Guía de TP Parte 1

BIOTECNOLOGIA
Universidad Tecnolgica Nacional Facultad Regional Buenos Aires
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Gua de Trabajos Prcticos de Laboratorio
BIOTECNOLOGA
Universidad Tecnolgica Nacional Facultad Regional Buenos Aires Departamento de Ingeniera Qumica
Autores: Ing. Marina de Escalada Pla / Dr. Jorge Pacsual / Ing. Ricardo Mateucci
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ndice de Contenido
Prctica 1 Prctica 2 Prctica 3 Apndice A Apndice B
Recuento Microbiolgico Ambiental y Tincin de Gram Anlisis Bacteriolgico de Aguas ...... Ingeniera Gentica Escherichia coli Recombinante ...... Confeccin de los Informes de Laboratorio ..... Medidas de Seguridad en el Laboratorio .....
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Prctica
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Recuento Microbiolgico Ambiental y Tincin de Gram
Introduccin Si bien el aire es un ambiente hostil para el desarrollo de microorganismos, puede estar cargado de bioaerosoles (microorganismos adheridos a partculas de polvo, fragmentos de hojas secas, piel, fibras de la ropa, gotitas de agua, etc.). Estos bioaerosoles pueden ser transportados a travs de grandes distancias por el propio movimiento del aire. Los microorganismos en forma de clulas vegetativas o forma de esporas (ms frecuente) pueden desarrollarse al encontrar un medio adecuado. Por este motivo es necesario conocer y controlar la calidad microbiolgica de ciertos ambientes (aire y superficies), como por ejemplo: en dnde se elaboren medicamentos, alimentos o cosmticos, en centros de salud, etc. Existen diferentes mtodos de muestreo microbiolgico del aire ambiente. En esta prctica realizaremos un muestreo por sedimentacin espontnea en placas conteniendo medios de cultivo. Este mtodo de muestreo tiene la ventaja de ser sencillo y econmico, permite recoger lo que normalmente sedimenta sobre las superficies del ambiente en estudio, permite continuar con una posterior investigacin de los microorganismos que han desarrollado en los medios de cultivo. Tiene como desventaja que los resultados obtenidos no pueden relacionarse con el volumen de aire muestreado y que no proporciona un resultado cualitativamente y cuantitativamente exacto, ya que principalmente detecta aquellos bioaerosoles que sedimentan a mayor velocidad, no detectando aquellos que permanecen en suspensin. Otros mtodos de muestreo microbiolgico de aire son: filtracin a travs de un material poroso, impacto sobre superficies slidas, burbujeo en lquidos. Tambin existen diferentes mtodos de muestreo para superficies. En la prctica emplearemos la del hisopado. Presenta como desventaja el hecho de no colectar la totalidad de la carga microbiana presente en la superficie. La cantidad de microorganismos recogidos depender de la rugosidad de la superficie hisopada, del tipo de microorganismos presentes y del operador (distintos operador pueden aplicar diferente presin sobre la superficie al momento de hisopar). A su vez, es importante el material del hisopo, dado que de ello depender su capacidad de retencin de los microorganismos y por lo tanto el posterior recuento. Por todo lo mencionado se puede asumir que esta metodologa de muestreo debe ser previamente estandarizada para obtener resultados reproducibles. Presenta como ventajas su economa y sencillez. Otras metodologas de muestreo consisten en: el empleo de esponjas, que
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presentan la ventaja de recoger una cantidad mayor de microorganismos; placas de contacto, que ya poseen el medio de cultivo el cual contacta directamente con la superficie. La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes. Permite la clasificacin de las clulas en dos grandes grupos (Gram positivas y Gram negativas); es un punto de partida para la identificacin, por lo que es de gran importancia en taxonoma bacteriana (ciencia de la clasificacin). Adems de indicar diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas clulas, permite una caracterizacin morfolgica debido al contraste generado. Si bien en la actualidad no est claramente establecido el fundamento de esta tincin, el de mayor aceptacin es que las clulas Gram positivas y Gram negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar tamao, forma y para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente 80% a 90% de la pared de la clula Gram positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% a 20% de la pared de la clula Gram negativa es peptidoglicano. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de violeta cristal y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de Lugol. El ingrediente activo es aqu el yodo, que penetra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el violeta cristal. De nuevo tanto las clulas Gram positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de etanol - acetona, disolvente en el que es soluble el complejo yodo violeta cristal. Las clulas Gram positivas no se decoloran, mientras que las Gram negativas s lo hacen. En la clula Gram negativa, la mezcla de etanol - acetona por ser un disolvente lipdico disuelve la membrana exterior de la pared (tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une el peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo yodo violeta cristal y la clula se decolora. La clula Gram positiva, a causa de sus pared celular ms espesa (ms peptidoglicano y menos lpido), no es permeable al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, provocando que el complejo yodo violeta cristal quede atrapado dentro de la clula. Despus de la decoloracin, las clulas Gram positivas son todava azules, pero las Gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
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Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: el tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo, ya que el yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas; la decoloracin debe realizarse con poco decolorante para evitar que las clulas Gram positivas pierdan la tincin; eI proceso de decoloracin debe ser corto y estandarizado; cultivos con ms de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo yodo violeta cristal.
Reactivos y Medios de Cultivo - Plate Count Agar (PCA): extracto de levadura 2,5g, hidrolizado pancretico de casena 5,0g, D(+)glucosa 1,0g, agar 15,0g, agua destilada c.s.p. 1L. Calentar a ebullicin con agitacin constante hasta disolucin del agar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,00,2. Distribuir aspticamente en placas de Petri (aproximadamente 15mL). - Yeast Extract Glucose Cloranfenicol Agar (YGC): extracto de levadura 5,0g, D(+)-glucosa 0,1g, cloranfenicol 0,1g, agar 15,0g, agua destilada c.s.p. 1L. Calentar a ebullicin con agitacin constante hasta disolucin del agar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,00,2. Distribuir aspticamente en placas de Petri (aproximadamente 15mL). - Solucin de violeta cristal (Reactivo de Hucker): Solucin A: violeta cristal (pureza mnima 90%) 2g, etanol (96%) 20mL. Solucin B: oxalato de amonio 0,8g, agua destilada 80mL. Disolver cada uno de los solutos en los solventes respectivos. Dejar en reposo solucin B durante al menos 12h; si es necesario calentar ligeramente hasta disolucin total. Mezclar ambas soluciones y filtrar. - Solucin de Lugol (yodo yodurado): yodo 1g, yoduro de potasio 2g, agua destilada c.s.p. 300mL. Mezclar ntimamente el yodo y el yoduro de potasio. Agregar agua destilada y agitar fuertemente. Almacenar en recipiente oscuro y al abrigo de la luz. - Solucin decolorante etanol - acetona: etanol (96%) 500mL, acetona 300mL. - Solucin de safranina: safranina (pureza mnima 90%) 0,25g, etanol (96%) 10mL, agua destilada c.s.p. 1L. Disolver el colorante en el alcohol. Agregar agua destilada y filtrar. - Aceite de inmersin o aceite de cedro. - Solucin de etanol - ter de petrleo 7:3: etanol (96%) 70mL, ter de petrleo 30mL.
Equipos y Materiales - Ansa rulo - Hisopos estriles.

