TCNICAS INSTRUMENTALES DEL ANLISIS

I. ESPECTROFOTOMETRA La espectrofotometra es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. 1, 2 Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. 1,2 Cada componente de la solucin tiene su patrn de absorcin de luz caracterstico. Se Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de una muestra versus soluciones standard, es posible determinar la identidad y la concentracin de componentes disueltos en la muestra (solucin incgnita). 1-3 1. Componentes.1, 2 Un espectrmetro tpico posee componentes bsicos: Fuente de radiacin, que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre (usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible y deuterio para ultravioleta). Compartimiento para la muestra. Monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra. Fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra. Registrador o sistema de lectura de datos.

2. Transmitancia y absorbancia. 1-3 En general, los espectrmetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). 2.1. Transmitancia (T), de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha

atravesado la muestra (It), y la cantidad de luz que incidi sobre ella (Io). Representacin: % T = It/Io x 100 2.2. Absorbancia (A), es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, Se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. 3. Ley de Lambert-Beer. Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin: 1-4 A = log I/Io = cl Donde: A: absorbancia c: concentracin del compuesto. A mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas. Se expresa siempre en unidades concentracin molar (M) l: grosor de la disolucin que atraviesa la radiacin. Cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms molculas se encontrar. Se expresa siempre en cm : coeficiente de extincin (caracterstico de cada compuesto). Las dimensiones de dependen de las de c y l, con lo que las dimensiones de resultan ser M-1cm-1

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc. 4. Manejo del espectrofotmetro. 1-4 - Se selecciona la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. - Hay espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la

cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas). Se mide primero la absorbancia de la cubeta conteniendo el disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. Se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de sta.

5. Ventajas: 1, 5 - Es rpida, precisa, verstil, fcil de usar y eficiente en costo. - Los espectrofotmetros se han mejorado en precisin y versatilidad en los ltimos aos con los avances de tecnologa, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio de qumica analtica. 6. Aplicaciones: 1,5 - Para hacer anlisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas en un laboratorio de investigacin. - Estandarizacin de colores de diversos materiales, como plsticos y pinturas. - Deteccin de niveles de contaminacin en aire y agua. - Determinacin de impurezas en alimentos y en reactivos. Sabias qu? La espectrofotometra es una tcnica que desde sus inicios a mediados de la dcada del 50 hasta la actualidad ha ido creciendo en cuanto a sus usos en diversas reas de la investigacin especialmente en aquellas en las que se determina la concentracin de trazas y de mezclas de sustancias. Por ejemplo se usa mucho en la determinacin de cafena en las bebidas gasificadas oscuras y actualmente para determinar la presencia de cocana en alguna de ellas, tambin para determinar la cantidad de cocana en orina de pacientes drogodependientes en proceso de rehabilitacin. 6,7

II. ELECTROFORESIS 1. Definicin: Es el transporte de partculas a travs de un disolvente, mediante un campo elctrico. La electroforesis aprovecha la propiedad de las macromolculas de presentar una velocidad caracterstica al ser sometida a un campo elctrico. 8

El movimiento de las molculas cargadas en un campo elctrico se representa por la siguiente ecuacin: 9

E = Campo elctrico en volts/cm q = Carga neta en la molcula f = Coeficiente de friccin (depende de la masa y de la forma de la molcula) v = Velocidad de migracin de la molcula

2. Tipos: a. De frente mvil: Las macromolculas estn presentes en toda la disolucin y su posicin se determina en funcin del tiempo por ptica de Schiliere. Es una tcnica poco usada debido a la poca utilidad de la determinacin cuantitativa de la movilidad. 8 b. Zonal: La disolucin a tratar se aplica como una mancha, o como una banda, y las partculas migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio de soporte inerte y homogneo, tal como el papel o ciertos tipos de geles. Se utiliza para analizar mezclas, para determinar la pureza de ciertos tipos de geles, para detectar cambios de movilidad o de conformacin y para la purificacin de sustancias.8

Tomado de: Freifelder D. Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. 1ra ed. Barcelona: Revert; 2003.

c. Continua:

La muestra tambin se aplica en una zona, pero se aade continuamente a lo largo del proceso. 8 3. Ejemplos: a. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) Es el mtodo ms utilizado para determinar la pureza de una protena, ya que separa biomolculas cargadas con base en los ndices a los cuales migran en un campo elctrico aplicado.10 Puede separar protenas con diferencias bastante grandes de pesos moleculares debido a que separa SOLO en base al PESO MOLECULAR. 11 La desnaturalizacin de la protena se debe al uso del SDS, el cual las disocia en subunidades, logrando de esta forma la configuracin extendida del polipptido. Cabe resaltar que el SDS imparte una gran carga negativa a la protena, enmascarando la carga intrnseca de esta, por lo que las relaciones carga:masa son similares. 11

