) ou imobilizados (lipases de Thermomyces lanuginosa, Rhizomucor miehei e Candida antarctica B), foram empregados como biocatalisadores para interesterificao enzimtica. Tambm feita a sinergia entre enzimas, pois um sistema de enzima duplo, constitudo por lipases imobilizadas e no imobilizadas, na maioria dos casos, tem aumentado a atividade da lipase livre. Utilizando uma combinao de EIE (empregando Lipozyme IM MD), de fracionamento e de desodorizao de lote, uma mistura de gordura de manteiga, leo de soja e leo de colza foi usada para produzir substitutos de

gordura do leite humano (FLHs) com uma estrutura molecular e composio de cidos graxos que era muito semelhante gordura do leite humano. A estabilidade oxidativa do leo FLHs foi menor do que o do leo de referncia com a mesma composio de cidos graxos, mas oxidao no conduziu a um aumento acentuado da rancidez durante o armazenamento; sabores desagradveis tais como queimado e amargo foram detectados, e ainda a otimizao do processo de desodorizao foi necessria para remover esses off-flavors. Tambm so relatadas pesquisas de: - interesterificao enzimtica de cido estearidnico (SDA, C18: 4n - 3) enriquecida com leo de soja e tripalmitina para produzir lpidos estruturados (SLS) enriquecidas com cido palmtico (PA) na posio sn-2 do triacilglicerol; - interesterificao enzimtica de gordura do leite anidro (AMF) com leo de linhaa (LO) em misturas binrias e com leo de colza (RO); - gordura do leite e misturas de leo de canola interesterificadas enzimaticamente usando a lipase de Rhizopus oryzae (L036P, Biocatalizadores (Cardiff, UK)) 241 ou Aspergillus niger (A lipase, Amano); - interesterificao enzimtica a partir de misturas de leos vegetais de vaca incorporados ao leite desnatado de caprino para produzir um leite de cabra baseados em frmulas infantis anlogos, homlogos de leite humano; - sebo de carne de bovino interesterificado com leo de girassol utilizando lipase imobilizada de Rhizomucor miehei; - interesterificao enzimtica de estearina de palma com leo de semente de Cinnamomum camphora para produzir zero trans triglicerdios de cadeia mdia; - gordura interesterificada trans livre por interesterificao de uma mistura de leo de farelo de arroz, a estearina de palma e leo de coco catalisada por Lipozyme TL; - mudana do ponto de fuso para conferir consistncia slida em misturas com leos vegetais; - Gorduras semi-slidas foram preparadas atravs de interesterificao enzimtica de azeite de oliva extra-virgem (EVOO) e leo de palma (PTH) totalmente hidrogenado em reatores em batelada utilizando Novozym 435, Lipozyme TL IM ou Lipozyme RM IM como biocatalisador. 5.4 Biodiesel O biodiesel produzido pela catlise de esterificao qumica ou enzimtica de

cidos graxos ou pela transesterificao de leos e gorduras com lcoois de cadeia curta para a produo de steres alqulicos de cidos graxos (FAAEs). Os leos e as gorduras, os cidos graxos e os seus correspondentes, que so usados para produzir o biodiesel so obtidos a partir de uma variedade de animais, plantas e microrganismos. As lipases podem ser utilizadas para catalisar a produo de FAAEs sob condies mais suaves e com uma produo de sais alcalinos menor do que o processo qumico. Um grande obstculo econmico para a utilizao do processo enzimtico a necessidade de se recuperar e reciclar o catalisador de enzima. A enzima imobilizada sobre um suporte slido, geralmente estabiliza a atividade catalisadora e permite a fcil recuperao e reciclagem do catalisador. Existem vrias fontes para a obteno dessas lipases microbianas como: Thermomyces lanuginosus, Pseudomonas fluorescens, Thermomyces lanuginosus, Candida Antarctica, entre outros. Nos estudos desenvolvidos para aplicao de tais enzimas estas formas imobilizadas ora sobre uma matriz comercial Toyopearl AFamino-650M (Tosoh Bioscience) ligaes covalentes mltiplas, aldedo-Lewatit (LewTLL), entre outros. As enzimas imobilizadas demonstraram diferentes atividades hidroltica e estabilidade trmica em relao as lipases solveis, e mostrou a atividade mais elevada para a transesterificao de leos vegetais. A influncia da superfcie de suporte sobre a carga e a atividade enzimtica da lipase imobilizada de Pseudomonas fluorescens, foi comparada por etanlise de leo de girassol, utilizando diferentes suportes porosos: polipropileno (Accurel ), polimetacrilato (Sepabeads EC-EP), slica (SBA-15 e a superfcie modificada um organossilicato (MSE)). A superfcie modificada com SBA-15 (SBA-15-R-CHO) permitiu a carga mais alta, ao passo que a lipase imobilizada sobre o MSE foi o biocatalisador mais ativo. Nessa reviso tambm foi constatado que os fosfolpidos presentes em leos derivados de plantas pode ser problemtico, a remoo destes fosfolipdeos antes da transesterificao de um processo de desengomagem pode aumentar o rendimento do biodiesel. Logo, para esses problemas podem ser aplicados dois processos enzimticos (desengomagem e transesterificao). Um estudo feito na produo de biodiesel a partir de leo de canola bruto (contendo tipicamente fosfolpidos 100-300 ppm), onde desengomagem foi executada usando a fosfolipase. O teor de fosfolipido inicial foi reduzida para menos de 5 ppm em desengomagem enzimtica. Alm de fosfolipdeos a produo de glicerol, subproduto durante a