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- Tubos estriles - Placas de Petri (dimetro 90mm) - Mechero Mecker - Batea para tinciones - Portaobjetos - Microscopio ptico con objetivo de inmersin - Hisopos - Marcador indeleble - Estufa de incubacin a 37C - Estufa de incubacin a 25C
Procedimiento 1- Muestreo de aire por sedimentacin espontnea (exposicin de placas): 1.1- Seleccionar un ambiente para efectuar la extraccin de muestras. Es conveniente que los distintos grupos seleccionen ambientes con diferentes caractersticas (aula, comedor, patio, bao, pasillo, laboratorio, etc.). 1.2- Rotular las placas en la base y en la tapa detallando nmero de grupo y medio de cultivo. 1.3- Abrir una placa de Petri con PCA y una con YGC sobre una superficie plana, que proporcione una separacin aproximada de 1m respecto al piso. Colocar la tapa al costado de cada medio y con la parte cncava hacia abajo. 1.4- Mantener la exposicin durante un tiempo preestablecido (1 hora o hora). Es conveniente que dos grupos expongan placas en un mismo ambiente a tiempos distintos para evaluar diferencias. 1.5- Una vez transcurrido el tiempo de exposicin cerrar las placas de Petri. Incubar las placas de PCA a 37 C durante 48h (invertidas) y las placas de YGC a 25 C durante 5 das (No invertidas). 2- Muestreo de superficies (hisopado): 2.1- Seleccionar una superficie y estimar el rea a hisopar (no hisopar reas superiores a los 100cm2). 2.2- Retirar el hisopo del contenedor e hisopar mediante movimientos de zig zag en tres sentidos (horizontal, vertical y diagonal), aplicando una presin constante y rotando el hisopo. 2.3- Colocar el hisopo en el tubo de trasporte estril. 2.4- Sembrar en placa de PCA, rotando la punta del hisopo sobre toda la superficie de la placa.
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2.5- Incubar las placas invertidas a 37 C durante 48h 3- Recuentos microbianos: 3.1- Con la ayuda de un marcador indeleble contar todas las colonias (incluir mohos) que han desarrollado en el medio PCA proveniente del muestreo del aire. Expresar el resultado como recuento total de aerobios a 37C, utilizar como unidad UFC / (tiempo de exposicin rea expuesta). 3.2- De la placa de YGC proveniente del muestreo de aire, contar todos los mohos y las levaduras que han desarrollado. Expresar los resultados como recuento de levaduras y como recuento de mohos, utilizar como unidad UFC / (tiempo de exposicin rea expuesta). 3.3- Del mismo modo que en 3.2, contar todas las colonias (incluir mohos) que han desarrollado en el medio PCA proveniente del muestreo de hisopado. Expresar el resultado como recuento total de aerobios a 37C, utilizar como unidad UFC / (rea hisopada). 4- Caracterizacin de una colonia y preparacin de un extendido: 4.1- Del medio de cultivo PCA seleccionar una colonia y marcarla mediante un crculo. 4.2- Describir la colonia seleccionada teniendo en cuenta las siguientes caractersticas: forma (puntiforme, alargada, circular, rizoide, irregular, filamentosa), color, tamao (grande: ms de 3mm, mediana: de 2 a 3 mm, pequea: menos de 2mm), borde (entero, estrellado, lobulado, festoneado, filamentoso, ondulado), elevacin (convexa, pulvinada, embonada, elevada, aplanada), superficie (suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta) y opacidad. (Ver figura 1) 4.3- Rotular el portaobjetos y colocar una gota de agua destilada en la mitad del mismo. 4.4- Con el ansa rulo previamente esterilizada con el mechero tomar parte de la colonia y suspenderla en la gota de agua mediante movimientos circulares. 4.5- Dejar secar al aire junto a la llama del mechero. 4.6- Fijar con calor pasando el preparado unas 10 veces por la llama sin quemarlo. 5- Tincin de Gram y caracterizacin de las clulas: 5.1- Cubrir el extendido con la solucin de violeta cristal y dejar actuar durante 60 segundos. 5.2- Lavar con fino chorro de agua durante 10 segundos, de manera de no arrastrar la preparacin. 5.3- Cubrir con solucin de Lugol y dejar actuar durante 60 segundos.
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5.4- Lavar con solucin decolorante durante 10 segundos o hasta que el decolorante escurra incoloro. Inmediatamente lavar con fino chorro de agua durante 10 segundos. 5.5- Cubrir con solucin de safranina y dejar actuar durante 60 segundos. 5.6- Lavar con fino chorro de agua durante 10 segundos. Secar al aire o empleando papel absorbente, o bien debajo del mechero. Nota: los tiempos de tincin pueden variar si se emplean soluciones con concentraciones distintas a las detalladas. En el caso de emplear kits comerciales se recomienda respetar los tiempos de tincin especificados por el fabricante. 5.7- Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al microscopio con objetivo de inmersin. 5.8- Determinar la morfologa de las clulas (cocos, bacilos, cocobacilos, vibrios, espirilos, espiroquetas), de ser posible la agrupacin (aislados, de a pares diplo-, en cadena estrepto-, en racimo estfilo-, en ttrada), clasificar en Gram positiva (azul) o Gram negativa (roja) (Ver figura 2)
Bibliografa - Gua de Trabajos Prcticos de Microbiologa Universidad Autnoma Metropolitana Azcapotzalco Departamento de Ciencias Bsicas - http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia - Gua de Trabajos Prcticos de Laboratorio de Ingeniera Bioqumica Lic. Graciela Vilela Universidad Tecnolgica Nacional, Facultad Regional Buenos Aires. - Gua de Trabajos Prcticos de Microbiologa e Inmunologa Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Qumica Biolgica. - El Aire: Hbitat y Medio de Transmisin de Microorganismos M.C. De La Rosa, M.A. Mosso, C. Ulln ISSN: 1139-1987 http://www.ucm.es/BUCM/revistas/cca/11391987/articulos/OBMD0202110375A.PDF - Biotecnologa: Curso de Prcticas de Laboratorio J.M. Becker Editorial Acribia (1996). - Informacin Tcnica Seleccionada para Productos de Microbiologa Laboratorios Britania S.A. http://www.britanialab.com.ar/espanol/catalogo_r.html - Gua de Trabajos Prcticos de Microbiologa (2001) Universidad Central de Venezuela, Facultad de Farmacia - Prof. Luisa Rossi Devido - http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/calidmic.pdf