Tomado de: Lodish H. Bologa celular y molecular. 5ta edicin. Buenos Aires: Mdica Panamericana; 2006.

b. Electroforesis bidimensional Las protenas se separan de manera secuencial, primero por sus cargas y luego por sus masas. En el primer paso, se desnaturaliza por completo un extracto celular mediante el agregado de altas concentraciones de urea y se extiende en una tira gel que presenta un gradiente continuo de pH. La protena cargada migrar a travs del gradiente hasta que encuentre su punto isoelctrico. En el segundo paso, se separa sobre la base del peso molecular al extender la tira de gel sobre una placa de poliacrilamida saturada con SDS. 11

Tomado de: Lodish H. Bologa celular y molecular. 5ta edicin. Buenos Aires: Mdica Panamericana; 2006.

III. CROMATOGRAFA En 1903, Mikhail Tswett, botnico ruso, describi la separacin de pigmentos de hojas de plantas en disolucin mediante empleo de absorbentes slidos. Llamo a este proceso cromatografa (del griego: chroma, color y grapheim, escribir), presumiblemente como resultado de las bandas coloreadas que aparecan en los adsorbentes a medida que los componentes de las mezclas de pigmentos se separaban unos de otros.12

La cromatografa comprende en la actualidad varias tcnicas y todas ellas se basan en el mismo procedimiento general: las sustancias de la muestra en fase mvil, se hacen pasar a travs de un medio estacionario (cuentas de celulosa, acrilamida, slice o papel) que, al tener distintos grados de interaccin con los compuestos individuales, obstaculiza su flujo en diferentes medidas. El resultado es que las sustancias distintas migran a diferentes velocidades. El tipo de interaccin entre la fase estacionaria y los componentes de la muestra es lo que distingue un tipo de cromatografa de otro. Dicha interaccin se basa en uno de los siguientes principios: intercambio inica, solubilidad, adsorcin o cribado. Una estrategia comn es empacar el material de fase estacionaria en una columna y luego permitir que la fase mvil fluya a travs de esta, en ocasiones con ayuda de cierta presin. Por razones obvias, tales mtodos se denominan colectivamente cromatografa en columna.13 1. Cromatografa de filtracin en gel o de exclusin de tamaos. Las separaciones ms exigentes en base al tamao se pueden lograr mediante la tcnica de cromatografa de filtracin en gel. La muestra se aplica a la parte superior de una columna que consta de perlas porosas hechas de un insoluble polmero hidratado como dextrano o agarosa (que son hidratos de carbono) o poliacrilamida. Sephadex, Sepharose, y Bio-Gel utilizan comnmente preparaciones comerciales de estas perlas, que son tpicamente 100 mm (0,1 mm) de dimetro. Las molculas pequeas pueden entrar en estas cuentas, pero los ms grandes no pueden. El resultado es que las molculas pequeas se distribuyen en la solucin acuosa, tanto dentro de las cuentas como entre ellas, mientras que las molculas grandes se encuentran slo en la solucin entre ellas las perlas. Las molculas grandes fluyen ms rpidamente a travs de esta columna y emergen en primer lugar porque un volumen ms pequeo es accesible para ellos. Las molculas que son de un tamao como para entrar en un cordn fluirn de la columna a un posicin intermedia, y las molculas pequeas, que tienen un tortuoso camino ms largo, saldrn al final.3

Imagen tomada de: Berg J, Tymoczko J, Stryer L. 6ta Edicin. Espaa: Revert; 2008.