transesterificao, pode impactar negativamente a eficincia da reao e a produtividade, em que o glicerol pode ser adsorvido por transportadoras de imobilizao de enzimas e formam uma camada hidroflica que torna as lipases inacessvel aos substratos hidrfobos. Para isso, o uso de um reator de leito enzimtica (PBR) integrado com um sistema de separao de glicerol foi avaliado para a produo sem solventes de biodiesel, para operao a longo prazo, o PBR manteve uma atividade de lipase significativa, a concentrao de metanol no efluente foi mantida a menos do que 2%, sob estas condies, o glicerol foi tambm removido com sucesso pelo tanque de separao (99,7% do rendimento terico). 5.4.1 Comercializao de biodiesel utilizando enzimas imobilizadas Existem processos comerciais com linha de produo enzimtica distintos. Na China h uma companhia com capacidade de 10 000 toneladas, empregando um processo desenvolvido na Universidade Tecnolgica de Qumica de Pequim, que utilizou a lipase imobilizada comercial (LS-10A, Candida sp. 99-125) como catalisador. Um segundo processo de biodiesel utilizando catlise enzimtica foi

comercializado em 2006 pela Hainabaichuan Co. Ltd., provncia de Hunan, com uma capacidade de 20 000 toneladas por ano (ampliado para 40 000 toneladas por ano em 2008), o processo de tecnologia empregada desenvolvido pela Tsinghua University, onde a Novozym 435 foi utilizado como o catalisador, e leo de palma, resduos de leo comestvel ou de leo com ndice de acidez elevada como matria-prima. Piemonte Biofuels anunciou em fevereiro de 2012 que escalou at um processo de transesterificao enzimtica em um estabelecimento comercial localizado na Pittsboro, Norte Carolina. Purolite (Bala Cynwyd, PA) e Transbiodiesel (Shfar-Am, Israel) anunciou em 2010 a inteno de fabricar e comercializar resinas de troca inica com enzimas para a esterificao simultnea de cidos graxos livres e de transesterificao de leos e gorduras. Apesar do biodiesel ser um produto comercial ainda so fabricados volumes pequenos em relao demanda global anual para o combustvel a diesel. As questes adicionais de moderao dos preos do petrleo, a sustentabilidade da produo de biocombustveis, bem como o impacto sobre os recursos hdricos necessrios para a produo de matrias-primas tambm precisam ser abordadas para que o sucesso comercial de produo de biodiesel enzimtica. 5.5 Anidrase carbnica Frente s discusses do aquecimento global por meio da liberao do CO2 que um