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Preguntas 1- Por qu durante el muestreo las placas deben ser colocadas sobre superficies planas y separadas a 1m del piso? 2- Cules son las condiciones de incubacin de los microorganismos que se desea cuantificar?. Justificar tiempos y temperaturas de incubacin, y medios de cultivo empleados. 3- Por qu se esteriliza y se enfra el ansa antes de tocar la colonia? 4- Por qu en la unidad se utiliza el trmino unidades formadoras de colonias y no slo colonias? 5- Por qu para la tincin de Gram se seleccionan colonias del PCA y no del YGC? 6- Cmo se observara al microscopio un: a) bacilo Gram positivo b) streptococo Gram negativo? Justifique y grafique lo observado.
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Figura 1 Morfologa de colonia en placa
Figura 2 Izquierda) Morfologa de una clula al microscopia Derecha) Agrupacin celular al microscopio
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Prctica
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Anlisis Bacteriolgico de Aguas
Introduccin El control bacteriolgico de aguas es utilizado para evaluar aguas destinadas a consumo, aguas recreativas, aguas para usos industriales y aguas residuales. La potabilidad de las aguas destinadas a consumo depende en parte de su aptitud bacteriolgica. Existen normas legales que establecen cantidades mximas de microorganismos para que su uso se considere aceptable. Lo mismo ocurre con las aguas empleadas con fines recreativos (piscinas, deportes acuticos, etc.), pero los lmites establecidos suelen ser menos estrictos que los de las aguas para consumo. El control bacteriolgico de aguas es indispensable en estos casos, ya que existen numerosas enfermedades hdricas de origen microbiano. En aguas para uso industrial se conocen microorganismo que pueden influir negativamente en estructuras, equipos y en el mismo producto terminado. Los lmites fijados por normas legales se aplican a procesos en los que la presencia de estos microorganismos pueda poner en riesgo al consumidor. Tambin suelen fijarse lmites por cuestiones de calidad. En aguas residuales estos controles son necesarios para evaluar el nivel de contaminacin microbiolgico expulsado al ambiente. Es imprescindible que en todo proceso productivo se realice un tratamiento de las aguas residuales, de modo de evitar la contaminacin del ambiente, en especial la contaminacin de los cursos y reservorios de agua. Dado que la investigacin de microorganismos puntuales no es sencilla ni econmica (y hasta en ciertos casos imposible), como por ejemplo la deteccin de todos los microorganismos responsables de las enfermedades hdricas en aguas potables y recreativas, se suelen emplear microorganismos indicadores. Estos indicadores consisten en grupos, gneros, familias o microorganismos de fcil y econmica deteccin y/o cuantificacin, cuya presencia y/o cantidad indican una mala calidad del agua y/o la potencial presencia de ciertos microorganismos de inters. El recuento de microorganismos aerobios mesfilos estima la flora total viable, sin especificar tipos de microorganismos. Este indicador suele emplearse para determinar la calidad sanitaria del agua o la eficiencia de procesos de eliminacin de microorganismos (sedimentacin, filtracin, cloracin, etc). El recuento de coliformes totales es un indicador empleado para determinar contaminacin fecal. Este grupo est formado por bacilos Gram negativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,
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aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas. Si bien su especificidad como indicador de contaminacin fecal no es buena (ya que no todos los coliformes son de origen intestinal), se suele usar por: su frecuencia en heces, su fcil deteccin en el laboratorio, sus caractersticas semejantes a las de algunos miembros patgenos de la familia Enterobacteriaceae. Si bien coliformes totales es un indicador que se ha instaurado, en la actualidad se prefieren otros indicadores de contaminacin fecal de mayor especificidad como coliformes fecales y como Escherichia coli.
Reactivos y Medios de Cultivo - Plate Count Agar (PCA): extracto de levadura 2,5g, hidrolizado pancretico de casena 5,0g, D(+)glucosa 1,0g, agar 15,0g, agua destilada c.s.p. 1L. Calentar a ebullicin con agitacin constante hasta disolucin del agar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,00,2. - Caldo Mac Conkey doble concentracin: bilis de buey 10,0g; peptona 40,0g; lactosa 20,0g; prpura de bromocresol 0,02g, agua destilada csp 1L. Disolver y distribuir 10mL por tubo con campanita Durham. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,30,2. - Caldo Mac Conkey simple concentracin: bilis de buey 5,0g; peptona 20,0g; lactosa 10,0g; prpura de bromocresol 0,01g, agua destilada csp 1L. Disolver y distribuir 5mL por tubo con campanita Durham. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,30,2. - Agra Cetrimida: peptona de gelatina 20,0g; cloruro de magnesio 1,4g; sulfato de potasio 10,0g; agar 13,6g; Cetrimida 0,3g; agua destilada csp 1L. Disolver los componentes y adicionar 10mL de glicerina; dejar reposar 5 min. Calentar a ebullicin con agitacin constante. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,20,2. Distribuir aspticamente en placas de Petri (aproximadamente 15mL). - Citrato de Koser: fosfato monopotsico 1,0g; sulfato de magnesio 0,2g; fosfato de sodio y amonio 1,5g; citrato de sodio 3,0g; agua destilada csp 1L. Disolver y distribuir 5mL por tubo. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 6,70,2 - Solucin salina: cloruro de sodio 8,5g, agua destilada c.s.p. 1000mL. Agregar agua destilada y agitar hasta disolucin total, calentar si es necesario. pH final 7,00,5. Dispensar 9mL en tubos de cultivo. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C
Equipos y Materiales - Pipetas de 10mL, 1mL y 0,1mL estriles