2. Cromatografa de intercambio inico. Aqu, las protenas interactan con la fase estacionaria mediante interacciones entre una carga y otra. Las protenas que tienen una carga positiva neta a un pH dado se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales con carga negativa, como carboxilatos o sulfatos (intercambiadores de cationes). De modo similar, las protenas con una carga negativa neta se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales con carga positiva, por lo general aminas terciarias o cuaternarias (intercambiadores de aniones). Las protenas, que son polianiones, compiten contra iones monovalentes por unin al soporte de ah el termino intercambio inico. Por ejemplo, las protenas se unen a la dietilaminoetil (DEAE) celulosa al remplazar los contraiones (por lo general, Cl o CH3COO) que neutralizan la amina protonada. Las protenas unidas se desplazan de manera selectiva mediante aumento gradual de la concentracin de iones monovalentes en la fase mvil. Las protenas muestran elucin en orden inverso de la fuerza de sus interacciones con la fase estacionaria. Puesto que la carga neta sobre una protena est determinada por el pH (cap. 3), es factible lograr la elucin secuencial de protenas mediante cambiar el pH de la fase mvil. De manera alternativa, una protena puede quedar sujeta a rondas consecutivas de cromatografa de intercambio inico, cada una a un pH diferente, de modo que las protenas que muestran coelucion a un pH presentan elucin a distintas concentraciones de sal a otro pH.10

Imagen tomada de: Berg J, Tymoczko J, Stryer L. 6ta Edicin. Espaa: Revert; 2008.

3. Cromatografa de afinidad. La cromatografa de afinidad es otro medio de purificacin de protenas de gran alcance y de aplicacin general. Esta tcnica toma ventaja de la alta afinidad de muchas protenas para grupos qumicos especficos. Por ejemplo, la concanavalina protena vegetal, puede ser purificada mediante el paso de un extracto crudo a travs de una columna de perlas que contienen residuos de glucosa unidos covalentemente. La concanavalina A se une a una columna de este tipo, ya que tiene afinidad por la glucosa, mientras que la mayora de las otras protenas no lo hacen. La concanavalina A unida a continuacin, se puede liberar de la columna mediante la adicin de una solucin concentrada de glucosa. La glucosa en solucin desplaza los residuos de glucosa de columna adjunta de sitios en concanavalina A vinculante. La cromatografa de afinidad es un poderoso medio de aislamiento de factores de transcripcin, protenas que regulan la expresin gnica mediante la unin a secuencias de ADN especficas. Una mezcla de protenas se cola a travs de una columna que contiene secuencias de ADN especficas unidas a una matriz; protenas con una alta afinidad por la secuencia se unirn y se conservar. En este ejemplo, el factor de transcripcin se libera por lavado con una solucin que contiene una alta concentracin de sal. En general, la cromatografa de afinidad se puede utilizar eficazmente para aislar una protena que reconoce grupo X por: (1) X unin covalente o un derivado de la misma a una columna, (2) la adicin de una mezcla de protenas a esta columna, que se lav a continuacin con tampn para eliminar las protenas no unidas, y (3) eluir la protena deseada mediante la adicin de una alta concentracin de una forma

soluble de X o alteracin las condiciones para disminuir la afinidad de unin. La cromatografa de afinidad es ms eficaz cuando la interaccin de la protena y la molcula que se utiliza como el cebo es altamente especfico.14

Imagen tomada de: Berg J, Tymoczko J, Stryer L. 6ta Edicin. Espaa: Revert; 2008.

4. Cromatografa lquida de alta presin. El poder de resolucin de todas las tcnicas de columna se puede mejorar sustancialmente a travs del uso de una tcnica llamada cromatografa lquida de alta presin (HPLC), que es una versin mejorada de las tcnicas de columna ya discutido. Los materiales de columna a s mismos son mucho ms finamente divididas y, como consecuencia, hay ms sitios de interaccin y por lo tanto mayor poder de resolucin. Debido a que la columna est hecha de un material ms fino, la presin debe ser aplicada a la columna para obtener tasas de flujo adecuadas. El resultado neto es de alta resolucin, as como la separacin rpida.14

ESPECTOMETRA DE MASA DEFINICIN: tcnica de anlisis cualitativo microanaltico que permite identificar compuestos desconocidos, cuantificar compuestos conocidos, y elucidar la estructura y propiedades qumicas de las molculas. 10, 15 VENTAJAS: 10 - Requiere cantidades pequeas de muestra ( - Sensibilidad, rapidez y versatilidad para secuencias de pptidos y protenas. - No se utiliza ningn tipo de radiacin. PARTES DEL ESPECTRMETRO DE MASAS: 12, 15

PARTES DEL MS
SISTEMA DE INTRODUCCIN DE MUESTRAS

FUENTE DE IONES

ANALIZADOR: SEPARAR SEGN Q/M SISTEMA DETECTOR Y REGISTRADOR

FUNCIONAMIENTO DEL ESPECTRMETRO DE MASAS: 15 1. Vaporizacin de la muestra mediante el uso de alto vaco y una fuente de calor. 2. Se ioniza la muestra mediante tcnica de impacto electrnico (bombardeo con una corriente de electrones a alta velocidad) 3. Perdida de electrones y fragmentacin dando diferentes iones, radicales y molculas neutras. 4. Los iones (molculas o fragmentos cargados) son conducidos mediante un acelerador de iones a un tubo analizador curvado sobre el que existe un fuerte campo magntico y conducidos a un colector/analizador 5. Registro de impactos de dichos iones en funcin de la relacin carga/masa de los mismos.