dos principais gases de efeito existem vrios estudos em curso para desenvolver mtodos eficazes para a captura de CO2 do gs de combusto, utilizao em qumicos ou injet-lo no subsolo para armazenamento a longo prazo. Entre os vrios mtodos em desenvolvimento para ps captura de CO2 emitido pela combusto um sistema de absoro de solvente base de amina. Tipicamente, solventes de amina tais como aminas mono-etanol (MEA) utilizado para a fixao do CO2 em uma coluna de absoro (40-60 C) e aps capturado este liberado aquecendo-se a soluo resultante numa coluna desorber a alta temperatura (> 100 C). Entretanto, esse processo demanda eletricidade e as colunas utilizadas resultam em custos de capital elevados. Um mtodo promissor, em desenvolvimento, para reduzir o custo de barreira de captura de CO2 utiliza enzima imobilizada, a anidrase carbnica, em uma amina ou solvente para aumentar a taxa de absoro de CO2. Apesar do processo enzimtico reduzir os custos de capital e de energia, o processo necessita de temperaturas elevadas e a maioria das enzimas no so estveis durante longos perodos de tempo no reator. Por isso, a imobilizao da enzima aumenta a sua estabilidade operacional e armazenagem e permite a reutilizao da enzima. 5.5.1 Propriedades e imobilizao da anidrase carbnica. Encontra-se a anidrase carbnica na natureza desempenhando um papel fundamental em muitos processos biolgicos, incluindo a respirao, fotossntese, a homeostase do pH, vias biossintticas que envolvem reaes carboxilase e as vias de desintoxicao. Trs tipos de anidrase carbnica estruturalmente diferentes tm sido identificados na natureza - o alfa, beta e gama e formas. Todas estas enzimas so metaloenzimas e catalisam a hidratao reversvel de CO2. A anidrase carbnica rpida e catalisa a hidratao do CO2 com nmeros de turnover de hidratao cerca de 106 s-1. A eficincia cataltica desta enzima essencialmente limitada pelo transporte de prtons, que est prximo do limite de difuso em tampes com pKa> 8, logo, esta enzima seria ideal para um processo de captura de CO2. Um certo nmero de estudos na literatura descrevem uma variedade de mtodos para imobilizar a anidrase carbnica. Estes incluem a imobilizao da enzima em diferentes suportes tais como slica, vidro de poro controlado, varetas de grafite, hidrogel de alginato, quitosano e a clulas de Escherichia coli. Um exemplo da imobilizao foi em um estudo em que a anidrase carbnica bovina

foi imobilizada em amina de slica mesoporosa (SBA-15) por adsoro, ligao covalente e agregao de enzima reticulada. A eficincia cataltica da enzima imobilizada foi semelhante ao de enzima livre. Em todos os casos, a enzima preparada por agregao reticulada apresentou um desempenho levemente melhor, especialmente em comparao com a enzima preparada por ligao covalente. Tambm apresentaram uma perda mnima de atividade ao longo de 30 ciclos, e menos de 20% de perda de atividade durante o armazenamento durante 30 dias. Em outro estudo, anidrase carbnica a imobilizao foi feita por ligao covalente a vidro de poro controlado. A enzima imobilizada foi significativamente mais estvel em tampo de carbonato (pH 10) a temperaturas mais elevadas e na presena de impurezas qumicas tpicas, tais como SO4, NO, Cl e anions encontrados no gs de combusto. Utilizando alginato a imobilizao da anidrase carbnica bovina foi to eficiente quanto a enzima livre na captura de CO2 (formao de calcite) e manteve uma atividade de 67% atravs de seis ciclos de funcionamento. A enzima imobilizada tambm obtiveram melhor estabilidade trmica e estabilidade de armazenamento em comparao com a enzima livre. Tambm foram imobilizadas em superfcie da E. coli., membrana de lquido por uma variedade de mtodos, incluindo a ligao covalente atravs de meios qumicos ou atravs da exibio em superfcie de uma clula e, por adsoro/arrastamento numa matriz slida ou de gel ou de uma membrana lquida. Os resultados destas vrias tcnicas de imobilizao so muito semelhantes, em que a enzima imobilizada geralmente tem uma atividade equivalente ou inferior em comparao com a enzima livre. Outros fatores a considerar durante a imobilizao da anidrase carbnica para captura de CO2 so problemas de transferncia de massa, o transporte para o local ativo da enzima, e a inibio da reao global em produto. Portanto, a seleo da matriz de imobilizao, concepo do reator, e a remoo do produto crtica para o desenvolvimento bem sucedido do presente pedido. Mesmo que no existem sistemas enzimticos relatados que podem atender a estabilidade, desempenho e custo para o processo de captura de CO2 de combusto, o desenvolvimento bem sucedido de um sistema enzimtico esperado em um futuro prximo. Estes estudos podero auxiliar mercados de processamento de gs natural, produo de hidrognio industrial e rea de fabricao de fertilizantes (uria), lugares onde necessrio o sequestro de CO2. 6. Avaliao do ciclo de vida dos produtos de enzima imobilizada