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- Mechero Mecker - Ansa rulo - Ansa recta - Pinza - Placas de Petri (dimetro 90mm) - Monitor estril (dimetro 50mm) - Equipo para filtracin por vaco. - Marcador indeleble - Bao termosttico a 47C - Estufa de incubacin a 37C - Estufa de incubacin a 44C
Procedimiento 1- Recuento total de aerobios a 37C: 1.1Siembra en profundidad por volocado:
1.1.1- Homogeneizar la muestra mediante agitacin. (El esquema de trabajo que a continuacin se va a detallar se puede ver en la figura 3). 1.1.2- Con pipeta estril verter 1mL de muestra en una placa de Petri (proceder por duplicado). Verter tambin 1mL de muestra en un tubo conteniendo 9mL de solucin salina estril (dilucin 10-1); agitar para homogeneizar. 1.1.3- Verter 1mL de la dilucin 10-1 en una placa de Petri (proceder por duplicado). Verter tambin 1mL de la dilucin 10-1 en otro tubo conteniendo 9mL de solucin salina estril (dilucin 10-2); agitar para homogeneizar. 1.1.4- Verter 1mL de la dilucin 10-1 en una placa de Petri (proceder por duplicado). Verter tambin 1mL de la dilucin 10-1 en otro tubo conteniendo 9mL de solucin salina estril (dilucin 10-2); agitar para homogeneizar. 1.1.5- Verter 1mL de la dilucin 10-2 en una placa de Petri (proceder por duplicado). Verter tambin 1mL de la dilucin 10-2 en otro tubo conteniendo 9mL de solucin salina estril (dilucin 10-3); agitar para homogeneizar. 1.1.6- Verter 1mL de la dilucin 10-3 en una placa de Petri (proceder por duplicado).
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Nota: es necesario utilizar una pipeta estril distinta para cada dilucin. 1.1.7- Agregar a cada placa de Petri aproximadamente 15mL de PCA (que se encuentra previamente fundido a 47C). 1.1.8- Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada placa de Petri. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin es: aplicara a la placa movimientos de vaivn 5 veces en una direccin; hacerla girar 5 veces en sentido horario; volver a aplicar movimientos de vaivn 5 veces en una direccin que forme ngulo recto con la primera; hacerla girar 5 veces en sentido antihorario. 1.1.9- Dejar reposar las placas de Petri el tiempo necesario para que solidifique el medio de cultivo. 1.1.10- Una vez solidificado el medio de cultivo, incubar en posicin invertida a 37C durante 24h 1.2Recuento:
1.2.1- Con la ayuda de un marcador indeleble contar todas las colonias (incluir mohos) que se han desarrollado en cada una de las placas de PCA. 1.2.2- Seleccionar los duplicados cuya dilucin haya permitido contar entre 30 y 300 colonias; descartar las otras. Si hay varias diluciones que hayan entrado en este intervalo, seleccionar aquella que presente menor diferencia entre duplicados. 1.2.3- Promediando los duplicados y teniendo en cuenta el factor de dilucin, expresar el resultado obtenido como recuento total de aerobios a 37C. Utilizar la unidad UFC/mL y expresar el resultado en nmero entero con dos cifras significativas. 1.2.4- Si todas las placas presentan un conteo superior a 300, efectuar conteos estimados a partir de subdivisiones de las placas de Petri que corresponden a la mayor dilucin. En caso de que los conteos sea superiores a 200 en una subdivisin correspondiente a un octavo de la placa de Petri, expresar el recuento como mayor a (>) 1600 (200 8) teniendo en cuenta el factor de dilucin. Utilizar la unidad UFC/mL y expresar el resultado en nmero entero con dos cifras significativas. 1.2.5- Si todas las placas presentan un conteo inferior a 30, efectuar conteos de las que corresponden a la menor dilucin. Si no se observan colonias en las placas correspondientes a la siembra directa, expresar el recuento como inferior a (<) 1. Utilizar la unidad UFC/mL y expresar el resultado en nmero entero con dos cifras significativas. Nota: los recuentos obtenidos para los puntos 1.2.4- y 1.2.5- se consideran estimados. Esto debe ser aclarado al expresar el resultado.
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2- Investigacin de coliformes totales, fecales (colifecales) e IAC (intermedias aerogenes cloacae): 2.1Siembra para investigacin de coliformes totales:
2.1.1- Homogeneizar la muestra mediante agitacin. 2.1.2- Segn el origen de la muestra se realizar la dilucin correspondiente. 2.1.3- En tres tubos con 10mL de caldo Mac Conkey doble concentracin aadir con pipeta estril 10mL de agua muestra. 2.1.4- En tres tubos con 5 mL de caldo Mac Conkey simple concentracin aadir con pipeta estril 1mL de agua muestra. 2.1.5- En tres tubos con 5mL de caldo Mac Conkey simple concentracin aadir con pipeta estril 0,1mL de agua muestra. 2.1.6- Homogeneizar los tubos empleando, evitando la formacin de burbujas dentro de las campanitas Durham. 2.1.7- Incubar a 37C durante 24 a 48h 2.2NMP de coliformes totales:
2.2.3- Se considera positivo todo tubo que presenta cido y gas, indicando que el agua posee bacterias coliformes. 2.2.4- El nmero ms probable (NMP) de bacterias coliformes por 100mL se calcula mediante tabla estadstica, teniendo en cuenta la combinacin de tubos sembrados con 10; 1 y 0,1mL de agua y la combinacin de tubos positivos. 2.3Confirmacin de colifecales:
2.3.1- De cada uno de los tubos Mac Conkey positivo, se repica con ansa rulo a tubos con 5mL de caldo Mac Conkey concentracin simple. 2.3.2- Se incuba a 44C durante 48h 2.4NMP de colifecales:
2.4.1- Se considera positivo todo tubo que presenta cido y gas (a la temperatura de incubacin formarn cido y gas las bacterias colifecales).
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2.4.2- Mediante el empleo de la tabla y usando la combinacin original sembrada y la combinacin de tubos positivos, se determina el NMP de bacterias colifecales en 100mL. 2.5Confirmacin bacterias intermedias aerogenes cloacae (IAC):
2.5.1- De todos los tubos positivos del caldo Mac Conkey incubado a 37C hacer repiques con ansa recta a tubos con medio Citrato de Koser. 2.5.2- Incubar a 37C durante 48h Nota: se utiliza ansa recta con el objeto de no llevar a los tubos con citrato, material nutritivo del cultivo original. Esto es importante, pues pequeas cantidades de peptona son suficientes para permitir el desarrollo de Escherichia coli (fecal) y modificar por lo tanto los resultados del ensayo. 2.6NMP de bacterias intermedias aerogenes cloacae (IAC):
2.6.1- Se consideran como positivos los tubos que presenten coloracin azul. Si el medio permanece verde, el ensayo se considera negativo. Si la coloracin es dudosa, pueden agregarse unas gotas de solucin de azul de bromotimol. 2.6.2- Mediante el empleo de la tabla y usando la combinacin original sembrada y la combinacin de tubos positivos, se determina el NMP de bacterias del grupo IAC en 100mL Nota: El citrato es utilizado por las bacterias como nica fuente de carbono produciendo amonaco; esto hace que el pH aumente junto con el desarrollo microbiano y produce el viraje del indicador, lo que es originado nicamente por las bacterias del grupo IAC. 3- Deteccin de Pseudomonas aeruginosa: 3.1Siembra por filtracin:
3.1.1- Homogeneizar la muestra mediante agitacin. (En la figura 4 se muestra un esquema del sistema empleado). 3.1.2- Verter 100mL de muestra en el monitor estril, usar la escala graduada del monitor para medir el volumen. 3.1.3- Aplicar vaco hasta filtracin total.
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3.1.4- Remover la membrana con la ayuda de una pinza y colocarla sobre una placa de Agar Cetrimida (asegurar un buen contacto entre la membrana y el medio de cultivo). 3.1.5- Incubar en posicin invertida a 37C durante 24h 3.2Interpretacin de resultados:
3.2.1- Observar las placas de Agar Cetrimida con exposicin a lmpara de luz UV (longitud de onda larga). Las colonias de Pseudomonas aeruginosa se ven fluorescentes. 3.2.2- Informar como Detectable o No Detectable en 100mL.
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TABLA PARA LA DETERMINACIN DEL NMP NMP por 100 mL usando tres tubos inoculados con 10; 1 y 0,1 mL de muestra Tubos Positivos 10 mL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 mL 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0,1 mL 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 Tubos Positivos 10 mL 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 mL 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0,1 mL 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
NMP 3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 9
NMP 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100
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Bibliografa - ISO 6222 Water Quality. Enumeration of Cultivable Micro-organisms. Colony Count by Inoculation in a Nutrient Agar Culture Medium (1999). - ISO 9308-1 Water Quality. Detection and Enumeration of Escherichia coli and Coliform Bacteria. Membrane Filtration Method (2000). - ISO 8199 Water Quality. General Guidance on the Enumeration of Micro-organisms by Culture (2005) - Mtodos Normalizados para el Anlisis de Aguas Potables y Residuales APHA, AWWA, WPCF Editorial Daz de Santos 20 Edicin (1998). - Gua de Trabajos Prcticos de Microbiologa Universidad Autnoma Metropolitana Azcapotzalco Departamento de Ciencias Bsicas - http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia - Gua de Trabajos Prcticos de Laboratorio de Ingeniera Bioqumica Lic. Graciela Vilela Universidad Tecnolgica Nacional, Facultad Regional Buenos Aires. - Biotecnologa: Curso de Prcticas de Laboratorio J.M. Becker Editorial Acribia (1996). - Informacin Tcnica Seleccionada para Productos de Microbiologa Laboratorios Britania S.A. http://www.britanialab.com.ar/espanol/catalogo_r.html - Chemdat online Merck http://www.merck-chemicals.com/chemdat/es_ES/Merck-ARSite/ARS/ViewWelcome-Start?CountryName=Argentina - Microorganismos de los Alimentos 1. Su Significado y Mtodos de Enumeracin ICMSF Editorial Acribia (2000). - Microbiologa Alimentaria. Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas M. Del Rosario Pascual Anderson, Vicente Caldern y Pascual Editorial Daz de Santos (2000)