IMPORTANCIA: 12 Establecer composicin elemental de las muestras: de esta se encarga la espectrometra de masas atmico. Establecer composicin de las molculas inorgnicas, orgnicas y biolgicas. Establecer composicin cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas. Establecer estructuras y composicin de superficies slidas. Identificar relaciones isotpicas de tomos en las muestras. ENFOQUE ISOELCTRICO Tcnica sensible para la separacin de protenas (es un tipo particular de electroforesis), cuyo fundamento tiene base en el punto isoelctrico, donde la carga media de todas las formas de una protena es cero. Por tanto, cuando una protena se encuentra en su pH isoelctrico no migra en un campo elctrico.15 FUNCIONAMIENTO: Se aplica en un gel de poliacrilamida una muestra de protenas. El gel contiene una mezcla de compuestos poliprticos llamados anfolitos. Los dos extremos del gel se ponen en contacto con una disolucin conductora, y se aplica una diferencia de potencial de varios centenares de voltios a lo largo del gel. Los anfolitos migran hasta que forman un gradiente de pH estable. Cuando las protenas dejan de migrar, se interrumpe el campo elctrico, se precipita las protenas en el lugar donde estn y se tien con un colorante para hacerlas visibles.16

BIBLIOGRAFA 1. Mora S. Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica. Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a distancia; 2007. 2. Ostrooumov M. Espectrometra infrarroja de reflexin en mineraloga avanzada, geomologa y arqueometra. Mxico: Instituto de geofsicaUNAM; 2007. 3. Duymovich C, Acheme, Sesini S, Mazziotta D. Espectrofotmetros y Fotocolormetros: Gua prctica de actualizacin. Acta bioqum. cln. latinoam. 2005; 39(4): 529-539. 4. Bogachev YV, Saakov VS, Rozengart EV, Knyazev MN, Drapkin VZ, Krivchenko AI. Derivative Spectrophotometry and Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy for Ecological and Biological Questions. USA: Springer; 2013. 5. MacDonald MG, Ramasethu J. Atlas de procedimientos en neonatologa. 3 ed. Espaa: Ed. Mdica Panamericana; 2005.. 6. Asociacin Espaola de Toxicologa. Cromatografa en capa fina y espectrofotometra en luz ultravioleta como ensayos de rutina para detectar cocana en orina de pacientes drogodependientes en proceso de rehabilitacin. Revista de Toxicologa 2007; 24 (2): 98-101. 7. Matheus P, Arvalo E, Contreras M, Triana N, Belandria O, Lisi D. Optimizacin y validacin de un mtodo por espectrofotometra de absorcin molecular ultravioleta para la determinacin de vitamina d3 en suplementos de calcio. Acta Bioclnica 2013; 3(6): 94-121. 8. Freifelder D. Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. 1ra ed. Barcelona: Revert; 2003. 9. Segal CA, Ortega GJ. Manual de prcticas: Biologa molecular de la clula. 1ra ed. Mxico: Publidisa; 2005. 10. Murray R, Bender D, Bothham K, Rodwell V, Weil P. Harper Bioqumica Ilustrada. 29 ed. Mxico: Mc Graw Hill; 2013. 11. Lodish H. Bologa celular y molecular. 5ta edicin. Buenos Aires: Mdica Panamericana; 2006. 12. Voet D y Voet J. Bioqumica. 3ra Edicin. Argentina: Editorial Medica Panamericana; 2006. 13. Bohinski R. Bioqumica. 5ta Edicin. Colombia: Pearson; 1998 14. Berg J, Tymoczko J, Stryer L. 6ta Edicin. Espaa: Revert; 2008. 15. Michigan: University of Michigan Medical School; c2013 [consultado 20 Setiembre 2013]. Disponible en: http://histology.med.umich.edu/medical/pharynx-esophagus-andstomach. 16. Harris D. Anlisis qumico cuantitativo. 3 ed. Barcelona: Revert; 2003.