A Avaliao do Ciclo de Vida (ACV) uma das melhores metodologias para a avaliao dos encargos ambientais associados a processos industriais. Alm de identificar a energia e os materiais utilizados, bem como resduos e emisses liberada para o ambiente, LCA tambm permite a identificao de oportunidades para a melhoramento ambiental, como os processos sustentveis. O uso de enzimas em processos industriais frequentemente associada reduo do consumo de energia, insumos qumicos e fluxos de resduos. Estudo feito por Oxenbll e Ernst que examinou processos enzimticos e no enzimtico, foi demonstrado que o uso de uma fosfolipase para desengomagem de leo vegetal resultou em uma reduo de 44 toneladas de gases de efeito estufa (em equivalentes de CO2) por 1000 ton de leo produzido. O uso de enzimas imobilizadas permitiu o processamento contnuo, que por sua vez pode levar a menores custos de produo e consumo de energia. Consumo de produtos qumicos e de gerao de fluxo de resduos tambm podem ser substancialmente reduzidas atravs da utilizao de enzimas imobilizadas. Vrios estudos recentes tm aplicado metodologia ACV para estudar as vantagens de enzimas imobilizadas para

interesterificao lipase mediada de triglicridos, a produo de biodiesel, e a produo de produtos farmacuticos intermedirios. Um estudo feito por Holm e Cowan aplicando ACV para comparao entre rotas qumicos e enzimticos imobilizadas para interesterificao da gordura na indstria de petrleo. EIE foi encontrado para ter um menor impacto ambiental em relao ao CIE devido gerao de menos subprodutos, temperaturas operacionais mais baixas e reduo do consumo de gua. Como resultado, EIE foi julgado para ter um significativo benefcio ambiental lquido relativo a CIE no que diz respeito ao uso de energia, aquecimento global, acidificao e formao de fumaa. A produo de biodiesel utilizando biocatalisadores reduz o consumo de energia, produtos secundrios indesejveis, tratamento de guas residuais mais caros e a recuperao do glicerol produzido como um bioproduto. Ambos os impactos econmicos e ambientais de enzimas imobilizadas so uma funo da produtividade global do biocatalisador. Um limiar de 5-10 toneladas de produto por quilograma de biocatalisador imobilizado tem sido citado como necessrio para utilizao industrial. E, alm dos custos de produo da enzima, o impacto adicional d o fabrico da matriz de imobilizao e o prprio processo de imobilizao deve ser levado em conta, por exemplo, num estudo realizado por Kim et al., a produo de aldolase

imobilizada foi retratada com maior impacto ambiental do que outras enzimas avaliada devido o processo de imobilizao, particularmente Sepabead produo , ser identificado como sendo a fonte de emisso de gases com efeito de estufa primria para a enzima imobilizada (51-83%). Assim, a utilizao de uma matriz de imobilizao com carter ambientalmente benigno e condies mais suaves do processo de imobilizao essencial. 7. Concluses Apesar dos desafios em curso, o desenvolvimento de aplicaes e em grande escala comercial de enzimas imobilizadas continuar a expandir-se, para a produo de produtos qumicos, assim como em aplicaes de consumo. A compreenso mais holstica dos fatores que justificam a implementao de processos de enzima imobilizada ir conduzir a prxima gerao de biocatalisadores e construir sobre os sucessos iniciais dentro da indstria. Os exemplos incluem a produo de HFCs, os aminocidos, os intermedirios farmacuticos e monmeros qumicos. Aplicaes alimentares continuaro a dominar a aplicao de enzimas imobilizadas em termos de volume, no entanto aplicaes emergentes para a produo de biodiesel e sequestro de carbono pode vir a ser aplicado em uma escala imensa. O advento da nanotecnologia e engenharia de sistemas integrados promete movimentar produtos de enzimas imobilizadas em outras reas de aplicao, tais como aqueles envolvendo substratos insolveis ou macromolecular, biossensores e materiais inteligentes. Uma possibilidade interessante a combinao de enzimas com catalisadores inorgnicos em sistemas multi-catalisadores capazes de sntese "one-pot" de produtos qumicos e materiais. A necessidade de desenvolver processos mais sustentveis e reduzir as emisses de gases de efeito estufa tambm ir favorecer o desenvolvimento desse campo. Embora possa ser verdade que a implementao de sistemas de enzimas imobilizadas at data no tenha vivido at, expectativas otimistas iniciais, as perspectivas so brilhantes dadas s tendncias atuais da indstria combinada com a rpida evoluo da tecnologia da enzima imobilizada.