Preguntas 1- Cmo pueden clasificarse los medios de cultivo empleados? Explicar la clasificacin segn la funcin de los componentes. 2- Si espera un recuento total a 37C de 10000 ufc/mL cmo procedera?. Qu diluyentes se pueden emplear?, justique esta respuesta. 3- Cmo procedera si desconoce los recuentos esperados de aerobios mesfilos y de coliformes totales? 4- En qu situaciones son adecuadas la siembra en profundidad y la siembra por filtracin? 5- Qu significado tienen las bacterias coliformes en un agua de bebida?
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6- Qu caractersticas definen al grupo coliforme? 7- Una muestra de agua de ro dio los siguientes resultados: Anlisis cuantitativo: se realiza una dilucin 1/100 y se siembra 1,0 ml de la misma en profundidad. Se cuentan 50 colonias. Cmo informara dicha muestra? NMP por esquema de Wilson: Tubos positivos por 10 ml 1,0 ml 0,1 ml 3 1 1 2 1 0 1 1 0
Mac Conkey 37C Mac Conkey 44C Citrato de Koser 37C
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Figura 3 Arriba) Preparacin de diluciones Abajo) Siembra en profundidad
Figura 4 Siembra por filtracin por membrana
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Prctica
3
Ingeniera Gentica - Escherichia coli Recombinante
Introduccin La ingeniera gentica permite la modificacin de organismos para favorecer o hacer factible un proceso biotecnolgico, ya sea incorporndole un gen o silenciando un gen que ya posee. Desde el punto de vista del proceso, esto consiste en la obtencin de un producto que el organismo no produce, en la obtencin de un producto modificado, en la eliminacin de metabolitos que acompaan al producto y que no son de inters, en la simplificacin del proceso de purificacin. Para la manipulacin gentica se debe tener una visin global del proceso, aplicando de este modo el concepto de metaintegracin. La tecnologa del ADN recombinante permite la incorporacin de un gen de inters a un clula por medio de un vector, aprovechando la maquinaria de la misma para su expresin. En esta prctica utilizaremos una cepa de Escherichia coli a la que se le ha incorporado el plsmido pGLO mediante un proceso de transformacin. Este plsmido, al igual que otros vectores, posee un origen de replicacin, un gen de resistencia, un gen reportero, una zona de restriccin para incorporacin del gen de inters y una regin de finalizacin de la transcripcin. El plsmido pGLO tiene la particularidad de permitir la expresin del gen reportero y el gen de inters utilizando el gen regulador y los elementos del control del opern arabinosa, por lo que la expresin de ambos genes se logra en presencia del efector Darabinosa. El gen reportero expresa la protena GFP (Green Fluorescent Protein) que presenta fluorescencia verde bajo la luz UV. La protena de inters se encuentra adherida a GFP, por lo que se puede fcilmente demostrar su expresin, observar su localizacin y lograr su purificacin. El plsmido pGLO, al igual que muchos otros vectores, puede ser adquirido comercialmente con todos los reactivos necesarios para la restriccin y para la transformacin del husped.
Reactivos y Medios de Cultivo - Luria Bertani agar (LB agar): peptona de casena 10,0g; extracto de levadura 5,0g; cloruro de sodio 10,0g; agar 15,0g; agua destilada c.s.p. 1L. Calentar a ebullicin con agitacin constante hasta disolucin del agar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,50,2.
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- Luria Bertani caldo (LB caldo): peptona de casena 10,0g; extracto de levadura 5,0g; cloruro de sodio 10,0g; agua destilada c.s.p. 1L. Agregar agua destilada y agitar hasta disolucin total, calentar si es necesario. Esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final 7,50,2. - Solucin de ampicilina 10%: ampicilina 100mg; agua destilada 1mL. Agregar agua destilada y agitar hasta disolucin total. Esterilizar mediante filtracin con filtro de jeringa de poro de 0,2m. - Solucin de L-arabinosa 20%: L-arabinosa 200mg; agua destilada 1mL. Agregar agua destilada y agitar hasta disolucin total. Esterilizar mediante filtracin con filtro de jeringa de poro de 0,2m. - Solucin de D-arabinosa 20%: D-arabinosa 200mg; agua destilada 1mL. Agregar agua destilada y agitar hasta disolucin total. Esterilizar mediante filtracin con filtro de jeringa de poro de 0,2m. - Luria Bertani agar + ampicilina (LB + ampi agar): Fundir LB agar y colocar en bao de agua a 45C. Una vez alcanzada la temperatura, adicionar en esterilidad 100L de solucin de ampicilina 10% cada 100mL de LB agar. - Luria Bertani caldo + ampicilina (LB + ampi caldo): Adicionar en esterilidad 100L de solucin de ampicilina 10% cada 100mL de LB caldo.
Equipos y Materiales - Ansa rulo - Esptula Drigalsky - Tubos estriles tipo Falcon - Placas de Petri estriles (dimetro 90mm) - Mechero Mecker - Marcador indeleble - Estufa de incubacin a 37C - Lmpara con luz UV - Centrfuga - Pipeta de Mohr de 10mL - Pipeta automtica de 1mL - Pipeta automtica de 100L - Puntas para pipetas automticas estriles
Procedimiento
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2- Preparacin del material: 1.6- Rotular seis placas de Petri indicando el medio de cultivo a contener (2 placas de LB, 2 placas de LB + ampi, 1 placa de LB + ampi + L-ara, 1 placa de LB + ampi + D-ara), la cepa a sembrar (E. coli salvaje, E. coli recombinante) y el nmero de grupo. Rotular la base y la tapa, escribiendo en un extremo de la placa de modo de poder observar fcilmente lo sembrado. 1.7- Rotular dos tubos tipo Falcon (1 tubo de LB + ampi + L-ara, 1 tubo de LB + ampi + D-ara). Rotular en la parte superior del tubo, de modo de poder observar fcilmente lo sembrado. 1.8- A las placas rotuladas como LB, adicionar en esterilidad aproximadamente 15mL de LB agar. Dejar solidificar 1.9- A las placas rotuladas como: LB + ampi, LB + ampi + L-ara, LB + ampi + D-ara; adicionar en esterilidad aproximadamente 15mL de LB agar + amipicilina. Dejar solidificar. 1.10- A la placa rotulada como LB + ampi + L-ara ya plaqueada (de 1.4), adicionar en esterilidad sobre la superficie 150L de solucin de L-arabinosa 20% empleando pipeta automtica y punta estril. Extender en esterilidad lo adicionado mediante esptula Drigalsky previamente esterilizada. Dejar absorber la solucin adicionada. 1.11- A la placa rotulada como LB + ampi + D-ara ya plaqueada (de 1.4), adicionar en esterilidad sobre la superficie 150L de solucin de D-arabinosa 20% empleando pipeta automtica y punta estril. Extender en esterilidad lo adicionado mediante esptula Drigalsky previamente esterilizada. Dejar absorber la solucin adicionada. 1.12- A los tubos rotulados como: LB + ampi + L-ara, LB + ampi + D-ara; adicionar en esterilidad 100 mL de Luria Bertani caldo + ampicilina empleando pipeta estril. 1.13- Al tubo rotulado como LB + ampi + L-ara ya adicionado con el medio (de 1.7) agregar 100L de solucin de L-arabinosa 20% empleando pipeta automtica y punta estril. 1.14- Al tubo rotulado como LB + ampi + D-ara ya adicionado con el medio (de 1.7) agregar 100L de solucin de D-arabinosa 20% empleando pipeta automtica y punta estril. 2- Siembra: 2.6- A una placas conteniendo LB y a una placa conteniendo LB + ampi, sembrar por estra la suspensin de E. coli salvaje empleando ansa de rulo. 2.7- A las placas restantes de LB, LB + ampi, LB + ampi + L-ara, LB + ampi + D-ara, sembrar por estra la suspensin de E. coli recombinante empleando ansa de rulo. 2.8- A los tubos tipo Falcon conteniendo LB + ampi + L-ara y LB + ampi + D-ara, sembrar la suspensin de E. coli recombinante empleando ansa de rulo.
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2.9- Incubar los tubos y las placas (invertidas) a 37C durante 24 horas. 3- Observacin de la sembrado: 3.4- Observar las placas y tubos, registrando aquellas en las que se observa desarrollo (formacin de colonias en placas y turbidez en tubos). 3.5- Iluminar con luz UV las placas y tubos que han presentado desarrollo (de 3.1), registrando aquellas en las que se observa fluorescencia. 4- Centrifugacin: 4.7- Centrifugar a 3000 rpm los tubos que presentan fluorescencia (de 3.2). 4.8- Iluminar con luz UV los tubos centrifugados, registrando la distribucin de la fluorescencia (pellet, sobrenadante o ambos).
Bibliografa - Biologa Molecular de los Genes Watson, Baker, Belll, Gann, Levine, Losick Editoriales Benjamin Cummings, CSHL Press (2004). - Introduccin a la Biotecnologa y a la Ingeniera Gentica Nair Editorial Infinity Science Press (2008). - Manual de Procedimientos y Experimentos de Biotecnologa - Harisha Editorial Infinity Science Press (2007). - Biotecnologa: Curso de Prcticas de Laboratorio J.M. Becker Editorial Acribia (1996). - Informacin Tcnica Seleccionada para Productos de Microbiologa Laboratorios Britania S.A. http://www.britanialab.com.ar/espanol/catalogo_r.html Preguntas 7- Describa el funcionamiento del opern arabinosa. 8- Mencione las partes que componen el plsmido pGLO y describa su utilidad. 9- En qu parte del plsmido insertara el gen que se desea expresar?; justifique. 10- Qu modificacin realizara al plsmido pGLO para que el gen a expresar se exprese en todo momento?.
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11- Por qu es importante observar la distribucin de la fluorescencia tras la centrifugacin de los tubos?. 12- Investigue y describa el funcionamiento de otros genes reportero.
araC ori
pGLO
GFP
bla
Figura 1 - Mapa gentico del plsmidos pGLO.
Opern ara araC B A D

Efector (Arabinosa)
Opern ara GFP araC GFP Gene

Efector (Arabinosa)
araC
araC
GFP Gene RNA Polimerasa
RNA Polimerasa araC B A D araC
GFP Gene
Figura 2 Opern arabinosa y expresin de GFP.
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Apndice
A
Confeccin de los Informes de Laboratorio
Para los trabajos prcticos realizados en el laboratorio, cada grupo deber presentar un breve informe de resultados que deber contener como mnimo la siguiente informacin: Cartula: Debe al menos incluir el ttulo de la prctica, los nombres de los autores (es conveniente incluir informacin para contactarlos mails-) y fecha de realizacin. Objetivo: Consiste en dos o tres frases que establecen los propsitos de la experiencia, qu se hizo, para qu y por qu. No hay que alargarse demasiado. Metodologa analtica: Es una breve resea de las condiciones de ensayo (tipo de siembra, medio de cultivo empleado, tiempo y temperatura de incubacin) Resultados: Aqu se vuelcan los datos/resultados generados durante la experiencia y, de ser aplicable, los clculos realizados para obtener el resultado final (trabajo prctico N2 anlisis bacteriolgico de aguas) La descripcin de: objetivo, metodologa analtica y resultados no debe superar una carilla. Adems del informe cada grupo deber presentar en otra hoja las respuestas a los cuestionarios que figuran al final de cada prctica.
- Bibliografa: Biotecnologa: Curso de Prcticas de Laboratorio J.M. Becker Editorial Acribia (1996).
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Apndice
B
Medidas de Seguridad en el Laboratorio
1- Antes de la clase leer la prctica hasta familiarizarse con los principios y mtodos implicados. Al conocer la experiencia disminuye la posibilidad de que ocurra un accidente. Adems esta programacin permite emplear el tiempo en el laboratorio de una manera ms eficaz. 2- No bloquear el acceso a la salida, salidas de emergencia, matafuegos, ducha, kit antiderrame, con sillas, bolsos u otro elemento que entorpezca. 3- Se debe conocer la ubicacin de todos los elementos de seguridad en el laboratorio (matafuegos, salidas de emergencia, ducha, lavaojos, kit antiderrame). 4- En el laboratorio est prohibido comer, fumar o beber. 5- Respetar las seales de advertencia. 6- En el laboratorio se debe usar guardapolvo en todo momento. Esto garantiza que ningn material caiga accidentalmente sobre la ropa o piel. 7- Evitar el uso de accesorios colgantes (collares, corbata, aros, etc.). Usar zapatos cerrados. Usar el cabello recogido. 8- A la mesada de trabajo slo se debe llevar aquellos materiales estrictamente necesarios para el trabajo, como cuaderno y bolgrafo. El resto de los objetos, como seran abrigos, libros, bolsos, deben dejarse fuera del rea de trabajo. 9- Comenzar la prctica desinfectando el rea de trabajo. Saturar la zona con desinfectante, extenderlo con una toalla de papel y dejar que se seque. Repetir este procedimiento al terminar la experiencia. 10- Utilizar guantes apropiados para cada manipulacin de sustancias qumicas o material biolgico. 11- Mantener todos los cultivos y sustancias qumicas identificados. Estos es crucial para evitar usos o colocaciones indebidas. No utilizar el contenido de un recipiente que no est identificado. 12- No utilizar equipos o materiales sin antes haber recibido la capacitacin del docente.
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13- Ser muy cuidadoso con los mecheros. Apagarlos cuando no se los usa. Tener cuidado durante la desinfeccin de la mesada con alcohol. 14- No manipular sustancias inflamables cerca de llamas. 15- No pipetear con la boca. 16- Todo material contaminado debe ser desinfectado antes de ser eliminado o reutilizado. Colocar las pipetas, tips y portaobjetos ya usados en solucin desinfectante 17- El derrame o cada de muestras contaminadas debe ser informado inmediatamente al docente 18- Cuando sea necesario, proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos. Si se usan sustancias qumicas que emitan vapores o puedan provocar proyecciones se debe evitar el uso de lentes de contacto. 19- Al manipular sustancias que produzcan vapores riesgosos por inhalacin se debe trabajar bajo campana. 20- Se debe usar barbijo descartable cuando exista riesgo de produccin de aerosoles o polvo durante la manipulacin de sustancias txicas o biopatgenas. 21- Lavarse las manos tras la sesin de trabajo. 22- Est prohibido realizar experimentos no autorizados por el docente. No sustituir nunca un reactivo por otro durante una experiencia. 23- Los residuos generados deben ser desechados en los recipientes destinados para tal fin segn las indicaciones del docente. 24- En caso de accidente o lesin avisar inmediatamente al docente para que pueda realizarse una accin rpida y apropiada.

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Prctica 1 Prctica 2 Prctica 3 Apndice A Apndice B

pgina 3 pgina 11 pgina 22 Pgina 27 Pgina 28

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Equipos y Materiales - Ansa rulo - Hisopos estriles.

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Figura 1 Morfologa de colonia en placa

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Equipos y Materiales - Pipetas de 10mL, 1mL y 0,1mL estriles

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Procedimiento 1- Recuento total de aerobios a 37C: 1.1Siembra en profundidad por volocado:

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Figura 3 Arriba) Preparacin de diluciones Abajo) Siembra en profundidad

Figura 4 Siembra por filtracin por membrana

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Figura 1 - Mapa gentico del plsmidos pGLO.

Opern ara araC B A D

Opern ara GFP araC GFP Gene

GFP Gene RNA Polimerasa

RNA Polimerasa araC B A D araC

Figura 2 Opern arabinosa y expresin de GFP.

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